JP3566719B2 - 外来性刺激に対する細胞性応答の調整 - Google Patents

Description

本発明はある程度国立衛生研究所補助金HL31782のもとで政府の補助で行われた。本発明に於て政府は一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は短時間の一次的な細胞に影響を及ぼす因子に対する短時間の二次的な応答を制御することによる、外来性刺激に対する細胞性応答の調整に関する。より詳細には、本発明はこれらの刺激に応答して生じる、特定のsn−２非飽和ホスファチジン酸および相当するホスファチジン酸から誘導されたジアシルグリセロールのレベルの上昇を制御するためにキサンチン誘導体を利用することに関している。
背景技術
外来刺激が標的細胞の振舞いに影響を与える機構の一般的な概略は、過去10−20年間にわたって一般的な分子生物学の教科書に記述されてきた。これらの刺激のうちの少なくともいくつかに関しては、細胞表面受容体に対する刺激作用剤の一次的な相互作用は様々な二次的な細胞内のシグナル経路に対する効果として翻訳されるが、この二次的なシグナル経路は、今度は、細胞の挙動に観測可能な効果を及ぼす。これらの二次的な経路のほとんどは、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、フォスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジン酸などのリン酸化されたアシルグリセロール誘導体の合成と加水分解を含んでいる。これらの化合物の構成要素の合成と放出は、標的細胞の性質と与えられた刺激に依存して、細胞増殖、増殖の抑制、分化、活性化等を引き起こす。
アシルグリセロールのリン酸化された誘導体の合成と分解を制御する経路は、複雑で凍結している。外来性刺激のある種の効果は、直ちに、すなわち数秒または１分間の間に観察される。他の種の効果は、外来性の刺激物が表面受容体に結合してから30−60分後に観察される。これらの二次伝令に対する短期間の効果は刺激そのものと関連しており、通常の細胞性作用を制御するリン酸化アシルグリセロール（PAG）経路の状況の評価可能な相互連結はない、と信じられている。
以下に記述するように、標的細胞に対する一次的な刺激の短期間の効果は、ホスファチジン酸（PA）とこのPAの加水分解によって形成される、対応するジアシルグリセロール（DAG）の特定の不飽和亜種のレベルを上昇させることである。DAGがホスファチジルイノシトール（PI）またはホスファチジルエタノールアミン（PE）の加水分解等のその他の二次的機構で生成され得ることは知られている。しかしながら、これらの様々な供給源から得られたDAGのアシル基の性質は同一ではない。とりわけPA加水分解によって得られたDAGは、アラキドン酸（C20:4、この記号はアシル基中のＣの数（20）と、π結合のかず（４）を表わしている）を含まない高レベルのsn−２不飽和を有している。これらのPA/DAGサブセット中に見いだされる典型的な脂肪酸基はオレイン酸（C18:1），リノール酸（C18:2）およびドコサヘキサン酸（C22:6）を含んでいる。
細胞活性化のモデルと出願人によって見いだされた本発明の化合物との関係のさらなる説明は、以下に示される。
標的細胞にとって負の結果をもたらす、例えば、疾病状態（悪性腫瘍、自己免疫疾患、または感染等）または医学的な介在（骨髄移植、または化学療法）の結果からなる一次的な刺激から標的細胞を保護することが望ましい、という数多くの状況背景がある。そのような保護を本発明の方法によってなし得ることができる。
本発明の方法に於て有用な化合物のいくつかは他の状況下で医学的に用いられることが示唆されている。ペントキシフィリン（１−（５−オキソヘキシル−３−、７−ジメチルキサンチン）は、このクラスのキサンチン誘導体のひとつであり、血流の増大に対して医療用として広く用いられている。ペントキシフィリンおよびその血管拡張剤としての使用は、米国特許第3,422,307および3,737,433に開示されている。ペントキシフィリンの代謝の性質はデイビスら、Applied Environment Microbio l（1984）48:327−331によって要約されている。代謝物のいくつかもまた、本発明の化合物である。ペントキシフィリンの一次代謝物である直接の還元産物［１−（５−ヒドロキシヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチン］は、脳血管流を増大させるものとして米国特許4,515,795および4,576,947に開示されている。
さらに、脳血管流の増進におけるこのクラスの化合物の第三アルコール類縁体の使用について多くの特許が出されている。これらは米国特許4,833,146および5,039,666を含んでいる。
さらに、米国特許4,636,507はペントキシフィリンおよびその一次代謝物が、多核白血球が既知の走化性の刺激に対して応答する場合の走化性を刺激する能力があることを記述している。ペントキシフィリンや関連した第三アルコール置換キサンチンがある種のサイトカインの走化性活性を阻害する能力は、米国特許4,965,271および米国特許5,096,906に開示されている。ペントキシフィリンおよびGM−CSFの投与は、同種骨髄移植状態にある患者の腫瘍壊死因子レベルを減少させる（Bianco,J.A.et al.,Blood（1970）76;Supplement l（522A））。
TNFの検出可能なレベルの減少は、移植関連合併症の顕著な減少を付随している。しかしながら、正常の志願者においては、TNFレベルはPTX受容者で高い。従って、TNFレベルの上昇がこのような合併症の一次的な要因となっているわけではない。
本発明によれば、以下に記述する化合物が、様々な刺激に応答する数多くの標的細胞の恒常性の保持に、体系的に使用され得ることが見いだされてた。さらに、そのような化合物を有効な投与量で与えることができる投与方法が開示されている。
本発明の開示
本発明は、外来性あるいはインサイチュの一次的刺激に対する細胞性応答を調整するために、置換されたキサンチンを使用することに関しており、さらに、そのような化合物を有効量投与する特定の方法に関している。
従って、一つの見地からすれば、本発明はある一つの刺激に対する標的細胞の応答を調節する方法を意図しているが、そのような方法は、当該細胞を所定量の下記構造式の化合物と接触させることを含んでいる：

（式中、R¹とR³のうちの一方（そしてただ一方のみ）は、直鎖若しくは枝分かれ鎖のω−あるいは（ω−１）−ヒドロキシアルキル（５−8C）、（ω−１）−オキソアルキル（５−8C）、（ω、ω−１）若しくは（ω−１、ω−２）−ジヒドロキシアルキル（５−8C）、またはアルケニル置換基（５−8C）であり、そして他方は、Ｃの代わりに一つまたは二つの隣接しない酸素原子を所望により含んでいてもよいアルキル置換基（１−12C）であり、そして、R²はＣの代わり一つまたは二つの隣接しない酸素原子を所望により含んでいてもよいアルキル（１−12C）である）。
細胞が刺激されると、sn−２非アラキドン酸不飽和を含むホスファチジン酸（PA）のサブセット及びこのPAから誘導されたジアシルグリセロール（DAG）のレベルの上昇が短期間のうちに刺激剤によってもたらされる。構造式Ｉの化合物はこれらの上昇したレベルの減少をもたらすが、その減少は、細胞を0.5mM濃度のペンドキシフィリン（PTX）で処理することによって達成される減少と等しいか、あるいはそれ以上のものである。この結果、刺激に対する標的細胞の応答の調節が行われる。以下にさらに詳しく説明するように、ペントキシフィリンに類似したこの結果は、ホスファチジルイノシトール（PI）を含む経路ではなく、主に1,2−二重不飽和および１−アルキル、２−不飽和種からなるホスファチジン酸由来の特定の活性化経路を遮断する結果である。これらの化合物は、ペントキシフィリン同様、この経路に関与する酵素を阻害することが示されている。
その他の特定の観点においては、本発明は活性化されたガン遺伝子に応答した腫瘍細胞の増殖を縮小させる方法；化学療法剤のような血球増生を阻害する因子の存在下で血球増生を刺激すること；抗原の存在下でＴ細胞を活性化すること及び抗原の存在下でＢ細胞によって抗体を分泌することを抑制するための方法；エンドドキシンまたはGM−CSFによるマクロファージの活性化を抑制すること；腫瘍壊死因子に対する間葉細胞の抵抗性の増強；増殖因子に応答した平滑筋の増殖の阻害；ヒト免疫不全ウイルスに応答したＴ細胞活性化とウイルスの複製の阻害;IL−１に応答した腎臓糸球体間質細胞の増殖の阻害；および腫瘍壊死因子に応答した骨髄ストローマ細胞の増殖の促進に関している。
作用を受ける細胞を構造式Ｉの化合物と接触させる方法は、インビトロ培養で、生体外での処理で、あるいは構造式Ｉの化合物あるいはそれらの混合物を作用を受ける細胞を有する被験者に投与することによって行うことができる。
さらに別の観点では、本発明は本発明の化合物を哺乳類被験動物に投与することに関しており、その際、酵素P450の活性を減少させるのに効果のある量の薬剤とともに投与することを含んでいる。とりわけ、本発明の化合物をキノロンとともに投与することはその効果を高める。
さらに別の観点では、本発明は、リゾホスファチジン酸アシル転移酵素（LPAAT）およびホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（PAPH）によって制御されている二次的情報伝達経路に対して、候補となっている薬剤の及ぼす影響を評価する方法に関しているが、その方法は、刺激のもとで標的細胞または適当な細胞内要素と、候補となっている薬剤を適切な条件下に於て接触させ、薬剤の存在下および非存在下でPAおよびDAGの関連したサブセットのレベルを評価する、というものである。
【図面の簡単な説明】
図１−11は様々な条件下でIL1刺激およびペントキシフィリン処理を行ったヒト糸球体間質細胞から抽出された脂質の高圧液相クロマトグラフィー（HPLC）で得られた溶出パターンを示している。
図１は休止状態にある細胞のHPLCパターンを示している。
図２はIL−１で刺激して５秒後の細胞由来のHPLCを示している。
図３はIL−１で刺激して15秒後の細胞由来のHPLCパターンを示している。
図４はIL−１で刺激して60秒後の細胞由来のHPLCパターンを示している。
図５は100μＭペントキシフィリン存在下でIL−１で刺激して15秒後の細胞から得られたHPLCパターンを示している。
図６は100μＭペントキシフィリン存在下でIL−１刺激して60秒後の細胞から得られたHPLCパターンを示している。
図７は500μＭペントキシフィリン存在下でIL−１で刺激して15秒後の細胞から得られたHPLCパターンを示している。
図８は1mMペントキシフィリン存在下でIL−１刺激して15秒後の細胞から得られたHPLCパターンを示している。
図９は1mMペントキシフィリン存在下でIL−１刺激して30秒後の細胞から得られたHPLCパターンを示している。
図10は1mMペントキシフィリン存在下でIL−１刺激して45秒後の細胞から得られたHPLCパターンを示している。
図11は1mMペントキシフィリン存在下でIL−１刺激して60秒後の細胞から得られたHPLCパターンを示している。
図12は典型的なHPLCパターンのリゾ−PAピークの高速原子衝突を用いて得られた質量スペクトルを示している。
図13Aおよび13Bは組換えヒトIL−１（図13A）およびTNFα（13B）によって刺激されたヒト糸球体間質細胞に対するペントキシフィリンの効果をグラフ表示している。
図14はヒト白血病細胞系統MO7eによるコロニー形成のGM−CSF刺激に対するペントキシフィリンの効果をグラフ表示している。
図15はU937細胞が、ペントキシフィリンまたはシプロフロキサシンの非存在下および存在下においてLPS刺激を受けた場合のTNFαの転写レベルを示すノザン分析の写真である。
図16はペントキシフィリンの存在下および非存在下での骨髄間質細胞におけるIL−６転写産物を検出するためのノザン分析の写真である。
図17はペントキシフィリンの存在下および非存在下におけるスチール因子（Steel factor）転写産物を検出するためのノザン分析の写真である。
図19A、19Bおよび19CはTNF（図19A）、IL−２（図19B）およびIL−２受容体（図19C）に対するプローブを用いて行った、混合リンパ球反応におけるCD3⁺リンパ球から得られたノザン分析の写真である。
図20はペントキシフィリンの存在下および非存在下での抗−CD₃モノクローナル抗体によって刺激されたCD₂ ⁺細胞の増殖に対するTNFの影響をグラフ表示している。
図21はペントキシフィリンの存在下および非存在下で様々な因子に応答している場合の、抗−CD₃抗体によって刺激されたCD₂ ⁺細胞の増殖に対する効果を示している。
図22はペントキシフィリンの存在下及び非存在下におけるネズミL929細胞に対するTNFの細胞毒性効果をグラフ表示している。
図23Aおよび23Bは様々な化合物のIL−２転写産物に対する効果を示したノザン分析の写真である。
発明を実施するための態様
本発明は二次的伝令経路系の特別な段階に対する特定のキサンチン誘導体の効果を利用して細胞の挙動を制御する方法に関している。特にこの経路に関するこの観点は以下の略号：
PE＝ホスファチジルエタノールアミン
LPE＝リゾホスフォエタノールアミン
PA＝ホスファチジン酸
LPA＝リゾホスファチジン酸
DAG＝ジアシルグリセロール
LPLD＝リゾホスホリパーゼＤ
LPAAT＝リゾホスファチジン酸アシル転移酵素
PAPH＝ホスファチジン酸ホスホヒドラーゼ
PLA2＝ホスホリパーゼＡ−２
PLD＝ホスホリパーゼＤ
PAA＝ホスホアラキドン酸
PLA−２＝ホスホリパーゼＡ−２
PC＝ホスファチジルコリン
を用いた以下の図に要約されている。
”再構築された"PA、循環経路＝示したsn1およびsn2の位置にＬ−飽和、２−リノレオイル−または1,2−ジオレオイル/1,2−sn−ジリノレオイル置換を受けたPAA、LPA,PAおよびDAG中間体。
”古典的PI経路”＝１−ステアロイル、２−アラキドニル脂肪酸側鎖によって置換されたPI,DAG、PA中間体。
"PLD−由来PA"＝例えば1,2−sn−ジオレオイル−、１−アルキル,2−リノレオイル−、および１−アルキル,2−ドコサヘキノイル−側鎖で置換されたPE,PC,LPA,PAおよびDAG中間体。

上述した図に示したように、リゾホスファチダーゼアシル転移酵素は、アシルCoAからアシル基をとりこむことによって、リゾホスファチジン酸からのホスファチジン酸の合成に影響する。PAホスホヒドロラーゼによるリン酸モエイティの加水分解はDAGの生成をもたらす。この経路のこれらの観点は、細胞表面にあるレセプターに対する一次刺激に対して直ちに（１分以内に）活性化されるように見える。以下に示されるように、直ちに起きる観測可能な効果は、PAおよびDAGレベルの上昇である。本発明の化合物の投与はこの上昇を反転させる。
本発明者は、ここで、PA,PI,PE、ホスファチジルコリン（PC）およびホスファチジルセリン（PS）等の膜リン脂質サブクラスの各々は、各サブクラスの代謝回転並びに細胞膜の循環再構築（cyclic remodeling）のために、特徴的な脂質アシル側鎖の一定の含有量に達していることを見いだした。PAは非常に安定で少量存在している。休止期にある細胞のPAはおもに飽和しており、顕著な量のミリスチン酸、ステアリン酸およびパルミチン酸を含んでいる。典型的な休止期の細胞では、PCはおもにsn−１位置のアシルパルミチン酸とsn2位置のオレイン酸から成り立っている。PEおよびPIはおもにsn1のステアリン酸とsn−２のアラキドン酸から構成されている。sn−１およびsn−２位置のアシル基のこの特徴的な含有量のため、例えば、もしPAがPLDの作用を通じてPCから派生しているのならば、この経路を通じて処理されたPC基質に特徴的なアシル側鎖を含むことになる、というように、いかなるPA種の起源もアシル基の性質から推測され得る。さらに、この特徴的なsn−１およびsn−２アシル含有量のため、如何なる1,2−sn−基質種の起源もその起源に関して識別され得る。これは、リン脂質種が加水分解されてDAGとなる前にPA型を経由したのかどうかを知る必要のため、定性分析される。上記で示したように、ホスファチジン酸へ転換し、その後DAGとなるリゾPAは示されることができる。これらの経路の複雑さは、刺激後の様々な時間における細胞内の中間体の脂質アシル側鎖の型の適切な分析によって分類され得る。
本発明者によって、好中球およびラット／ヒト糸球体間質細胞のようなある種の間葉細胞においては、いくつかの二次的情報経路は、逐次的に、同時に、あるいはその両方の状態で活性化され得ることが見いだされた。例えば、好中球においてはＦ−Met−Leu−Pheが、PLDの作用を通じてPAの生成を刺激するが、この場合、続いてPAPHの作用と通じたDAGの生成が起きる；それから数分後,DAGが古典的なホスホイノシチドの経路を通じてPIから生成される。調べられた細胞の多くでDAGは、PAAがPLA−２によってsn−２加水分解を受け、続いてLPAATによってsn−２アシル転移を受ける経路を通じて再構築されたPAと、PLDによってPEまたはPC基質から生成されたPA由来のPLD−経路の両方に由来している。
ここで本発明者によって開発された方法は、例えばPAおよびDAGの様々な亜種の識別を可能にするため、いくつかの亜種が同時に形成される場合もあることが見いだされた。例えば、IL−１刺激後のラット糸球体上皮細胞では、３つの異なったDAG種が形成され、１つはLPAATを含む上述した再構築機構によって再構築されたPAに由来しており、１つはPLDに由来するPAに由来しており、もう１つはPIに由来している。”再構築された"PAは１−飽和、２−リノレオイルPAおよび１、２−ジオレオイル/1,2−sn−ジリノレオイルPAとして特徴付けられる。これらのPAsに由来するDAGは、質量分析基で確認されるように、PAsの脂質アシル側鎖組成を有している。PI由来のDAGは、おもに１−ステアロイル、２−アラキドノイルであり、PA由来DAGから区別される。
本発明の化合物は、１、２−二重不飽和及び１−アルキル、２−不飽和亜種の中間体に対する基質特異性を持つPAPH酵素中にLPAATの亜種の阻害剤を含んでいる。そのような阻害剤の典型的な例の一つは、ここで示すようにPIは含まないが、おもに1,2−二重不飽和および１−アルキル,2−不飽和亜種からなるホスファチジン酸由来の特異的な活性化経路においてPAPHを阻害するペントキシフリンである。これは例えば、TNFによって刺激された、ヒト糸球体間質細胞がペントキシフィリンの非存在下および、存在下でPIからDAGを産生し、更にPIを再生成することの記述によって示される。後者の系では、PAまたはDAGがPI以外の供給源から得られることを示唆する証拠はない。本発明のHPLC分析および質量スペクトル技術は、不変で比較的単調な、すなわちいくつかではなく１つの型しかとらないシグナルを伝える分子であり、そのことは一貫した広がらないタイプのシグナルであることと適合するが、PIおよびDAG亜種の形成の微妙で複雑な評価を可能にする。
従って、種々の濃度のペントキシフィリンがPA/DAG経路を通じて再構成されるPAの形成を特異的に阻害することが示される；すなわち、１）高濃度のPTX条件下ではLPAATでPA亜種の形成を阻害し、２）低濃度のPTX条件下ではPAPHでPA−由来DAGの形成を阻害する。ペントキシフィリンの存在下では,PAはホスホリパーゼＤの作用によって形成され続け,DAGもまた、ホスホリパーゼＣのPCおよびPIへの作用によって形成される。後者の経路は本発明の化合物またはペントキシフィリンによっては阻害されない。ペントキシフィリン処理された細胞では、再構成され、且つPLDに由来するPAから由来するDAG,例えば1,2−snジオレオイルDAG、１−アルキル,2−リノレオイルDAGおよび１−アルキル,2−ドコサヘキサノイルDAGは減少する。
一般に、本発明の分析法によって測定され、構造式Ｉの化合物で作用を受ける特定の関連PAおよび対応するDAGは、不飽和で非アラキドン酸のsn−１およびsn−２の位置の脂質アシル側鎖を一般に持っているとみなされる。
PAとDAGのこれらの特定の中間体を検出するための本発明の分析系の能力は、本発明の主題であるリン脂質代謝の新しい代替経路を構成する関連した基質と酵素の識別を可能にする。
本開示に基づいた新しい治療剤を開発するための分析は、以下に詳細に記述されている。短くいえば、主題の代替リン脂質代謝経路に関わる代謝酵素は、異なるアシル側鎖及び基質の異性体に対して立体特異性を示すため、PTXとその代謝物の特定の光学異性体に富む薬剤調整物を用いることによって改良された治療効果および効能を示す薬剤が提供され得る。
キサンチンの異なる光学異性体（例えば立体異性体およびキラル体）は、それらのホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（phosphatidate phosphohydrolase）を阻害する異なる活性に基づいて、異なる薬剤活性を持つことが予想される。アルキル基R¹R⁵の鎖長、および／または構造式IIのR⁴R⁵が、例えば２−ヒドロキシプロピルであるような第三ヒドロキシルアルキルキサンチンの構造は不斉炭素原子を有することが可能で、このことから異なる立体異性体が生じる。従って、本発明は一つの望ましい態様に於て、キサンチンの代謝物の一つであるM1の選択されたキラル型が改良された薬剤活性を有することを意図する。例えばシンガーらの骨髄移植（出版準備中）では次の事実が開示されている；（ａ）M1,M3,M4およびM5代謝物に関するデータと、二つの類縁体HWA448およびHWA138−−−−代謝物がPTXよりも高い活性を示すこと；（ｂ）M1およびHWA448は活性がある;M3,M4およびM5およびHWA138はＴ細胞増殖に最低限の抑制を示すか、あるいは抑制を全く示さないこと；（ｃ）PTX中のN1側鎖の長さとN7置換基の大きさはこの活性に重要であること；（ｄ）混合したリンパ球培養液中でリンパ球を誘発した後にPTXを加えても、増殖応答を阻害するにはまだ効果的であること；（ｅ）PTXは抗CD3によって誘導されたリンパ球の増殖を抑制し、阻害はTNFαまたはIL−１以外の機構を通じて調整されること（なぜなら外来性組換えTNFまたはIL−１はこの阻害を打ち消さないからである）；（ｆ）PTXはTNFαによるTNF転写産物の下流制御に対してよりも強い効果をTNFαの分泌に対して及ぼしたこと；および（ｇ）PTXはHLA−DR、トランスフェリン受容体（CD71）,IL−２受容体（CD25）、およびMLR−刺激リンパ球のCD69を含むリンパ球の細胞表面抗原の発現を減少させたこと。
本発明のキサンチン由来の化合物の効果は、インビトロおよびインビボで説明され得る。以下に示すように、キサンチン誘導体の存在下および非存在下で一次的な刺激剤とともに標的細胞を培養し、その後脂質含量を抽出し、分析することを含む単純な分析は、その脂質アシル含量によって特性付けられるように、上述の経路の様々な要素のレベルの診断に役立つ。この分析はキサンチン誘導体の関連した酵素リゾホスファチジン酸アシル転移酵素（LPAAT）およびホスファチジン酸ホスホリルヒドラーゼ（PAPH）に及ぼす効果を間接的に測定する。一般に、これらの酵素の阻害は、キサンチン誘導体によって影響され、従って、PAおよびDAG中間体の特定のアシル化亜種の関連した種のレベルの低下を引き起こす。
以下の実施例で、インビボで、P450の阻害剤とともにペントキシフィリンを投与すると、ペントキシフィリンの効果が強められることが示されている。このインビボにおける効果は、キサンチン誘導体の代謝経路の阻害によるものと考えられている。この効果の基盤は、インビトロのものと違う可能性があり、また、おそらく違うのであろうが、それでも前述の分析は、本発明で有用なキサンチン由来の化合物とともに投与する候補となる薬剤を評価するのに有用である。これが事実であることは、キノロンのようなP450を阻害することのできる化合物がキサンチン誘導体の効果を促進することもまた、インビトロで証明され、そのため必要とされる投与量レベルが低下することからもわかる。さらなるインビトロ分析は、以下に実施例２に記述しているが、この例では、活性化されたガン遺伝子を含む形質転換された細胞系統はペントキシフィリンによってその表現型が調整されることが示されており、その際、ペントキシフィリンとシプロフロキサシンを一緒に投与すると、ペントキシフィリンまたはシプロフロキサシン単独の場合よりも劇的によい効果をもたらす。そのような分析を用いて、さらなるキサンチン誘導体とP450の阻害剤が、細胞の振舞いを調節することに対するそれらを組み合わせた効果に関して、試験され得る。
キサンチン誘導体は、単独で、あるいはP450の阻害剤と組み合わせて、インビボで細胞の振舞いを調節するのに効果的である。キサンチン誘導体とP450阻害剤を一緒に投与する必要性はキサンチン誘導体の選択で変化する。例えば、もしキサンチン誘導体としてペントキシフィリンが用いられるのなら、組み合わせ投与が非常に望まれる。一方、もしペントキシフィリンの一次代謝物である、１−（５−ヒドロキシヘキシル）−3,7ジメチルキサンチン（ここではM1と表わす）が用いられるなら、P450阻害剤と共に投与する必要はない。
”治療”において用いられる様々な薬剤の負の効果を逆転させるためにキノリンと共にペントキシフィリンと投与する効果を以下に記載する。従って、以下に実施例４で示すように、化学療法または放射線療法を受け、続いてプレドニソンおよび／またはシクロスポリンＡを免疫抑制剤として投与されている移植患者は、ペントキシフィリン（PTX）およびP450阻害キノロンであるシプロフロキサシン（CIPRO）を同時に投与することにより効果が得られる。
本発明の分析
構造式Ｉの化合物は、本発明の分析系を用いてPAおよびDAGの関連した亜種のレベルを上昇させる一次刺激の効果を緩和することが示される。一般に分析のために、試験される細胞は、最初に様々な時間にわたって一次刺激剤と共に培養され、それから氷冷メタノール中で固定される。脂質は例えばクロロホルム：メタノール2:1（v/v）を用いて抽出され、抽出物はバーステンとハリス、Biochemistry（1991） による記述に従ってHPLCで分析される。この方法では、ライニンmu−プラシルカラム（Rainin mu−Polasil column）が用いられ、3:4ヘキサン：プロパノール有機担体および分離の最初の10分間に１−10％水による勾配をかけて行われる。溶出パターン中のピークの検出は単離された２重結合を検出する紫外領域の吸収で行う。従って、不飽和PAおよびDAGの関連したピークは、溶出パターン中で示される。本分析法は様々な形のPA及びDAGを識別することを可能にするため、構造式Ｉの化合物により影響を受ける経路に関連したそれらを直接測定することができる点は注目すべき重要点である。これらの成分のアシル置換基の性質の決定は、高速原子衝突質量分光学を用いて達成される。従って、関連した不飽和（非アラキドン酸の）PAおよびDAG亜種が検出される。用いられる時間はサイトカイン等の一次刺激による刺激後５−60秒である。この技術は時間の関数としての様々な脂質構成要素のレベルの評価を可能にする。
上述した本発明の分析の概略は、適当な標的細胞の使用に関して提示されているが、細胞構成単位もまた、この分析の基質として用いられる。そうした細胞構成物には、間葉細胞および／または外胚葉細胞から得られたミクロソーム、とりわけ髄間質細胞あるいはヒトまたはラットの糸球体間質細胞からのミクロソーム；ウシ脳由来のミクロソームまたはシナプトソーム；細胞膜に富むミクロソームまたは参考文献としてここに含められた、バーステンらJ.Biol.Chem.（1991）226:20732−20743の記述にしたがって得られた細胞膜；界面活性剤で可溶化されたミクロソーム；シナプトソームおよび膜あるいはその他の細胞の調製物で例えばNP−40、ミラナール、SDSまたはその他の中性界面活性剤によって可溶化されたもの；および界面活性剤で可溶化されたか、さらに精製された細胞タンパク質の調製物（タンパク質LPAATおよび／またはPAPHなどを含む）を含んでいる。
本発明の化合物の効果を試験するために、候補となる化合物を様々な濃度で最初の培養に含ませる。固定、抽出、およびHPLCは上述のように行われる。候補となる化合物の効果は以下に説明するように、対照である候補の化合物無しの細胞と比較し、関連したPAおよびDAGレベルが低くなっていることに反映する。
インビボにおいてP450の阻害剤を共に投与する効果は、キサンチン代謝経路の阻害であり、おそらく、上述のインビトロ分析法に関与してはいないと考えられているが、上述するように、対応する化合物は以下の実施例２で確認するように、インビトロにおいては同様の効果を有する。従って、脂質の抽出とそれに続くHPLCに基づいた上述の方法は、また、構造式Ｉの化合物と共に投与された場合、インビボに対応した効果を有すると期待される化合物を識別するためにも用いられ得る。そのような選別分析においては、一次刺激を与えた培養は、構造式Ｉの化合物の存在下で、そして、候補となる”ヘルパー”化合物の存在下および非存在下で行われる。
本発明のさらなる分析法では、候補となるP450の阻害剤とともにキサンチン化合物を投与する効果は、形質転換されたNIH3T3−D5C3細胞を用いて、対照実験、キサンチン誘導体のみと培養した場合、およびキサンチン誘導体とP450酵素阻害剤を共に加えて培養した場合の形質転換の表現型に対する効果を比較することによって評価可能である。
本発明で用いられる化合物
本発明の化合物は以下の構造式を有する：

（式中、R¹とR³のうちの一方（そしてただ一方のみ）は、直鎖若しくは枝分かれ鎖のω−あるいは（ω−１）−ヒドロキシアルキル（５−8C）、（ω−１）−オキソアルキル（５−8C）、（ω、ω−１）若しくは（ω−１、ω−２）−ジヒドロキシアルキル（５−8C）、またはアルケニル置換基（５−8C）であり、そして他方は、Ｃの代わりに一つまたは二つの隣接しない酸素原子を所望により含んでいてもよいアルキル置換基（１−12C）であり、そして、R²はＣの代わり一つまたは二つの隣接しない酸素原子を所望により含んでいてもよいアルキル（１−12C）である）。
これらの化合物は、米国特許３、737,433、ベルギー特許831,051および1986年６月８日付のPCT出願EP86/00401を含む，上で引用された参考文献の中で述べられているように調製される。
本明細書中で用いられる場合、直鎖あるいは枝分かれアルキルは、指定された炭素数の飽和炭化水素置換基を意味し、例えばアルキル（１−12C）とは、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｉ−ヘキシル、ｎ−デシル、２−メチルヘキシル,5−メチルオクチル、などのことを指す。ω−あるいはω−１−ヒドロキシアルキル（５−8C）は、５−ヒドロキシベンチル、５−ヒドロキシヘキシル、６−ヘドロキシヘキシル、６−ヒドロキシヘプチル、５−ヒドロキシ−５−メチルヘキシル、５−ヒドロキシ−４−メチルヘキシルといった、ωあるいはω−１の位置に水酸基を含む、炭素数５−８の直鎖あるいは枝分かれアルキル基のことを指す。同様に、ω−１オキソアルキル（５−8C）は、例えば、４−オキソペンチル、５−オキソヘキシル、６−オキソヘプチル、５−メチル−６−オキソヘプチルなどを指す。
本発明の化合物はまた、所望により一つあるいは二つの隣接しない酸素原子を炭素の代わりに含む、アルキル基である置換基を含むことができる。それゆえ、これらの置換基は、例えば、メトキシエチル、エトキシプロピル、2'−ヒドロキシエトキシプロピルなどを含む。
本発明に於て用いられる特に好ましい化合物は、R¹が直鎖または枝分かれのω−または（ω−１）−ヒドロキシアルキル（５−8C）、あるいは（ω−１）−オキソアルキル（５−8C）であり、R²とR³が互いに独立してＣの代わりに１つあるいは二つの隣接しない酸素原子を所望により含む、アルキル（１−12C）であるような化合物を含む。特に好ましい化合物は,R¹が（ω−１）−ヒドロキシアルキルあるいは（ω−１）−オキソアルキルであるような化合物である。R²の好ましい具体例には、低級アルキル（１−4C）、特にメチルおよびエチル基が含まれる。R³の好ましい具体例にはＣのかわりに一つあるいは二つの隣接しない酸素原子を所望により含むアルキル（１−6C）が含まれる。R³の特に好ましい具体例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル,2−エトキシエチル、２−メトキシエトキシメチル、エトキシメチル、ｎ−ブチルが含まれる。また特に好ましいのは、R¹が４−オキソペンチル、４−ヒドロキシペンチル、５−オキソヘキシル、５−ヒドロキシヘキシル、６−オキソヘプチル、または６−ヒドロキシヘプチルである、構造式Ｉの化合物である。非常に好ましいものは、構造式Ｉの化合物が１−（５−ヒドロキシヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチン、１−（５−オキソヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチン、あるいは１−（５−メチル−５−ヒドロキシヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチンである。
本発明の方法に於て有用なもう一つの化合物群は、以下の構造式で示される：

その際、R⁴とR⁵は同じかあるいは異なったものであり、２から６の炭素原子を持つ直鎖あるいは枝分かれのアルキル基、つまり、シクロヘキシル、アルコキシヘキシルおよびヒドロキシアルキル基から成る群から選ばれ、Ａはメチル群により置換され得る４つまでの炭素をもつ炭化水素基を表わす。
以下のペントキシフィリンの代謝物もまた有用である。代謝物Ｉ、１−（５−ヒドロキシヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチネップ；代謝物II、１−（5,6−ジヒドロキシヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチン；代謝物III、１−（4,5−ジヒドロキシヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチン;M4すなわち１−（４−カルボキシブチル）−3,7−ジメチルキサンチン;M5:1−（３−カルボキシプロピル）−3,7−ジメチルキサンチン;M6:1−（５−オキソヘキシル）−３−メチルキサンチン；そしてM7:1−（５−ヒドロキシヘキシル）−３−メチルキサンチン。
本発明化合物の使用と医薬製剤
以下に示されるような構造式の化合物は、一次的刺激から数秒以内におこる二次的伝達経路に対するこれらの一次的刺激の効果をやわらげることによって一次的刺激を受ける細胞に於ける恒常性を維持する機構を作り出す。
ここで挙げられた刺激は広範囲にわたっており、例えば様々なサイトカイン、成長因子、ガン遺伝子産物、効くと思われる治療剤、放射線、ウイルス感染、毒素、バクテリア感染、そしてこれらにより生じる産物などを含む。たとえ中和作用が行われなくても、標的細胞に有害な作用を示す刺激ならすべてその定義に含まれる。
例えば構造式Ｉの化合物は骨髄移植（BMT）をうけている患者に対して用いられ、BMTが適合した同種移植、不適合な同種移植あるいは自己移植のいずれであるかには関わらない。自己移植を受ける患者は、移植細胞対宿主病（GVHD）を起こさないから免疫抑制剤を投与する必要が無いとは言え、構造式Ｉの化合物を与えることが有益である。しかし、その治療のために移植が行われた病気に対して用いられる化学療法や放射線療法の毒性効果は、患者の細胞に対して拒絶刺激をもたらす。
一般的に、BMTをうける患者の全ては、通常の骨髄の回復にとっては致死量を超える量の全身放射を伴う、あるいは伴わない化学療法を必要とする。このことは患者を助けるために貯蔵しておいた患者の骨髄または供与体の骨髄を用いることに対して論理的根拠を与える。
一般的に、化学療法および放射線は、患者が新しいあるいは貯蔵された骨髄を注入されるまで、７−10日間連続して患者に施される。骨髄が患者に与えれれる日が移植０日目と示され、患者が化学物質／放射線を受けていたそれ以前の日々は、負の数字が当てはめられる。以後の日々は正の数字で示される。
BMTをうけた人の中で拒絶反応が起こる時期の中間値は、移植後最初の100日以内に存在する。それゆえ、統計的には、患者が100日を超えて生存した場合、引続き生存する確率は大幅に上昇する。以下の実施例で示されるように、構造式Ｉの化合物は生存する患者の百分率を上げることができる。100日以内の死亡者の受け入れられる百分率は、15−20％が”危険度の低い”患者で、30−40％が”危険度の高い”患者である。これらの死亡者は、高用量の化学物質／放射線の直接的な効果によるもので、さらに、GVHDが異種骨髄を注入される人の死亡率に寄与している。
以下に説明されるように、キノロンとともにペントキシフィリンを投与することは、450を阻害することにより、キサンチンの代謝を抑制すると考えられているが、骨髄の起源に関係なく、これらの移植を受ける人に対してよい効果を持っている。
P450阻害剤と共にあるいはなしで、構造式Ｉの化合物を投与するのに適したその他の患者には,IL−２といった生物学的反応修飾物質および、リンホカインにより活性化されるキラー細胞（LAK）、腫瘍に湿潤したリンパ球といった腫瘍抑制細胞（TIL細胞）での処理だけでなく、化学治療剤や放射線療法といった腫瘍治療のための毒性薬剤を投与される患者が含まれる；それに、他の治療をうけていてもいなくても、急性及び慢性の骨髄白血病、毛様細胞性白血病、リンパ腫、巨核球白血病などのものを一般的に含む腫瘍にかかっている患者、バクテリア、カビ、原生動物、あるいはウイルスの感染により引き起こされる病状、心臓手術を受けた患者に見られるような、例えば再狭窄といった形で、望ましくない平滑筋細胞の増殖を生じた患者、自己免疫病に苦しみそれゆえＴおよびＢ細胞の不活化が必要な患者、そして神経障害を持った患者、等も含まれる。
一般的に、インビボにおける構造式Ｉの化合物の効果は、キサンチン誘導体代謝およびクリアランス経路を阻害する化合物、とくにP450を阻害する化合物の添加により高められる。以下に説明するキノロン・シプロフロキサシンのほかに、他の適当な薬剤（１日の投与量のmgの範囲）として、プロプラノロール（20−100）、メタプロロール（20−100）、ベラパミル（100−400）、ディルチアゼム（100−400）、ニフェジピン（60−100）、シメチジン（400−2400）、シプロフラキサシン（500−2000）、エノキサシン（500−2000）、ノルフロキサシン（500−2000）、オフロキサシン（500−2000）、ペフロキサシン（500−2000）、エリスロマイシン（100−1000）、トロレアンドマイシン（100−1000）、ケトコニゾール（100−2000）、チアベンザドール（100−1000）、イソニアジド（100−1000）、およびメキシレチン（100−1000）がある。
複合療法として、構造式Ｉの化合物およびP450阻害剤は、個別に、あるいは単一組成物で投与することもできる。適切な処方は、治療すべき異常の性質、選ばれた医薬の性質、及び担当の医師の判断による。これらの化合物は、粘膜経由や皮膚経由といった他の投与方式も可能ではあるが、一般的には注射あるいは経口投与のために製剤される。これらの化合物の適切な処方は例えばRemi ngton's Pharmaceutical Sciences（最新版）Mack Publishing Company,Easton,PAに示されている。
本発明の化合物は、安定性、結晶化の簡便さ、および高い溶解性などの目的で、遊離塩基あるいは薬学的に好ましい塩の形で製剤及び投与される。
そのような組成物におけるキサンチンの量は、適当な量が得られるだけの量である。本発明による好ましい組成物や調合品は、経口投与単位形態が約1.0mgから600mgの間の活性化合物を含むように調合される。
用量の値は変化させ得るけれども、構造式Ｉのキサンチンが一日当り約1200から約3200mgの効果的な経口、非経口、あるいは静脈内の致死量以下の量の投与のような治療を必要としている患者に投与されたとき、よい結果が達成される。白血病に用いるための特に好ましい投与計画は、体重1kgあたり4mgあるいは、21日間１日５−６回、20−30分かけて300mgを注入する、というものである。しかし、どの様な特定の患者に対しても、特定の投与量計画は、患者の必要性およびキサンチンを投与する人あるいは投与を監視する人の専門的判断に従わせるべきである、ということが理解されねば成らない。ここに述べられた投与量は、模範的なものを示しただけであり、本発明の範囲や実施を制限するものではない。
選択された構造式Ｉの化合物に依存して、投与量の水準は以下に説明されるキノロンのようなP450の阻害剤の共投与により、評価可能な程度減らすことができる。多くのP450阻害剤と構造式Ｉの化合物は適合性であり、量を組み合わせて製剤できる。しかし、その化合物はまた、別個に共投与する事も可能である。
以下の例は本発明の例示を意図したもので、本発明を制限するためのものではない。
実施例１
糸球体間質細胞活性化に対するペントキシフィリンの効 果
本実施例は、ペントキシフィリンが、リン脂質二次伝令経路中の２つの酵素：リソ−PAアシルトランスフェラーゼ（LPAAT）およびホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（PAPH）を阻害することを示す。このことは、本発明のアッセイ法を用いて、細胞をIL−１で刺激することによる、不飽和非アラキドンPAおよびその誘導体であるDAGのレベルの上昇を、500μＭ以上の濃度のペントキシフィリンが防ぐことを示すことによって証明される。本実施例は本発明の方法の例示でもある。
ヒト糸球体間質（mesangial）細胞をIL−１とともに５−60秒の様々な時間でインキュベートし、その細胞を氷冷したメタノールで固定、クロロホルム：メタノール 2:1（v/v）を用いて脂質を抽出した。不安定な中間産物の分解を止めるため、固定／抽出プロセスは素早く行うことが非常に重要である。
抽出物を、3:4 ヘキサン：プロパノール有機担体で、分離の最初の10分間で１−10％の水勾配をかけながらレイニン ミュー−ポラシルカラム（Rainin mu−Porasil column）のHPLCにかけた。各脂質種の相対濃度は206nmでの吸光度（A206;脂質種の不飽和アシル含量に従う）を用いて決定される。しかし、不飽和PAおよびDAGアシル基はアラキドン酸塩を含まないことが示されている。各脂質種の絶対量は、フラクションコレクターを用いて脂質を分離し、HPLCカラムで再精製することによって決定される。リン脂質のリンの測定は、nmole/mg細胞蛋白質として表される。蛋白質濃度はブラッドフォード法を用いて決定される。
コントロールであるヒト糸球体間質細胞脂質に関する結果を図１に示す。図１−11中で用いられている略号は:DAG、ジアシルグリセロール;chol.esters、コレステロールエステル;PA、ホスファチジン酸;lyso（リソ）−PA、リソホスファチジン酸;PE、ホスファチジルエタノールアミン;Pi、ホスファチジルイノシトール;PS、ホスファチジルセリン；およびPC、ホスファチジルコリンである。
図１で見られる脂質代謝物の分布は、制御された条件下の培養液中でヒト糸球体間質細胞（human mesangial cell;HMC）の２％以内に一定に維持されている。（PEと比較して）PA、リソ−PAおよびDAGの低いレベルは注目されるであろう。
HMCを10^-11Mのインターロイキン−１に接触させた後、リン脂質および代謝物の著しい再分布が、PAおよびDAGの有意な増加を含め、５秒以内に明確となる。（図２）。図３および４は、それぞれIL−１で15秒および60秒間刺激した後のHPLCを示す。PAは15秒間のホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼの作用によってDAGに変換されるが;60秒間の刺激で再びPAピークが現れる。
このPAの再出現がDAGからの再合成によるものではないことを立証するために、HMCを、DAGからPAへのリン酸化を防ぐジアシルグリセロールキナーゼインヒビター、R50922とインキュベートした。この場合でも、得られるHPLCパターンは変化しない。この発見を確認するために、PAおよびDAG画分に高速原子ボンバード質量分析（fast−atom bonbardment mass spectrometry）を行ったところ、形成された主要なPA種は、１−オレオイル（C18:1）２−リノレオイル（C18:2）PA、および１−リノレオイル ２−リノレオイルPA（それぞれm/z比は699および697）で、それらが次に１−オレオイル、２−リノレオイルおよび1,2−Sn−ジリノレオイルジアシルグリセロール（それぞれm/z比は618−620および616−618であり、m/z比の広がりは高速原子ボンバード前の特異なプロトン付加による）に変換されることが示された。
HMCをまた、様々な濃度のペントキシフィリンの存在下で10^-11MのIL−１と反応させた。100μＭのペントキシフィリンでは、ヒト糸球体間質細胞の周期的なPA生成、および15秒と60秒の時点に見られるPAからDAGへの変換について変化はなかった。これらの結果は図５および６に示されており、これらはそれぞれ、100μＭペントキシフィリン存在下でIL−１とインキュベートした時の15秒後および60秒後におけるHPLCを示している。ペントキシフィリンを表す大きなピークが観察される。
500μＭでは、ペントキシフィリンはPAからDAGへの変換に若干の減衰をもたらすが、図７（15秒の時点を表す）に示されるように、応答させなくするわけではない。1mMのPTXは、IL−１刺激後に調べられた全ての時点におけるIL−１によるPAおよびDAGの上昇をなくす。図８−11は、1mMペントキシフィリンの存在下でHMCをIL−１で様々な時間だけ刺激した後の糸球体間質細胞脂質のHPLCを示す。
図８は15秒後のHPLCを示す。
図９は30秒後のHPLCを示す。
図10は45秒後のHPLCを示す。
図11は60秒後のHPLCを示す。
これらの時点全てにおいて、PAおよびDAGのレベルは刺激していない細胞に見られるレベルにほぼ落ち着いている。
図８−11に示されるHPLCパターンの種々のピークの性質の立証は、高速原子ボンバード（FAB）質量分析によってなされた。個々の構成物を分離後に単離し、この技術を用いて分析した。これらのパターン中のリソ−PAピークの分析結果を図12に示す。主要なピークが311、325、339、353−357、381−387、411、417、425、433、461、465、479、493および555に現れる。これらは、脂肪族アシルの分解産物（311、325、339）および以下の一次構造:1−ミリストイル（myristoyl）リソ−PA（381−385）、１−パルミトイル（palmitoyl）リソ−PA（411）、１−ｏ−2"−エン−リノレオイル（linoleoyl）リソ−PA（417）、１−リレノオイルリソ−PA（433）、１−C20:1および１−C20:2リソ−PA（461、465）、１−ｏ−ドコサノイル（docosanoyl）リソ−PA（479）、および１−ドコサノイルリソ−PA（493）を含むリソホスファチジン酸亜種を表す。以上のことから、蓄積するリソ−PAは不飽和脂肪酸を高いレベルで含む。500μＭ以上の量のペントキシフィリンは、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼおよびリソ−PAアシルトランスフェラーゼの両方の阻害をもたらす。さらなる測定から、0.5mMのペントキシフィリンはPAPHを阻害するが、LPAATに対するその阻害効果はより高い濃度でのみ明らかとなることが示された。
実施例２
細胞の悪性形質転換に対するPTXの効果
あるNIH3T3細胞系列（D5C3）は活性化された癌遺伝子で形質転換された標的細胞を提供する。細胞を温度感受性のｖ−abl突然変異遺伝子で形質転換した。この変異遺伝子はチロシンリン酸化の欠如によって非許容温度では非発癌性の産物を生産する温度感受性ｖ−abl蛋白質をコードする。細胞を、ペントキシフィリン（1mM）を加えたもの、および加えないものを継代後に５日間許容温度（33℃）で培養した。
ペントキシフィリンのない場合、細胞は典型的な形質転換された様相を持ち、主としてゆるく接着した塊として増殖した。1mMペントキシフィリンの存在下では、細胞の全体数が約50％減少し、非許容温度（39℃）で観察されるのと同様の非形質転換性の繊維芽細胞の様相を、主として呈した。
50μg/mlの濃度のシプロフロキサシン（Ciprofloxacin）も有意な効果を持つ。ペントキシフィリン（1mM）とシプロフロキサシン（50μg/ml）の組み合わせは相加的な効果、即ち、ペントキシフィリン（1mM）のみ若しくはシプロフロキサシン（50μg/ml）のみで見られるよりも強い形質転換表現型の阻害効果を持った（表１）。

この実施例の方法を用いると、候補となるキノロン（quinolone）型およびキサンシン（xanthine）化合物の複合効果に関して、即ち、キノロンを一緒に投与して用いると、キサンシンを単独で投与した場合よりも低い薬量のキサンシンで済むことを試験することが可能となる。
さらに、突然変異Ｋ−ras（コドン12Gly−Val）で形質転換したNIH3T3マウス繊維芽細胞をin vitroおよびヌードマウスで試験した。in vitroで、ペントキシフィリンがないと、細胞は急速に増殖し、典型的な形質転換された様相を持ち、軟寒天中で足場非依存性のコロニーを高頻度に形成した。0.5mMあるいはそれ以上の濃度のペントキシフィリンは、増殖の阻害および足場非依存性の増殖の抑制をもたらした。
ヌードマウスに10⁶の細胞を皮下注射し、腹膜内に100mg/kgのペントキシフィリンを日に１回もしくは２回与えた。単に塩水注射を施した対照動物は、８日後に2.5±0.2gの重さの腫瘍が発達した。ペントキシフィリンを日に１回施した動物は、0.45±0.2gの重さしかない腫瘍しか持たず、一方、日に２回施した動物は、0.2±0.1gの腫瘍を持った。
乳癌および横紋筋肉腫からのヒトに由来する腫瘍細胞についての同様の研究は、同様の結果を示した。
実施例３
細胞の挙動に対するペントキシフィリンの効果
SV−40 Ｔ抗原で形質転換されたヒト腎臓糸球体間質細胞を、標準条件下でrhIL−１若しくはTNFαと共に、ペントキシフィリン（PTX）を加えて、あるいは加えずに培養した。形質転換した糸球体間質細胞は加えられた増殖因子に関係なく増殖するが、IL−１およびTNFαは糸球体間質細胞に対する正常な増殖シグナルである。実施例１で示されたように、IL−１を腎臓糸球体間質細胞に加えると、30秒以内にLPAATおよびPAPHが活性化され；これら両酵素の効果は1mMのペントキシフィリンにより阻害される。本実施例では、処理された細胞の増殖をトリチウム化したチミジンの取り込みを用いて測定した。
図13Aに示されるように、添加されたPTXは形質転換細胞のIL−１により刺激された増殖を停止させ、そしてこれは外来性のヒトIL−１組み換え体の添加によっては逆転されない。図13Bは、PTXがこれらの細胞においてTNFαの増殖効果を高めることを示す。
ヒト白血病細胞系（Mo7e）は、増殖に関して、添加される顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）に依存している。Mo7e細胞をペントキシフィリン（PTX）の入った若しくは入っていないrhGM−CSF入り固形培地で培養した。培養開始後10日後に倒立顕微鏡下でコロニーを計数した。図14に示されるように、PTXの添加はGM−CSF刺激されたコロニーの増殖を高めた。従ってPTXは、増殖を阻害する活性化関連遺伝子の上昇調節（upregulation）を防ぐ。
LPSで３時間誘導したU937細胞におけるTNFα転写産物のレベルに対するPTXの効果を図15に示す。図15は、1mMのPTXの添加がこれらの細胞のTNF刺激された増殖を高めたことを示す。この図は、ノザンブロットによるTNF RNAのレベルの測定結果を示す。ここで見られるように、1mM PTXの添加はLPS刺激に応答して得られるTNF RNAを検出できないレベルにまで下げた。キノロンであるシプロフロキサシン（CIPRO）は同様の効果を持つが、より低い濃度でこのような効果を生じる。これらのデータは、PTXがIL−１により刺激されたある種の間充織系列の正常および形質転換細胞に対して反増殖的であり、ある種の癌に対して増殖停止特性を有する可能性を示す。
図16は、骨髄ストロマ細胞をペントキシフィリン（PTX）の濃度を増加させながら３時間これに晒すことによってIL−６転写産物の生産の増加が起こることを証明するノザンブロットを示す。
図17にある結果は、PTXが細胞性スチール（Steel）因子の細胞活性化経路を上昇させることを示す。このことは即ち、継代（天然の）若しくはクローン化（CDCL）骨髄ストロマ細胞系をPTXと共に３時間培養した後のスチール因子転写産物のレベルによって表される（スチール因子は、ｃ−kitリガンド、マスト細胞増殖因子、および幹細胞増殖因子とも呼ばれる）。
CD3陽性リンパ球の増殖はPTXにより劇的に阻害される。これらの実験では、新しく単離されたCD−２陽性細胞を固相モノクローナル抗体により刺激してCD3表現型を獲得させ、次にPTXを加えた。この増殖に対する阻害効果はTNFおよびIL−２受容体の転写産物の抑制を伴うが、IL−２転写産物の抑制は伴わない。図19は、混合リンパ球反応液中のCD3陽性リンパ球から得られるノザンブロットをTNFに対する適当なプローブ（図19A）、IL−２に対する適当なプローブ（図19B）、およびIL−２α受容体に対する適当なプローブ（図19C）でハイブリダイズさせた結果を示す。増殖のブロックは、腫瘍壊死因子（図20および21）の添加によってもIL−１（図21）の添加によっても克服されなかった。図20は、高濃度のTNFでもこれらの細胞のチミジン取り込みに対するPTXの阻害効果を逆転できないことを示し；図21は、詳細な実験の結果を示しており、ここではCD2陽性Ｔ細胞を免疫磁気ビーズを用いて選択し、吸着されたモノクローナル抗体64.1を用いて刺激した。サイトカインおよびPTXを培養開始時に添加し、５日後に細胞を回収した。これらの結果に示されるように、チミジンの取り込みは濃度依存的にPTXによって減少した。IL−１の添加もTNFの添加もこの阻害を逆転できなかった。
マウス繊維肉腫細胞系列のL929も、TNF細胞傷害性のアッセイのための指標として試験した。図22に示されるように、TNFはこれらの細胞に対して濃度依存的に細胞傷害的である。細胞増殖は、増殖の目安として光学密度を用いたクリスタルバイオレット染色（crystal violet staining）によって調べられた。しかし1mMの濃度で加えられたPTXは、TNFの細胞傷害性に対して保護的であった。最後に、２つの単球細胞系列、U937およびTHP1を用いてサイトカインIL−８の保護に対するペントキシフィリンの効果を試験した。培養液中の細胞系列をリポ多糖もしくはGM−CSFにより誘導してIL−８産生を上昇調節させた。これらの細胞の抽出物に対してIL−８をコードするmRNAをプローブに行われたノザンブロットは、ペントキシフィリンの添加がIL−８の生産を阻害せず、実際に上昇調節しうることを示した。実施例１に示された証拠に基づくと、IL−８の生産がLPAATおよびPAPHに依存した伝達経路により制御されないと結論することができる。
実施例４
ホメオスタシスの維持
自己移植受容者の場合でさえも含めて、骨髄移植の受容者における合併症に対する少なくとも１つの刺激には、こうした治療を必要とする患者に課せられる照射療法および化学療法ルーチンが含まれる。腫瘍という重荷を負っている患者の骨髄移植は、激しい腫瘍治療で破壊された非腫瘍性骨髄細胞を回復させるために行われるのが典型である。患者自身の骨髄が採取され、再投与のために保存されている場合は、対宿主性移植片病（graft−versus−host disease;GVHD）が問題とならないので免疫抑制をもたらす必要は理論的にはない。しかし、骨髄が別の人物から供与された場合、骨髄が組織適合性について合致していても、拒絶が起こる可能性が強い。
３つのタイプの移植受容者：化学療法以前に採取され冷凍されていた自己骨髄を受けた患者；表現型の点から患者とHLAが同一の氏族供与者からの適合した同種骨髄を受けた患者；および１つ若しくは複数の主要HLA遺伝子座が異なる、氏族供与者もしくは他の供与者からの適合しない同種骨髄を受けた患者において研究がなされた。自己骨髄の受容者でさえ、移植後の回復は遅く、血小板および赤血球はこうした患者においてすら、しばしば有意には補充されない。彼等は炎症を抑えるためにステロイドを与えられる。同種骨髄を受けた患者は、それが適合しているか否かに拘らず、シクロスポリンおよびプレドニゾンを用いて免疫抑制のための標準的な治療を受ける。適合した同種骨髄の受容者に関しては、これらの免疫抑制剤で治療しても、約50％の割合でGVHDの発病が見られる。適合しない同種骨髄の受容者に関しては、免疫抑制は、標準プロトコールに従って、プレドニゾンの入った若しくは入っていないメトトレキセート中のシクロスポリンで効果を与えるのが一般的である。このグループの患者では、GVHDのおこる割合は90％に達する。
以下の結果はこれらの３つの移植群の各々について得られたものである。多発性骨髄腫、悪性リンパ腫、または進行性CMLもしくはAMLに対して同種骨髄移植を受けた患者に予備的研究を行った。全ての実験グループにおいてプレドニゾンを免疫抑制剤としてしばしば投与した。研究において、これらの患者は予備的養生法を始める前に外来患者部門で以下の養生法に従って最低３日から最高７日間薬を受けた：
PTX:600mg p.o.1日４回、午前９時、午後１時、午後５時および午後９時；
CIPRO:500mg p.o.1日２回；および
PD:0.5mg/kg １日２回（計1mg/kg/日、−１日目から始めて等価の量のメチルプレドニゾロンに変えられる）。
治療期間中は、患者は以下の研究薬で続けられる：
PTX:移植後＋20日まで続け、次いで600mg/日の割合で減らし投与を止めた；
CIPRO:移植後30日または30日よりも早い場合は退院日まで続けた；
そして
PD:0日目から始めて14日以上かけて徐々に減らし、投与を止めた。
以下のデータはこの研究の結果を示す。
これらの研究における患者はすべて、GVHD予防法としてPDおよびシクロスポリンを受けた。顆粒球の回復は、標準的なPD投与に加えてPTX,CIPROを用いた治療を受けた患者（Ｎ＝10）、またはGM−CSFを用いた治療を受けた患者（Ｎ＝10）、またはPTXを用いた治療を受けた患者（Ｎ＝４）において、骨髄移植後に測定された。PTX/CIPROでの治療は、GM−CSF若しくはPTXだけを受けた患者に見られる場合に比べ、好中球減少症の開始を遅らせ移植片の融合を早めた。これらの結果は図18に示されている。
さらに、移植後最初の30日間の血小板輸血の必要性および赤血球の必要性をGM−CSF（Ｎ＝27）またはPTX/CIPRO治療（Ｎ＝10）を受けた患者で比較した。PTX/CIPROの患者では、これらの必要性は共に劇的に減少した。血小板輸血に関しては、GM−CSF群が87±69ユニットの血小板を要したのに対し、PTX/CIPROの患者は7.2±5.6ユニットしか必要としなかった;GM−CSF受容者が24.7±24ユニットのRBC（赤血球）を要したのに対し、PTX/CIPROの患者は4.4±３ユニットのRBCしか必要としなかった。血小板およびRBC輸血に依存しなくなるまでの時間も、３重治療を受けた患者では短くなった。
記録に残っている対照群もしくはGM−CSFを受けた患者と比較して、PTX/CIPROの投与は発熱日数、ビリルビン最大値（肝臓毒性）、クレアチニン最大値（腎臓毒性）を有意に減少させ、入院期間を著しく減少させた。
以下の表２−４は、上述のようなステロイドおよび／若しくは免疫抑制剤の投与を含む標準治療およびPTX/CIPROを用いた治療を受けた移植受容者を用いた詳しい研究の結果を示す。同種移植については、免疫抑制剤に加えてGM−CSFを受けた更に別の対照群も研究した。表の説明は測定した種々のパラメーターを説明する。一般に、データは表中で、移植片融合（ANC）、輸血必要性（血小板）、器官毒性（腎臓に関してはクレアチニン、肝臓に関してはビリルビン）および生存の程度を表すようにまとめられている。
表２は自己移植受容者の結果を表す。PTX/CIPROを用いた複合治療を受けた患者は、標準プロトコールを受けた患者に比べ、融合および生存率が高まることが示された。
表３は、適合した同種供与者の骨髄の受容者に関する結果を示す。ここでもまた、標準治療およびGM−CSFを用いた治療の両方と比較して、融合が改善され、毒性が減少し、そして生存率が改善された。
表４は、血縁でない供与者からの骨髄の受容者に関する結果を示す。ここでもまた、標準治療およびGM−CSFを用いた治療の両方と比較して、全般的な結果が改善された。
これらの表中のデータは、それ故、ペントキシフィリンと、キノロンであるシプロフロキサシンを一緒に投与すると、化学治療もしくは放射線治療に対する治療法として、骨髄移植を受けた被験者の代謝状態を改善することを示すものである。

腎臓副作用（高カリウム血症、局所的腎臓高血圧症）およびこの腎臓作用（例えば、高血圧症）から逸脱して広まると考えられる拡散性の全身性作用が、腎臓糸球体間質細胞中の我々の経路の刺激および内皮細胞中への拡散由来する；言い換えれば、膜作用性／脂質溶解性によるシクロスポリンの副作用がリソ−PAアシルトランスフェラーゼおよびホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼを刺激すること（ヒト糸球体間質細胞、内皮細胞および3T3繊維芽細胞から、このことについて有効な直接のデータがある）であることを我々は主張する。
CT1501 Ｒがリソ−PA アシルトランスフェラーゼおよびホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼをブロックするので、我々は、それ故、高血圧症および腎臓機能障害を含めたシクロスポリンＡのアシルトランスフェラーゼ／ホスファチジン酸ヒドロラーゼ誘導性副作用をブロックすることができると我々は主張する。

Claims (4)

1. 腫瘍もしくは腫瘍の苦痛を治療するための医薬組成物であって、
   

   

   ［式中、R¹およびR³のうちの一方、そして一方のみは、５ないし８の炭素原子を有する（ω−１）−オキソアルキルであり、そしてR²、並びにR¹およびR³の他方は、１ないし12の炭素原子を有するアルキル置換基である］
   で表される化合物；および
   シプロフロキサシン
   を含む、前記医薬組成物。
2. 前記組成物が以下の対象：
   （ａ）骨髄移植（BMT）を受けている；または
   （ｂ）新生物に罹患している
   を治療するために使用される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 哺乳類対象において使用される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 式Ｉの化合物が、１−（５−オキソヘキシル）−3,7−ジメチルキサンチンである、請求項１−３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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