JP3513075B2 - 免疫測定法及びそのための試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、凝集法による免疫
測定法及びそのための試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】不溶性担体粒子を利用した免疫測定法
は、血清、血漿、尿、髄液などの体液に含まれる抗原性
物質の定量方法として臨床検査に応用され、現在は自動
化による簡便性・迅速性の理由から広く普及している。
近年は、更なる測定性能の向上を目的とした応用技術が
提案されている。例えば、少なくとも２つの異なった量
の同一抗体が負荷された２種の異ったサイズ範囲のラテ
ックス粒子を用いる試薬(特公昭63-14783号公報参照)や
平均粒径の異なる２種類の不溶性担体粒子に抗体を感作
して用いる測定法(特許第第2588174号公報参照）によれ
ば、広い濃度範囲におよぶ測定が可能となる。平均粒子
径が単一の不溶性担体粒子にポリクローナル抗体とモノ
クローナル抗体を併せて用いる方法(特開平10-90268公
報参照)によれば、同様な効果が得られる。また、平均
粒径の異なる２種類以上の不溶性担体粒子に特定の抗原
に対する２種以上のモノクローナル抗体を感作し、立体
障害による凝集阻害を回避することで正確な定量を可能
とする測定法(特開平10-123137公報参照)などが提案さ
れている。

【０００３】また、Journal of Clinical Laboratory A
nalysis 12:137-144 (1998)及び「医学と薬学」４２巻
５号 1999年11月 42(5):781-788, 1999には、大小２
種類の担体粒子を用い、平均粒径の小さな担体粒子には
反応速度の小さなモノクローナル抗体を感作し、平均粒
径の大きな担体粒子には反応速度の大きなモノクローナ
ル抗体を感作した感作粒子混合物を用いて凝集法により
免疫測定を行うことが記載されている。しかしながら、
これらの文献に記載された方法では、測定可能な濃度範
囲が狭く、高濃度領域の測定が困難であるという問題を
有している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】臨床検査における血清
免疫検査項目では、低濃度域に臨床的な判定を下すため
の重要なポイントを持つものが多く、低濃度域の測定精
度が検査結果を左右する大きな要因になっていることは
明らかである。粒子径の異なる複数の不溶性担体を混合
して用いる技術は、特許第2588174号公報に示されると
おり、単一の粒子を用いる場合に比べて測定範囲は広く
することができ、低濃度域の測定も可能となるが、測定
精度の面では更なる向上が望まれる。測定精度の向上に
は測定系の高感度化が有効であるが、従来の技術におい
て測定系を高感度化することが測定範囲の縮小をもたら
してしまうことは、特許第2588174号公報に記載されて
いる通りである。また、Journal of Clinical Laborato
ry Analysis 12:137-144 (1998)及び「医学と薬学」４
２巻５号 1999年11月 42(5):781-788, 1999に記載さ
れた方法では高濃度域の測定が困難であり、測定範囲が
狭くなっている。

【０００５】従って、本発明の課題は、測定範囲を広範
囲に維持したまま、低濃度域の測定をより高感度化する
測定方法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、大小２種類の担体粒子を用い、平均粒径の小
さな担体粒子には反応速度の小さなポリクローナル抗体
を感作し、平均粒径の大きな担体粒子には反応速度の大
きなポリクローナル抗体を感作した感作粒子混合物であ
って、大小の粒子の平均粒径の比率、それらの重量比率
及びそれらの平均粒径の値を最適化することにより、測
定範囲を広範囲に維持したまま、低濃度域の測定を従来
法よりも高感度化することができることを見出し、本発
明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、第１の粒子状不溶性
担体上に、測定すべき抗原と抗原抗体反応する第１のポ
リクローナル抗体又はその抗原結合性断片を担持した第
１の感作粒子と、第２の粒子状不溶性担体上に、測定す
べき抗原と抗原抗体反応する第２のポリクローナル抗体
又はその抗原結合性断片を担持した第２の感作粒子との
混合物であって、前記第１の粒子状不溶性担体の平均粒
子径が0.05〜0.10μｍであり、前記第２の粒子状不溶性
担体の平均粒子径は、前記第１の粒子状不溶性担体の平
均粒子径の1.5〜5.0倍であり、前記第１の粒子状不溶性
担体の総重量が前記第２の粒子状不溶性担体の総重量の
2.5〜10.0倍であり、前記第２のポリクローナル抗体の
抗原抗体反応速度は、前記第１のポリクローナル抗体の
抗原抗体反応速度よりも大きい、第１及び第２の感作粒
子混合物と、測定すべき抗原を含む検体とを反応させ、
凝集の生成速度を光学的に測定することを含む、凝集法
による免疫測定方法を提供する。また、本発明は、第１
の粒子状不溶性担体上に、測定すべき抗原と抗原抗体反
応する第１のポリクローナル抗体又はその抗原結合性断
片を担持した第１の感作粒子と、第２の粒子状不溶性担
体上に、測定すべき抗原と抗原抗体反応する第２のポリ
クローナル抗体又はその抗原結合性断片を担持した第２
の感作粒子との混合物であって、前記第１の粒子状不溶
性担体の平均粒子径が0.05〜0.10μｍであり、前記第２
の粒子状不溶性担体の平均粒子径は、前記第１の粒子状
不溶性担体の平均粒子径の1.5〜5.0倍であり、前記第１
の粒子状不溶性担体の総重量が前記第２の粒子状不溶性
担体の総重量の2.5〜10.0倍であり、前記第２のポリク
ローナル抗体の抗原抗体反応速度は、前記第１のポリク
ローナル抗体の抗原抗体反応速度よりも大きい、第１及
び第２の感作粒子混合物から成る、凝集法による免疫測
定用試薬を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の凝集法による免疫測定法
では、平均粒子径の異なる大小２種類の粒子状不溶性担
体が用いられる。平均粒子径（直径）が小さい方の、第
１の粒子状不溶性担体の平均粒子径は0.05〜0.10μｍ、
好ましくは0.06〜0.08μｍである。第１の粒子状不溶性
担体の平均粒子径がこの範囲内にあると、高濃度域での
正確な測定が可能になり、測定可能な濃度範囲が高濃度
側に広がる。また、平均粒子径が大きい方の、第２の粒
子状不溶性担体の平均粒子径は、前記第１の粒子状不溶
性担体の平均粒子径の1.5〜5.0倍、好ましくは2.0〜4.0
倍である。第２の粒子状不溶性担体の平均粒子径が、第
１の粒子状不溶性担体の平均粒子径の1.5〜5.0倍の範囲
内にあると、低濃度域での測定感度が高くなる。

【０００９】なお、粒子状不溶性担体自体は、従来から
凝集法に広く用いられているいずれの担体粒子であって
もよく、例えばラテックス粒子や赤血球粒子等を挙げる
ことができる。ポリスチレンラテックス等のラテックス
粒子を特に好ましく用いることができる。

【００１０】前記第１及び第２の粒子状不溶性担体に
は、反応速度が異なるポリクローナル抗体がそれぞれ感
作される。平均粒子径が小さな第１の粒子状不溶性担体
には、反応速度が小さな第１のポリクローナル抗体が感
作され、平均粒径が大きな第２の粒子状不溶性担体には
反応速度が大きな第２のポリクローナル抗体が感作され
る。ここで、反応速度の大小は、各ポリクローナル抗体
を対応抗原と反応させることにより生じる凝集を吸光度
の変化により測定する場合の、反応初期（反応開始から
１分以内、好ましくは２０秒以内）の吸光度の変化率の
大小により表される。抗原抗体反応開始時点からの時間
を横軸に取り、吸光度を縦軸に取り、抗原抗体反応開始
前の吸光度を同じにして抗原抗体反応を行わせ、反応開
始から２０秒後の吸光度の変化を比較することにより反
応速度の大小を比較した場合、第２のポリクローナル抗
体の反応速度は、第１のポリクローナル抗体の反応速度
の1.3〜2.0倍程度が好ましく、特に好ましくは1.5〜1.7
倍程度である。なお、反応速度の大小は、力価の大小と
は必ずしも相関しない。下記実施例に示すように、力価
がほぼ同じでも反応速度はかなり異なる場合がある。抗
体を担体粒子に感作する方法は周知の常法により行うこ
とができる。すなわち、抗体溶液に粒子を浮遊させて放
置することにより物理的に吸着させることができる。

【００１１】なお、粒子状不溶性担体には、ポリクロー
ナル抗体に代えて、Fabフラグメントや、F(ab')₂フラグ
メントのような、そのポリクローナル抗体の抗原結合性
断片を感作することもできる。

【００１２】反応に供される前記第１の粒子状不溶性担
体の総重量が前記第２の粒子状不溶性担体の総重量の2.
5〜10.0倍であり、特に3.0〜7.0倍であることが好まし
い。第１及び第２の粒子状不溶性担体の重量比率が上記
の範囲内にあると、高濃度域での正確な測定が可能にな
り、測定可能な濃度範囲が高濃度側に広がる。

【００１３】第１及び第２の感作粒子の反応系中での濃
度は特に限定されないが、測定感度の観点から、反応系
中の前記第２の感作粒子の濃度が0.02〜0.07 W/V％程度
が好ましい。

【００１４】免疫測定自体は、従来の凝集法と全く同様
にして行うことができる。すなわち、上記第１及び第２
の感作粒子を緩衝液に懸濁し、これに検体を加え、凝集
の生成速度を光学的に測定することにより行うことがで
きる。凝集の生成速度は、反応液の吸光度、濁度又は光
透過率等を連続的に又は時間間隔をあけて断続的に測定
することにより容易に測定することができる。凝集速度
は、例えば抗原抗体反応開始６０秒後から９０秒後の吸
光度の変化を測定することにより測定することができ
る。もっとも、測定時間はこれに限定されるものではな
く、反応の比較的初期（好ましくは反応開始から２分間
以内）の任意の時間における吸光度等の変化を測定する
ことにより測定することができる。凝集速度は、検体中
の抗原濃度と相関するので、既知の抗原濃度の標準試料
をいくつか作製して反応を行い、凝集速度を測定して検
量線を作成しておき、検体中の抗原濃度は、測定された
凝集速度をその検量線にあてはめることにより知ること
ができる。反応温度は、特に限定されないが、通常、３
７℃程度が好ましい。

【００１５】本発明の方法により測定することができる
抗原は何ら限定されるものではなく、それに対応するポ
リクローナル抗体を作製することができるあらゆる抗原
が本発明の方法により測定可能である。例えば、Ｃ反応
性タンパク質（ＣＲＰ）のような疾病のマーカーとなる
各種タンパク質、細菌やウイルスのような病原体等を挙
げることができるがこれらに限定されるものではない。
また、検体も何ら限定されるものではなく、血清、血
漿、尿、髄液、痰等の体液や、飲食物又はその抽出液な
どを挙げることができるがこれらに限定されるものでは
ない。なお、体液等をそのまま用いた場合に抗原濃度が
高すぎて正確な測定が困難な場合には、体液等を希釈し
たものを検体として用いることができることは言うまで
もない。

【００１６】本発明は、抗原性物質に対する抗体の反応
速度の違いを利用することにより、被検試料中の抗原性
物質をその含有濃度に応じて効果的に捉えることを可能
とし、測定の精度を向上させるものである。つまり、被
検試料中の抗原性物質の濃度が非常に希薄な場合には、
反応速度の速い抗体が優先的に抗原性物質を捉えること
で該抗体が感作された粒子径の大きい不溶性担体が優先
的に凝集を起こし、反応は僅かでも大きい光学的変化と
して捉えられる。一方、被検試料中の抗原性物質の濃度
が高い場合には、反応速度の速い抗体は急速に消費され
るため粒子径の大きい不溶性担体は瞬時に凝集してしま
うが、反応速度の遅い抗体がゆっくりと反応を持続する
ことで該抗体が感作された粒子径の小さい不溶性担体の
凝集反応が維持され、光学的変化を抑えながら継続させ
る事ができる。本発明は、これらの効果により測定範囲
を広範囲に維持したまま低濃度域の測定をより高感度化
することを可能とする測定方法である。さらに、本発明
では、大小の粒子の平均粒径の比率、それらの重量比率
及びそれらの平均粒径の値を最適化することにより、測
定範囲を広範囲に維持したまま低濃度域の測定をより高
感度化することが特に良好に達成される。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００１８】参考例１ 抗ヒトＣＲＰウサギポリクロー
ナル抗体の反応速度 抗体の反応速度について、市販されている抗ヒトＣ反応
性タンパク質(C-Reactive Protein；ＣＲＰ)ウサギポリ
クローナル抗体による実例を示す。抗ヒトＣＲＰウサギ
ポリクローナル抗体Ａ、および抗ヒトＣＲＰウサギポリ
クローナル抗体Ｂを、抗原性物質であるヒトＣＲＰに対
する凝集力価が等しくなるようにグリシン緩衝液で希釈
したものをそれぞれ反応液とし、抗原性物質との抗原抗
体反応により生成される凝集を光学的に測定した。測定
試料には、ヒトＣＲＰ精製抗原を正常ヒト血清で希釈し
てＣＲＰ濃度が約１０ｍｇ/ｄＬとなるように調製した
ものを用いた。

【００１９】測定装置には、生化学検査用自動分析装置
ＴＢＡ−３０Ｒを用い、測定試料２５μＬに対して、凝
集促進剤として３％のポリエチレングリコールを含むグ
リシン緩衝液２５０μＬを添加し、その５分後に抗体Ａ
およびＢのそれぞれから調製された反応液を５０μＬ加
える設定とし、抗原抗体反応により生成される凝集を光
波長３４０ｎｍ（主波長）における吸光度の経時的変化
として２０秒毎に５分間測定し、その結果を図１のグラ
フに示した。なお、バックグランドの吸光度を消去する
ために、波長８０４ｎｍ（副波長）における吸光度を測
定し、主波長における吸光度から差し引いて吸光度を算
出した。

【００２０】抗原抗体反応が開始される５分の点以降、
抗体Ａでは吸光度が急激に上昇しているのに対し、抗体
Ｂでは比較的緩やかに吸光度が上昇する。このことは、
抗体Ａが抗体Ｂに比べ反応速度が速いことを意味してい
る。また、測定の最終点である１０分で抗体Ａと抗体Ｂ
の吸光度は、ほぼ同じレベルにあり凝集力価としては同
等であることを示している。

【００２１】実施例１、比較例１及び２ ヒトＣＲＰの
測定 抗ヒトＣＲＰウサギポリクローナル抗体Ａ、および抗ヒ
トＣＲＰウサギポリクローナル抗体Ｂをポリスチレンラ
テックスＣ(粒子径0.21μｍ）、およびポリスチレンラ
テックスＤ(粒子径0.06μｍ）との組み合わせでそれぞ
れ感作し、グリシン緩衝液中に分散浮遊液状とし、計４
種類の試薬を調製した。これら４種類の試薬をそれぞれ
混合して使用した。なお、試薬はCambiasoらの方法（Me
thods inEnzymology Vol.74; Section I, B [6]:106-13
9）に従い、グリシン緩衝液中で抗体とポリスチレンラ
テックスの規定量を混合し、室温で６０分間放置するこ
とにより感作をおこない、遠心操作により剰余分の抗体
を除去した後、ウシ血清アルブミンを含むグリシン緩衝
液によりポリスチレンラテックス粒子表面の抗体未感作
部分のブロッキングを施し、再び遠心操作により抗体感
作ポリスチレンラテックス粒子を集め、グリシン緩衝液
中に再浮遊することにより調製した。

【００２２】測定用試料として、ヒトＣＲＰ精製抗原を
正常ヒト血清で希釈して調製したＣＲＰ標準品を用い
た。ＣＲＰ標準品は血漿蛋白国際標準品ＣＲＭ４７０に
準拠して値付けされたもので、１，５，１０，２０，３
０，５０ｍｇ/ｄＬを用意した。０ｍｇ/ｄＬとして生理
的食塩液を使用した。

【００２３】生化学検査用自動分析装置ＴＢＡ−８０Ｆ
Ｒを用い、次の条件パラメータにて測定をおこなった。
測定検体量４μＬに対し、第１試薬としてグリシン緩衝
液を２００μＬ、調製した試薬を第２試薬として２００
μＬ、反応開始(第２試薬添加後)６０秒後から９０秒間
の平均反応速度を光波長５７２ｎｍの吸光度変化により
測定する設定とした。

【００２４】本発明の実施例として、抗体Ａが感作され
たラテックスＣと抗体Ｂが感作されたラテックスＤをそ
れぞれの粒子濃度が０.０３％(W/V)、および０.１７％
(W/V)となるようにグリシン緩衝液中で混合したものを
調製し、試薬［１］（実施例１）とした。

【００２５】本発明の比較例として、抗体Ａが感作され
たラテックスＣ、およびラテックスＤをそれぞれの粒子
濃度が０.０３％(W/V)、および０.１７％(W/V)となるよ
うにグリシン緩衝液中で混合したものを調製し、試薬
［２］（比較例１）とした。また、抗体Ｂが感作された
ラテックスＣ、およびラテックスＤについても同様の濃
度で混合し、試薬［３］（比較例２）とした。

【００２６】試薬［１］（実施例１）、試薬［２］（比
較例１）、試薬［３］（比較例３）について、試薬毎に
ＣＲＰ濃度と一分間当たりの吸光度変化量との関係を示
す検量線を作成した。これを表１、および図２に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】その結果、試薬［２］（比較例１）におい
ては吸光度変化量の濃度依存性が得られる範囲が１０ｍ
ｇ/ｄＬまでと非常に短く、一方試薬［１］（実施例
１）、および試薬［３］（比較例２）については５０ｍ
ｇ/ｄＬまでとなった。試薬［１］（実施例１）と試薬
［３］（比較例２）を比較すると測定範囲はほぼ同等と
見られるが、低濃度域の吸光度変化量において試薬
［１］（実施例１）が優位にあり、数値的にもＣＲＰ濃
度１ｍｇ/ｄＬにおいて３倍以上の差が見られた。

【００２９】試薬［２］（比較例１）では、反応速度の
速い抗体Ａのみを用いていることにより、抗原抗体反応
を介する不溶性担体粒子の凝集生成が速やかに進行する
ため、ＣＲＰ濃度の低い試料でも非常に高感度な測定が
実現される。しかし、ＣＲＰ濃度の高い試料では反応が
瞬時に起こり、測定が開始される前に凝集の生成は進行
し、測定時間内には飽和状態に達してしまうため、平均
反応速度は見掛け上少ないものとして測定されてしま
う。

【００３０】試薬［３］（比較例２）では、反応速度の
遅い抗体Ｂのみを用いていることにより、抗原抗体反応
を介する不溶性担体粒子の凝集生成は緩やかに進行する
ため、 ＣＲＰ濃度の高い試料に対して試薬［２］（比
較例１）で見られるような現象はＣＲＰ濃度５０ｍｇ/
ｄＬまで見られず測定範囲は広いが、 ＣＲＰ濃度１ｍ
ｇ/ｄＬでの吸光度変化量は試薬［２］（比較例１）の
半分程度となってしまう。これは、特開昭63-65369号公
報に示される技術であり、不溶性担体粒子を混合して用
いることで得られる性能である。

【００３１】本発明の実施例である試薬［１］では、低
濃度域において試薬［２］（比較例１）と同等の吸光度
変化量を有し、測定範囲において試薬［３］（比較例
２）と同等の性能を有している。これは、抗体Ａ，Ｂの
反応速度の違いが試料中のＣＲＰ濃度に応じて、粒子径
が互いに異なるラテックスＣ，Ｄの持つ性能を効果的に
発揮させていることを示している。

【００３２】実施例２、比較例３及び４ ヒトβ₂-ミク
ログロブリン(Beta-2-Microglobulin；ＢＭＧ)の測定 参考例２に記載した、抗ヒトＢＭＧウサギポリクローナ
ル抗体Ｅ、および抗ヒトＢＭＧウサギポリクローナル抗
体ＦをポリスチレンラテックスＧ(粒子径0.14μｍ）、
およびポリスチレンラテックスＨ(粒子径0.07μｍ）と
の組み合わせでそれぞれ感作し、グリシン緩衝液中に分
散浮遊液状とし、計４種類の試薬を調製した。これら４
種類の試薬をそれぞれ混合して使用した。感作は実施例
１と同様に行った。

【００３３】測定用試料として、ヒトＢＭＧ精製抗原を
緩衝液で希釈して調製したＢＭＧ標準品を用いた。ＢＭ
Ｇ標準品はＷＨＯ国際標準品に準拠して値付けされたも
ので、５０ｍｇ/Ｌを生理的食塩液にて２倍階段希釈し
たものを１/２⁸まで用意した。０ｍｇ/Ｌとして生理的
食塩液を使用した。

【００３４】生化学検査用自動分析装置ＴＢＡ−３０Ｒ
を用い、次の条件パラメータにて測定をおこなった。測
定検体量３μＬに対し、第１試薬としてグリシン緩衝液
を１５０μＬ、調製した試薬を第２試薬として１５０μ
Ｌ、反応開始(第２試薬添加後)６０秒後から９０秒間の
平均反応速度を光波長５７２ｎｍの吸光度変化により測
定する設定とした。

【００３５】本発明の実施例として、参考例２に記載し
た抗体Ｅが感作されたラテックスＧと抗体Ｆが感作され
たラテックスＨをそれぞれの粒子濃度が０.０６％(W/
V)、および０.１７％(W/V)となるようにグリシン緩衝液
中で混合したものを調製し、試薬［４］（実施例２）と
した。

【００３６】本発明の比較例として、抗体Ｅが感作され
たラテックスＧ、およびラテックスＨをそれぞれの粒子
濃度が０.０６％(W/V)、および０.１７％(W/V)となるよ
うにグリシン緩衝液中で混合したものを調製し、試薬
［５］（比較例３）とした。また、抗体Ｆが感作された
ラテックスＧ、およびラテックスＨについても同様の濃
度で混合し、試薬［６］（比較例４）とした。

【００３７】試薬［４］（実施例２）、試薬［５］（比
較例３）、試薬［６］（比較例４）について測定をおこ
ない、試薬毎にＢＭＧ濃度と一分間当たりの吸光度変化
量の関係を示す検量線を作成した。これを表２、および
図３に示す。

【００３８】

【表２】

【００３９】その結果、試薬［５］（比較例３）におい
て吸光度変化量の濃度依存性が得られる範囲が２５ｍｇ
/Ｌまでであり、試薬［４］（実施例２）、および試薬
［６］（比較例４）については５０ｍｇ/Ｌまでとなっ
た。試薬［６］（比較例４）で測定範囲は広範に確保さ
れるが低濃度域での吸光度変化量は試薬［５］に比べて
非常に低い。試薬［４］（実施例２）において、低濃度
域の吸光度変化量は試薬［５］（比較例３）と同等であ
り、測定範囲は５０ｍｇ/Ｌまでの性能を示した。

【００４０】本発明の実施例である試薬［４］（実施例
２）では、低濃度域において試薬［５］（比較例３）と
同等の吸光度変化量、および試薬［６］（比較例４）と
同等の測定範囲を有している。これは実施例１と同様の
結果であり、本発明が特定の抗原性物質、およびそれに
対する特定の抗体で成立するものではないことを示して
いる。

【００４１】

【発明の効果】本発明による免疫学的測定法によれば、
低濃度域の高感度化と広範囲な測定範囲の維持が可能と
なり、血清免疫検査等において臨床的な判定を下すため
の重要である低濃度域の測定精度を向上させ、より正確
な判定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１における各抗体の抗原抗体反応による
凝集生成速度を比較した図である。

【図２】実施例１での各試薬におけるＣＲＰ濃度と１分
間当たりの吸光度変化量の関係をグラフに示し、比較し
た図である。

【図３】実施例２での各試薬におけるＢＭＧ濃度と１分
間当たりの吸光度変化量の関係をグラフに示し、比較し
た図である。

フロントページの続き (72)発明者 関根 盛 新潟県五泉市大字木越字鏡田1359番１ デンカ生研株式会社生産本部内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 21/27 G01N 21/59

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第１の粒子状不溶性担体上に、測定すべ
   き抗原と抗原抗体反応する第１のポリクローナル抗体又
   はその抗原結合性断片を担持した第１の感作粒子と、第
   ２の粒子状不溶性担体上に、測定すべき抗原と抗原抗体
   反応する第２のポリクローナル抗体又はその抗原結合性
   断片を担持した第２の感作粒子との混合物であって、前
   記第１の粒子状不溶性担体の平均粒子径が0.05〜0.10μ
   ｍであり、前記第２の粒子状不溶性担体の平均粒子径
   は、前記第１の粒子状不溶性担体の平均粒子径の1.5〜
   5.0倍であり、前記第１の粒子状不溶性担体の総重量が
   前記第２の粒子状不溶性担体の総重量の2.5〜10.0倍で
   あり、前記第２のポリクローナル抗体の抗原抗体反応速
   度は、前記第１のポリクローナル抗体の抗原抗体反応速
   度よりも大きい、第１及び第２の感作粒子混合物と、測
   定すべき抗原を含む検体とを反応させ、凝集の生成速度
   を光学的に測定することを含む、凝集法による免疫測定
   法。
2. 【請求項２】 反応系中の前記第２の感作粒子の濃度が
   0.02〜0.07 W/V％である請求項１記載の免疫測定法。
3. 【請求項３】 第１の粒子状不溶性担体上に、測定すべ
   き抗原と抗原抗体反応する第１のポリクローナル抗体又
   はその抗原結合性断片を担持した第１の感作粒子と、第
   ２の粒子状不溶性担体上に、測定すべき抗原と抗原抗体
   反応する第２のポリクローナル抗体又はその抗原結合性
   断片を担持した第２の感作粒子との混合物であって、前
   記第１の粒子状不溶性担体の平均粒子径が0.05〜0.10μ
   ｍであり、前記第２の粒子状不溶性担体の平均粒子径
   は、前記第１の粒子状不溶性担体の平均粒子径の1.5〜
   5.0倍であり、前記第１の粒子状不溶性担体の総重量が
   前記第２の粒子状不溶性担体の総重量の2.5〜10.0倍で
   あり、前記第２のポリクローナル抗体の抗原抗体反応速
   度は、前記第１のポリクローナル抗体の抗原抗体反応速
   度よりも大きい、第１及び第２の感作粒子混合物から成
   る、凝集法による免疫測定用試薬。