JP3560979B2 - 安定化された水性ステロイド免疫検定用標準 - Google Patents

Description

発明の分野
水性の蛋白質含有媒質中の、酸素による分解を受け易い生物学的に活性なステロイド化合物は、遷移金属キレート化剤の添加によりその貯蔵安定性が向上する。
発明の背景
天然および合成の生物学的に活性な化合物の存在または量についてヒトの体液を分析するために広範に用いられている方法は、免疫検定による方法であり、目的の分析物（analyte）とこの分析物を認識する抗体との間の相互作用が測定される。これはしばしば、所与の分析物の量を定量する比較的迅速で安価な方法を提供する。分析物・抗体反応は、種々様々な技法によって測定され得る。一つの技法は競合検定法であり、この検定法においては、抗分析物抗体を固相に固定し、既知量の標識分析物および分析物を含有する疑いのある試料の両方と反応させる。該試料中の分析物はその際、固定化された抗体に結合するために該標識抗体と競合する。固定化抗体により捕獲される標識の量は、試料中に存在する分析物の量に反比例する。
どの分析技法も標準（standard）への何らかの参照を必要とするが、かかる参照は免疫検定法にとって特に重要である。かかる検定法において利用される試薬には、正確には反応性に再現性がなく所与の範囲内でのみ再現性のある生物学的物質が含まれる。加えて、抗体とその分析物の間の免疫学的結合は、必ずしも制御され得るとは限らない敏感な因子により影響され得る。この点で、精確な再現性を得るための厳格すぎる試みは、迅速で安価な検定の目標と両立しない。
それ故、免疫検定法の各試験について含まれるべき１個またはそれ以上の標準を提供するプラクティスが開発されている。例えば、アボット・ラボラトリーズ社により製造されているIMx（登録商標）器具は、各試験当たり20個を越える試料を分析し得る。バラツキの尺度を与えるために各試験において、ある既知量の分析物を含有する数個の試料を含むのが一般的である。かかる標準試料は、対象物質として普通知られている。
さらに、分析装置を較正しおよび時々再較正するために種々の既知量の分析物を含有する多数の試料を提供することも一般的である。かかる標準試料は、キャリブレータと普通称される。
キャリブレータおよび対照物質の両方について、分析物について検定されることになっている体液の挙動と同様な挙動を検定において示す希釈剤を用いることが好ましい。例えば、ヒト血清が分析されることになっている場合、キャリブレータおよび対照物質は両方共、適切に処理された正常ヒト血清中に希釈され得る。あるいは、血清と同様な蛋白質分を有する水性媒質例えばウシ血清アルブミン（BSA）の緩衝化溶液が用いられ得る。
目的の或るクラスの分析物即ちステロイドは、かかる緩衝化水性蛋白質含有媒質において経時的に分解する傾向を示す。この傾向は、木炭ストリッピング（charcoal stripped）されたヒト血清においておよびBSAの水溶液においても観察された。これに関して、キャリブレータまたは対照物質のマトリックスまたは担体として用いるために意図されたヒト血清は、存在し得るステロイドを除去するために木炭ストリッピングされる。かくして、初期のステロイド含有率は、単に、ストリッピングされた血清に計測量を添加することにより精確に制御され得る。
このように、標準的現場条件下で長期貯蔵安定性を示す、ステロイド免疫検定用のキャリブレータ溶液および対照物質溶液に対するニーズがある。特に、約２℃と８℃の間の温度にて長期間貯蔵されるとき有意に分解しないかかる溶液に対するニーズがある。このような溶液が６ヵ月を越える間安定であることが、特に望ましい。
発明の簡単な説明
ヒト体液の免疫検定の標準化のために適する希薄水性蛋白質含有溶液中の、酸化による分解を受け易い生物学的に活性なステロイド化合物は、該溶液中に遷移金属キレート化剤を混入するこにより、より貯蔵安定になる。興味あるステロイドとしては、例えばエストラジオールおよびプロゲステロンのような天然ホルモンステロイドが含まれる。キレート化剤として、例えばジエチレントリアミン五酢酸（DETP）およびエチレンジアミン四酢酸のような四座および一層多座のアミノ酢酸キレート化剤を含む。興味ある水性媒質として、例えば木炭ストリッピングされた正常ヒト血清およびウシ血清アルブミン（BSA）の水溶液、特に約６と９の間のpHに緩衝されたものが含まれる。特に興味ある溶液としては、約2.5×10^-11g/mL〜1.0×10^-7g/mLのステロイド濃度および約0.1mMより大きい、好ましくは約0.2mM〜50mMのキレート化剤濃度を有するものが含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１は、種々のキレート化剤および対照検体についての、37℃における日数に対する標準溶液中のプロゲステロンの損失の一連のプロットである。
図２は、キレート化剤および対照検体についての、37℃における日数に対する標準溶液中のエストラジオールの損失のプロットである。
図３は、キレート化剤および対照検体についての、37℃における日数に対する標準溶液中のエストラジオールの損失のプロットである。
発明の詳細な記載
本発明に関して興味あるステロイドは、ヒトにおいて生物学的活性を示しかつ水性媒質中で酸化分解を受ける傾向を有するものである。これらのステロイドは免疫検定用の標的となり得、従ってかかる検定用の標準として利用できそうである。かかる標準は、典型的には、免疫検定が行われつつある体液と同様な媒質中における検定に対して参照ステロイドを呈するようにするために水性媒質を利用する。これらのステロイドの中には天然のホルモンステロイドがあり、そして特に興味あるものは、女性性ホルモンのような、正常な生物学的レベルが変動するものである。このグループ内に、プロゲステロン、エストロンおよびエストラジオールが含まれる。他の興味あるステロイドは、コルチソルおよびテストステロンを含む。
興味あるキレート化剤は、水性媒質から金属イオンを封鎖することのできるものである。特に興味あるものは、遷移金属を封鎖することのできるキレート化剤である。水性媒質中のステロイドの酸化分解は、遷移金属が触媒する経路を通じて進行すると考えられ、従ってこの活性をかかる金属と錯化することにより阻害し得るキレート化剤が特に興味ある。鉄がかかる分解反応における特に重要な物質であると考えられ、従って鉄を封鎖するのに特に有効であるキレート化剤が興味ある。
興味あるキレート化剤は、次のものを含む。即ち、
2,2′−ジピリジン、即ちビピリジン，
1,2−ビス（ジエルチルホスフィノ）エタン，
1,2−ビス（ジエチルホスフィノ）メタン，
ｏ−フェニレンビスジメチルアルシン［ｏ−C₆H₄（AsMe₂）_２］，
ジエチレントリアミン［H₂N（CH₂CH₂NH）₂H］，
｛［2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4,5−ジイル）ビス（メチレン）］ビス（ジフェニルホスフィン）｝，
1,2−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン、dppe,
エチレンジアミン四酢酸，
エチレンジアミン［H₂NCH₂CH₂NH₂］，
トリス−（２−ジメチルアミノエチル）アミン［Ｎ（CH₂CH₂NMe₂）_３］，
ビス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［HN（CH₂CH₂PPh₂）_２］，
トリス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［Ｎ（CH₂CH₂PPh₂）_３］，
1,10−フェナントロリン，
プロピレンジアミン（1,2−ジアミノプロパン），
ビス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［HN（CH₂CH₂PPh₂）_２］，
トリス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）ホスフィン［Ｐ（CH₂CH₂PPh₂）_３］，
サリチルアルデヒド，
ビス−サリチルアルデヒドエチレンジアミン，
トリス−（２−ジフェニルアルシノエチル）アミン［Ｎ（CH₂CH₂AsPh₂）_３］，
トリス−（３−ジメチルアルシノプロピル）ホスフィン［Ｐ（CH₂CH₂CH₂AsMe₂）_３］，
ビス−（３−ジメチルアルシノプロピル）メチルアルシン［MeAs（CH₂CH₂CH₂AsMe₂）_２］，
N,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミン（TMED又はtmedとも称する），
1,3−ジアミノプロパン（トリメチレンジアミン），
トリス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［Ｎ（CH₂CH₂PPh₂）_３］，
トリス−（２−アミノエチル）アミン［Ｎ（CH₂CH₂NH₂）_３］，
トリエチレンテトラミン［（−CH₂NHCH₂CH₂NH₂）_２］，
トリス−（２−メチルチオメチル）アミン［Ｎ（CH₂CH₂SMe）_３］，
デフェロキサミン［Ｎ′−［５−［［４−［［５−（アセチルヒドロキシアミノ）ペンチル］アミノ］−1,4−ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］−Ｎ−（５−アミノペンチル）−Ｎ−ヒドロキシブタンジアミド］。
好ましいキレート化剤は三座または一層多座であるものを含み、四座および五座が特に好ましい。好ましいキレート化剤の中ではアミノ酢酸構造を有するものが、そしてこれらの中ではエチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸が特に好ましい。
特に興味ある水性媒質は、実質的蛋白質分（protein content）を有するものである。血清のようなヒト体液の挙動と同様であるかまたは酷似する媒質中で免疫検定を行うことが、本発明の標準にとってしばしば望ましい。ある場合には、検定されるべきヒト体液の蛋白質分から劇的に相違する蛋白質分を用いることが有利な場合もある。このことは、該体液の他の特性についての調整を可能にし得る。血清を含めてヒト体液は、実質的蛋白質分を有する。典型的な蛋白質濃度は約10mg/mLと300mg/mLの間の範囲であり得、血清では約50mg/mLが一般的である。この蛋白質分は天然に例えば正常ヒト血清において存在し得、あるいは５パーセント重量／容量のような、ウシ血清アルブミン（BSA）の水溶液が添加され得る。
水性媒質はフィブリノゲンを実質的に含まないことが好ましい。かくして、血漿以外の媒質を用いることが好ましい。これに関して、粒子形成性成分を含有する媒質を避けることも好ましい。
蛋白質溶液は固有のステロイドを本質的に含まないことが好ましい。従って、蛋白質溶液が正常ヒト血清である場合、好ましくは、天然に存在するステロイドを除去するために木炭ストリッピングされる。他方では、ステロイド不含有の木炭ストリッピングされていない市販のBSAのような、他の技法により該ステロイドが除去されている蛋白質製剤が、特に好ましい。これらの中には、有機相での洗浄により得られたものがある。木炭ストリッピングは鉄のような望ましくない遷移金属を与え得る、と考えられる。
蛋白質はそれ自体不所望な遷移金属の源であり得る、と考えられる。蛋白質は、遷移金属不含有の蛋白質を得ることを困難にする仕方で金属と錯化することが、知られている。
必ずではないけれども、水性媒質がヒト体液のpHと同様なpHを有することが好ましい。水性媒質が約６と９の間のpHを有することが特に好ましく、７と8.5の間のpHが特に好ましい。水性媒質のpHは、TRISとして普通知られているトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのような、生物学的物質と共に使用される通常の緩衝剤のいずれかによって好都合に調整され得る。
興味ある水溶液のステロイド濃度は、ヒト体液を検定する際に遭遇するステロイド濃度の範囲にわたるべきである。典型的には、種々のステロイドが、1mL当たり約５ピコグラムと1mL当たり100ナノグラムの間のレベルにおいて検定される。1mL当たり約５×10^-11グラムと４×10^-8グラムの間の濃度が、特に興味ある。
キレート化剤は、水性ステロイド溶液の酸化分解を阻止するために有効な量にて使用されるべきである。それらを約0.1mMを越える量にて用いることが好ましく、そしてそれらを約0.2mMと50mMの間の量にて用いることが特に好ましい。少なくとも約1mMのキレート化剤濃度を使用することが特に有利である。約20mMを越えるキレート化剤濃度を使用する際、特にアミノ四酢酸および五酢酸のクラスの一層有効な鉄キレート化剤では、限られた利点が存在するように思える。しかしながら、コスト以外には、一層高い濃度を用いることにあまり不利益が存在するとは思われない。
キレート化剤により達成される酸化分解の阻止は、水性ステロイド溶液に種々の時間、高められた温度にて応力をかけそして免疫検定により検出できるステロイド含有量の損失を観測することにより、好都合に検定され得る。高温試験により得られた結果は、より低い温度に保持されるステロイド溶液のより長い期間の安定性の予言となる。
免疫検定用ステロイド標準は典型的には約２℃と８℃の間の温度に維持され、そして望ましくは約６ヵ月を越える安定性を有し即ち６ヵ月以内に有意の分解を示さない。該標準が約10パーセントより小さい好ましくは約５パーセントより小さい免疫検定における信号損失を示す、ことが特に望ましい。
かかる安定性は、４週間と５週間の間の期間にわたる約37℃にての熱老化から好都合に投影され得る。４週間の間約10％より小さい損失を示す組成物は、約６ヵ月を越える安定性を有すると予期される。
以下の実施例は本発明の例示であり、そして請求の範囲において定められる本発明の範囲を制限するものとして決して解釈されるべきでない。当業者は本発明の概念が適用され得る多くの他の装置および使用方法を考え得る、ということが理解されよう。
実施例1: IMx（登録商標）エストラジオール検定
エストラジオール検定を、IMx（登録商標）器具によりIMx（登録商標）使い捨てカートリッジ上で次の方式で実施した。75マイクロリットル（75μＬ）の血清試料を35μＬの５α−ジヒドロテストステロン緩衝液（DHT緩衝液）、50μＬのウサギ抗エストラジオール抗体被覆微粒子懸濁液および90μＬのIMx（登録商標）緩衝液と混合した。この反応混合物を、37℃にて27.5分間インキュベートした。DHT緩衝液は、２μg/mLの５α−ジヒドロテストステロン、0.75％（w/v）サポニン、0.5Mグリシン、0.25mMクエン酸ナトリウムおよび0.12％メチルイソチアゾリノンのpH4.5の水溶液であった。該ウサギ抗エストラジオール抗体被覆微粒子懸濁液は、0.1Mビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis−Tris）、0.1M塩化ナトリウム、13.6％スクロース、0.1％アジ化ナトリウムおよび0.2mg/mLの正常ウサギIgGのpH6.5の水溶液である微粒子緩衝液中に懸濁された0.01％固形分を含有していた。IMx（登録商標）緩衝液は、0.3MのNaCl、0.1MのTRIS（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）および0.1％アジ化ナトリウムのpH7.5の水溶液であった。IMx（登録商標）エストラジオール試薬（DHT緩衝液、ウサギ抗エストラジオール抗体被覆微粒子懸濁液、結合体およびメチルウンベリフェロンホスフェート基質を含む。）、IMx（登録商標）緩衝液、IMx（登録商標）使い捨てカートリッジおよびIMx（登録商標）器具は、イリノイ州アボットパークのアボット・ラボラトリーズ社から市販されており、並びにUS5,342,760、EP−Ａ−288 793および「Fiore等,Clin.Chem.,34/9:1726〜1732,1988」（それらはすべて、参考として本明細書中に組み入れるものとする。）に記載されている。
175マイクロリットル（175μＬ）の上記の反応混合物を、IMx（登録商標）使い捨てカートリッジの繊維マトリックスに移した。該繊維マトリックスは、該IMx（登録商標）カートリッジの吸収パッド上に置かれている。微粒子は該繊維マトリックスにより捕獲され、そして溶液は該吸収パッドにより吸収された。微粒子を、次いでIMx（登録商標）緩衝液で洗浄した。60マイクロリットル（60μＬ）のエストロン６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムアルカリ性ホスファターゼ結合体溶液を該マトリックスに添加し、37℃にて12秒間インキュベートし、そして次いでIMx（登録商標）緩衝液で再び洗浄した。該結合体溶液は、分析物不含有の試料の検定に使用されるとき或る強さの信号を与えるのに十分な結合体を含有する、0.1MのBis−Tris、0.5M塩化ナトリウム、１％カゼイン、1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛および0.1％アジ化物のpH6.5の水溶液であった。
65マイクロリットル（65μＬ）の、1.2mMの４−メチルウンベリフェロンホスフェートおよび0.1Mの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールのpH9の水溶液を該マトリックスに添加し、そして４−メチルウンベリフェロンの形成速度を蛍光反射率により測定した。IMx（登録商標）器具により、水銀アークランプを光源として用いる蛍光計で蛍光が測定された（「Fiore等,Clin.Chem.,34/9:1726〜1732,1988」（その内容は、参考として本明細書中に組み入れるものとする。）に記載されているのと同様に行った）。０、50、250、750、1500および3000pg/mLのエストラジオールを含有するキャリブレータを用いて、標準曲線を作成した。この曲線を用いて、この検定は、13.9±4.3pg/mLの平均感度を有すると決定された。
実施例2: IMx（登録商標）プロゲステロン検定
プロゲステロン検定を、次の変更を除いて実施例１におけるエストラジオール検定と同様の方式を用いてIMx（登録商標）器具によりIMx（登録商標）使い捨てカートリッジ上で実施した。15マイクロリットル（15μＬ）の血清試料を80μＬのプロゲステロン試料緩衝液、80μＬの抗プロゲステロン抗体被覆微粒子懸濁液および75μＬのIMx（登録商標）緩衝液と混合した。この反応混合物を、37℃にて20.8分間インキュベートした。プロゲステロン試料緩衝液は、2.25Mグリシン、0.5μg/mLの５α−ジヒドロテストステロン、0.2％（w/v）サポニン、0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％メチルイソチアゾリノンのpH2.8の水溶液（ペンシルバニア州フィラデルフィアのローム・アンド・ハース社から入手できる。）であった。該抗プロゲステロン抗体（オーストラリア国のサリー大学から入手できる。）被覆微粒子懸濁液は、0.5Mモルホリノエタンスルホン酸（MES）、0.1M塩化ナトリウム、10％スクロース、２％ウシ血清アルブミン（ニューヨーク州ホーソーンのインテルゲン社から入手できる。）、0.1mg/mLヒツジIgG（カリフォルニア州サンタアナのアーヴィン・サイエンティフィック社から得られる、ヒツジ血清の50％硫酸アンモニウムカット。）および0.2％アジ化ナトリウムのpH6.5の水溶液である緩衝液中に懸濁された0.001％固形分（インディアナ州インディアナポリスのセラダイン社から入手できる微粒子）を含有していた。
175マイクロリットル（175μＬ）の上記の反応混合物を、IMx（登録商標）使い捨てカートリッジの繊維マトリックスに移した。該微粒子を、次いでIMx（登録商標）緩衝液で洗浄した。60マイクロリットル（60μＬ）の17−ヒドロキシプロゲステロン−３−（ｏ−カルボキシメチル）オキシムアルカリ性ホスファターゼ結合体溶液を該マトリックスに添加し、反応を37℃にて８秒間インキュベートし、そして次いでIMx（登録商標）緩衝液で再び洗浄した。該結合体溶液は、US5,342,760に記載されているようなEDACカップリング法によりアルカリ性ホスファターゼ（独国のベーリンガー・マンハイム社から入手できる。）に結合された17−ヒドロキシプロゲステロン（ニューハンプシャ州ウィルトンのステラロイズ社から入手できる。）を含有していた。該結合体溶液は、分析物不含有の試料の検定において使用されるとき或る強さの信号を与えるのに十分な結合体を含有する、50mMのtris、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、0.5％カゼイン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）および0.1％アジ化ナトリウムのpH7.4の水溶液であった。
４−メチルウンベリフェロンホスフェートの添加並びに４−メチルウンベリフェロンの形成速度の定量は、実施例１に記載された通りに行った。０、１、４、10、20および40ng/mLのプロゲステロンを含有するキャリブレータを用いて、標準曲線を作成した。この曲線を用いて、この検定は、0.13ng/mLの平均感度を有すると決定された。
実施例3: 血清マトリックスの製造
１リットルの正常ヒト血清（テネシー州メンフィスのインターステート・ブラッド・バンクから入手できる。）を50グラムの活性炭（イリノイ州オーランドパークのアール・ダブリュー・グリーフ・アンド・カンパニー社から入手できる。）と混合することにより、ステロイドがストリッピングされた血清を製造した。２時間の室温混合後、該活性炭を濾過により除去した。アルカリショックした血清（alkaline shocked serum）を、エストラジオール血清マトリックス（IMx（登録商標）エストラジオール検体希釈剤として、アボット・ラボラトリーズ社から入手できる。）に対して用いた。アルカリショックした血清は、木炭ストリッピングされた血清を6N水酸化ナトリウムでpH11に上げ、この混合物を２〜８℃にておおよそ18時間インキュベートし、6N−HClでpHを約8.0に調整し、この最終混合物を濾過することにより製造された。アジ化ナトリウムを、すべての血清マトリックスに対して0.2％（w/v）まで添加した。エストラジオール（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）またはプロゲステロン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）を、ステロイドがストリッピングされた血清のアリコートに添加して、下記に記載の安定性実験のためのキャリブレータ、対照物質または試験試料を作製した。
実施例4: BSAマトリックスの製造
IMx（登録商標）エストラジオール用の、ウシ血清アルブミン（BSA）を基剤としたキャリブレータマトリックスを、有機洗浄によりステロイドがストリッピングされたBSA（イリノイ州カンカキーのマイルズ・ペンテックス社から入手できる。）を0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび0.2％アジ化ナトリウムのpH8の水溶液中５％（w/v）の濃度まで溶解することにより製造した。
実施例5: 血清中のプロゲステロンの安定性に対する種々のキレート化剤の効果
マトリックス安定性実験からプロゲステロンおよびエストラジオールのキャリブレータおよび対照物質の安定性に関する有用な情報を妥当な時間で得るために、ステロイド試料の分解を測定するのに必要な観察時間を低減する技法を案出した。試験試料を37℃にてインキュベートし、そして数日間または数週間の期間観察した。かかるより高い温度は、キャリブレータおよび対照物質が全期間にわたって２〜８℃にて貯蔵されていたなら標準的には数ヵ月間の期間にわたる観察を必要としたであろうステロイド分解を加速した。
実施例３において製造されたような木炭ストリッピングされたヒト血清（アルカリショックがされていない）（10mL）をガラスシンチレーションバイアル中に分取し、そして種々の金属キレート化剤を次の最終濃度まで添加した。
ａ）1.0mMジエチレントリアミン五酢酸（DETP,ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）。
ｂ）10.0mMジエチレントリアミン五酢酸（DETP）。
ｃ）1.0mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA,ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）。
ｄ）10.0mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）。
ｅ）1.0mMデフェロキサミンメシレート（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）。
試料を室温にて12分間ロッカー（rocker）上でインキュベートし、次いでこれに、エタノールストック溶液中で調製された10μg/mLのプロゲステロン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）を5ng/mLまで薬剤添加した（spiked）。室温にてロッカー上で８分インキュベートした後、試料をプロゲステロンのベースライン濃度について検定した。各組成物の４個の1.0mLアリコートをTDx（登録商標）ミクロ遠心分離管（イリノイ州アボットパークのアボット・ラボラトリーズ社から入手できる。）中に入れ、そして−20℃にて凍結貯蔵した。シンチレーションバイアルを、37℃にてインキュベートした。指摘された日数時に、アリコートを解凍し、そして37℃にて貯蔵されたバイアルから取り出した対応するアリコートと共に試験して損失パーセントを検定した。
損失パーセント（損失％）は、凍結されたアリコートに対する、応力がかけられた試料中のプロゲステロンの損失の絶対的測定値である。24個のような多数の試料が、IMx（登録商標）器具の単一実験中試験され得る。該IMx（登録商標）により、ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の結合の量に比例する４−メチルウンベリフェロンの形成速度が測定される。IMx（登録商標）エストラジオールおよびプロゲステロンの検定は競合的であるため、４−メチルウンベリフェロンの形成速度は、分析物濃度に反比例する。単一実験からの試験試料についての濃度の比較は、それ故、分析物濃度の内部的に制御される指標を与え得る。かかる比較は、実験間または器具間の変動により複雑化されない。
これらの実験について、薬剤添加されていない（unspiked）アリコートを、薬剤添加されたアリコートと共に同じ実験に含めた。応力がかけられたまたは凍結された薬剤添加された試料からの信号を薬剤添加されていないアリコートからの信号で割りそしてこの結果をこの検定のために予め作成しておいた置換曲線上にプロットすることにより、各老化条件について濃度を決定した。損失パーセントは、凍結された濃度と応力がかけられた濃度の間の差を凍結されたアリコートについて得られた濃度で割ることにより決定される。これらの結果は、損失パーセント即ち［（凍結された濃度−応力がかけられた濃度）／凍結された濃度］×100％として示される。図１は、試薬無添加と比較されたデフォロキサミン、DETPおよびEDTAの添加による経時（日数０、３、８、15および29）損失％の低減を示す。損失％の低減は、10mMのDETPについて最も有効であり、そしてその次は1mMのDETPであった。29日後試薬無添加の場合のほぼ80％損失と比較して、10mMのDETPの場合損失パーセントは除去された。
実施例6: DETPによる血清中のエストラジオールの安定化
15ミリリットル（15mL）の、実施例３において製造されたアルカリショックされかつ木炭ストリッピングされたヒト血清を、ガラスシンチレーションバイアル中に分取し、そしてジエチレントリアミン五酢酸（DETP）を10mMまで添加した。DETP無添加の対照試料も調製した。これらの試料を室温にて８分間ロッカー上でインキュベートし、２時間平衡化させ、次いでこれに、木炭ストリッピングされた血清中で調製された500ng/mLのエストラジオール（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）ストック溶液を750pg/mLまで薬剤添加した。室温にてロッカー上で５分インキュベートした後、試料をベースライン濃度について検定した。４個の1mLアリコートをTDx（登録商標）ミクロ遠心分離管（イリノイ州アボットパークのアボット・ラボラトリーズ社から入手できる。）中に入れ、そして−20℃にて凍結した。シンチレーションバイアルを、37℃にてインキュベートした。指示された日数時に凍結アリコートを解凍し、そして37℃にて貯蔵されたバイアルから取り出した対応するアリコートと共に試験して、実施例５において概説されたデータ処理を用い、しかし結果は薬剤添加されていない検体についての標準信号を用いて正規化され得ると仮定して、損失パーセントを検定した。図２は、試薬無添加と比較された10mMのDETPの添加による経時（日数０、７、14、21および28）損失％の低減を示す。損失パーセントは、10mMのDETPの添加により28日後20％超からほぼ損失なしへ低減することが観察された。
実施例7: DETPによる５％BSAマトリックス中のエストラジオールの安定化
BSA試料マトリックスを実施例４における記載のようにして製造し、そして２個のマスターアリコートに分けた。DETPを一方のアリコートに20mMまで添加した。エストラジオールを両方のアリコートに750pg/mLの濃度まで添加し、そして各アリコートを更に10個のポリエチレン製滴瓶中に分取した。各マスターアリコートからの５個の滴瓶を37℃にてインキュベートし、そして他の５個を−20℃にて凍結した。指示された日数時に凍結アリコートを解凍しそして対応する37℃アリコートと共に試験して、実施例６に記載のようにして損失パーセントを検定した。図３は、試薬無添加と比較された20mMのDETPの添加による経時（日数０、７、14、21、28および35）損失％の低減を示す。損失パーセントは、20mMのDETPの添加により28日後10％超からほぼ損失なしへ低減することが観察された。
記載された実施態様並びに示された代替的実施態様は、限定というよりむしろ具体例として意図されている。従って、本発明の説明は、開示された特定の実施態様に本発明を限定するよう意図されているものではなくて、上記に説明され、また請求の範囲に記載されている本発明の思想および範囲内のすべての均等物および主題を包含するよう意図されている。

Claims (19)

1. ステロイドおよびジエチレントリアミン五酢酸を水性媒質中に含む、イムノアッセイにおける参照標準として使用するための検量用組成物。
2. ステロイドが分解を受け易い生物学的に活性なステロイドである、請求項１に記載の組成物。
3. ステロイドが水性媒質中で遷移金属により触媒される酸化分解を受け得るものである、請求項２に記載の組成物。
4. タンパク質分を含む、請求項３に記載の組成物。
5. タンパク質分の含有量が10mg/mL〜300mg/mLである、請求項４に記載の組成物。
6. 水性媒質が緩衝化されている、請求項５に記載の組成物。
7. タンパク質分が牛血清アルブミンより供給される、請求項５に記載の組成物。
8. タンパク質分が木炭ストリッピングされた正常ヒト血清により供給される、請求項７に記載の組成物。
9. ステロイドがエストラジオールまたはプロゲステロンである、請求項５に記載の組成物。
10. ステロイドがエストラジオールである、請求項９に記載の組成物。
11. タンパク質分がステロイドストリッピングされた牛血清アルブミンにより供給される、請求項10に記載の組成物。
12. 水性媒質が実質的にフィブリノーゲンを含まない、請求項11に記載の組成物。
13. 水性媒質が血漿ではない、請求項11に記載の組成物。
14. ステロイドが2.5×10^-11〜1.0×10^-7g/mLの濃度範囲で存在する、請求項４または５に記載の組成物。
15. ジエチレントリアミン五酢酸が0.1mMより大きい濃度で存在する、請求項４または５に記載の組成物。
16. ジエチレントリアミン五酢酸が0.2mM〜50mMの濃度範囲で存在する、請求項15に記載の組成物。
17. 水溶液中のステロイドに、水溶液から金属イオンを封鎖する少なくとも0.1mMの有効なキレート量のジエチレントリアミン五酢酸を加える工程を含む、金属−イオンを含有する免疫学的参照標準ステロイド水溶液の安定化方法。
18. ジエチレントリアミン五酢酸のキレート量が0.2mM〜50mMである、請求項17に記載の方法。
19. イムノアッセイにおける参照標準としての、水性媒質中にステロイドおよびジエチレントリアミン五酢酸を含む組成物の使用。

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