JP3593500B2

JP3593500B2 - コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子

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Publication number: JP3593500B2
Application number: JP2000614405A
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Inventors: ゲルドゲリッセン; ジェラルドブラウス; ラルフプリース; スフェンクラップマン; アレクサンダーベー．ストラッサー
Original assignee: ラインバイオテックゲゼルシャフトフュルノイエバイオテクノロジスクプロツェッセウントプロドクテエムベーハー
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 2000-04-27
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2020-04-27
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Description

【０００１】
本発明は、コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドおよびその誘導体をコードする核酸からなる核酸分子に関する。上記誘導体は配列番号：２に記載のコリスミ酸ムターゼの少なくとも１０％のコリスミ酸ムターゼ活性を有する。本発明はさらに、核酸分子を含むベクター、核酸分子を含む宿主細胞、およびコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。本発明はさらに、コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチド、およびそれを特異的に認識する抗体に関する。また本発明は、核酸分子を使用した栄養要求性酵母株の作製方法、および異種遺伝子の組換え体発現方法におけるその用途に関する。
【０００２】
単細胞の真核微生物である酵母は、容易に培養することが可能であり、遺伝子を操作しやすいという大きな利点をもつ。また、高等生物について知られているパターンに基づいて組換えタンパク質を処理および修飾することができる。酵母は現在知られている限り病原性物質を含まないことから、治療用タンパク質の作製にも適している。例えば異種遺伝子発現によって作製された最初のワクチンであるＢ型肝炎ワクチンは、詳細に研究されているパン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で異種的に発現された（Ｌｅｐｅｔｉｃら、１９９６）。
【０００３】
サッカロミセス・セレビシエでは多種多様なタンパク質の作製が可能であるものの（ＧｅｌｌｉｓｓｅｎおよびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、１９９７の総説を参照）、いくつかの制限事項がある。例えば異種タンパク質の最大量は、細胞内の総タンパク質量の約１〜５％に留まる（ＢｕｃｋｈｏｌｚおよびＧｌｅｅｓｏｎ、１９９１）。
【０００４】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）さらにはハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの他の様々な酵母の特性が明らかにされており、発現系としての適切性に関してサッカロミセス・セレビシエとの比較が行われている（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）。上記の酵母はいずれもサッカロミセス・セレビシエと比較して活性タンパク質の分泌が極めて盛んで、異種遺伝子の発現は個々の遺伝子の影響を受けるものの、ドナー生物種には無関係である。メチロトローフは当初から組換えタンパク質を産生する生物体として注目されていた。メチロトローフは、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）の４つの属に分けられ、いずれもメタン、メチルアミン、ホルムアルデヒド、またはギ酸を炭素源およびエネルギー源として利用することができる。
【０００５】
なかでも、サッカロマイセターレス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）目に属する酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｌｏｄｄｅｒ、１９７０）は、メチロトローフ酵母の比較的小さな群に属する。ハンセヌラ・ポリモルファは好気性条件下でグルコースを発酵せず、クラブトリー効果が陰性で（Ｖｅｒｄｕｙｎら、１９９２）、また増殖に最適な温度が３７℃であることから熱耐性酵母に分類される。したがってこの酵母はメチロトローフ属の例外である。メチロトローフ酵母の生息環境は有機物質を多く含む。
【０００６】
現時点で酵母ハンセヌラ・ポリモルファの遺伝子でクローン化されて特性が解析されているものは数種に過ぎず（ＨａｎｓｅｎおよびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、１９９６）、ゲンバンクにおけるハンセヌラ・ポリモルファのクローン化された遺伝子の数は３０を超える。しかしながら、これらの遺伝子の何種が詳細に解析されているか、または、プラスミド選択のマーカー遺伝子としてどれほど適しているかについて発明者は不案内である。したがって、上記遺伝子群とサッカロミセス・セレビシエの相同遺伝子群との間の類似性は（そのような遺伝子群がある範囲内では）比較的限られていると示唆することができる（Ｄｏｂｓｏｎら、１９８２）。メチロトローフの代謝上、鍵となる酵素は酵素メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、およびギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）の各酵素であり、これらの酵素の発現を極めて強力なプロモーターで調節することができれば、異種遺伝子の発現に様々な有用な可能性が開かれる。これらの事項から、ハンセヌラ・ポリモルファは産業上重要な微生物の一つとなっている（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら、１９９４）。
【０００７】
現在まで、ハンセヌラ・ポリモルファの栄養要求性株は２種のみが利用可能であり、その形質転換はそれぞれｕｒａ３−またはｌｅｕ２−欠損性の機能的相補性を元に選択することができる。栄養要求性株および栄養要求性を相補する能力がある核酸、からなる別の形質転換系を構築する試みは未だ成功していない。これは、相補性能力をもつ適切な遺伝子群が利用できていなかったためである。パン酵母サッカロミセス・セレビシエのアミノ酸または核酸の生合成経路にかかわる遺伝子群は数多く知られているにもかかわらず、パン酵母とメチロトローフ酵母の遺伝子間の差がときに大きなものであることが過去に報告されている。したがって、サッカロミセス・セレビシエの遺伝子がメチロトローフ酵母の栄養要求性を適切に補うということは一般的には言えず、メチロトローフ酵母の遺伝子群がサッカロミセス・セレビシエの栄養要求性の相補能力をもつことを予測することもできない。
【０００８】
したがって本発明の基礎にある技術的問題は、適切な栄養要求性酵母株の形質転換における相補性の選択マーカーとしてはたらきうるハンセヌラ・ポリモルファ由来の新規遺伝子を提供することにある。また別の問題として、ベクターおよび上記遺伝子を含む宿主細胞の提供が挙げられる。さらに、遺伝子にコードされるポリペプチドおよび同ポリペプチドを特異的に認識する抗体の提供も挙げられる。また、適切な栄養要求性の株を提供することも挙げられる。
【０００９】
上記の問題は、コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸またはその相補鎖からなる核酸分子を用いることで本発明により解決される。このような核酸は以下に挙げるものから選択される：
（ａ）配列番号：１に記載のＤＮＡ配列または、それに対応するＲＮＡ配列を有する核酸；
（ｂ）（ａ）に記載の核酸の相補鎖にハイブリッドを形成する核酸；
（ｃ）遺伝暗号を基に、（ａ）および（ｂ）で定義されるＤＮＡ配列に対して縮重している核酸；
（ｄ）コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードし（ａ）〜（ｃ）に記載の核酸およびその相補鎖の一つとハイブリッドを形成する核酸
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載の核酸の一つと少なくとも６０％の相同性がある核酸；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載の核酸の異型であって、その異型が（ａ）〜（ｅ）に記載の核酸に対する付加、欠失、挿入、または逆位を有する核酸の異型；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）に記載の核酸の一つの核酸の断片；
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）に記載の複数の核酸の組み合わせであって、
核酸またはその相補鎖にコードされるポリペプチドが、配列番号：２に記載のコリスミ酸ムターゼのコリスミ酸ムターゼ活性の少なくとも１０％を有するポリペプチド。
【００１０】
微生物および植物における芳香族アミノ酸の生合成は、エリスロース−４−リン酸およびホスホエノールピルビン酸からコリスミ酸に至るシキミ酸経路の７種の酵素による媒介反応から始まる（図１）。コリスミ酸は最初の分岐点の基質である。パン酵母サッカロミセス・セレビシエでは、この分岐点を出発点として一方で酵素アントラニル酸シンターゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．３．２７）によりアントラニル酸が生成し、もう一方では酵素コリスミ酸ムターゼ（Ｅ．Ｃ．５．４．９９．５）によりプレフェン酸が生成する。最終的に別の中間産物を経て、プレフェン酸からチロシンとフェニルアラニンが生成する（Ｂｒａｕｓ、１９９１）。パン酵母サッカロミセス・セレビシエでは、コリスミ酸ムターゼは第ＸＶＩ染色体のＡＲＯ７遺伝子にコードされている（Ｓｃｈｍｉｄｈｅｉｎｉら、１９８９）。ＡＲＯ７は０．９５ｋｂのｍＲＮＡをコードし、７７１ｂｐのオープンリーディングフレームを含み、これは２５６アミノ酸からなるタンパク質をコードする。
【００１１】
下記に、本出願との関連でどのように理解されるべきかを明らかにするために、各用語を詳しく説明する。
【００１２】
本明細書で使用する「コリスミ酸ムターゼ」という用語は、完全なコリスミ酸ムターゼ、コリスミ酸ムターゼの断片、コリスミ酸ムターゼの変異体、およびそれらの融合タンパク質を含む。本発明では、配列番号：２に記載のコリスミ酸ムターゼの少なくとも１０％のコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドを対象とする。
【００１３】
「コリスミ酸ムターゼ活性」とは、酵素コリスミ酸ムターゼ［Ｅ．Ｃ．５．４．９９．５］で触媒されるフェニルアラニンおよびチロシンの生合成の一部としてのコリスミ酸からプレフェン酸への触媒的変換を意味する。本発明のポリペプチドのコリスミ酸ムターゼ活性は例えば、産物プレフェリンから３２０ｎｍに吸光を示すフェニルピルビン酸への酸触媒変換を介して分光光度的な方法で測定される（Ｓｃｈｍｉｄｈｅｉｎｉら、１９８９）。
【００１４】
成長または増殖について「原栄養」微生物は、単純な栄養素（炭素および窒素）およびミネラルのみを必要とするが、それ自身で必要なすべてのアミノ酸を合成することができる。したがって「最小培地」で成長可能である。
【００１５】
これに対し「栄養要求性」の微生物は、別の因子群、例えば対象となる因子については生合成経路を欠くために自身が合成できないアミノ酸を必要とする。本発明における栄養要求性は、好ましくはフェニルアラニン／チロシン要求性であり、これは例えば、本発明で調製された栄養要求性酵母株のコリスミ酸ムターゼ活性の低下または消失が原因である。
【００１６】
「最小培地」は栄養素を含む溶液を意味し、原栄養微生物の増殖に必要な成分のみを含む。本発明における最小培地は、好ましくはフェニルアラニンおよび／またはチロシンを含まない培地であり、原栄養型の微生物と比較することで、微生物のフェニルアラニン／チロシン要求性型の選択が可能となる。
【００１７】
「Ｈｉｓ」タグは、少なくとも６残基のヒスチジンアミノ酸の配列を意味する。これを適切にクローニングし、発現可能な配列と融合させることで、アミノ末端に少なくとも６個のヒスチジン残基を有する融合タンパク質を作ることができる。この融合タンパク質は、Ｎｉ^２＋カラムと錯体を形成させることで容易に精製することができる。
【００１８】
「異種遺伝子」とは、それ自身の（同種の）プロモーターの制御下で発現するのではなく、または、それが由来する微生物で発現するのではなく、または、それ自身のプロモーターの制御下でもオリジナルの微生物内でも発現されない構造遺伝子のコード領域を意味するものとして理解される。
【００１９】
「クローニング」は、当技術分野で周知であるあらゆるクローニング法を含むことを意図しており、本明細書において使用される可能性があるが、当業者にとって自明のツールであることから必ずしもすべてを詳細に説明しない。
【００２０】
「適切な宿主細胞における組換え体の発現」とは、既知の発現システムに関して当技術分野で周知のあらゆる発現法を意味し、本明細書において使用される可能性のあるあらゆる方法を意味するものとして理解されるが、当業者にとって自明のツールであることから必ずしもすべてを詳細に説明しない。
【００２１】
ハンセヌラ・ポリモルファを形質転換して、サッカロミセス・セレビシエのａｒｏ７Δ欠失株のフェニルアラニン／チロシン要求性を機能的に相補する能力をもつゲノムクローンを選択して配列を決定することで本発明者らは、本発明の核酸を同定することと、この核酸を有するメチロトローフ酵母の栄養要求性変異体を作製することに初めて成功した。これにより、さらに至急必要なメチロトローフ酵母の形質転換系が提供される。この形質転換系では、できるかぎり単純な培地を用いた形質転換酵母の標的選択が可能となる。
【００２２】
本発明者らは、ハンセヌラ・ポリモルファの染色体ＤＮＡの制限酵素切断断片をシャトルベクターにクローニングすることで、ハンセヌラ・ポリモルファ由来のゲノムバンクを調製した。該シャトルベクターは酵母内でコピー数が多く、ハンセヌラの遺伝子群は、その内因性プロモーターの制御を受けてサッカロミセス・セレビシエで発現する。このゲノムバンクは、栄養要求性のサッカロミセス・セレビシエ株の相補に使用したが、ハンセヌラ・ポリモルファの内因性プロモーターが、サッカロミセス・セレビシエ内で活性であるか否かは不明である。
【００２３】
予想に反して現在では、ハンセヌラ・ポリモルファ由来のコリスミ酸ムターゼ遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ内で転写・翻訳されること、および酵素活性を有することが判明している。
【００２４】
複数の理由から、特にコリスミ酸ムターゼ遺伝子がサッカロミセス・セレビシエ内で発現することは予測されていなかった。
【００２５】
したがって、ハンセヌラ・ポリモルファ由来のコリスミ酸ムターゼ遺伝子がイントロンを含むか否か、またサッカロミセス・セレビシエのスプライシング装置が、プレＲＮＡの正確なプロセシング能力をもつか否かは不明であった。将来的にはハンセヌラ・ポリモルファに由来するコリスミ酸ムターゼ遺伝子にはイントロンがないことが示されると考えられる。
【００２６】
さらに、その翻訳産物がサッカロミセス・セレビシエ内で正確に折りたたまれれ、また必要に応じて集合し、コリスミ酸からプレフェン酸への反応の触媒能力を有する十分な活性のあるコリスミ酸ムターゼを供与できるか否かを予測することはできていなかった。この予測ができないという点は、ハンセヌラ・ポリモルファに由来するＬＥＵ２ホモログであるＨＬＥＵ２には、サッカロミセス・セレビシエにおいて対応する変異の相補能力がないという事実により支持される（Ａｇａｐｈｏｎｏｖら、１９９４）。
【００２７】
さらに、芳香族アミノ酸であるチロシンおよびフェニルアラニンのハンセヌラ・ポリモルファにおける生合成が、酵素コリスミ酸ムターゼの作用によりコリスミ酸からプレフェン酸への変換にかかわるということは全く知られていなかった。芳香族アミノ酸の生合成にはかなり大きな差があることが実際に知られている。いくつかのシアノバクテリアでは、プレフェン酸はアミノ基転移により最初にアロゲン酸に変換される。この経路はまた植物でも認められ（ＪｅｎｓｅｎおよびＳｔｅｎｍａｒｋ、１９７５）、サッカロミセス・セレビシエおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で用いられるヒドロキシフェニルピルビン酸／フェニルピルビン酸経路と比べて自然界に広く分布している。
【００２８】
本発明の核酸分子に含まれる核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡとすることができる。この場合、合成ＤＮＡ配列は、ヌクレオシド間結合の修飾を含む配列を意味する配列としても理解できる。また核酸はＲＮＡ配列とすることができ、例えば、組換えベクターシステムによる発現に必要となる場合がある。（ｂ）に記載の核酸は、例えば、微生物に由来するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うために（ａ）に記載の配列の１つ、またはその断片もしくはその相補鎖に対応する検出用標識プローブを使用することで得られる。このようなバンクを作製する際に元となる微生物は、以下に挙げる属から選択される属に属することが好ましい：ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリュイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）。特に、このような微生物は以下に挙げる種から選択される種に属する：ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）。この場合、陽性のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンの同定は標準的な方法で行われる。マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８９）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照されたい。
【００２９】
好ましい態様では（ｂ）または（ｄ）に記載のハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件では例えば、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、２５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中における６５℃で一晩のインキュベーションと、それに続く２×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ中における６５℃での洗浄が挙げられる。
【００３０】
好ましい態様では、核酸は（ａ）に記載の核酸配列に対して少なくとも６０％の相同性があるものとして提供される。好ましくは、核酸は（ａ）に記載の核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性がある。特に好ましくは、核酸は（ａ）に記載の核酸配列に対して少なくとも９０％または９５％の相同性がある。
【００３１】
本発明における「相同性」という表現は、ＤＮＡレベルにおける相同性を意味し、これは既知の方法、例えばコンピュータを用いた配列比較で決定することができる（Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ、Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）、４０３〜４１０）。
【００３２】
「相同性」という表現は当業者に周知であり、配列間の一致率で決定される２つまたはそれ以上の核酸分子間の関連性の程度を意味する。「相同性率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、ギャップまたは他の配列特性を考慮した上での２つまたはそれ以上の配列における同一領域のパーセンテージとして得られる。
【００３３】
相互に関連のある核酸分子の相同性は既知の方法で決定することができる。一般には、特別の必要条件を考慮したアルゴリズムを用いる特別のコンピュータープログラムが用いられる。
【００３４】
相同性決定の好ましい方法では、最初に対象配列間の最大の一致率を求める。相同性決定に用いられるコンピュータープログラムには、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２（１２）：３８７（１９８４）；ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ、マジソン、ウィスコンシン州）を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ならびにＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０））があるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴＨａｎｄｂｏｏｋ、ＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．ら、ＮＣＢＮＬＭＮＩＨメリーランド州ベセスダ２０８９４；ＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０））から入手することができる。既知のスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムも相同性の決定に使用することができる。
【００３５】
核酸配列の比較における好ましいパラメータの例を以下に挙げる：
アルゴリズム：ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴァンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０）
比較マトリックス（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｍａｔｒｉｘ）：マッチ＝＋１０
ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ（ｇａｐｐｅｎａｌｔｙ）５０
ギャップ長さペナルティ（ｇａｐｌｅｎｇｔｈｐａｎａｌｔｙ）：３
【００３６】
ＧＡＰプログラムも上記パラメータによる使用に適している。上記のパラメータは、核酸配列比較用のデフォルトのパラメータである。
【００３７】
アルゴリズムの別の例では、ギャップオープニングペナルティ（ｇａｐｏｐｅｎｉｎｇｐｅｎａｌｔｙ）、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｅｎａｌｔｙ）、および比較マトリックス（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｍａｔｒｉｘ）（いずれもプログラムハンドブック、ウィスコンシンパッケージ第９版、１９９７年９月における命名）が使用される。それぞれの選択は、対象となる比較、さらには比較が配列ペア間で行われるか否か、どの時点でギャップ（ＧＡＰ）もしくはベストフィット（ＢｓｓｔＦｉｔ）を優先させるか、または、ある配列と大規模配列データベースとの比較であればどの時点でＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを優先させるか、の各状況に依存する。
【００３８】
前出のアルゴリズムで６０％の一致率があることが判明した場合、本出願では６０％の相同性があると記述する。これより大きい相同性についても同様に扱う。
【００３９】
好ましい態様では、本発明で対象とする核酸は（ａ）〜（ｆ）に記載された複数の核酸の組み合わせであり、当業者に周知である融合および必要に応じてクローニングにより得られる。このような組み合わせは例えば、免疫源性を有するコンストラクトを作製する際に極めて重要な場合がある。
【００４０】
さらに好ましい態様では、本発明で対象とする核酸にコードされたポリペプチドは、配列番号：２に記載のコリスミ酸ムターゼのコリスミ酸ムターゼ活性を少なくとも５０％有する。特に好ましくは、ポリペプチドは配列番号：２に記載のコリスミ酸ムターゼ活性の少なくとも７５％を有する。この場合、前述の通りコリスミ酸ムターゼ活性はシュミデイニ（Ｓｃｈｍｉｄｈｅｉｎｉ）ら、１９８９にしたがって測定される。
【００４１】
別の態様では、核酸分子はその発現に適したプロモーターを含み、該核酸分子はプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターの選択は、発現に使用される発現系、特に宿主生物の選択に依存する。本発明では、ＰＧＫプロモーターおよびＧ３ＰＤＨプロモーターなどの構成的プロモーターに加えて、ＧＡＬ４、ＡＤＨ２、および銅メタロチオネインのプロモーターなどの誘導性プロモーターが好ましい（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第６３巻、ツァン（ＲＳＴｕａｎ）編、第ＩＩＩ章；シェナ（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．）ら（１９９１）、Ｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅａｎｄｉｎｄｕｃｉｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｙｅａｓｔ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１９４、３８９〜３９８の調査による）。さらに、転写を上昇させる哺乳類のグルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ）の使用も本発明で考慮される（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１（１９８８）、９６５〜９６７）。
【００４２】
また、メチロトローフ酵母、特にハンセヌラ・ポリモルファのメタノール代謝にかかわるプロモーターも好ましい。ハンセヌラ・ポリモルファのメタノール代謝酵素の遺伝子は、これまで調べられた酵母のなかでも、極めて強く発現・調節される遺伝子の一つである（ＶａｎｄｅｒＫｌｅｉら、１９９１）。対応するタンパク質は、細胞の総タンパク質量の最大３０％となる場合がある（Ｊａｎｏｗｉｃｚら、１９８５；Ｌｅｄｅｂｏｅｒら、１９８５）。メタノール代謝にかかわる遺伝子の発現は、一方ではメタノールで誘導され、他方ではグリセロールの存在により脱抑制される。このように、メタノール代謝にかかわる強いプロモーターも、メタノールを含まない培養条件下における異種遺伝子の発現に使用することができる。
【００４３】
特に好ましいプロモーターは、ハンセヌラ・ポリモルファで調べられたメタノールオキシダーゼＭＯＸのプロモーターであり、約１．５ｋｂと異常に大きく、これまで報告された酵母のプロモーターのなかで最も強力なプロモーターである。グルコースが存在するとＭＯＸプロモーターは抑制されるが、このプロモーターの活性は、グリセロールまたはメタノールにより１０００倍以上に上昇させることが可能である（Ｇｏｄｅｃｋｅら、１９９４）。さらに特に好ましいプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼＤＡＳのプロモーター（Ｌｅｄｅｂｏｅｒら、１９８５）およびＦＭＤプロモーター（欧州特許第２９９１０８号）である。
【００４４】
別の好ましい態様では、核酸分子はまた、発現したタンパク質を確実に輸送するための核酸配列をコードするシグナルペプチドを含む。この場合、シグナルペプチドがコードする核酸配列は、発現対象の異種遺伝子の５’端に直接結合させることが好ましい。多くの真核生物におけるタンパク質の分泌および修飾に関しては、ポリペプチドを分泌装置へ導くために、タンパク質配列のＮ末端にシグナル配列を融合させることが必要である。これを可能にするものとして例えば、サッカロミセス・オクシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）の遺伝子ＧＡＭ１（Ｄｏｈｍｅｎら、１９９０）およびミドリガニ（Ｃａｒｃｉｎｕｓｍａｅｎａｓ）のホルモン遺伝子（Ｗｅｙｄｅｍａｎｎら、１９８９）に由来する成分がある。これらを用いることでヒルジンを分泌させることに成功している（Ｗｅｙｄｅｍａｎｎら、１９９５）。
【００４５】
別の好ましい態様では、本発明の核酸分子はベクターの少なくとも一部（特に制御領域）も含む。このようなベクターの例を以下に挙げる：λ誘導体などのバクテリオファージ、プラスミド、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０ウイルス、およびレトロウイルス（好ましくはＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス））。
【００４６】
特に好ましいベクターは酵母の形質転換用ベクターであり、組み込み型酵母プラスミド（ＹＩｐ）および染色体外プラスミドベクターはいずれも利用可能である。染色体外プラスミドベクターはさらにエピソーム性酵母プラスミド（ＹＥｐ）、複製型酵母プラスミド（ＹＲｐ）、および酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）に分類される（上記のＳｉｎｇｈ，Ｋ．Ｋ．およびＨｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．による「ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ」の第１１章を参照）。さらに人工酵母染色体（ＹＡＣ）も、本発明における発現ベクターとして使用される可能性がある。
【００４７】
また特に好ましいベクターには、複製起点ｏｒｉおよび抗生物質耐性カセットを含む酵母複製型プラスミドがある。このベクターは大腸菌において増殖および選択が可能である。さらにこのプラスミドは、例えばハンセヌラ・ポリモルファのＨＡＲＳ１などの、酵母細胞内で染色体に依存しない複製を担うＡＲＳ配列、およびＵＲＡ３やＨＬＥＵ２などの代謝関連の酵母選択マーカーを含む（ＧｅｌｌｉｓｅｎおよびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、１９９７）。
【００４８】
これまでに多くの異種タンパク質がハンセヌラ・ポリモルファで作製されており（ＧｅｌｌｉｓｓｅｎおよびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、１９９７）、一つの形質転換ベクター上に複数の発現カセットを配置することで様々な遺伝子を同時に発現させることも可能となっている（Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９４）。
【００４９】
また核酸分子には、ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ配列を追加的に含めることが好ましい。Ｈｉｓタグがコンストラクトで発現することで、アミノ末端にＨｉｓタグを有した融合タンパク質が生成し、ニッケルカラム上にキレートを生成させることでタンパク質の精製が容易になる。
【００５０】
本発明では、本発明の核酸分子を含み、かつ異種遺伝子の発現に適した宿主細胞が提供される。当技術分野では原核細胞および真核細胞の発現系が多く知られており、宿主細胞は例えば大腸菌や枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核細胞のほか、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、またはＨｅＬａ細胞、およびそれらの誘導細胞）などの真核細胞から選択される。当技術分野では例えばＣＨＯ細胞に匹敵するようにグリコシル化パターンを修飾したＣＨＯ産生系列が知られている。
【００５１】
酵母は、以下の属に属することが好ましい：ピキア、ハンセヌラ、カンジダ、トルロプシス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、クリュイベロミセス、およびヤロウィア。また特に微生物は以下の種に属する：ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、クリュイベロミセス・ラクティス、およびヤロウィア・リポリティカ（上記のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙを参照）。
【００５２】
本発明の別の目的に、コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドの作製方法がある。この目的のために、本発明で対象とする核酸分子は適切な宿主細胞で発現され、そのタンパク質は宿主細胞または培地から標準的な手法で分離される。
【００５３】
ＤＮＡ配列の発現に関する多くの方法が当業者に周知である。これについては上述のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙを参照されたい。発現は、構成的発現でも誘導的発現でもよく、ＩＰＴＧおよびＺｎ^２＋などの誘導物質は当業者に周知である。産生されるコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドは、そのアミノ末端にＨｉｓタグを融合させることで、ニッケルカラム上でキレートを生成させることで精製される。コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過クロマトグラフィーで精製することが好ましい。これらの手法の実施手順は当業者に周知である。
【００５４】
さらに好ましい態様では、本発明で産生されるコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドは修飾を受ける。この場合の修飾には、例えば架橋（例えばジシクロヘキシルカルボジイミドやＰＥＧ利用（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）もしくは集合（自己集合化）など）によるモノマーを出発物質とする二量体、オリゴ体、およびポリマーの形成などがある。他の修飾には、側鎖の修飾、例えばポリペプチドのε−アミノ−リジン残基や、アミノ末端またはカルボキシ末端の修飾などがある。その他の修飾には、翻訳後の処理、例えばタンパク質のグリコシル化や部分的または全体にわたる脱グリコシル化が含まれる。
【００５５】
好ましい態様では、原核生物またはグリコシル化能を欠損した真核生物における組換え体の発現で得られるポリペプチドはグリコシル化されない。また、本発明で考慮されるのはコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドであって、グリコシル化能力をもつ真核細胞（酵母細胞、昆虫細胞、または、ＣＨＯ細胞もしくはＨｅＬａ細胞などの哺乳類細胞）における組換え体の発現でグリコシル化されるものである。
【００５６】
別の態様では、コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドは、本発明で対象とする一つまたは複数の核酸分子によりコードされたアミノ酸配列を含むように作製することができる。
【００５７】
好ましくは、コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列またはその断片であって、配列番号：２のコリスミ酸ムターゼの少なくとも１０％、好ましくは５０％以上、また特に好ましくは７５％以上のコリスミ酸ムターゼ活性を有するものを利用することができる。
【００５８】
本発明の別の態様では、組換え体の作製方法またはそれを修正して得られるコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【００５９】
さらに、コリスミ酸ムターゼ活性を有する非グリコシル化ポリペプチドおよびグリコシル化ポリペプチドであってグリコシル化能をもつ、またはグリコシル化能をもたない宿主細胞における発現で得られるポリペプチドが提供される。ポリペプチドの目的とする用途に応じて、特にハンセヌラ・ポリモルファなどのメチロトローフ酵母などの酵母のグリコシル化のパターン、またはＣＯＳ細胞もしくはＨｅＬａ細胞のグリコシル化のパターンが好ましい。
【００６０】
本発明はさらに、コリスミ酸ムターゼ活性を有する本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体であって、実験動物を同ポリペプチドで免疫化して得られる抗体を提供する。ポリクローナル抗体は、例えばウサギ、マウス、またはラットを免疫化した後に抗血清を抽出することで得られる。モノクローナル抗体は、例えばマウスを免疫化して脾臓細胞を抽出および不死化し、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を産生するハイブリドーマをクローン化することにより標準的な手法で得られる。
【００６１】
本発明の別の態様では、フェニルアラニンおよびチロシン要求性の酵母株を産生する方法を提供する。この方法では、対応する酵母株の内因性のコリスミ酸ムターゼ遺伝子を破壊し、変異体は配列番号：２に記載されるコリスミ酸ムターゼのコリスミ酸ムターゼ活性の１０％未満を示す。
【００６２】
本発明では、変異体を産生する方法として相同組換えを利用することができる。相同組換えによるコリスミ酸ムターゼ遺伝子の破壊は、この遺伝子の内因性の染色体コピーを不活性化されたコピーと置換することに基づく。破壊コンストラクトの調製では、この遺伝子のより大きな領域が破壊されたクローニングが、好ましくは５’領域および３’領域を含む効率のよい相同組換えに必要となる。クローン化された領域は少なくとも２ｋｂの長さをカバーすることが好ましい。
【００６３】
ハンセヌラ・ポリモルファ由来のゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩで切断した後に、コリスミ酸ムターゼに特異的なプローブ（例えば配列番号：３）でサザンブロット解析を行ったところ、それぞれ３．２ｋｂと３．０ｋｂの２本のバンドが得られた。さらに調査したところ３．２ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＢｇｌＩＩ断片は配列番号：３に記載の６９０ｂｐに加えて５’側の隣接領域を含んでいた。３．０ｋｂのＢｇｌＩＩ断片は、配列番号：３に記載の９６０ｂｐに加えて３’側の隣接領域を含んでいる。３．２ｋｂ断片と３．０ｋｂ断片の、当業者に周知の標準手段による分離および標的融合（ｄｉｒｅｃｔｅｄｆｕｓｉｏｎ）により６．２ｋｂの断片が得られる。この断片はコリスミ酸ムターゼ遺伝子と長い５’側および３’側の隣接領域を含む。
【００６４】
本発明で破壊対象となる核酸は、好ましくは配列番号：１に記載の核酸またはそれと相同な核酸であり、特に好ましくは配列番号：３に記載の核酸またはそれに相同な核酸であり、特に６．２ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を含む核酸、それに相同な核酸、またはその一部の核酸がクローニングされ、オリゴヌクレオチド交換による変異導入の対象となる。この場合、変異には対象となる遺伝子の発現を低下させたり、不活性な翻訳産物を産生したりする付加、欠失、逆位、または置換が含まれる。このような変異は好ましくは、少なくとも一つの領域またはその一部分で起こり、アミノ酸の位置（配列番号：２）として１０〜２０位、１５４〜１６７位、１９２〜１９６位、および２４０〜２４７位に対応する核酸上の位置から選択される。これらの領域は、コリスミ酸ムターゼの触媒中心を形成すると考えられている部分である。コリスミ酸ムターゼをコードする核酸は、より長いオリゴヌクレオチド中にクローニングすることで不活性化することが好ましい。
【００６５】
内因性のコリスミ酸ムターゼ遺伝子は単コピーの遺伝子として存在することが好ましい。
【００６６】
オリゴヌクレオチド交換に使用するオリゴヌクレオチドは、抗生物質耐性または代謝マーカーなどの少なくとも一つの選択マーカーを含むことが好ましい。本発明では当技術分野で周知のあらゆる選択可能マーカーが対象とされる。または、このコンストラクトは合成して調製することもできる。効率のよい相同組換えのためには、コンストラクトの長さは少なくとも２ｋｂである必要がある。
【００６７】
クローン化されるオリゴヌクレオチドは、５’側および３’側の両側でコリスミ酸ムターゼに特異的な断片と接する。この配列は請求項１（ａ）〜（ｈ）に記載の配列に対応しており、またはこれらに相補的であり、またオリジナルの染色体コピーとハイブリッドを形成可能である。
【００６８】
破壊変異体を作製する際には、最初にこのコンストラクトを直鎖状にする。次に破壊変異体の作製に使用する原栄養酵母株を上記コンストラクトで形質転換する。このコンストラクトは選択マーカーを含むので、形質転換体を適切な選択圧の下で選択することができる。フェニルアラニン／チロシン要求性の形質転換体は、フェニルアラニン／チロシンを含まない培地上で増殖させることで同定される。
【００６９】
好ましい態様では、この方法は以下の段階からなる：
ａ）相同組換えに適し、相同組換えに不適な核酸に隣接する請求項１（ａ）〜（ｈ）に記載の核酸の少なくとも２つの断片を含むコンストラクトの調製；
ｂ）完全な内因性コリスミ酸ムターゼ遺伝子を有する酵母株細胞の、上記コンストラクトによる形質転換；および
ｃ）フェニルアラニンおよびチロシン要求性の形質転換体の同定。
【００７０】
特に好ましくは、このコンストラクトは選択マーカー遺伝子も含む。さらに同コンストラクトは一つまたは複数の組換え部位（好ましくは選択マーカーの５’側および３’側に隣接し、内因性のコリスミ酸ムターゼ遺伝子が破壊された後に同コンストラクトから選択マーカーの除去を可能とする組換え部位）を含めることができる。
【００７１】
組換え部位はｌｏｘＰであることが好ましい。特に好ましい態様では、この方法はさらに段階ｂ）を含む。この段階では、酵母細胞をＣｒｅリコンビナーゼの発現に適した核酸に接触させ、その結果としてｌｏｘＰ／Ｃｒｅリコンビナーゼ組換え系による選択マーカーの除去が可能となる。
【００７２】
特に好ましい態様では、この酵母株はハンセヌラ・ポリモルファである。
【００７３】
本発明の別の態様では、フェニルアラニンおよびチロシン要求性の酵母株が提供される。このような株は例えば本発明の方法で得られる。
【００７４】
別の態様では、タンパク質の組換え体作製法は、以下の段階を含むように提供される：
ａ）本発明の栄養要求性酵母株の、発現に適した本発明の核酸と、適切なプロモーターの制御下における発現に適した異種遺伝子の組み合わせによる形質転換；
ｂ）異種遺伝子の発現および本発明の核酸分子の発現に適した条件下における形質転換体の培養、および必要に応じて、異種遺伝子にコードされたタンパク質の分離。
【００７５】
好ましい態様では、この方法はさらに、フェニルアラニンおよび／またはチロシンを含まない培地上における形質転換体を選択する段階を含む。
【００７６】
本発明による組換え体の作製方法は、本発明の核酸分子および空間的に互いに分かれた異種遺伝子を用いて行うことができる。この場合、２つの要素は２つのベクター（バイナリベクターシステム）として提供することができ、また相互に独立に形質転換に利用できる。またはコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸分子および異種遺伝子を一つのベクター上に配置することができる。このような融合ベクターには、選択マーカー遺伝子および異種遺伝子が相互に共有結合で結合されているために、形質転換後にすべての原栄養性クローンが異種遺伝子も含み、その結果としてスクリーニングの手間を軽減させるという利点がある。
【００７７】
本発明による、異種遺伝子の発現に好ましいプロモーターおよびベクターは、本発明の核酸分子の発現に関して上述したプロモーターおよびベクターに対応する。このベクターは、組換えタンパク質を培地中へ分泌させるためのシグナルペプチドをコードする核酸配列も選択的に含み、異種遺伝子の５’側と直接接している。またＨｉｓタグをコードする核酸配列を異種遺伝子の５’端への付加することで、組換え体の発現後にニッケルキレートカラム上における精製が可能となる点も有利である。
【００７８】
本発明はさらに、上述の方法で得られる組換えタンパク質を提供する。
【００７９】
本発明を、図面および実施例を用いて説明するつもりであるが、これらに限定されるものではない。記述および実施例を元に、当業者に受け入れられる他の態様も含まれる。
【００８０】
材料および方法
１．材料
１．１試薬
溶液、緩衝液、および培地を調製するための化学物質はＭｅｒｃｋ社（ダルムシュタット、ドイツ）、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社（ハイデルベルク、ドイツ）、ＣａｒｌＲｏｔｈＧｍｂＨ＆ＣｏＫＧ社（カルルスルーエ、ドイツ）、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カルルスルーエ、ドイツ）、Ｆｌｕｋａ社（ノイウルム、ドイツ）、およびＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ社（シュタインハイム、ドイツ）から入手した。
【００８１】
制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素、およびポリメラーゼはＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ社（ビリニュス、リトアニア）から、ＲＮａｓｅＡはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ社（マンハイム、ドイツ）から購入した。ＤＮＡのサイズ標準としてＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ社の「１ｋｂＤＮＡラダー」（ＧｅｎｅＲｕｌｅｒＰｌｕｓ）を使用した。アガロースはＲｏｔｈから入手した。
【００８２】
大腸菌からのプラスミドＤＮＡの調製および、アガロースゲルからのＤＮＡの抽出にはＱｉａｇｅｎ社（ヒルデン、ドイツ）のキットを使用した。
【００８３】
合成オリゴヌクレオチドはＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｄｕｃｔｓＳｕｐｐｌｙＧｏｔｔｉｎｇｅｎＧｍｂＨ社（ゲッティンゲン、ドイツ）およびＧｉｂｃｏＢＲＬ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＧｍｂＨ、カルルスルーエ、ドイツ）から購入した。
【００８４】
配列決定はＭＷＧ−ＢｉｏｔｅｃｈＧｍｂＨ社（エーベルスベルク、ドイツ）に依頼した。
【００８５】
１．２株、プラスミド、およびオリゴヌクレオチド
クローニングには大腸菌ＤＨ５α株［Ｆ’、φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）、Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７、（ｒ_Ｋ ⁻、ｍ_Ｋ ^＋）、ｓｕｐＥ４４、λ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１］を使用した（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ、１９８９）。また、ハンセヌラ・ポリモルファＲＢ１１株（ｕｒａ３）を使用した（Ｗｅｙｄｅｍａｎｎら、１９９５）。
【００８６】
使用したサッカロミセス・セレビシエの株を表１に示した。
クローニングに必要なプラスミドおよびオリゴヌクレオチドを表２と表３に示した。
【００８７】
【表１】使用したサッカロミセス・セレビシエ株

【００８８】
【表２】使用したプラスミド

【００８９】
【表３】使用したオリゴヌクレオチド

【００９０】
２．方法
２．１微生物の培養
２．１．１大腸菌
この細胞はルリア−ベルターニ培地（ＬＢ：１％トリプトン、０．５％酵母エキストラクト、１％ＮａＣｌ）で３７℃で培養した。アンピシリン耐性マーカーをもつ株については、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを培地に添加した。
【００９１】
２．１．２ハンセヌラ・ポリモルファ
この細胞は「酵母エキストラクト・ペプトンデキストロース培地」（ＹＥＰＤ：２％ペプトン、１％酵母エキストラクト、２％グルコース）または「酵母窒素基礎培地」（ＹＮＢ：０．１５％酵母窒素源、０．５％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ミオイノシトール（２００ｍＭ）、５％グルコース、に本株についてはウラシルを添加）で３７℃で培養した。すべての培地は使用前に蒸気滅菌し、固体培地とするために２％の寒天を添加した。
【００９２】
２．１．３サッカロミセス・セレビシエ
この細胞は「酵母エキストラクト・ペプトンデキストロース培地」（ＹＥＰＤ：２％ペプトン、１％酵母エキストラクト、２％グルコース）または「最小ビタミン培地」（ＭＶ：０．１５％酵母窒素源、０．５２％硫酸アンモニウム、２％グルコース、１％コハク酸、０．３％ＫＯＨ）で３０℃で培養した。Ｌ−アミノ酸やウラシルなどの添加物質はシェルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら（１９８６）の方法で添加し、抗生物質と同様に、滅菌濾過または蒸気滅菌した無菌培地に添加した。固体培地とするために２％の寒天を添加した。酵母細胞の増殖は６００ｎｍにおける光学密度を測定して追跡した。
【００９３】
２．２核酸の分離
２．２．１大腸菌からのＱｉａｇｅｎによるプラスミドＤＮＡの調製
培養した細菌を最初に遠心して沈澱させ、得られた沈澱を０．３ｍｌの緩衝液Ｐ１（製造業者による緩衝液の名称）に再懸濁した。次に０．３ｍｌの緩衝液Ｐ２を添加し、この混合液を５分間室温でインキュベートした。次の段階では、０．３ｍｌの冷却緩衝液Ｐ３を添加し、再び５分間氷中でインキュベートした。次いで同混合液を１０分間遠心（１２，０００ｒｐｍ）し、あらかじめＱＢＴ緩衝液で平衡化しておいたＱｕｉａｇｅｎ−ｔｉｐ２０カラムに上清を添加した。上清がカラムを通過した後に、これを１ｍｌのＱＣ緩衝液で４回洗浄した。結合したＤＮＡは０．８ｍｌのＱＦ緩衝液で溶出した。溶出したＤＮＡは０．７容のイソプロパノールを添加して遠心（３０分、１０，０００ｒｐｍ）して沈澱させた。最後にこのＤＮＡを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、乾燥後に水に溶解した。
【００９４】
２．２．２大腸菌からのプラスミドＤＮＡの分離（ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、１９７９）
大腸菌培養液を５ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ中で３７℃で一晩回転振盪機で培養した。１．５ｍｌの培養液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器に入れて遠心し、細胞を１００ μｌの溶液Ｉ（５０ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．４、４ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に再懸濁した。室温における７分間のインキュベーション後に、２００ μｌの溶液ＩＩ（０．２ｍＭＮａＯＨ、１％ｗ／ｖＳＤＳ）を添加し、この混合液を軽く振盪して５分間氷中でインキュベートした。５０ μｌの溶液ＩＩＩ（３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８）を添加し、混合液を再び軽く振盪してさらに７分間氷中でインキュベートした。細胞残渣を遠心して沈澱させて上清をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）をベースとしたＣＨ_２Ｃｌ_２飽和フェノール４５０ μｌで抽出し、次に４５０ μｌのＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。１ｍｌの冷エタノールを添加してプラスミドを沈澱させ、−２０℃でインキュベートした。３０分間４℃で遠心した後、沈澱を２００ μｌの７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥後に５０ μｌのＴＥ緩衝液（２５ μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む）に溶解した。ＤＮＡを溶解させるために６５℃で５分間加熱し、熱安定性ＲＮａｓｅＡと２０分間３７℃でインキュベートしてＲＮＡを分解した。プラスミドＤＮＡ溶液は−２０℃で保存した。
【００９５】
２．２．３ハンセヌラ・ポリモルファからの染色体ＤＮＡの分離（ＨｏｆｍａｎおよびＷｉｎｓｔｏｎ、１９８７）
１０ｍｌのＹＥＰＤ培地に接種して約１５分間３７℃でインキュベートした。細胞を遠心して沈澱させて０．５ｍｌの滅菌水に再懸濁し、再び遠心して沈澱させた。上清を捨て、０．２ｍｌの溶解緩衝液（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）、０．２ｍｌのフェノール／ＭｅＣｌ_２／ＴＥ、および０．３ｇのガラス球を添加した。細胞を破砕するために上記溶液を３〜４分間振盪した後に、細胞残渣を遠心して沈澱させた（５分間、１３，０００ｒｐｍ）。水相を新しい容器に移し、１ｍｌのエタノールを添加後してＤＮＡを沈澱させ、再び遠心して沈澱させた。沈殿を０．４ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、３ μｌのＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加後に混合液を５分間３７℃でインキュベートした。次に１０ μｌの４Ｍ酢酸アンモニウムおよび１ｍｌのエタノールを添加して遠心してＤＮＡを沈澱させ、上清を捨てて乾燥させた後に５０ μｌのＴＥに溶解した［原文のまま］。
【００９６】
２．３クローニング法
２．３．１ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」；Ｓａｉｋｉら、１９８５）
ポリメラーゼ連鎖反応は、熱に安定な酵素であるＴａｑポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いてＧｅｎｅＡｍｐ（商標）反応容器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で行った。通常５〜５０ｎｍｏｌのプライマーオリゴヌクレオチドと１０〜１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを製造業者の指示通りに２０〜５０ μｌの反応緩衝液に使用した。原則として以下の温度で３０サイクルを行った：９４℃における３０秒間の変性／一定反応温度における３０秒間のハイブリダイゼーション／Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼによる７２℃における３０秒〜３分間の合成。ＰＣＲサイクルは３分間の変性段階から開始し、５分間の最終合成段階で終了した。
【００９７】
２．３．２ＤＮＡの制限酵素による切断
制限酵素を用いた分析目的の反応では、約０．５ μｇのＤＮＡを１〜２ユニットの制限酵素と容量２０ μｌで２〜３時間３７℃でインキュベートした。調製目的の量のＤＮＡの制限酵素による切断では、相応の大用量の酵母と適量の酵素を使用した。反応緩衝液は製造業者の指示通りに使用した。
【００９８】
２．３．３アガロースゲル電気泳動
０．１容量のＤＮＡ用色素（２５％ｗ／ｖフィコール４００、０．２５％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、０．２５％ｗ／ｖキシレンシアノール、２００ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を制限酵素混合液に添加し、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス酢酸、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）に浸した水平アガロースゲルに０．５ μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを加えて電気泳動でＤＮＡ断片を分離した。ＤＮＡのバンドはＵＶトランスイルミネーター（２５４ｍｍ）で検出した。
【００９９】
２．３．４アガロースからのＤＮＡ断片の分離
アガロースゲルからＤＮＡ断片を分離するために、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｎｃｔｉｏｎＫｉｔＰｒｏｔｏｃｏｌのカラムおよび緩衝液を製造業者による使用上の指示にしたがって使用した。このためＤＮＡ断片を最初にゲルから切り出して秤量した。３倍量のＱＸ１緩衝液を添加して１０分間５０℃でインキュベートした。ゲル断片を完全に溶解させた直後に１倍量のイソプロパノールを添加し、同混合液をＱＩＡｑｕｉｃｋカラム上に重層して遠心した。カラムに結合したＤＮＡを洗浄するために０．７５ｍｌのＰＥ緩衝液を添加して再遠心した。最後にＤＮＡを５０ μｌの水で溶出した。
【０１００】
２．３．５ＤＮＡ断片のライゲーション（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）
粘着末端または平滑末端の直鎖状ＤＮＡ断片を総容量２０ μｌの反応混合液中で、ライゲーション緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ、０．６ｍＭＡＴＰ、ｐＨ７．６）および５ユニットのＴ４リガーゼを用いて一晩１５℃または５時間室温でライゲーションした。ＤＮＡ濃度は１〜１０ μｇ／ｍｌとし、ベクター／挿入ＤＮＡのモル比は１：５〜１：１０とした。ライゲーション反応後に同ＤＮＡを精製することなく形質転換に用いた。
【０１０１】
２．４形質転換の方法
２．４．１大腸菌の形質転換（Ｉｎｏｕｅら、１９９０）
２５０ｍｌのＳＯＢ培養液（２％トリプトン、０．５％酵母エキストラクト、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＭｇＳＯ_４）の細胞を指数増殖期で１０分間４℃（１０００×ｇ）で遠心して沈澱させ、８０ｍｌのＴＢ緩衝液（１０ｍＭＰＩＰＥＳ、１５ｍＭＣａＣｌ_２×Ｈ_２Ｏ、２５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ６．７、５５ｍＭＭｎＣｌ_２×Ｈ_２Ｏ）に再懸濁した。インキュベーション（氷上で１０分）後、細胞を４℃で２，５００ｒｐｍで再遠心した。次に沈殿物を２０ｍｌのＴＢ緩衝液中に慎重に再懸濁して７％ＤＭＳＯと慎重に十分混合した。１０分間氷上でインキュベーションした後、コンピテント細胞を取り分け、液体窒素中で凍結ショックを加えて−７０℃で保存した。２００ μｌのコンピテント細胞を１〜１０ μｇのＤＮＡに添加して氷上で３０分間インキュベートした。３０秒間の４２℃における熱ショックを加えた後、この混合液を氷上で凍らせ、８００ μｌのＳＯＣ培地（ＳＯＢ、２０ｍＭグルコースを含む）で処理して３７℃で１時間振盪した。各容量（１０〜９００ μｌ）の細胞培養液を固体選択培地（ＬＢ完全培地の寒天プレートに５０ μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したもの）にプレーティングし、最終的にプレートを一晩３７℃でインキュベートして形質転換細胞がコロニーを形成するのを待った。
【０１０２】
２．４．２サッカロミセス・セレビシエの形質転換（Ｉｔｏら、１９８３を改変）
０．５ｍｌの新鮮な酵母培養液の一晩増殖させたものを形質転換混合液として用いた。細胞を室温で遠心（５分間、３，５００ｒｐｍ）して沈澱させ上清を除いた。次に形質転換用のＤＮＡおよび５０ μｇのキャリアＤＮＡを添加して混合した。最後に０．５ｍｌのＰＥＧ（４０％ＰＥＧ３３５０、０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ＭＤＴＴ）を添加し、形質転換混合液を振盪して少なくとも１２時間室温でインキュベートした。２０分間の熱ショック（４２℃）を加えた後に、この細胞を慎重に遠心し、１ｍｌのＹＥＰＤ中で１時間３０℃でインキュベートした。次に細胞を机上遠心機で５秒間遠心し、上清を捨てた後に残りの液体に再懸濁して選択培地にプレーティングした。
【０１０３】
２．５ハイブリダイゼーションの方法
２．５．１サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）
サザンハイブリダイゼーションでは、約１０ μｇの染色体ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に溶解し、適切な制限酵素を用いて１２時間かけて切断した。切断後のＤＮＡは１％アガロースゲルで分離した。このアガロースゲルを最初に０．２５ＭのＨＣｌで、次に５ＭＮａＯＨ／１．０ＭＮａＣｌで、最後に１Ｍ酢酸アンモニウムで、計３回にわたって各２０分間洗浄した。次に、分離したＤＮＡを１２時間の乾燥ブロッティングによりニトロセルロースメンブレンに転写した。次にメンブレンを２分間２×ＳＳＣ（０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で洗浄して風乾し、最後に紫外光（２５４ｎｍ）下で「架橋反応」を５分間行った。
【０１０４】
このメンブレンを５０ｍｌのチャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）緩衝液（７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、２５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）中で３０分間６５℃でプレハイブリダイゼーションを行った後、半分量のハイブリダイゼーション溶液を廃棄した。次に、放射性標識したＤＮＡプローブを添加してハイブリダイゼーションを一晩６５℃で行った。ハイブリダイゼーション後にメンブレンを２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳで３０分間６５℃で洗浄した後に、Ｘ線フィルムまたはリン光体イメージングプレートを感光させた。
【０１０５】
２．５．２プローブＤＮＡの調製
プローブＤＮＡの調製には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＰｒｉｍｅ−Ｉｔ（ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ）を製造業者の指示通りに使用した。必要となるＤＮＡは事前にＰＣＲで増幅しておいたものをプローブの調製に用いた。
【０１０６】
２．６ハンセヌラ・ポリモルファ由来のコリスミ酸ムターゼの特性解析
２．６．１粗抽出液の調製
各酵母株を個別に添加して酵母細胞をＹＮＢ培地で培養し、ＯＤ_５４６が約４となった時点で集菌した。粗抽出物はクラドルフェール（Ｋｒａｄｏｌｆｅｒ）ら（１９７７）の方法を元にアミコンフレンチプレス（ＡｍｉｃｏｎＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓ）を用いて調製した。
【０１０７】
２．６．２タンパク質量の決定
タンパク質溶液のタンパク質量は、ＢＳＡをタンパク質標準物質としてブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）（１９７６）の方法で決定した。
【０１０８】
２．６．３酵素活性の測定
コリスミ酸ムターゼ活性の測定は、シュミデイニ（Ｓｃｈｍｉｄｈｅｉｎｉ）ら（１９８９）による停止試験（ｓｔｏｐｔｓｅｔ）を一部改変して行った。すべての酵素試験および吸光度測定は３０℃で行った。５００ μｌの反応混合液は５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．６、２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＤＴＴ、および１０ μｌの対象タンパク質分画を含むものとした。コリスミ酸からプレフェン酸へ変換させる反応は、コリスミ酸を最終濃度１ｍＭとなるように添加することで開始し、１０分後に５００ μｌの１ＭＨＣｌを加えて停止した。これはＯＤ_３２０で測定されるプレフェン酸のフェニルピルビン酸への変換にも影響を及ぼす。
【０１０９】
４ｍｌの１ＭＮａＯＨを添加して中和することで反応を終了させた。ＯＤ_３２０の測定をＨ_２Ｏに対して行い、酵素を含まない同様の溶液をゼロ値として使用した。この測定はまた５ μＭのＬ−トリプトファンの存在下でも行った。酵素を含まない側定値のゼロ値を吸光値から差し引いた。フェニルピルビン酸の分子吸光係数（３０℃で１３０９５ μｌ／（ｍｏｌ × ｃｍ））を用いて、変換率（産物のμｍｏｌ／（分 × ｍｇタンパク質））および比活性（変換／ｍｇタンパク質）を算出した。
【０１１０】
結果
１．ハンセヌラ・ポリモルファに由来するゲノム遺伝子バンクの調製
ゲノム遺伝子バンクの調製では、ハンセヌラ・ポリモルファＲＢ１１に由来する染色体を分離し、これを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に切断した。同酵素の認識配列は４塩基からのみなるのでゲノム上に比較的頻繁に現れる。５時間の反応の間にアリコートを１５分間隔で採取し、各反応はＥＤＴＡを添加することで終了させた。このようにして染色体ＤＮＡが確実に切断されて様々な大きさの断片とするようにした。切断後のＤＮＡをアガロースゲルで分離し、１ｋｂ〜１０ｋｂの様々な大きさの分画に分け、それぞれゲルから抽出した。抽出後の断片の分画を、事前にＢａｍＨＩで直鎖状にしておいたベクターｐＲＳ４２６（ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＨｉｅｔｅｒ、１９８９）にライゲーションした（図２）。
【０１１１】
このようにして得られたプラスミドライブラリーで大腸菌を形質転換し、ｂｌａ遺伝子にコードされる抗生物質耐性をアンピシリン存在下で選択した。全体として約１５０，０００個の形質転換体が得られた。これらをＬＢ培地のプレートから洗い流し、グリセリンを添加した後に−２０℃で保存した。
【０１１２】
２．ハンセヌラ・ポリモルファゲノムに由来する１．８ｋｂのＤＮＡ断片は、サッカロミセス・セレビシエのａｒｏ７Δ表現型を相補する。
ハンセヌラ・ポリモルファのゲノムバンクのプラスミドを大腸菌から分離し、サッカロミセス・セレビシエＲＨ２１８５株（ＭＡＴα（Δａｒｏ７：：ＬＥＵ２ｓｕｃ２−δ９ｕｒａ３−５２ｌｅｕ２−３ｌｅｕ２−１１２ｈｉｓ４−５１９）を形質転換して、ＡＲＯ７遺伝子の欠失に起因するＴｙｒ／Ｐｈｅ要求性を相補した。形質転換後の酵母細胞を、ウラシル要求性について最初に選択するためにベクターｐＲＳ４２６（ＳＣ−Ｕｒａ）のＵＲＡ３遺伝子の存在下で選択した後に、最小培地（ＹＮＢ＋Ｔｒｐ＋Ｈｉｓ）に移した。３０℃における約５のインキュベーション段階後、ウラシル、トリプシン、およびフェニルアラニンの非存在下で増殖能力がある３個の形質転換酵母のコロニーが分離された。プラスミドを分離して再形質転換を行った後においてもＲＨ２１８５上のＡＲＯ７欠失の相補性が認められた。制限酵素を用いた解析により、約５ｋｂの付加的なＤＮＡ断片がベクターｐＲＳ４２６中に同定された。さらに同ＤＮＡ断片の位置を決めるためにサブクローニングを行い、得られた断片を再びベクターｐＲＳ４２６にライゲーションした。このような様々なプラスミドで、ゲノムバンクのプラスミドに類似しているものについて、それがＲＨ２１８５中のＴｙｒ／Ｐｈｅ要求性を相補する能力をもつか否かを調べた。その結果、上記能力を有する約１．８ｋｂのＡｐａＩ／ＸｂａＩ断片が得られた。この結果は形質転換を繰り返し行うことで確認した。形質転換後の酵母細胞内のハンセヌラ・ポリモルファ由来の上記１．８ｋｂのＤＮＡ断片（プラスミドｐＭＥ１５２５上にある）では野生型に匹敵するような増殖がみられたが、形質転換後の酵母細胞内のハンセヌラ・ポリモルファ由来の５ｋｂの断片（プラスミドｐＭＥ１５２４上にある）は極めて緩やかに増殖することが注目された（図３）。
【０１１３】
ハンセヌラ・ポリモルファから得られた相補性の１．８ｋｂの断片を確認するために、同断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。ハンセヌラ・ポリモルファ、アスペルギルス・ニードランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびサッカロミセス・セレビシエ由来の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断してプローブでハイブリダイゼーションを行ったところ、ハンセヌラ・ポリモルファについて明瞭なシグナルが検出されたが、サッカロミセス・セレビシエについて得られたシグナルは弱く、アスペルギルス・ニードランスについてはシグナルは得られなかった。さらにサザンハイブリダイゼーションにより、同遺伝子がハンセヌラ・ポリモルファのゲノム上に１回のみ出現することが示された（図４）。
【０１１４】
ハンセヌラ・ポリモルファＲＢ１１に由来するこの１．８ｋｂのＤＮＡ断片の配列を完全に決定し、８４３ｂｐからなるオープンリーディングフレームを同定することができた（図５）。これはサッカロミセス・セレビシエ由来のＡＲＯ７遺伝子と５８％の一致率が認められた。したがってこの断片は、ＡＲＯ７に相同な酵母ハンセヌラ・ポリモルファの遺伝子であると推定され、本明細書ではこれをＨＡＲＯ７と呼ぶことにする。
【０１１５】
３．様々な欠失コンストラクトの調製
ハンセヌラ・ポリモルファに由来する１．８ｋｂのＤＮＡ断片の配列を元に、プライマーＯＬＳＫ３４およびＯＬＳＫ３５を用いて様々なｈａｒｏ７Δ欠失コンストラクトを調製した。これらの様々な欠失コンストラクトでハンセヌラ・ポリモルファを形質転換し、同遺伝子が意図した遺伝子であることを確認し、ハンセヌラ・ポリモルファにコリスミ酸ムターゼのイソ酵素が存在しないことを確認した。
【０１１６】
ハンセヌラ・ポリモルファのＨＡＲＯ７を欠失させることで、同遺伝子が意図した遺伝子であることを最終的に証明することが可能で、この遺伝子に代わる別の遺伝子の存在を調べることができる。また同時にこのような欠失変異体を構築することで、新しい選択の可能性が開ける。ｈａｒｏ７Ａ欠失株の調製では３種の異なる破壊カセットを構築した。ハンセヌラ・ポリモルファのゲノムへの組み込みが必要なことから、相同組換えによりＨＡＲＯ７遺伝子の欠失に影響すると思われるＨＡＲＯ７遺伝子の隣接領域を上記３種のコンストラクトに対して用いた。３’端側の隣接領域はプライマーＯＬＳＫ３４およびＴ７を用いて増幅した後に制限酵素ＡｐａＩおよびＢｇｌＩＩで切断した。５’端側の隣接領域はプライマーＯＬＳＫ３５およびＴ３を用いて増幅した後に制限酵素ＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで切断した。これは、プライマーＯＬＳＫ３４とＯＬＳＫ３５がＢｇｌＩＩの切断部位を有するために可能である（図６）。
【０１１７】
両断片をＡｐａＩ／ＸｂａＩで切断したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩにライゲーションした後に、同ベクターを再びＢｇｌＩＩで開環して様々な破壊カセットを導入した（図７）。
【０１１８】
ｈｉｓＧ：：ＵＲＡ３：：ｈｉｓＧ破壊カセット（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９６）をＢｇｌＩＩで切断して上述のベクターにライゲーションした。ＵＲＡ３マーカーを使用することで、同カセットがハンセヌラ・ポリモルファゲノムに組み込まれたか否かを確認することができる。相同的な統合すなわちＨＡＲＯ７の欠失が実際に起こっているか否かはフェニルアラニン／チロシン要求性の選択により、またサザンハイブリダイゼーションにより明らかにすることができる。ｈｉｓＧ部分はＵＲＡ３マーカーの最終的な除去に都合がよく、これは５−ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）による対抗選択を行うことで確認することができる。これはＵＲＡ３遺伝子産物が５−ＦＯＡの毒性転換を生じ、ＵＲＡ３マーカーのない細胞のみ生存できるようになるためである（Ｂｏｅｋｅら、１９８４）。
【０１１９】
ｌｏｘＰ：：ｋａｎＭＸ：：ｌｏｘＰ破壊カセット（Ｇｕｌｄｅｎｅｒら、１９９６）をＢａｍＨＩで切断して上述のベクターにライゲーションした。ｋａｎＭＸマーカーを使用することで、同カセットがハンセヌラ・ポリモルファゲノムに組み込まれたか否かをカナマイシン耐性（Ｇ４１８）を選択することで確認することができる。ｋａｎ^ｒ遺伝子は繊維性真菌アシビア・ゴシピイ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）の翻訳伸長因子（ＴＥＦ）のプロモーターおよびターミネーターに隣接している（ＳｔｅｉｎｅｒおよびＰｈｉｌｉｐｐｓｅｎ、１９９４）。相同的な組み込みが実際に起こっているか否かは、フェニルアラニン／チロシン要求性の選択およびサザンハイブリダイゼーションによる選択で示すことができる。この系では、欠失が起こった後にゲノムからマーカーが再び除去される可能性がある。これはバクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系を介して起こる（Ｇｕｌｄｅｎｅｒら、１９９６）。プラスミドｐＳＨ４７（Ａｕｓｔｉｎら、１９８１）にはＧＡＬ１プロモーターが上流につながったＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子、およびＡＲＳ、ＣＥＮ、およびＵＲＡ３マーカーなどの要素が含まれる。ガラクトースによりリコンビナーゼの発現が誘導され、これが隣接するｌｏｘＰ領域の組換えによるゲノムからのマーカーの除去に影響を及ぼす。
【０１２０】
ｌｏｘＰ：：ＯＤＣ１：：ｌｏｘＰ破壊カセットは、ｌｏｘＰ：：ｋａｎＭＸ：：ｌｏｘＰ破壊カセット（Ｇｕｌｄｅｎｅｒら、１９９６）に類似しているが、ｋａｎＭＸ遺伝子がハンセヌラ・ポリモルファ由来のＯＤＣ１遺伝子（＝ＵＲＡ３）に置換されている点が異なる（ＭＨｉｌｌｅｒ、私信）。この場合も、欠失が起こった後にゲノムからマーカーが再び除去される可能性がある。この場合のマーカーの除去は、５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）培地上で選択することで確認することができる。これはＯＤＣ１遺伝子産物が５−ＦＯＡの毒性変換を生じて、ＯＤＣ１マーカーをもたない細胞が生存可能となるからである（Ｂｏｅｋｅら、１９８４）。
【０１２１】
ｈｉｓＧ：：ＵＲＡ３：：ｈｉｓＧ破壊カセットでハンセヌラ・ポリモルファＲＢ１１を形質転換したところ、チロシン／フェニルアラニン要求性およびウラシルの原栄養性を有する変異体が得られ、予測された表現型を有していた。
【０１２２】
４．栄養要求性酵母株を用いたタンパク質の組換えによる発現例とプラスミド選択における機能相補性
本発明の核酸分子を用いてハンセヌラ・ポリモルファにおける組換えタンパク質を発現させるために、適切な発現プラスミドを調製することができる。例えばＲｈｅｉｎＢｉｏｔｅｃｈＧｍｂＨ社のプラスミドｐＦＰＭＴ１２１は、このようなプラスミドの基礎として使用される。このプラスミドはＲＢ１１などのウラシル要求性株の形質転換後にハンセヌラ・ポリモルファにおける選択に用いられるサッカロミセス・セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子を有する（Ｗｅｙｄｅｍａｎｎら、１９９５）（ｏｄｃ１またはｕｒａ３）。ハンセヌラ・ポリモルファ由来のＦＭＤプロモーター（ＥＰ−Ｂ−Ｏ２９９１０８）とそれに続くＭＯＸターミネーター配列（Ｇｏｄｅｃｋｅら、１９９４）は発現モジュールとなる。
【０１２３】
制限酵素ＮｄｅＩによる切断後、５ｋｂのＤＮＡ断片をｐＦＰＭＴ１２１から分離することができる。これはＵＲＡ３をコードする配列をもたないプラスミドに対応する。このＤＮＡ断片の突出部をクレノウ処理で埋めた後に、ｐＳＫ６９（配列番号：３）の１．３ｋｂのＥｃｏ７２Ｉ／ＳｓｐＩ断片にライゲーションすることができる。結果として得られるプラスミドには、選択マーカー遺伝子としてハンセヌラ・ポリモルファ由来の酵素コリスミ酸ムターゼをコードするコリスミ酸ムターゼ遺伝子（ＨＡＲＯ７）が含まれる。この選択はチロシンおよびフェニルアラニンに関する原栄養性を対象とする。
【０１２４】
または、１．３ｋｂのＥｃｏ７２Ｉ／ＳｓｐＩ断片を、ＳｍａＩで直鎖状にしたプラスミドｐＦＰＭＴ１２１にクローニングすることができる。この操作を行うことで、ＵＲＡ３およびＨＡＲＯ７の２つのマーカー遺伝子を含む発現プラスミドが得られる。
【０１２５】
異種タンパク質発現用の組換えＤＮＡ断片は、これらのプラスミドのＦＭＤプロモーター領域のすぐ下流にある適切な制限酵素切断部位にクローニングすることができる。この場合、コードされるＤＮＡ配列をハンセヌラ・ポリモルファ内で確実に分泌させて発現産物のプロセシングが行われるためのＤＮＡ配列と融合することが好ましい。制御配列の一例として、サッカロミセス・セレビシエのＭＦα１遺伝子が挙げられる（Ａｒｎｏｌｄら、１９９８）。
【０１２６】
異種発現プラスミドに対する形質転換と、最小培地における増殖により選択される陽性形質転換体［原文のまま］。最小培地と完全培地で交互に増殖させることにより、多世代を経た後に、発現コンストラクトが有糸分裂を経て安定にゲノムに組み込まれたものを同定することができる。次に発現モジュールが宿主ゲノム上で極めて高いコピー数で存在する同株を発現用の株として使用することが好ましい。異種タンパク質の発現は、好ましくはグリセリンを唯一の炭素源とする培地に交換することでグルコース含有培地中での株の培養後にみられる。このような条件下では、異種タンパク質の強力な発現と関連するＦＭＤプロモーターの脱抑制が生じる。最終的にこれは標準的なクロマトグラフィーによる方法で培養上清を精製することで純粋な状態で分離することができる。
【０１２７】
５．ハンセヌラ・ポリモルファ由来の１．８ｋｂの断片はコリスミ酸ムターゼ活性を有するタンパク質をコードする
この１．８ｋｂの断片が、コリスミ酸ムターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むか否かを確認するために、さまざまなプラスミドをもつ酵母株の細胞抽出物をフレンチプレスを用いて調製し、それぞれのコリスミ酸ムターゼ活性を測定した。酵素の比活性を測定するために、サッカロミセス・セレビシエＲＨ２１８５（ｐＲＳ４２６）、ハンセヌラ・ポリモルファＲＢ１１、サッカロミセス・セレビシエＲＨ２１８５（ｐＭＥ１５２４）、およびサッカロミセス・セレビシエＲＨ２１８５（ｐＭＥ１５２５）から細胞抽出物を調製した。ハンセヌラ・ポリモルファに由来する５ｋｂの断片（ｐＭＥ１５２４）さらには１．８ｋｂの断片（ｐＭＥ１５２５）がコリスミ酸ムターゼ活性を担う遺伝子をコードすることを示すことができた（表４）。
【０１２８】
【表４】様々な細胞抽出物のコリスミ酸ムターゼの比活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）

この表は、各対象につき４回の活性測定値の平均値を示す。サッカロミセス・セレビシエＲＨ２１８５＋ｐＲＳ４２６、Ｓ．ｃ．＋ｐＭＥ１５２４、Ｓ．ｃ＋ｐＭＥ１５２５、およびハンセヌラ・ポリモルファＲＢ１１の細胞抽出物の値を測定した。各対象の測定は５００ μＭのトリプトファンの存在下または非存在下で行った。
【０１２９】
６．酵母ハンセヌラ・ポリモルファのＨＡＲＯ７遺伝子の同定
相補性を有する１．８ｋｂのＤＮＡ断片の配列を、Ｔ３プライマーおよびＴ７プライマーを用いて完全に決定した（図５）。
【０１３０】
酵素コリスミ酸ムターゼは、酵母ハンセヌラ・ポリモルファの８４３ｂｐからなる遺伝子にコードされておりＨＡＲＯ７と命名されている。この遺伝子はサッカロミセス・セレビシエのａｒｏ７Δ欠失株のフェニルアラニン／チロシン要求性を、ハンセヌラ・ポリモルファ由来のゲノム遺伝子バンクで相補することでクローン化された。したがって、ハンセヌラ・ポリモルファのプロモーターはサッカロミセス・セレビシエで機能する。イントロンは存在せず、２８０アミノ酸からなる３２ｋＤＡのタンパク質は同配列に由来すると考えられる。ハンセヌラ・ポリモルファ由来のコリスミ酸ムターゼのアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエの同配列と５８％の一致率を示し、アスペルギルス・ニードランスの同配列と４４％の一致率を示す。これらのアミノ酸配列を比較して認められた顕著な特徴は、ハンセヌラ・ポリモルファに由来する配列の２３アミノ酸からなる末端が、サッカロミセス・セレビシエにもアスペルギルス・ニードランスにも存在せず、他の真核生物のコリスミ酸ムターゼのアミノ酸配列にも存在しないことである。
【０１３１】
参考文献

【図面の簡単な説明】
【図１】シキミ酸経路による芳香族アミノ酸の生合成を示す。
【図２】ベクターｐＲＳ４２６へのＤＮＡ断片のライゲーションを示す。このベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで直鎖状にして、ハンセヌラ・ポリモルファのゲノムに由来するＳａｕ３ＡＤＮＡ断片を同切断部位にライゲーションした。このライゲーションはＢａｍＨＩとＳａｕ３Ａの切断部位が相互に互換性をもつために可能となる。
【図３】２種の相補的なＤＮＡ断片で形質転換した細胞の増殖比較を示す。増殖速度の差を強調するために、５ｋｂ（ｐＭＥ１５２４）または１．８ｋｂ（ｐＭＥ１５２４のｐＭＥ１５２５サブクローン）のＤＮＡ断片で相補される細胞の成分を水で希釈し、各希釈段階の２０ μｌを最小培地にアプライした。異なる希釈段階の光学密度は各例で同じであるが、基本的に異なる増殖速度を示す必要があったことから、正確な増殖パラメーターは決定されなかった。
【図４】サッカロミセス・セレビシエのａｒｏ７Δ選択株のフェニルアラニン／チロシン要求性の相補能力を有するハンセヌラ・ポリモルファ由来の１．８ｋｂのＤＮＡ断片と、様々な真菌由来の染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのオートラジオグラフを示す。サッカロミセス・セレビシエ（１）、アスペルギルス・ニードランス（２）、およびハンセヌラ・ポリモルファ（３）に由来する染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、ハンセヌラ・ポリモルファに由来する１．８ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を用いて調製した、^３２Ｐで放射標識したＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させた。
【図５】サッカロミセス・セレビシエのａｒｏ７Δ選択株のフェニルアラニン／チロシン要求性の相補能力があるゲノムの１．８ｋｂの断片（配列番号：３）の配列を示す。５’領域および３’領域を小文字で示し、オープンリーディングフレーム（配列番号：１）、および由来する遺伝子産物の一次配列（配列番号：２）を大文字で示す。
【図６】ＨＡＲＯ７−ＯＲＦの隣接領域の増幅を示す。ＨＡＲＯ７遺伝子の隣接領域は、それぞれプライマーＯＬＳＫ３４／Ｔ７およびＯＬＳＫ３５／Ｔ３を用いて増幅した後に、それぞれＡｐａＩ／ＢｇｌＩＩおよびＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩで切断した。
これは、プライマーＯＬＳＫ３４とＯＬＳＫ３５がＢｇｌＩＩ認識配列を含むために可能である。
【図７】様々な欠失コンストラクトの作製を示す。ＨＡＲＯ７−ＯＲＦの隣接領域をＡｐａＩ／ＸｂａＩで切断したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩに、それぞれＡｐａＩ／ＢｇｌＩＩ断片およびＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ断片としてライゲーションした。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）から市販されている。同ベクターを再びＢｇｌＩＩで開環し、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでそれぞれ切断した破壊用カセットにした。
【配列表】

Claims

コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸またはその相補鎖を含む核酸分子であって、該核酸が以下の（a）〜（h）から選択される核酸分子：
（a）配列番号：1記載のDNA配列、またはそれに対応するRNA配列を有する核酸；
（b）（a）に記載の核酸の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸；
（c）遺伝暗号を基に、（a）および（b）で定義されるDNA配列に対して縮重している核酸；
（d）コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする（ a ）又は（ c ）に記載の核酸およびその相補鎖の一つとストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸；
（e）（a）に記載の核酸と少なくとも９０％の相同性を有する核酸；
（f）（ a ）に記載の核酸の異型であって、（ a ）に記載の核酸に対する付加、欠失、挿入、または逆位を有する異型；
（g）（a）〜（f）に記載の核酸の一つの核酸の断片；
（h）（a）〜（g）に記載の複数の核酸の組み合わせであって、
核酸またはその相補鎖にコードされるポリペプチドが、配列番号：2に記載のコリスミ酸ムターゼのコリスミ酸ムターゼ活性の少なくとも10%を有し、核酸分子がサッカロマイセス・セレビシエに由来するARO7遺伝子の核酸配列を含まないことを条件とするポリペプチド。
デオキシリボ核酸分子であることを特徴とする、請求項1記載の核酸分子。
（e）に記載の核酸が（a）に記載の核酸の一つと少なくとも95%の相同性を有することを特徴とする、請求項1記載の核酸分子。
請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子であって、該核酸にコードされるポリペプチドが、配列番号：2に記載のコリスミ酸ムターゼのコリスミ酸ムターゼ活性の少なくとも50%を有することを特徴とする核酸分子。
請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子であって、該核酸にコードされるポリペプチドが、配列番号：2に記載のコリスミ酸ムターゼのコリスミ酸ムターゼ活性の少なくとも75%を有することを特徴とする核酸分子。
請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子であって、発現制御に適したプロモーターをさらに含み、コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が該プロモーターの制御下にある核酸分子。
プロモーターが、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）に由来するMOXプロモーターまたはFMDプロモーターであることを特徴とする、請求項6記載の核酸分子。
発現および選択的には分泌に適した異種核酸配列をさらに含む、請求項6 または 7記載の核酸分子。
請求項6 〜 8のいずれか一項に記載の核酸分子であって、該核酸分子がベクターの少なくとも一部を含み、該ベクターがバクテリオファージ、プラスミド、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、SV40ウイルス、およびレトロウイルスから選択される核酸分子。
請求項6 〜 9のいずれか一項に記載の核酸分子であって、該核酸が、Hisタグをコードする核酸配列をさらに含み、該核酸分子が発現することでHisタグとの融合タンパク質の形成が導かれる核酸分子。
請求項6 〜 10のいずれか一項に記載の核酸分子を含む天然には存在しない宿主細胞であって、該核酸分子の発現に適した原核細胞または真核細胞である宿主細胞。
原核細胞が大腸菌（E. coli）および枯草菌（Bacillus subtilis）から選択されることを特徴とする、請求項11記載の宿主細胞。
真核細胞がハンセヌラ・ポリモルファおよびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母細胞、昆虫細胞、ならびに哺乳類細胞（好ましくはCHO細胞、COS細胞、およびHeLa細胞）から選択されることを特徴とする、請求項11記載の天然には存在しない宿主細胞。
コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドの製造方法であって、請求項1 〜 9のいずれか一項に記載の核酸分子が適切な宿主細胞で発現し、そのタンパク質が必要に応じて単離される、ポリペプチドの製造方法。
製造されるコリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドが、天然のポリペプチドまたは化学的に修飾されたポリペプチドであることを特徴とする、請求項14記載の方法。
発現が請求項11 〜 13のいずれか一項に記載の宿主細胞で行われることを特徴とする、請求項14 または 15記載の方法。
フェニルアラニンおよびチロシン要求性の酵母株を製造する方法であって、対応する酵母株の請求項１に記載された内因性コリスミ酸ムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の破壊を含み、その変異体が配列番号：2記載のコリスミ酸ムターゼのコリスミ酸ムターゼ活性を10%未満有する株を製造する方法。
以下の段階を含む、請求項17記載の方法：
a）相同組換えに適さない核酸に隣接する、請求項1の（a）〜（h）に記載の、相同組換えに適した核酸の少なくとも2つの断片を含むコンストラクトの調製；
b）該コンストラクトによる、完全な内因性コリスミ酸ムターゼ遺伝子を有する酵母株の細胞の形質転換、および
c）フェニルアラニンおよびチロシン要求性形質転換体の同定。
フェニルアラニン/チロシン非含有培地上における形質転換体の選択をさらに含むことを特徴とする、請求項18記載の方法。
コンストラクトが選択マーカー遺伝子も含むことを特徴とする、請求項17 または 18記載の方法。
請求項18 〜 20のいずれか一項に記載の方法であって、コンストラクトが一つまたは複数の組換え部位をさらに含むことを特徴とする方法。
組換え部位の一つがloxPであることを特徴とする、請求項21記載の方法。
段階b）における酵母株の細胞をさらに、Creリコンビナーゼの発現に適した核酸と接触させることを特徴とする、請求項22記載の方法。
請求項17 〜 23のいずれか一項に記載の方法であって、酵母株がハンセヌラ・ポリモルファであることを特徴とする方法。
フェニルアラニンおよびチロシン要求性の酵母株であって、請求項17 〜 24のいずれか一項に記載の方法により得られる酵母株。
ハンセヌラ・ポリモルファの原栄養酵母株の変異体であることを特徴とする、請求項25記載の栄養要求性酵母株。
以下の段階を含む、組換えによるタンパク質製造方法：
a）請求項6 〜 10のいずれか一項に記載の核酸分子の発現に適した核酸分子と、適切なプロモーターの制御下における発現に適した異種遺伝子を組み合わせた請求項25 または 26記載の栄養要求性酵母株の形質転換；および
b）異種遺伝子および核酸分子の発現に適した条件下における形質転換体の培養、ならびに選択的には異種遺伝子によりコードされたタンパク質の単離。
フェニルアラニンおよび/またはチロシンを含まない培地上における形質転換体の選択段階をさらに含むことを特徴とする、請求項27記載の方法。
核酸分子および異種遺伝子が互いに分かれていることを特徴とする、請求項27 または 28記載の方法。
核酸分子および異種遺伝子が一つのベクター上にあることを特徴とする、請求項27 または 28記載の方法。