JP3490085B2

JP3490085B2 - 構造エピトープを有する抗原を用いる抗ｈｃｖ抗体のイムノアッセイ

Info

Publication number: JP3490085B2
Application number: JP50344094A
Authority: JP
Inventors: ワイ．チエン，デイビッド
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1992-07-07
Filing date: 1993-07-02
Publication date: 2004-01-26
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: SK284556B6; CZ291951B6; FI950002L; NO950006D0; AU4662993A; CZ695A3; JP2003329687A; EP0649537B1; DK0649537T4; ES2171414T3; RU2126158C1; PL307178A1; HUT70473A; HU9500008D0; UA39944C2; DK0649537T3; ES2171414T5; NO950006L; SK495A3; FI110546B

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）感染の広がりを
管理するための物質および方法論に関する。より特定す
れば、本発明は、HCV感染の検出、予防および治療、な
らびにイムノアッセイおよびそれに用いるキットに有用
なポリペプチド免疫剤に関する。

背景 HCVは、輸血後非A,非Ｂ肝炎（NANBH）の主な原因とし
て、Houghtonらによって最初に同定および特徴付けられ
た。HCVに関する実質的な情報を提供することに加え
て、Houghtonら、および彼らの共同研究者達は、多数の
一般的および特異的免疫剤および方法を開示した。例え
ば、以下の文献を参照のこと： Houghtonら、EPO第318,216号;Houghtonら、EPO第388,23
2号;Chooら、Science（1989）244:359〜362;Kuoら、Sci
ence（1989）244:362〜364;Takeuchiら、J.Gen.Virol.
（1990）71:3027〜3033;Takeuchiら、Gene（1990）91:2
87〜291;Takeuchiら、Nucl.Acids Res.（1990）18:462
6;Miyamuraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1990）87:983
〜987:Saitoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1990）87:65
47〜6549;Chooら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1991）88:
2451〜2455;Hanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 1711〜
1715;Houghtonら、Hepatology（1991）14:381〜388;Wei
nerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1992）89:3468〜347
2。これらの文献は、HCV一般ならびにHCVポリペプチド
免疫剤の製造および使用に関して、当該技術に広範囲な
背景を提供する。簡単のために、従って、これらの文献
の開示は、特に本明細書中に参考として援用されてい
る。

Houghtonらの研究は、さらに応用および展開された。
例えば、以下の文献を参照のこと:Highfieldら、UK特許
出願第2,239,245号（The Welcome Foundation Ltd.）;W
ang、EPO第442,394号（United Biomedical Inc.）;Leun
gら、EPO第445,423号（Abbott Laboratories）;Habits
ら、EPO第451,891号（Akzo N.V.）;Reyesら、PCT第WO 9
1/15516号（Genelabs Inc.）;Makiら、EPO第468,657号
（Tonen Corp.）；およびKamadaら、EPO第469,348号（S
hionogi Seiyaku K.K.）。以下の文献もまた参照のこ
と:Matsuuraら、（1992）J.Virology 66:1425;Katoら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1990）87:9524〜9528;Takami
zawaら、J.Virol.（1991）65:1105〜1113;Chibaら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA（1991）88 4641〜4645;Harada
ら、J.Virol.（1990）65:3015〜3021;Hijikataら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA（1991）88:5547〜5551;Okamoto
ら、Jpn.J.Exp.Med.（1990）60:167〜177;Yuasaら、J.G
en.Virol.（1991）72:2021〜2024;Watanabeら、Int.J.G
ancer（1991）48:340〜343。

HCVのキャリアおよびHCV汚染された血液または血液製
剤をスクリーニングおよび同定するための高感度の特異
的な方法は、医学における重要な進歩である。輸血後肝
炎（PTH）は輸血した患者の約10％に生じ、これらの症
例の90％までHCVが原因であった。この疾患の主な問題
点は、他の肝炎（例えば、Ｂ型）と比較して、慢性的な
肝臓障害に頻繁に進行することである（22〜55％）。

患者の看護、および、血液および血液製剤または親密
な個人的接触によるHCVの伝染の予防には、HCVに関する
抗体を検出するための信頼性のある診断および予後手段
（例えば、HCVポリペプチド）が必要である。このよう
なポリペプチドはまた、疾患の予防および／または治療
のためのワクチンおよび免疫療法治療薬として有用であ
る。HCVは比較的新しい因子であるので、疾患の臨床経
過および集団におけるHCVの疫学のさらなる研究を与え
得る追加の免疫剤を明らかにすることが継続的に必要と
される。

発明の開示出願人らは、HCV抗原に関するさらなる血清学的研究
を行い、そして構造エピトープを保持するHCVエンベロ
ープ抗原を利用するイムノアッセイが、直鎖状エピトー
プを有する同じ抗原を利用するアッセイよりも、抗HCV
抗体を検出するのにさらに有効であることを発見した。

従って、本発明の一つの局面は、Ｃ型肝炎ウイルス
（HCV）に対する抗体を含む疑いのあるほ乳類生体成分
中の該抗体を検出する方法であって、該生体成分を、HC
VのE1またはE2ドメイン由来の構造エピトープを含むHCV
抗原と、（もし存在すれば）該抗体と該抗原との間の免
疫反応を行わせる条件下で接触させる工程、および該抗
体と該抗原との（もし存在すれば）免疫複合体の存在を
検出する工程を包含する。

他の実施態様において、本発明の方法は、抗原がE1お
よび／またはE2ドメイン中にコードされ、またはE1およ
び／またはE2抗原である。ある実施態様においては、抗
原はワクチニアベクターから発現し得るか、またはCHO
細胞中で発現し得る。さらに、本発明の特定の実施態様
においては、別の構造エピトープから構成される第二の
抗原が含まれる。

本発明の別の局面は、血液製剤を調製するために血液
または血液成分を使用する前に、そのような血液または
血液成分をHCVについてスクリーニングする方法であっ
て、 a.潜在的な供与者由来の生体成分を、HCVのE1またはE2
ドメイン由来の構造エピトープを含むHCV抗原と、（も
し存在すれば）該生体成分中の抗体と該抗原との間の免
疫反応を行わせる条件下で反応させる工程； b.該抗原と該抗体との間で形成される複合体を、もし存
在すれば、検出する工程；および c.該複合体が工程ｂで検出される場合に該供与者からの
すべての血液または血液成分を捨てる工程、を包含す
る。

本発明のさらに別の局面は、HCV抗体を検出するキッ
トであって、適切なバイアル中に荷造りされた、HCVのE
1またはE2ドメイン由来の構造エピトープを含むHCV抗
原、および対照標準物、ならびに該キット成分の使用の
指示を含む。

図面の簡単な説明図１は、HCVポリタンパク質の推定されるドメインを
示す図である。

図２は、ベクターpSC59のいくつかの特徴を示す図で
ある。

図3A、3Bおよび3Cは、個々のHCV抗原に対するELISAア
ッセイに陽性のグループＩ、IIおよびIIIの患者の割合
を示す。

発明の詳細な説明「HCV抗原」とは、少なくとも一つのHCVエピトープを
規定するアミノ酸配列（および／またはアミノ酸類似
体）を包含する、ポリペプチドまたはポリペプチド類似
体（例えば、ミミトープ（mimitope））を意味する。代
表的には、エピトープを規定する配列は、HCVタンパク
質のアミノ酸配列に相当する（同一であるか、またはエ
ピトープを破壊しないネイティブのアミノ酸残基の類似
体で置換されている）。一般に、エピトープを規定する
配列は、５個またはそれ以上のアミノ酸の長さであり、
より代表的には８個またはそれ以上のアミノ酸の長さで
あり、そしてよりさらに代表的には10個またはそれ以上
のアミノ酸の長さである。構造エピトープに関しては、
エピトープを規定する配列の長さはさまざまな変化を受
け易く、なぜならこれらのエピトープは三次元形態の抗
原（例えば、ひだ（folding）形成）より形成されると
考えられるからである。従って、エピトープを規定する
アミノ酸は、比較的数は少なく、分子長にそって（また
は、二量体などの場合では異なる分子上にさえも）広く
散在し得、ひだ形成を介して正しいエピトープ構造をも
たらす。エピトープを規定する残基の間の抗原の部分
は、構造エピトープの構造に対して重要であり得ない。
例えば、構造エピトープに重要な配列が維持されている
ならば（例えば、ジスルフィド結合を伴ったシステイ
ン、グリコシル化部位など）、これらの介在する配列が
欠失または置換されても構造エピトープに影響し得な
い。

本発明のHCV抗原は、HCVのE1および／またはE2（エン
ベロープ）ドメイン由来の構造エピトープを含む。E1ド
メイン（ウイルスエンベロープタンパク質に相当すると
考えられる）は、HCVポリタンパク質のアミノ酸192位〜
383位の範囲にあると現在推定されている（PCT公開番号
WO91/15771、図１）。CHO系（グリコシル化）における
発現では、SDS−PAGEにより決定されるように、約35Kd
の分子量を有すると考えられている。E2タンパク質（以
前はNS1と称されていた）は、ポリタンパク質のアミノ
酸384位〜800位の範囲にあると考えられており、そして
またエンベロープタンパク質であると考えれている。CH
O系（グリコシル化）における発現では、約72Kdの見か
けのゲル分子量を有すると考えられている。これらのタ
ンパク質の終点は近似値であることが理解される（例え
ば、E2のカルボキシ末端は750位〜820位のアミノ酸領域
のどこかに存在し得る）。前述のPCT出願中のプロトタ
イプ単離物のHCV1配列は、例示目的のみのため引用され
ていること、そして本発明の実施には任意のHCV単離物
（例えば、「背景」のセクションで引用した参考文献を
参照のこと）が、E1および／またはE2配列の適切な供給
源であることがまた理解される。

本発明に用いられるE1およびE2抗原は、完全長のウイ
ルスタンパク質、実質的に完全長であるそれらの変形
物、またはそれらの機能的フラグメント（例えば、構造
エピトープの形成または保持に必須の配列を欠いていな
いフラグメント）であり得る。さらに、本発明のHCV抗
原はまた、目的の構造エピトープの形成をブロックまた
は妨害しない他の配列を包含し得る。構造エピトープの
存在または不在は、目的の抗原を抗体（ポリクローナル
の血清または構造エピトープに対してモノクローナル）
でスクリーニングし、そしてその反応性と（存在すれ
ば）直鎖状エピトープのみを保持する変性型の抗原の反
応性とを比較することにより容易に決定され得る。ポリ
クローナル抗体を用いるそのようなスクリーニングにお
いては、最初にポリクローナル血清を変性抗原で吸着
し、そしてそれが目的の抗原に対する抗体を保持してい
るかどうかを観察することが有利であり得る。

本発明のHCV抗原は、目的の構造エピトープを提供す
る任意の都合のよい方法で作成され得る。例えば、ほ乳
類または昆虫細胞における組換え発現は、分泌グリコシ
ル化E1および／またはE2抗原を「ネイティブな」構造
（“native"conformation）で提供する好適な方法であ
る。しかし、タンパク質について知られているように、
他の組換え宿主で抗原を発現し、そして回収後にタンパ
ク質を再生することもまた可能である。化学合成もま
た、「ネイティブな」抗原の構造エピトープと交差反応
する構造ミミトープ（mimitope）を提供し得ることが理
解される。

１つ以上のE1またはE2モノマーを含むE1および／また
はE2の複合体（凝集体とも呼ばれる）はまた、好適な抗
原である。E1:E1ダイマー、E2:E2ダイマー、およびE1:E
2ヘテロダイマーはすべて、本発明の範囲内にある抗原
である。凝集体はまた、より大きい形態を包含し得、そ
して800kDを超える分子量を有し得る。

用語「融合ポリペプチド」は、HCV抗原が、アミノ酸
の単一かつ連続の鎖（この鎖は天然にはない。）の部分
であるポリペプチドを意味する。HCV抗原は、ペプチド
結合により互いに直接に結合し得、または介在するアミ
ノ酸配列により分離され得る。融合ポリペプチドはま
た、HCVに対して外因性のアミノ酸配列を含有し得る。

用語「共通の固体マトリックス」は、個々のHCV抗原
またはHCV抗原を含む融合ポリペプチドが、共有結合に
よりまたは疎水吸着のような非共有結合手段により結合
する固体を意味する。

用語「生体成分」は、個体により産生される抗体を通
常含む、ほ乳類個体（例えば、類人猿、ヒト）の流体ま
たは組織を意味する。そのような成分は、当該技術分野
で公知であり、そして、制限されないが、血液、血漿、
血清、脊椎液、リンパ液、分泌物（呼吸器、腸管または
尿生殖器の）、涙、唾液、乳、白血球、および骨髄腫を
含む。生体成分は、生物学的液体を含む。用語「生物学
的液体」は生物体から得られた流体をいう。いくつかの
生物学的流体は、凝血因子（例えば、第VIII:C因子）、
血清アルブミン、成長ホルモンなどのような他の産物の
供給源として使用される。そのような場合、生物学的流
体の供給源はHCVなどのウイルスによる汚染のないこと
が重要である。

用語「免疫学的に反応性」は、問題の抗原が、HCV感
染個体由来の生体成分中に存在する抗HCV抗体と特異的
に反応することを意味する。

用語「免疫複合体」は、抗体が抗原上のエピトープに
結合するとき形成される結合物を意味する。

本明細書で使用される用語「E1」は、ときにＥまたは
Ｓタンパク質と呼ばれる、HCVポリタンパク質の最初の4
00アミノ酸の内で発現されるタンパク質またはポリペプ
チドをいう。その天然の形態において、それは膜と強固
に会合して見いだされる35kDの糖タンパク質である。大
部分の天然HCV株で、このE1タンパク質は、ウイルスポ
リタンパク質中でＣ（コア）タンパク質に続いてコード
される。E1タンパク質は、完全長ポリタンパク質のアミ
ノ酸約192位から約383位まで拡がる。本明細書で使用さ
れる用語「E1」はまた、天然のE1と免疫学的に交差反応
する類似体および短縮形態を含む。

本明細書で使用される用語「E2」は、ときにNS1タン
パク質と呼ばれる、HCVポリタンパク質の最初の900アミ
ノ酸の内で発現されるタンパク質またはポリペプチドを
いう。その天然の形態では、それは膜と強固に会合して
見いだされる72kDの糖タンパク質である。大部分の天然
のHCV株では、E2タンパク質は、ウイルスポリタンパク
質中でE1タンパク質に続いてコードされる。E2タンパク
質は、アミノ酸約384位から約820位まで拡がる。本明細
書で使用される用語「E2」はまた、天然のE2と免疫学的
に交差反応する類似体および短縮形態を含む。

本明細書で使用される用語「凝集体」は、１つ以上の
E1またはE2モノマーを含むE1および／またはE2の複合体
をいう。E1:E1ダイマー、E2:E2ダイマー、およびE1:E2
ヘテロダイマーはすべて、本定義の範囲内の「凝集体」
である。凝集体はまた、より大きい形態を包含し得、そ
して800kDを超える分子量を有し得る。

本明細書でタンパク質に適用される用語「精製され
た」は、所望のタンパク質が組成物中で全タンパク質成
分の少なくとも35％を占める組成物についていう。所望
のタンパク質は、好適には、全タンパク質成分の少なく
とも40％、より好適には少なくとも約50％、より好適に
は少なくとも約60％、さらにより好適には少なくとも約
70％、なおより好適には少なくとも約80％、なおより好
適には少なくとも約90％、そして最も好適には少なくと
も約95％を占める。組成物は、本明細書で使用される純
度百分率の決定に影響することなく、炭水化物、塩、脂
質、溶媒などの他の成分を含有し得る。「単離された」
HCVタンパク質とは、少なくとも35％の純度であるHCVタ
ンパク質組成物を意味する。

用語「単離されたポリペプチド」は、他のHCVウイル
ス成分、特にゲノムHCVポリヌクレオチドが実質的に無
いポリペプチドをいう。組成物中のポリペプチドの重量
が、ポリペプチドおよび他の成分を組み合わせた重量の
少なくとも70％、より好適には少なくとも約89％、なお
より好適には約90％、そして最も好適には95％またはそ
れ以上であれば、ポリペプチド組成物には別の成分が
「実質的にない」という。

発明を実施する様式本発明のイムノアッセイ法は、E1およびE2ドメイン由
来であって、HCVに感染した個体の血清中の抗体により
認識される構造エピトープを維持するHCV抗原を利用す
る。各抗原は、抗原とHCV感染個体由来の生体成分中の
抗体との免疫反応性、および抗原の変性によるエピトー
プの免疫反応性の損失により証明されるように、天然に
存在するHCV粒子またはその感染性生成物中にある少な
くとも１つの構造エピトープを有する。抗原の長さは、
そのエピトープに関連する免疫反応性構造エピトープを
維持するために充分である。１つの抗原上に１つ以上の
構造エピトープを有することは本発明の範囲内である。
しばしば、イムノアッセイで使用されるネイティブなエ
ンベロープ抗原はほとんど完全長であり得るが、例え
ば、溶解度を増加するために、または分泌を改善するた
め（例えば膜結合ドメインの欠失）に、短縮され得る。
単一の抗原、あるいは抗原の組み合わせまたは凝集体の
いずれを使用することも本発明の範囲内である。従っ
て、イムノアッセイは、E1エピトープ、E2エピトープ、
ネイティブなE1およびE2の凝集体または組み合わせを使
用し得る。直鎖状のエピトープを有する抗原をHCVエン
ベロープ構造エピトープと組み合わせて使用することも
本発明の範囲内にある。

構造エピトープの存在を検出する方法は当該技術分野
で公知であり、そしていくつかは以下の実施例で説明さ
れる。

HCV1のヌクレオチド配列中にコードされる推定アミノ
酸および他の証拠に基づき、コードされるHCVポリタン
パク質の可能なタンパク質ドメインおよびおおよその境
界は以下のとおりである：これらのドメインは、しかし、暫定的なものである。例
えば、E1−NS2境界は多分750−810領域中にあり、そし
てNS3−NS4領域は約1640−1650である。Ｃの191アミノ
酸形態は、さらにプロセッシングされる（例えば、約17
0アミノ酸の長さまで）前駆体であり、そして、NS2、NS
4およびNS5タンパク質はそれぞれ２つの成熟タンパク質
にプロセッシングされる証拠もある。これらドメインの
関係が図１に示される。

ネイティブな構造を有するE1およびE2抗原を含むE1お
よびE2抗原を調製する方法は、Spaete R.ら、Virology
（1992）188:819−830およびWO92/08734中に記載され、
これらは本明細書に参考として援用される。一般に、宿
主細胞としては、発現されるエンベロープタンパク質内
にネイティブな構造エピトープを形成させる宿主が選択
され；これら宿主細胞は、例えば、動物細胞、昆虫細
胞、酵母細胞などを包含し得る。

真核性宿主は、培養系中の酵母およびほ乳類細胞を含
む。Saccharomyces cerevisiaeおよびSaccharomyces ca
rlsbergensisは、最も一般的に使用される酵母宿主であ
り、そして便利な真菌宿主である。酵母適合ベクター
は、栄養要求性変異株に原栄養性、または野生型株に重
金属耐性を付与することにより形質転換体の選択を可能
にするマーカーを担持する。酵母適合ベクターは、複製
の２ミクロン複製起点（Broachら、（1983）Meth.Enz.1
01:307.）、CEN3およびARS1の組み合わせ、または宿主
細胞ゲノム中への適切なフラグメントの取り込みをもた
らす配列のような、複製を確実にする他の手段を使用し
得る。酵母ベクターの制御配列は、当該技術分野で公知
であり、そして、３ホスホグリセレートキナーゼ（Hitz
eman（1980）J.Biol.Chem.255:2073）を含む、解糖系酵
素合成のためのプロモーター（Hessら（1968）J.Adv.En
zyme Reg ７:149;Hollandら、（1978）Biochemistry 1
7:4900）を含む。エノラーゼ遺伝子由来のターミネータ
ー（Holland（1981）J.Biol.Chem.256:1385.）などのタ
ーミネーターもまた含有され得る。特に有用な制御系
は、グリセルアルデヒド−３ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ（GAPDH）プロモーターまたはアルコールデヒドロ
ゲナーゼ（ADH）調節可能なプロモーター、やはりGAPDH
に由来するターミネーター、そして分泌が望まれる場合
は、酵母アルファーファクター由来のリーダー配列を含
む制御系である。さらに、作動可能に連結された転写調
節領域および転写開始領域は、野生型生物において天然
には結合しないようなものであり得る。これらの系は、
1984年10月３日に公開されたEPO第120,551号;1984年８
月22日に公開されたEPO第116,201号；および1985年12月
18日に公開されたEPO第164,556号中に詳細に記載され、
これらすべては本発明の譲受人に譲渡され、そして本明
細書に参考として援用される。

発現宿主として利用可能なほ乳類細胞系は、当該技術
分野で公知であり、そしてHeLa細胞を含む、アメリカン
タイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手可能な
多くの不死化細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、および多
くの他の細胞系を含む。ほ乳類細胞に適するプロモータ
ーもまた、当該技術分野で公知であり、そしてシミアン
ウイルス40（SV40）（Fiers（1978）Nature 273:11
3）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、アデノウイルス（AD
V）、およびウシパピローマウイルス（BPV）などのウイ
ルスプロモーターを含む。ほ乳類細胞はまた、ターミネ
ーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし得る；発現
を増加するエンハンサー配列もまた含まれ得、そして遺
伝子の増幅を引き起こす配列もまた所望され得る。これ
らの配列は当該技術分野で公知である。

ほ乳類細胞中での複製に適するベクターは当該技術分
野で公知であり、そしてウイルス複製単位（レプリコ
ン）、または宿主ゲノム中へのNANBVエピトープをコー
ドする適切な配列の組み込みを確実にする配列を含有し
得る。

外来DNAを発現するために使用されるベクターであっ
て、ワクチン調製に使用され得るベクターがワクチニア
ウイルスである。この場合、異質のDNAがワクチニアゲ
ノム中に挿入される。外来DNAのワクチニアウイルスゲ
ノム中への挿入手法は、当該技術分野で公知であり、そ
して例えば、相同組換えを利用する。異質DNAの挿入
は、一般に生来必須でない遺伝子、例えば、チミジンキ
ナーゼ遺伝子（tk）中であり、それはまた選択可能なマ
ーカーを提供する。組換えウイルスの構築を多大に促進
するプラスミドベクターが記載されている（例えば、Ma
ckettら（1984）J.Virol.49:857.、Chakrabartiら（198
5）Mol.Cell Biol.５:3403;GENE TRANSFER VECTORS FOR
MAMMALIAN CELLS（MillerおよびCalos編、Cold Spring
Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,N.Y.）、p.1
0.中のMoss（1987）参照）。次いで、HCVポリペプチド
の発現が、細胞、または生きている組換えワクチニアウ
イルスで免疫化された個体中で起こる。

所望の配列をコードするHCV CDNAのセグメントが、ワ
クチニアベクター中に挿入される。ポリペプチドをコー
ドする配列は、リーダー配列に付着され得る。リーダー
配列は、組織プラスミノゲン活性化因子（TPA）のリー
ダー配列、または例えば、β−グロビンのリーダー配列
のような別の起源由来であり得る。異質のポリヌクレオ
チドは、クローニング部位を含むポリリンカー配列の付
加による、pSC11の改変形態である、ワクチニアベクタ
ー中に挿入され得る。

HCVポリペプチドが、ワクチニアベクターから発現さ
れるか否か検出するために、BSC 1細胞は組換えベクタ
ーで感染され得、そして発現を許容する条件下で顕微鏡
スライド上で成長され得る。次いで、細胞はアセトン固
定化され得、そして組換え発現ベクター中のHCVセグメ
ントが由来したHCVゲノム領域中にコードされるポリペ
プチドに対する抗HCV抗体を含むことが知られている血
清を用いて免疫蛍光アッセイが実行され得る。

真核性またはウイルスゲノムの発現のための他の系
は、昆虫細胞およびこれら細胞中の使用に適したベクタ
ーを含む。これらの系は、当該技術分野で公知であり、
そして例えば、ヘルパー非依存性のウイルス発現ベクタ
ーである、バキュロウイルスAutographa californica核
多角体病ウイルス（AcNPV）に由来する昆虫発現転移ベ
クターを含む。この系に由来する発現ベクターは、通
常、強力なウイルス多角体病遺伝子プロモーターを使用
し、異質遺伝子の発現を行う。目下のところ、AcNPV中
に外来遺伝子を導入するために最も一般的に使用される
転移ベクターはpAc373である。当業者に公知の、多くの
他のベクターがまた、改善された発現のために設計され
た。これらは、例えば、pVL985（多角体病遺伝子（poly
hedrin）開始コドンをATGからATTに変え、そしてATTか
ら32塩基対下流にBamHIクローニング部位を導入;Luckow
およびSummers（1989）Virology 17:31参照）を含む。
融合していない外来タンパク質の良好な発現には、通
常、ATG開始信号に先行する適切な翻訳開始信号を含
む、短いリーダー配列を理想的に有する外来遺伝子を必
要とする。プラスミドはまた、多角体病遺伝子ポリアデ
ニル化信号およびアンピシリン耐性（amp）遺伝子、な
らびにE.coli中での選択および増殖のための複製起点を
含有し得る。

バキュロウイルス中の所望の部位に異質DNAを導入す
る方法は当該技術分野で公知である（SummerおよびSmit
h、Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
No.1555;Juら（1987）;Smithら（1983）Mol.＆ Cell Bi
ol.３:2156−2165;およびLuckowおよびSummers（1989）
Virology 17:31参照）。例えば、挿入は、相同組換えに
より、多角体病遺伝子のような遺伝子中であり得；挿入
はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子中に作成された
制限酵素部位中であり得る。挿入される配列は、ポリタ
ンパク質の全てのまたは変化するセグメントをコードす
る配列、またはウイルスポリペプチドをコードする他の
オープンリーディングフレームであり得る。

シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およ
びリン酸化などの、翻訳後の修飾のための信号は、昆虫
細胞により認識されるようである。分泌および核蓄積に
必要な信号はまた、無脊椎動物細胞および脊椎動物細胞
間で保存されているようである。無脊椎動物細胞中で有
効な脊椎動物細胞由来のシグナル配列の例は当該技術分
野で公知であり、例えば、細胞外への輸送のための信号
であるヒトインターロイキン−２シグナル（IL−２）
は、昆虫細胞中で認識されそして適切に除去される。

イムノアッセイ法本発明のHCV E1およびE2抗原は、抗体を検出するため
に既知の抗原を用いる実質上すべてのアッセイ方法にお
いて用いられ得る。もちろん、目的のHCV構造エピトー
プを変性する方法は避けるか、改変されるべきである。
これらのアッセイのすべての共通の特徴は、HCV抗体を
含む疑いのある生体成分と抗原とを、抗原を生体成分中
に存在するそのような任意の抗体と結合する条件下で接
触させるということである。このような条件は、代表的
には、生理学的温度、pHおよび過剰の抗原を用いるイオ
ン強度である。抗原を標本とインキュベーションし、次
いで抗原を含む免疫複合体を検出する。

イムノアッセイのデザインには、多数の変法があり、
そして多くの方法が当該分野で公知である。例えば、プ
ロトコルには、固体支持体または免疫沈降法が用いられ
得る。大部分のアッセイは、標識化抗体またはポリペプ
チドの使用を含む；これらの標識は、例えば、酵素、蛍
光、化学発光、放射活性、または色素分子であり得る。
免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた公
知である；それらの例としては、ビオチンおよびアビジ
ンを利用するアッセイ、および、ELISAアッセイのよう
な酵素標識化および酵素介在性イムノアッセイがある。

イムノアッセイは、限定はされず、不均一系での方法
または均一系での方法であり得、そして標準型または競
合型であり得る。不均一系の方法では、ポリペプチド
は、代表的には、インキュベーション後、ポリペプチド
からの試料の分離を容易にするための固体マトリックス
または固体支持体に結合する。用いられ得る固体支持体
の例としては、ニトロセルロース（例えば、膜またはマ
イクロタイターウェル形態で）、ポリビニルクロライド
（例えば、シートまたはマイクロタイターウェルで）、
ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイク
ロタイタープレートで）、ポリビニリジンフルオライド
（Immunlon^TMとして知られる）、ジアゾ化紙、ナイロン
膜、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズがある。
例えば、Dynatech Immunlon^TM1またはImmunlon^TM2マイ
クロタイタープレートまたは0.25インチポリスチレンビ
ーズ（Precision Plastic Ball）が、不均一系での方法
において用いられ得る。抗原性ポリペプチドを含有する
固体支持体は、代表的には、試験試料からその固体支持
体を分離した後に、そして結合抗体を検出する前に、洗
浄される。標準型の方法および競合型の方法は共に、当
該分野では公知である。

均一系の方法では、試験試料は、溶液中の抗原と組み
合わせてインキュベートされる。例えば、それは、形成
される任意の抗原−抗体複合体が沈降され得る条件下で
行われ得る。これらのアッセイの標準型の方法および競
合型の方法は共に、当該分野では公知である。

標準型の方法では、抗原−抗体複合体中のHCV抗体の
量は、直接、モニターされる。これは、抗HCV抗体上の
エピトープを認識する標識化抗異種（例えば、抗ヒト）
抗体が、複合体形成により結合し得るかどうかを決定す
ることにより、行われ得る。競合型の方法では、試料中
のHCV抗体の量は、複合体における既知量の標識化抗体
（または他の競合リガンド）の結合に対する競合効果を
モニターすることにより推定される。

形成された抗HCV抗体を含む複合体（または、競合ア
ッセイの場合には競合抗体の量）は、方法に依存して、
多くの既知の手法のいずれかによっても検出される。例
えば、複合体中の非標識化HCV抗体は、標識（例えば、
酵素標識）で複合化された抗異種Igの複合体を用いて検
出され得る。

イムノ沈降アッセイまたは凝集反応アッセイの方法で
は、HCV抗原と抗体との間の反応は、溶液または懸濁液
から沈降する網目状物（network）を形成し、そして肉
眼で見える沈降物の層またはフィルムを形成する。抗HC
V抗体が試験標本中に存在しない場合、肉眼で見える沈
降物は形成されない。

現在、３つの特異的な型の粒子凝集反応（PA）アッセ
イが存在する。これらのアッセイは、支持体にコーティ
ングされる場合、種々の抗原に対して抗体を検出するた
めに用いられる。このアッセイの１つの型は、赤血球
（RBC）を用いる赤血球凝集反応アッセイであり、このR
BCは、RBCに吸着する抗原（または抗体）により受動的
に感作される。生体成分中に存在する特異的抗原抗体の
添加は、もし存在すれば、精製抗原でコーティングされ
たRBCを凝集させる。

赤血球凝集反応アッセイにおける潜在的な非特異的反
応を排除するために、２つの人工担体がPA反応において
RBCの代わりに使用され得る。これらのうち最も一般的
なものは、ラテックス粒子である。しかし、ゼラチン粒
子もまた使用され得る。これらの担体のいずれかを利用
するアッセイは、精製抗原でコーティングされた粒子の
受動的凝集反応に基づいている。

構造エピトープを含むHCV E1およびE2抗原は、代表的
には、これらのイムノアッセイにおいて使用されるため
のキットの形態でパッケージされる。このキットは、通
常は、別々の容器中に、ネイティブなHCV抗原、対照の
抗体調製物（陽性および／または陰性）、そのアッセイ
方法が標識化抗体を必要とする場合には標識化抗体、お
よび、標識が直接シグナルを生成しないならばシグナル
生成試薬（例えば、酵素基質）を含む。ネイティブなHC
V抗原は、固体マトリックスに既に結合しているか、ま
たはその抗原をマトリックスに結合させるための試薬と
は別々であり得る。このアッセイを行うための指示書
（例えば、書面、テープ、CD−ROMなど）が、通常、キ
ット内に含まれ得る。

ネイティブなHCV抗原を利用するイムノアッセイは、
潜在的に感染性HCVのない供給品を調製するための血液
をスクリーニングするのに有用である。血液供給品を調
製する方法は以下の工程を含む。血液供与者からの生体
成分（好ましくは、血液または血液成分）を、HCV抗体
（もし存在すれば）とHCV抗原との間の免疫学的反応を
可能にするために、ネイティブなHCV E1またはネイティ
ブなHCV E2抗原と反応させる工程。抗HCV抗体−HCV抗原
複合体が上記反応の結果として形成されるかどうかを検
出する工程。血液製剤に拠出される血液は、ネイティブ
なHCV抗原、すなわちE1またはE2に対する抗体を示さな
い供与者からのものである。

HCV抗原に対する陽性の反応性の場合において、疑陽
性の可能性を小さくするためにイムノアッセイを繰り返
すのが好ましい。例えば、血液製剤（例えば、輸血、血
漿、第VIII因子、免疫グロブリンなど）を製造するため
の血液の大規模スクリーニングにおいて、「スクリーニ
ング」試験は、代表的には、特異性を犠牲にして、（汚
染血液が合格しないことを確実にするために）フォーマ
ット化されて感度を増大させる；すなわち、疑陽性の割
合が増加する。従って、代表的には、「繰り返し反応
性」（すなわち、供与試料についてイムノアッセイを２
回またはそれ以上実施した場合に陽性）である疑陽性の
供与者をさらに試験するために繰り延べるだけである。

以下の実施例は、本発明を例示することを意図し、そ
していかなる方法でも本発明を限定することを意図しな
い。

実施例１ PSC59ポリの構築この構築に用いられるHCV配列を、プラスミドpC5P−
１からStu I（部分消化）/Bgl IIフラグメントとして単
離した。このフラグメントは、HCV−１のポリタンパク
の最初のメチオニンから966位のアスパラギン酸まで延
びている。含まれるドメインは、それぞれ、ヌクレオキ
ャプシドであるＣ、いずれも推定エンベロープ糖タンパ
クであるE1およびE2、ならびにNS2の短縮型である。さ
らに、そのフラグメントはまた、HCVゲノムの5'−非翻
訳領域部分に対応する約60bpを含む。

クレノウポリメラーゼでこのフラグメントを処理して
平滑末端を作り、次いでワクチニアベクター、すなわち
PSC59（National Institute of Health,Bethesda,Mdの
B.Moss博士から入手）のStu I部位内にクローニングす
る。このベクターを図２に示す。ベクターのポリリンカ
ー配列内への連結反応の結果として、NS2領域のC'末端
は、さらにPro−Tyr配列を含む。

実施例２ E1およびE2を含むHCVポリタンパク質フラグメントをコ
ードするワクチニアウイルスのストックの調製組換えワクチニアウイルスのスクリーニングを、Mack
ettらの「DNA Cloning」第II巻（D.M.Glover編,IRL Pre
ss,Oxford,England,1985,191−211頁）の記載に本質的
に従って、実施した。さらに詳細には、アフリカミドリ
ザルの腎細胞、すなわちBSC40の集密細胞単層（6cm皿）
を、0.05の感染多重度（MOI）で野生型ワクチニアウイ
ルス（WR株）で感染させた。37℃で２時間インキュベー
ション後、リン酸カルシウム法を用いて、25μｇのPSC5
9ポリDNAで細胞をトランスフェクトした。４時間のイン
キュベーション後、培地を正常培地に変え、そして細胞
を37℃でさらに48時間インキュベートした。細胞を皿か
らかき取ることによって細胞を回収し、そして凍結−融
解を３回行うことによってウイルスを放出させ、そして
細胞溶解物中の放出されたウイルスを−80℃で貯蔵し
た。

組換えウイルスをスクリーニングするために、ヒト14
3TK^-細胞に、細胞溶解物の10倍系列希釈液を２時間感染
させた。接種液を除去した後、25μg/mlの５−ブロモデ
オキシウリジンを含有する１％アガロース血清培地を添
加し、そして細胞を37℃で72時間インキュベートした。
0.01％のニュートラルレッドを加えた１％アガロースを
有する細胞層を重層し、そして細胞を37℃で一晩インキ
ュベートすることによって、プラークを肉眼で見えるよ
うにした。次いで、重層アガロースを注意深く除去し、
そして細胞層をマスターニトリセルロースフィルター
（SchleirおよびSchuell,BA85,0.45μｍ）を用いてブロ
ッティングした。マスターフィルターのレプリカプレー
トを作り、そしてHCV配列に対する³²P標識化ハイブリダ
イゼーションプローブでプローブした。陽性プラークを
マスターフィルターから単離し、それらを0.5ml無血清
培地中に置き、そして30秒間ずつ２回超音波処理した。
このスクリーニングプロセスをプラークに２回繰り返し
て、ウイルスを精製した。

組換えワクチニアウイルスを増殖させるために、BSC4
0細胞の10個の皿（150cm²）に0.5のMOIでウイルススト
ックを感染させた。感染を37℃で２時間行い、そしてウ
イルスストックを新鮮培地で置き換えた。72時間後、細
胞を集め、10mM Tris HCl（pH 9.0）中に懸濁し、そし
てWheaton dounce組織破砕機中でホモゲナイズした。細
胞破片を遠心分離によって除去し、上清液をトリプシン
処理および超音波処理し、そしてウイルス懸濁液のアリ
コットを−80℃で貯蔵した。

実施例３ E1/E2抗原の生成１リットルのHela S3撹拌（spinner）細胞を、撹拌フ
ラスコ中で1ml当たり10⁶個細胞の密度まで増殖させた。
HCVポリタンパク質フラグメントをコードする組換えワ
クチニアウイルスを1.0のMOIを用いて細胞に感染させ、
一晩インキュベートし、細胞を集め、そして−80℃で細
胞ペレットとして貯蔵した。

E1/E2発現産物を、低張緩衝液中で細胞を溶解し、続
いて非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中で抽出す
ることにより精製した。細胞抽出物を、レクチン（GN
A）アガロースカラムを通してクロマトグラフィーにか
けた。所望のタンパク質を、メチル−α−Ｄ−マンノピ
ラノシド（Sigma Corp.）を用いてカラムから溶出させ
た。E1またはE2に対して作製された特異的抗血清を用い
て、ウェスタンブロットによりE1およびE2について溶出
フラクションをモニターした。抗原を含むフラクション
をプールし、Ｓ−セファロースカラム（Pharmacia）上
で濃縮した。最終生成物の純度は約70％であった。

実施例４イムノアッセイのためのE1/E2の使用患者血清試料は、Uniglobe Research Corporation（Resed
a,ICA）から購入し、米国の東部州、西部州、中西部州
および南部州から集められ、ランダムに選択された供与
者の有償血漿から得た。H.Tong（Pasadena,California
のHuntington Memorial Hospital）により提供された血
清試料は、輸血関連慢性NANBHの38人の患者からなる一
群と、慢性NANBHの第IV薬物（IV drug）服用者の39人の
患者からなる別の群から得られた。これらの77人の患者
は、他の肝疾患はなく、抗HAVおよび抗Hbs抗原に非反応
性であり、そして抗核抗体（ANA）は正常であった。３
人の輸血に伴うHCV血清変換（seroconversion）パネル
は、H.Alter（National Institutes of Health,Bethesd
a,Maryland）およびClarkston,GeorgiaのSerologicals
Incorporationから得た。急性分解性（acute resolve
d）HCV試料は、Max von Petlenkofer−Institute,Unive
rsity of Munich,Munich,Germanyにより提供された。急
性分解性（acute resolving）NANBHの19人の患者を、長
期追跡試験（２〜11年）の間の肝生体組織検査および正
常アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベルに
基づいて診断した。

組換えHCV抗原の発現および精製 C22（119アミノ酸）、E1（130アミノ酸）、E2（251ア
ミノ酸）、NS5（942アミノ酸）およびキメラC25（c200/
c22とも呼ばれる）（858アミノ酸）の抗原を、酵母S.ce
revisiae内の内部抗原として、Kuo,G.ら,Science（198
9）244:362−364およびCousens L.ら,Gene（1987）61:2
65−272による前述の方法を用いてヒトスーパーオキシ
ドジスムターゼ（SOD）とのＣ−末端融合物として発現
させた。５−１−１抗原を合成するために、前述の方法
を用いてE.coli内で内部SOD融合ポリペプチドとして、C
33C抗原（266アミノ酸）を発現させた（PCT WO 89/0466
99;EPO公開番号第318,216号；およびHoughtonら,Scienc
e 244:359（1989）を参照、これらは、本明細書中に参
考として援用されている）。細胞破壊および遠心分離に
続いて、5M尿素または１％SDSのいずれかを用いて細胞
ペレットから不溶性SOD融合ポリペプチドを抽出し、そ
してゲル濾過、またはイオン交換クロマトグラフィー
（Ｑ−およびＳ−セファロース）およびゲル濾過クロマ
トグラフィー（セファクリルＳ−300 HR）の組み合わせ
のいずれかを用いて精製した。

HCVのネイティブなE1およびE2抗原［rVV（e1およびe
2）とも呼ばれる］を、完全長HCV E1およびE2遺伝子を
含む組換えワクチニアウイルス（rvv）感染細胞の小胞
体から精製した。アフィニティクロマトグラフィー、続
いて非変性条件下でイオン交換クロマトグラフィーによ
って精製を行った。これらの方法は、WO 92/08734に記
載されており、それは本明細書中に参考として援用され
ている。

ネイティブなHCV E2抗原、すなわちCHO−e2を、Spaet
eら,Virology（1992）188:819−830に本質的に従って調
製した。より詳細には、CHO−e2抗原を産生する哺乳動
物CHO細胞系を、383位のAlaから661位のGluまでコード
するHCV−１配列を含むプラスミドから構築した。次い
で、完全長e2（e2/ns1とも呼ばれる）抗原を発現する安
定な細胞系を生成するために、このプラスミドをCHO細
胞内にトランスフェクトした。高い発現を示すクローン
を、選別し、そして10％透析済ウシ胎児血清および1.6
μＭメトトレキセートを加えた通常の補充液を含むDME/
H21内で増殖させることによって、ローラーボトル内で
増殖させた。培養培地の上清液を集め、そしてCHO−e2
抗原を精製するために用いた。精製スキームは、非変性
条件下でのアフィニティクロマトグラフィーおよびイオ
ン交換クロマトグラフィーを含んでいた。

ネイティブなe2推定構造エピトープを不安定化するた
めに、最終濃度10mMのDL−ジチオスレイトール（DT
T）、0.2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を添加し、1
00℃で５分間煮沸することによって、変性CHO−e2を調
製した。すべての精製組換えHCV抗原は、SDSポリアクリ
ルアミドゲル分析およびクマシーブルーによる染色によ
り、少なくとも90％の純度であると判断された。

ELISAアッセイ RVV（e1およびe2）、CHO−e2および変性CHO−e2抗原
を、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（pH7.4）で最適濃
度に希釈し、そしてこれらをImmulon^TM1プレート（Dyna
tech,Chantilly、FA）上にコーティングした。ELISAア
ッセイを以下のように行った。プレート上の試験標本を
試料希釈液で40倍に希釈し、そして37℃で１時間インキ
ュベートし、次いで洗浄緩衝液で洗浄した。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（HRPO）に結合したポリクローナルヤ
ギ抗ヒトIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体を各ウェルに添加した。プ
レートを37℃で１時間インキュベートし、次いで洗浄し
た。ｏ−フェニレンジアミン 2 HCl（OPD）および過酸
化水素をHRP発色のために添加した。これらの結果は、
プレートリーダーを用いて、492/620nmで読み取った。
抗原のRVV（e1およびe2）、SOD、C25、C22、C33Cおよび
ns−５に対するELISAカットオフO.D.値は、陰性対照の
平均からのO.D.値に0.4を加えた値であった。CHO−e2お
よび変性CHO−e2のカットオフ値は、対応する抗原陰性
対照からのO.D.値に0.3 O.D.を加えた値であった。抗C1
00−３のカットオフ値は、その平均陰性対照O.D.値に0.
45 O.D.値を加えた値であった。

イムノアッセイ結果米国患者群から得た血液成分中の抗HCV抗体を検出す
るための上記の抗原を用いたELISAアッセイの結果を表
１に示す。

表１の結果は、酵母産生HCVエンベロープ抗原e1およ
びe2が、ワクチニアウイルスRVV（e1およびe2）内なら
びにCHO細胞CHO−e2内で産生された組換え抗原よりも免
疫反応性がずっと低いことを示す。各試験群において、
酵母産生抗原（e1およびe2）の反応性は、動物細胞内で
産生された抗原の反応性の2/3にすぎないかまたはそれ
より低かった。酵母e1およびe2抗原が酵母細胞内で産生
され、そして変性条件下で精製されたことは、注記に値
する。このように、直鎖状エピトープのみがこれらの抗
原内に存在するようである。対照的に、ネイティブなHC
V抗原、RVV（e1およびe2）、ならびにCHO−e2は、非変
性条件下で宿主動物細胞から単離し、ネイティブな構造
エピトープを存在させるようにした。

細胞内でE1およびE2遺伝子から発現した組換えネイテ
ィブHCV抗原は、C33Cおよび恐らくはC25と同程度の免疫
反応性があり、そして調べた他のHCV抗原のいずれより
も免疫反応性が高いようである。C25は、NS₃、NS₄、お
よびＣポリペプチド部分を含み、そして図１に示したよ
うに融合したキメラ性ポリタンパク質である。

宿主免疫系初期応答の刺激における構造エピトープの
役割を、HCV血清変換パネルのイムノアッセイにより評
価した。表２の結果は、ネイティブなHCVエンベロープ
抗原、RVV（e1およびe2）、ならびにCHO−e2の、３種の
血清変換パネルのサンプルとの免疫反応性を示す。パネ
ルのサンプルはそれぞれ、輸血後NANBHである個人から
の逐次的採血を示す。表２の結果からわかるように、ネ
イティブなHCVエンベロープ抗原、即ち、天然の構造エ
ピトープを有するHCVエンベロープ抗原は、試験した他
のHCV抗原が検出する抗体と比べると、感染経過の間の
比較的初期に生じる抗体を検出する。このように、これ
らの抗原は、HCV感染診断用イムノアッセイに特に有用
であり得る。

表３の結果は、E1およびE2遺伝子から発現したネイテ
ィブなHCV抗原の、対応する変性抗原との比較を示す。
表では、急性分解性NANBHである患者由来の血清との免
疫反応性を、時間と共に追跡し、そして慢性NANBHであ
る患者由来の血清と比較した。表３からわかるように、
構造エピトープおよび直鎖状エピトープを両方とも含む
ネイティブなHCVエンベロープ抗原、RVV（e1およびe
2）、ならびにCHO−e2は、直鎖状エピトープ、e1および
e2（酵母内で産生された）、ならびに変性CHO−e2を含
む抗原よりも免疫反応性が高い。総合的な観察によれ
ば、ネイティブなHCVエンベロープ抗原の免疫反応性
は、急性分解性患者では、８〜９倍の間で増大し、そし
て慢性NANBH患者では約２倍増大する。このように、分
解型（resolving form）NANBHである患者の免疫学的反
応の多くは、構造エピトープに対しての反応であるが、
急性型での免疫学的反応は、構造エピトープおよび直鎖
状エピトープに対する反応に、大体均等に分かれる。

これらの研究は、構造エピトープが、HCVに対する宿
主の免疫学的反応に関与し得るという最初の証拠を与え
る。

実施例５ E1/E2イムノアッセイ：免疫適格患者および免疫抑制患
者の比較患者３群の患者を調べた。全ての患者は、ヒト免疫不全ウ
イルス（HIV）に対する抗体については陰性であった。
群Ｉは、20人の輸血関連慢性HCV感染しているが、それ
以外は健康な免疫適格（immunocompetent）患者からな
っていた。全ての患者が抗HCVおよびHCV RNAについて陽
性であった。群IIは、15人の維持血液透析中の患者を含
んでいた。11人が、提示（presentation）時に抗HCV陽
性であり、１人は、追跡調査（follow−up）中に腎移植
を受けた。４人の患者が、追跡調査中に抗HCV陽性にな
った。群IIIは、17人の腎移植片被移植者を含んでい
た。７人の患者が、提示時にHCVおよびHCV RNA陽性であ
った。７人が追跡調査中に抗HCV陽性になり、そのうち
の２人は初期にはHCV RNAのみ陽性であった。２人の患
者が、提示時にHCV RNAのみ陽性であり、両者ともHCV R
NA陽性であり続けたが追跡調査中は抗HCV陰性であっ
た。１人の患者が、追跡調査中にのみHCV RNA陽性にな
った。

血清血清は、先を見越して1989年７月と1992年４月との間
に収集し、そして試験に先立って、アリコートを−70℃
で貯蔵した。群Ｉの患者については、２〜４サンプルを
６〜12ヶ月の間隔で試験した。群IIおよび群IIIの全て
の患者については、1.5〜２年の間隔で収集した２サン
プルを試験した。第２サンプルで抗HCVおよび／またはH
CV RNA状態に変化があった患者については、中途期間の
追加サンプルおよび追跡調査サンプルも試験した。

ELISAアッセイ HCV抗原を実施例４と同様にして調製し、そして実施
例４で記載したように、ELISAアッセイで用いた。N e1
およびe2アッセイでは、ワクチニアタンパク質への結合
による偽陽性は、（ｉ）サンプル希釈物への、競争的抗
原として作用するワクチニア細胞溶解物の添加、および
（ii）陰性コントロールとしてのワクチニア反応性サン
プルの使用により低下する。

図3A〜3Cに結果を示す。群Ｉの免疫適格患者のうち55
％のみが、酵母内で発現したe1およびe2抗原に対して反
応した。しかし、全ての患者が、ワクチニアウイルス内
で発現したネイティブなグリコシル化e1またはe2抗原に
対して反応した。免疫適格患者の場合と同様に、ほとん
どの群IIの血液透析患者が、C25、C22、ならびにN e1お
よびe2抗原に対して反応性であった。顕著に低い割合の
患者が、C100−３、C33C、NS−５、e1、およびe2と反応
した。免疫適格患者と比較すると、群IIIの腎移植片被
移植者のうちの顕著に少数が、試験した全てのHCV抗原
に対して反応した。

全ての免疫適格患者が、C25、C22、およびC33Cに反応
した;90％がNS−５に反応し、そして80％がC100−３に
反応した。55％のみが酵母誘導e1およびe2抗原に対して
反応したが、全員がワクチニア発現N e1およびe2抗原に
反応し、このことにより、エンベロープエピトープが構
造性であり、そしてグリコシル化されていることが示さ
れた。透析患者および移植患者のうち65％〜90％が、C2
5、C22、ならびにN e1およびe2に反応したが、12％〜60
％のみがC100−３、C33C、およびNS−５に反応した。C2
5ならびにN e1およびe2はあまり影響されずに、肝炎Ｃ
ウイルス抗原への反応性の減少または喪失が、腎移植ま
たは骨髄移植の後、観測された。

このことは、e1およびe2エピトープが構造性であり、
そしてこれらのエピトープへの反応性は、他のHCV抗原
に比べて、免疫抑制により最小の影響を受けることを示
唆する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/569 G01N 33/576

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対する、ほ乳
類宿主の生体成分における早期セロコンバージョンをイ
ンビトロで検出するための方法であって、（ａ） HCVに対する抗体を含んでいる疑いのある生体
成分と、HCVゲノムのE1ドメイン内にコードされる抗
原、HCVゲノムのE2ドメイン内にコードされる抗原、ま
たはそれらの凝集体から選択される、非変性条件下で精
製されたHCV抗原とを、免疫学的反応が生じ得る条件下
で接触させる工程、および（ｂ）該抗体と該抗原との免疫複合体の存在を検出す
る工程、を包含する方法。
【請求項２】前記HCV抗原が、HCVゲノムのE1ドメイン内
にコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記HCV抗原が、E1である、請求項１また
は２に記載の方法。
【請求項４】前記HCV抗原が、HCVゲノムのE2ドメイン内
にコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記HCV抗原が、E2である、請求項１また
は４に記載の方法。
【請求項６】前記HCV抗原が、E1/E2凝集体である、請求
項１に記載の方法。
【請求項７】前記HCV抗原が、E1/E1凝集体である、請求
項１に記載の方法。
【請求項８】前記HCV抗原が、E2/E2凝集体である、請求
項１に記載の方法。
【請求項９】前記HCV抗原または凝集体が、組換えワク
シニアウイルスから発現される、請求項１〜８のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項１０】前記HCV抗原または凝集体が、CHO細胞に
おいて発現される、請求項１〜８のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項１１】請求項１〜10のいずれか１項に記載の方
法に使用するためのキットであって、該キットは、適切
なバイアル中にパッケージされた前記HCV抗原と、該キ
ット成分の使用の指示とを含む、キット。
【請求項１２】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対するほ乳
類宿主の早期セロコンバージョンを検出するための組成
物であって、 HCVゲノムのE1ドメイン内にコードされる抗原、HCVゲノ
ムのE2ドメイン内にコードされる抗原、またはそれらの
凝集体から選択される、非変性条件下で精製されたHCV
抗原、を含有する、組成物。
【請求項１３】前記HCV抗原が、HCVゲノムのE1ドメイン
内にコードされる、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】前記HCV抗原が、E1である、請求項12ま
たは13に記載の組成物。
【請求項１５】前記HCV抗原が、HCVゲノムのE2ドメイン
内にコードされる、請求項12に記載の組成物。
【請求項１６】前記HCV抗原が、E2である、請求項12ま
たは15に記載の組成物。
【請求項１７】前記HCV抗原が、E1/E2凝集体である、請
求項12に記載の組成物。
【請求項１８】前記HCV抗原が、E1/E1凝集体である、請
求項12に記載の組成物。
【請求項１９】前記HCV抗原が、E2/E2凝集体である、請
求項12に記載の組成物。
【請求項２０】前記HCV抗原または凝集体が、組換えワ
クシニアウイルスから発現される、請求項12〜19のいず
れか１項に記載の組成物。
【請求項２１】前記HCV抗原または凝集体が、CHO細胞に
おいて発現される、請求項12〜19のいずれか１項に記載
の組成物。
【請求項２２】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対するほ乳
類宿主の早期セロコンバージョンを検出するためのキッ
トであって、該キットは、適切なバイアル中にパッケー
ジされた、請求項12〜21のいずれか１項に記載の組成物
と、該キット成分の使用の指示とを含む、キット。