JP3606665B2 - Zinc-lactoferrin, its production and use - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物と、亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンに関する。また、本発明は、亜鉛−ラクトフェリンを製造する方法に関する。さらに、本発明は、亜鉛−ラクトフェリンを有効成分とする亜鉛強化飲食品あるいは飼料添加物あるいはこのような亜鉛−ラクトフェリンを配合した飲食品および飼料に関する。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、亜鉛独特の金属味が消失しており、また、亜鉛に起因する酸化作用も抑制されているので、飲食品や飼料等に亜鉛を添加する際の素材として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
亜鉛は、炭酸デヒドロターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等やＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等、多くの酵素の活性発現に重要な働きを担っている。
この亜鉛は、ヒトの微量必須元素として知られており、その栄養所要量は１５ｍｇ／日といわれている［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ， Ｒｅｃｏｍｅｎｄｅｄ Ｄｉｅｔａｒｙ Ａｌｌｏｗａｎｃｅｓ， １９８９， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．］。亜鉛の欠乏症については、成人の場合あまり認められていないが、１９５０年代にイランにおける貧血、性機能不全、皮膚障害等の原因が亜鉛の欠乏症であったことが知られており、また、１９６０年代にエジプトにおける皮膚障害の原因が亜鉛の欠乏症であったことが知られている［Ｐｒａｓａｄ，Ａ．Ｓ．， Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ．， ｖｏｌ．４３， ｐｐ．２８２９−２８３４， １９８４］ 。
また、子供の場合、亜鉛の軽度な欠乏症として、食欲不振や感覚障害等が知られている［Ｈａｍｂｉｄｇｅ，Ｋ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔ． Ｒｅｓ．， ｖｏｌ．６， ｐｐ．８６８−８７４， １９７２］ 。特に、新生児の場合、亜鉛は重要なものであり、初乳には常乳の４倍程度の亜鉛が含まれていることが知られており ［李家珍ら， 日本栄養食糧学会誌， ｖｏｌ．４２， ｐｐ．３６５−３６８， １９８９］ 、人工乳においては、亜鉛の吸収性が悪く、亜鉛を積極的に添加する必要があることも報告されている［Ｓａｎｄｓｔｏｍ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｄｉｓ． Ｃｈｉｌｄ．， ｖｏｌ．１３７， ｐｐ．７２６−７２９， １９８３］ 。
【０００３】
なお、加齢と共に亜鉛の吸収効率が低下するという報告もあり［Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｚｉｎｃ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ．３３５−３５０， １９８９， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｌｏｎｄｏｎ］、高齢者における潜在的な需要も考慮されている。
さらに、最近では、亜鉛の不足により放射線に対する抵抗力が低下すること、インスリンに亜鉛が存在することから亜鉛の不足により糖代謝の異常につながること、皮膚障害の治療に亜鉛の投与が有効であること、火傷により身体からの亜鉛の損失が大きいこと ［西牟田守， 食の科学， ｖｏｌ．２０９， ｐｐ．２４−３４， １９９５］が示唆されており、亜鉛の積極的な摂取についても、今後の課題と考えられている。
【０００４】
なお、日本人の場合、亜鉛については穀類からの摂取が主といわれているが、近年、穀類の摂取割合が減少していることから亜鉛不足も心配される。
一方、亜鉛は油脂の劣化を促進することが知られており、食品中に単に添加した場合、過酸化脂質生成が問題となる。特に、食品中の油脂は、食材の口当たりを滑らかにする等、食感を決定し、風味の面でも、食品の美味しさを引き出す最も重要な要因の一つであり、油脂を除いて食品の安定性を評価することはできない。したがって、亜鉛を添加することによる油脂の劣化が大きな問題になる。
【０００５】
油脂は、保存中に劣化し、加熱処理中にも劣化する。劣化した油脂は、風味の悪化や異臭が認められるだけではなく、その摂取は多くの疾病の原因ともなる。劣化した油脂には商品価値が無く、油脂の劣化防止対策は油脂の利用上不可欠なものとなっている。油脂の劣化による過酸化物生成の原因となるものに、光、空気、ミネラルの存在等がある。その中でも、亜鉛、銅、鉄、マンガン、ニッケル等の重金属は油脂の酸化を特に促進する。そのため、油脂の精製技術において、ミネラルの除去工程は重要であると考えられている。食品に含まれる金属中では銅が最も酸化を促進し、亜鉛、鉄がこれに次ぐといわれる。
このように、飲食品や飼料等に亜鉛を強化することで、亜鉛を補給することができると考えられるが、現在のところ、亜鉛による飲食品や飼料等の劣化を防止することができないことや亜鉛に由来する独特の金属臭が生じること等から、亜鉛の飲食品や飼料等への添加は難しい状況にある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような飲食品あるいは飼料に添加したときの亜鉛の欠点を改善することを目的とするものである。すなわち、本発明は、亜鉛に由来する独特の金属臭がなく、長期間安定で、耐熱性を有し、さらに、飲食品や飼料等に添加した場合に起こる飲食品や飼料等の劣化を防止する働きを有する亜鉛−ラクトフェリンを提供することを課題とする。
また、本発明は、このような亜鉛−ラクトフェリンを製造する方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、このような亜鉛−ラクトフェリンを有効成分とする飲食品あるいは飼料添加物及びこれらを配合した飲食品および飼料を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
これまでに、ラクトフェリン類と亜鉛との結合を報告したものは、ラクトフェリン１分子に亜鉛１原子が結合するというもののみである［Ｓｈｉｎｇｈ，Ｈ．， Ｆｌｙｎｎ，Ａ． ａｎｄ Ｆｏｘ，Ｐ．Ｆ．， Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ．５６， ｐｐ．２３５−２４８， １９８９］ 。また、トランスフェリンと亜鉛との結合を報告したものも、トランスフェリン１分子に２原子以下の亜鉛が結合するというもののみである［Ａｉｓｅｎ，Ｐ． ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｄ．Ｃ．， “Ｉｒｏｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ Ｉｒｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， ｐｐ．２３９−３７１， Ｖ．Ｃ．Ｈ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９］ 。すなわち、ラクトフェリン類１分子に３原子以上の亜鉛が結合することは未だに知られていなかった。
【０００８】
本発明者らは、ラクトフェリン類に結合する亜鉛量を高めることについて、鋭意研究を進めたところ、炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンを利用することにより、通常知られているラクトフェリン類の金属結合部位の数よりも遙かに多量の亜鉛を結合させることができることを見出した。すなわち、ラクトフェリン類を含む溶液と亜鉛を含む溶液とを混合すると、ラクトフェリン類と亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンを形成することを見出し、さらに、ｉ）炭酸、 ｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸を含む溶液と、 ｉｖ）亜鉛を含む溶液と、ｖ）ラクトフェリン類を含む溶液とを混合すると、炭酸および／または重炭酸を介してラクトフェリン類と亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンを形成することを見出した。そして、この亜鉛−ラクトフェリンは、亜鉛を多く含有し、亜鉛独特の金属臭がなく、長期間安定で、しかも耐熱性を有し、さらに亜鉛による飲食品や飼料等の劣化を防止することができることを見出した。
【０００９】
また、ラクトフェリン類に代え、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素により、あるいは、酸やアルカリにより分解したラクトフェリン類分解物を用いても同様の亜鉛−ラクトフェリンが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、このようなラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物と亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンである。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛が３原子以上結合している。また、本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛が３原子以上が、炭酸および／または重炭酸 １．５分子以上を介して結合している。この亜鉛−ラクトフェリンはその溶液を常温で少なくとも１ケ月間は沈澱を生じず、加熱しても沈澱を生じないという性質を有し、飲食品や飼料等に配合しても亜鉛による品質の低下を生じさせない。
【００１１】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、溶液中で反応させる必要があるが、使用するラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物、あるいは亜鉛のいづれか一方が固体状態であってもよい。また、反応溶液中の炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンのモル濃度を高く保つために、予め溶解しきれない量の炭酸塩および／または重炭酸塩を溶液中に含有させておいてもよいし、反応途中の溶液中に、炭酸塩および／または重炭酸塩、および／または、炭酸溶液および／または重炭酸溶液を添加してもよい。さらに、ｐＨ調整剤として、塩酸や水酸化ナトリウム等を使用してもよい。
【００１２】
本発明において使用するラクトフェリン類としては、ヒトやウシ等の哺乳類の乳等の分泌液から分離されるラクトフェリンを例示することができる。さらに、血液や臓器等から分離されるトランスフェリンや卵等から分離されるオボトランスフェリン等もラクトフェリンと同様に使用することができる。これらのラクトフェリン類については、既に大量に調製する方法がいくつも知られており、どのような方法で調製されたラクトフェリン類でもよい。また、ラクトフェリン類は、完全に単離されている必要はなく、他の成分が含まれていても構わない。さらに、遺伝子操作により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等から生産されたラクトフェリン類を使用することも可能である。そして、ラクトフェリン類をトリプシン、ペプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素により、あるいは、酸やアルカリにより分解したラクトフェリン類分解物をも使用することができる。
【００１３】
また、本発明において使用することのできる亜鉛としては、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、炭酸亜鉛、グルコン酸亜鉛等を例示することができる。そして、ラクトフェリン類と結合させるために添加する亜鉛の量は、ラクトフェリン類１モルに対して、亜鉛イオンとして３モル以上、好ましくは３０モル以上、より好ましくは６０モル以上であり、上限は ３００モルである。ラクトフェリン類と結合させるために添加する亜鉛の量が ３００モルを越えると、製造中や保存中に沈澱が生じたり、ラクトフェリン類と亜鉛とが完全に反応せず、亜鉛がイオンの状態で溶液中に残存したりするので好ましくない。
【００１４】
さらに、本発明において使用することのできる炭酸または重炭酸としては、炭酸水、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム等の塩類を溶解した溶液、あるいは、それらの混合溶液等を例示することができる。なお、耐熱性の亜鉛−ラクトフェリンを製造するには、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度が低いとラクトフェリン類と亜鉛との結合が充分に行われないので、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度を亜鉛イオンのモル濃度に対し少なくとも２倍以上、好ましくは５倍以上とする必要がある。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、上記の原材料に加え、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、塩酸、クエン酸、乳酸等をｐＨ調整剤として使用することができるし、また、糖質、蛋白質、脂肪等の物質が含まれていても構わない。前記反応はｐＨ７〜９で行われる。そして、上記原材料を加えると通常はｐＨ７〜９となるので、特にｐＨ調整剤を使用する必要はないが、前記ｐＨの範囲を大巾に逸脱した場合は、ｐＨ調整剤によって前記ｐＨの範囲に調整される。
【００１５】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを飲食品あるいは飼料に配合するに際し、配合量等に特に制限はなく、物理的に可能な量を飲食品および飼料等に配合することができる。また、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを油脂を含む食品１ｋｇに対し５０〜３００ｇ程度配合してもこの食品の劣化は見られないので、油脂や油脂を含む飲食品、飼料等に本発明の亜鉛−ラクトフェリンを直接配合しても問題はない。したがって、大豆油、菜種油、綿実油、ゴマ油、サフラワー油、オリーブ油、トウモロコシ油等の植物油や魚油、乳脂、豚脂等の動物油、さらにはビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＤ等の脂溶性ビタミン等の酸化され易い物質に直接配合することも可能である。しかし、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの油脂への分散性を考慮すると、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの配合量は、好ましくは油脂１ｋｇに対し１００ｇ以下が適当である。もちろん、亜鉛の過剰摂取を避けるよう、栄養学的見地から適正に本発明の亜鉛−ラクトフェリンの配合量を決定する必要がある。なお、アメリカでの基準値は、亜鉛の一日の所要量は成人で１５ｍｇとされているので、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを飲食品に配合するに際しては、亜鉛の一日の摂取量が１５ｍｇ以下となるよう配合することが望ましいといえる。さらに、アスコルビン酸等の水溶性の酸化され易い物質を含む飲食品、飼料等に本発明の亜鉛−ラクトフェリンを直接配合しても問題はない。なお、飲食品、飼料等を製造するに際し、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを配合する時期については特に制限はなく、製造工程の適宜の段階で配合すればよい。
【００１６】
食品添加物または飼料添加物として使用するときは、このような亜鉛−ラクトフェリンを単独で用いてもよいし、あるいは必要な担体、増量剤、その他の食品添加物等と混合して用いてもよい。
【００１７】
次に試験例を示し、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの特徴を説明する。
【試験例１】
本試験例では、亜鉛−ラクトフェリン中の重炭酸と亜鉛との比率が耐熱性に及ぼす影響について示す。
（Ａ溶液）各モル濃度に調整した重炭酸ナトリウムを含む水溶液１リットル
（Ｂ１溶液）塩化亜鉛 １００ミリモルを含む水溶液 ０．２リットル
（Ｂ２溶液）ラクトフェリン１ミリモルを含む水溶液 ０．８リットル
Ｂ１溶液とＢ２溶液とを混合してＢ溶液を作成した後、Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌し亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。そして、０．０５モル／リットルのイミダゾールおよび０．１５モル／リットルの食塩を含む ｐＨ７．５の液状食品を模倣した緩衝液 （以下、模擬緩衝液という） で、亜鉛濃度が ３．６ミリモル／リットルとなるまでこれらの溶液を希釈し、９０℃で１０分間加熱して沈澱の有無を観察した。
【００１８】
【表１】
以上の結果、重炭酸／亜鉛が ０．５以上で耐熱性が認められた。
従来より、ラクトフェリン、鉄および重炭酸塩を混合すると鉄飽和型ラクトフェリンが生成することが知られている。ラクトフェリンは、Ｎロープと呼ばれる領域とＣロープと呼ばれる類似した領域との二つの領域で構成されている。そして、鉄は、このラクトフェリンの二つの領域それぞれに１原子結合する。すなわち、Ｎロープでは、 Ａｓｐ６０， Ｔｙｒ１９２， Ｔｙｒ１９２， Ｈｉｓ２５３の４個のアミノ酸残基に１個の鉄イオンが結合し、さらに、この鉄イオンに１個の重炭酸イオンが結合している。また、Ｃロープのでの鉄結合部位は、 Ａｓｐ３９５， Ｔｙｒ４３５， Ｔｙｒ５２８， Ｈｉｓ５９７ である［Ｂ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．２０９， ｐｐ．７１１−７３４， １９８９］ 。したがって、通常、鉄飽和型ラクトフェリンというのは、ラクトフェリン１モル当たり鉄イオンが２モルと重炭酸イオンが２モル結合している。この鉄飽和型ラクトフェリンは、鉄が結合していないラクトフェリンに比べると若干安定性が増すが、６５℃以上で加熱すると沈澱してしまう。この欠点を解決するために、本発明者らは、鉄がラクトフェリンに３原子以上結合した鉄−ラクトフェリン結合体 ［特開平６−２３９９００号公報］ や鉄−ラクトフェリン複合体 ［特願平７− ８６０２３号］ を開発している。
【００２０】
【試験例２】
本試験例では、亜鉛−ラクトフェリンが、ラクトフェリン１分子当たり３原子以上の亜鉛を結合できることを示す。以下のようにして、試料１〜４を調製し試験を行った。
試料１：亜鉛の終濃度が０．９９ミリモル／リットルおよびラクトフェリンの終濃度が１３．２マイクロモル／リットルとなるよう塩化亜鉛水溶液とラクトフェリン水溶液とを混合し試験例１と同様にして亜鉛とラクトフェリンが結合した亜鉛−ラクトフェリンを調製した。
【００２１】
試料２：亜鉛の終濃度が０．９９ミリモル／リットルおよびラクトフェリンの終濃度が１３．２マイクロモル／リットルとなるよう試験例１に示した方法により重炭酸を介して亜鉛とラクトフェリンが結合した亜鉛−ラクトフェリンを調製した。
【００２２】
試料３：ラクトフェリンをトリプシン（シグマ社） で分解したラクトフェリン分解物、すなわち、ラクトフェリンに対しトリプシン１重量％を添加し、リン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）中で３７℃、３時間加水分解した後、分画分子量 １，０００カットの透析膜により透析することにより得られる分子量 １，０００以上のラクトフェリン分解物を使用し、亜鉛の終濃度が０．９９ミリモル／リットルおよびラクトフェリン換算でラクトフェリン分解物の終濃度が１３．２マイクロモル／リットルとなるよう試験例１に示した方法により重炭酸を介して亜鉛とラクトフェリン分解物が結合した亜鉛−ラクトフェリン分解物を調製した。
【００２３】
試料４：亜鉛の終濃度が１．９８ミリモル／リットルとなるよう塩化亜鉛水溶液を調製した（対照）。
【００２４】
試料１〜４の各試料を分子量 １，０００カットの限外濾過膜（ミリポア社）に１ｍｌ添加して脱塩し、リテンテート量が ０．２ｍｌになったところで１ｍｌ加水して脱塩することを繰り返し、総計６ｍｌ加水した。このようにして得られたリテンテートおよびパーミエートについて、発光分光分析機（ＩＣＰ）で亜鉛含量を測定した。また、リテンテート亜鉛残存率を次式により求めた。
リテンテート亜鉛残存率（％）＝｛リテンテート亜鉛総量÷（リテンテート亜鉛総量＋パーミエート亜鉛総量）｝×１００
さらに、各試料について９０℃で１０分間の処理を行い、その後の沈澱の有無を観察することにより耐熱性を確認した。その結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
この表にみられるように、試料４では殆ど全ての亜鉛がパーミエートに移行しており、使用した亜鉛が分子量 １，０００カットの膜を透過していることが判った。一方、試料２では殆ど全ての亜鉛がリテンテートに残存しており、亜鉛がラクトフェリンと結合し分子量 １，０００カットの膜を透過していないことが判った。また、試料１では亜鉛が殆ど結合していないことから、ラクトフェリン類と亜鉛とを結合させるには、試料２を調製する方法によらなければならないことが判る。
【００２７】
【試験例３】
亜鉛−ラクトフェリンの元素分析
亜鉛−ラクトフェリンは試験例２と同様にして作製した。また、対照として、ウシラクトフェリン（東洋紡）標品を１％になるように水に溶解したものを作製した。これらを、分画分子量１万の透析膜を用いて、超純水に対して５日間透析して、無機塩類を除去した。得られた溶液を凍結乾燥した後、さらに真空乾燥を行い、試料粉末を調製した。試料は鉄含量を測定するために発光分光分析機（ＩＣＰ） により、また炭素、窒素量をＣＨＮ 元素分析機により分析した。分析結果は、試料１から試料２の値を引いた差で示した。
【００２８】
【表３】
以上の結果から亜鉛−ラクトフェリンでは通常のラクトフェリンと比較して、亜鉛が多く結合していることがわかる。また、炭素数も通常のラクトフェリンよりも増加していることが確認できる。本試験例の場合、炭酸およびまたは重炭酸以外には炭素源となるものがないため、炭素数の増加は炭酸およびまたは重炭酸によるものとわかる。このことから、亜鉛−ラクトフェリンではラクトフェリン、亜鉛、炭酸およびまたは重炭酸が存在することがわかった。
【００３０】
【試験例４】
塩濃度の低い領域では、通常のラクトフェリンでも耐熱性を有することが知られている ［特開平４−８２６９号公報］ 。本試験例では、次の亜鉛−ラクトフェリンの試料Ａ〜Ｃを調製し、その耐熱性を調べた。その結果、本発明の亜鉛−ラクトフェリンは塩濃度の高い領域でも耐熱性を有することが判明した。
試料Ａ：試験例１と同様に調製した。
試料Ｂ：試料Ａを分子量分画１０，０００カットの限外濾過膜（アドバンテック社）で脱塩、濃縮し、ラクトフェリンとして ２５０マイクロモル／リットルとなるよう超純水で希釈した。なお、この時の電気伝導度は ０．２ミリジーメンス／センチメートルであった。
試料Ｃ：試料Ｂを模擬緩衝液（ｐＨ ７．０）で４倍に希釈し、さらに塩濃度を高めるために３０ミリモル／リットルとなるよう食塩を添加した。
これらの各試料をネジ口付き試験管に密封した後、９０℃で１０分間加熱し、ラクトフェリンの沈澱生成の有無を目視で判定した。そして、沈澱生成が認められないものを０、沈澱生成がやや認められるものを１、沈澱生成が多いものを２とした。その結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、塩濃度が低い領域においては勿論、塩濃度が高い領域においても耐熱性を有することが判る。
【００３３】
【試験例５】
本試験例では、ラクトフェリンを対照として、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを試験例１と同様に調製し、保存安定性を調べた。なお、保存安定性を試験するに際しては、電気伝導度を５０ミリジーメンスとなるよう食塩で調整して行った。遠心処理した各試料を密封し、９０℃で１０分間加熱した後、３７℃で保存し、保存１ヵ月後、沈澱生成の有無を目視で判定した。そして、沈澱生成が認められないものを０、沈澱生成がやや認められるものを１、沈澱生成が多いものを２とした。その結果を表５に示す。
【００３４】
【表５】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、９０℃で１０分間の熱ストレスを与えた後も、常温で高い保存安定性を有していることが判る。したがって、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを配合した飲食品を製造するに際し、加熱殺菌等の製造工程に特に制限を設ける必要はない。例えば、加熱殺菌については、通常実施されている工程に従って処理すれば良く、６５℃で３０分間加熱する低温殺菌や １２０℃で２〜３秒間の加熱、 １４０〜 １５０℃で３〜５秒間の加熱、あるいはレトルト殺菌も可能である。また、凍結乾燥のみでなく、噴霧乾燥で亜鉛−ラクトフェリン粉末を製造することができる。そして、これらの亜鉛−ラクトフェリンは亜鉛が含まれているので、亜鉛欠乏症を起こし易い、乳児や高齢者等の飲食品、医薬品、動物用飼料等の素材として特に有用である。
【００３６】
【試験例６】
本試験例では、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの酸化安定性を調べた。
試験例１で調製した亜鉛−ラクトフェリンの凍結乾燥粉末を魚油６ｇに添加し、ランシマット（メトローム社） 装置により温度８０℃で強制劣化試験を行った。また、対照として塩化亜鉛を魚油６ｇに添加した試料についても同様に試験した。なお、亜鉛−ラクトフェリンの凍結乾燥粉末および塩化亜鉛は、ウルトラディスパーサー（ヤマト社） で魚油に分散させた。表６に各試料の組成を示す。
【００３７】
【表６】
本試験例では、魚油の劣化度を酸化誘導期の長さ（時間） で表した。その結果を表７に示す。
【表７】
塩化亜鉛を魚油に添加した試料では、試験開始直後から激しい魚油の劣化が認められた。一方、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを魚油に添加した試料では、亜鉛を添加しているにも係わらず、亜鉛無添加の試料と酸化誘導期は変わらなかった。したがって、亜鉛−ラクトフェリンの形態で亜鉛を添加することにより、亜鉛に起因する魚油の劣化を完全に抑制できることが判る。
【００４０】
【試験例７】
本試験例では、試験例１で調製した亜鉛−ラクトフェリンの噴霧乾燥粉末を大豆油６ｇに添加し、ランシマット（メトローム社） 装置により温度 １２０℃で強制劣化試験を行った。また、対照として塩化亜鉛を大豆油６ｇに添加した試料についても同様に試験した。なお、亜鉛−ラクトフェリンの噴霧乾燥粉末および塩化亜鉛は、ウルトラディスパーサー（ヤマト社） で大豆油に分散させた。表８に各試料の組成を示す。
【００４１】
【表８】
本試験例でも、魚油の劣化度を酸化誘導期の長さ（時間） で表した。その結果を表９に示す。
【表９】
塩化亜鉛を大豆油に添加した試料では、試験開始直後から激しい大豆油の劣化が認められた。一方、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを大豆油に添加した試料では、亜鉛を添加しているにも係わらず、亜鉛無添加の試料と酸化誘導期は変わらなかった。したがって、亜鉛−ラクトフェリンの形態で亜鉛を添加することにより、亜鉛に起因する大豆油の劣化を完全に抑制できることが判る。このように、食用油脂の種類に係わらず亜鉛に起因する油脂の劣化を完全に抑制できる。
さらに、魚油および大豆油の同様の試料について４０℃オーブン保存試験を行った。すなわち、経時的にサンプリングし、過酸化物価（ＰＯＶ）を測定したが、ランシマット試験と同様の傾向が見られた。本発明の亜鉛−ラクトフェリンによる油脂劣化の抑制は、あらゆる温度域で見られることが判る。
【００４４】
【発明の実施の形態】
本発明のラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛が３原子以上結合している亜鉛−ラクトフェリン、あるいは、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛３原子以上が、炭酸および／または重炭酸 １．５分子以上を介して結合している亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物、亜鉛、炭酸および／または重炭酸を混合することにより行うが、この反応については溶液中で行う必要がある。ただし、使用するラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物、あるいは亜鉛のいずれか一方が固体状態であっても良い。また、反応溶液中の炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンのモル濃度を高く保つために、予め溶解しきれない量の炭酸塩および／または重炭酸塩を溶液中に含有させておいてもよいし、反応途中の溶液中に、炭酸塩および／または重炭酸塩、および／または、炭酸溶液および／または重炭酸溶液を添加してもよい。
【００４５】
そして、ラクトフェリン類と結合させるために添加する亜鉛の量は、ラクトフェリン類１モルに対し、亜鉛イオンとして３モル以上、好ましくは３０モル以上、より好ましくは６０モル以上であり、上限は ２００モルである。また、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度が低いとラクトフェリン類と亜鉛との結合が充分に行われないので、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度を亜鉛イオンのモル濃度に対し少なくとも２倍以上、好ましくは５倍以上とする必要がある。
【００４６】
さらに、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、上記の原材料に加え、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、塩酸、クエン酸、乳酸等をｐＨ調整剤として使用することができるし、また、糖質、蛋白質、脂肪等の物質が含まれていても構わない。
【００４７】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを飲食品あるいは飼料添加物として用いるときは、これらの水溶液、粉末単独、あるいは担体、増量剤その他の公知の添加物と混合したものを用いてもよい。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンの使用に際し、配合量等に特に制限はなく、物理的に可能な量を飲食品および飼料等に配合することができる。また、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを油脂や油脂を含む飲食品、飼料等に直接配合しても問題はない。しかし、亜鉛−ラクトフェリンの油脂への分散性を考慮すると、亜鉛−ラクトフェリンの配合量は、好ましくは油脂１ｋｇに対し１００ｇ以下が適当である。さらに、アスコルビン酸等の水溶性の酸化され易い物質を含む飲食品、飼料等に本発明の亜鉛−ラクトフェリンを直接配合してもよい。なお、飲食品、飼料等を製造するに際し、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを配合する時期については特に制限はなく、適宜、製造工程中に配合すればよい。
【００４８】
次に、実施例を示し、本発明を詳しく説明する。
【実施例１】
ラクトフェリン（ＤＯＭＯ社製）を１０マイクロモル含む水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして １．５ミリモル含む水溶液（Ｂ溶液）１リットルを調製した後、Ａ溶液にＢ溶液を加え、ラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液を分子量 ５，０００カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮し、さらに、亜鉛濃度が１３ｍｇ／１００ｍｌとなるよう希釈した。そして、この亜鉛−ラクトフェリン溶液の官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００４９】
【実施例２】
重炭酸ナトリウムを １．２モルとラクトフェリン（ＤＯＭＯ社製）を１０マイクロモル含む水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして １．５ミリモル含む水溶液（Ｂ溶液）１リットルを調製した後、Ａ溶液にＢ溶液を加え、ラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液を分子量 ５，０００カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮し、さらに模擬緩衝液（ｐＨ ８．９）で亜鉛濃度が２６ｍｇ／１００ｍｌとなるよう希釈した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。さらに、官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００５０】
【実施例３】
ウシラクトフェリン ９０ｇと塩化亜鉛６水和物 ５２ｇを１０リットルの水に溶解し、撹拌機で撹拌しながら重炭酸ナトリウム５ｇを添加し、亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液から重炭酸ナトリウムを除去するために分子量 ５，０００カットの限外濾過膜（ミリポア社製） で脱塩および濃縮し、脱イオン水を加えて容量を１０リットルとした。そして、この亜鉛−ラクトフェリン溶液（溶液１）中の亜鉛量および濃縮を開始した直後の透過液（溶液２）中の亜鉛量を誘導結合プラズマ発光分光分析器（ＩＣＰ）で測定したところ、溶液１中の亜鉛量は９２ｍｇ／１００ｍｌであり、溶液２中の亜鉛量は ０．１ｍｇ以下／１００ｍｌであった。
【００５１】
【実施例４】
硫酸亜鉛を亜鉛イオンとして １．５ミリモル含む溶液（Ａ溶液） ０．２リットル、トランスフェリン（アポ型、高純度、牛血漿製、和光純薬工業）を１０マイクロモル含む溶液（Ｂ溶液） ０．８リットルを調製した後、Ａ溶液とＢ溶液を混合し、トランスフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−トランスフェリン溶液を調製した。この亜鉛−トランスフェリン溶液を分子量 ５，０００カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮し、さらに、模擬緩衝液（ｐＨ ６．８）で亜鉛濃度が２６ｍｇ／２００ｍｌとなるよう希釈した。そして、この亜鉛−トランスフェリン溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。
【００５２】
【実施例５】
炭酸ナトリウムを ０．５モルおよび重炭酸カリウムを ０．７モル含む水溶液１リットルを酢酸でｐＨ ８．３に調製し、Ａ溶液を調整し（Ａ溶液）、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして ０．７ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液） ０．２リットル、オボトランスフェリン（タイプＩＶ、粗卵白製、無亜鉛、シグマ社）１ｇの０．０１Ｎ 塩酸溶液にトリプシン（シグマ社） ２０ｍｇを添加し、３７℃で１時間加水分解したオボトランスフェリン分解物８００ｍｇ（オボトランスフェリン１０マイクロモルに相当する重量） を含む水溶液 ０．８リットル（Ｂ２溶液）を調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、このＢ１溶液とＢ２溶液の混合液をＡ溶液に加えてオボトランスフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−オボトランスフェリン溶液を調製した。この亜鉛−オボトランスフェリン溶液を分子量 ５００カットの透析膜で脱塩し、さらに、模擬緩衝液（ｐＨ ６．２）で亜鉛濃度が２６ｍｇ／２００ｍｌとなるよう希釈した。そして、この亜鉛−オボトランスフェリン溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。また、この亜鉛−オボトランスフェリン溶液中の亜鉛量をＩＣＰで測定したところ、オボトランスフェリン分解物８ｍｇ当たり、０．１１ｍｇの亜鉛が結合していることが判った。
【００５３】
【実施例６】
重炭酸ナトリウムを １．０モル含む水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして１ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液） ０．２リットル、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製）を１０マイクロモル含む水溶液（Ｂ２溶液） ０．８リットルを調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、このＢ１溶液とＢ２溶液の混合液をＡ溶液に加えてラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。なお、この亜鉛−ラクトフェリン溶液のｐＨを ８．５に維持するため、随時水酸化ナトリウムを添加した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液については脱塩せずに、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却した。なお、この状態で沈澱生成は全く認められなかった。さらに、この亜鉛−ラクトフェリン溶液を３７℃で１ヵ月保存し、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。
【００５４】
【実施例７】
炭酸ナトリウムを １．０モル含む水溶液１リットルを２Ｎ塩酸でｐＨ ８．０に調整した溶液（Ａ溶液）、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして１ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液） ０．２リットル、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製） を１０マイクロモル含む水溶液（Ｂ２溶液） ０．８リットルを調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、このＢ１溶液とＢ２溶液の混合液をＡ溶液に加えてラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液については脱塩せずに、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却した。なお、この状態で沈澱生成は全く認められなかった。さらに、この亜鉛−ラクトフェリン溶液を３７℃で１ヵ月保存し、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。また、官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００５５】
【実施例８】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリン溶液を亜鉛濃度が１０ｍｇ／２００ｍｌとなるよう生乳２０リットルに添加し、均質化した後、 １５０℃で４秒間滅菌処理し、直ちに４℃に冷却して ２５０ｍｌ容紙容器に無菌充填した。そして、３７℃で３ヶ月保存した後、この亜鉛−ラクトフェリン添加乳を遠心分離して沈澱生成の有無を調べたところ、沈澱生成は全く認められなかった。また、大腸菌数および一般細菌数共に０であった。さらに、対照として生乳を同様の条件で滅菌し、保存したものを用い官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味やその他の風味異常を感じたものはいなかった。
【００５６】
【実施例９】
ラクトフェリン（ＤＭＶ社製）１ｇを ０．２モル酢酸緩衝液（ｐＨ ４）に溶解し、ペプシン（シグマ社）２６，０００ユニットを添加して３７℃で２時間反応させた後、水酸化ナトリウムでｐＨ ７．５とした。次に、この溶液にトリプシン（シグマ社） ２００，０００ユニットを添加して３７℃で１０時間反応させ、ラクトフェリン分解物を得た。なお、電気泳動で確認したところ、このラクトフェリン分解物の分子量は５０，０００および３０，０００であった。
重炭酸ナトリウムを １．３モル含む溶解していない塩が沈澱している水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして １．２ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液） ０．２リットル、上記のラクトフェリン分解物を分解前のラクトフェリンとして１０マイクロモル含む溶液（Ｂ２溶液） ０．８リットルを調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、良く撹拌しながらＡ溶液にＢ１溶液とＢ２溶液の混合液を加えてラクトフェリン分解物に亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン分解物溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン分解物溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。さらに、官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００５７】
【実施例１０】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、常法に従って以下の配合の亜鉛およびビタミンＥ含有 １５０ｍｇカプセルを打ち抜き法により製造した。
配合比
カプセル用溶液
ゼラチン ４５％
グリセリン ２２％
水 ３３％
原料組成
ビタミンＥ ３５％ （２００ＩＵ）
亜鉛−ラクトフェリン ２０％
小麦胚芽油 ４０％
乳化剤 ５％
このカプセル剤は、健康食品として用いられる。
このカプセル剤については、３７℃で３ヶ月保存した後も油脂の異臭や亜鉛の金属味は全くなかった。
【００５８】
【実施例１１】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、常法に従って以下の配合の亜鉛およびβ−カロチン含有 ２００ｍｇカプセルを打ち抜き法により製造した。
配合比
カプセル用溶液
ゼラチン ４５％
グリセリン ２２％
水 ３３％
原料組成
β−カロチン ３５％ （２，０００ＩＵ）
亜鉛−ラクトフェリン ８％
小麦胚芽油 ５３％
乳化剤 ４％
このカプセル剤については、３７℃で３カ月保存した後も油脂の異臭や亜鉛の金属味は全くなかった。
【００５９】
【実施例１２】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、亜鉛添加マーガリンを製造した。すなわち、融点４２℃の大豆硬化油１０％、大豆白絞油４０％およびパーム油２５％からなる油脂に乳化剤としてグリセリン脂肪酸エステル（エステル価６０）０．５％を添加した油相に、脱脂粉乳１％、亜鉛−ラクトフェリン ０．５％（亜鉛０．０７％相当量） 、乳酸 ０．１％および水２３．３％を添加し、油中水型乳化物を得た。そして、この油中水型乳化物をマーガリン製造機で冷却、固化および練圧することによりマーガリンを製造した。また、比較例として、亜鉛−ラクトフェリンの代わりに硫酸亜鉛０．３５％および水２３．５％で同様にマーガリンを製造した。これらのマーガリンについて１５℃で保存試験を行い、製造直後および保存６カ月の過酸化物価（ＰＯＶ）を測定した。その結果を表１０に示す。
表に示されるように、亜鉛−ラクトフェリンを添加したマーガリンの劣化は完全に抑制されていることが判る。
【００６０】
【表１０】
【実施例１３】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、亜鉛添加マヨネーズを製造した。すなわち、卵黄 １５ｇ、サフラワー油９０ｍｌ、食酢１５ｍｌ、食塩２ｇ、からし０．５ｇ、コショウ０．５ｇ、砂糖１．５ｇおよび亜鉛−ラクトフェリン ０．５％を材料としてマヨネーズを製造した。また、比較例として、亜鉛−ラクトフェリンの代わりに硫酸亜鉛を添加したマヨネーズを製造した。これらのマヨネーズについて１５℃で保存試験を行い、製造直後および保存６カ月のＰＯＶを測定した。その結果を表１１に示す。
亜鉛−ラクトフェリンを添加したマヨネーズの劣化は完全に抑制されていることが判る。
【００６２】
【表１１】
【発明の効果】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、亜鉛独特の金属味が消失し、また、亜鉛に起因する酸化作用が抑制された状態で、飲食品や飼料に亜鉛強化のために添加することができる。また、簡単な方法で亜鉛を多量に含む状態で調製することができ工業的に有利である。従って、亜鉛強化飲食品あるいは飼料添加物として有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to zinc-lactoferrin in which lactoferrins or lactoferrin degradation products and zinc are bound. The present invention also relates to a method for producing zinc-lactoferrin. Furthermore, the present invention relates to a zinc-enriched food or drink or feed additive containing zinc-lactoferrin as an active ingredient, or a food or drink and feed containing such zinc-lactoferrin.
The zinc-lactoferrin of the present invention has lost its metallic taste unique to zinc, and the oxidation action caused by zinc is also suppressed, so it is useful as a material for adding zinc to foods and drinks, feeds, etc. is there.
[0002]
[Prior art]
Zinc plays an important role in the activity expression of many enzymes such as carbonate dehydrogenase, carboxypeptidase, alkaline phosphatase, alcohol dehydrogenase, lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase, RNA polymerase, DNA polymerase and the like.
This zinc is known as a human trace essential element, and its nutritional requirement is said to be 15 mg / day [National Research Council, Recommended Dietary Allowances, 1989, National Academy Press, Washington, D.]. C. ]. Zinc deficiency is rarely recognized in adults, but it was known that the cause of anemia, sexual dysfunction, skin disorders, etc. in Iran was zinc deficiency in the 1950s, and 1960s It is known that the cause of skin disorders in Egypt was zinc deficiency [Prasad, A. et al. S. , Fed. Proc. , Vol. 43, pp. 2829-2834, 1984].
In children, anorexia and sensory disturbance are known as mild deficiency of zinc [Hambidge, K. et al. M.M. et al. , Pediat. Res. , Vol. 6, pp. 868-874, 1972]. In particular, zinc is important for newborns, and it is known that colostrum contains about four times as much zinc as regular milk [Li Jie Jin et al., Journal of the Japanese Society of Nutrition and Food, vol. 42, pp. 365-368, 1989], it has also been reported that in artificial milk, the absorbability of zinc is poor and it is necessary to positively add zinc [Sandstorm, B. et al. et al. , Am. J. et al. Dis. Child. , Vol. 137, pp. 726-729, 1983].
[0003]
In addition, there is a report that the absorption efficiency of zinc decreases with aging [King, J. et al. C. et al. , Zinc in human biology, pp. 335-350, 1989, Springer-Verlag, London], the potential demand in the elderly is also considered.
Furthermore, recently, the resistance to radiation decreases due to the lack of zinc, the presence of zinc in insulin leads to abnormal sugar metabolism due to the lack of zinc, and the administration of zinc is effective in the treatment of skin disorders In addition, the loss of zinc from the body due to burns is great [Nishi Hamada Mamoru, Food Science, vol. 209, pp. 24-34, 1995], and active intake of zinc is also considered as a future problem.
[0004]
In addition, in the case of Japanese people, it is said that zinc is mainly taken from cereals. However, in recent years, since the intake of cereals has decreased, there is a concern about zinc shortages.
On the other hand, zinc is known to promote the deterioration of fats and oils, and when it is simply added to foods, formation of lipid peroxide becomes a problem. In particular, fats and oils in foods are one of the most important factors that determine the texture of the food, such as smoothing the mouthfeel of the ingredients, and also bring out the deliciousness of the food in terms of flavor. The stability cannot be evaluated. Therefore, deterioration of fats and oils by adding zinc becomes a big problem.
[0005]
Fats and oils deteriorate during storage and also during heat treatment. Deteriorated fats and oils not only have a worse flavor and a strange odor, but their intake also causes many diseases. Deteriorated fats and oils have no commercial value, and measures to prevent deterioration of fats and oils are indispensable for the use of fats and oils. Factors that cause peroxide generation due to deterioration of fats and oils include the presence of light, air, and minerals. Among them, heavy metals such as zinc, copper, iron, manganese and nickel particularly promote the oxidation of fats and oils. Therefore, the mineral removal process is considered to be important in the oil refining technology. Among the metals contained in food, copper is the most accelerating oxidation, followed by zinc and iron.
Thus, it is thought that zinc can be replenished by strengthening zinc in foods and drinks, feeds, etc., but at present, deterioration of foods and drinks, feeds, etc. due to zinc cannot be prevented or Addition of zinc to foods and drinks, feeds, etc. is difficult due to the occurrence of a unique metal odor derived from zinc.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to improve the disadvantages of zinc when added to such foods and drinks or feeds. That is, the present invention has no unique metal odor derived from zinc, is stable for a long period of time, has heat resistance, and further prevents deterioration of food, drink, feed, etc. that occurs when added to food, drink, feed, etc. It is an object to provide zinc-lactoferrin having a function of
Another object of the present invention is to provide a method for producing such zinc-lactoferrin.
Furthermore, this invention makes it a subject to provide the food / beverage products or feed additive which uses such zinc- lactoferrin as an active ingredient, the food / beverage products and feed which mix | blended these.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
To date, only zinc lactate bound to one lactoferrin molecule has been reported to bind lactoferrins to zinc [Shingh, H. et al. , Flynn, A .; and Fox, P.A. F. , J. et al. Dairy Res. , Vol. 56, pp. 235-248, 1989]. Moreover, the only thing which reported the coupling | bonding of transferrin and zinc is that in which zinc of 2 atoms or less binds to one transferrin molecule [Aisen, P. et al. and Harris, D.A. C. "Iron Carriers and Iron Proteins", pp. 239-371, V.E. C. H. , New York, 1989]. That is, it has not yet been known that zinc of 3 atoms or more binds to one molecule of lactoferrin.
[0008]
The inventors of the present invention have made extensive studies on increasing the amount of zinc bound to lactoferrins. By utilizing carbonate ions and / or bicarbonate ions, metal binding sites of lactoferrins that are generally known are known. It has been found that a much larger amount of zinc than the number of can be bound. That is, when a solution containing lactoferrin and a solution containing zinc are mixed, it is found that zinc-lactoferrin is formed by combining lactoferrins and zinc, and i) carbonic acid, ii) bicarbonate, or iii) carbonic acid. And a solution containing zinc and iv) a solution containing zinc and v) a solution containing lactoferrin form a zinc-lactoferrin in which the lactoferrin and zinc are bound via carbonic acid and / or bicarbonate. I found out. And this zinc-lactoferrin contains a lot of zinc, has no metal odor unique to zinc, is stable for a long time, has heat resistance, and can prevent deterioration of food, drink, feed, etc. due to zinc. I found.
[0009]
Further, the present inventors have found that similar zinc-lactoferrin can be obtained by using lactoferrin degradation products decomposed by proteolytic enzymes such as trypsin, pepsin, chymotrypsin, etc., or by acid or alkali instead of lactoferrin. It came to be completed.
[0010]
The present invention is zinc-lactoferrin in which such lactoferrins or lactoferrin degradation products and zinc are bound.
In the zinc-lactoferrin of the present invention, 3 atoms or more of zinc are bound per molecule of lactoferrin or lactoferrin degradation product. In the zinc-lactoferrin of the present invention, 3 or more atoms of zinc per molecule of lactoferrin or lactoferrin degradation product are bonded via 1.5 or more molecules of carbonic acid and / or bicarbonate. This zinc-lactoferrin has the property that the solution does not precipitate at room temperature for at least one month and does not precipitate even when heated. Don't make it happen.
[0011]
In producing the zinc-lactoferrin of the present invention, it is necessary to react in a solution, but either lactoferrins or lactoferrin degradation products used or zinc may be in a solid state. Further, in order to keep the molar concentration of carbonate ion and / or bicarbonate ion in the reaction solution high, an amount of carbonate and / or bicarbonate that cannot be dissolved in advance may be contained in the solution. Carbonate and / or bicarbonate and / or carbonate solution and / or bicarbonate solution may be added to the solution during the reaction. Furthermore, you may use hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc. as a pH adjuster.
[0012]
Examples of the lactoferrin used in the present invention include lactoferrin separated from the secretion of milk from mammals such as humans and cows. Furthermore, transferrin isolated from blood, organs, etc., ovotransferrin isolated from eggs, etc. can be used in the same manner as lactoferrin. Regarding these lactoferrins, several methods for preparing them in large quantities are already known, and lactoferrins prepared by any method may be used. Moreover, the lactoferrins do not need to be completely isolated and may contain other components. Furthermore, it is also possible to use lactoferrins produced from microorganisms, animal cells, transgenic animals, etc. by genetic manipulation. A lactoferrin degradation product obtained by degrading lactoferrin with a protease such as trypsin, pepsin or chymotrypsin, or with acid or alkali can also be used.
[0013]
Examples of zinc that can be used in the present invention include zinc chloride, zinc sulfate, zinc carbonate, and zinc gluconate. And the quantity of zinc added in order to couple | bond with lactoferrin is 3 mol or more as a zinc ion with respect to 1 mol of lactoferrin, Preferably it is 30 mol or more, More preferably, it is 60 mol or more, and an upper limit is 300 mol. It is. If the amount of zinc added to bind to lactoferrin exceeds 300 mol, precipitation occurs during production and storage, or lactoferrin and zinc do not react completely, and zinc is in an ionic state in the solution. It is not preferable because it remains on the surface.
[0014]
Furthermore, as carbonic acid or bicarbonate that can be used in the present invention, a solution in which salts such as carbonated water, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, sodium carbonate, calcium carbonate are dissolved, or a mixture thereof is used. A solution etc. can be illustrated. In order to produce heat-resistant zinc-lactoferrin, if the concentration of carbonic acid and / or bicarbonate solution is low, binding of lactoferrins and zinc is not sufficiently performed, so the concentration of carbonic acid and / or bicarbonate solution is low. Must be at least 2 times, preferably 5 times or more the molar concentration of zinc ions.
In producing the zinc-lactoferrin of the present invention, sodium hydroxide, ammonia, potassium hydroxide, hydrochloric acid, citric acid, lactic acid and the like can be used as a pH adjuster in addition to the above raw materials, and sugar Substances such as quality, protein and fat may be included. The reaction is performed at pH 7-9. When the above raw materials are added, the pH is usually 7-9, so it is not necessary to use a pH adjuster. However, if the pH range is greatly deviated, the pH adjuster can be used to bring the pH range. Adjusted.
[0015]
When the zinc-lactoferrin of the present invention is blended with food or drink or feed, the blending amount is not particularly limited, and physically possible amounts can be blended with food and drink or feed. Moreover, since the deterioration of this food is not seen even if it mix | blends about 50-300g with 1 kg of foodstuffs containing fats and oils of the zinc- lactoferrin of this invention, the zinc- There is no problem even if lactoferrin is blended directly. Therefore, vegetable oil such as soybean oil, rapeseed oil, cottonseed oil, sesame oil, safflower oil, olive oil, corn oil, animal oil such as fish oil, milk fat, pork fat, and fat-soluble vitamins such as vitamin A, vitamin E, vitamin D, etc. It is also possible to blend directly into a substance that is easily oxidized. However, considering the dispersibility of the zinc-lactoferrin of the present invention in fats and oils, the blending amount of the zinc-lactoferrin of the present invention is preferably 100 g or less per 1 kg of fats and oils. Of course, it is necessary to determine the blending amount of the zinc-lactoferrin of the present invention appropriately from a nutritional point of view so as to avoid excessive intake of zinc. The standard value in the US is that the daily requirement for zinc is 15 mg for adults. Therefore, when the zinc-lactoferrin of the present invention is added to food and drink, the daily intake of zinc is 15 mg. It can be said that it is desirable to mix | blend so that it may become the following. Furthermore, there is no problem even if the zinc-lactoferrin of the present invention is directly blended with foods and drinks, feeds and the like containing water-soluble easily oxidizable substances such as ascorbic acid. In addition, when manufacturing food-drinks, feed, etc., there is no restriction | limiting in particular about the time which mix | blends the zinc-lactoferrin of this invention, What is necessary is just to mix | blend in the suitable step of a manufacturing process.
[0016]
When used as a food additive or a feed additive, such zinc-lactoferrin may be used alone, or may be used by mixing with necessary carriers, extenders, other food additives, etc. .
[0017]
Next, a test example is shown and the characteristic of the zinc- lactoferrin of this invention is demonstrated.
[Test Example 1]
In this test example, the influence of the ratio of bicarbonate and zinc in zinc-lactoferrin on the heat resistance is shown.
(A solution) 1 liter of aqueous solution containing sodium bicarbonate adjusted to each molar concentration
(B1 solution) 0.2 liter of aqueous solution containing 100 mmol of zinc chloride
(B2 solution) 0.8 liter of aqueous solution containing 1 mmol of lactoferrin
After the B1 solution and the B2 solution were mixed to prepare the B solution, the B solution was added to the A solution and stirred to prepare a zinc-lactoferrin solution. Then, a buffer solution (hereinafter referred to as a simulated buffer solution) imitating a liquid food having a pH of 7.5 containing 0.05 mol / liter imidazole and 0.15 mol / liter sodium chloride, and having a zinc concentration of 3.6 mmol / These solutions were diluted to liters and heated at 90 ° C. for 10 minutes to observe the presence or absence of precipitation.
[0018]
[Table 1]
As a result, heat resistance was recognized when bicarbonate / zinc was 0.5 or more.
Conventionally, it is known that iron saturated lactoferrin is produced when lactoferrin, iron and bicarbonate are mixed. Lactoferrin is composed of two regions, a region called N rope and a similar region called C rope. And iron binds to each of the two regions of the lactoferrin by one atom. That is, in the N rope, one iron ion is bonded to four amino acid residues of Asp60, Tyr192, Tyr192, and His253, and one bicarbonate ion is further bonded to the iron ion. The iron binding site on the C rope is Asp395, Tyr435, Tyr528, His597 [B. F. Anderson et al. , J. et al. Mol. Biol. , Vol. 209, pp. 711-734, 1989]. Therefore, in general, iron saturated lactoferrin has two moles of iron ions and two moles of bicarbonate ions per mole of lactoferrin. This iron-saturated lactoferrin is slightly more stable than lactoferrin to which iron is not bound, but precipitates when heated above 65 ° C. In order to solve this drawback, the present inventors have proposed an iron-lactoferrin conjugate [Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-239900] or an iron-lactoferrin complex [Japanese Patent Application No. 7-86023]. No.] is being developed.
[0020]
[Test Example 2]
This test example shows that zinc-lactoferrin can bind zinc of 3 atoms or more per molecule of lactoferrin. Samples 1 to 4 were prepared and tested as follows.
Sample 1: A zinc chloride aqueous solution and a lactoferrin aqueous solution were mixed so that the final concentration of zinc was 0.99 mmol / liter and the final concentration of lactoferrin was 13.2 micromol / liter. Zinc-lactoferrin bound to was prepared.
[0021]
Sample 2: zinc in which zinc and lactoferrin are bound via bicarbonate by the method shown in Test Example 1 so that the final concentration of zinc is 0.99 mmol / liter and the final concentration of lactoferrin is 13.2 micromol / liter -Lactoferrin was prepared.
[0022]
Sample 3: A lactoferrin degradation product obtained by degrading lactoferrin with trypsin (Sigma), that is, 1% by weight of trypsin was added to lactoferrin and hydrolyzed in a phosphate buffer (pH 7.5) at 37 ° C. for 3 hours. Thereafter, a lactoferrin degradation product having a molecular weight of 1,000 or more obtained by dialysis with a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 1,000 is used, and the final concentration of zinc is 0.99 mmol / liter and the lactoferrin degradation product in terms of lactoferrin. A zinc-lactoferrin degradation product in which zinc and a lactoferrin degradation product were bound via bicarbonate was prepared by the method shown in Test Example 1 so that the final concentration of was 13.2 micromol / liter.
[0023]
Sample 4: An aqueous zinc chloride solution was prepared so that the final concentration of zinc was 1.98 mmol / liter (control).
[0024]
Add 1 ml of each sample 1-4 to an ultrafiltration membrane (Millipore) with a molecular weight of 1,000 and desalinate. When the amount of retentate reaches 0.2 ml, add 1 ml of water to desalt. Repeatedly 6 ml in total. The zinc content of the thus obtained retentate and permeate was measured with an emission spectrophotometer (ICP). Moreover, the retentate zinc residual rate was calculated | required by following Formula.
Retentate zinc remaining rate (%) = {total amount of retentate zinc ÷ (total amount of retentate zinc + total amount of permeate zinc)} × 100
Furthermore, each sample was treated at 90 ° C. for 10 minutes, and heat resistance was confirmed by observing the presence or absence of subsequent precipitation. The results are shown in Table 2.
[0025]
[Table 2]
As can be seen from this table, in Sample 4, almost all of the zinc was transferred to the permeate, and it was found that the zinc used permeated the membrane having a molecular weight of 1,000 cut. On the other hand, in Sample 2, almost all zinc remained in the retentate, and it was found that zinc was bound to lactoferrin and did not permeate the membrane having a molecular weight of 1,000 cut. Moreover, since zinc is hardly bound in Sample 1, it can be seen that the method of preparing Sample 2 must be used to bind lactoferrins and zinc.
[0027]
[Test Example 3]
Elemental analysis of zinc-lactoferrin
Zinc-lactoferrin was prepared in the same manner as in Test Example 2. As a control, a bovine lactoferrin (Toyobo) preparation dissolved in water at 1% was prepared. These were dialyzed against ultrapure water for 5 days using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 10,000 to remove inorganic salts. The obtained solution was freeze-dried and then vacuum-dried to prepare a sample powder. Samples were analyzed with an emission spectrophotometer (ICP) to measure the iron content, and with a CHN elemental analyzer for carbon and nitrogen content. The analysis result is shown by the difference obtained by subtracting the value of sample 2 from sample 1.
[0028]
[Table 3]
From the above results, it can be seen that zinc-lactoferrin is bound more in zinc than ordinary lactoferrin. Moreover, it can confirm that carbon number is also increasing rather than normal lactoferrin. In the case of this test example, since there is no carbon source other than carbonic acid and / or bicarbonate, it can be understood that the increase in the carbon number is due to carbonic acid and / or bicarbonate. From this, it was found that zinc-lactoferrin contains lactoferrin, zinc, carbonic acid and / or bicarbonate.
[0030]
[Test Example 4]
It is known that even normal lactoferrin has heat resistance in a region where the salt concentration is low [JP-A-4-8269]. In this test example, the following samples A to C of zinc-lactoferrin were prepared and their heat resistance was examined. As a result, it was found that the zinc-lactoferrin of the present invention has heat resistance even in a region where the salt concentration is high.
Sample A: prepared in the same manner as in Test Example 1.
Sample B: Sample A was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight fraction of 10,000 cut (Advantech), and diluted with ultrapure water to a lactoferrin concentration of 250 micromol / liter. The electrical conductivity at this time was 0.2 millisiemens / cm.
Sample C: Sample B was diluted 4-fold with a simulated buffer (pH 7.0), and sodium chloride was added to a concentration of 30 mmol / liter to further increase the salt concentration.
Each of these samples was sealed in a test tube with a screw cap and then heated at 90 ° C. for 10 minutes to visually determine the presence or absence of lactoferrin precipitation. And, the case where precipitation was not recognized was 0, the case where precipitation was slightly recognized was 1, and the case where precipitation was high was 2. The results are shown in Table 4.
[0031]
[Table 4]
It can be seen that the zinc-lactoferrin of the present invention has heat resistance not only in a region where the salt concentration is low but also in a region where the salt concentration is high.
[0033]
[Test Example 5]
In this test example, using lactoferrin as a control, the zinc-lactoferrin of the present invention was prepared in the same manner as in Test Example 1, and the storage stability was examined. In testing the storage stability, the electrical conductivity was adjusted with sodium chloride so as to be 50 millisiemens. Each of the centrifuged samples was sealed, heated at 90 ° C. for 10 minutes, and stored at 37 ° C. After one month of storage, the presence or absence of precipitation was visually determined. And, the case where precipitation was not recognized was 0, the case where precipitation was slightly recognized was 1, and the case where precipitation was high was 2. The results are shown in Table 5.
[0034]
[Table 5]
It can be seen that the zinc-lactoferrin of the present invention has high storage stability at room temperature even after being subjected to heat stress at 90 ° C. for 10 minutes. Therefore, when manufacturing the food / beverage products which mix | blended the zinc-lactoferrin of this invention, it is not necessary to provide a restriction | limiting in particular in manufacturing processes, such as heat sterilization. For example, heat sterilization may be carried out according to the usual process, pasteurization heating at 65 ° C for 30 minutes, heating at 120 ° C for 2-3 seconds, heating at 140-150 ° C for 3-5 seconds Alternatively, retort sterilization is possible. Moreover, zinc-lactoferrin powder can be produced not only by freeze-drying but also by spray-drying. And since these zinc-lactoferrins contain zinc, they are particularly useful as raw materials for foods and drinks for infants and the elderly, pharmaceuticals, animal feeds, etc., which are likely to cause zinc deficiency.
[0036]
[Test Example 6]
In this test example, the oxidation stability of the zinc-lactoferrin of the present invention was examined.
The freeze-dried powder of zinc-lactoferrin prepared in Test Example 1 was added to 6 g of fish oil, and a forced deterioration test was performed at a temperature of 80 ° C. using a rancimat (Metrome) apparatus. As a control, a sample in which zinc chloride was added to 6 g of fish oil was similarly tested. The freeze-dried zinc-lactoferrin powder and zinc chloride were dispersed in fish oil with an ultradisperser (Yamato Co.). Table 6 shows the composition of each sample.
[0037]
[Table 6]
In this test example, the degree of deterioration of fish oil was expressed as the length (time) of the oxidation induction period. The results are shown in Table 7.
[Table 7]
In the sample in which zinc chloride was added to fish oil, severe fish oil deterioration was observed immediately after the start of the test. On the other hand, in the sample in which the zinc-lactoferrin of the present invention was added to fish oil, the oxidation induction period was not different from that in the sample without addition of zinc, although zinc was added. Therefore, it turns out that degradation of the fish oil resulting from zinc can be suppressed completely by adding zinc with the form of zinc- lactoferrin.
[0040]
[Test Example 7]
In this test example, the zinc-lactoferrin spray-dried powder prepared in Test Example 1 was added to 6 g of soybean oil, and a forced deterioration test was performed at a temperature of 120 ° C. using a Lansimat (Metrohm) apparatus. Further, as a control, a sample in which zinc chloride was added to 6 g of soybean oil was similarly tested. The zinc-lactoferrin spray-dried powder and zinc chloride were dispersed in soybean oil with an ultradisperser (Yamato). Table 8 shows the composition of each sample.
[0041]
[Table 8]
Also in this test example, the degree of deterioration of fish oil was expressed by the length (time) of the oxidation induction period. The results are shown in Table 9.
[Table 9]
In the sample in which zinc chloride was added to soybean oil, severe deterioration of soybean oil was observed immediately after the start of the test. On the other hand, in the sample in which the zinc-lactoferrin of the present invention was added to soybean oil, the oxidation induction period was not different from that in the sample without addition of zinc, although zinc was added. Therefore, it turns out that degradation of soybean oil resulting from zinc can be completely suppressed by adding zinc in the form of zinc-lactoferrin. Thus, the deterioration of fats and oils due to zinc can be completely suppressed regardless of the type of edible fats and oils.
Furthermore, 40 degreeC oven preservation | save test was done about the same sample of fish oil and soybean oil. That is, sampling over time and measuring the peroxide value (POV) showed the same tendency as in the Rancimat test. It can be seen that the suppression of fat and oil degradation by the zinc-lactoferrin of the present invention is observed in all temperature ranges.
[0044]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Zinc-lactoferrin in which 3 atoms or more of zinc are bound per molecule of the lactoferrin or lactoferrin degradation product of the present invention, or 3 atoms or more of zinc per molecule of lactoferrin or lactoferrin degradation product is carbonic acid and / or bicarbonate. When producing zinc-lactoferrin bound via 1.5 or more molecules, it is carried out by mixing lactoferrins or lactoferrin degradation products, zinc, carbonic acid and / or bicarbonate. Need to do in. However, either lactoferrin or lactoferrin degradation product to be used, or zinc may be in a solid state. In order to keep the molar concentration of carbonate ions and / or bicarbonate ions in the reaction solution high, an amount of carbonate and / or bicarbonate that cannot be dissolved in advance may be contained in the solution. Carbonate and / or bicarbonate and / or carbonate solution and / or bicarbonate solution may be added to the solution during the reaction.
[0045]
The amount of zinc added for binding with lactoferrins is 3 mol or more, preferably 30 mol or more, more preferably 60 mol or more as zinc ions, with respect to 1 mol of lactoferrin, and the upper limit is 200 mol. is there. In addition, if the concentration of the carbonic acid and / or bicarbonate solution is low, the lactoferrins and zinc are not sufficiently bound, so the concentration of the carbonic acid and / or bicarbonate solution is at least twice the molar concentration of zinc ions. Preferably, it is necessary to be 5 times or more.
[0046]
Furthermore, in producing the zinc-lactoferrin of the present invention, sodium hydroxide, ammonia, potassium hydroxide, hydrochloric acid, citric acid, lactic acid and the like can be used as a pH adjuster in addition to the above raw materials. Substances such as carbohydrates, proteins and fats may be contained.
[0047]
When the zinc-lactoferrin of the present invention is used as a food or drink or feed additive, these aqueous solutions, powders alone, or those mixed with carriers, extenders and other known additives may be used.
When using the zinc-lactoferrin of the present invention, there is no particular limitation on the blending amount and the like, and physically possible amounts can be blended in foods and drinks and feeds. Moreover, there is no problem even if the zinc-lactoferrin of the present invention is directly blended with fats and oils, foods and drinks containing fats, feeds and the like. However, considering the dispersibility of zinc-lactoferrin in fats and oils, the blending amount of zinc-lactoferrin is preferably 100 g or less per 1 kg of fats and oils. Furthermore, you may mix | blend the zinc-lactoferrin of this invention directly with the food-drinks, feed, etc. containing water-soluble easily oxidized substances, such as ascorbic acid. In addition, when manufacturing food-drinks, feed, etc., there is no restriction | limiting in particular about the time which mix | blends the zinc-lactoferrin of this invention, What is necessary is just to mix | blend in a manufacturing process suitably.
[0048]
Next, an Example is shown and this invention is demonstrated in detail.
[Example 1]
After preparing 1 liter of an aqueous solution (solution A) containing 10 micromoles of lactoferrin (DOMO) and 1 liter of an aqueous solution (solution B) containing 1.5 mmol of zinc chloride as zinc ions, the solution B was added to the solution A, A zinc-lactoferrin solution in which zinc was bound to lactoferrin was prepared. This zinc-lactoferrin solution was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 5,000 cut, and further diluted to a zinc concentration of 13 mg / 100 ml. And when the sensory evaluation test of this zinc-lactoferrin solution was carried out, none of the 10 panelists felt a metallic taste.
[0049]
[Example 2]
After preparing 1 liter of an aqueous solution (solution A) containing 1.2 mol of sodium bicarbonate and 10 μmol of lactoferrin (manufactured by DOMO), and 1 liter of an aqueous solution (solution B) containing 1.5 mmol of zinc chloride as zinc ions The solution B was added to the solution A to prepare a zinc-lactoferrin solution in which zinc was bound to lactoferrin. This zinc-lactoferrin solution was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 5,000 cut, and further diluted with a simulated buffer (pH 8.9) to a zinc concentration of 26 mg / 100 ml. The zinc-lactoferrin solution was sealed in a test tube with a screw cap, heated at 90 ° C. for 10 minutes, naturally cooled to room temperature, and stored at 37 ° C. One month after storage, the presence or absence of precipitation was visually determined. No precipitation was observed. Furthermore, when a sensory evaluation test was conducted, none of the 10 panelists felt a metallic taste.
[0050]
[Example 3]
90 g of bovine lactoferrin and 52 g of zinc chloride hexahydrate were dissolved in 10 liters of water, and 5 g of sodium bicarbonate was added while stirring with a stirrer to prepare a zinc-lactoferrin solution. In order to remove sodium bicarbonate from this zinc-lactoferrin solution, it was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane (Millipore) having a molecular weight of 5,000 cut, and deionized water was added to make the volume 10 liters. Then, the amount of zinc in the zinc-lactoferrin solution (solution 1) and the amount of zinc in the permeate (solution 2) immediately after the start of concentration were measured with an inductively coupled plasma emission spectrometer (ICP). The amount of zinc in it was 92 mg / 100 ml, and the amount of zinc in Solution 2 was 0.1 mg or less / 100 ml.
[0051]
[Example 4]
Solution containing 1.5 millimole of zinc sulfate as zinc ions (solution A) 0.2 liter, solution containing transferrin (Apo-type, high purity, manufactured by Bovine Plasma, Wako Pure Chemical Industries) (solution B) 0. After preparing 8 liters, solution A and solution B were mixed to prepare a zinc-transferrin solution in which zinc was bound to transferrin. This zinc-transferrin solution was desalted and concentrated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight of 5,000 cut, and further diluted with a simulated buffer solution (pH 6.8) to a zinc concentration of 26 mg / 200 ml. The zinc-transferrin solution was sealed in a test tube with a screw cap, heated at 90 ° C. for 10 minutes, naturally cooled to room temperature, and stored at 37 ° C. One month after storage, the presence or absence of precipitation was visually determined. No precipitation was observed.
[0052]
[Example 5]
1 liter of an aqueous solution containing 0.5 mol of sodium carbonate and 0.7 mol of potassium bicarbonate was adjusted to pH 8.3 with acetic acid, solution A was prepared (solution A), and zinc chloride was used as zinc ions. Aqueous solution containing millimole (B1 solution) 0.2 liters, Ovotransferrin (type IV, crude egg white, zinc-free, Sigma) 1 g 0.01N hydrochloric acid solution 20 mg trypsin (Sigma) 20 mg was added, After preparing 0.8 liter (B2 solution) of an aqueous solution containing 800 mg of a hydrolyzed ovotransferrin degradation product (weight corresponding to 10 micromol of ovotransferrin), the B1 solution and the B2 solution were mixed. A mixed solution of the solution was added to the solution A to prepare a zinc-ovotransferrin solution in which zinc was bound to ovotransferrin. This zinc-ovotransferrin solution was desalted with a dialysis membrane having a molecular weight of 500 cut, and further diluted with a simulated buffer (pH 6.2) so that the zinc concentration was 26 mg / 200 ml. Then, this zinc-ovotransferrin solution was sealed in a test tube with a screw cap, heated at 90 ° C. for 10 minutes, naturally cooled to room temperature, and stored at 37 ° C. One month after storage, the presence or absence of precipitation was visually determined. No precipitation was observed. Further, when the amount of zinc in the zinc-ovotransferrin solution was measured by ICP, it was found that 0.11 mg of zinc was bound per 8 mg of the ovotransferrin degradation product.
[0053]
[Example 6]
1 liter of an aqueous solution containing 1.0 mol of sodium bicarbonate (A solution), 0.2 liter of an aqueous solution containing 1 mmol of zinc chloride as zinc ions (B1 solution), and an aqueous solution containing 10 μmol of bovine lactoferrin (manufactured by ULN) B2 solution) After preparing 0.8 liter, the B1 solution and the B2 solution were mixed, and the mixed solution of the B1 solution and the B2 solution was added to the A solution to prepare a zinc-lactoferrin solution in which zinc was bound to lactoferrin. In addition, in order to maintain the pH of this zinc-lactoferrin solution at 8.5, sodium hydroxide was added as needed. The zinc-lactoferrin solution was heated at 90 ° C. for 10 minutes without desalting and then naturally cooled to room temperature. In this state, no precipitation was observed. Furthermore, this zinc-lactoferrin solution was stored at 37 ° C. for 1 month, and when the presence or absence of precipitation was visually determined, no precipitation was observed.
[0054]
[Example 7]
1 liter of an aqueous solution containing 1.0 mol of sodium carbonate adjusted to pH 8.0 with 2N hydrochloric acid (solution A), 0.2 liter of an aqueous solution containing 1 mmol of zinc chloride as zinc ions (solution B1), bovine lactoferrin ( After preparing 0.8 liter of an aqueous solution (B2 solution) containing 10 micromoles of ULN), the B1 solution and the B2 solution are mixed, and the mixed solution of the B1 solution and the B2 solution is added to the A solution to add zinc to lactoferrin Prepared a zinc-lactoferrin solution. The zinc-lactoferrin solution was heated at 90 ° C. for 10 minutes without desalting and then naturally cooled to room temperature. In this state, no precipitation was observed. Furthermore, when this zinc-lactoferrin solution was stored at 37 ° C. for one month and the presence or absence of precipitation was visually determined, no precipitation was observed. Moreover, when the sensory evaluation test was implemented, none of the 10 panelists felt a metallic taste.
[0055]
[Example 8]
The zinc-lactoferrin solution prepared as in Example 2 was added to 20 liters of raw milk so that the zinc concentration was 10 mg / 200 ml, homogenized, sterilized at 150 ° C. for 4 seconds, and immediately cooled to 4 ° C. Aseptically filled into a 250 ml paper container. And after storing at 37 degreeC for 3 months, this zinc- lactoferrin addition milk was centrifuged and the presence or absence of precipitation production | generation was investigated, and precipitation production | generation was not recognized at all. The number of E. coli and the number of general bacteria were 0. Furthermore, when a sensory evaluation test was conducted using raw milk sterilized and stored under the same conditions as a control, none of the 10 panelists felt a metal taste or other abnormal flavor.
[0056]
[Example 9]
1 g of lactoferrin (manufactured by DMV) is dissolved in 0.2 molar acetic acid buffer (pH 4), 26,000 units of pepsin (Sigma) is added and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The pH was 7.5. Next, 200,000 units of trypsin (Sigma) was added to this solution and reacted at 37 ° C. for 10 hours to obtain a lactoferrin degradation product. In addition, when confirmed by electrophoresis, the molecular weight of this lactoferrin degradation product was 50,000 and 30,000.
1 liter of an aqueous solution (solution A) containing 1.3 mol of sodium bicarbonate in which undissolved salt is precipitated, 0.2 liter of an aqueous solution containing 1.2 mmol of zinc chloride as zinc ions (solution B1), A solution containing 10 micromoles of lactoferrin degradation product as a lactoferrin before decomposition (B2 solution) After preparing 0.8 liter, the B1 solution and the B2 solution are mixed, and the B solution and the B2 solution are mixed with the A solution while stirring well. The solution was added to prepare a zinc-lactoferrin degradation product solution in which zinc was bound to the lactoferrin degradation product. The zinc-lactoferrin degradation product solution was sealed in a test tube with a screw cap, heated at 90 ° C. for 10 minutes, naturally cooled to room temperature, and stored at 37 ° C. One month after storage, the presence or absence of precipitation was visually determined. No precipitation was observed. Furthermore, when a sensory evaluation test was conducted, none of the 10 panelists felt a metallic taste.
[0057]
[Example 10]
Using zinc-lactoferrin prepared as in Example 2, a 150 mg capsule containing zinc and vitamin E having the following composition was produced by a punching method according to a conventional method.
Mixing ratio
Capsule solution
Gelatin 45%
Glycerin 22%
Water 33%
Raw material composition
Vitamin E 35% (200 IU)
Zinc-lactoferrin 20%
Wheat germ oil 40%
Emulsifier 5%
This capsule is used as a health food.
About this capsule, even after storing at 37 ° C. for 3 months, there was no off-flavor of fat and oil and no metallic taste of zinc.
[0058]
Example 11
Using zinc-lactoferrin prepared as in Example 2, a 200 mg capsule containing zinc and β-carotene containing the following composition was produced by a punching method according to a conventional method.
Mixing ratio
Capsule solution
Gelatin 45%
Glycerin 22%
Water 33%
Raw material composition
β-Carotene 35% (2,000 IU)
Zinc-lactoferrin 8%
Wheat germ oil 53%
Emulsifier 4%
About this capsule, even after storing at 37 ° C. for 3 months, there was no odor of fats and oils and no metallic taste of zinc.
[0059]
Example 12
Zinc-added margarine was produced using the zinc-lactoferrin prepared as in Example 2. That is, skim milk powder in an oil phase in which 0.5% glycerin fatty acid ester (ester value 60) is added as an emulsifier to fats and oils consisting of 10% hardened soybean oil having a melting point of 42 ° C., 40% soybean white drawn oil and 25% palm oil 1%, zinc-lactoferrin 0.5% (equivalent amount of zinc 0.07%), lactic acid 0.1% and water 23.3% were added to obtain a water-in-oil emulsion. And this margarine was manufactured by cooling, solidifying, and kneading this water-in-oil emulsion with a margarine manufacturing machine. As a comparative example, margarine was similarly produced with 0.35% zinc sulfate and 23.5% water instead of zinc-lactoferrin. These margarines were subjected to a storage test at 15 ° C., and the peroxide value (POV) was measured immediately after production and after storage for 6 months. The results are shown in Table 10.
As shown in the table, it can be seen that the degradation of margarine to which zinc-lactoferrin was added was completely suppressed.
[0060]
[Table 10]
Example 13
Zinc-added mayonnaise was prepared using zinc-lactoferrin prepared as in Example 2. That is, mayonnaise was produced using 15 g of egg yolk, 90 ml of safflower oil, 15 ml of vinegar, 2 g of salt, 0.5 g of mustard, 0.5 g of pepper, 1.5 g of sugar and 0.5% of zinc-lactoferrin. Moreover, the mayonnaise which added the zinc sulfate instead of zinc-lactoferrin as a comparative example was manufactured. These mayonnaise was subjected to a storage test at 15 ° C., and POV was measured immediately after production and after storage for 6 months. The results are shown in Table 11.
It can be seen that deterioration of mayonnaise added with zinc-lactoferrin is completely suppressed.
[0062]
[Table 11]
【The invention's effect】
The zinc-lactoferrin of the present invention can be added to foods and drinks and feeds for zinc enrichment in a state in which the metallic taste unique to zinc disappears and the oxidizing action due to zinc is suppressed. Further, it can be prepared in a simple manner in a state containing a large amount of zinc, which is industrially advantageous. Therefore, it is useful as a zinc-enriched food or drink or feed additive.
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