JP3400367B2

JP3400367B2 - 精製された新規精巣上体前進運動能タンパク質および稔性促進因子／抑制因子として有用な前記タンパク質の精製方法

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Publication number: JP3400367B2
Application number: JP36625798A
Authority: JP
Inventors: チャンドラマジュムデルゴパル; シャンカルジャイスワルビジャイ
Original assignee: カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1998-12-24
Publication date: 2003-04-28
Anticipated expiration: 2018-12-24
Also published as: IN189766B; JPH11279197A; US6231862B1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、精製された新規の
精巣上体前進運動能タンパク質( epididymal forward
motility protein)および稔性促進／抑制に有用な前記
精巣上体前進運動能タンパク質の単離方法に関する。本
発明の方法は、特にヤギから精製した、稔性促進因子お
よび稔性抑制因子として有用な新規の精巣上体前進運動
能タンパク質の単離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】前進運動能タンパク質（FMP ）は人口増
加を抑制する避妊用ワクチンとして使用できる可能性を
有している。FMP は（精子の運動能が低いための）ヒト
の不妊の問題のいくらかを改善する可能性をも有してい
る：不妊問題は全人類の大きな社会的問題である。また
FMP は（精子の運動能が十分でないことによる）動物の
育種問題のいくらかも解決する可能性を有しており、そ
れによりミルクと肉の生産を増強できる。

【０００３】人口爆発は、インドを含む発展途上国にお
いて主要な問題である。いくつかの避妊方法が利用でき
るものの、望ましくない副作用／低効率という限界があ
る。さらに、これらの方法の幾つかは多くの貧しい人た
ちにとってかなり高価である。別の広範囲の大きな社会
的問題はヒトの不妊である。約15％の夫婦が不妊である
と考えられている。世界中の沢山の不妊である人々は不
幸な暮らしをおくっている。ヒトの不妊の理由の一つは
精子の運動能の低さによるものである。いくつかの複雑
な補助的生殖技術（Assisted Reproductive Technologi
es）（たとえば、IVF ：試験管受精(in vitro Fertiliz
ation)、ICSI：細胞質内精子注入（Intracytoplasmic S
perm Injection））が精子過少症および（精子運動能が
低い）精子無力症の患者の問題を解決するために利用で
きるが、これらの技術は非常に費用がかかり成功率は極
めて低い。人口爆発とヒトの不妊という問題を解決する
ためには、生殖過程の生化学的基礎について深く理解す
ることが必須である、以下の節に精巣上体の精子成熟に
関する文献を簡単に考察する：精子の成熟は雄の生殖機
能において重要な事象である。

【０００４】哺乳動物の精巣の精子は運動せず生殖力が
ない。精巣上体を通過する間にこれらの細胞は前進運動
能を獲得し、これが雌性卵を受精させる能力にとって必
須である。精巣上体の精子成熟過程の生化学的基礎はあ
まりよく分かっていない。Hoskins D.D., Brandt H. お
よびAcott T.S. Fed Proc, 37, 2534-2542, 1978; Maju
mder G.C., Dey C.S., Halder S.およびBarua M., Arch
Androl, 24, 287-303, 1990が参照できる。精巣上体プ
ラズマ(EP)／精液プラズマ(SP)はin vitroで、雄牛由来
の精巣上体頭部の未熟精子に前進運動(FM)を誘導する因
子を有している。Acott, T.S. とHoskins, D.D. J Biol
Chem, 253, 6744-6750, 1978 、Hoskins, D.D., Bran
t, H.およびAcott, T.S. Fed. Proc. 37, 2534-2542, 1
978が参照できる。ハムスターの場合は、Cornwall, G.
A, Smyth, T.S., Vindivich, D., Harter, C., Robinso
n, J. およびChang, T.S.K. Biol Repord 35, 1065-107
4, 1986 が参照できる。ヤギの場合はJaiswal, B.S. と
Majumder, G.C., Int J Androl, 19, 97-102,1996 が参
照できる。

【０００５】Hoskins とその共同研究者（Acott, T.S.
とHoskins, D.D. J Biol Chem, 253, 6744-6750, 1978
、Hoskins, D.D., Brandt, H. およびAcott, T.S. Fe
d. Proc. 37, 2534-2542, 1987）はウシSPおよびEPから
有効成分を部分精製し、これは前進運動能タンパク質
（FMP ）と命名されている。FMP は精巣上体に由来し、
精巣上体における合成後この因子は精巣上体プラズマ中
に分泌され続いて精液プラズマへ移る（Brandt, H. Aco
tt, T.S., Johnson, D.J. およびHoskins, D.D. Biol.
Reprod. 19, 830-835, 1978 ）。

【０００６】FMP の単離のため、これらの研究者は以下
に述べるように幾つかの分画技術を用いた。ウシSPは90
℃で10分間加熱され、次に沈殿したタンパク質を除去す
るため1,78,000x ｇで60分間遠心された。得られた上清
液は４M 尿素、100mM NaCl、10mMジチオスレイトールお
よび100mM Tris-HCl、ｐＨ7.5 を含むバッファーを用い
てセファロース6Bクロマトグラフィーにかけられた。こ
れらの方法によりFMPは約15倍に精製された。また、こ
の因子はさらに熱処理SPのコンカナバリンA-アガロース
アフィニティークロマトグラフィーによって部分精製さ
れた。FMP はコンカナバリンA に結合し、0.25M のα-
メチル-D- マンノシドで溶出された。単離されたFMP は
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) ゲル電気泳動で示される
ように幾つかのタンパク質を含んでおり、FMP の純度は
不明である。同様な方法を用いてFMP はまたウシEPから
も単離されたが、その純度は不明である。FMP は37KDa
の熱安定糖タンパク質で精巣上体の精子成熟の過程で精
子FMの開始に必須であると考えられている。FMP はin v
itroでウシの未熟／不動性の精巣上体頭部精子（caput-
epididymal spermatozoa）の前進運動を誘導する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の主要な目的
は、精製された新規な、ヤギの精巣上体前進運動能タン
パク質（FMP ）、特にヤギの精巣上体のEPに由来するも
のを単離する方法を提供することである。他の目的は、
上述したような、ウシFMP とは著しく異なるヤギEPから
の新規なFMP （125KDa）の単離方法を提供することであ
る。本発明の方法によって初めて我々がFMP （EPからの
生理学的な精子運動開始／活性化因子）の完全な精製を
成し遂げた。

【０００８】本発明の方法によって得られた単離FMP
は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、
高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）および等電点電
気泳動技術によって証明されるように均質であり、これ
らによってFMP の純度はほぼ100 ％であることが示唆さ
れる。得られたFMP(125KDa) はAcott T.S.とHoskins D.
D., J Biol Chem. 253, 6744-6750, 1978 によってウシ
SPから部分精製された37KDa FMP と異なっている。FMP
は高度に免疫原性であり、その抗体は成熟精子のFMを強
く阻害し、このことはFMP が避妊用ワクチンとして機能
する可能性を暗示するものである。本発明の方法よって
得られたタンパク質は成熟精子の運動能を刺激する高い
効果を有するので、FMP は低精子運動能によるヒトの不
妊の問題のいくらかを改善する可能性を有する。本発明
の方法により得られたヤギの精巣上体FMP はヒト血清の
運動促進タンパク質（約200KDa）と比較して著しく異な
る分子量を有する。これについては特許番号WO9012032
，1990年10月18日、米国第530 4464号、1994年4 月19
日；米国第545 3354号、1995年9 月26日を参照しても良
い。また、96年3 月27日付けの我々の特許出願637/DEL/
96号に記載しクレームした、低精子運動能によるヒトの
不妊の治療の可能性を有する水牛血清からのもの（66KD
a ）とも異なっている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、精製された新
規な精巣上体前進運動能タンパク質および稔性促進／阻
害因子として有用な、前記精巣上体前進運動能タンパク
質の単離方法を提供するものであり、その方法はヤギの
精巣上体プラズマを、精製された新規な精巣上体運動能
タンパク質を得るまで複数段階の分画にかけ、精製する
ことを含む。

【００１０】本発明の１つの実施態様では、分画は硫酸
アンモニウム分画、ジエチルアミノエチル（DEAE）- セ
ルロース／セファデックスをイオン交換樹脂として用い
た陽イオン交換クロマトグラフィー、カルボキシメチル
（CM）- セルロース／セファデックスをイオン交換樹脂
として用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、コンカ
ナバリンＡ- セファロース4Bアフィニティークロマトグ
ラフィー、PBE-94樹脂と呼ばれるポリバッファー交換体
（polybuffer exchanger）を用いた等電点クロマトグラ
フィー、アルミナゲルまたはバイオラッド（Bio Rad ）
のヒドロキシアパタイトを用いた吸着クロマトグラフィ
ー、および不溶性マトリックスとしてセファクリル／セ
ファデックスを用いた分子ふるいクロマトグラフィーま
たは高性能液体クロマトグラフィーのような方法を用い
て達成されるであろう。

【００１１】本発明の方法は、（ａ）新規なFMP の精製
及び特性解析および（ｂ）ヤギEPからのその精製につい
ての方法論、を含む。我々の発明は、初めてEPからの均
質と思われるFMP の精製について報告するものである。
単離されたFMP の純度はPAGE、HPLC、等電点電気泳動な
どのような、近代的な複数の解析技術を用いてはっきり
と証明されている。セファクリルS-200 ゲル濾過、HPLC
および未変性PAGEによって決定された未変性FMP の分子
量はおよそ125KDaである。これは約70および54KDa サブ
ユニットの2 量体タンパク質である。この因子は、in v
itroで精巣上体未熟精子にFMを誘導することに関して高
い蛋白質特異性と親和性を有する。

【００１２】FMP は30μg/mlの濃度で最大の運動- 促進
活性を示した。FMP はまたヤギの尾部成熟精子のFMを増
強することもできる。Ca²⁺およびMg²⁺はFMP 活性を刺激
する。精子のFMP 処理は精子内サイクリックAMP 濃度の
有意な上昇を引き起こし、それによりFMP は膜結合アデ
ニルシクラーゼを活性化することにより精子の運動能を
刺激することが示唆される。FMP は約4.75の等電点（P
I）を有する酸性タンパク質である。100 ℃で３分間の
熱処理に安定である。FMP はコンカナバリンＡ（ConA）
に対して高親和性に結合する糖タンパク質である。FMP
はマンノース、ガラクトースおよびN-アセチルグルコサ
ミンをおよそ6:1:6 の割合で含む。FMP はα- マンノシ
ダーゼ、β-N- アセチルグルコサミニダーゼおよびタン
パク質分解酵素とインキュベーションするとその活性が
著しく失われ、糖とタンパク質部分の両方がその生物学
的活性には必須であることを示している。

【００１３】免疫蛍光法検査により、FMP は精子の外表
面上、特に頭部領域に局在していることが示された。FM
P は高度に免疫原性である。これに対する抗体はヤギの
成熟精子のFMを阻害し、未熟の精子のin vitroにおける
FMP-誘導運動開始を阻害する。酵素結合免疫吸着測定法
（ELISA ）を用いてFMP の分布を色々な組織及び幾つか
の体液で解析した。FMP の比活性は精巣上体プラズマ中
で最も高かった。FMPまたは／および免疫的に交差反応
性のタンパク質が骨髄および血清中にかなりの濃度で存
在している。テストした他の組織では低い／僅かなFMP
濃度であった。この因子は精子原形質膜に現れ、膜結合
FMP 濃度は精巣上体の精子成熟過程で顕著に増加する。
このヤギEPの精製タンパク質（FMP ）は生理学的な運動
- 活性化タンパク質である。FMP は文献で報告されてい
る（Acott, T.S. およびHoskins,D.D. J. Biol. Chem.,
253, 6744-6750, 1978）ものと特性が明確に異なる新
規な運動能促進タンパク質である。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の方法は実質的にヤギ精巣
上体尾部プラズマからのFMP の単離および前記タンパク
質の精製からなる。精巣上体プラズマはまず硫酸アンモ
ニウムで分画された。運動促進因子はこの塩の30〜70％
飽和で沈殿した。次にFMP の塩分画は低イオンアルカリ
性バッファー（例えば10mMリン酸カリウムｐＨ8.0 ）を
用いてDEAE- セルロース／セファデックスのような陰イ
オン交換樹脂にかけられた。この因子は樹脂に結合し、
100 〜200mM リン酸カリウムｐＨ8.0 のようなより高い
塩濃度でカラムから溶出することができる。運動促進因
子（FMP ）がこの樹脂に結合しないときは、FMP はまた
樹脂としてCM- セルロース／セファデックスを用い、低
イオン酸性バッファー（例えば10mM酢酸ナトリウムバッ
ファーｐＨ5.6 ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフ
ィーによって精製することもできる。

【００１５】イオン交換クロマトグラフィーで得られた
部分精製FMP は、さらにconA- セファロース4Bアフィニ
ティーマトリックスを用いたコンカナバリンＡアフィニ
ティークロマトグラフィーで更に精製された。FMP はこ
のマトリックスに結合し、0.25〜0.50M のα- メチルD-
マンノピラノシドでカラムから溶出させることができ
る。運動促進因子はさらにPBE 94樹脂（Pharmacia ）お
よび溶出バッファーとしてポリバッファー74を用いた等
電点クロマトグラフィーによって更に精製することがで
きる。運動促進因子は次に不溶性ゲル懸濁物（例えば、
アルミナゲルまたはバイオラッドのヒドロキシアパタイ
トゲルビーズ）を用いた吸着クロマトグラフィーにかけ
られた。吸着検討のためには低イオンバッファー（例え
ば10〜20mMリン酸カリウム、ｐＨ7 〜8 ）を使用しても
よい。この因子はゲルに結合し、比較的高濃度の塩（例
えば500mM リン酸カリウムバッファー、ｐＨ7.0 から8.
0 ）で溶出させることができる。吸着クロマトグラフィ
ーの後得られた部分精製FMPはさらに、不溶性マトリッ
クスとしてセファクリル／セファデックスを用いた分子
ふるい、またはいろいろなｐＨ（6.9 から7.5 ）といろ
いろなイオン強度（100 〜150mM ）のリン酸バッファー
を用いたHPLCカラムによってさらに精製された。これら
の方法の適切な組合わせにより、精巣上体プラズマの運
動促進因子がおよそ200 から500 倍に精製され、収率は
精巣上体プラズマ中に存在する全活性のおよそ10から20
％である。

【００１６】本発明はまた実質的に純粋で、約125KDaの
分子量を有し精子運動を活性化するタンパク質性の高分
子を、いずれかの適切な賦形剤と一緒に含む医薬調製物
に関する。適切な賦形剤の例は培地または他の塩溶液で
ある。この医薬調製物はそれ自体は既知の方法によって
調製される。本発明の医薬調製物は不妊治療のための可
能性を有している。本発明の方法は実施例により以下に
更に説明されるが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものと解釈してはならない。

【００１７】

【実施例】実施例：１ヤギ精巣上体尾部を地元の屠殺場から集めた。EPは以前
に記載されたように（Roy N., Majumder G.C. とChakra
borty C.K. Andrologia, 17, 200-206, 1985）精巣上体
尾部から調製した。EPの抽出過程で、修正リンガー液
（modified Ringer's solution）（RPS 培地：119mM Na
Cl、5mM KCl 、 1.2mM MgSO₄、 10mM グルコース、16.3
mMリン酸カリウムｐＨ6.9 、ペニシリン50ユニット/ml
）で希釈した。調製されたEPは5 から10mgタンパク質/
ml を含んでいる。EPは以前に報告されたように（Jaisw
al B.S.とMajumder G.C. Int. J. Androl., 19, 97-10
2, 1996 ）精巣上体尾部の未熟精子にin vitroでFM開始
を引き起こすFMP を含んでいる。

【００１８】FMP の単離のため、8.8mg タンパク質/ml
かつ100 ユニットFMP /ml を含んだ250ml のEPを使用し
た。１ユニットのFMP は精子細胞の10％にFMを誘導する
因子量として定義されるものである。EPをまず硫酸アン
モニウムの0 〜30％および30〜70％飽和を用いて硫酸ア
ンモニウム分画にかけた。各ステップで、タンパク質懸
濁液を18000gで15分間遠心し、沈殿したタンパク質ペレ
ットを10mMリン酸カリウムｐＨ8.0 に溶解し、一方上清
は固体硫酸アンモニウムを添加することにより更に飽和
度を上げた。およそ90％のFMP 活性が30〜70％硫酸アン
モニウム飽和によって沈殿した。(NH₄)₂SO₄分画からの
活性画分を10mMリン酸カリウムバッファーｐＨ8.0 に対
して透析した。

【００１９】次に、得られたFMP をあらかじめ10mMリン
酸カリウムバッファーｐＨ8.0 で平衡化しておいたDEAE
- セルロースカラム（0.75ｘ7.5cm ）のイオン交換クロ
マトグラフィーで更に精製した。FMP は樹脂に結合しFM
P 活性の大部分はリン酸カリウムバッファーの直線勾配
（165 〜185mM ｐＨ8.0 ）で溶出された。FMP 活性画
分を集めPM-30 膜によるアミコン（Amicon）限外濾過に
よって濃縮した。次にこのFMP 調製物をバッファーＩ
（20mM Tris-HCl 、ｐＨ7.2 、1.0mM CaCl₂、1.0mM Mg
Cl₂および1.0mM MnCl₂）中に分散させ、ConA- セファ
ロースアフィニティークロマトグラフィーにかけた。サ
ンプルをあらかじめバッファーＩで平衡化しておいたCo
nA- セファロースカラム（１ｘ12cm）にかけた。FMP は
樹脂に結合し、0.5Mα- メチルD-マンノピラノシドで溶
出させた。

【００２０】FMP はさらにPBE-94（Pharmacia の製品）
の等電点クロマトグラフィーによって更に精製した。イ
オン交換樹脂PBE-94のカラム（0.7 ｘ10cm）を25mMイミ
ダゾール-HCl、ｐＨ7.4 で平衡化し、FMP サンプルをこ
れにかけた。サンプルが通り抜けたらカラムを平衡化バ
ッファーで洗浄した。次にFMP をポリバッファー74-HC
l、ｐＨ4.0 （Pharmacia ）でカラムから溶出し、各画
分の体積を１mlとした。FMP 活性画分を集めPM-30 膜を
用いてアミコン限外濾過により濃縮し、最後に10mMリン
酸カリウムバッファーｐＨ7.5 に対して透析した。生じ
たFMP 調製物を10mMリン酸カリウムバッファーｐＨ7.5
に懸濁した10mlのアルミナゲル（250mg/ml、Sigma Chem
ical Co.）と混合した。この混合物を4 ℃にて1 時間撹
拌した。

【００２１】この懸濁液を次に500gで10分間遠心した。
上清（未吸着画分）を捨て、結合したFMP を0.5Mリン酸
カリウムｐＨ7.5 で溶出した。FMP 調製物をアミコンPM
-30膜を用いた限外濾過により濃縮し、RPS 培地、ｐＨ
6.9 に分散させた。次にFMPをRPS 培地ｐＨ6.9 で平衡
化したセファクリルS-200 ゲル濾過カラム（0.9 ｘ50c
m）でクロマトグラフィーを行なった。溶出を平衡化バ
ッファーで行ない、画分を（各１ml）LKB フラクション
コレクターで集め、画分のタンパク質量を280nmの吸光
度でモニターした。活性画分を集めPM-30 膜を用いたア
ミコン限外濾過によって濃縮した。全ての精製ステップ
は０〜４℃で行なった。これらの方法により、FMP はお
よそ500 倍に精製され、精製された因子の比活性は約50
00ユニット/mg タンパク質であった。単離したFMP はほ
ぼ100 ％の純度であった。純粋なFMP の収量は、250ml
のEP調製物からおよそ0.6mg で、活性の総回収率は約12
％であった。

【００２２】実施例２ヤギ精巣上体尾部を地元の屠殺場から集めた。EPは以前
に報告されたように（Roy N., Majumder G.C. とChakra
borty C.K. Andrologia, 17, 200-206, 1985）精巣上体
尾部から調製した。EPの抽出過程で、RPS 培地で希釈し
た。次にEP抽出物（500ml ：9.6mg タンパク質/ml ）を
硫酸アンモニウムの0 〜30％および30〜70％飽和を用い
て硫酸アンモニウム分画にかけた。各ステップで、タン
パク質懸濁液を18000gで15分間遠心し、沈殿したタンパ
ク質ペレットを10mMリン酸カリウムｐＨ8.0 に溶解し、
一方上清は固体硫酸アンモニウムを添加することにより
更に飽和度を上げた。FMP 活性のおよそ90％が硫酸アン
モニウムの30〜70％飽和によって沈殿した。

【００２３】活性のある硫酸アンモニウム画分を10mM酢
酸バッファーｐＨ5.6 に対して透析し、CM- セルロース
クロマトグラフィーにかけた。樹脂は10mM酢酸ナトリウ
ムバッファーｐＨ5.6 で平衡化した。サンプルを通した
後、カラムを平衡化バッファーで洗浄した。次にカラム
を、0.1M、0.2M、0.5M、および１M のNaClを含む各50ml
の10mM酢酸ナトリウムバッファーｐＨ5.6 で連続的に洗
浄した。FMP の大部分（およそ95％）は樹脂に結合しな
かった。保持されなかったFMP 画分をPM-30 膜を用いて
アミコン限外濾過によって濃縮し、バッファーI に対し
て透析した。次に、透析したFMP 画分をConA- セファロ
ースアフィニティークロマトグラフィーにかけた。FMP
はConAアフィニティーマトリックスに結合する。バッフ
ァーI でカラムを適当に洗浄後、FMP を0.5Mα- メチル
-D- マンノピラノシドで溶出した。次にFMP 活性画分を
PM-30 膜を使用してアミコン限外濾過により濃縮し、次
にリン酸緩衝生理食塩水（PBS ：0.9 ％Naclを含む50mM
リン酸ナトリウムｐＨ7.0）に対して透析した。

【００２４】次に、透析したFMP を予めPBS で平衡化し
ておいたセファクリルS-200 ゲル濾過カラム（１ｘ50c
m）でクロマトグラフィーを行なった。１mlの画分をLKB
フラクションコレクターで集めた。FMP の溶出プロフ
ィールは280nm の吸光度によりモニターした。FMP 活性
画分を集め、PM-30 膜を用いてアミコン限外濾過により
濃縮し、10mMリン酸カリウムバッファーｐＨ8.0 に対し
て透析した。次に、生じたFMP 調製物をヒドロキシアパ
タイトカラム（１ｘ５cm）にかけた。FMP はヒドロキシ
アパタイトゲルに吸着し、100mM リン酸カリウムバッフ
ァーｐＨ8.0 で溶出した。FMP 活性画分を集めアミコン
限外濾過によって濃縮し、-70 ℃に保存した。全ての単
離ステップは０〜４℃でおこなった。この因子はおよそ
400 倍に20％の回収率で精製された。単離したFMP はほ
ぼ90％の純度であった。500ml のEP調製物（約4.8gのタ
ンパク質を含む）から2.6mg の部分精製FMP を得た。

【００２５】本発明の主要な利点は、精巣上体からの新
規な産物を開発したことであり、それは多数の利用法の
可能性を有する：１．FMP の抗体は雄性配偶子の稔性に必須である、精子
- 前進運動を強く阻害し、これはFMP 抗体が雄性稔性を
抑制する可能性を示すものである。従ってFMP は避妊ワ
クチンとして機能する可能性を有する。２．ヒトの不妊の重要な理由の一つは精子の運動能の低
さである。精子の稔性に必須の精子前進運動の促進因子
として、FMP はヒトの不妊問題のいくらかを除去する可
能性を有している。３．また家畜の精子の何らかの運動能欠損はこれらの動
物の育種に関して不都合な影響も与える。動物の生産物
が世界経済において重要な役割を果たすことはよく報告
されている。従って、精子前進運動の促進因子として、
FMP は家畜の育種を改良するために非常に高い応用可能
性を有しており、これによりミルク、肉、皮、ウール等
の、動物の種々の生産物を増加させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ビジャイシャンカルジャイスワルインドウェストベンガル 700032 カルカッタジャダヴプルラジャスボドチャンドラムーリックロード４インディアンインスティテュートオブケミカルバイオロジー (56)参考文献Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．，Ｖｏｌ．９（５），ｐ．371−380（1986) Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，Ｖｏｌ. 20（２），ｐ．247−252（1979) Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，Ｖｏｌ. 19（４），ｐ．830−835（1978) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 253（19），ｐ．6744−6750（1978) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/47 C07K 1/16 C07K 1/18 C07K 1/22 A61K 31/00 A61K 38/00 ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヤギ精巣上体プラズマから単離された、
125KDaの分子量を有する新規な前進運動性タンパク質。
【請求項２】 70KDaおよび54KDaの２つのサブユニット
を含む、請求項１の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項３】 4.75の等電点を有する酸性タンパク質で
ある、請求項１に記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項４】 Ca²⁺およびMg⁺²で活性化される、請求項
１に記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項５】 100℃において３分間の熱処理に安定で
ある、請求項１に記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項６】糖タンパク質である、請求項１に記載の
新規な前進運動性タンパク質。
【請求項７】糖残基としてマンノース、ガラクトース
およびＮ−アセチルグルコサミンを有する、請求項１に
記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項８】糖側鎖が活性に必須である、請求項１に
記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項９】タンパク質部分が活性に必須である、請
求項１に記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項１０】精子運動の活性化に対して高いタンパ
ク質特異性を有する、請求項１に記載の新規な前進運動
性タンパク質。
【請求項１１】精子の前進運動活性化について30μg/
mlの濃度で最適活性である、請求項１に記載の新規な前
進運動性タンパク質。
【請求項１２】強い免疫原性である、請求項１に記載
の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項１３】その抗体が精子の前進運動を強く阻害
することにより避妊ワクチンとしての可能性を有する、
請求項１に記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項１４】精巣上体尾部プラズマに高濃度で現れ
る、請求項１に記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項１５】精子頭部の外表面に局在する、請求項
１に記載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項１６】精巣上体未熟精子においてin vitroで
前進運動を開始させるために必要である、請求項１に記
載の新規な前進運動性タンパク質。
【請求項１７】ヤギ精巣上体プラズマから請求項１に
記載の新規な前進運動性タンパク質を単離する方法であ
って、ヤギ精巣上体プラズマを分画すること、前記分画
された精巣上体プラズマから前記運動性タンパク質をク
ロマトグラフィー法によって精製することを含む方法。
【請求項１８】分画が70％飽和までの濃度の硫酸アン
モニウムを用いて行なわれる、請求項１７に記載の方
法。
【請求項１９】タンパク質の精製がイオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、吸
着クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー
および高性能液体クロマトグラフィーによって行なわれ
る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】クロマトグラフィーに用いられるイオ
ン交換樹脂が、カルボキシメチル-セルロース／セファ
デックス、ジエチルアミノエチル-セルロース／セファ
デックス、PBE94樹脂と称されるポリバッファー交換体
から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】吸着クロマトグラフィーに用いられる
材料がアルミナゲルおよびバイオラッドのヒドロキシア
パタイトから選ばれる、請求項１７に記載の方法。