JP3438889B2 - 所望のタンパク質を高レベルに発現させる組換え宿主細胞の選別法 - Google Patents
所望のタンパク質を高レベルに発現させる組換え宿主細胞の選別法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
生きている宿主細胞にDNAを機能的な形態で導入する
方法の発見は多くの基本的な生物学的過程を理解するた
めの手掛かりを提供すると共に、重要なタンパク質また
は他の分子を商業的に有用な量で生産することを可能に
した。
方法の発見は多くの基本的な生物学的過程を理解するた
めの手掛かりを提供すると共に、重要なタンパク質また
は他の分子を商業的に有用な量で生産することを可能に
した。
そのような遺伝子移送法の一般的な成功にもかかわら
ず、所望のタンパク質をコード化する遺伝子が宿主細胞
中に導入されてその中で発現する効率を制限し得る、い
くつかの一般的な課題が存在する。１つの問題は遺伝子
がいつ成功裏に受容細胞中に移送されたかを知ることで
ある。第２の問題は、その遺伝子を含有する細胞と、移
送操作には耐えたけれどもその遺伝子を含有していない
細胞とを識別することである。第３の問題は、その遺伝
子を含有し、その遺伝子によってコード化されているタ
ンパク質を高レベルに発現させる細胞を同定し、単離す
ることである。
ず、所望のタンパク質をコード化する遺伝子が宿主細胞
中に導入されてその中で発現する効率を制限し得る、い
くつかの一般的な課題が存在する。１つの問題は遺伝子
がいつ成功裏に受容細胞中に移送されたかを知ることで
ある。第２の問題は、その遺伝子を含有する細胞と、移
送操作には耐えたけれどもその遺伝子を含有していない
細胞とを識別することである。第３の問題は、その遺伝
子を含有し、その遺伝子によってコード化されているタ
ンパク質を高レベルに発現させる細胞を同定し、単離す
ることである。
一般に、真核細胞中に遺伝子を導入する既知の方法は
非常に効率が悪いという傾向がある。ある与えられた培
養中の細胞のうち、外部から加えられたDNAを取り込
み、それを発現させる細胞の比率はわずかに過ぎず、DN
Aを安定に保持する細胞の比率はさらに低い。
非常に効率が悪いという傾向がある。ある与えられた培
養中の細胞のうち、外部から加えられたDNAを取り込
み、それを発現させる細胞の比率はわずかに過ぎず、DN
Aを安定に保持する細胞の比率はさらに低い。
所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子を組み
込んでいる細胞の同定は、多くの場合、一般に選択可能
遺伝子と呼ばれるもう１つの遺伝子であって選択可能な
タンパク質をコード化する遺伝子を同じ細胞中に導入す
ることによって達成される。選択可能なタンパク質は選
択した特定の培養条件下で宿主細胞の成長または生存に
とって必要なタンパク質であり、例えば抗生物質や他の
薬剤に対する耐性を付与する酵素あるいは宿主細胞の代
謝的または異化的な欠損を補う酵素である。例えば、真
核細胞と共に一般に使用される選択可能遺伝子にはアミ
ノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ（APHまたはn
eo）、ハイブロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ
（hyg）、ジヒドロフォレート・レダクターゼ（DHFR）
およびチミジン・キナーゼ（tk）が含まれる。
込んでいる細胞の同定は、多くの場合、一般に選択可能
遺伝子と呼ばれるもう１つの遺伝子であって選択可能な
タンパク質をコード化する遺伝子を同じ細胞中に導入す
ることによって達成される。選択可能なタンパク質は選
択した特定の培養条件下で宿主細胞の成長または生存に
とって必要なタンパク質であり、例えば抗生物質や他の
薬剤に対する耐性を付与する酵素あるいは宿主細胞の代
謝的または異化的な欠損を補う酵素である。例えば、真
核細胞と共に一般に使用される選択可能遺伝子にはアミ
ノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ（APHまたはn
eo）、ハイブロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ
（hyg）、ジヒドロフォレート・レダクターゼ（DHFR）
およびチミジン・キナーゼ（tk）が含まれる。
選択可能なタンパク質をコード化する第２の組み込ま
れた遺伝子の宿主細胞による発現に基づいてある遺伝子
を組み込んでいる宿主細胞を同定する方法は同時トラン
スフェクション（もしくは同時形質転換）と呼ばれてい
る。この方法では所望のタンパク質をコード化する生成
物遺伝子と選択可能遺伝子が同時に宿主細胞に導入され
る。生成物遺伝子と選択可能遺伝子は、宿主細胞中に導
入される前に、単一のDNA分子上に存在してもよいし、
別個のDNA分子上に存在してもよい。ウィグラーら,Cell
16:777（1989）。次に、選択可能遺伝子がコード化す
る選択可能なタンパク質を合成する細胞のみが成長また
は生存できる条件下で培養を行うことによって、選択可
能遺伝子を組み込んでそれを発現させている細胞を同定
または単離する。典型的な場合、このようにして同定ま
たは単離された細胞の多くの中に生成物遺伝子が存在
し、それが発現される。
れた遺伝子の宿主細胞による発現に基づいてある遺伝子
を組み込んでいる宿主細胞を同定する方法は同時トラン
スフェクション（もしくは同時形質転換）と呼ばれてい
る。この方法では所望のタンパク質をコード化する生成
物遺伝子と選択可能遺伝子が同時に宿主細胞に導入され
る。生成物遺伝子と選択可能遺伝子は、宿主細胞中に導
入される前に、単一のDNA分子上に存在してもよいし、
別個のDNA分子上に存在してもよい。ウィグラーら,Cell
16:777（1989）。次に、選択可能遺伝子がコード化す
る選択可能なタンパク質を合成する細胞のみが成長また
は生存できる条件下で培養を行うことによって、選択可
能遺伝子を組み込んでそれを発現させている細胞を同定
または単離する。典型的な場合、このようにして同定ま
たは単離された細胞の多くの中に生成物遺伝子が存在
し、それが発現される。
真核宿主細胞中に導入された遺伝子の発現レベルは、
遺伝子のコピー数、転写の効率、メッセンジャーRNA（m
RNA）のプロセシング、安定性および翻訳効率を含む複
数の因子に依存する。したがって所望の遺伝子の高レベ
ルな発現は典型的な場合、上記因子の１またはそれ以上
の最適化を必要とするであろう。
遺伝子のコピー数、転写の効率、メッセンジャーRNA（m
RNA）のプロセシング、安定性および翻訳効率を含む複
数の因子に依存する。したがって所望の遺伝子の高レベ
ルな発現は典型的な場合、上記因子の１またはそれ以上
の最適化を必要とするであろう。
例えば、高い転写レベルを与える「強力な」プロモー
ターまたはエンハンサーに遺伝子のコード領域を共有結
合させることによってタンパク質の生産レベルを増大さ
せることができる。プロモーターとエンハンサーは転写
に関与する宿主細胞中のタンパク質と特異的に相互作用
するヌクレオチド配列である。クレイガー,Meth.Enzymo
l.185:512（1990）；マニアティスら,Science 236:1237
（1987）。プロモーターは遺伝子のコード配列の上流に
位置するヌクレオチド配列であり、RNAポリメラーゼに
よる遺伝子の転写を容易にする。高レベル発現のための
強力なプロモーターとして知られている真核プロモータ
ーには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後
期プロモーター、マウス・メタロチオネイン−Ｉプロモ
ーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復およびヒト・サ
イトメガロウイルス（CMV）主要即時初期プロモーター
などがある。
ターまたはエンハンサーに遺伝子のコード領域を共有結
合させることによってタンパク質の生産レベルを増大さ
せることができる。プロモーターとエンハンサーは転写
に関与する宿主細胞中のタンパク質と特異的に相互作用
するヌクレオチド配列である。クレイガー,Meth.Enzymo
l.185:512（1990）；マニアティスら,Science 236:1237
（1987）。プロモーターは遺伝子のコード配列の上流に
位置するヌクレオチド配列であり、RNAポリメラーゼに
よる遺伝子の転写を容易にする。高レベル発現のための
強力なプロモーターとして知られている真核プロモータ
ーには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後
期プロモーター、マウス・メタロチオネイン−Ｉプロモ
ーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復およびヒト・サ
イトメガロウイルス（CMV）主要即時初期プロモーター
などがある。
エンハンサーは連結したプロモーターからの転写を刺
激する。エンハンサーは実際にはプロモーターと物理的
および機能的に重複し得るのであるが、プロモーターと
は異なり、転写開始部位の下流やプロモーターからかな
り離れた所に位置していても活性である。例えば、上に
挙げた強力なプロモーターはすべて強力なエンハンサー
をも含有している。ベンディグ,Genetic Engineering
7:91（アカデミック・プレス,1988）。
激する。エンハンサーは実際にはプロモーターと物理的
および機能的に重複し得るのであるが、プロモーターと
は異なり、転写開始部位の下流やプロモーターからかな
り離れた所に位置していても活性である。例えば、上に
挙げた強力なプロモーターはすべて強力なエンハンサー
をも含有している。ベンディグ,Genetic Engineering
7:91（アカデミック・プレス,1988）。
宿主細胞中の遺伝子のコピー数を増大させることによ
ってタンパク質の生産レベルを増大させることもでき
る。高い遺伝子コピー数を得るための一方法は、例えば
同時トランスフェクション中に選択可能遺伝子に対して
大モル過剰の生成物遺伝子を用いることによって、宿主
細胞中に複数コピーの遺伝子を直接導入することであ
る。カウフマン,Meth.Enzymol.185:537（1990）。しか
し、この方法では生成物遺伝子を高いコピー数で含有す
る細胞の比率は同時トランスフェクションされた細胞の
一部に過ぎず、そのような細胞を、より少ないコピー数
の生成物遺伝子を含有する大部分の細胞と識別するため
の一般的に適用可能な便利な方法は存在しないので、所
望の高コピー数トランスフェクタントを同定するために
は面倒で時間のかかるスクリーニング法を必要とするの
が通例である。
ってタンパク質の生産レベルを増大させることもでき
る。高い遺伝子コピー数を得るための一方法は、例えば
同時トランスフェクション中に選択可能遺伝子に対して
大モル過剰の生成物遺伝子を用いることによって、宿主
細胞中に複数コピーの遺伝子を直接導入することであ
る。カウフマン,Meth.Enzymol.185:537（1990）。しか
し、この方法では生成物遺伝子を高いコピー数で含有す
る細胞の比率は同時トランスフェクションされた細胞の
一部に過ぎず、そのような細胞を、より少ないコピー数
の生成物遺伝子を含有する大部分の細胞と識別するため
の一般的に適用可能な便利な方法は存在しないので、所
望の高コピー数トランスフェクタントを同定するために
は面倒で時間のかかるスクリーニング法を必要とするの
が通例である。
高い遺伝子コピー数を得るためのもう１つの方法に
は、宿主細胞中で自律的に複製することができるベクタ
ー中に遺伝子をクローニングすることが含まれる。その
ようなベクターの例には、エプスタイン−バー・ウイル
スまたは牛パピローマウイルスから誘導される哺乳類発
現ベクターおよび酵母２ミクロンプラスミドベクターが
含まれる。スティーヴンおよびヘンチェル,Biochem.J.2
48:1（1987）；イェーツら,Nature 313:812（1985）；
ベッグス,Genetic Engineering 2:175（アカデミック・
プレス,1981）。しかしそのようなベクターの制御され
ない複製は細胞の生存能と相いれないし、制御された複
製はベクターのコピー数を制限するので、この方法の有
用性には限界がある。さらに、自律的な複製は（おそら
く転写のレベルで）遺伝子の発現を妨害することが示さ
れている。レブコウスキーら,Nature 317:169（198
5）。
は、宿主細胞中で自律的に複製することができるベクタ
ー中に遺伝子をクローニングすることが含まれる。その
ようなベクターの例には、エプスタイン−バー・ウイル
スまたは牛パピローマウイルスから誘導される哺乳類発
現ベクターおよび酵母２ミクロンプラスミドベクターが
含まれる。スティーヴンおよびヘンチェル,Biochem.J.2
48:1（1987）；イェーツら,Nature 313:812（1985）；
ベッグス,Genetic Engineering 2:175（アカデミック・
プレス,1981）。しかしそのようなベクターの制御され
ない複製は細胞の生存能と相いれないし、制御された複
製はベクターのコピー数を制限するので、この方法の有
用性には限界がある。さらに、自律的な複製は（おそら
く転写のレベルで）遺伝子の発現を妨害することが示さ
れている。レブコウスキーら,Nature 317:169（198
5）。
高い遺伝子コピー数を得るためのさらにもう１つの方
法には、宿主細胞中での遺伝子増幅が含まれる。真核細
胞中で自然に起こる遺伝子の増幅の頻度は比較的低い。
シムケ,J.Biol.Chem.263:5989（1988）。しかし宿主細
胞を適当な選択圧にさらすことによって、遺伝子の増幅
を誘発するか、もしくは少なくとも選択することもでき
る。例えば多くの場合、生成物遺伝子を選択可能で増幅
可能な標識遺伝子と共に宿主細胞に導入し、次いで、同
時トランスフェクションされた細胞を徐々に濃度が増大
する選択剤にさらすことによって、その標識遺伝子の増
幅について選択することができる。典型的な場合、生成
物遺伝子はそのような条件下で標識遺伝子と同時に増幅
されるであろう。
法には、宿主細胞中での遺伝子増幅が含まれる。真核細
胞中で自然に起こる遺伝子の増幅の頻度は比較的低い。
シムケ,J.Biol.Chem.263:5989（1988）。しかし宿主細
胞を適当な選択圧にさらすことによって、遺伝子の増幅
を誘発するか、もしくは少なくとも選択することもでき
る。例えば多くの場合、生成物遺伝子を選択可能で増幅
可能な標識遺伝子と共に宿主細胞に導入し、次いで、同
時トランスフェクションされた細胞を徐々に濃度が増大
する選択剤にさらすことによって、その標識遺伝子の増
幅について選択することができる。典型的な場合、生成
物遺伝子はそのような条件下で標識遺伝子と同時に増幅
されるであろう。
この目的に最も広く使用されている選択可能で増幅可
能な標識遺伝子はDHFR遺伝子である。DHFR遺伝子に関連
して用いられる選択剤はメトトレキセート（Mtx）であ
る。所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子とDH
FR遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションし、Mt
xを含有する培養培地中でその細胞を一次培養すること
によってトランスフェクタントを同定する。野生型DHFR
遺伝子を使用する場合に好適な宿主細胞はDHFR活性が欠
損したチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞系で
あり、この細胞系はウルラウブおよびチェイシン,Proc.
Natl.Acad.Sci.77:4216（1980）に記述されているよう
に調製され、増殖される。次に、トランスフェクタント
細胞を逐次的に増大する量のMtxにさらす。これはDHFR
遺伝子の複数コピーとそれに付随する生成物遺伝子の複
数コピーの合成を導く。シムケ,J.Biol.Chem.263:5989
（1988）；アクセルら，米国特許第4399216号；アクセ
ルら，米国特許第4634665号。
能な標識遺伝子はDHFR遺伝子である。DHFR遺伝子に関連
して用いられる選択剤はメトトレキセート（Mtx）であ
る。所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子とDH
FR遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションし、Mt
xを含有する培養培地中でその細胞を一次培養すること
によってトランスフェクタントを同定する。野生型DHFR
遺伝子を使用する場合に好適な宿主細胞はDHFR活性が欠
損したチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞系で
あり、この細胞系はウルラウブおよびチェイシン,Proc.
Natl.Acad.Sci.77:4216（1980）に記述されているよう
に調製され、増殖される。次に、トランスフェクタント
細胞を逐次的に増大する量のMtxにさらす。これはDHFR
遺伝子の複数コピーとそれに付随する生成物遺伝子の複
数コピーの合成を導く。シムケ,J.Biol.Chem.263:5989
（1988）；アクセルら，米国特許第4399216号；アクセ
ルら，米国特許第4634665号。
DHFR増幅法を次の細胞型に拡張するために、メトトレ
キセートに対する感受性が減少しているタンパク質をコ
ード化する突然変異DHFR遺伝子を、正常な数の内因性野
生型DHFR遺伝子を含有している宿主細胞と組み合わせて
使用することができる。シモンセンおよびレビンソン,P
roc.Natl.Acad.Sci.80:2495（1983）。別法として、生
成物遺伝子、DHFR遺伝子およびneor遺伝子などの優性選
択可能遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションす
ることができる。キムおよびウォルド,Cell 42:129（19
85）。ネオマイシン（または関連する薬剤G418）を含有
する培養培地中で細胞を一次培養することによってトラ
ンスフェクタントを同定し、次いで、そのようにして同
定されたトランスフェクタントを逐次的に増大する量の
Mtxにさらすことによって、DHFR遺伝子と生成物遺伝子
の増幅について選択する。
キセートに対する感受性が減少しているタンパク質をコ
ード化する突然変異DHFR遺伝子を、正常な数の内因性野
生型DHFR遺伝子を含有している宿主細胞と組み合わせて
使用することができる。シモンセンおよびレビンソン,P
roc.Natl.Acad.Sci.80:2495（1983）。別法として、生
成物遺伝子、DHFR遺伝子およびneor遺伝子などの優性選
択可能遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションす
ることができる。キムおよびウォルド,Cell 42:129（19
85）。ネオマイシン（または関連する薬剤G418）を含有
する培養培地中で細胞を一次培養することによってトラ
ンスフェクタントを同定し、次いで、そのようにして同
定されたトランスフェクタントを逐次的に増大する量の
Mtxにさらすことによって、DHFR遺伝子と生成物遺伝子
の増幅について選択する。
この議論から理解されるであろうように、高レベルの
所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞の選択は
一般に多段階工程である。第１段階では、生成物遺伝子
と選択遺伝子を組み込んでいる一次トランスフェクタン
トを選択する。以降の段階では、この一次トランスフェ
クタントを選択可能遺伝子の高レベル発現に関するさら
なる選択に付し、次いで生成物遺伝子の高レベル発現に
関する無作為スクリーニングに付す。高レベルの所望の
タンパク質を発現させている細胞を同定するためには、
典型的には多数のトランスフェクタントをスクリーニン
グする必要がある。トランスフェクタントの大部分は最
大レベルより少ない所望のタンパク質を生産する。
所望のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞の選択は
一般に多段階工程である。第１段階では、生成物遺伝子
と選択遺伝子を組み込んでいる一次トランスフェクタン
トを選択する。以降の段階では、この一次トランスフェ
クタントを選択可能遺伝子の高レベル発現に関するさら
なる選択に付し、次いで生成物遺伝子の高レベル発現に
関する無作為スクリーニングに付す。高レベルの所望の
タンパク質を発現させている細胞を同定するためには、
典型的には多数のトランスフェクタントをスクリーニン
グする必要がある。トランスフェクタントの大部分は最
大レベルより少ない所望のタンパク質を生産する。
このような組換え宿主細胞を一段階で直接的に選択す
るいくつかの方法が記述されている。例えばある方法で
は、生成物遺伝子とDHFR遺伝子で宿主細胞を同時トラン
スフェクションし、高濃度のMtxを含有する培地中で直
接培養することによって高レベルのDHFRを発現させる細
胞を選択する。この方法で選択された細胞の多くは同時
トランスフェクションされた生成物遺伝子をも高レベル
で発現させる。ページおよびシンデンハム,Bio/Technol
ogy 9:64（1991）。もう１つの方法には、転写される領
域の5'末端に生成物遺伝子を含有し、3'末端に選択可能
遺伝子を含有するポリシストロン性mRNA発現ベクターの
使用が含まれる。ポリシストロン性mRNAの3'末端にある
選択可能遺伝子の翻訳は充分でないので、このようなベ
クターは所望の遺伝子の優先的翻訳を示し、選択を生き
残るために高レベルのポリシストロン性mRNAを必要とす
る。カウフマン,Meth.Enzymol.,185:487（1990）；カウ
フマン,Meth.Enzymol.185:537（1990）；カウフマンら,
EMBO J.6:187（1987）。したがって、特定の選択可能遺
伝子と組み合わせて使用するのに適した選択剤を含有す
る培地中で一次トランスフェクタントを培養することに
より、所望のタンパク質生成物を高レベルで発現させる
細胞を一段階で得ることができる。
るいくつかの方法が記述されている。例えばある方法で
は、生成物遺伝子とDHFR遺伝子で宿主細胞を同時トラン
スフェクションし、高濃度のMtxを含有する培地中で直
接培養することによって高レベルのDHFRを発現させる細
胞を選択する。この方法で選択された細胞の多くは同時
トランスフェクションされた生成物遺伝子をも高レベル
で発現させる。ページおよびシンデンハム,Bio/Technol
ogy 9:64（1991）。もう１つの方法には、転写される領
域の5'末端に生成物遺伝子を含有し、3'末端に選択可能
遺伝子を含有するポリシストロン性mRNA発現ベクターの
使用が含まれる。ポリシストロン性mRNAの3'末端にある
選択可能遺伝子の翻訳は充分でないので、このようなベ
クターは所望の遺伝子の優先的翻訳を示し、選択を生き
残るために高レベルのポリシストロン性mRNAを必要とす
る。カウフマン,Meth.Enzymol.,185:487（1990）；カウ
フマン,Meth.Enzymol.185:537（1990）；カウフマンら,
EMBO J.6:187（1987）。したがって、特定の選択可能遺
伝子と組み合わせて使用するのに適した選択剤を含有す
る培地中で一次トランスフェクタントを培養することに
より、所望のタンパク質生成物を高レベルで発現させる
細胞を一段階で得ることができる。
残念ながら、これらの既知の一段階選択法はそれらの
有用性を制限するいくつかの欠点を持っている。高レベ
ルの選択剤を含有する培地中で直接培養することによっ
て得られる高発現細胞は乏しい成長性と安定性を有する
ことがあり、それゆえに長期間の生産工程に対するそれ
らの有用性には制限がある。ページおよびシンデルマ
ン,Bio/Technology 9:64（1991）。Mtxに対する高レベ
ルの耐性に関する一段階選択は、増幅された遺伝子を含
有する細胞ではなくて、むしろ変化したMtx−耐性DHFR
酵素を伴う細胞か、あるいは変化したMtx輸送特性を有
する細胞を生産することがある。ハーバーら,J.Biol.Ch
em.256:9501（1981）；アサラフおよびシムケ,Proc.Nat
l.Acad.Sci.84:7154（1987）。ポリシストロン性ベクタ
ーの場合には、3'選択可能遺伝子の発現について選択し
た時に、5'生成物遺伝子の欠失または再配置に関する強
い選択が起こる。5'生成物遺伝子中にそのような突然変
異を有するベクターを保持する細胞はその集団中で他の
細胞とよりも早く成長し、それゆえに高レベルの所望の
タンパク質を実際に発現させる細胞の選択を妨害する傾
向がある。カウフマン,Meth.Enz.185:537（1990）。
有用性を制限するいくつかの欠点を持っている。高レベ
ルの選択剤を含有する培地中で直接培養することによっ
て得られる高発現細胞は乏しい成長性と安定性を有する
ことがあり、それゆえに長期間の生産工程に対するそれ
らの有用性には制限がある。ページおよびシンデルマ
ン,Bio/Technology 9:64（1991）。Mtxに対する高レベ
ルの耐性に関する一段階選択は、増幅された遺伝子を含
有する細胞ではなくて、むしろ変化したMtx−耐性DHFR
酵素を伴う細胞か、あるいは変化したMtx輸送特性を有
する細胞を生産することがある。ハーバーら,J.Biol.Ch
em.256:9501（1981）；アサラフおよびシムケ,Proc.Nat
l.Acad.Sci.84:7154（1987）。ポリシストロン性ベクタ
ーの場合には、3'選択可能遺伝子の発現について選択し
た時に、5'生成物遺伝子の欠失または再配置に関する強
い選択が起こる。5'生成物遺伝子中にそのような突然変
異を有するベクターを保持する細胞はその集団中で他の
細胞とよりも早く成長し、それゆえに高レベルの所望の
タンパク質を実際に発現させる細胞の選択を妨害する傾
向がある。カウフマン,Meth.Enz.185:537（1990）。
したがって、組換え宿主細胞における所望のタンパク
質生成物の高レベル発現を獲得する方法であって、高濃
度のMtxや他の選択剤に細胞をさらす必要のない方法、
あるいは自律的に複製するベクターまたはポリシストロ
ン性mRNA発現ベクターの使用を必要としない方法を提供
することが本発明の１つの目的である。高レベルの所望
のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞を選択する方
法であって、迅速かつ便利に実施することができ、多数
の細胞をスクリーニングする必要がない方法を提供する
ことが本発明のもう１つの目的である。高レベルの所望
のタンパク質生成物を発現させる組換え宿主細胞の新し
い一段階選択法を提供することが本発明のもう１つの目
的である。
質生成物の高レベル発現を獲得する方法であって、高濃
度のMtxや他の選択剤に細胞をさらす必要のない方法、
あるいは自律的に複製するベクターまたはポリシストロ
ン性mRNA発現ベクターの使用を必要としない方法を提供
することが本発明の１つの目的である。高レベルの所望
のタンパク質を発現させる組換え宿主細胞を選択する方
法であって、迅速かつ便利に実施することができ、多数
の細胞をスクリーニングする必要がない方法を提供する
ことが本発明のもう１つの目的である。高レベルの所望
のタンパク質生成物を発現させる組換え宿主細胞の新し
い一段階選択法を提供することが本発明のもう１つの目
的である。
したがって本発明は、高レベルの所望のタンパク質を
発現させる組換え宿主細胞の選択法であって、数多くの
様々な真核宿主細胞にとって有用であり、現行の細胞選
択技術に固有の問題を回避する改善された方法を提供す
る。
発現させる組換え宿主細胞の選択法であって、数多くの
様々な真核宿主細胞にとって有用であり、現行の細胞選
択技術に固有の問題を回避する改善された方法を提供す
る。
発明の要約
本発明は、高レベルの所望のタンパク質を発現させる
組換え宿主細胞を選択するための改善された方法に関す
る。本発明の方法では、出発選択可能遺伝子の転写され
る領域中に、対応するmRNA前駆対から低い効率でそのイ
ントロンが正しくスプライスされるような長さのイント
ロンを挿入することによって、該出発選択可能遺伝子を
修飾する。その結果として、イントロンで修飾された遺
伝子から生産される選択可能なタンパク質の量は出発選
択可能遺伝子から生産されるものの量よりかなり少なく
なる。
組換え宿主細胞を選択するための改善された方法に関す
る。本発明の方法では、出発選択可能遺伝子の転写され
る領域中に、対応するmRNA前駆対から低い効率でそのイ
ントロンが正しくスプライスされるような長さのイント
ロンを挿入することによって、該出発選択可能遺伝子を
修飾する。その結果として、イントロンで修飾された遺
伝子から生産される選択可能なタンパク質の量は出発選
択可能遺伝子から生産されるものの量よりかなり少なく
なる。
次いで宿主細胞をイントロンで修飾した選択可能遺伝
子と所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子で同
時トランスフェクションする。このような同時トランス
フェクションの後では、得られたトランスフェクタント
のほとんどが、トランスフェクタントにおいてイントロ
ンで修飾された選択可能遺伝子から生産される比較的低
いレベルの選択可能タンパク質の結果として、選択可能
タンパク質の特徴である選択可能な表現型を示し得ない
ということが観測される。しかし驚くべきことに、それ
らのトランスフェクタントの一部は選択可能な表現型を
示し、それらのトランスフェクタントの中では、大部分
が生成物遺伝子によってコード化される所望のタンパク
質を高レベルに発現させることが認められる。
子と所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子で同
時トランスフェクションする。このような同時トランス
フェクションの後では、得られたトランスフェクタント
のほとんどが、トランスフェクタントにおいてイントロ
ンで修飾された選択可能遺伝子から生産される比較的低
いレベルの選択可能タンパク質の結果として、選択可能
タンパク質の特徴である選択可能な表現型を示し得ない
ということが観測される。しかし驚くべきことに、それ
らのトランスフェクタントの一部は選択可能な表現型を
示し、それらのトランスフェクタントの中では、大部分
が生成物遺伝子によってコード化される所望のタンパク
質を高レベルに発現させることが認められる。
図面の簡単な説明
図１は、Ras2.2細胞を実施例２に記述するように同時
トランスフェクションした後に得られたハイグロマイシ
ン耐性（hygr）、ネオマイシン耐性（neor）およびハイ
グロマイシン／ネオマイシン耐性（hygr/neor）細胞の
コロニー数を示す。それぞれの異なるネオマイシン耐性
遺伝子内に存在する合成イントロンの長さを示す。ネオ
マイシン耐性遺伝子を含有するベクターの構築について
は実施例１に記述する。
トランスフェクションした後に得られたハイグロマイシ
ン耐性（hygr）、ネオマイシン耐性（neor）およびハイ
グロマイシン／ネオマイシン耐性（hygr/neor）細胞の
コロニー数を示す。それぞれの異なるネオマイシン耐性
遺伝子内に存在する合成イントロンの長さを示す。ネオ
マイシン耐性遺伝子を含有するベクターの構築について
は実施例１に記述する。
図２は、様々な薬物耐性細胞培養によって生産される
ヒト成長ホルモン（hGH）のレベルを示す。Ras2.2細胞
を実施例２に記述するようにベクターで同時トランスフ
ェクションした。薬物耐性細胞培養から得られる培地中
のhGHのレベル（pg/細胞）をELISA放射線免疫検定法に
よって決定した。
ヒト成長ホルモン（hGH）のレベルを示す。Ras2.2細胞
を実施例２に記述するようにベクターで同時トランスフ
ェクションした。薬物耐性細胞培養から得られる培地中
のhGHのレベル（pg/細胞）をELISA放射線免疫検定法に
よって決定した。
図３は、実施例２に記述の如く、pRK−hyg、pRSV−hG
HおよびpNeol3G−71もしくはpNeol3G△Ｓでトランスフ
ェクションしたRas2.2細胞の培養から得られた個々の細
胞クローンによって生産されるhGHのレベルを示す。
HおよびpNeol3G−71もしくはpNeol3G△Ｓでトランスフ
ェクションしたRas2.2細胞の培養から得られた個々の細
胞クローンによって生産されるhGHのレベルを示す。
発明の詳細な説明
一般に本発明の方法には、所望のタンパク質をコード
化する生成物遺伝子とイントロンを含有する選択可能遺
伝子で真核宿主細胞を同時トランスフェクションするこ
とが含まれ、該イントロンは、その宿主細胞中で該選択
可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベル
を、イントロンを含まない選択可能遺伝子と比較して減
少させる。
化する生成物遺伝子とイントロンを含有する選択可能遺
伝子で真核宿主細胞を同時トランスフェクションするこ
とが含まれ、該イントロンは、その宿主細胞中で該選択
可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベル
を、イントロンを含まない選択可能遺伝子と比較して減
少させる。
イントロンは非コードヌクレオチド配列であり、多く
の真核遺伝子内に正常に存在し、総合的にスプライシン
グと呼ばれる多段階の過程で、新たに転写されたmRNA前
駆体から除去される。
の真核遺伝子内に正常に存在し、総合的にスプライシン
グと呼ばれる多段階の過程で、新たに転写されたmRNA前
駆体から除去される。
単一の作用機序が、哺乳類、植物および酵母細胞にお
けるmRNA前駆体のスプライシングの原因であると考えら
れている。一般にスプライシングの過程は、イントロン
の5'末端と3'末端が正しく切断され、得られたmRNAの末
端が正確に連結されて、タンパク質合成にとって適切な
読み枠を有する成熟したmRNAが生産されることを必要と
する。
けるmRNA前駆体のスプライシングの原因であると考えら
れている。一般にスプライシングの過程は、イントロン
の5'末端と3'末端が正しく切断され、得られたmRNAの末
端が正確に連結されて、タンパク質合成にとって適切な
読み枠を有する成熟したmRNAが生産されることを必要と
する。
イントロンの切断が起こる位置をスプライス部位と呼
ぶ。多数の異なる遺伝子中のスプライス部位を取り巻く
ヌクレオチド配列を比較することによって、イントロン
の各末端のスプライス部位に関する共通配列を定義する
ことが可能になっている。この共通配列は、スプライス
部位に対するそれぞれの位置に認められる最も一般的な
ヌクレオチドを特定するものである。例えば高等真核生
物のmRNAでは、5'スプライス部位が共通配列AG:GUAAGU
（ここにコロン記号は切断と連結の部位を表す）内に現
れ、3'スプライス部位が共通配列（U/C）nNCAG:G内に現
れる。酵母のmRNAでは、5'スプライス部位が共通配列:G
UAUGUによって限定されており、3'スプライス部位が共
通配列（C/U）AG:によって限定されている。オーシマお
よびゴトー,J.Mol.Biol.195:247（1987）；パジェット
ら,Ann.Rev.Biochem.55:1119（1986）；マウント,Nuc.A
cids Res.10:459（1982）。
ぶ。多数の異なる遺伝子中のスプライス部位を取り巻く
ヌクレオチド配列を比較することによって、イントロン
の各末端のスプライス部位に関する共通配列を定義する
ことが可能になっている。この共通配列は、スプライス
部位に対するそれぞれの位置に認められる最も一般的な
ヌクレオチドを特定するものである。例えば高等真核生
物のmRNAでは、5'スプライス部位が共通配列AG:GUAAGU
（ここにコロン記号は切断と連結の部位を表す）内に現
れ、3'スプライス部位が共通配列（U/C）nNCAG:G内に現
れる。酵母のmRNAでは、5'スプライス部位が共通配列:G
UAUGUによって限定されており、3'スプライス部位が共
通配列（C/U）AG:によって限定されている。オーシマお
よびゴトー,J.Mol.Biol.195:247（1987）；パジェット
ら,Ann.Rev.Biochem.55:1119（1986）；マウント,Nuc.A
cids Res.10:459（1982）。
様々な天然に存在する突然変異遺伝子および合成的に
構築した突然変異遺伝子の分析によって、5'および3'ス
プライス部位の共通配列内の多くの位置におけるヌクレ
オチド変化が、成熟したmRNAの合成を減少または停止さ
せるという効果を持っていることが示されている。シャ
ープ,Science 235:766（1987）；パジェットら,Ann.Re
v.Biochem.55:1119（1986）；グリーン,Ann.Rev.Genet.
20:671（1986）。スプライス部位を含むRNAの二次構造
がスプライシングの効率に影響を与え得ることも突然変
異の研究によって明らかにされている。ゾルニック,Cel
l 43:667（1985）；コナルスカら,Cell:165（1985）。
構築した突然変異遺伝子の分析によって、5'および3'ス
プライス部位の共通配列内の多くの位置におけるヌクレ
オチド変化が、成熟したmRNAの合成を減少または停止さ
せるという効果を持っていることが示されている。シャ
ープ,Science 235:766（1987）；パジェットら,Ann.Re
v.Biochem.55:1119（1986）；グリーン,Ann.Rev.Genet.
20:671（1986）。スプライス部位を含むRNAの二次構造
がスプライシングの効率に影響を与え得ることも突然変
異の研究によって明らかにされている。ゾルニック,Cel
l 43:667（1985）；コナルスカら,Cell:165（1985）。
イントロンの長さもスプライシングの効率に影響を与
え得る。ウサギベータ−グロビン遺伝子の大きなイント
ロン内で異なるサイズの欠失突然変異を作成することに
よって、ウィーリンガらは正しいスプライシングに必要
な最小のイントロンの長さが約69ヌクレオチド（nts）
であることを決定した。Cell 37:915（1984）。アデノ
ウイルスE1A領域のイントロンに関する同様の研究は、
約78ntsのイントロン長が正しいスプライシングの発生
を可能にするが、その効率が減少することを明らかにし
ている。イントロンの長さを91ntsまで増大させると正
常なスプライシング効率が回復したが、イントロンを63
ntsまで欠失させると正しいスプラインシングが停止し
た。ウルフェンダールら,Nuc.Acids Res.13:6299（198
5）。
え得る。ウサギベータ−グロビン遺伝子の大きなイント
ロン内で異なるサイズの欠失突然変異を作成することに
よって、ウィーリンガらは正しいスプライシングに必要
な最小のイントロンの長さが約69ヌクレオチド（nts）
であることを決定した。Cell 37:915（1984）。アデノ
ウイルスE1A領域のイントロンに関する同様の研究は、
約78ntsのイントロン長が正しいスプライシングの発生
を可能にするが、その効率が減少することを明らかにし
ている。イントロンの長さを91ntsまで増大させると正
常なスプライシング効率が回復したが、イントロンを63
ntsまで欠失させると正しいスプラインシングが停止し
た。ウルフェンダールら,Nuc.Acids Res.13:6299（198
5）。
本発明はその態様の１つとして、高レベルの所望のタ
ンパク質を発現させる組換え宿主細胞を同定もしくは単
離する方法であって、次の工程（または段階）からなる
方法を提供する： （１）真核宿主細胞を、 （ａ）天然に存在する選択可能遺伝子中には存在しな
いイントロンを含有するように修飾された選択可能遺伝
子であって、該イントロンが該宿主細胞によってスプラ
イシングされて選択可能タンパク質をコード化するメッ
センジャーRNAを与えることができ、該選択可能遺伝子
中の該イントロンの存在が宿主細胞において該選択可能
遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを減
少させる、選択可能遺伝子、および、 （ｂ）所望のタンパク質をコード化する遺伝子、 で同時トランスフェクションし、 （２）得られたトランスフェクタントを、該選択可能遺
伝子に適した選択剤を含有する培地中で培養する。
ンパク質を発現させる組換え宿主細胞を同定もしくは単
離する方法であって、次の工程（または段階）からなる
方法を提供する： （１）真核宿主細胞を、 （ａ）天然に存在する選択可能遺伝子中には存在しな
いイントロンを含有するように修飾された選択可能遺伝
子であって、該イントロンが該宿主細胞によってスプラ
イシングされて選択可能タンパク質をコード化するメッ
センジャーRNAを与えることができ、該選択可能遺伝子
中の該イントロンの存在が宿主細胞において該選択可能
遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを減
少させる、選択可能遺伝子、および、 （ｂ）所望のタンパク質をコード化する遺伝子、 で同時トランスフェクションし、 （２）得られたトランスフェクタントを、該選択可能遺
伝子に適した選択剤を含有する培地中で培養する。
本発明はもう１つの態様として、高レベルの所望のタ
ンパク質を発現させる組換え宿主細胞を同定もしくは単
離する方法であって、次の段階からなる方法を提供す
る： （１）真核宿主細胞を、 （ａ）第１の選択可能遺伝子、 （ｂ）第２の選択可能遺伝子であって、天然に存在す
る選択可能遺伝子中には存在しないイントロンを含有す
るように修飾されており、そのイントロンは該宿主細胞
中でスプライシングされて選択可能タンパク質をコード
化するメッセンジャーRNAを与える能力を有し、該選択
可能遺伝子中の該イントロンの存在がその宿主細胞にお
いて該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク
質のレベルを減少させる、選択可能遺伝子、および、 （ｃ）所望のタンパク質をコード化する遺伝子、 で同時トランスフェクションし、 （２）得られたトランスフェクタントを、第１の選択可
能遺伝子に適した選択剤を含有する培地中で培養し、 （３）工程（２）の選択を生き残ったトランスフェクタ
ントを、第２の選択可能遺伝子に適した選択剤を含有す
る培地中で培養する。
ンパク質を発現させる組換え宿主細胞を同定もしくは単
離する方法であって、次の段階からなる方法を提供す
る： （１）真核宿主細胞を、 （ａ）第１の選択可能遺伝子、 （ｂ）第２の選択可能遺伝子であって、天然に存在す
る選択可能遺伝子中には存在しないイントロンを含有す
るように修飾されており、そのイントロンは該宿主細胞
中でスプライシングされて選択可能タンパク質をコード
化するメッセンジャーRNAを与える能力を有し、該選択
可能遺伝子中の該イントロンの存在がその宿主細胞にお
いて該選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク
質のレベルを減少させる、選択可能遺伝子、および、 （ｃ）所望のタンパク質をコード化する遺伝子、 で同時トランスフェクションし、 （２）得られたトランスフェクタントを、第１の選択可
能遺伝子に適した選択剤を含有する培地中で培養し、 （３）工程（２）の選択を生き残ったトランスフェクタ
ントを、第２の選択可能遺伝子に適した選択剤を含有す
る培地中で培養する。
本明細書で用いる用語「選択可能遺伝子」とは、選択
した特定の細胞培養条件下における宿主細胞の成長また
は生存にとって必要なタンパク質をコード化するDNAを
意味する。したがって選択可能遺伝子で形質転換された
宿主細胞はある種の細胞培養条件下で成長または生存す
ることができ、一方、トランスフェクションされなかっ
た宿主細胞は成長または生存することができない。典型
的な場合、選択可能遺伝子は薬物に対する耐性を付与す
るか、もしくは宿主細胞における代謝的または異化的欠
損を補償するであろう。例えば一般に使用される選択遺
伝子には、アミノグリコシド・ホスホトランスフェラー
ゼ（APHまたはneo）、ハイグロマイシン・ホスホトラン
スフェラーゼ（hyg）、ジヒドロフォレート・レダクタ
ーゼ（DHFR）およびチミジン・キナーゼ（tk）の遺伝子
が含まれる。
した特定の細胞培養条件下における宿主細胞の成長また
は生存にとって必要なタンパク質をコード化するDNAを
意味する。したがって選択可能遺伝子で形質転換された
宿主細胞はある種の細胞培養条件下で成長または生存す
ることができ、一方、トランスフェクションされなかっ
た宿主細胞は成長または生存することができない。典型
的な場合、選択可能遺伝子は薬物に対する耐性を付与す
るか、もしくは宿主細胞における代謝的または異化的欠
損を補償するであろう。例えば一般に使用される選択遺
伝子には、アミノグリコシド・ホスホトランスフェラー
ゼ（APHまたはneo）、ハイグロマイシン・ホスホトラン
スフェラーゼ（hyg）、ジヒドロフォレート・レダクタ
ーゼ（DHFR）およびチミジン・キナーゼ（tk）の遺伝子
が含まれる。
本明細書で使用する用語「選択可能タンパク質」と
は、選択可能遺伝子によってコード化されているタンパ
ク質を意味する。用語「選択可能な表現型」とは、選択
可能遺伝子または選択可能タンパク質によって宿主細胞
に付与される表現型を意味する。用語「選択剤」とは、
特定の選択可能標識が欠損している宿主細胞の成長また
は生存を妨害する物質を意味する。例えば選択可能遺伝
子がアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼをコ
ード化している場合、好適な選択剤にはネオマイシンお
よびG418が含まれる。選択可能遺伝子がハイグロマイシ
ン・ホスホトランスフェラーゼをコード化している場
合、好適な選択剤はハイグロマイシンである。
は、選択可能遺伝子によってコード化されているタンパ
ク質を意味する。用語「選択可能な表現型」とは、選択
可能遺伝子または選択可能タンパク質によって宿主細胞
に付与される表現型を意味する。用語「選択剤」とは、
特定の選択可能標識が欠損している宿主細胞の成長また
は生存を妨害する物質を意味する。例えば選択可能遺伝
子がアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼをコ
ード化している場合、好適な選択剤にはネオマイシンお
よびG418が含まれる。選択可能遺伝子がハイグロマイシ
ン・ホスホトランスフェラーゼをコード化している場
合、好適な選択剤はハイグロマイシンである。
本明細書で使用する用語「生成物遺伝子」とは、所望
のタンパク質生成物をコード化するDNAを意味する。本
発明の方法は選択可能遺伝子ではない生成物遺伝子の高
レベルな発現を得るのに得に適しているのであるが、宿
主細胞中で発現することができる生成物遺伝子であれば
いずれも使用することができる。したがって生成物遺伝
子によってコード化されるタンパク質は典型的には、選
択した特定の細胞培養条件下における宿主細胞の成長ま
たは生存に必要ではないタンパク質であろう。例えば生
成物遺伝子は、抗体、ウイルス抗原、インターフェロン
あるいは成長ホルモンをコード化してもよい。
のタンパク質生成物をコード化するDNAを意味する。本
発明の方法は選択可能遺伝子ではない生成物遺伝子の高
レベルな発現を得るのに得に適しているのであるが、宿
主細胞中で発現することができる生成物遺伝子であれば
いずれも使用することができる。したがって生成物遺伝
子によってコード化されるタンパク質は典型的には、選
択した特定の細胞培養条件下における宿主細胞の成長ま
たは生存に必要ではないタンパク質であろう。例えば生
成物遺伝子は、抗体、ウイルス抗原、インターフェロン
あるいは成長ホルモンをコード化してもよい。
選択可能遺伝子と生成物遺伝子はゲノムDNAや、細胞R
NAから転写されたcDNAから得ることができ、またインビ
トロ合成によって得ることもできる。例えばゲノムDNA
またはcDNAライブラリーからのそのような遺伝子の単離
は、検出可能な部分（放射性同位体など）で標識された
DNAハイブリッド形成プローブであって、相補的な塩基
対形成によって所望の選択遺伝子または生成物遺伝子に
優先的にハイブリッド形成することができるDNAハイブ
リッド形成プローブを使用することによって都合よく達
成される。ケラーおよびマナク，「DNA Probe」の149〜
213頁（1989）。別法として、ポリメラーゼ連鎖反応（P
CR）法を用いて適当なウイルス供給源、細胞供給源また
は組織供給源の核酸内に存在するそのような遺伝子を増
幅することによって、所望の選択可能遺伝子または生成
物遺伝子を得ることもできる。同時トランスフェクショ
ンの際にイントロンで修飾された選択可能遺伝子に対し
て大モル過剰の生成物遺伝子を使用することができるよ
うに、本発明の方法で使用する生成物遺伝子と、イント
ロンで修飾された選択可能遺伝子は、別個のDNA分子で
あることが好ましい。
NAから転写されたcDNAから得ることができ、またインビ
トロ合成によって得ることもできる。例えばゲノムDNA
またはcDNAライブラリーからのそのような遺伝子の単離
は、検出可能な部分（放射性同位体など）で標識された
DNAハイブリッド形成プローブであって、相補的な塩基
対形成によって所望の選択遺伝子または生成物遺伝子に
優先的にハイブリッド形成することができるDNAハイブ
リッド形成プローブを使用することによって都合よく達
成される。ケラーおよびマナク，「DNA Probe」の149〜
213頁（1989）。別法として、ポリメラーゼ連鎖反応（P
CR）法を用いて適当なウイルス供給源、細胞供給源また
は組織供給源の核酸内に存在するそのような遺伝子を増
幅することによって、所望の選択可能遺伝子または生成
物遺伝子を得ることもできる。同時トランスフェクショ
ンの際にイントロンで修飾された選択可能遺伝子に対し
て大モル過剰の生成物遺伝子を使用することができるよ
うに、本発明の方法で使用する生成物遺伝子と、イント
ロンで修飾された選択可能遺伝子は、別個のDNA分子で
あることが好ましい。
本明細書で使用する用語「イントロン」とは、ある遺
伝子の転写される領域内もしくはメッセンジャーRNA前
駆体内に存在する核酸配列であって、翻訳に先立って宿
主細胞によってそのメッセンジャーRNA前駆体から摘出
または「スプライシング」され得るヌクレオチド配列を
いう。本発明での使用に適したイントロンは、天然に存
在する核酸からの精製や新規（デノボ）合成などの当該
技術分野でよく知られている数種類の方法のいずれかに
よって調製することができる。天然に存在する数多くの
真核遺伝子中に存在するイントロンが同定され、特徴づ
けられている。マウント,Nuc.Acids Res.10:459（198
2）。機能的なスプライス部位を含む人工的なイントロ
ンも記述されている。ウィニーら,Mol.Cell.Biol.9:329
（1989）；ガターマンら,Mol.Cell.Bio.9:1526（198
9）。例えば適当な制限エンドヌクレアーゼによる天然
に存在する核酸の消化や、イントロンの5'末端および3'
末端にある配列に相補的なプライマーを用いるPCRクロ
ーニングによって、天然に存在する核酸からイントロン
を得ることができる。別法として、限定された配列と長
さのイントロンを有機化学の様々な方法を用いて合成的
に調製することもできる。ナラングら,Meth.Enzymol.6
8:90（1979）；カルサースら,Meth.Enzymol.154:（198
5）；フレーラーら,Nuc.Acids Res.14:5399（1986）。
伝子の転写される領域内もしくはメッセンジャーRNA前
駆体内に存在する核酸配列であって、翻訳に先立って宿
主細胞によってそのメッセンジャーRNA前駆体から摘出
または「スプライシング」され得るヌクレオチド配列を
いう。本発明での使用に適したイントロンは、天然に存
在する核酸からの精製や新規（デノボ）合成などの当該
技術分野でよく知られている数種類の方法のいずれかに
よって調製することができる。天然に存在する数多くの
真核遺伝子中に存在するイントロンが同定され、特徴づ
けられている。マウント,Nuc.Acids Res.10:459（198
2）。機能的なスプライス部位を含む人工的なイントロ
ンも記述されている。ウィニーら,Mol.Cell.Biol.9:329
（1989）；ガターマンら,Mol.Cell.Bio.9:1526（198
9）。例えば適当な制限エンドヌクレアーゼによる天然
に存在する核酸の消化や、イントロンの5'末端および3'
末端にある配列に相補的なプライマーを用いるPCRクロ
ーニングによって、天然に存在する核酸からイントロン
を得ることができる。別法として、限定された配列と長
さのイントロンを有機化学の様々な方法を用いて合成的
に調製することもできる。ナラングら,Meth.Enzymol.6
8:90（1979）；カルサースら,Meth.Enzymol.154:（198
5）；フレーラーら,Nuc.Acids Res.14:5399（1986）。
本明細書で使用する用語「PCR」および「ポリメラー
ゼ連鎖反応」とは、米国特許第4683195号（1987年７月2
8日発効）に記述されているインビトロ増幅法を意味す
る。一般的にPCR法には、増幅すべき核酸配列を含む鋳
型核酸に優先的にハイブリッド形成することができる２
つのDNAプライマーを用いるプライマー伸長合成のサイ
クルの繰り返しが含まれる。全ゲノムDNA、細胞RNAから
転写されたcDNA、ウイルスまたはプラスミドDNAから特
定のDNA配列をクローン化するためにPCR法を使用するこ
とができる。ワングおよびマーク，「PCR Protocols」
の70〜75頁（アカデミック・プレス,1990）；シャル
フ，「PCR Protocols」の84〜98頁；カワサキおよびワ
ング，「PCR Technology」の89〜97頁（ストックトン・
プレス,1989）。
ゼ連鎖反応」とは、米国特許第4683195号（1987年７月2
8日発効）に記述されているインビトロ増幅法を意味す
る。一般的にPCR法には、増幅すべき核酸配列を含む鋳
型核酸に優先的にハイブリッド形成することができる２
つのDNAプライマーを用いるプライマー伸長合成のサイ
クルの繰り返しが含まれる。全ゲノムDNA、細胞RNAから
転写されたcDNA、ウイルスまたはプラスミドDNAから特
定のDNA配列をクローン化するためにPCR法を使用するこ
とができる。ワングおよびマーク，「PCR Protocols」
の70〜75頁（アカデミック・プレス,1990）；シャル
フ，「PCR Protocols」の84〜98頁；カワサキおよびワ
ング，「PCR Technology」の89〜97頁（ストックトン・
プレス,1989）。
核酸をインビトロで修飾するための様々な既知の方法
のいずれかを用いて、正常時にはその選択可能遺伝子内
に存在しないイントロンを含有するように選択可能遺伝
子を修飾することができる。典型的な場合、まず正常時
にRNAに転写される選択可能遺伝子の領域内で、制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて選択可能遺伝子を切断し、次
いで得られた制限断片を、例えばDNAリガーゼ酵素を用
いる連結（ライゲーション）によって、宿主細胞発現に
とって正しい向きでイントロンに共有結合させる。
のいずれかを用いて、正常時にはその選択可能遺伝子内
に存在しないイントロンを含有するように選択可能遺伝
子を修飾することができる。典型的な場合、まず正常時
にRNAに転写される選択可能遺伝子の領域内で、制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて選択可能遺伝子を切断し、次
いで得られた制限断片を、例えばDNAリガーゼ酵素を用
いる連結（ライゲーション）によって、宿主細胞発現に
とって正しい向きでイントロンに共有結合させる。
本発明において有用であるためには、選択可能遺伝子
中に導入されるイントロンが、イントロンで修飾された
選択可能遺伝子の宿主細胞内における発現レベルを、修
飾されていない選択可能遺伝子と比較してかなり減少さ
せるような長さでなければならない。好ましくは、イン
トロンが、そのイントロンのスプライシングを停止させ
ることなく、選択可能タンパク質をコード化する成熟し
たmRNAの合成が可能であるような最小限の長さを有する
であろう。多少の増減は考え得るものの、典型的な場合
には、選択可能遺伝子中に導入されるイントロンは50、
55または65ヌクレオチド以上であって、85、80または75
ヌクレオチド以下の長さを有するであろう。
中に導入されるイントロンが、イントロンで修飾された
選択可能遺伝子の宿主細胞内における発現レベルを、修
飾されていない選択可能遺伝子と比較してかなり減少さ
せるような長さでなければならない。好ましくは、イン
トロンが、そのイントロンのスプライシングを停止させ
ることなく、選択可能タンパク質をコード化する成熟し
たmRNAの合成が可能であるような最小限の長さを有する
であろう。多少の増減は考え得るものの、典型的な場合
には、選択可能遺伝子中に導入されるイントロンは50、
55または65ヌクレオチド以上であって、85、80または75
ヌクレオチド以下の長さを有するであろう。
生成物遺伝子の高レベルな発現を得るために、特定の
宿主細胞中の特定の選択可能遺伝子内でどの大きさのイ
ントロンが最適であるかを予め正確に予測することは困
難であるので、異なる大きさのイントロンの何らかのス
クリーニングが必要になることは理解されるであろう。
しかし一旦適切な大きさのイントロンを決定すれば、本
発明の方法でそれを通例の如く使用することにより、い
かなる所望のタンパク質の高レベル発現をも得ることが
できる。イントロンの長さは、そのイントロンの長さを
１または数（好ましくは10未満）ヌクレオチド長だけ増
大させた時に得られる一次トランスフェクタントの数と
比較して、そのイントロンで修飾された選択可能遺伝子
によってコード化される選択可能タンパク質の選択可能
な表現型特性を示す一次トランスフェクタントが相対的
に少ない数で得られるような長さであるべきである。
宿主細胞中の特定の選択可能遺伝子内でどの大きさのイ
ントロンが最適であるかを予め正確に予測することは困
難であるので、異なる大きさのイントロンの何らかのス
クリーニングが必要になることは理解されるであろう。
しかし一旦適切な大きさのイントロンを決定すれば、本
発明の方法でそれを通例の如く使用することにより、い
かなる所望のタンパク質の高レベル発現をも得ることが
できる。イントロンの長さは、そのイントロンの長さを
１または数（好ましくは10未満）ヌクレオチド長だけ増
大させた時に得られる一次トランスフェクタントの数と
比較して、そのイントロンで修飾された選択可能遺伝子
によってコード化される選択可能タンパク質の選択可能
な表現型特性を示す一次トランスフェクタントが相対的
に少ない数で得られるような長さであるべきである。
異なる長さのイントロンを調製することは簡単な問題
であり、それらには新規（デノボ）合成や現存のイント
ロンのインビトロ欠失突然変異導入などの当該技術分野
でよく知られている方法が含まれる。同様に、異なる長
さのイントロンによって修飾された選択可能遺伝子を含
有する様々な宿主細胞における生成物遺伝子の発現レベ
ルを決定することも簡単な問題であり、それらには分析
的ゲル電気泳動、ELISA検定法または放射線免疫検定法
などの当該技術分野でよく知られている分析法が含まれ
る。
であり、それらには新規（デノボ）合成や現存のイント
ロンのインビトロ欠失突然変異導入などの当該技術分野
でよく知られている方法が含まれる。同様に、異なる長
さのイントロンによって修飾された選択可能遺伝子を含
有する様々な宿主細胞における生成物遺伝子の発現レベ
ルを決定することも簡単な問題であり、それらには分析
的ゲル電気泳動、ELISA検定法または放射線免疫検定法
などの当該技術分野でよく知られている分析法が含まれ
る。
本明細書で使用する用語「発現」とは、宿主細胞内で
起こる転写または翻訳を意味する。宿主細胞内での生成
物遺伝子の発現レベルは、その細胞内に存在する対応す
るmRNAの量か、もしくは生成物遺伝子によってコード化
され、その細胞によって生産されるタンパク質の量に基
づいて決定することができる。例えば生成物遺伝子から
転写されたmRNAをノーザンハイブリッド形成によって定
量することができる。サムブルックら，「Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual」,7.3〜7.57頁（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス,198
9）。生成物遺伝子によってコード化されるタンパク質
は、そのタンパク質の生物学的活性を検定するか、もし
くはそのような活性とは無関係な検定法（そのタンパク
質と反応することができる抗体を用いるウェスタンブロ
ッティングや放射線免疫検定法など）によって定量する
ことができる。サムブルックら，「Molecular Cloning:
A Laboratory Manual」,18.1〜18.88頁（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス,1989）。
起こる転写または翻訳を意味する。宿主細胞内での生成
物遺伝子の発現レベルは、その細胞内に存在する対応す
るmRNAの量か、もしくは生成物遺伝子によってコード化
され、その細胞によって生産されるタンパク質の量に基
づいて決定することができる。例えば生成物遺伝子から
転写されたmRNAをノーザンハイブリッド形成によって定
量することができる。サムブルックら，「Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual」,7.3〜7.57頁（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス,198
9）。生成物遺伝子によってコード化されるタンパク質
は、そのタンパク質の生物学的活性を検定するか、もし
くはそのような活性とは無関係な検定法（そのタンパク
質と反応することができる抗体を用いるウェスタンブロ
ッティングや放射線免疫検定法など）によって定量する
ことができる。サムブルックら，「Molecular Cloning:
A Laboratory Manual」,18.1〜18.88頁（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス,1989）。
遺伝子の転写には、それが選択可能遺伝子であるか、
イントロンで修飾された選択可能遺伝子であるか、ある
いは所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子であ
るかにかかわりなく、発現のために使用する特定の宿主
細胞中で機能的なプロモーターにその遺伝子が機能可能
に連結している必要がある。遺伝子は、それがあるプロ
モーターの制御下でRNAに転写され得る場合に、そのプ
ロモーターに機能可能に連結しているという。
イントロンで修飾された選択可能遺伝子であるか、ある
いは所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝子であ
るかにかかわりなく、発現のために使用する特定の宿主
細胞中で機能的なプロモーターにその遺伝子が機能可能
に連結している必要がある。遺伝子は、それがあるプロ
モーターの制御下でRNAに転写され得る場合に、そのプ
ロモーターに機能可能に連結しているという。
哺乳類宿主細胞中での使用に適したプロモーターには
SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモ
ーター、マウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーター、
ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、ヒトサイトメガ
ロウイルス主要即時初期プロモーター、マウス乳房腫瘍
ウイルスLTRプロモーターおよび単純疱疹ウイルス・チ
ミジンキナーゼプロモーターが含まれる。サムブルック
ら，「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」,16.5
〜16.26頁（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス,1989）；ベンディグ,Genetic Engineer
ing 7:91（アカデミック・プレス,1988）。植物宿主細
胞での使用に適したプロモーターには、オクトピン・シ
ンターゼ（ocs）およびノパリン・シンターゼ（nos）遺
伝子並びに35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモー
ターが含まれる。リヒテンシュタインおよびフラー,Gen
etic Engineering 6:104（アカデミック・プレス,198
7）。酵母宿主細胞での使用に適したプロモーターはホ
スホグリセレート・キナーゼ（pgk）、エノラーゼ（en
o）、アルコール・デヒドロゲナーゼ（adh）および他の
解糖系遺伝子のプロモーターが含まれる。キンスマンお
よびキングスマン,Genetic Engineering,76−83頁（ブ
ラックウェル・サイエンティフィク・パブリケーション
ズ,1988）。
SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモ
ーター、マウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーター、
ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、ヒトサイトメガ
ロウイルス主要即時初期プロモーター、マウス乳房腫瘍
ウイルスLTRプロモーターおよび単純疱疹ウイルス・チ
ミジンキナーゼプロモーターが含まれる。サムブルック
ら，「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」,16.5
〜16.26頁（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス,1989）；ベンディグ,Genetic Engineer
ing 7:91（アカデミック・プレス,1988）。植物宿主細
胞での使用に適したプロモーターには、オクトピン・シ
ンターゼ（ocs）およびノパリン・シンターゼ（nos）遺
伝子並びに35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモー
ターが含まれる。リヒテンシュタインおよびフラー,Gen
etic Engineering 6:104（アカデミック・プレス,198
7）。酵母宿主細胞での使用に適したプロモーターはホ
スホグリセレート・キナーゼ（pgk）、エノラーゼ（en
o）、アルコール・デヒドロゲナーゼ（adh）および他の
解糖系遺伝子のプロモーターが含まれる。キンスマンお
よびキングスマン,Genetic Engineering,76−83頁（ブ
ラックウェル・サイエンティフィク・パブリケーション
ズ,1988）。
本明細書で使用する用語「トランスフェクション」お
よび「同時トランスフェクション」とは、一般に核酸を
宿主細胞中に導入する過程をいう。真核宿主細胞中に遺
伝子を導入するために様々な方法が知られている。これ
らの方法のうちで最も一般的使用される方法には細胞中
へのDNAの直接的な移送が含まれる。例えばリン酸カル
シウム沈殿物またはDEAEデキストランの存在下で細胞を
DNAにさらすことによって哺乳類細胞中にDNAを導入する
ことができる。ケオウンら,Meth.Enzymol.185:527（199
0）。哺乳類細胞とは対照的に、酵母と植物細胞は激し
い化学的処理や物理的処理に対して比較的耐性な厚い壁
によって取り囲まれており、これが多くの小分子の取り
込みを阻害する。したがってそのような細胞中にDNAを
導入する方法は、典型的にはその第１段階として、その
細胞壁のいくらかを除去することによる、酵母または植
物細胞の、それぞれスフェロプラストまたはプロトプラ
ストへの変換を伴う。次に、そのスフェロプラストまた
はプロトプラストをポリエチレングリコール（PEG）の
存在下でDNAにさらすことによって、その細胞中にDNAを
導入する。ヒンネンら,Proc.Natl.Acad.Sci.75:1929（1
978）。ピールボルテら,Plant.Molec.Biol.5:235（198
4）；ポトリカスら,Mol.Gen.Genet.199:169（1985）。
別法として、酢酸リチウムで処理しておいた無傷の酵母
細胞中にDNAを導入することもできる。ステアルンスら,
Meth.Enzymol.185:280（1990）。
よび「同時トランスフェクション」とは、一般に核酸を
宿主細胞中に導入する過程をいう。真核宿主細胞中に遺
伝子を導入するために様々な方法が知られている。これ
らの方法のうちで最も一般的使用される方法には細胞中
へのDNAの直接的な移送が含まれる。例えばリン酸カル
シウム沈殿物またはDEAEデキストランの存在下で細胞を
DNAにさらすことによって哺乳類細胞中にDNAを導入する
ことができる。ケオウンら,Meth.Enzymol.185:527（199
0）。哺乳類細胞とは対照的に、酵母と植物細胞は激し
い化学的処理や物理的処理に対して比較的耐性な厚い壁
によって取り囲まれており、これが多くの小分子の取り
込みを阻害する。したがってそのような細胞中にDNAを
導入する方法は、典型的にはその第１段階として、その
細胞壁のいくらかを除去することによる、酵母または植
物細胞の、それぞれスフェロプラストまたはプロトプラ
ストへの変換を伴う。次に、そのスフェロプラストまた
はプロトプラストをポリエチレングリコール（PEG）の
存在下でDNAにさらすことによって、その細胞中にDNAを
導入する。ヒンネンら,Proc.Natl.Acad.Sci.75:1929（1
978）。ピールボルテら,Plant.Molec.Biol.5:235（198
4）；ポトリカスら,Mol.Gen.Genet.199:169（1985）。
別法として、酢酸リチウムで処理しておいた無傷の酵母
細胞中にDNAを導入することもできる。ステアルンスら,
Meth.Enzymol.185:280（1990）。
真核細胞中に遺伝子を導入する他の方法は、エレクト
ロポレーション、マイクロインジェクション、または組
換えウイルスによる感染を伴う方法など、当該技術分野
でよく知られている。カウフマン,Meth.Enzymol.185:48
7（1990）；ケオウンら,Meth.Enzymol.185:527（199
0）；リヒテンシュタインら,Genetic Engineering 6:10
4（アカデミック・プレス,1987）。
ロポレーション、マイクロインジェクション、または組
換えウイルスによる感染を伴う方法など、当該技術分野
でよく知られている。カウフマン,Meth.Enzymol.185:48
7（1990）；ケオウンら,Meth.Enzymol.185:527（199
0）；リヒテンシュタインら,Genetic Engineering 6:10
4（アカデミック・プレス,1987）。
上述の如くイントロンを含有するように修飾された選
択可能遺伝子と所望のタンパク質をコード化する生成物
遺伝子による同時トランスフェクションの後、特定の選
択可能遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で宿
主細胞を培養する。好適な栄養培地と細胞培養法は当該
技術分野でよく知られている。シェルマン,Meth.Enzymo
l.194:3（1991）；マザー,Meth.Enzymol.185:567（199
0）；ベルリンおよびボーデ，「Basic Biotechnology」
中の133〜177頁（VCHパブリッシャーズ,1987）。イント
ロンの大きさが適切に選択されたとすれば、そのような
一段階選択の結果として数個の一次トランスフェクタン
トが得られ、それらの一次トランスフェクタントは生成
物遺伝子の高レベル発現に関して都合よく検定される。
択可能遺伝子と所望のタンパク質をコード化する生成物
遺伝子による同時トランスフェクションの後、特定の選
択可能遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で宿
主細胞を培養する。好適な栄養培地と細胞培養法は当該
技術分野でよく知られている。シェルマン,Meth.Enzymo
l.194:3（1991）；マザー,Meth.Enzymol.185:567（199
0）；ベルリンおよびボーデ，「Basic Biotechnology」
中の133〜177頁（VCHパブリッシャーズ,1987）。イント
ロンの大きさが適切に選択されたとすれば、そのような
一段階選択の結果として数個の一次トランスフェクタン
トが得られ、それらの一次トランスフェクタントは生成
物遺伝子の高レベル発現に関して都合よく検定される。
別法として、異なる選択可能遺伝子をコード化する２
つの選択遺伝子と所望のタンパク質をコード化する生成
物遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションするこ
とができる。トランスフェクション後、第１の選択可能
遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で細胞を培
養し、個々の一次トランスフェクタントを選択する。次
いで、これらの一次トランスフェクタントを第２の選択
可能遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で培養
する。ここに第２の選択可能遺伝子は上述のごとくイン
トロンによって修飾されている。図２に示すように、こ
の二段階選択法によれば、上述の一段階選択法の場合に
可能であったレベルよりかなり高い生成物遺伝子の発現
レベルを得ることが可能であり得る。
つの選択遺伝子と所望のタンパク質をコード化する生成
物遺伝子で宿主細胞を同時トランスフェクションするこ
とができる。トランスフェクション後、第１の選択可能
遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で細胞を培
養し、個々の一次トランスフェクタントを選択する。次
いで、これらの一次トランスフェクタントを第２の選択
可能遺伝子に適した選択剤を含有する栄養培地中で培養
する。ここに第２の選択可能遺伝子は上述のごとくイン
トロンによって修飾されている。図２に示すように、こ
の二段階選択法によれば、上述の一段階選択法の場合に
可能であったレベルよりかなり高い生成物遺伝子の発現
レベルを得ることが可能であり得る。
したがって本発明の教示によれば、１）宿主細胞中で
その選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質
の量を減少させるイントロンによって修飾された選択可
能遺伝子で同時トランスフェクションされた宿主細胞で
あって、２）その後に選択可能遺伝子を欠く宿主細胞の
成長または生存を許さない選択条件下で成長または生存
することができる宿主細胞、を発現のために使用するこ
とにより、所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝
子の高レベルな発現が得られる。
その選択可能遺伝子から生産される選択可能タンパク質
の量を減少させるイントロンによって修飾された選択可
能遺伝子で同時トランスフェクションされた宿主細胞で
あって、２）その後に選択可能遺伝子を欠く宿主細胞の
成長または生存を許さない選択条件下で成長または生存
することができる宿主細胞、を発現のために使用するこ
とにより、所望のタンパク質をコード化する生成物遺伝
子の高レベルな発現が得られる。
したがって本発明の方法は、工業、農業および医薬分
野における多くの異なるタンパク質の生産に有用であ
り、天然の供給源からは制限された量しか入手すること
ができないタンパク質（例えば成長ホルモン、インター
フェロン、神経栄養性因子、DNase、エリスロポエチ
ン、インヒビン、インスリン、リラクシンおよび組織プ
ラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質を含む）の
生産にとりわけ有用である。本発明の組換え宿主細胞中
で生産される所望のタンパク質は宿主細胞溶解液から回
収することもできるが、好ましくは分泌されたタンパク
質として細胞培養培地から回収されるであろう。いずれ
の場合にも、当該技術分野でよく知られている方法によ
って所望のタンパク質を他の宿主細胞タンパク質から精
製して、実質上均一な所望のタンパク質の調製物を得る
ことができる。
野における多くの異なるタンパク質の生産に有用であ
り、天然の供給源からは制限された量しか入手すること
ができないタンパク質（例えば成長ホルモン、インター
フェロン、神経栄養性因子、DNase、エリスロポエチ
ン、インヒビン、インスリン、リラクシンおよび組織プ
ラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質を含む）の
生産にとりわけ有用である。本発明の組換え宿主細胞中
で生産される所望のタンパク質は宿主細胞溶解液から回
収することもできるが、好ましくは分泌されたタンパク
質として細胞培養培地から回収されるであろう。いずれ
の場合にも、当該技術分野でよく知られている方法によ
って所望のタンパク質を他の宿主細胞タンパク質から精
製して、実質上均一な所望のタンパク質の調製物を得る
ことができる。
以下の実施例は単に例示を目的とするものであって、
本発明の限定を意図するものではない。
本発明の限定を意図するものではない。
実施例１
トランスフェクション用のベクターの構築
1.pSVE.hygB
元々はプラスミドpLG90（グリッツおよびデイビース,
Gene 25:179（1983））中に得られた遺伝子であって、
クレンら,Gene 57:21（1987）が記述しているように開
始コドンの直前の配列に関して修飾が加えられている細
菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝
子（「hygB」）を、２つの制限エンドヌクレアーゼ断片
として単離した：該遺伝子の5'部分を含有するCla I−P
st I断片および3'部分を含有するPst I−BamH I断片。
これらの断片を、プラスミドpML−１（ラスキーおよび
ボッチャン,Nature 283:79（1981））中のSV40初期エン
ハンサー／プロモーターおよびヒトＢ型肝炎ウイルス
（HBV）ポリアデニル化（ポリ（Ａ））領域を含有する
大きいCla I−BamH I断片に同時に連結した。得られた
ベクターは、先行するSV40初期エンハンサー／プロモー
ターと後続のHBV−ポリ（Ａ）領域を伴うhygB遺伝子を
含有している。
Gene 25:179（1983））中に得られた遺伝子であって、
クレンら,Gene 57:21（1987）が記述しているように開
始コドンの直前の配列に関して修飾が加えられている細
菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝
子（「hygB」）を、２つの制限エンドヌクレアーゼ断片
として単離した：該遺伝子の5'部分を含有するCla I−P
st I断片および3'部分を含有するPst I−BamH I断片。
これらの断片を、プラスミドpML−１（ラスキーおよび
ボッチャン,Nature 283:79（1981））中のSV40初期エン
ハンサー／プロモーターおよびヒトＢ型肝炎ウイルス
（HBV）ポリアデニル化（ポリ（Ａ））領域を含有する
大きいCla I−BamH I断片に同時に連結した。得られた
ベクターは、先行するSV40初期エンハンサー／プロモー
ターと後続のHBV−ポリ（Ａ）領域を伴うhygB遺伝子を
含有している。
2.pRK.hyg
hygBコード配列を含有すpSVE.hygBのHind III−BamH
I断片に対して、ベクターpRK7（PCT公開番号WO90/02798
（1990年３月22日公開））の大きいHind III−BamH I断
片を連結することによってベクターpRK.hygを構築し
た。したがってpRK.hyg中のhygB遺伝子の前方にはpRK7
のエンハンサー／プロモーターおよびイントロン領域が
存在し、hygB遺伝子の後方にはpRK7のSV40後期ポリ
（Ａ）領域が存在する。
I断片に対して、ベクターpRK7（PCT公開番号WO90/02798
（1990年３月22日公開））の大きいHind III−BamH I断
片を連結することによってベクターpRK.hygを構築し
た。したがってpRK.hyg中のhygB遺伝子の前方にはpRK7
のエンハンサー／プロモーターおよびイントロン領域が
存在し、hygB遺伝子の後方にはpRK7のSV40後期ポリ
（Ａ）領域が存在する。
3.pRSV−hGH
このベクターはラウス肉腫ウイルスの長末端反復（LT
R）に由来する転写調節配列の制御下にあるヒト成長ホ
ルモン（hGH）の完全なコード配列を含有する。rasP.hG
H（コーエンおよびレビンソン,Nature 334:119（198
8））のrasプロモーターをRSVプロモーターで置換する
ことによって、これを構築した。
R）に由来する転写調節配列の制御下にあるヒト成長ホ
ルモン（hGH）の完全なコード配列を含有する。rasP.hG
H（コーエンおよびレビンソン,Nature 334:119（198
8））のrasプロモーターをRSVプロモーターで置換する
ことによって、これを構築した。
4.pML−UM20
プラスミドpML−UM20はプラスミドpML−１のEcoR I部
位とHind III部位の間にポリリンカー領域を含有する。
プラスミドpUC18（ノランダーら,Gene 26:101（198
3））のポリリンカー領域を含有する中間体プラスミドp
UM20の小さいEcoR I−Hind III断片にpML−１の大きいE
coR I−Hind III断片を連結することによって、これを
構築した。pML−UM20中のポリリンカー領域の配列はそ
のEcoR I部位およびHind III部位を含めて下記の通りで
ある： 5'−GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGG
GGCCCTCGAGACGCGTGGCATGCAAGCTT−3'［配列番号１］ この配列は制限エンドヌクレアーゼSma I（CCC/GG
G）、BamH I（G/GATCC）、Sal I（G/TCGAC）およびXho
I（C/TCGAG）にとっての認識部位を含有しており、これ
らを下記の構築で使用する（切断部位を［／」で示
す）。
位とHind III部位の間にポリリンカー領域を含有する。
プラスミドpUC18（ノランダーら,Gene 26:101（198
3））のポリリンカー領域を含有する中間体プラスミドp
UM20の小さいEcoR I−Hind III断片にpML−１の大きいE
coR I−Hind III断片を連結することによって、これを
構築した。pML−UM20中のポリリンカー領域の配列はそ
のEcoR I部位およびHind III部位を含めて下記の通りで
ある： 5'−GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGG
GGCCCTCGAGACGCGTGGCATGCAAGCTT−3'［配列番号１］ この配列は制限エンドヌクレアーゼSma I（CCC/GG
G）、BamH I（G/GATCC）、Sal I（G/TCGAC）およびXho
I（C/TCGAG）にとっての認識部位を含有しており、これ
らを下記の構築で使用する（切断部位を［／」で示
す）。
5.pSV16B.neo
このベクターは、先行するベクターpSV16B5（1991年
６月13日に公開されたPCT公開WO91/08291）のエンハン
サー／プロモーターおよびイントロン領域と、後続する
HBVポリ（Ａ）シグナルを伴う、修飾された細菌性ネオ
マイシン・ホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子を
含有する。これを下記の数段階で構築した。
６月13日に公開されたPCT公開WO91/08291）のエンハン
サー／プロモーターおよびイントロン領域と、後続する
HBVポリ（Ａ）シグナルを伴う、修飾された細菌性ネオ
マイシン・ホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子を
含有する。これを下記の数段階で構築した。
a. 中間体プラスミドpUC.neo3'の構築
Sph IおよびPst I制限エンドヌクレアーゼでの消化に
よってプラスミドpUC119を直線化した後、これを、
（ｉ）neoコード領域の3'部分を含有するベクターpSVE.
NeoBal6（シーバーグら,Nature 312:71（1984））のPst
I−Sma I断片と、（ii）HBVポリ（Ａ）領域を含有する
ベクターp311E（リウら）のBamH I−Sph I断片に同時に
連結させた。連結に先立って、p311E由来の断片のBamH
I付着末端を大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片を
用いて４種類すべてのデオキシリボヌクレオチドの存在
下で補填することによって、pSVE.NeoBal6由来の断片の
Sma Iによって生成した平滑末端に結合できるようにし
た。したがって、得られたpUC.neo3'プラスミドは、PUC
119のポリリンカー内に挿入されたHBVポリ（Ａ）領域と
neo遺伝子の3'末端から構成される。
よってプラスミドpUC119を直線化した後、これを、
（ｉ）neoコード領域の3'部分を含有するベクターpSVE.
NeoBal6（シーバーグら,Nature 312:71（1984））のPst
I−Sma I断片と、（ii）HBVポリ（Ａ）領域を含有する
ベクターp311E（リウら）のBamH I−Sph I断片に同時に
連結させた。連結に先立って、p311E由来の断片のBamH
I付着末端を大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノー断片を
用いて４種類すべてのデオキシリボヌクレオチドの存在
下で補填することによって、pSVE.NeoBal6由来の断片の
Sma Iによって生成した平滑末端に結合できるようにし
た。したがって、得られたpUC.neo3'プラスミドは、PUC
119のポリリンカー内に挿入されたHBVポリ（Ａ）領域と
neo遺伝子の3'末端から構成される。
b. pSV16B.hygの構築
（ｉ）ベクターpSV16B.tPAのエンハンサー／プロモー
ターとイントロン領域を含有する該ベクターのSSt I−P
st I断片と（ii）hygBコード配列を含有するpSV16B.tPA
のHind III−Sal I断片を、（iii）Sst IとSal Iでの消
化によって直線化したpUC119に連結するという三部分連
結によってこのベクターを構築した。Pst I切断によっ
て生じたSV16B.tPA断片の3'突出末端をT4 DNAポリメラ
ーゼを用いて削除し、Hind III消化によって生じたSV16
B.tPAの5'突出末端を補填することにより、これら２つ
の末端の平滑末端連結ができるようにした。このベクタ
ーは、pUC119のポリリンカー領域内に挿入されたSV16B
エンハンサー／プロモーターおよびイントロン領域とそ
れに続くhygBコード配列およびそれに続くHBVポリ
（Ａ）領域を含有する。
ターとイントロン領域を含有する該ベクターのSSt I−P
st I断片と（ii）hygBコード配列を含有するpSV16B.tPA
のHind III−Sal I断片を、（iii）Sst IとSal Iでの消
化によって直線化したpUC119に連結するという三部分連
結によってこのベクターを構築した。Pst I切断によっ
て生じたSV16B.tPA断片の3'突出末端をT4 DNAポリメラ
ーゼを用いて削除し、Hind III消化によって生じたSV16
B.tPAの5'突出末端を補填することにより、これら２つ
の末端の平滑末端連結ができるようにした。このベクタ
ーは、pUC119のポリリンカー領域内に挿入されたSV16B
エンハンサー／プロモーターおよびイントロン領域とそ
れに続くhygBコード配列およびそれに続くHBVポリ
（Ａ）領域を含有する。
c. SV16B.neoの構築
（ｉ）pUC.neo3'の大きいSst I−Pst I断片、（ii）S
V16Bエンハンサー／プロモーターおよびイントロン領域
を含有するpSV16B.hygのSst I−Cla I断片、および（ii
i）neoコード配列の5'部分を含有するpSVE.NeoBal6のCl
a I−Pst I断片を連結することによって、このベクター
を構築した。
V16Bエンハンサー／プロモーターおよびイントロン領域
を含有するpSV16B.hygのSst I−Cla I断片、および（ii
i）neoコード配列の5'部分を含有するpSVE.NeoBal6のCl
a I−Pst I断片を連結することによって、このベクター
を構築した。
6.pNeol3G
ベクターpNeol3Gは、neoコード配列内にイントロンが
存在するという点でpSV16B.neoと異なる。neo遺伝子の
内部の短いBal I−Pst I断片を例外としてpSV16B.neoの
すべてを含有するpSV16B.neoの大きいBal I−Pst I断片
を、下記のPCR法によって作成したイントロン含有neo断
片に連結した。
存在するという点でpSV16B.neoと異なる。neo遺伝子の
内部の短いBal I−Pst I断片を例外としてpSV16B.neoの
すべてを含有するpSV16B.neoの大きいBal I−Pst I断片
を、下記のPCR法によって作成したイントロン含有neo断
片に連結した。
ａ）neoコード領域内の唯一のPst I部位を取り巻く配列
（転写されない鎖）と、ヒトＨ−ras遺伝子のT24/EJア
レル（コーエンおよびレビンソン,Nature 334:119（198
8））中に認められるように、択一的なＨ−rasエクソン
IDX（コーエンら,Cell 58:461（1989））に続くイント
ロンの5'末端配列からなる第１のプライマーneol3−529
Gを調製した。neol3−529Gプライマーの完全なヌクレオ
チド配列は、 5'−ATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTgtaggtctcccg−3'
［配列番号２］ である。neo配列を大文字で示し、Ｈ−ras配列を小文字
で示す。Pst I認識配列に下線を付す。neo配列の最後の
３ヌクレオチドが択一的なＨ−rasエクソンIDXの最後の
３ヌクレオチドに同一であることに注意すること。コー
エンら,Cell 58:461（1989）。
（転写されない鎖）と、ヒトＨ−ras遺伝子のT24/EJア
レル（コーエンおよびレビンソン,Nature 334:119（198
8））中に認められるように、択一的なＨ−rasエクソン
IDX（コーエンら,Cell 58:461（1989））に続くイント
ロンの5'末端配列からなる第１のプライマーneol3−529
Gを調製した。neol3−529Gプライマーの完全なヌクレオ
チド配列は、 5'−ATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTgtaggtctcccg−3'
［配列番号２］ である。neo配列を大文字で示し、Ｈ−ras配列を小文字
で示す。Pst I認識配列に下線を付す。neo配列の最後の
３ヌクレオチドが択一的なＨ−rasエクソンIDXの最後の
３ヌクレオチドに同一であることに注意すること。コー
エンら,Cell 58:461（1989）。
ｂ）Bal I切断部位とプライマーneol3−529G中のneo配
列の最後のヌクレオチドの間のneo遺伝子の転写される
鎖の配列と、それに続くＨ−rasイントロンＤの3'末端
の転写される鎖の配列からなる第２のプライマーneol3
−567を調製した。コーエンら,Cell.58:461（1989）。n
eol3−567プライマーの完全なヌクレオチド配列は、 5'−CCAGCCACGATctgggaaaggagggatgggatc−3'［配列番
号３」 である。neo配列を大文字で示し、Ｈ−ras配列を小文字
で示す。
列の最後のヌクレオチドの間のneo遺伝子の転写される
鎖の配列と、それに続くＨ−rasイントロンＤの3'末端
の転写される鎖の配列からなる第２のプライマーneol3
−567を調製した。コーエンら,Cell.58:461（1989）。n
eol3−567プライマーの完全なヌクレオチド配列は、 5'−CCAGCCACGATctgggaaaggagggatgggatc−3'［配列番
号３」 である。neo配列を大文字で示し、Ｈ−ras配列を小文字
で示す。
ｃ）プライマーneol3−529Gとneol3−567をPCR法で使用
することにより、プラスミドile12N（Ｇ）（コーエンお
よびレビンソン,Nature 334:119（1988））（コーエン
ら,Cell 58:461（1989）ではIIe12（Ｇ）とも呼ばれて
いる）のエクソン４（コーエンら,Cell 58:461（198
9））とIDXの間に位置するイントロンを増幅した。得ら
れた増幅産物をPst Iによる部分的消化に付し、neoコー
ド配列内のPst I認識部位での切断によって生成した断
片を電気泳動的な分画の後に、ポリアクリルアミドゲル
から単離した。したがって、単離されたこの断片は、ne
o遺伝子のPst I−Bal I断片内に挿入されたプラスミドi
le12N（Ｇ）のＨ−ras遺伝子中のIDXに続く全イントロ
ンＤ配列を含有する。
することにより、プラスミドile12N（Ｇ）（コーエンお
よびレビンソン,Nature 334:119（1988））（コーエン
ら,Cell 58:461（1989）ではIIe12（Ｇ）とも呼ばれて
いる）のエクソン４（コーエンら,Cell 58:461（198
9））とIDXの間に位置するイントロンを増幅した。得ら
れた増幅産物をPst Iによる部分的消化に付し、neoコー
ド配列内のPst I認識部位での切断によって生成した断
片を電気泳動的な分画の後に、ポリアクリルアミドゲル
から単離した。したがって、単離されたこの断片は、ne
o遺伝子のPst I−Bal I断片内に挿入されたプラスミドi
le12N（Ｇ）のＨ−ras遺伝子中のIDXに続く全イントロ
ンＤ配列を含有する。
7.pNeol3G△Ｓ
このベクターはpNeol3Gのイントロン内部のSma I断片
（約300nts）を欠く。pNeol3GをSma Iで消化した後、大
きい方のSma I断片を自己連結させることによって、こ
れを構築した。
（約300nts）を欠く。pNeol3GをSma Iで消化した後、大
きい方のSma I断片を自己連結させることによって、こ
れを構築した。
8.pNeol3G−65
このベクターはベクターpNeol3G中に存在するＨ−ras
イントロンの中央部分を欠くが、該イントロンの5'末端
の11ntsと3'末端の54ntsを保持している。（ｉ）ベクタ
ーpNeol3Gの大きいSma I−Sst II断片を、（ii）Ｈ−ra
sイントロンの3'部分とそれに続くneoおよびHBV配列を
含有するベクターpNeol3A（このベクターはイントロン
のヌクオチド位置４におけるＧからＡへの置換を除いて
pNeol3Gと同一である）のEcoN I−Sst II断片に連結し
て、イントロンの3'−近位EcoN I部位と5'−近位Sma I
部位の間の配列を除去することによって、これを構築し
た。EcoN I消化によって生成した5'突出末端を補填し
て、Sma I切断によって生成する平滑末端に連結できる
ようにした。
イントロンの中央部分を欠くが、該イントロンの5'末端
の11ntsと3'末端の54ntsを保持している。（ｉ）ベクタ
ーpNeol3Gの大きいSma I−Sst II断片を、（ii）Ｈ−ra
sイントロンの3'部分とそれに続くneoおよびHBV配列を
含有するベクターpNeol3A（このベクターはイントロン
のヌクオチド位置４におけるＧからＡへの置換を除いて
pNeol3Gと同一である）のEcoN I−Sst II断片に連結し
て、イントロンの3'−近位EcoN I部位と5'−近位Sma I
部位の間の配列を除去することによって、これを構築し
た。EcoN I消化によって生成した5'突出末端を補填し
て、Sma I切断によって生成する平滑末端に連結できる
ようにした。
9.pNeol3G−101
プラスミドpML−UM20のポリリンカー領域の部分をベ
クターpNeol3G−65の65nt長イントロンに加えて101nt長
のイントロンを作成することにより、このベクターを構
築した。ベクターpNeol3Gの大きいSma I−Sst II断片
を、pML−UM20の消化によって生成した36nt長のSma I−
Xho I断片と、上述のpNeol3A由来のEcoN I−Sst II断片
とに、同時に連結した。Xho I消化によって生成した5'
突出末端を補填して平滑末端連結を可能にした。得られ
たプラスミドの１つpNeol3G−101は、pNeol3G断片のSma
I部位に融合したポリリンカー領域の補填Xho I部位
（これはXho I部位を再生させた）と、pNeol3A断片の補
填EcoN I末端に融合したポリリンカー領域のSma I生成
末端とを有する。
クターpNeol3G−65の65nt長イントロンに加えて101nt長
のイントロンを作成することにより、このベクターを構
築した。ベクターpNeol3Gの大きいSma I−Sst II断片
を、pML−UM20の消化によって生成した36nt長のSma I−
Xho I断片と、上述のpNeol3A由来のEcoN I−Sst II断片
とに、同時に連結した。Xho I消化によって生成した5'
突出末端を補填して平滑末端連結を可能にした。得られ
たプラスミドの１つpNeol3G−101は、pNeol3G断片のSma
I部位に融合したポリリンカー領域の補填Xho I部位
（これはXho I部位を再生させた）と、pNeol3A断片の補
填EcoN I末端に融合したポリリンカー領域のSma I生成
末端とを有する。
10.pNeol3G−76
ベクターpNeol3G−76は76nt長のイントロンを含有
し、これはpNeol3G−101内のpML−UM20由来のポリリン
カー領域の一部を削除することによってpNeol3G−101か
ら誘導された。pNeol3G−101の大きいXho I−Sst II断
片を、neo遺伝子とイントロンの3'部分を含有するpNeol
3G−101のBamH I−Sst II断片に連結することによっ
て、これを構築した。Xho IおよびBamH Iによって生成
した5'突出末端を補填して平滑末端連結を可能にした。
し、これはpNeol3G−101内のpML−UM20由来のポリリン
カー領域の一部を削除することによってpNeol3G−101か
ら誘導された。pNeol3G−101の大きいXho I−Sst II断
片を、neo遺伝子とイントロンの3'部分を含有するpNeol
3G−101のBamH I−Sst II断片に連結することによっ
て、これを構築した。Xho IおよびBamH Iによって生成
した5'突出末端を補填して平滑末端連結を可能にした。
11.pNeol3G−72＊
ベクターpNeol3G−72＊は72nt長のイントロンを含有
し、これはpNeol3G−101内のpML−UM20由来のポリリン
カー領域の一部を欠失させることによって、pNeol3G−1
01から誘導された。pNeol3G−72＊中に残存しているポ
リリンカーの部分は5'−GATCCCC−3'という配列を有す
る。pNeol3Gの大きいSma I−Sst II断片を、neo遺伝子
とイントロンの3'部分を含有するpNeol3A−101（このベ
クターはイントロンのヌクレオチド位置４におけるＧか
らＡへの置換を除いてpNeol3G−101と同一である）のBa
mH I−Sst II断片に連結することによって、このベクタ
ーを構築した。BamH I切断によって生成した5'突出末端
を補填することによって、Sma Iによって生成した平滑
末端への連結を可能にした。
し、これはpNeol3G−101内のpML−UM20由来のポリリン
カー領域の一部を欠失させることによって、pNeol3G−1
01から誘導された。pNeol3G−72＊中に残存しているポ
リリンカーの部分は5'−GATCCCC−3'という配列を有す
る。pNeol3Gの大きいSma I−Sst II断片を、neo遺伝子
とイントロンの3'部分を含有するpNeol3A−101（このベ
クターはイントロンのヌクレオチド位置４におけるＧか
らＡへの置換を除いてpNeol3G−101と同一である）のBa
mH I−Sst II断片に連結することによって、このベクタ
ーを構築した。BamH I切断によって生成した5'突出末端
を補填することによって、Sma Iによって生成した平滑
末端への連結を可能にした。
12.pNeol3G−72
ベクターpNeol3G−72も72nt長のイントロンを含有す
るが、pNeol3G−72＊のポリリンカー由来の配列が5'−T
CGAGTC−3'という配列で置換されている点でpNeol3G−7
2＊と異なる。このベクターを下記の通りに構築した。
るが、pNeol3G−72＊のポリリンカー由来の配列が5'−T
CGAGTC−3'という配列で置換されている点でpNeol3G−7
2＊と異なる。このベクターを下記の通りに構築した。
ａ）四部分連結によって中間体ベクター10.28.9を作成
した。その４断片は次の通りである。
した。その４断片は次の通りである。
i. HBVポリ（Ａ）領域とpUC119配列を含有するpNeol3
A−101の大きいEcoR I−Sst II断片。
A−101の大きいEcoR I−Sst II断片。
ii. SV16B由来のエンハンサー／プロモーター、neo遺
伝子の5'部分および101nt長のイントロンの5'末端部分
を含有するpNeol3A−101のEcoR I−Xho I断片。
伝子の5'部分および101nt長のイントロンの5'末端部分
を含有するpNeol3A−101のEcoR I−Xho I断片。
iii. neo遺伝子とイントロンの3'部分を含有するpNeo
l3A−EcoN I−Sst II断片。
l3A−EcoN I−Sst II断片。
iv. 次の配列を有する２つの相補的オリゴヌクレオチ
ドをアニーリングさせることによって得た合成DNA断
片： Ａ鎖:5'−TCGAGCCCTTTTCTCGAGTC−3'［配列番号４］ Ｂ鎖:5'−GGACTCGAGAAAAGGGC［配列番号５］ これらのオリゴヌクレオチドはアニーリングさせた時
に、一端に5'−TCGAという配列の5'突出部を残し、他端
に１つのＧヌクレオチドという5'突出部を残すように設
計された。これらの突出部はそれぞれXho I切断およびE
coN I切断によって生成する5'突出末端に相補的であ
る。
ドをアニーリングさせることによって得た合成DNA断
片： Ａ鎖:5'−TCGAGCCCTTTTCTCGAGTC−3'［配列番号４］ Ｂ鎖:5'−GGACTCGAGAAAAGGGC［配列番号５］ これらのオリゴヌクレオチドはアニーリングさせた時
に、一端に5'−TCGAという配列の5'突出部を残し、他端
に１つのＧヌクレオチドという5'突出部を残すように設
計された。これらの突出部はそれぞれXho I切断およびE
coN I切断によって生成する5'突出末端に相補的であ
る。
上記４断片の連結によって、85ntイントロンとイント
ロンの位置４におけるＧからＡへの置換を有するベクタ
ー10.28.9が生成した。このベクターは近接する２つのX
ho I部位をイントロン内に含有している。１つはXho I
で生成した断片２の末端の、合成断片の5'TCGA突出部へ
の連結によって再形成され、他方は合成断片内に含有さ
れる（下線部）。
ロンの位置４におけるＧからＡへの置換を有するベクタ
ー10.28.9が生成した。このベクターは近接する２つのX
ho I部位をイントロン内に含有している。１つはXho I
で生成した断片２の末端の、合成断片の5'TCGA突出部へ
の連結によって再形成され、他方は合成断片内に含有さ
れる（下線部）。
ｂ）pNeol3G−101の大きいXho I−Sst II断片を、neo遺
伝子とイントロンの3'部分を含有する10.28.9のXho I−
Sst II断片に連結することによってpNeol3G−72を構築
した。この構築によりイントロンから内部Xho I断片が
除去されて、72nt長のイントロンと、そのイントロンの
ヌクレオチド位置４におけるＡからＧへの置換とが生成
する。
伝子とイントロンの3'部分を含有する10.28.9のXho I−
Sst II断片に連結することによってpNeol3G−72を構築
した。この構築によりイントロンから内部Xho I断片が
除去されて、72nt長のイントロンと、そのイントロンの
ヌクレオチド位置４におけるＡからＧへの置換とが生成
する。
13.pNeol3G−71およびpNeol3G−70
pNeol3G−72について上に概略を記したものと同じ手
法によって、これらのベクターを構築した。しかし、そ
れぞれの場合について、合成オリゴヌクレオチド配列が
pNeol3G−72を構築するために使用したものとはわずか
に異なった。中間体ベクター10.28.5を作成するために
は、Ａ鎖が上記の配列の最後のヌクレオチドを欠き、Ｂ
鎖が上記のＢ鎖配列の最初のヌクレオチドを欠いた。こ
れは、この中間体ベクター10.28.5内の84nt長のイント
ロンと、最終的なpNeol3G−71ベクター中の71ntイント
ロンをもたらした。同様に、上記Ａ鎖配列の最後の２ヌ
クレオチドを欠くＡ鎖オリゴヌクレオチドと、上記Ｂ鎖
配列の第１と第３のヌクレオチドを欠くＢ鎖オリゴヌク
レオチドを用いて、中間体ベクター10.28.1を作成し
た。これは、この中間体ベクター10.28.1中の83nt長の
イントロンと、最終的なベクターpNeol3G−70中の70nt
長のイントロンとをもたらした。
法によって、これらのベクターを構築した。しかし、そ
れぞれの場合について、合成オリゴヌクレオチド配列が
pNeol3G−72を構築するために使用したものとはわずか
に異なった。中間体ベクター10.28.5を作成するために
は、Ａ鎖が上記の配列の最後のヌクレオチドを欠き、Ｂ
鎖が上記のＢ鎖配列の最初のヌクレオチドを欠いた。こ
れは、この中間体ベクター10.28.5内の84nt長のイント
ロンと、最終的なpNeol3G−71ベクター中の71ntイント
ロンをもたらした。同様に、上記Ａ鎖配列の最後の２ヌ
クレオチドを欠くＡ鎖オリゴヌクレオチドと、上記Ｂ鎖
配列の第１と第３のヌクレオチドを欠くＢ鎖オリゴヌク
レオチドを用いて、中間体ベクター10.28.1を作成し
た。これは、この中間体ベクター10.28.1中の83nt長の
イントロンと、最終的なベクターpNeol3G−70中の70nt
長のイントロンとをもたらした。
14.pNeol3G−69
ベクターpNeol3G−69は69nt長のイントロンを含有
し、これはpNeol3G−101内のpML−UM20由来のポリリン
カー領域の一部を削除することによって、pNeol3G−101
から誘導された。pNeol3G−101の大きいXho I−Sst II
断片を、neo遺伝子とイントロンの3'部分を含有するpNe
ol3AのEcoN I−Sst II断片に連結することによって、こ
れを構築した。
し、これはpNeol3G−101内のpML−UM20由来のポリリン
カー領域の一部を削除することによって、pNeol3G−101
から誘導された。pNeol3G−101の大きいXho I−Sst II
断片を、neo遺伝子とイントロンの3'部分を含有するpNe
ol3AのEcoN I−Sst II断片に連結することによって、こ
れを構築した。
実施例２
1.Ras2.2細胞系
リン酸カルシウム法（グラハムおよびファン・デル・
エブ,Virology 52:456（1973））によって、ヒトＨ−ra
s遺伝子の形質転換24/EJアレルを含有するプラスミドpT
24−10（ケイポンら,Nature 302:33（1983））でRat−
１細胞（シーバーグら,Nature.312:71（1984））を安定
にトランスフェクションした。非選択培地中で２週間培
養した後、接触阻害された細胞のバックグラウンドに対
して現れる形質転換された細胞の中心を同定し、さらに
増殖させ、低密度で軟寒天中に接種し、そこから、形質
転換された細胞の個々のコロニーを単離した。比較的高
い形質転換度を示した１つのコロニーをRas2.2と命名し
た。
エブ,Virology 52:456（1973））によって、ヒトＨ−ra
s遺伝子の形質転換24/EJアレルを含有するプラスミドpT
24−10（ケイポンら,Nature 302:33（1983））でRat−
１細胞（シーバーグら,Nature.312:71（1984））を安定
にトランスフェクションした。非選択培地中で２週間培
養した後、接触阻害された細胞のバックグラウンドに対
して現れる形質転換された細胞の中心を同定し、さらに
増殖させ、低密度で軟寒天中に接種し、そこから、形質
転換された細胞の個々のコロニーを単離した。比較的高
い形質転換度を示した１つのコロニーをRas2.2と命名し
た。
2.トランスフェクション
リン酸カルシウム法によって、1.4×106細胞あたりに
表示した量の下記DNAを用いてRas2.2細胞を正副１対で
トランスフェクションした。
表示した量の下記DNAを用いてRas2.2細胞を正副１対で
トランスフェクションした。
1. 0.5μｇのpRK−hyg、および、
2. 10.0μｇのpRSV−hGH、および、
3. 2.0μｇの下記DNAのうちの１つ（イントロンで修飾
されたネオマイシン耐性遺伝子を含有するネオマイシン
耐性ベクター）： ａ）pNeol3G−71 ｂ）pNeol3G−72 ｃ）pNeol3G−72＊ ｄ）pNeol3G−76 ｅ）pNeol3G−101 ｆ）pNeol3G−△Ｓ。
されたネオマイシン耐性遺伝子を含有するネオマイシン
耐性ベクター）： ａ）pNeol3G−71 ｂ）pNeol3G−72 ｃ）pNeol3G−72＊ ｄ）pNeol3G−76 ｅ）pNeol3G−101 ｆ）pNeol3G−△Ｓ。
3.選択
同時トランスフェクションした細胞を２日後に400μg
/mlのネオマイシン類縁体G418か、もしくは200μg/mlの
ハイグロマイシンを含有する培地（等体積のDMEMとF12
培地、５％牛胎児血清、2mMグルタミン）に移し、その
後、２日毎に供給した。薬物にさらした20日後にG418耐
性コロニー（G418r）を計数し、さらなる培養のために
貯蔵した。選択剤にさらした10日後にハイグロマイシン
耐性コロニー（hygr）を計数し、さらなる培養のために
貯蔵した。hygr貯蔵物中の細胞を１回継代し、350μg/m
l（pNeol3G−71またはpNeol3G−72でトランスフェクシ
ョンしたhygr貯蔵物）もしくは400μg/ml（pNeol3G−72
＊、pNeol3G−76、pNeol3G−101またはpNeol3G−△Ｓで
トランスフェクションした細胞のhygr貯蔵物）の濃度の
G418を含有する培地中に様々な密度で接種し、その後２
ないし４日毎に供給した。G418にさらした２ないし４週
間後に、得られたハイグロマイシン/G418耐性コロニー
（hygr/G418）を計数し、さらなる培養のために貯蔵し
た。
/mlのネオマイシン類縁体G418か、もしくは200μg/mlの
ハイグロマイシンを含有する培地（等体積のDMEMとF12
培地、５％牛胎児血清、2mMグルタミン）に移し、その
後、２日毎に供給した。薬物にさらした20日後にG418耐
性コロニー（G418r）を計数し、さらなる培養のために
貯蔵した。選択剤にさらした10日後にハイグロマイシン
耐性コロニー（hygr）を計数し、さらなる培養のために
貯蔵した。hygr貯蔵物中の細胞を１回継代し、350μg/m
l（pNeol3G−71またはpNeol3G−72でトランスフェクシ
ョンしたhygr貯蔵物）もしくは400μg/ml（pNeol3G−72
＊、pNeol3G−76、pNeol3G−101またはpNeol3G−△Ｓで
トランスフェクションした細胞のhygr貯蔵物）の濃度の
G418を含有する培地中に様々な密度で接種し、その後２
ないし４日毎に供給した。G418にさらした２ないし４週
間後に、得られたハイグロマイシン/G418耐性コロニー
（hygr/G418）を計数し、さらなる培養のために貯蔵し
た。
図１は異なるネオマイシン耐性ベクターを用いて得ら
れた薬物耐性コロニーの数を表している。このデータは
最適な大きさのイントロンが71または72ntsであること
を示している。なぜならネオマイシン耐性遺伝子内にこ
れらの長さのイントロンを含有しているpNeol3G−71、p
Neol3G−72およびpNeol3G−72＊ベクターはG418rおよび
hygr/G418rコロニーを生じさせるが、ネオマイシン耐性
遺伝子内に76nt長のイントロンを含有するpNeol3G−76
ベクターの場合と比較すると相対的にコロニーが少ない
からである。
れた薬物耐性コロニーの数を表している。このデータは
最適な大きさのイントロンが71または72ntsであること
を示している。なぜならネオマイシン耐性遺伝子内にこ
れらの長さのイントロンを含有しているpNeol3G−71、p
Neol3G−72およびpNeol3G−72＊ベクターはG418rおよび
hygr/G418rコロニーを生じさせるが、ネオマイシン耐性
遺伝子内に76nt長のイントロンを含有するpNeol3G−76
ベクターの場合と比較すると相対的にコロニーが少ない
からである。
4.ヒト成長ホルモン（hGH）のレベルの決定
同時トランスフェクションした細胞培養中での発現
ほぼ等しい細胞密度のG418、hygrおよびhyg/G418耐性
細胞を35S−メチオニンおよび35S−システインで代謝的
に放射線標識し、その後、上清タンパク質をドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲルで分析
することによって、細胞培養上清中に存在するヒト成長
ホルモン（hGH）のレベルを決定した。
細胞を35S−メチオニンおよび35S−システインで代謝的
に放射線標識し、その後、上清タンパク質をドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲルで分析
することによって、細胞培養上清中に存在するヒト成長
ホルモン（hGH）のレベルを決定した。
さらに、ポリクローナル抗hGH抗体を用いるELISA放射
線免疫検定法によって、細胞培養上清中のhGHのレベル
を決定した。薬物耐性細胞の貯蔵物を微量滴定培養プレ
ートの各ウェルあたり1.5×105細胞の密度で接種し、密
集成長させた。次に細胞を収集し、計数し、その細胞培
養上清（調整培地）を検定した。図２は、同時トランス
フェクションされた異なる細胞型のそれぞれについて、
細胞培養上清中のhGHの計算された量を細胞あたりに基
づいて示すものである（pg/細胞）。これらの数は、微
量滴定プレートのある与えられたウェルから得られる細
胞培養上清中の免疫反応性のhGHの量（ELISAによって決
定したもの）を、そのウェルから回収された細胞の数で
割ることによって得た。
線免疫検定法によって、細胞培養上清中のhGHのレベル
を決定した。薬物耐性細胞の貯蔵物を微量滴定培養プレ
ートの各ウェルあたり1.5×105細胞の密度で接種し、密
集成長させた。次に細胞を収集し、計数し、その細胞培
養上清（調整培地）を検定した。図２は、同時トランス
フェクションされた異なる細胞型のそれぞれについて、
細胞培養上清中のhGHの計算された量を細胞あたりに基
づいて示すものである（pg/細胞）。これらの数は、微
量滴定プレートのある与えられたウェルから得られる細
胞培養上清中の免疫反応性のhGHの量（ELISAによって決
定したもの）を、そのウェルから回収された細胞の数で
割ることによって得た。
最適な大きさのイントロンが71または72ntsであると
いう先の決定と合致して、図２のデータは最も高いレベ
ルのhGHが、pNeol3G−71、pNeol3G−72またはpNeol3G−
72＊ベクターで同時トランスフェクションされた細胞に
よって生産されることを示している。
いう先の決定と合致して、図２のデータは最も高いレベ
ルのhGHが、pNeol3G−71、pNeol3G−72またはpNeol3G−
72＊ベクターで同時トランスフェクションされた細胞に
よって生産されることを示している。
5.ヒト成長ホルモン（hGH）のレベルの決定
個々の細胞クローン中での発現
pNeol3G−71もしくはpNeol3G−△Ｓでトランスフェク
ションされたG418耐性細胞の貯蔵物を10mm組織培養皿中
に極めて低い密度で接種した。個々のコロニー（クロー
ン）を単離し、１世代増殖させた後、各クローンから細
胞を収集し、60mm組織培養皿あたり４×108細胞の密度
で接種した。数時間後、35S−メチオニンと35S−システ
インで細胞を代謝的に放射線標識し、その後、上清タン
パク質をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析することにより、細胞培養上清中
に存在するヒト成長ホルモン（hGH）のレベルを決定し
た。
ションされたG418耐性細胞の貯蔵物を10mm組織培養皿中
に極めて低い密度で接種した。個々のコロニー（クロー
ン）を単離し、１世代増殖させた後、各クローンから細
胞を収集し、60mm組織培養皿あたり４×108細胞の密度
で接種した。数時間後、35S−メチオニンと35S−システ
インで細胞を代謝的に放射線標識し、その後、上清タン
パク質をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析することにより、細胞培養上清中
に存在するヒト成長ホルモン（hGH）のレベルを決定し
た。
さらに、個々のクローンによって生産されるhGHのレ
ベルを、ポリクローナル抗hGH抗体を用いるELISA放射線
免疫検定法によって決定した。各クローンから得た細胞
を微量滴定細胞培養プレートの各ウェルあたり1.5×105
細胞の密度で接種し、密集成長させた。次に細胞を収集
し、計数し、細胞上清（調整培地）を検定した。図３は
分析した異なるクローンのそれぞれについて、細胞の
数、細胞培養上清中のhGHの量（ELISAによって決定した
もの）および細胞あたりの生産されたhGHの計算量（pg/
細胞）を表す。
ベルを、ポリクローナル抗hGH抗体を用いるELISA放射線
免疫検定法によって決定した。各クローンから得た細胞
を微量滴定細胞培養プレートの各ウェルあたり1.5×105
細胞の密度で接種し、密集成長させた。次に細胞を収集
し、計数し、細胞上清（調整培地）を検定した。図３は
分析した異なるクローンのそれぞれについて、細胞の
数、細胞培養上清中のhGHの量（ELISAによって決定した
もの）および細胞あたりの生産されたhGHの計算量（pg/
細胞）を表す。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ジェネンテク，インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：所望のタンパク質を高レベルに発
現させる組換え宿主細胞の選別法 （iii）配列の数:5 （iv）通信先： （Ａ）宛て名：ジェネンテク，インコーポレイテッ
ド （Ｂ）町名：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバ
ード460番 （Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国籍：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94080 （ｖ）コンピューター読み取り形式： （Ａ）媒体の型:5.25インチ,360Kbフロッピーディ
スク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パティン（patin）（ジェン
ネンテク） （vi）本出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日:1992年２月20日 （Ｃ）分類： （vii）原出願データ： （Ａ）出願番号:07/677,045 （Ｂ）出願日:1991年３月29日 （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ヘンスレイ，マックス・ディ （Ｂ）登録番号:27,043 （Ｃ）参照／整理番号:693 （ix）通信情報： （Ａ）電話:415/266−1994 （Ｂ）ファクシミリ:415/952−9881 （Ｃ）テレックス:910/371−7168 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:75塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:40塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号5:
現させる組換え宿主細胞の選別法 （iii）配列の数:5 （iv）通信先： （Ａ）宛て名：ジェネンテク，インコーポレイテッ
ド （Ｂ）町名：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバ
ード460番 （Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国籍：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94080 （ｖ）コンピューター読み取り形式： （Ａ）媒体の型:5.25インチ,360Kbフロッピーディ
スク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パティン（patin）（ジェン
ネンテク） （vi）本出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日:1992年２月20日 （Ｃ）分類： （vii）原出願データ： （Ａ）出願番号:07/677,045 （Ｂ）出願日:1991年３月29日 （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ヘンスレイ，マックス・ディ （Ｂ）登録番号:27,043 （Ｃ）参照／整理番号:693 （ix）通信情報： （Ａ）電話:415/266−1994 （Ｂ）ファクシミリ:415/952−9881 （Ｃ）テレックス:910/371−7168 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:75塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:40塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:33塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:17塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の記載：配列番号5:
Claims (16)
- 【請求項１】所望のタンパク質を高レベルで発現する組
換え宿主細胞を選択する方法であって、以下の工程
（１）、（２）： （１）真核細胞を （ａ）天然には存在しない50−85ヌクレオチドのイント
ロンを含有する選択可能遺伝子であって、該イントロン
は宿主細胞中でスプライシングされて選択可能タンパク
質をコードするメッセンジャーRNAを与えることができ
るものであり、該イントロンの該選択可能遺伝子中にお
ける存在が宿主細胞において該選択可能遺伝子から生産
される選択可能タンパク質のレベルを減少させるもので
ある、選択可能遺伝子、および （ｂ）所望のタンパク質をコードする生成物遺伝子 でトランスフェクションする工程 （２）選択可能タンパク質によって付与される選択可能
な表現型を有するトランスフェクタントを同定する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】選択可能遺伝子が原核生物供給源から得ら
れるものである請求項１の方法。 - 【請求項３】第２の選択可能遺伝子で該宿主細胞をトラ
ンスフェクションすることをさらに含む請求項１の方
法。 - 【請求項４】所望のタンパク質をコードする生成物遺伝
子と第２の選択可能遺伝子で該宿主細胞をトランスフェ
クションすることをさらに含む請求項１の方法。 - 【請求項５】第２の選択可能遺伝子がハイグロマイシン
耐性遺伝子またはDHFR遺伝子である請求項３または請求
項４の方法。 - 【請求項６】該イントロンの長さが55−85ヌクレオチド
である請求項１の方法。 - 【請求項７】該イントロンの長さが65−75ヌクレオチド
である請求項１の方法。 - 【請求項８】該選択可能遺伝子がハイグロマイシン耐性
遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子である請求項１の
方法。 - 【請求項９】該イントロンが該選択可能遺伝子のコード
領域内に存在する請求項１の方法。 - 【請求項１０】該イントロンが該選択可能遺伝子の転写
される非コード領域内に存在する請求項１の方法。 - 【請求項１１】該真核宿主細胞が哺乳類細胞である請求
項１の方法。 - 【請求項１２】該哺乳類細胞がチャイニーズ・ハムスタ
ー卵巣（CHO）細胞またはシミアンCOS細胞またはヒト胚
性腎臓293細胞である請求項11の方法。 - 【請求項１３】請求項１の方法に従って作成されるトラ
ンスフェクタント細胞。 - 【請求項１４】選択可能遺伝子とその選択可能遺伝子の
転写される領域内のイントロンからなる単離された核酸
であって、該イントロンが該選択可能遺伝子内に天然に
は存在せず、該イントロンが宿主細胞において該選択可
能遺伝子から生産される選択可能タンパク質のレベルを
減少させるに足る長さである、50−85ヌクレオチドであ
ることを特徴とする単離された核酸。 - 【請求項１５】所望のタンパク質を高レベルで発現する
組換え宿主細胞を選択する方法であって、以下の工程
（１）および（２）： （１）真核宿主細胞を （ａ）50−85ヌクレオチドのイントロンを含有する選択
可能遺伝子であって、該イントロンは宿主細胞中でスプ
ライシングされて選択可能タンパク質をコードするメッ
センジャーRNAを与えることができるものであり、該イ
ントロンの該選択可能遺伝子中における存在が宿主細胞
において該選択可能遺伝子から生産される選択可能タン
パク質のレベルを減少させるものである、選択可能遺伝
子、および （ｂ）所望のタンパク質をコードする生成物遺伝子 で同時トランスフェクションする工程 （２）該選択可能遺伝子によって付与される選択可能な
表現型を有するトランスフェクタントを同定する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項１６】同時トランスフェクションされた宿主細
胞から該生成物遺伝子によってコード化されるポリペプ
チドを回収することをさらに含む請求項15の方法。
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