JP3478341B2 - 原料物質からのパクリタクセルの抽出方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の詳細な説明」 発明の分野 本発明は、原料物質からのパクリタクセル（タキソー
ル（taxol））及び他のタキソイド（taxoid）類の抽出
及び精製するための方法及び装置に関する。本方法及び
装置は、特に、イチイの木の針葉及び他の部分からパク
リタクセル及び他のタキソイド類を抽出及び精製するた
めの臨界流体及び近臨界流体（near critical fluid）
に関する。

発明の背景 抗腫瘍活性を示す種々の化合物が、植物材料、微生物
及び海洋微生物の有機溶媒抽出液中で識別されてきた。
化学療法学的薬剤及び抗−HIV剤としてのこれらの化合
物の有用性に関する後続研究は、これらの化合物の天然
存在量が少ないこと及び慣用の抽出方法が効果が無いこ
とにより妨げられてきた。このような化合物の一例とし
ては、西洋イチイTexus brevifoliaから誘導したジテル
ペン植物生成物であるパクリタクセル（タキソール（ta
xol:NSC 125973））が挙げられる。この薬物は、現在臨
床試験中であるが、卵巣癌及び他の多くの癌の進行した
ケースに対して顕著な30〜40％応答を示した。しかしな
がら、この薬剤は供給量が少ない。

現在、パクリタクセルは、T.brevifoliaの粉砕した樹
皮から主に３段階で有機溶媒により抽出され、次いで主
に４段階でクロマトグラフィーにより精製されている。
抽出工程は、粉砕した樹皮から開始し、これを50〜55℃
でメタノールで３回浸出させる。次いで抽出液をメタノ
ール中で濃縮する。次に濃縮したメタノール抽出液を塩
化メチレンと水の間で分別する。パクリタクセルを含む
塩化メチレン画分を濃縮する。塩化メチレン濃縮液を50
/50アセトン：ヘキサン中に溶解させ、混合物を濾過し
て不溶物を除去する。この有機抽出工程により固体含有
量を含む琥珀色のシロップ状物が得られるが、これは粉
砕した樹皮の約1.3％である。

慣用法による精製法は、４つの主な段階で実施する。
第１段階では、抽出工程からアセトン：ヘキサン混合物
を、70/30ヘキサン：アセトン混合物中のFlorisilカラ
ム上でクロマトグラフィーにかけて、パクリタクセル含
有画分を分離する。このパクリタクセル画分を次いで濃
縮して乾燥させる。この段階は９回程度の多くの回数で
繰り返し得る。第２段階では、パクリタクセル濃縮液を
メタノール：水混合物から結晶化させ、次いでアセト
ン：ヘキサン混合物から再結晶させると、85〜95％の純
度のパクリタクセルが得られる。第３段階では、このパ
クリタクセルを塩化メチレン中2.5％イソプロパノール
または2.5％ｎ−ブタノールを充填したシリカゲル上で
クロマトグラフィーにかけると、約98％純度のパクリタ
クセルが得られる。第４段階では、このパクリタクセル
をアセトン中に溶解させ、溶液を濾過し、次いでアセト
ン：ヘキサン混合物からパクリタクセルを再結晶させ
る。

この有機相抽出及びクロマトグラフィー精製工程によ
り、99％純度のパクリタクセルが得られるが、これは粉
砕した樹皮の約0.014％である。この方法によってパク
リタクセルを製造することは、 （ｉ）抽出及び精製工程に時間がかかること； （ii）苛酷な環境下での滞留時間が長いこと；及び （iii）全体の収率が低いこと によって妨害されている。また、T.brevifoliaの樹皮
は、通常、壮年期の木（樹齢100〜200年）から得られ
る。樹皮は収穫するのが困難且つ高価であり、供給量は
限られている。このような木は絶滅の恐れがある。代替
の製造経路及び原材料物質を探索するのに多くの研究が
なされている。代替の製造経路の幾つかには、関連性の
高いタキソイド、10−デアセチルバッカチンIII（10−d
eacetyl baccatin III）からの全合成及び半合成が含ま
れる。代替原料としては、観葉植物のイチイの針葉、小
枝、芽及び植物細胞培養物が含まれる。未だに達成され
ておらず、商業化も困難であることが証明されている全
合成以外は、これらの方法は全て、バイオマス原料から
タキソイド類を抽出及び精製することが必要である。

観葉植物のイチイの針葉は、非常に魅力的な原料物質
であることが判明し得るだろう。針葉は多量のタキソイ
ド類を含み、種苗場及び農場で迅速に栽培し得る再生可
能な原料である。

しかしながら、針葉には、さらに工程上に課題があ
る。針葉は、有機溶媒に抽出される多量の非極性成分及
びロウを含んでいる。より非極性のロウの幾つかは、ヘ
キサンで溶媒前洗浄することにより除去し得る。しかし
ながら、タキソイド類に非常に近い幾つかの組成物は、
塩化メチレンとメタノールとの混合物を使用する主な慣
用の溶媒抽出段階でパクリタクセルと一緒に共抽出され
てしまう。有機溶媒により針葉から抽出される全質量
は、樹皮の場合が25％であるのと比較して、35〜42％を
変動し得る。非常に大きな割合は、より多量のタキソノ
ールを示すのではなく、共抽出する不純物を示してい
る。新鮮な針葉は、かなりの量の水（約60％）も含んで
いる。

このように、針葉のパクリタクセル抽出及び精製段階
は、上述した樹皮に関する工程よりもずっと複雑で非常
に時間がかかる。

1993年１月７日のEP Ａ 0521625（Squibb及びSon
s）は極性溶媒を含む超臨界流体（変性剤とともに使用
される）を使用したタキソイド類の抽出を開示する。

ケミカル アブストラクト第116巻26号（1992年）、
コロンバス、オハイオ、USA、アブストラクト262349、J
ennings Dらの「Taxus Brevifoliaの樹皮からのタキソ
ールの超臨界抽出」は、Taxus木の粉砕樹皮からの超臨
界二酸化炭素または二酸化炭素及びエタノールによるパ
クリタクセルの抽出を開示する。

発明の概要 本発明の態様は、ロウ及び他の成分を含むタキソイド
含有原料物質からパクリタクセル及び他のタキソイド類
を抽出及び精製するための方法及び装置に関する。本発
明の態様は、イチイの木の針葉からタキソイド類、例え
ばパクリタクセルを抽出するのに特に適している。本態
様は、特に臨界流体または近臨界流体に関する。

本明細書中、「臨界流体（critical fluid）」という
用語は、その臨界圧力以上及び臨界温度以上に於ける流
体を指す。超臨界流体は、その臨界圧力及びその臨界温
度を越える流体を指す。従って、「臨界流体」は、「超
臨界流体」という用語を実質的に包含する。「近臨界流
体（near critical fluid）」という用語は、臨界圧力
及び／又は臨界温度に近いがその臨界圧力及び／又は臨
界温度にはない流体、特に臨界圧力以上であるが臨界温
度未満の流体を指す。近臨界流体は、臨界流体と酷似す
る密度を有する流体を示すのに用いられる。これを応用
して、臨界流体又は近臨界流体を指すのに「CoNC流体
（CoNC fluid）」という用語を使用する。

本発明の一態様は、タキソイド含有原料物質からタキ
ソイド類を抽出する方法に関する。本方法は、原料物質
がロウ及び他の成分を含み、該他の成分が慣用の溶媒抽
出法を使用する際にタキソイド類と一緒に共抽出され得
るような場合に特に適用できる。本方法は、原料物質を
脱ロウ条件にさらす段階を含む。脱ロウ条件は、原料物
質を第１の流体にさらすことを含む。第１の流体は非極
性CoNC流体である。ロウは第１の流体に溶解し、ロウを
含んだ抽出剤と脱ロウした原料物質が形成される。さら
に本方法は、脱ロウした原料物質を第２の流体にさらす
ことにより、脱ロウした原料物質からタキソイド類を除
去し、タキソイド抽出剤と残存物質を形成する段階を含
む。第２の流体は、CoNC流体と極性補助溶媒の混合物で
ある。ロウを含んだ抽出剤及びタキソイド抽出剤をクロ
マトグラフィー手段にかけて、タキソイドと１種以上の
溶離剤を形成する。

本明細書中、「非極性」という用語は、0.0〜0.1デバ
イの双極子モーメントをもつ物質を指す。「極性」とい
う用語は、約0.1〜1.7デバイの双極子モーメントを有す
る物質を指す。

好ましくは、溶離剤を減圧して共溶離したタキソイド
類を分離する。減圧すると、共溶離するタキソイド類は
CoNC流体から沈殿する。CoNC流体の減圧時に単離された
タキソイド類をクロマトグラフィー方法により精製し
て、精製タキソイド類を形成する。

好ましくは、減圧した第一及び第二流体を抽出剤冷却
装置に通過させ、実質的にタキソイドを含まないCoNC流
体（これは次いで再循環される）及び廃棄物（これは取
り除かれる）を形成する。

「実質的にタキソイドを含まない」という用語は、プ
ロセス工程の出発物質に比較してより少ないタキソイド
を含有する意味に使用する。

クロマトグラフイー手段は一本若しくはそれ以上のク
ロマトグラフカラムを有する。第二の流体の通過の間に
第１カラムに吸収されたタキソイドは、有機溶媒（ヘキ
サン:n−プロパノール：メタノール３成分グラジエン
ト）の比較的極性の混合物又は第３流体で溶離される。
この第３流体は、CoNC流体及び異なる種類又は濃度の補
助溶媒、即ち、第２流体から構成される。大量のタキソ
イドを含有すると確認されているフラクションをさらに
追加のカラムを用いてクロマトグラフイーに付す。タキ
ソイドを含まないか少量のタキソイドしか含まないと確
認されているフラクションは廃棄物として処理するか又
は追加のクロマトグラフイープロセスにより溶離剤とし
て再プロセス及び再循環させる。少量のタキソイドを含
む画分（これは廃棄物ではない）を第４流体に付す。第
４流体はCoNC流体及び極性補助溶媒から構成される。第
４流体の圧力及び／又は温度は第３流体よりも高いか又
は低いのいずれかであり、非タキソイド溶質を除去す
る。その後、第４流体の温度及び圧力を調節し、当該流
体を第１のクロマトグラフイーカラム中を再循環させ
る。

タキソイド含有画分を更に複数のカラムに付し、次い
で、有機溶媒混合物又は第５流体からなる比較的非極性
の移動相により溶離する。第５流体はCoNC流体及び非極
性補助溶媒から構成されている。適切な有機溶媒混合物
にはメタノール及びアセトニトリル混合物等がある。精
製したパクリタクセル及び密接に関連したタキソイドを
含有する画分を集める。タキソイドを含まないか少量の
タキソイドしか含まない移動相は廃棄に送られるか又は
再処理及び再循環される。同定不可能なタキソイドを含
有するCoNC流体／溶剤混合物は、この混合物の圧力及び
温度を変化させることにより再処理し、不純物にその溶
液を残させ、CoNC流体及びCoNC流体／再循環に適した補
助溶剤混合物を生じさせる。

好ましくは、CoNC流体は、二酸化炭素；亜酸化窒素；
プロパンのようなアルカン；エチレンのようなアルケ
ン；及びクロロジフルオロメタンのようなフルオロカー
ボンである化合物から選択される。これらの化合物は標
準室温及び圧力で気体である。しかし、低温及び大気圧
を超える圧力では、これらの化合物はCoNC流体を形成す
る能力を有する。

好ましくは、極性補助溶媒は、メタノール、エタノー
ル、ブタノール、プロパノール、塩化メチレン及びアセ
トンからなる極性溶媒群から選択される。

本方法の実施態様は、パクリタクセル、セファロマン
ニン（cephalomannine）、バッカチンIII、10−デアセ
チルバッカチンIII、デアセチルパクリタクセル及びデ
アセチル−７−エピタキソール並びにそれらの誘導体及
び前駆物質からなるタキソイドを抽出するのに理想的に
適している。本発明の実施態様は、針葉のような更新し
うる原料物質からパクリタクセル及びパクリタクセル様
組成物の単離と抽出をできる。

場合により、針葉をまず乾燥して水分を除去し、処理
してこの原料物質の表面積を広げる。表面積を広げる典
型的な処理には粉砕又は微粉砕等がある。

本発明の一実施態様では、ロウやその他の構成分を含
有するタキソイド含有原料物質からタキソイドを抽出す
るための装置に特徴がある。この装置は、原料物質、第
１流体及び第２流体を受け入れる様になっている部屋を
有する。この装置は、更に当該部屋と連絡する第１流体
源を有する。第１流体は、CoNC流体を含む。第１流体源
は、第１流体を部屋内に向けることができ、原料物質を
脱ロウ条件にする。第１流体は原料物質のロウを溶解さ
せ、ロウ含有抽出剤と脱ロウした原料物質を生じさせ
る。装置は、更に第２流体源を有する。この第２流体は
ある流体と極性補助溶媒との混合物である。第2CoNC流
体源は上記部屋に連絡されている。第２流体源は第２流
体を部屋内に向けることができ、タキソイド抽出剤と廃
棄物を形成する。部屋は、当該部屋からロウ含有抽出剤
とタキソイド抽出剤とを受けるためのクロマトグラフイ
ー手段に連絡し、溶離剤と濃縮したタキソイドを形成す
る。

好適なクロマトグラフ手段は一本又はそれ以上のカラ
ムを有する。好ましくは、カラムは溶離液の圧力を減少
させるための減圧手段と連絡する。減圧時、タキソイド
（溶離剤と共に溶離される）は遊離され、更に処理でき
る。

好ましくは、減圧手段を通過するとき生成したタキソ
イドを精製し、精製タキソイドを形成する。

好ましくは、減圧手段は抽出剤冷却装置と連絡し、減
圧手段から溶離剤を受け取る。冷却して、不純物を溶離
剤から取り除き溶離剤を再循環させることができる。

好ましくは、第１及び第２流体を、クロマトグラフイ
ー手段と連絡する導管及びポンプ手段によりタキソイド
及び廃棄物の除去後に再循環させる。

本装置の一実施態様は、タキソイド精製手段の一本又
はそれ以上のカラムと連絡する導管並びに第１流体源又
は第２流体源と連絡する導管を特徴とする。この導管は
タキソイドが溶離するまでカラム内を流れる第２流体を
受けるようになっている。装置は、更に第２流体を、タ
キソイドが溶離すると、このような導管から第２カラム
に向けるための手段を有し、このようなタキソイドを除
去しタキソイド不含CoNC流体を生じさせる。

好ましくは、タキソイド不含CoNC流体を減圧して不純
物にその溶液を残させ、再循環のために適する第２流体
を生成させる。

好ましくは、装置は、CoNC流体として二酸化炭素；プ
ロパンのようなアルカン；エチレンのようなアルケン；
クロロジフルオロメタンのようなフルオロカーボン；及
び又は亜酸化窒素を受け取るようになっている。好まし
くは、装置は、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、ブタノール、メチレンクロリド及びアセトンからな
る群から選択される極性溶媒を受けるようになってい
る。

本装置は、パクリタクセル、バッカチンIII、10−デ
アセチルバッカチンIII、セファロマンニン、デアセチ
ルタキソール及びデアセチル−７−エピタキソールのよ
うなタキソイドの単離のために理想的に適している。

本発明の実施態様は、鑑賞用イチイ材の針葉から、2
0.9％のメタノールを含有する超臨界二酸化炭素（40℃
で8784kPa（1,274psia））を用いて、僅か21分内に0.04
8重量％パクリタクセル（取得可能なパクリタクセルの9
9＋％）を抽出できる。このパクリタクセル回収は驚く
べきことであり予期されないことである。この短い滞留
時間は、工業的プラントの資本及び操業コストを劇的に
影響を与え得るので、意味がある。

本発明の実施態様は、改良した浸透及び溶媒和により
非常に高速の抽出に特徴がある。従来の方法と比較し
て、プロセスは改良した製造能力と改良したスケーラビ
リテイー（scalability）を有する。このプロセスは全
体的により高い効率及びより少ないプロセス工程を特徴
とする。本発明により製造した抽出剤は、可及的に少な
い有機溶媒の使用を伴う改良した製造品質を特徴とす
る。

本発明の装置と方法は、研究目的や臨床試験のために
タキソイドの取得可能性を増加させることができる。好
適な原料材料には針葉がある。本方法と装置は、典型的
には、針葉にのみ見いだされる不純物の存在下にタキソ
イドを抽出する。しかし、本方法及び装置は、イチイ植
物の針葉に加えその他の原料物質から抽出する応用性を
有する。

本発明のその他の特徴は図面及び以下の詳細な記述の
検討により明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の特徴を具体化する臨界流体抽出及び
クロマトグラフイー装置の略図を表し； 図２は、試薬、超臨界流体及び補助溶剤の再循環を含
む、本発明の特徴を具体化する臨界流体抽出及びクロマ
トグラフイー装置を表し； 図３は、針状葉から抽出の228及び280nmにおけるクロ
マトグラムを表し； 図4a及びｂは、本発明の方法により採取したフラクシ
ョンのクロマトグラムを表す。

発明の詳細な説明 本発明の実施態様を、イチイ木の針葉からのパクリタ
クセルの抽出のための方法と装置として記載する。本明
細書中で使用するとおり、イチイはTaxus media種及びT
axus brevifolia種、並びにTaxus属のその他の植物を包
含することを意図している。

本発明は、溶剤としてCoNC流体の使用を特徴とする。
CoNC流体は、気体状の二酸化炭素や亜酸化窒素のような
周囲条件において気体として存在する一定の物質から構
成される。このような気体が圧縮されそれらの臨界圧や
臨界温度に近付くか又は超える条件に移行すると、この
ような気体は溶媒和力を増強させる。

CoNC流体は液体様の密度を示すと同時に拡散率及び粘
度の気体様特性を示す。このCoNC流体は、広いスペクト
ルの溶媒和力を示す。何故なら、その密度が温度と圧力
の双方に強く依存するからである。一桁又はそれ以上に
溶解度を変化させるために、温度と圧力を変えることが
できる。CoNC流体は、更に微小孔材料内に容易に浸透で
きる超低表面張力を示す。

数字11によって一般的に示されている、針葉を含む原
材料からのタキソイド類のCoNC流体抽出を実施するため
の本発明の特徴を具現化する装置は、図１に記載されて
いる。装置11は、４つの主要な要素、即ち；抽出器13;
数字15によって一般的に示されているCoNC流体運搬集成
装置；数字17によって一般的に示されているクロマトグ
ラフィー精製集成装置；及び数字19によって一般的に示
されている圧力低下手段から成っている。

抽出器13は、図1Aにより詳細に記載されている。抽出
器13は、原材料を受け入れるために区画21を画定する囲
い20を有する。好ましくは、原材料は粉砕またはすりつ
ぶしによって微細な粒子にされている。区画21は、流体
を受け入れるための注入口23と流体を除去するための排
出口25とを有する。抽出器分路27は、注入口23と連絡し
ており、これによりCoNC流体が排出させられる。分路27
を通過するCoNC流体の流れは、バルブ27aによって調節
される。

抽出器13には、一定の温度を維持するためのサーモス
タット調節器（示されていない）と原材料を充填するた
めの開口部（示されていない）とが備えつけられてい
る。そのような抽出器の一つとして、IscoモデルSFX 2
−10抽出ユニットが知られている。

区画21の注入口23は、CoNC流体運搬集成装置15と連絡
している。CoNC流体運集成装置15は以下の主要な要素、
即ち;CoNC流体容器29、補助溶媒容器31およびシリンジ
ポンプ33から成っている。シリンジポンプ33は、導管35
を介して区画21の注入口23と連絡している。２つのバル
ブ35a及び35bは導管35中の流れを調節する。シリンジポ
ンプ33を適合させることによって、補助溶媒容器31から
の補助溶媒とCoNC流体容器29からのCoNC流体を受け入れ
る。シリンジポンプ33は導管37を介して臨界流体容器29
と連絡している。バルブ37aは、導管37中のCoNC流体の
流れを調節する。

シリンジポンプ33は、２つの導管45及び47を介して補
助溶媒容器31と連絡している。導管45は、シリンジポン
プ33及び補助溶媒ポンプ49と直接連絡している。シリン
ジポンプ33への補助溶媒の流れは、バルブ45aによって
調節される。導管45中の圧力は、圧力計51によって監視
される。

導管47は、補助溶媒ポンプ49及び補助溶媒容器31と直
接連絡している。補助溶媒は導管47から補助溶媒ポンプ
49へと受け取られ、導管45へ押し出される。導管47を有
する補助溶媒ポンプ49への補助溶媒の流れは、バルブ47
aによって調節される。

抽出器排出口25は、クロマトグラフィー精製集成装置
17と連絡している。クロマトグラフィー精製集成装置17
は、２つの主要な要素、即ち、HPLCカラム61及びフィル
ター要素63から成っている。フィルター要素63は、５ミ
クロンのフィルターであり、排出導管65を介して排出口
25と連絡している。抽出器から導管65を通って流れるCo
NC流体は、フィルター要素67によってろ過される。CoNC
流体は導管67を介してHPLCカラム61に入る。HPLCカラム
61は正常相HPLCカラムである。

CoNC流体はHPLCカラム61から圧力低下集成装置19へと
流れる。CoNC流体は導管71を介してHPLCカラム61を出て
いく。排出口導管71内の圧力は、圧力計73によって監視
され、圧力低下バルブ71aによって調節される。

減圧されたCoNC流体は、回収容器77に入る。回収容器
77は、固体または液体の保持相、例えば、塩化メチレン
とメタノールとの50:50混合物を含む。回収容器77は、
蒸発しない補助溶媒だけでなく、CoNC流体中に保持され
たタキソイド類を保持する。CoNC流体は、導管83を通っ
て排出される。

操作においては、乾燥され、かつ粉砕若しくはすりつ
ぶされた原材料、例えば、イチイの木の粉砕若しくはす
りつぶされた針葉を、抽出器13の区画21内に置く。原材
料は最初に、第１の流体、例えばCoNC二酸化炭素の流れ
を受ける。第１のCoNC流体は比較的非極性である。原材
料のワックス類および他の成分は、CoNC流体中に溶解
し、区画21の排出口25を通って、そして導管65を通って
除去される。CoNC流体中に保持された原材料のワックス
および他の非タキソイド成分は、回収容器77中に回収さ
れ、放出される。CoNC流体は出口83を通って排出され
る。

次いで、第２の流体を、メタノール、エタノールまた
はアセトン等の極性補助溶媒と、CoNC流体とを組み合わ
せることによって形成する。シリンジポンプ33は、導管
35を介して抽出器区画21中に注入される第２の流体を受
ける。第２の流体は、原材料からパクリタクセルおよび
他のタキソイド類を除去する。タキソイドを積んだ第２
の流体は、区画21から排出口25を通って、クロマトグラ
フィー集成装置17のHPLCカラム61へと除去される。HPLC
カラム61は、パクリタクセル、および10−デアセチルバ
ッカチン−IIIのようなタキソイド類を第２のCoNC流体
から除去する。

第２の流体中に共に溶出するタキソイド類および他の
不純物は、回収容器77中に回収される。第２のCoNC流体
と補助溶媒は圧力低下バルブ71aにおいて減圧され、そ
れによりタキソイド類と他の不純物は溶液から出ていく
ようになる。CoNC流体は出口83を介して回収容器77から
排出される。

CoNC流体と補助溶媒の再循環を特徴とする、本発明の
特徴を具現化する装置は、図２に記載されている。数字
111によって一般的に示されている、タキソイド抽出装
置は、以下の主要な要素、即ち；抽出集成装置113;数字
115によって一般的に示されているCoNC流体集成装置；
数字117によって一般的に示されているクロマトグラフ
ィー集成装置；及び、数字119によって一般的に示され
ている圧力低下集成装置から成っている。

抽出区画113は、図１に関して記載した抽出区画13の
特徴と同様の特徴を有している。即ち、抽出区画113
は、注入口と排出口（示されていない）とを有する内側
の区画（示されていない）を有している。抽出集成装置
の区画は、タキソイド類を含む原材料を保持することが
できる。好ましくは、原材料は、乾燥しており、場合に
よっては、乾燥およびすりつぶし用集成装置（示されて
いない）によって微粒子の形態にされている。

抽出集成装置113は、区画の注入口（示されていな
い）と連絡した導管135を介してCoNC流体を受ける。導
管135を通る流れは、バルブ135aによって調節される。
導管135は予熱器137と連絡している。予熱器137はCoNC
流体と補助溶媒混合物の温度を調整する。予熱器137
は、導管141を介して静止混合器139と連絡している。静
止混合器139は、CoNC流体と補助溶媒とを均一な混合物
になるまで混合し、第２のCoNC流体を形成する。

静止混合器139は、導管145を介して循環ポンプ143
と、そして導管149を介して補助溶媒補給ポンプ147と連
絡している。補助溶媒補給ポンプ147は、補助溶媒を含
む容器（示されていない）と連絡している。補助溶媒ポ
ンプ147は、導管141中に補助溶媒を注入して、抽出集成
装置113に供給されたCoNC流体中の補助溶媒の濃度を調
整することができる。

循環ポンプ143は、導管153を介して過冷却器151と連
絡している。過冷却器151を適合することによって、CoN
C流体とCoNC流体／補助溶媒混合物とを冷却し、温度を
調整する。過冷却器151は、導管159a、159b及び159cを
介して、CoNC流体の貯蔵器155、及びCoNC流体／補助溶
媒混合物を含む第２のCoNC流体を含む貯蔵器と連絡して
いる。

抽出器113の区画の排出口（示されていない）は、ク
ロマトグラフィー集成装置117と連絡している。クロマ
トグラフィー集成装置117は、以下の主要な要素、即
ち；第１の吸着カラム161及び第２の吸着カラム163から
成っている。第１の吸着カラム161は、導管163を介して
抽出集成装置113の区画の排出口（示されていない）と
連絡している。バルブ165aは、導管165中の第２のCoNC
流体の流れを調節する。

第１の吸着カラム161は、原材料から抽出された、パ
クリタクセル、バッカチンIII、10−デアセチルバッカ
チンIII、セファロマンニン及び他の興味のあるタキソ
イド類を保持するように適合される。第１の吸着カラム
161は、分路167を介して、CoNC流体とCoNC流体／補助溶
媒混合物の出所と連絡している。分路167は、CoNC流体
貯蔵器155及びCoNC流体／補助溶媒貯蔵器157と連絡して
いる。バルブ167aは、導管167を通る流体の流れを調節
する。分路167により、CoNC流体とCoNC流体／補助溶媒
混合物が、第１の吸着カラム161によって吸着されたタ
キソイド類を溶出するようになる。

第１の吸着カラム161は、導管169を介して第２の吸着
カラム163と連絡している。バルブ169aは、導管169にお
けるCoNC流体またはCoNC流体／補助溶媒混合物の動きを
調節する。第２のHPLCカラム163は、圧力低下集成装置1
19と連絡している。圧力低下集成装置119の導管171は、
第２の吸着カラム163からの流れを受ける。導管171を通
る流体の流れはバルブ171aによって調節される。導管17
1は、溶出したパクリタクセル及びCoNC流体／補助溶媒
を、圧力低下バルブ171b、パクリタクセル加熱器173、
及びパクリタクセル分離器175に運搬する。パクリタク
セル加熱器173は、第１の流体を希釈し、第２の流体が
パクリタクセルをパクリタクセル分離器175中で溶液の
外へ分離するようにする。

パクリタクセルは、導管177を通ってパクリタクセル
分離器175から除去される。バルブ177aは、導管177を通
る流体の流れを調節する。過臨界流体及び過臨界流体／
補助溶媒混合物は、出口線179を介してパクリタクセル
分離器175から除去される。

線179は、抽出媒体冷却器181と連絡している。抽出媒
体冷却器181は、CoNC流体及びCoNC流体／補助溶媒混合
物の濃度を高める。

抽出媒体冷却器181は、導管183a、183b及び183cを介
して、第１の流体貯蔵器155及び第２の流体／補助溶媒
貯蔵器157と連絡している。第１の流体貯蔵器155はCoNC
流体を含む。第２の流体貯蔵器157はCoNC流体と補助溶
媒とを含む第２の流体を含む。バルブ183a及び183bは、
導管183A、183B及び183Cにおける流体の動きを調節す
る。

タキソイド10−デアセチルバッカチンIIIは、一定のC
oNC流体／補助溶媒混合物とともにカラム161から溶出す
る。導管169は、バッカチン分路191を介して圧力低下集
成装置119と連絡している。バルブ191aは、バッカチン
分路191を通る流体の流れを調節する。第１の吸着カラ
ム161から溶出した10−デアセチルバッカチンIIIは、バ
ッカチン分路191に向けられる。

バッカチン分路191は、圧力低下バルブ193、バッカチ
ン加熱器195及びバッカチン分離器197と連絡している。
圧力低下バルブ193は、CoNC流体／補助溶媒混合物の圧
力を減少させる。バッカチン加熱器197は、CoNC流体及
びCoNC流体／補助溶媒混合物を希釈する。低い圧力及び
中程度の温度の組み合わせにより、10−デアセチルバッ
カチンIIIが、バッカチン分離器197において溶液から出
てくるようになる。

10−デアセチルバッカチンIIIは、導管199を介してバ
ッカチン分離器197から除去される。バルブ199aは、バ
ッカチン分離器197からの10−デアセチルバッカチンIII
の移動を調節する。

バッカチン分離器197は、導管201を介して、抽出媒体
冷却器181、第１の流体貯蔵器155及び第２の流体貯蔵器
157と連絡している。導管201は、CoNC流体とCoNC流体／
補助溶媒混合物を再循環させるための導管179と連絡し
ている。

第１の吸着カラム161は、第２の分路211を介して、圧
力低下集成装置119と連絡している。バルブ211aは、導
管211を通るCoNC流体及びCoNC流体／補助溶媒混合物の
動きを調節する。導管211は、圧力低下バルブ213、抽出
媒体加熱器215、廃棄物分離器217及び分路219と連絡し
ている。分路219は導管171と連絡している。分路219
は、再循環させるために、第２の吸着カラム163から、
過臨界流体及び過臨界流体／補助溶媒混合物を受ける。
バルブ219aは、導管219を通る動きを調節する。

導管211は、本質的にタキソイドを含まない流体およ
びCoNC流体／補助溶媒の混合物を、HPCL用カラム161お
よび分岐路219から受け取る。

また、圧力減少バルブ213は、CoNC流体／補助溶媒の
混合物の液圧を、導管211を通して減少させる。抽出物
用加熱器215により、CoNC流体およびCoNC流体／補助溶
媒の混合物を、導管211を通して加熱することになり、
圧力低下及び加熱は、廃棄物分離器217において、溶液
から廃棄物を廃棄するのに役立つ。

そして、廃棄物は、廃棄物分離器217から、導管221を
通して、取り除かれ、バルブ221aは、導管221を通して
廃棄物流体の動きを制御している。

廃棄物分離器217は、抽出物冷却器181、第１流体貯蔵
器155および第２流体貯蔵器157と導管221を介して連結
されている。そして、導管221は、導管179と連結してお
り、CoNC流体およびCoNC流体／補助溶媒を、抽出物冷却
器181に運び、抽出物冷却器181は、循環用流体の密度を
濃縮させる。

CoNC流体の損失は、CoNC流体の補給ポンプ225で補償
される。そして、CoNC流体の補給ポンプ225は、第1CoNC
流体貯蔵器155および第2CoNC流体貯蔵器157と導管227a,
b,cを介して連結されている。また、CoNC流体の補給ポ
ンプ225は、CoNC流体供給源（図示せず）とも連結して
いる。

超臨界流れの二酸化炭素を使用する操作において、乾
燥された原料物質は、抽出器113の抽出室に、すり砕か
れて、入れられる。好適な乾燥された原料物質として
は、イチイの針葉である。かかる原料物質は、第１流体
を用いて、脱ロウ工程にかけられる。第１流体には、約
0.8g/mlの濃度で、超臨界流れの二酸化炭素を含んでい
る。飽和した、およそ7000kPa（1000psi）の液状二酸化
炭素が第１流体貯蔵器155から取り出され、若干、ポン
プ輸送中のキャビティー発生を防止するために冷却され
る。循環ポンプ143は、第１流体に圧力を加えて、抽出
圧力の20790kPa（3000psi）にまで高め、そして静止混
合器139を通して、二酸化炭素を抽出温度である40℃に
するための予熱137にポンプ輸送する。そして、非極性
二酸化炭素が、原料物質から非極性のロウやある程度の
タキソイドを抽出する。

ロウを含む抽出用溶剤は、タキソイドを保持する第１
吸着用カラム161を通過させられる。二酸化炭素は、バ
ルブ211aを通過したのち、さらに逆圧力制御器213を通
過する。二酸化炭素は、約7686kPa（1,100psi）まで圧
力低下し、温度も付随して低下する。

第１流体は、再び、抽出器の加熱器215で、約40℃ま
で加熱される。これらの状態において、準超臨界状態の
二酸化炭素の密度は、たったの約0.2g/mlとなり、その
結果、取り込まれたロウは、ほとんど溶解性がなく、廃
棄物回収分離器217において、脱離される。そして、そ
れから清澄化された二酸化炭素は、抽出器における冷却
器181を通過させられ、液化し、第1CoNC貯蔵器155に戻
る。

脱ロウ化された原料物質は、それから、第２流体を利
用したパクリタクセル抽出／吸着工程に資せられること
になる。第２流体は、超臨界状態の二酸化炭素および、
極性の補助溶媒、例えばアセトンを含んでいる。第２流
体は、貯蔵器157から、循環ポンプ143により取り出され
る。さらなる補助溶媒が、流えに加えられ、前述のサイ
クル工程中に失われた流体の損失を補償する。混合され
た流れは、静止混合器139を通って、均一な組成物とな
り、そしてそれから、予熱器137を通った後、抽出容器1
13に入っていく。抽出条件は、ほとんど脱ロウ工程と同
じである。

抽出液は、パクリタクセル、タキソイドおよび不純物
を含んでおり、ポンプで、第１吸着カラム161まで送ら
れて、そこで、パクリタクセルおよび類似の化合物が選
択的に吸着される。

次に、抽出室113は、ラインから外れるように設けら
れており、供せられたり、外されたりして、また再充填
されることが可能である。パクリタクセルは、第１吸着
カラム161から、第３流体を利用して、溶出させられる
ことになる。第３流体は、二酸化炭素や補助溶媒を含ん
でいる。極性補助溶媒の濃度は、第２流体混合物と比べ
て第３流体中において高い。第１吸着カラムの通過後の
流れは、流れがバルブ169aを通して分岐され、第２吸着
カラム163につながるポイントにおいて、パクリタクセ
ル／セファロマンニンが溶出するまでは、直接、バルブ
211aに通じている。

第２吸着カラム163は、パクリタクセル、セファロマ
ンニン、タキソイドおよび他の不純物を吸着する。ま
た、臨界状態の液体／補助溶媒は、シリカカラムからバ
ッカチンを脱離させる効果も有しているので、溶出液
は、直接バルブ191を通って、分離する減圧力ループに
通され、そこでバッカチンは、バッカチン分離器197に
回収されることも可能となる。回収されたバッカチン
は、この抽出工程においてシリカカラムを通ってきた他
の物質を含んでおり、さらに使用前に清澄工程が必要で
ある。

バッカチン回収に続いて、臨界流体／補助溶媒混合物
は抽出器用の冷却器181を通過し、そしてそれから、CoN
C流体／補助溶媒貯蔵器157に還元される。

タキソイドを含まない流れは、吸着カラム161および1
63の通過後、バルブ219aに直接つながっており、続いて
減圧されて、不純物を脱離する。そして溶媒流れは、そ
れから、抽出器用の冷却器181およびCoNC流体／補助溶
媒貯蔵器157に還元される。

次に、パクリタクセルは、第２吸着カラム163から、
第４の流体を使用して、溶出されることとなる。第４の
流体は、CoNC流体および極性補助溶媒から構成されてい
る。補助溶媒は、第２流体よりも低濃度で存在してい
る。従って、第４の流体は、第２流体よりも極性が少な
いということになる。タキソイドは、パクリタクセル分
離器175の圧力降下により回収される。CoNC流体／補助
溶媒混合物は、再び抽出器用の冷却器181に導入され、
リサイクルされる。一定量の補助溶媒は、回収されたパ
クリタクセル中に含まれる。これは、沸騰、凝縮および
還流により取り除かれる。

本技術分野の当業者は、第１、第２、第３および第４
の流体が、理想的な、あるいは一様なCoNC流体組成を有
している場合があり、あるいは異なる流体組成を有して
いる場合もあり、さらには明確な流路において流動する
ことを容易に認識するであろう。同様に、第２、第３お
よび第４の流体が、理想的な、あるいは一様な補助溶媒
の組成を有している場合があり、あるいは異なる流体組
成を有している場合もあり、さらには明確な流路におい
て流動することを認識するであろう。

工程や装置には、さらに別な流体に対して、別途クロ
マトグラフ工程を設けることも可能である。

実施例 Ａ 一般 HPCL用有機溶媒として、ベーカーから入手したアセト
ニトリル、クロロホルム、ヘキサン、メタノール、およ
びメチレンクロライド、EMサイエンスから入手したアセ
トンが使用された。清浄化トルエン（マリンクロドット
社）、ｐ−アニスアルデヒド（シグマ社）、ブチルパラ
ベン（シグマ社）、および無水エタノール（ベーカー
社）もまた使用した。使用した臨界流体は、CPグレード
（98％＋）の二酸化炭素（CO₂）、窒化酸素（N₂O）、プ
ロパン（C₃H₈）および、フレオン22またはクロロジフル
オロメタン（CHClF2）であって、MA州、エベレツトのア
ソシエーテッドガスプロダクトから入手したものであ
る。

使用したパクリタクセルの標準サンプルは、バッカチ
ンIII（LOT＃330753）、セファロマンニン（LOT＃31873
5）およびパクリタクセル（LOT＃s125973および125973
−L/24）であって、ナショナルキャンサーインスチチュ
ートから入手したものであり、また、10−デアセチルタ
キソール（LOT＃GS−6S−170−４）、10−デアセチル−
７−エピタキソール（LOT＃GS−6S−170−３）および、
７−エピタキソール（LOT＃GS−6S−172−１）であっ
て、VA州、ブラクスバーグ、バージニアポリテクニック
工科州立大学、の、キングストン在住のコンサルタント
であるデビット、G.I博士から入手したものである。LOT
＃125973−L/24のパクリタクセルは、不純物を多く含ん
でおり、標準サンプルとしては使用できなかった。純粋
な標準溶液の保管は、メタノール中で行われた。混合標
準溶液は、イソクラチック（isocratic）モードおよび
勾配モードにおける、異なる移動相に関する、共溶出お
よび、ピーク障害の影響を調べるために使用された。比
較的純粋な、パクリタクセル−セファロマニンにおい
て、部分的に削除されたLOT＃624955−1/13/0のもの
が、NCIから入手され、使用された。使用された原料物
質は、新たに12″に切断された茎であって、Taxus Medi
aの“ヒクシー（Hicksii）”を、MI州、グランドヘブ
ン、ゼレンカナーゼリーのレンカマ農場（Renkema Farm
s）から入手した。

針葉は、手で茎から採取し、60℃のオーブン中で、一
晩乾燥させられた。

針葉の典型的な固形分は、約40％であった。

乾燥された針葉を、それから、20,000rpmのジァンカ
＆クンケル（Janke＆Kunkel）の粉砕機を用いてすり砕
き、微粒子（70メッシュ）とした。HPCLを用いたタキセ
ン類の分析は、コンピューター制御された３成分系の勾
配システム（モデル2350ポンプ／モデル2360 波長変換
検知機（モデルV4）付きコントローラー、イスコ、リン
カーン、NE州）およびレオダインモデル7125インジェク
ターであった。長さ15cm、５マイクロンのフェニルカラ
ムが、フェニル保護カラム（ライニン、ウーバーン、MA
州）とともに使用された。３溶液系のシステムは、グラ
ジエントシステムとして用いられ、Ａ＝60％メタノー
ル、Ｂ＝40％メタノール/40％アセトニトリルおよび、
Ｃ＝100％メタノールである。流量は、1.0ml/分であ
り、検出波長は、228nmを使用した。この勾配システム
は、標準サンプル間の優れた分離効果を示し、バッカチ
ンIIIを、あるサンプルにおいて定量分析が可能な程、
十分に溶剤から取り出すことができた。また、55％メタ
ノール:12％アセトニトリルを1.0m/min.で流し、検出波
長228nmを用いた、イソクラチック移動相も同様に使用
された。かかるHPCLを用いたわれわれの分析技術は、パ
クリタクセル／セファロマンニンの部分削除サンプルの
分析についても、NCIやポリサイエンス会社において確
認評価された（Bio−Engにおいては23.8％パクリタクセ
ル、44.3％セファロマンニンの条件で実施し、それに対
してNCIでは、23.8％パクリタクセル、43.6％セファロ
マンニンの条件で実施した。）。

使用した他の分析または準備装置としては、シングル
ビームUV/VIS 分光光度計（日立製、モデル110−1
0）、フリードリッヒ凝縮器およびフアットマンセルロ
ースシンブル付きソックレー抽出器（VWR）、マイクロ
回転蒸発器（ビューレーインストルメンツ、モデル4214
−00）、およびジフェニルおよびシリカプレート付きの
薄層クロマトグラフシステムがある。薄層クロマトグラ
フシステムは、タキソイドに関して、HPLCよりもかなり
感度に劣ることが確認されたため、他の用途には使用さ
れなかった。

一般的なパクリタクセルの分析方法は、有機溶剤、部
分的には塩化メチレンを用いた抽出方法に関与してお
り、アセトニトリル−メタノール−水移動相を使用し
て、フェニルカラムの同定に使われた。

これらのシステムは、本皮サンプルから良好に抽出す
るものの、針葉試料は、この逆位相システムのパクリタ
クセルと共溶離する化合物を含んでいる。メタノール抽
出、部分的に塩化メチレン抽出およびミニカラムを用い
た分析方法の清掃は、228nmから280nmの純粋なパクリタ
クセル吸収データについて、共溶離する化合物の影響を
除くために行われる。

Taxus brevifoliaのイチイ針葉および樹皮中のパクリ
タクセルの測定に関する方法が幾つか公表されている。
本発明の実施例は、単純化された抽出技術、シリカミニ
カラムを用いた洗浄および228nmおよび280nmにおける吸
収データを用いた最終的な定量を含むことを特徴とす
る。この方法は、これまでに公表された方法によっては
測定されない、共に溶離される不純物についての補正を
成し遂げる。

HPLCシステムは、日常的分析業務のためのISCO V4検
出器を含むISCO3 3成分勾配装置（Lincoln,NE）、228nm
および280nmにおける同時定量のためのISCO Ｓ 500検
出器、および３次元スペクトラルスキャンを生じるスペ
クトラフィジックススペクトラフォーカスモデルSF101
−0122検出器からなる。シリカミリカラム（01−00SPIC
Eカートリッジ）はレイニンインスツルメント社、Wobur
n,MAから得られた。カラムクロマトグラフィーに用いら
れたシリカはEMScience社からカタログ番号10180−３シ
リカゲル40,70−230メッシュとして供給された。

Taxusの枝の試料は60℃において16−20時間乾燥し
た。針を幹から取り出し、Waringのブレンダーによりす
りつぶし、そして70メッシュスクリーンで篩にかけた。
篩を通過しなかった物質を再びブレンドして、サンプル
の90％がスクリーンを通過するようにした。

すりつぶした試料（200mg）を40mlのバイアル中で秤
量した。メタノール（30ml）を加え、そして磁気攪拌機
を用いてサンプルを一晩撹拌した。抽出物を＃40Whatma
nペーパーで濾過して、15mlの水と10mlの塩化メチレン
を含む250ml分液ロートに集めた。抽出容器は30mlの塩
化メチレンで洗浄して、この洗浄液を濾過して分液ロー
トに集めた。

メタノール−水の層は３倍容のメチレンクロリド（各
々50ml）で抽出し、そしてこれらの抽出物を250ml回転
蒸発フラスコに移した。必要に応じてさらに水およびメ
タノールを加えて、層の分離を生じさせるかまたは明瞭
にした。抽出は200mlの全容積が回収されるまで続け
た。抽出物を蒸発させて乾燥を明確にした。痕跡料の残
余の水は20mlのアセトン、続いて25mlのヘキサンで除去
し、再び抽出物を乾燥させた。次に、サンプルを再び8m
lの塩化メチレンに溶解した。

抽出物の塩化メチレン溶液をゆっくりとシリカミリカ
ラムを通過させ、そしてカラムは別の4mlの塩化メチレ
ンで洗浄した。この洗浄により、ロウ様の非極性物質が
除去され、パクリタクセルはカラム上部付近の緑色のバ
ンド中に含まれた。溶出液を塩化メチレン中の４％アセ
トンに変更して、緑色のバンドがカラムから出始めたと
きに溶出を止めた。次に、溶出液を塩化メチレン中の20
％アセトンに変更し、この溶剤の２つの10ml部分を用い
て、パクリタクセルを含むバンドをカラムから溶出し
た。抽出物は回転蒸発を用いて乾燥させ、そして残余物
を2.00mlのメタノール中に取り出した。

HPLCカラムは、レイニン80−D15−C5マイクロソーブ
５ミクロン、4.6mm×15.0cmフェニル結合相カラムであ
り、1.5cmのフェニルガードカラムを備えていた。移動
相は12％アセトニトリルおよび55％メタノールであり、
残りは水であった。流速は1.0ml/分であった。パクリタ
クセルの標準物を0.050mg/mlの濃度でメタノール中に用
意した。注入容積は標準物およびサンプルの両方に関し
て10マイクロリットルであった。ピークの高さは228nm
および280nmにおけるデュアルチャンネルモードにおい
て測定し、そしてパクリタクセルを以下の式により定量
した： Taxusの針葉および樹皮両者からの抽出物は古典的な
有機層抽出並びに超臨界流体抽出を用いて調製した。分
析は、フェニルカラムを用いた逆層HPLC、および228nm
における単一波長検出を用いて、パクリタクセル含有量
に関する0.04％から0.05％の範囲の乾燥バイオマスの生
成量を用いて、我々の実験室で実施された。これらの抽
出物の一部は続いて、確認分析のためにナショナルキャ
ンサーインスティテュート（フレデリック、メリーラン
ド）に提出した。フォトダイオードジンレツ検出器を備
えたHPLCを用いて実施されたそれらの分析から、針葉試
験に関して280nmにおける大きな吸収を示す物質の存在
が示された。樹皮サンプル、パクリタクセル対照混合物
中のすべての化合物、および純粋なパクリタクセルはこ
の共に溶出される化合物を示さなかった。この夾雑物の
発見により、我々はその単離を促され、その結果、パク
リタクセルのピーク中にその存在がそのスペクトルの特
徴から補償された。

干渉化合物が逆層システムにおいてパクリタクセルと
共に溶離されるので、我々は通常相システムを用いて分
離をした。タキサスメディアの「Hicksii」針の27gのサ
ンプルはメタノール−トルエンにより抽出され、22mm×
250mmのシリカゲルのカラム上でクロマトグラフされ
た。迅速な分離が行われ、塩化メチレン中の50％アセト
ンを用いてカラムからパクリタクセル画分を取り出し
た。この抽出物を蒸発により乾燥し、塩化メチレン中の
９％アセトンに再び溶解し、そして塩化メチレン中の９
％アセトンで平衡化された第二の22mm×250mmシリカゲ
ルカラム上においた。ゆっくりとしたアセトンの勾配が
始まり、そしてアセトン濃度は270nmにおいて監視し
た。

アセトン濃度が９％から15％に徐々に増加した、13の
200ml画分を取った。画分＃４は針サンプルのクロマト
グラフのスキャンにおける280nmに見られたピークのパ
ターンと正確に適合するパクリタクセル保持時間領域に
おけるピークのパターンを含んだ（図3aおよび3b）。こ
れらの干渉ピークのスペクトルのスキャンは幾つかの共
通の特徴を示した。干渉物質は280nmにごく近い吸収最
大、235nmにごく近い吸収最小、およびＡ（280）/A（22
8）に関する約3.5の応答比を有した。

画分＃５は画分＃４と同様の吸収パターンを示した
が、しかしながら、この画分の物質量は同じクロマトグ
ラフパターンでマスを減少させた。画分＃６、＃７、お
よび＃８は本質的にマスを有さない。パクリタクセルは
最初に、画分＃９において大きなピークとしてごく僅か
な量のセファロマニンと共に出現した。画分＃10は大き
なピークのパクリタクセルおよびセファロマニン両者を
含んだ。これらのパクリタクセルのピークは純粋パクリ
タクセルと同一のスペクトルスキャンを示し、そしてＡ
（280）/A（228）に関して約0.05の値を生じた。

連立方程式を設定してパクリタクセルのピークのPF
（精製因子）を計算した： 式中、Ａ（280）＝AT（280）＋AU（280） Ａ（228）＝AT（228）＋AU（228） および、Ａ（280）＝280nmにおける全吸収 AT（280）＝280nmにおけるパクリタクセルの
吸収 AU（280）＝280nmにおける未知物質の吸収 但し、K1＝AU（280）/AU（280）＝3.50（計算値） K2＝AU（228）/AU（228）＝0.05（計算値） および、K3＝Ａ（280）/A（228） 次に、 我々の測定値においてK2およびK1の代用として、以下の
式が得られた： PF＝1.0145−0.29×Ａ（280）/A（228） （２） 上記の式を用いて実験結果を補正した。サンプルのほ
とんどは精製因子0.91を生じる約0.35の吸収比を与え
た。即ち、装飾イチイ、Taxus Media「Hicksii」の針の
パクリタクセル含有量の値は228nmにおける吸収を用い
たフェニルカラムの逆層HPLCで0.050％と測定され、乾
燥バイオマス重量基準により0.046％と補正された。フ
ェニルカラム結合カラムを用いてパクリタクセルに関し
て分析する他の研究者は、彼らのパクリタクセルピーク
が下に潜んでいる干渉物質が含むかもしれないという可
能性に気づくべきであり、そしてパクリタクセルピーク
のスペクトルスキャンを稼働させ、および／または228n
mにおける監視に加えて280nmにおける監視を行うことに
よりこれらの干渉物質に関して試験すべきである。

実施例 実施例1:有機相抽出 臨界流体抽出及び精製試験と平行して、比較の目的で
いくつかの有機相抽出技術を使用した。これらの技術は
一般に、ヘキサン洗浄、メタノール（Ｍ）／塩化メチレ
ン（MC）抽出、３〜４段階の塩化メチレン−水相分配に
つづく蒸発による乾燥及びメタノールへの再溶解から成
る。HPLC分析の前に、シリカのミニ−カラム（長さ1c
m）を非常に不純な画分を除去するために使用した。

最初に、乾燥粉砕粉末をヘキサンで洗浄して非極性の
ロウ類を除去した。次の２つの手順を使用した：ソック
レー抽出及び室温におけるヘキサン過剰（10mL/g）での
撹拌棒による混合−後者の技術はスネイダー（Snader）
技術と呼ばれる。この手順にかかった時間は８〜24時間
であった。

ヘキサン抽出物を乾燥し、ヘキサンに再溶解し、濾過
し、そしてヘキサン：アセトン溶離液を使用してシリカ
のミニ−カラム上で洗浄した。ヘキサンで洗浄した針葉
を乾燥し、次にM/MCの50/50混合物で抽出した。ソック
レー技術によるこの抽出を３時間実施し、さらに12〜15
時間放置した；スネイダー技術において、試料を一晩回
転させた。粗M/MC抽出物を蒸発して乾燥し、そしてMCへ
再溶解した。等量のこの画分と蒸留水とを混合し、次に
分液ロート中で分離させた。

MC相を回転蒸発器に入れ、そして水相をMCで再抽出し
た（さらに３回まで）。スネイダー抽出で形成された水
/MCエマルジョンを破壊するために少量のメタノールを
使用した。MC部分を回転蒸発器で乾燥し、そして風袋を
はかった。HPLC分析のために、乾燥したMC抽出物をメタ
ノールに再溶解した。これらの試験の結果を、パクリタ
クセルについての初期乾燥バイオマスの百分率及び純度
についての乾燥抽出物重量の百分率として、表１に列挙
した。

実施例2:臨界流体相抽出 先の試験は臨界流体抽出が針葉の中の水分の存在によ
って妨害されたことを示した。したがって、全ての以降
の試験は、質量移動抵抗を最小化し、そして暴露表面積
を最大化するために観葉（ornamental）イチイの乾燥粉
砕した針葉について実施した。試験の第２の結果は、推
測されたように、臨界流体抽出が溶媒の極性によって制
御されることを示した。この結果において、試料は増加
していく極性の臨界流体溶媒によって連続して抽出され
た。これらの試験の結果（全て20790kPa（3000psi）及
び60℃で実施）を表２に列挙する。

上の表２において、パクリタクセルの％はもとの乾燥
試料の質量を基準とし、純度の％は抽出した質量を基準
としている。

実施例３ フレオン−22、クロロジフルオロメタン（CHClF₂）の
結果を確認しそして改善するために数回の試験を実施し
た。例えば、TAXC−７をフレオン−22の10試料容量で20
分間のみ実施した。数回の試験は抽出効率についての容
量的な処理量及び滞留時間の影響を評価するために行っ
た。試験はまた非常に非極性のロウ類がパクリタクセル
の臨界流体相への質量移動（mass transfer）を禁止す
るかどうかを決定するために実施した。これらの試験は
臨界流体の100試料容量は試料からパクリタクセル全て
を抽出するのに十分であるより多いこと、及び極性のロ
ウはパクリタクセルの質量移動を妨害しないことを示唆
した。結果として、以降の試験は、ヘキサンで洗浄した
針葉かまたは超臨界流体二酸化炭素（SCF CO₂）抽出し
た針葉のいずれかについて、臨界流体溶媒の最小の100
試料容量で実施した。SCF CO₂は試験した条件でのその
非極性及び密度によって、非常にヘキサンに類似して挙
動し、針葉から約７％の極性ロウ類を抽出し、パクリタ
クセルを抽出しなかった。

オゾン枯渇剤であるフレオン−22を代替するために、
SCF CO₂の極性をメタノールの添加によって変性した。
温度、圧力及び補助溶媒の条件は20790kPa（3000psig）
及び60℃でのフレオン−22に適合するヒルデブランド溶
解度パラメーターを基準として選択した。これらの試験
の結果を表３に列挙する。

これらの試験（残留物の有機相抽出／残留物のHPLC分
析に基づく）は利用できるパクリタクセルの約99＋％を
抽出した。

実施例4:圧力及び温度の影響 圧力、温度及びメタノール濃度に対する感受性試験の
結果を表４に列挙する。、 表４に列挙した試験の残留物のSCF抽出物及び有機相
抽出物の平均パクリタクセル含量は0.0468±0.0022であ
り、TAXC−25及び26の残留物中にパクリタクセルは発見
されなかった。TAXC−29及びTAXC−30がフレオン（表２
中のTAXC−７）の結果に最も近かった。

実施例5:臨界流体抽出及び精製 CXP 極性の変性剤を使用しないフレオン22を、シリカのHP
LC（water'sのMicroporasil）カラムが臨界流体相から
パクリタクセルを選択的に取り出すために使用できるか
どうかを決定するために使用した。これらの試験の結果
を表５に列挙する。

これらの試験のそれぞれの前留分（forerun）を50:50
のM:MC溶媒トラップ中に集めた。それぞれの場合におい
て、パクリタクセルは含まないかなりの素材が前留分中
に集められた。例えば、オリジナルの乾燥試験素材の1
2.1％がTAXC−34の前留分から集められ、これをTAXC−3
4Fと呼ぶ。表５のTAXC−34CはシリカHPLCカラム上に選
択的に付着した物質（試料素材の2.3％）を意味する。
試験完了後にメタノールでカラムから溶離したこの素材
は逆相HPLCクロマトグラフィーによって0.626％のパク
リタクセルを含有すると定量された。臨界流体処理され
た試料中のパクリタクセルの残留濃縮物、TAXC−34R
は、有機相抽出及び逆相HPLC分析によって0.0324％であ
ると決定された。したがって、試験TAXC−34の全パクリ
タクセル含量は0.0470％であり、そのうちの31.1％は13
（0.626/0.047）の精製係数で回収された。表５に列挙
したデータはTAXC−32Cにおいて13890kPa（2000psig）
の背圧で最適の結果が得られ、35の精製係数でパクリタ
クセルの34.9％が回収された。

実施例6:超臨界CO₂/極性補助溶媒でのCXP フレオン−22を置換するために、SCF CO₂と一緒に数
種の補助溶媒系を評価した。メタノールは、シリカカラ
ム上の吸着部位についてパクリタクセルと競合して勝る
ので、もはや選択される補助溶媒ではない。このことは
シリカのミニカラム試験及びシリカHPLCカラムを使用し
た以降の試験において確認された。評価した補助溶媒は
メタノール、塩化メチレン、アセトン、ブタノール及び
エタノールであり、それぞれ20790kPa（3000psig）及び
60℃においてSCF CO₂中10モル％であった。全ての試験
を13890kPa（2000psig）の背圧で実施した。補助溶媒と
してメタノール及びエタノールを使用した試験の前留分
においてかなりの量でパクリタクセルを見いだした。ブ
タノールでの結果は不明瞭であった。

10モル％で補助溶媒として塩化メチレン及びアセトン
を使用して実施した試験の前留分にはパクリタクセルは
発見されなかった。塩化メチレン補助溶媒試験（TAXC−
36C）において、シリカカラムから16の精製係数で約半
分のパクリタクセル（0.0242％）が回収された。SCF C
O₂/アセトン試験（TAXC−37C）ではシリカカラムからよ
り少量のパクリタクセル（精製係数15で0.0147％）が得
られた。

実施例7:勾配クロマトグラフィーによるCXP HPLCカラムの頭部に付着した物質をクロマトグラフ法
によって溶離することによって精製係数がさらに改善さ
れた。シリカカラムの歴史及び保持挙動は未知で、低い
極性から中くらいの極性へ進める勾配アプローチを選択
した。これらの試験の結果を表７に列挙する。

シリカカラムから回収された％パクリタクセルは、全
パクリタクセル（７つの試験、TAXC−34〜40からの平均
0.047±0.0025％）とバイオマス残留物中のパクリタク
セルとの間の差異によって決定した。前留分にはパクリ
タクセルは発見されなかった。TAXC−41Cは、1.0ml/分
の流量で60分間のヘキサン：塩化メチレン：メタノール
勾配によってクロマトグラフ法によって溶離された。指
針として228nmの吸収を使用して25の画分を風袋を測っ
た容器に集めた。収集容器をクロマトグラフの走査にお
けるそれぞれの谷において変更した。画分を蒸発させて
乾燥し、そして抽出重量を決定するために秤量した。画
分を次に、逆相フェニルカラム上での慣用のHPLC分析の
ために適切な量のメタノールに再溶解した。仮定「パク
リタクセルバンド」のクロマトグラムは、この画分は主
としてパクリタクセル及びセファロマンニン（cephalom
annine）から成ることを示した。隣接するバンドの分析
はパクリタクセルの約95％が仮定「パクリタクセルバン
ド」中に溶離したことを示した。パクリタクセルの純度
は、少しの量の素材が回収されたので確認できなかっ
た。しかし、純度は約17％であると推定され、ほぼ360
の精製係数を得た。

表７中のTAXC−43Cはその臨界流体抽出、選択的付着
及びクロマトグラフの溶離条件によってTAX−41Cと異な
る。TAX−34Cについて、ヘキサン非洗浄試料を最初に13
890kPa（2000psig）及び40℃においてSCF CO₂の100試
料容量で抽出し（TAXC−42）、ロウ類及び他の非極性成
分を除去した。試料乾燥質量の6.6％である抽出物はパ
クリタクセルを含まなかった。TAXC−42からの残留物を
次にTAXC−43中に10モル％のアセトンを含むSCF CO₂で
抽出した。この抽出は13890kPa（2000psig）及び41℃に
おいて実施し、この条件は商業的装置の主たる操作経費
を最小化する。さらに、臨界流体再圧縮の経費を最小化
するために可能なかぎり等圧に近接させて系を操作し
た。

付着したパクリタクセル及び他の不純物を、画分の増
加した分解能が得られるように延長されたキサン:n−プ
ロパノール：メタノール３成分勾配によって、シリカカ
ラムからクロマトグラフ法によって溶離された。この試
験において、図4aに示す７つのみの画分が得られた。こ
の画分を風袋を測った容器に集め、回転蒸発器で乾燥さ
せ、メタノールに再溶解して分析した。画分番号５のHP
LCクロマトグラム（仮定「パクリタクセルバンド」）を
図4bに示す。この走査はパクリタクセルバンドは主とし
てパクリタクセル及びセファロマンニンを含むことを示
す。精製係数はほぼ130であり、％純度はHPLC分析及び
画分番号５についての4.0ミリグラムの重量に基づき6.2
％であった。

TAXC−45C及びTAXC−47CはTAXC−43Cと同様の方法で
実施した。全ての３つ試験は、SCF CO₂洗浄を先行し
た。TAXC−45Cにおいて、18モル％のアセトンを含むSCF
CO₂がカラム全長にわたりパクリタクセルを広げる十
分に極性であるので、パクリタクセルは鋭いピークでカ
ラムからクロマトグラム法によって溶離されなかった。
このことは個々に、シリカのミニ−カラムを使用した試
験において確認された。TAXC−47Cにおいて、SCF CO₂
中の高い塩化メチレン濃度（21モル％）はHPLCカラムの
頭部にパクリタクセルを保持するのに有効であるが、生
のバイオマスからのパクリタクセルの抽出において、21
モル％メタノール補助溶媒のように有効ではなかった。
本明細書中において記述した臨界流体抽出及びクロマト
グラフ精製法はセファロマンニンよりもパクリタクセル
について選択的であると考えられる。TAXC−43Cび画分
番号５中のパクリタクセルのセファロマニンに対する濃
度（図4bを参照されたい）は2.22であるが、針葉中の比
は1.08であると測定された。同様のT/C比がTAXC−45C
（2.04）及びTAXC−47C（2.08）について得られた。

SCF CO₂洗浄試料及びTAXC−43、45及び47の前留分か
らの抽出物の試験は、10−デアセチルバカチンIII及び
バカチンが、いくつかの極性可溶物及びパクリタクセル
から有効に分離され得ることを示す。我々は、これらの
バカチンは試験条件において極性の補助溶媒を含むSCF
CO₂に非常に溶解性であり、そして高い極性の条件（2
0％を超えるアセトン−その抽出及び臨界流体による精
製に有利な条件）でシリカカラム上に選択的に吸着され
得ることを発見した。

本発明の態様は以下の通りである。

1.タキソイド類をタキソイド含有原料物質から抽出する
方法であって、次の工程： ａ）前記原料物質を第１流体にさらすことによって原
料物質を脱ロウすること、ここで第１流体は臨界または
近臨界流体を含んで成り、前記ロウは第１流体に溶解し
てロウ含有抽出物及び脱ロウされた原料物質を形成し； ｂ）前記脱ロウされた原料物質を第２流体にさらして
タキソイド抽出物及び廃棄物質を形成すること、ここで
前記第２流体は臨界または近臨界流体及び極性補助溶媒
を含んで成り、 ｃ）クロマトグラフィー手段を通して前記タキソイド
抽出物中の不純物からタキソイド類を分離してタキソイ
ド及び溶離液を生成すること を含んで成る、前記の方法。

2.前記クロマトグラフィー手段が少なくとも１つのカラ
ムを含む、１に記載の方法。

3.前記クロマトグラフィー手段が第１カラム及び第２カ
ラムを含み、前記第１カラムがタキソイドを保持するた
めの正常シリカ吸着カラムを含んで成り、前記第２カラ
ムがタキソイドを分離または精製するための逆相吸着カ
ラムを含んで成る、２に記載の方法。

4.前記ロウ含有抽出物が前記第１カラムによって受け取
られ、前記第１カラムが臨界または近臨界流体／補助溶
媒混合物中に溶離するタキソイドを保持している、３に
記載の方法。

5.前記タキソイド抽出物が前記第１カラムによって受け
取られ、前記第１カラムがタキソイド類を保持し、かつ
臨界または近臨界流体補助溶媒混合物中に溶離する前記
タキソイドを放出して第１タキソイド溶出液を形成し、
そして前記第１タキソイド溶出液を減圧してタキソイド
類及び臨界または近臨界流体／補助溶媒混合物を生じ
る、４に記載の方法。

6.前記第１カラムに保持された前記タキソイド類が第３
流体によってカラムから溶離されて第２溶出液を形成
し、前記第３流体は臨界または近臨界流体及び極性補助
溶媒の混合物を含んで成り、前記極性補助溶媒は前記第
２流体と比較してより大きな極性を示す、５に記載の方
法。

7.前記第２溶出液が前記第２カラムに向けられ、前記第
２カラムがタキソイド類を保持しそして臨界または近臨
界流体及び補助溶媒を放出する、６に記載の方法。

8.前記第２カラムに保持された前記タキソイド類が第４
流体によって溶離されてタキソイド溶出液を形成し、前
記第４流体は臨界または近臨界流体及び極性補助溶媒の
混合物を含んで成り、前記補助溶媒は前記第２流体より
低い濃度で存在する、７に記載の方法。

9.前記タキソイド溶出液が減圧されてタキソイド及びタ
キソイド類を実質的に含まない臨界または近臨界流体及
び極性補助溶媒混合物を形成する、８に記載の方法。

10.臨界流体と補助溶媒との混合物がタキソイド類が取
り出された後に再循環される、５、７または９に記載の
方法。

11.タキソイド類が前記第１カラムから溶離されるまで
前記臨界または近臨界流体及び補助溶媒が再循環されそ
してその後第２カラムに向けられ、前記タキソイド類が
前記第２カラムによって取り出されてタキソイド類を実
質的に含まない臨界または近臨界流体／補助溶媒混合物
を生成する、３に記載の方法。

12.前記タキソイド類を実質的に含まない臨界または近
臨界流体／補助溶媒混合物が減圧されて不純物に溶液を
残させるタキソイド類を実質的に含まない臨界または近
臨界流体／補助溶媒混合物を生成する、11に記載の方
法。

13.前記タキソイド類バカチンIII及び10−デアセチルバ
カチンIIIが第１カラムから溶離される、５に記載の方
法。

14.減圧で生成された前記精製されたタキソイドがバカ
チンIII及び10−デアセチルバカチンIIIである、５に記
載の方法。

15.減圧で生成された前記タキソイドがタキソール及び
セファロマンニンであり、９に記載の方法。

16.前記臨界または近臨界流体及び補助溶媒混合物が抽
出物冷却器を通って、再循環される精製された臨界また
は近臨界流体及び補助溶媒を形成する、５、７または９
に記載の方法。

17.前記補助溶媒が、メタノール、エタノール、ブタノ
ール、プロパノール、塩化メチレン及びアセトンより成
る極性溶媒の群から選択される極性溶媒である、１に記
載の方法。

18.前記超臨界流体が、二酸化炭素、フッ化炭化水素及
び亜酸化窒素より成る群から選択される１種以上のガス
を含んで成る、１に記載の方法。

19.前記タキソイドが、タキソール、セファロマンニ
ン、バカチンIII、10−デアセチルバカチンIII、及びデ
アセチル−７−エピタキソールより成る１種以上のタキ
ソイド類から選択される、１に記載の方法。

20.前記原料物質が針葉を含んで成る、１に記載の方
法。

21.前記タキソイド類が臨界または近臨界流体及び補助
溶媒混合物によって前記第２カラムから溶離され、タキ
ソイド含有抽出物を形成し、前記タキソイド含有抽出物
が減圧及び熱にさらされて前記タキソイドを前記溶出液
から分離する、12に記載の方法。

22.ロウ類及び他の成分を含む原料物質からタキソイド
類を単離するための装置であって、 原料物質、臨界または近臨界流体及び補助溶媒を受け
取るために適合した部屋； 臨界または近臨界流体を前記部屋に向けかつ前記原料
物質を脱ロウ条件にさらしてロウ含有抽出物及び脱ロウ
された原料物質を形成するための、前記部屋と連絡して
いる臨界または近臨界流体源； 前記ロウ含有抽出物を受け取るための、前記抽出部屋
と連絡しているロウ抽出物受取手段； 前記臨界または近臨界流体及び極性補助溶媒を前記部
屋に向け、かつ前記原料物質を抽出条件にさらしてタキ
ソイド抽出物及び廃棄物質を形成するための、前記部屋
と連絡している臨界または近臨界流体及び極性補助溶媒
源；並びに 前記ロウ抽出物及びタキソイド抽出物を受け取り、そ
してクロマトグラフ法によってタキソイド及び溶離液を
形成するための前記抽出部屋と連絡しているタキソイド
精製手段 を含んで成る前記の装置。

23.前記ロウ含有抽出物からバカチンを取り出してバカ
チン及びタキソイドを含まない臨界または近臨界流体を
形成するために、前記ロウ抽出物受取手段がバカチン精
製アセンブリーと連絡している、22に記載の装置。

24.前記タキソイド精製手段が第１シリカ吸収カラムお
湯帯第２逆相カラムを含む、22に記載の装置。

25.前記タキソイドが前記第２逆相カラムから溶離され
てタキソイド含有溶出液を形成し、前記溶出液が減圧及
び熱にさらされてタキソイド及びタキソイドを実質的に
含まない臨界または近臨界流体／補助溶媒混合物を形成
する、24に記載の装置。

26.前記ロウ含有抽出物及び溶出液が減圧及び熱にさら
されて廃棄物質及び再循環のための臨界または近臨界流
体／補助溶媒混合物を形成する、22に記載の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｂ０１Ｄ 15/08 (56)参考文献 欧州特許出願公開521675（ＥＰ，Ａ １) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｎｏ．587，ｐ．300 −305（1991) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏ ｌ．15，Ｎｏ．４，ｐ．697−706 （1991) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 305/14 A61K 35/78

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】タキソイド類をタキソイド含有原料物質か
   ら抽出する方法であって、次の工程： ａ）前記原料物質を第１流体にさらすことによって原料
   物質を脱ロウすること、ここで前記ロウは第１流体に溶
   解してロウ含有抽出物及び脱ロウされた原料物質を形成
   し； ｂ）前記脱ロウされた原料物質を第２流体にさらしてタ
   キソイド抽出物及び廃棄物質を形成すること、 ｃ）クロマトグラフィー手段を通して前記タキソイド抽
   出物中の不純物からタキソイド類を分離してタキソイド
   及び溶離液を生成すること を含んで成り、 第１流体が0.0〜0.2デバイの双極子モーメントを有する
   臨界流体（超臨界流体を包含する）又は近臨界流体から
   成り、そして 第２流体が0.0〜0.2デバイの双極子モーメントを有する
   臨界流体（超臨界流体を包含する）若しくは近臨界流体
   と極性補助溶媒とから成るか、又は 第２流体がクロロジフルオロメタンから成り、 該極性補助溶媒が、メタノール、エタノール、ブタノー
   ル、プロパノール、塩化メチレン及びアセトンからなる
   群から選択される、 前記の方法。
2. 【請求項２】ロウ類及び他の成分を含む原料物質からタ
   キソイド類を単離するための装置であって、 原料物質、臨界流体（超臨界流体を包含する）または近
   臨界流体及び極性補助溶媒を受け取るために適合した部
   屋； 臨界流体（超臨界流体を包含する）または近臨界流体を
   前記部屋に向けかつ前記原料物質を脱ロウ条件にさらし
   てロウ含有抽出物及び脱ロウされた原料物質を形成する
   ための、前記部屋と連絡している臨界流体（超臨界流体
   を含む）または近臨界流体源； 前記ロウ含有抽出物を受け取るための、前記抽出部屋と
   連絡しているロウ抽出物受取手段； 前記臨界流体（超臨界流体を包含する）または近臨界流
   体及び極性補助溶媒を前記部屋に向け、かつ前記原料物
   質を抽出条件にさらしてタキソイド抽出物及び廃棄物質
   を形成するための、前記部屋と連絡している臨界流体
   （超臨界流体を包含する）または近臨界流体及び極性補
   助溶媒源；並びに 前記ロウ抽出物及びタキソイド抽出物を受け取り、そし
   てクロマトグラフ法によってタキソイド及び溶離液を形
   成するための前記抽出部屋と連絡しているタキソイド精
   製手段 を含んで成り、 臨界流体（超臨界流体を包含する）または近臨界流体が
   0.0〜0.2デバイの双極子モーメントを有し、該極性補助
   溶媒が、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパ
   ノール、塩化メチレン及びアセトンからなる群から選択
   される、 前記の装置。