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JP3462220B2 - 生体分子の同定および特徴付け用のゲル、方法および装置 - Google Patents

生体分子の同定および特徴付け用のゲル、方法および装置

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JP3462220B2
JP3462220B2 JP52445098A JP52445098A JP3462220B2 JP 3462220 B2 JP3462220 B2 JP 3462220B2 JP 52445098 A JP52445098 A JP 52445098A JP 52445098 A JP52445098 A JP 52445098A JP 3462220 B2 JP3462220 B2 JP 3462220B2
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Oxford Glycosciences UK Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 1.緒言 本発明は、生物学的試料に存在する分子を効率よく系
統的に試験し、健康および疾病におけるそれらの役割を
決定するためのコンピューター利用方法および装置に関
する。詳細には、本発明は、グリコシル化され、または
他の翻訳後修飾を示す蛋白質を含む生物学的試料に存在
する蛋白質の系統的同定および特徴付けを含むプロテオ
ミックス（Proteomics）の新たな分野に関する。プロテ
オミックスアプローチは、診断、予後または治療に対す
る応答のモニタリングに有用である蛋白質を同定し、疾
病の予防および治療のために蛋白質標的を同定すること
において顕著な利点を提供する。
2.発明の背景 分子遺伝学における最近の進歩は、所与の細胞または
組織で発現された核酸を研究するための高処理量の配列
決定技術および系統的戦略の利益を明かにした。これら
の進歩は、蛋白質、オリゴ糖および他の生体分子の複合
混合物からのサブセットまたは個々の分子を同定または
選択し、さらなる分析のためにかかる選択生体分子を単
離するオペレーター非依存性コンピューター媒介法の必
要性を強調した。
標的に駆動される薬物発見および合理的薬物デザイン
についての戦略は、疾病過程および治療介入のための標
的のごとき成分の使用に因果関係的に関連する蛋白質の
ごとき鍵となる細胞成分を同定することを必要とする。
しかしながら、蛋白質のごとき生体分子を分析する現在
の方法は、時間がかかり、高価であり、検出、イメージ
ング、精製および分析において非能率さを欠点として持
つ。
ゲノミックスアプローチは、生物学的過程の遺伝子的
基礎の我々の理解を進歩させたが、それはかなりの制限
を有する。第一には、同定された遺伝子−−および特に
部分的cDNA配列によってコードされた産物の機能は、し
ばしば未知である。第二には、蛋白質の翻訳後修飾につ
いての情報が、その遺伝子配列の知識からまれにしか導
き出せず、大部分の蛋白質が、生化学的特性に深く影響
し得る（グリコシル化およびリン酸化のごとき）翻訳後
修飾を受けることは今や明かである。第三には、蛋白質
発現は、mRNAの細胞レベルが、必ずしもその遺伝子産物
の発現レベルと相関しないように翻訳後制御にしばしば
付される。第四には、核酸のランダム配列決定のための
自動化戦略は、もしあれば、いずれのものが臨床的また
は科学的重要性の徴候を示すかの決定に先立って、非常
に多数の核酸分子の分析を含む。
これらの理由については、蛋白質、オリゴ糖および他
の生体分子の直接的分析を介して生物学的または疾患の
過程において、蛋白質および炭水化物発現の、および一
般的に翻訳後修飾のパターンを試験することによってゲ
ノムデータを補足する必要がある。しかしながら、技術
的制約は、従来、生物学的試料中に存在する蛋白質およ
び他の生体分子の迅速で、対費用効果のよい、再現可能
な、系統的分析を妨げてきた。
3.発明の概要 本発明は、生物学的試料中の生体分子を同定、選択お
よび特徴付けするための効率のよい、コンピューター利
用方法および装置に指向される。本発明によると、二次
元アレイは、複合混合物中に存在する生体分子を分離す
ることによって生成される。本発明は、二次元アレイに
おいて検出された複数の生体分子の同一性および相対的
豊富さを表し、それによって複数の生物学的試料からの
プロフィールのコンピューター媒介比較を可能とするコ
ンピューター生成デジタルプロフィールを提供する。生
物学的試料をスクリーニングし、それらのプロフィール
を比較するためのこの自動化技術は、その存在、不存在
または改変された発現が注目する疾病および状態と関係
する個々の生体分子の迅速で効率よい同定を可能とす
る。かかる生体分子は、治療剤として、治療介入のため
の標的として、および診断、予後および治療に対する応
答を評価するマーカーとして有用である。また、この技
術は、その発現パターンが注目する疾患または状態と関
連する生体分子のセットの迅速でかつ効率よい同定を可
能とし；かかる生体分子のセットは、診断、予後および
治療に対する応答の評価用の一群のマーカーを提供す
る。
さらに、本発明の高処理量の自動化方法および装置
は、予め規定された基準により、生体分子の配列情報ま
たは他の構造的特徴の知識を必要とすることなく、個々
の分離された生体分子（または分離された生体分子のサ
ブセット）のオペレーター非依存性選択を可能とする。
これは、今度は、生物学的試料中で検出された選択され
た複数の生体分子の、自動化されたオペレーター非依存
性単離および並列的特徴付けを提供する。かくして、本
発明は、有利には、配列決定および構造的特徴付けに先
立って、生体分子の自動化選択を可能とする。一の特別
な具体例において、本発明は、（蛋白質のごとき）生体
分子の電気泳動に適しており、かつ当該ゲル中の１以上
の生体分子に会合した標識（例えば、１以上の蛋白質に
結合した蛍光標識）の検出に関し、当該ゲルが二次元空
間安定性を有し、支持体が実質的に非干渉性であるよう
に固体支持体に結合したゲルを供する。もう一つの特別
な具体例において、本発明は、デジタルプロフィールを
比較して二次元アレイで検出された１以上の生体分子を
選択し、ロボットデバイスに指令して二次元アレイから
かかる選択生体分子を単離する指示を生成する統合コン
ピュータープログラムを提供する。さらなる具体例にお
いて、該プログラムは、実験的試料および臨床的データ
のごとき関連データ、試料に対して行われた操作、およ
び試料の分析によって生成したデータを追跡する実験情
報管理システム（LIMS）をも実行する。
4.図表の簡単な記載 図１は、本発明の特別な具体例に従って異なる蛋白質
の混合物に対して行われる操作のフローダイアグラムで
ある。
図２は、本発明の特別な具体例において、コンピュー
ターによって行われる機能を示すフローダイアグラムで
ある。
図３は、本発明の支持されたゲルから生体分子を単離
するロボットデバイスのダイアグラムである。
5.発明の詳細な記載 本発明は、生物学的試料中の生体分子、例えば、蛋白
質を迅速で効率よく同定および特徴付けするための方法
および装置を提供する。本発明の一の適用では、生物学
的試料を２つの連続的分離工程に付す。第一分離工程に
おいては、生物学的試料を、生体分子を含む一次元アレ
イを生成するように一つの物理的および化学的特性によ
り分離する：例えば、第一軸に沿う等電点電気泳動によ
って蛋白質を分離する。第二分離工程においては、この
一次元アレイ中の生体分子を、分離された生体分子の二
次元アレイを生成するように第二の物理的または化学的
特徴により分離する：例えば、等電点電気泳動によって
分離された蛋白質を、第一軸に垂直な第二軸に沿うSDS
−PAGEに付す。分離された生体分子を続いてのイメージ
ング用の二次元アレイにしっかりと保持する。安定な二
次元アレイは長期間（例えば、数箇月または数年）貯蔵
または保管でき、選択された生体分子は、イメージング
から得られたデータの自動化コンピューター分析に基づ
き、いずれかの所望の時点にてアレイから回収できる。
二次元アレイを検出器で画像化して、各々検出された
生体分子についての一組のＸ、Ｙ座標およびシグナル値
を含むコンピューター可読出力を生成させる。所望なら
ば、コンピューター可読出力をスクリーンまたはいずれ
かの適当な媒体上にコンピューター生成画像として、コ
ンピューター媒介分析の前後にヒトオペレーターに表示
できる。コンピューター可読出力のコンピューター媒介
分析を行う結果、複数の検出された生体分子について、
各々のかかる生体分子の相対的豊富さを表すコンピュー
ター可読プロフィールおよび二次元アレイのそのＸ、Ｙ
座標から推定されるその属性を生じさせる。例えば、等
電点電気泳動に続いてSDS−PAGEによって分離された蛋
白質を含むゲルを画像化することから得られたプロフィ
ールは、複数の検出された蛋白質の等電点（pI）、見掛
けの分子量（MW）および相対的豊富さを表す。
本発明のコンピューター可読プロフィールは、特定の
基準を満足する１以上の生体分子を同定するためのコン
ピューター媒介分析に適する。一の具体例においては、
第一セットのプロフィールを第二セットのプロフィール
と比較して、該第一セットの全プロフィールに（また
は、第一セットのプロフィールの第一パーセンテージ
に）表され、第二セットのプロフィールには存在しない
（または、第一および第二パーセンテージが独立して特
定される場合、第二セットのプロフィールの第二パーセ
ンテージには存在しない）生体分子を同定する。他の具
体例においては、プロフィールのセットを比較して、も
う一つの試料セットのプロフィールの特定パーセンテー
ジより一の試料セットのプロフィールの特定パーセンテ
ージにおいて指定された高レベルの発現にて存在する生
体分子を同定し、あるいはその翻訳後プロセッシングが
もう一つに対する一の試料セットと異なる生体分子を同
定する。
そのように同定された１以上の生体分子を単離のため
に選択する。一の具体例において、さらなるヒトの介入
なくして予め定められたプログラムされた基準に従っ
て、この選択をコンピューターにより自動的に行う。も
う一つの具体例において、ヒトオペレーターは、コンピ
ューター媒介分析の結果を概観し、次いでコンピュータ
ーに選択を入れる。各選択された生体分子の単離では、
コンピューターは、ロボットデバイスを指令する機械可
読命令を生成して、（ａ）選択生体分子を含む二次元ア
レイの１以上の部分を取り出し、（ｂ）さらなる特徴付
けのために取り出された部分を１以上の適当な容器に運
ぶ。例えば、選択された蛋白質を分析して、その全また
は部分的アミノ酸配列を決定でき、いずれかの関連する
オリゴ糖部位を検出し特徴付けでき、また、翻訳後プロ
セッシング、例えば、リン酸化、ミリスチン酸化等の他
の態様を試験できる。本発明は、有利には、二次元アレ
イから取り出された生体分子の自動並列的プロセッシン
グを可能とし、それによって複数の選択生体分子の迅速
かつ効率的な特徴付けを促進する。図１は、本発明の一
の特別な具体例による試料のプロセッシングを示すフロ
ーチャートを示す。
本発明は、蛋白質を同定および分析するのに有用であ
るが、より一般的には、いずれの生体分子の同定および
分析にも適用できる。本明細書で用いられるごとく、
「生体分子」なる用語は、生物学的試料中に存在するい
ずれの有機分子をもいい、ペプチド、ポリペプチド、蛋
白質、オリゴ糖、脂質、ステロイド、プロスタグランジ
ン、プロスタサイクリンおよび（DNAおよびRNAを含む）
核酸を含む。本明細書で用いられごとく、「蛋白質」な
る用語は、グリコシル化および非グリコシル化蛋白質を
いう。
5.1 生物学的試料 本明細書で用いられるごとく、「生物学的試料」なる
用語は、（細菌および酵母のごとき）単細胞微生物およ
び（植物および動物、例えば、脊椎動物および哺乳動
物、とりわけ健康または見掛上健康なヒト対象者または
診断もしくは調べられるべき状態または疾病に罹ったヒ
ト患者のごとき）多細胞生物を含むいずれかの生存生物
から得られた、排出または分泌されたいずれかの固体ま
たは流動体の試料をいう。生物学的試料は、いずれかの
部位（例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄
液、房水または硝子液、またはいずれかの身体分泌
液）、浸出液、滲出液（例えば、感染または炎症の膿瘍
またはいずれかの他の部位から得られた体液）または関
節から得られた体液（例えば、正常関節、または慢性関
節リウマチ、変形性関節症、痛風または敗血症性関節炎
のごとき疾病に罹った関節）から得られた生物学的体液
であり得る。あるいは、生物学的試料は、（生検または
剖検標本を含む）いずれか器官または組織から得ること
ができ、または（初代細胞または培養細胞を問わず）細
胞またはいずれかの細胞、組織または器官に条件付けさ
れた培地を含むことができ、所要ならば、生物学的試料
は予備的分離技術を含む予備的処理に付すことができ
る。例えば、細胞および組織を抽出し、区別される亜細
胞画分中の生体分子、例えば、細胞の異なる部分に見出
される蛋白質または薬物の分離分析のために亜細胞性分
画に付すことができる。Deutscher（ed.）、1990、Meth
ods In Enzymology vol.182、pp.147−238参照（その全
てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）。同
様に、免疫沈降を行って、蛋白質のごとき抗原性的に関
連する生体分子を同定することができる。前記のFirest
one ＆ Winguth In Duetscher.pp.688−699参照（その
全てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）。
好ましくは、分析に有用な関連する臨床情報のカタロ
グを作り、対応する試料に索引を付し；コンピューター
ベースの実験情報管理システム（LIMS）がこの目的に好
ましい。好ましくは、かかる情報は、家庭歴、臨床的診
断、性別、年齢、国籍、居住地、就職地および医学的履
歴のごとき患者データを含む。また、好ましくは試料自
体に関連した情報は、LIMSに索引を付け；かかる情報
は、試料のタイプ、試料が採取された正確な場所、試料
が採取された日付および時間、収集および貯蔵の間の時
間、貯蔵方法および試料を得るために用いられた手法を
含むことができる。
適当な試料に情報記録を索引する方法は、記録および
試料に番号を合わせる割り当てを含むことができる。好
ましくは、このプロセスをバーコードおよびバーコード
スキャナーの使用を介して自動化する。各試料を処理す
る場合、スキャナーを用いて、その種々の操作を介して
試料を追跡するLIMSに試料識別番号を記録し、かくして
記録および試料間のリンクを保存する。また、バーコー
ドの使用は、貯蔵された試料およびゲルの保管収容およ
び検索を自動化することを可能とする。
5.2 蛋白質の分析 一の具体例においては、本発明の方法および装置を用
いて、生物学的試料または複数試料中の１以上の蛋白質
を同定および特徴付けする。
5.2.1. 第一分離工程 蛋白質を分離するための非常に様々な技術は当業者に
よく知られており（例えば、Deutscher（編）、1990、M
ethods In Enzymology vol.182、pp.9−18および285−5
54参照（その全てをここに出典明示して本明細書の一部
とみなす））、本発明により使用できる。限定されるも
のではないが、例として、蛋白質は、等電点（例えば、
等電点クロマトグラフィーまたは等電点電気泳動によ
る）、電気泳動移動度（例えば、２−メルカプトエタノ
ールまたはジチオトレイトールのごとき還元剤への先行
する曝露の有り無しにて、非変性電気泳動による、また
は尿素またはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のごとき
変性剤の存在下の電気泳動による）、いずれかの適当な
マトリックス（例えば、固定化抗体またはレクチンの例
では、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはアフィニ
ティークロマトグラフィー）上のFPLCおよびHPLCを含め
たクロマトグラフィーによって、または遠心（例えば、
密度勾配沈降平衡法または速度沈降法）によって分離で
きる。
前記に列挙されたいずれかの技術を含むいずれかの分
離技術を第一分離工程に用い得る。一の具体例におい
て、第一分離工程の結果、不連続的一次元アレイ（例え
ば、アフィニティークロマトグラフィーの間に収集され
た画分）を生じさせる。より好ましくは、第一分離工程
の結果、連続的一次元アレイを生じさせ；とりわけ好ま
しいのは適当な電解質を供給されたポリアクリルアミド
の細長いゲル中での等電点電気泳動である。
5.2.2. 第二分離工程 第二分離工程は、第一分離工程に用いられたものと区
別される分離技術を使用して、分離された蛋白質の二次
元アレイを生成する。いずれかの分離技術（前記に列挙
されたものを含む）は、いずれかの媒体中で用いること
ができ、但し（ａ）生体分子（例えば、蛋白質）の得ら
れた二次元アレイを画像化して、分離媒体中の複数の分
離された生体分子の物理的位置を検出でき、（ｂ）１以
上の選択生体分子が第二分離工程を行う媒体から単離で
きるものとする。好ましい具体例において、第二分離工
程は、ポリアクリルアミド平板ゲルのごときゲルにおい
て電気泳動を使用し；とりわけ、ドデシル硫酸ナトリウ
ムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PEGE）が好ましい。第一分離工程の結果、不連続的一
次元アレイが生じたならば、一次元アレイの画分（また
は、そのアリコート）を第二分離技術に付す。例えば、
アフィニティークロマトグラフィーからの画分のアリコ
ートをSDS−PEGE用ポリアクリルアミドゲルのウエルに
負荷する。第一分離工程の結果、連続的一次元アレイが
生じたならば、該アレイ（または、その一部）を第二分
離技術に付す。例えば、等電点電気泳動によって第一軸
に沿って分離された蛋白質を含む細長いゲルを第一軸に
垂直な第二軸に沿ってSDS−PEGE用ポリアクリルアミド
平板ゲルに負荷する。
5.2.3. 支持されたポリアクリルアミドゲル 本発明の一つの態様は電気泳動における使用に適した
支持されたゲルであり、ここに該ゲルは二次元空間安定
性を有するように固体支持体に安定に結合され、該支持
体は、剛直で、ゲル中の１以上の生体分子に結合または
会合した標識の検出に関して実質的に非干渉性である。
好ましくは、該支持体は、蛍光標識の検出に関して実質
的に非干渉性であり；プラスチックとは異なってガラス
は、蛍光イメージングを損なうかあるいは妨げるスペク
トル活性を欠くので、ガラス支持体はこの目的に適す
る。
ゲルおよび固体支持体間の安定な結合によって、ゲル
の残りの位置的シフトなくして、または最小のゆがみし
かなくして、ゲルの１以上の部分を今や取り出す（例え
ば、切り出しによる）ことができ、それによって、操作
および貯蔵中に分離された蛋白質の二次元アレイの完全
さを維持し；好ましくは、ゲルを固体支持体に共有結合
させる。イメージングして分離された蛋白質のＸ、Ｙ座
標を決定するのに続いて、選択された蛋白質を含む支持
されたゲルの１以上の部分をさらなる分析のために取り
出すことができ、一方、残余の蛋白質を所要ならば続く
取り出しのためにそれらの先に画像化された位置に安定
に保持する。本発明の支持されたゲルは、分離された生
体分子の正確な、再現可能な切り出しおよび単離を促進
することに主要な進歩を表す。さらに、支持されたゲル
にバーコードを付して、オリジナル試料の同定および分
離された生体分子の二次元アレイ間の不可分のリンクを
供し；かかるリンクは、本発明のLIMSを用いて維持でき
る。
支持されたゲルを調製するために、固体支持体を、例
えば、Ｙ−メタクリル−オキシプロピルトリメトキシシ
ランのごとき二官能性リンカーを用いて機能化でき、次
いで、ゲルを機能化された支持体に注型する。好ましい
具体例において、該支持体は、略平面であり（例えば、
略平面のガラスシート）；とりわけ好ましいものはガラ
スの平面板である。所望ならば、例えば、低下させた温
度（例えば、４℃、−20℃または−70℃）にて、支持さ
れたゲルを貯蔵できる。貯蔵の適当な方法は、1997年７
月９日に出願された国際特許出願PCT/GB97/01846に記載
され、その全てをここに出典明示して本明細書の一部と
みなす。いくつかの操作（例えば、ゲルの１または複数
の一部の切り出し）では、開口表面の支持されたゲルが
好ましく；他の操作（例えば、電気泳動）では、ゲルが
安定に結合する第一固体支持体（例えば、二官能性リン
カーで処理されたガラスプレート）およびゲルが安定に
結合しない第二固体支持体（例えば、未処理ガラスプレ
ートまたはシリコーン処理剤で処理したガラスプレー
ト）間に任意にゲルを挟むことができる。
5.2.4 分離された蛋白質の検出 二次元アレイ中の蛋白質は、いずれかの所望の技術に
よって検出できる。一の具体例において、ポリアクリル
アミドゲル中の蛋白質は、当該分野でよく知られるよう
に（クマシーブルーまたは蛍光染料のごとき）適当な染
料でまたは（銀染色のごとき）適当な染色技術によって
標識される。好ましい具体例において、ポリアクリルア
ミドゲル中の蛋白質は、蛋白質と結合または接触する
と、蛍光的に活性になるが、あるいはその蛍光特性が変
わる染料をゲルに含浸させることによって標識し、それ
によってイメージングに先立って非結合染料を除去する
必要性をなくする;Sypro Red（Molecular Bioprobes In
c.、Eugene、Oregon）は、この目的に適する。もう一つ
の具体例において、該蛋白質は、抗体、レクチンまたは
放射性核種のごときレポーター部位、酵素、またはビオ
チンのごとき結合種と会合する他の適当なリガンドをゲ
ルに含浸することによって標識でき；非結合の抗体、レ
クチンまたは他のリガンドの除去によって、レポーター
種は、いずれかの適当な技術によって検出できる。さら
なる具体例において、蛋白質は、例えば、いずれかの適
当な放射性核種（例えば、トリチウム、イオウの放射性
核種または炭素の放射性核種）で代謝標識することによ
って、またはいずれかの適当な放射性核種（例えば、放
射性ヨウ素）で化学的または酵素的に標識することによ
って、分離に先立って放射性標識される。なお、さらな
る具体例において、該蛋白質は、適当な膜に電気移動さ
せて、リポーター部位と会合した抗体、レクチンまたは
他の適当なリガンドでプローブされる二次元アレイのレ
プリカを形成し；かかるウェスタンブロティング用の技
術は、当該分野においてよく知られている。
標識された蛋白質は、−−例えば、デンシトメトリー
または分光学によって、または蛍光または放射活性を検
出することによって用いるレポーター種を検出すること
ができ−−かつコンピューター可読出力を生じさせるい
ずれの検出器でも映像化される。一の具体例において、
検出器はゲルを第一軸に直交する第二軸に沿って進行さ
せつつ回転ミラーが第一軸に沿ってゲルを横切るレーザ
ービームをスキャンするレーザー蛍光スキャナーであ
る。レーザーを連続的にスキャンしている間ゲルが直線
的に移動されるかかるスキャナーは、スキャンが完了し
た後にスキャンされ、自動的にカプセルに入れられた移
動メカニズムへとホッパー（例えば、染色タンク）から
ゲルを自動的に負荷することを可能とし、それにより、
処理量を改良し、ゲルの手動処理を低下させる。好まし
くは、ゲルによって放射される蛍光は、導波管に入り、
光電子増倍管のごとき光検出器に伝達される。一の具体
例において、レーザービームは、それを反射させて直角
にゲルを打つ正確な形の第二ミラーに達するまでゲルに
平行な面に沿って回転ミラーから伝わる。該正確なミラ
ーにより、ゲルが一方側から他方側にスキャンされる間
はレーザービームの路長は、一定のままである。この一
定の路長は、レーザービームの振幅が周期的に変調され
る相感受性検出を促する；蛋白質染料複合体によって放
射された蛍光シグナル（シグナル）は、使用されて、相
シフトのない（または、より小さい相シフト）が観察さ
れるバックグラウンド蛍光（ノイズ）からこのシグナル
を区別する相シフトを示す。かかるレーザー蛍光スキャ
ナーは、Basiji、1997、Development of a High−Throu
ghput Fluorescence Scanner Employing Internal Refl
ection Optics And Phase−Sensitive Detection（Ph.
D.Thesis,University of washington,Seattle,WA）に記
載され、その全てをここに出典明示して本明細書の一部
とみなす。
分離された蛋白質の二次元アレイで検出されたいずれ
かの特徴のＸ、Ｙ座標を決定することに用いるイメージ
ングデバイスによって検出できる１以上の参照ポイント
を供するのが望ましい。参照ポイントは、ゲルを共有結
合させる支持体（例えば、機能化された略平面のガラス
表面）上に設けることができる。別法として、参照ポイ
ントは、ゲルがイメージングの間に固定されたフレーム
上に設けることができる；適合するフレームは、ロボッ
ト単離デバイス中に設けることができる。
5.3. オリゴ糖の分析 生物学的試料中のオリゴ糖（グリカン）は、オリゴ糖
を開裂し、標識し、分離するために確立された技術を用
い、本発明の方法および装置で同定した特徴付けること
ができる。例えば、各々の全てをここに出典明示して本
明細書の一部とみなすTownsend ＆ Hotchkiss（ed
s.）、1997、Techniques In Glycobiology（Marcel Dek
ker、Inc.、New York）;Takahashi、1996、J.Chromatog
raphy 720:217−225参照。
好ましい具体例において、オリゴ糖は（例えば、２−
アミノベンズアミジンまたは２−アントラニル酸のよう
なオルト置換されたアニリン誘導体で）蛍光標識し、二
次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離す
る。Starrら、1996、J.Chromatography 720:295−321;B
iggeら、1995、Analyt.Biochem.230:229−238参照（そ
の全てをここに出典明示して本明細書の一部とみな
す）。例えば、蛍光標識されたオリゴ糖を、オリゴ糖の
固有の電荷−対−質量比に大きく基づく分離を達成する
ために、第一の次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動
（PAGE）（例えば、15％のアクリルアミドゲルおよびpH
7.4のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「Tri
s」）/N−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸（「TAPS」緩衝液））に付すこ
とができる。次いで、オリゴ糖のこの一次元アレイは、
オリゴ糖とホウ酸アニオンとの非共有結合性の錯体化か
ら生起する誘導された電荷に大きく基づく分離を達成す
るために、20％のアクリルアミドゲルおよびpH8.5の20m
Mトリス／ホウ酸緩衝液を用いて、第二の次元のPAGEに
付される。得られた二次元アレイのオリゴ糖を蛍光スキ
ャナーで画像化して、コンピューター可読出力を生成さ
せる。
5.4. 検出器出力のコンピューター解析 本発明は、有利には、検出器出力のコンピューター媒
介分析を提供する。限定されるものではないが、例とし
て、本発明のこの態様は、まず等電点電気泳動、次いで
SDS−PAGEによって分離された蛋白質の状況において論
じ；しかしながら、本明細書に記載された方法および装
置は、分離された生体分子のいずれかの二次元アレイを
画像化することから導かれる出力の解析に等しく適用で
きることは当業者には容易に明らかであろう。
解析の出力を移すために、検出器を操作可能にコンピ
ューターに接続する。ここに用いられるごとく、「操作
可能に接続する」なる用語は、直接的リンク（例えば、
伝導ケーブル、赤外線伝達デバイス等を介しての永久的
または断続的接続）またはデータが中間保管デバイス
（例えば、サーバーまたはフロッピーディスク）を介し
て移動される間接的リンクのいずれかを含む。検出器の
出力は、コンピューターが受け入れることができるフォ
ーマットであるべきことは容易に確認されるだろう。ビ
ットマップフォーマット（例えば、GIFフォーマット）
は、この目的に好ましい。
一旦適切にプログラムされたコンピューターに移され
たならば、該出力を処理して参照ポイントを検出し；人
工産物を濾過し除去し；特徴を検出し定量し；画像ファ
イルを造ることができる。特徴は、バックグラウンドと
潜在的蛋白質スポットとのコンピューター媒介比較によ
って検出できる。例えば、コンピュータープログラム
は、所与の閾値を超える染色および蛍光を示すゲルの領
域に対応するシグナルを選択できる。
さらに、コンピューターを用いて、検出された特徴を
編集し、所与の試料の二連解析（またはいずれかの数の
複連）に合わせることができる。出力を評価および比較
して、著しい異常性を有し、またはあまりにも低い負荷
もしくは全画像強度であり、またはあまりにも貧弱な解
像度であり、または二連があまりにも異なる、画像ファ
イルを拒絶することができる。もし二連のうちの１つの
画像ファイルが拒絶されたならば、二連に属する他の画
像ファイルも画像の質に拘らず拒絶される。これらの機
能のいずれも、オペレーター決定基準に従ってまたはヒ
トオペレーターに画像ファイルを対話式に示して自動的
に行うことができる。
ゲルの泳動において、ランドマーク同定を用いてゲル
の泳動におけるいずれかの変動も補正することができ
る。このプロセスは、一定の等電点および電気泳動移動
度を有する所与の生物学的試料に見出されることが知ら
れているまたは期待される１以上のランドマーク蛋白質
の同定を含む。これらのランドマーク蛋白質は、内因性
標準品として供して、いずれの可能なゲル変動またはゆ
がみも補正できる。別法として、またはさらに、１以上
の蛋白質を試料に添加して、外因性標準品として供する
ことができる。人工産物であると考えられる特徴は、分
析から外に濾過することができ；かかる人工産物は、主
にゲルの端、とりわけ試料適用ポイントおよび染料のフ
ロントにて生じるようである。
所望ならば、２以上の実験からの出力を整列させ組み
合せてパノラマ式の画像ファイルを形成することができ
る；例えば、蛋白質を含む試料を、一の実験においてpH
4.0ないし5.0の等電点電気泳動勾配および次の実験にお
いてpH5.0ないし6.0の等電点電気泳動勾配を用いて、二
次元電気泳動によって分離することができる。今や、コ
ンピューターを用いて、検分またはさらなる分析のため
に単一パノラマ式画像としてこれらの実験から得られた
出力を表すことができる。
二連ゲルはランドマークを介して整列させることがで
き、適合プロセスを行うことができる。適合プロセス
は、二連ゲル上の対応する特徴を対とすることを含むこ
とができる。これは、対とされた特徴が分離の再現性を
示すので、次に測定された等電点および見掛けの分子量
は正確であるという保証の増大を供する。処理された画
像ファイルは、視覚的点検のためにスクリーンに表示
し、グラフ表示としてプリントアウトし、その後の分析
に使用することができる。
一の具体例において、コンピューターを用いて全ての
検出された蛋白質の（あるいは、オペレータ確立基準に
より対話式または自動的に選択されたサブセットの）
Ｘ、Ｙ座標を測定する。かかる座標は、分離工程中に用
いられた実験パラメーター、ランドマーク蛋白質または
外因性標準品を参照すると、個々の等電点および見掛け
の分子量と相関する。また、蛋白質の特徴を表すシグナ
ルの強度も測定し保存する。
画像処理用の適当なプログラムは当該分野でよく知ら
れている。商品名MELANIE （リリース2.2、1997）の
下、BioRad Laboratories、Hercules、Californiaによ
って配給されている商用プログラムはこの目的に適す
る。好ましい具体例において、MELANIE を用いて、検
出器出力に次の操作；（ａ）ランドマーク定義を参照す
ることによって等電点（pI）および分子量（MW）値に列
および行座標を変換するようなゲルのキャリブレーショ
ン；（ｂ）ゲル画像における特徴の検出；（ｃ）二連ゲ
ル間の特徴の対合；（ｄ）各検出された特徴、その絶対
的特徴強度（Vol.）、相対的特徴強度（％Vol.）、pIお
よびMWについての計算；（ｅ）異なる試料からのゲル泳
動間の特徴の対合を行う。かくして、MELANIEからの出
力は、特徴レポート、ランドマークレポートおよび対合
レポートを含むことができる。
5.5. プロフィールのコンピューター生成および分析 画像処理プログラム（例えば、MELANIE ）の出力を
コンピューターでさらに処理して、比較分析に適当なデ
ジタルプロフィールを生成させることができる。
5.5.1. プロフィールの構築 今や、デジタルプロフィールをMELANIE によって処
理された各画像ファイル用に構築できる。好ましい具体
例において、そのうち一つが同胞セット用の「代表的」
ゲルとして任意に表示される２以上の複連（「同胞」と
いう）にて各試料を分析する。デジタルプロフィール
は、好ましくは、各々同定された特徴につき;1）ユニー
クな任意の同定暗号;2）Ｘ、Ｙ座標;3）等電点;4）分子
量；および５）蛍光強度を含む。
同胞ゲルの各セットでは、同胞画像からの特徴レポー
トを適合する特徴間の％Vol、pIおよびMWを平均するこ
とによって合成複合物に合体させる。従って、合成複合
物は、同胞セットの代表的ゲルから得られた特徴IDに割
り当てられた平均特徴パラメーターよりなる。加えて、
％Volの平均の標準偏差は、次の式（二連ゲル用）によ
って計算される： Ｄ＝100＊SQRT（sqr（＜Ｖ＞−V1）＋sqr（＜Ｖ＞−V2））／＜Ｖ＞ ここに、＜Ｖ＞＝（V1＋V2）/2であって、V1、V2は、特
徴の対についての％Volである。
また、さらなる情報を、合成複合物、例えば、ゲルに
適用された蛋白質の合計量およびゲルのバーコードと合
わせることができる。好ましい具体例において、合成複
合物は、代表的ゲルを参照した、かつ代表的ゲルのバー
コードを鍵としたMELANIE フォーマットの特徴レポー
トを含む。
このプロフィールは、合成複合物画像を構築する画像
を生成するために用いた実際の記憶されたゲルまで追跡
でき、ゆえにプロフィールのコンピューター分析によっ
て同定された蛋白質を検索できる。
また、プロフィールは、オリジナル試料または患者に
遡って追跡することができる。標準品およびランドマー
クの使用、続いてのマスターゲルに対する関連スポット
により可能とされた修正とカップリングさせたゲルシス
テムの再現性は、同一または異なる時間にて同一または
異なる試料での多くのゲル泳動の比較を可能とする。さ
らに、セクション5.1に記載されたごとく、オリジナル
の生物学的試料の採取中にアセンブルされたデータは再
度統合でき、これは年齢または臨床的成果のごとき情報
に基づいた試料のコンピューターで選択した断面の分析
を可能とする。図２は、本発明の一の特殊な具体例によ
るコンピューター媒介分析を示すフローダイアグラムを
示す。
5.5.2. 試料間のクロス対合 さて、異なる試料の分析から生成したデータをコンピ
ューター分析に付す。好ましい具体例において、各々重
要な特徴には、特徴の分子含量を同定し、かつ全ゲルに
おける特徴の適合において同一の値を有する指標（「分
子クラスター指標」、「MCI」）が割り当てられる。各
タイプの試料に対し、各ゲルが引き続いてマップされる
座標系をユニークに定義する「分子クラスター表」が造
られる。このアプローチは、セットにおける全ての他の
ものと各ゲルを対合させるのを試みるNxN問題を緩和す
る。
分子クラスター表を作成するために、代表的なゲルを
任意に選んでマスターゲルとし、好ましくはその試料タ
イプに最適であるとみなされるものとする。分子クラス
ター表の新しい項目は、この代表的ゲルがメンバーであ
る同胞セットの合成複合物において各特徴（分子クラス
ター）に対して造られる。さらなる分子クラスターは、
それらが他のゲル中に観察されるが、マスター表に表さ
れていない場合に表に加えることができる。かかる他の
ゲルは、「第二マスター」として知られる。
一の具体例において、MCIは、pI/MW空間の階層的カッ
ド−トリー（quad−tree）分解によって、特徴のpIおよ
びMWから計算される。まず、全pI/MW空間を取り囲む2D
グリッドが計算される。限定されるものではないが、例
によれば、pIは、０および14の間のいずれかの値を取る
ことができ、MWは、1,000および1,000,000の間のいずれ
かの値を取ることができる。（ゲル上にその置換えを表
す）蛋白質の行の位置は、その分子量の対数におよそ比
例するので、グリッド位置は、分子量の自然対数、すな
わち、In（MW）に関して計算される。分解が、2D空間の
各セルにおける特徴数が１よりも大きくはないらしいと
ころに達するまで、2DのpI/In（MW）空間は、各象限が
その親よりも少ない特徴を含む連続してより小さい象限
に、水平および垂直にシリアルの二等分によって分けこ
とができる。
一の特別な具体例において、全pI/In/（MW）空間が垂
直および水平に共に512分割に分けられる（RES＝512）
ように９連続の細別がなされる。マスターゲルにおける
特徴のMCIは、今や、次の式によってマスター座標系に
おいて、pIおよびMWから計算される： 所与のタイプの全ての他の試料の代表的ゲルは、今
や、その試料タイプ用のマスターおよび第二マスターゲ
ルと（MELANIE を用いて）適合させることができる。
次いで、デジタルプロフィールは、各適合させた特徴に
ついて、マスターまたは第二マスタープロフィールにお
ける特徴のMCIを加えることによって注釈を付けられ
る。
5.5.3. プロフィールの微分解析 一旦プロフィールがMCIで注釈を付けられれば、コン
ピューター解析を行って、１以上の特徴を表す注目する
蛋白質または他の生体分子を選択できる。好ましくは、
単一試料からの同胞ゲルの反復解析から発生する合成複
合プロフィールを比較することによって解析を行う。
画像セットは、データベース中の試料のユーザー選択
可能リストから造られる。画像セットの各メンバーは、
同胞セットの合成複合プロフィールおよび特徴を突き合
わせるのに用いたマスター分子クラスター表を含む。
次いで、特徴セットが定義され、これは画像セットを
横切って判明した特徴のセットを表す。任意の閾値レベ
ルＸが、特徴セットにつき指定され；もしそれが画像セ
ットのメンバーの少なくともＸ％にて生じる（すなわ
ち、同一のMCIを有する）ならば、所与の特徴は定義さ
れて、セットの一部になる。特徴セットの各メンバーに
ついては、次の属性が定義される：（１）該MCI（２）
特徴が同定されたセットにおける平均％Vol（特徴が生
じる画像セットの全メンバーについての平均％Vol）
（３）％Volの中央値および（４）特徴が同定された画
像の数。
今や、バイナリセット操作を行って、２つの画像セッ
ト間の特徴のセットを比較することができる（「バック
グラウンド」および「フォアグラウンド」セットとい
う）。基本的バイナリ操作は、２つの特徴セットにおけ
る突き合わせ特徴間のフォールドチェンジ（fold−chan
ge）の計算である。フォールドチェンジ（Ｇ）は、次の
アルゴリズムによって決定される： V1およびV2を各々バックグラウンド特徴セットF1およ
びフォアグラウンド特徴セットF2における特徴の平均％
Volとし、（ここに、不在の特徴は、Ｖ＝０によって表
し）、次いで： Ｇ＝V2/V1（ここに、V2＞V1） Ｇ＝V1/V2（ここに、V1＞V2） Ｇ＝＋MAX_G（ここに、V1＝０） Ｇ＝−MAX_G（ここに、V2＝０） ここに、MAX_Gは、いくつかの適当な大きな数である。
このアルゴリズムは、フォールドチエンジ計算おける
平均％Volの代わりに％Volの中央値を用いて任意に行う
ことができる。結果は棒グラフまたはいずれかの他の都
合よい形式において報告できる。
逐次セット操作を行って、いくつかの試料登録変数の
関数として特徴セットの各特徴の発現における変化を決
定できる。例えば、かかる比較は（ａ）試料ドナーのセ
ットにおける発現変動の時系列試験；（ｂ）異なる疾病
を有する個人のセットについての発現変動の比較；また
は（ｃ）異なる治療中の個人のセットについての発現変
動の比較に用いることができる。逐次セット操作は、行
が特徴セットの個々のメンバーを列挙し、列は異なる画
像セットを列挙し、マトリックス中のセルは前記の各画
像セットにおける各特徴の平均％Volから計算された数
を含む。
例えば、特徴を比較するには、３つの画像セット（S
1、S2およびS3と命名）にわたり、各試料のMCI（Ｆ）の
％Vol、V1、V2およびV3を対応する画像セットにおけるM
CI（Ｆ）についての平均％Volとして計算する。次に、
平均、中央値および最大のV1、V2およびV3を行を横切っ
て計算する。試料セットがMCI（Ｆ）を含まない場合、
対応する％Volは０を取る。ユーザーは画像セットまた
は平均もしくは中央値のいずれかであり得る参照列Vref
を選択する。次いで、各セルは次のように計算される： P1＝（V1−Vref）/Vmax P2＝（V2−Vref）/Vmax P3＝（V3−Vref）/Vmax これらの値は全て−1.0ないし＋1.0の範囲にある。この
範囲をサブレンジ（例えば、７個の等しいサブレンジ）
のいずれかの所望の数に分割でき、得られた結果をグラ
フで示し、各セル中の値は各サブレンジにつき記号によ
って表される。
オペレーター指定基準によりコンピューター媒介比較
は、非常に多数のプロフィールの迅速で効率よい分析を
促し、たとえ各プロフィールが何百または何千の検出さ
れた生体分子を表し得るとしても比較すべきプロフィー
ル間の小さな差の同定を可能とする。大きな試料セット
の迅速で効率よい操作についての能力は、統計的に有意
な差を検出する見込みを強める。
また、本発明の実施者は、各々新しく生じたプロフィ
ールを連続的に成長しているデータベースに加えること
ができ、恐らくはオリジナルの研究者によって想像され
ない組合せでクロス実験比較を可能とする。プロフィー
ルデータベースは、仮想実験が試行されるのを可能と
し、ここに実際の臨床的データを再現する必要なくし
て、いずれの試験からのプロフィールもいずれの他の試
験からのプロフィールとも比較できる。例えば、蛋白質
についての分子量および等電点を供するいずれのデータ
ベースも、蛋白質の分析から導かれた本発明のプロフィ
ールと比較することができる。
当業者ならば、かかる分析の多くの形態を取ることが
できるのを認識でき、以下の例示を挙げるが、限定的な
ものではない。
疾病および正常な個人のプロフィールを比較して、２
つの集団間で一貫して異なるスポットのパターンを同定
できる。該スポットは、治療的または診断的に重要な蛋
白質を含むことができる。
一個人からの疾病および正常な組織のプロフィールを
比較して、疾病および正常な組織の間で一貫して異なる
スポットのパターンを同定できる。該スポットは、治療
的または診断的目的で注目する生体分子を含むことがで
きる。これは、比較は一個人から採取された試料間でな
されるように異なる個人間の変動につき、制御するの利
点を有する。
処置および非処置の個人のプロフィールを比較して、
ある種の治療または薬物治療と相関するスポットのパタ
ーンを同定できる。これは、薬物メカニズムを解明する
こと、薬物耐性を研究することまたは薬物開発において
役立ち得る。
健康、疾病のおよび治療された疾病の個人の３元比較
は、いずれの薬物が正常プロフィールにより密接に似た
ものに疾病のプロフィールを復元できるか否かを同定で
きる。臨床試験またはルーチン的処置におけるかを問わ
ず、これを用いて薬物をスクリーニングし、処置の効力
をモニターし、副作用の発生を検出および予測すること
ができ、いずれのスポットが疾病の表示および治療によ
り重要か否かを同定できる。
また、非処置、薬物Ａで処置または薬物Ｂで処置され
た疾病個人の３元比較は、注目する生体分子を同定でき
る。例えば、もしＡが有効であると知られ、かつＢが有
効でないと知られているならば、処置群Ａ（一方）およ
び非処置群もしくは処置群Ｂ（他方）間で異なる生体分
子は、予後に有用であり、治療標的としての研究用候補
物質である。
5.6. 支持されたゲルの選択された部分の取り出し 一旦分離されれば、生体分子は安定したアレイに保持
されることは、本発明の支持されたゲルの特色である。
今や、単一の検出された特徴を含むゲルの一部をアレイ
の残余の空間的完全さに影響することなしに取り出すこ
とができる。例として、取り出しは、ゲルの一部の切り
出しによって、所望の種を吸引によって取り出すことが
できるかまたは落ち出ることができるようにゲルを溶か
す薬剤の局部を適用することによって、または電気溶出
デバイスを局部的に適用することによって取り出すこと
ができる。分析に必要な種を含むゲルの一部の取り出し
は、プロフィールに基づいて正確に再現よく行うことが
でき；かかる一部は、画像化されたゲルから、または二
連または他の反復の画像化ゲルから取り出すことができ
る。これがコンピューター制御分析および選択に非常に
適していることは、容易に認識されるであろう。
好ましくは、選択されたゲルの一部を本発明の装置を
用いて切り出す。かくして、生体分子の分離に続いて得
られた生体分子プロフィールをその参照として使用する
ソフトウエアの制御下、ロボットデバイスを供すること
ができる。このデバイスは、操作可能にコンピューター
と接続し、機械可読命令によって駆動されて、複数の生
体分子の混合物の分析から導かれた複数のプロフィール
のコンピューター媒介分析によって生じた命令に従って
オペレーター非依存的にゲルに対し切り出しおよび操作
を行うことができる。コンピューターは、Ｘ、Ｙ移動を
プログラムし、ロボットデバイスの切断ヘッドを指令し
て、同定された特徴を単離および取り出すために単回切
断または一連の重複する切断を行う。
かかるデバイスは、（１）ゲルが画像化下に置かれた
フレームと同一であるかまたはそれに一致する規定され
たフレーム（２）ゲルを有するフレームの制御された位
置のベッド；および（３）オペレーターによって規定さ
れた注目するゲル領域を位置決定するためのソフトウエ
アを介して指示され、所望の操作を行うことができ、収
容チャンバーにおける定義された位置にゲルまたはゲル
誘導の物質を送達することができる可変性の操作および
切り出し成分に添付のドライブを有する可動なＸ、Ｙ座
標位置決定メカニズムを含み得る。かかる装置の一の具
体例を図３に示す。
この器械は、ガラス裏打ちのゲルからゲル断片を取り
出し、適当な容器に取り出された断片を移すことができ
る。別々の反応容器（例えば、エッペンドルフバイア
ル）を各ゲル断片に使用でき；より好ましくは、ゲル断
片を試験管のラックまたは96ウェル採取用マイクロプレ
ートのごとき多容量容器中のチャンバーに移す。操作さ
れるべきガラス裏打ちのゲルを器械のベッド上のガイド
に取り付け、かくして、切断メカニズムでガラス、ゆえ
にゲルを整列させる。該器械は機械可読命令によりゲル
の１以上の選択された一部を取り出す。一の具体例にお
いて、新しいチップを各特徴につき選択し、芯切断、剪
断および吸引のプロセスを適用してガラスへのゲル結合
を壊し、ゲル断片を取り出す。好ましくは、剪断プロセ
スは、第一軸に沿っての左右のチップ移動、続いての第
一軸に対してある角度（最も好ましくは直角）の第二軸
に沿っての左右のチップ移動を含む。各ゲル断片を採取
プレートに移し、次いで、好ましくは液体中に排出し
て、チップからのゲル断片の取り出しを援助する。好ま
しくは、ゲル断片が切断プロセスの間に真空ポンプ内へ
吸引されることを防ぎ、また、排出の間にゲル断片をチ
ップの外に押し出す二重の目的で移動用シャトルをチッ
プ内に含める。異なる特徴間のキャリオーバを最小限に
するために、切断道具を不可分な自動化洗浄ステーショ
ンにおいて洗浄できる。より好ましくは、新しい切断道
具を各特徴に用いて、それによっていずれかのキャリオ
ーバを防ぐために、切断道具を変える。
大きな特徴は、複数の隣接または重なった切断をなす
ことによって切り取り、同一特徴の全片は採取プレート
の同一ウェルに置かれ、特徴の異なる片は異なるウェル
に置かれる。別法として、プロフィールを大きな特徴の
外辺部の周りで切断し；次いで、ゲルに切断作用を適用
して、支持体からそれを分離しつつゲルを持ち上げ、全
ての特徴を収集容器に移す。該システムを配置して、多
数のゲルが一つの収集プレートに切り入れることを可能
とし、また、いずれかの数の収集プレートにゲルを切り
入れ、かくして全特徴をさらに処理するのを可能とす
る。一旦収集プレートが満たされるかまたは完成したな
らば、さらなる処理が準備できたか、または貯蔵でき
る。選択されたゲル断片を切り出した後、例えば、前記
のごとき低下した温度にてゲルの残余を貯蔵できる。
5.7. ゲルの取り出された部分の処理 ゲルの１以上の取り出された部分は、ワークステーシ
ョン、例えば、十分にプログラムでき、蛋白質分解のた
めに配列される一般的モジュラー化学ユニットに送達さ
れる。このワークステーションは、試薬添加、ピペッテ
ィングおよび移動、インキュベーション、混合、冷却、
真空乾燥および固相抽出技術、またはモジュールを展開
できるいずれかの他の技術を含むいずれかのプロトコー
ルの操作を可能とする。プレートは、統合された担体操
作により器械のベッドに再配置される担体上に適合させ
る。かかるプレートは、いずれかの形式、好ましくはウ
ェルの直交マトリックス、より好ましくは、9mmピッチ
のマイクロプレート形式を取ることができる。とりわ
け、Porvair Ltd.、Stepperton、United Kingdomによっ
て製造されたもののごとき液体を通過させることができ
る各ウェルに基底にノズルを有するマイクロプレートが
好ましい。かかるマイクロプレートにおいて、液体およ
びゲル片をテフロンフリットによって保持し、液体をピ
ペッティングユニットによって上から適用される空気圧
によってフリットを通して抽出する。この液体を廃棄物
に送り、またはペプチド溶出の間、抽出プロセス中にノ
ズルの下に位置する第二プレートに集めることができ
る。
本発明により単離された蛋白質は以下の記載のごとく
分析でき、あるいは、単離された蛋白質に対するポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体の産生のためにマウ
ス、ラットまたはウサギのごとき実験動物に投与するこ
とができる。かかる抗体は診断および予後テストにおい
て、および例えば、抗体アフィニティークロマトグラフ
ィーによって大量の蛋白質の精製に有用である。
5.8. 蛋白質の分析 該ワークステーションは、単独または組合わせで１以
上の適当な酵素（例えば、トリプシンまたはキモトリプ
シン）を用いて化学的蛋白質分解または酵素的蛋白質分
解のためにプログラムできる。例えば、Shevchenkoら、
1996、Analytical Chemistry 68:850−858およびHoutha
eveら、1995、FEBS Letters 376:91−94参照（各々の全
てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）。所
望ならば、電気溶出を任意に用いて、ゲルスライスから
蛋白質を抽出することができる。好ましい具体例におい
て、取り出されたゲル断片中の各蛋白質を切断して、さ
らなる特徴付けに適当なペプチドのプールを生成するた
めに、該ワークステーションをプログラムする。かくし
て、該ワークステーションは、適当なラック中に切断ゲ
ル片の試料を受け取り、これらの断片を洗浄、還元、ア
ルキル化、洗浄およびトリプシン分解の工程に付す。得
られたペプチドを分析に先立ってさらなるクリーニング
および付加的調製のために第二プレートに抽出する。例
えば、Shevchenkoの引用を参照。インキュベーション
は、100℃以上までのいずれかの温度にて行なうことが
でき；ワークステーションは、インキュベーションが高
温にてまたは長期間行われる場合は、液体損失を防止ま
たは最小化するための密閉メカニズムを含む。該ユニッ
トは無人の、理想的には終夜操作するようにデザインさ
れ、広範囲な検知、モニタリングおよび自動チェックメ
カニズムを有して、プログラムされたプロトコールが正
確に行われることを保証し、いずれのエラーも報告し、
先に明記された不測の事態の発生に際して進行を中断さ
せる。多数のプレートを並列に処理でき、もし所望なら
ば異なるプロトコールにより処理できる。また、ワーク
ステーションは、ペプチドクリーンアップ、およびヒド
ラジン分解もしくは標識化のごとき他のプロセスが可能
である。
5.8.1. アミノ酸配列の決定 今や、取り出された蛋白質に由来する１以上のペプチ
ドのアミノ酸配列は、例えば、タイム−オブ−フライト
質量分析法（MALDI−TOF MS）または電子スプレーイオ
ン化質量分析法（ESI MS）と組み合わせたマトリック
ス−利用レーザー脱着／イオン化のごとき適当な質量分
析技術によって決定することができる。Jensenら、197
7、Protein Analysis By Mass Spectrometry、In Creig
hton（ed.）、Protein Structure、A Practical Approa
ch（Oxford University Press）、Oxford、pp29−57;Pa
tterson ＆ Aebersold,1995,Electrophoresis 16:1791
−1814;Figeysら、1996,Analyt.Chem.68:1822−1828参
照（各々の全てをここに出典明示して本明細書の一部と
みなす）。好ましくは、HPLCまたはキャピラリー電気泳
動のごとき分離技術を、質量分析法と直接または間接的
に連結する。Ducretら、1996、Electrophoresis 17:866
−876;Gevaertら、1996、Electrophoresis 17:918−92
4;Clauserら、1995、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5072
−5076参照（各々の全てをここに出典明示して本明細書
の一部とみなす）。とりわけ、米国特許出願第08/877,6
05号に記載されたde novo配列決定技術は好ましい（そ
の全てをここに出典明示して本明細書の一部とみな
す）。de novo配列決定において、ペプチドの分子質量
はいずれかの適当な技術、好ましくは質量分析法によっ
て正確に決定する。コンピューターを用いて、合計し
て、ペプチド結合の形成、プロトン付加、アミノ酸の測
定された質量を変更する他の因子、およびアミノ酸の可
能な組合わせを強いる実験条件における水損失とみなさ
れたペプチドの測定された質量となるアミノ酸の全ての
許容される組合わせを決定する。次いで、コンピュータ
ーは、許される組合わせにおいてアミノ酸の全ての線状
の並べ替えの許容されたライブラリーを構築する。次い
で、理論的断片化スペクトルを並べ替えの許容されたラ
イブラリーの各メンバーについて計算し、未知ペプチド
につき質量分析法によって獲得可能な実験的断片化スペ
クトルと比較して未知ペプチドのアミノ酸配列を決定す
る。最も好ましくは、タンデム質量分析を用いて、未知
ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
一旦単離された蛋白質の全または部分的アミノ酸配列
を実験的に決定すれば、コンピューターを用いて、その
予測アミノ酸配列が実験的に決定されたアミノ酸配列と
合う発現された配列タグ（EST）を含めた、適合したア
ミノ酸配列またはヌクレオチド配列につき有効なデータ
ベースを検索できる。もし適合する核酸配列が見出され
なければ、実験的に決定されたアミノ酸配列をコードす
る縮重したセットのヌクレオチド配列が当該技術におい
てよく知られた技術によって逆作成でき；かかる縮重し
たセットのヌクレオチド配列は、単離された蛋白質をコ
ードする遺伝子をクローニングし、配列決定された蛋白
質またはペプチド断片を発現するのに有用である。別法
として、蛋白質を得る種において好ましいゴドン（例え
ば、蛋白質がヒト蛋白質である場合はヒトにおいて好ま
しいコドン）のみ用いて、縮重したセットのヌクレオチ
ド配列のサブセットを逆作成でき；所望ならば、このサ
ブセットは、関連した種において最も高度に好ましい１
つのヌクレオチド配列に限定できる。
単離された蛋白質をコードする遺伝子を公的または私
的なデータベースにおいて同定する場合、遺伝子をクロ
ーニングし、細菌、酵母または哺乳動物宿主細胞に導入
できる。かかる遺伝子がデータベース中で同定されない
場合、本発明の方法および装置によって決定された蛋白
質のアミノ酸配列をコードする縮重したプローブセット
を用いて、かかる遺伝子をクローニングできる。データ
ベースが蛋白質の実験的に決定されたアミノ酸配列をコ
ードする１以上の部分的ヌクレオチド配列を含む場合、
かかる部分ヌクレオチド配列（またはそれらの相補物）
は、遺伝子をクローニングするためのプローブとして機
能し、縮重したセットを使用する必要性を緩和する。
遺伝子工学により作成されて、かかる組換え蛋白質を
発現する細胞は、スクリーニングプログラムで用いて、
組換え蛋白質と特異的に相互作用する他の蛋白質または
薬物を同定し、あるいは、例えば、治療的投与用の大量
の組換え蛋白質を産生することができる。クローニング
された遺伝子の保有は、その欠如または減少した発現が
疾患と関係する蛋白質を置き換えまたは補足して、遺伝
子治療を可能とする。クローニング遺伝子の保有は、同
様にアンチセンスまたはトリプルヘリックス治療を可能
として、その存在または強化された発現が疾患と関係す
る蛋白質の発現を抑制する。
5.8.2. 翻訳後プロセッシングの分析 多くの蛋白質は、アミノ酸以外の化学的な基、例え
ば、リン酸基およびオリゴ糖での翻訳後修飾を受ける。
蛋白質のかかる基の存在、位置および化学的同一性は本
発明の装置および方法によって得られた蛋白質特異的ペ
プチド断片を用いて分析する。一の具体例において、ゲ
ル断片中の単離された蛋白質から得られたペプチドプー
ルを分割する。一部分を前のセクション5.8.1.に記載さ
れたごとく蛋白質の同定に用いる。他の部分または複数
部分を用いて、当該分野で知られた標準的方法によって
個々の翻訳後修飾を同定する。例えば、リン酸化分析
は、In Carrら、1996、Analyt.Biochem.239:180−192お
よびTownsendら、1996、Protein Science 5:1865−1873
に記載されている（各々の全てをここに出典明示して本
明細書の一部とみなす）。グリカン分析は、Dwekら、19
93、Analyt.Biochem.62:65−100に記載されている（そ
の全てをここに出典明示して本明細書の一部とみな
す）。
6.実施例：慢性関節リウマチを有する患者の血清および
滑液からの蛋白質 慢性関節リウマチ（RA）を有する患者からの血清およ
び滑液中の蛋白質を等電点電気泳動、続いてSDS−PAGE
によって分離し、比較した。
6.1. 等電点電気泳動 等電点電気泳動（IEF）では、Sanchezら、1997、Elec
trophoresis 18:324−327（その全てをここに出典明示
して本明細書の一部とみなす）に記載されたごとき至適
な修飾を有する、製造者の使用説明書、Immobiline Dr
yStrip Kit、Pharmacia、＃18−1038−63、Edition AB
用の使用説明書参照（その全てをここに出典明示して本
明細書の一部とみなす）、に記載された手順に続いて、
Immobiline DryStrip Kit（Pharmacia BioTech）に各
試料を適用した。ある種の場合には、Westermeier、199
3、Electrophoresis In Practice（VCH、Weinheim、Ger
many）、pp.197−209（その全てをここに出典明示して
本明細書の一部とみなす）に記載された手法により、特
別なpH範囲における分解を増大させるまたはゲルに大量
の標的蛋白質を負荷するために、2pH単位またはより小
さいpH範囲を有する狭い範囲の「ズームゲル」を用い
る。
6.2. ゲル平衡およびSDS−PAGE 前記のSanchezらに記載されたごとく、ジスルフィド
結合の最初の還元に続いて、遊離チオール基のアルキル
化を含む２つの工程手法によって、SDS緩衝液系中の平
衡化によってSDS−PAGEのためにIEFゲルを調製した。従
って、以下に明記されたごとき修飾を用いて、Hochstra
sserら、1988、Analytical Biochemistry 173:412−423
（その全てをここに出典明示して本明細書の一部とみな
す）により、SDS−PAGEを行った。
6.3. 支持されたゲルの調製 ゲルを接着すべきガラスプレート（「ボトムプレー
ト」）に、エタノール中のＹ−メタクリル−オキシプロ
ピルトリメトキシシランの0.4％溶液を適用することに
よって、ガラス支持体へのSDS−PAGEゲルの共有結合を
達成した。過剰な試薬を水で洗浄することによって除去
し、ボトムプレートを乾燥させた。この工程にて、ゲル
用の識別証明としておよびプレートのコート面を識別す
るためのマーカーとして、粘着性のバーコードをゲルマ
トリックスと接触しないような位置でボトムプレートに
取り付けた。
対向するガラスプレート（「トッププレート」）をRe
pelSilane（Pharmacia Biotech）で処理してゲル接着を
最小化した。試薬を適用した後、プレートの表面に加熱
した空気の流れ（例えば、熱空気銃）を適用することに
よって、トッププレートを加熱した。過剰な試薬を水洗
浄によって再び除去し、トッププレートを乾燥させた。
乾燥されたプレートを13枚のゲルサンドイッチの容量
を有する注型ボックス中に組み立てた。同一条件下、よ
り多くのゲルを注型するために平行していくつかの注型
ボックスを組み立てた。各サンドイッチのトップおよび
ボトムプレートに1mm厚さのスペサーにより間隔をあけ
た。該サンドイッチにアセテートシートを挟み込んで、
ゲル重合後にサンドイッチの分離を促した。次いで、Ho
chstrasserらの前記引用によってキャスティングを行っ
た。
6.4. SDS−PAGE IEF工程からのゲルストリップを注いだSDS−PAGEゲル
の頂上に適用し、電気泳動を開始した。電気泳動試行の
間のゲルの一様な冷却を保証するために、Amessら、199
5、Electrophoresis 16:1255−1267（その全てをここに
出典明示して本明細書の一部とみなす）によって実質的
に記載されるごとくに、システムをデザインした。電気
泳動の間、熱変動を最小化し、ゆえに蛋白質の移動のコ
ンシステンシーを維持するために、一様で効率よい冷却
が望ましい。トラッキング染料がゲルの基底端に達する
まで、電気泳動を行った。次いで、染色のためにゲルを
直ちに取り出した。
6.5. 染色 ゲルカセットの頂上プレートを注意深く取り出し、ボ
トムプレートに結合したゲルを得た。次いで、12枚のゲ
ルの収容能力を持つ染色装置にゲルが接着されたボトム
プレートを入れた。ゲルを40％（v/v）エタノール、10
％（v/v）酢酸、50％（v/v）水を含む固定液に完全に一
晩浸した。次いで、固定液をタンクから排出し、7.5％
（v/v）酢酸、0.05（w/v）SDSに30分間浸漬することに
よってゲルを整えた。次いで、プライミング溶液を排出
し、染料溶液中の４時間の完全な浸漬によってゲルを染
色した。製造者の使用説明書により、Sypro Red（Molec
ular Bioprobes、Inc.、Eugene、Oregon）を希釈するこ
とによって、蛍光染料のストック溶液を調製した。0.4
μｍのフィルターを通して、真空下、希釈溶液を濾過し
た。
全ての12ゲルにわたる種々の溶液の連続的で一様な循
環を達成するために、その全ての幅を横切るタンクの底
に沿って広がり、各ゲルにわたり一様に溶液を流すのを
可能とする穴を設けた分配棒を介してタンク内に溶液を
導入した。
6.6. ゲルのイメージング 以下に記載されたごとき修飾を持って、製造者の使用
説明書により、Stormscanner（Molecular Dynamics、Su
nnyvale、California）で、蛍光染色されたゲルを画像
化することによって、コンピューター可読出力を得た
（Storm User's Guide、1995、Version 4.0、Part No.1
49−355参照、その全てをここに出典明示して本明細書
の一部とみなす）。ゲルは剛直にガラスプレートに結合
しているので、イメージング中にゲルをスキャナーベッ
ド接触させて保持する。ゲルおよびスキャナーベッド間
の一様でない接触から発生する干渉パターンを回避する
ために、空気ポケットを避けるように注意して、水の被
膜をゲルの下に導入した。さらに、ゲルをゲルと一緒に
画像化された２つの蛍光ボタンを設けたフレームに置い
て、ゲルに検出された他の特徴のＸ、Ｙ座標を決定する
ために、参照ポイント（M1およびM2と指定）を供する。
ゲルの正確な配列を保存するために、ロボットゲル切り
出し器上に適合したフレームを設けた。イメージングの
後、少量の染色液を含むポリエチレンバッグにゲルを密
封し、次いで、４℃にて貯蔵した。
スキャナーからの出力をまずMELANIE を用いて処理
して、登録ポイントであるM1およびM2を自動検出し；画
像を自動切り取りし（すなわち、ゲルの境界線、例えば
参照フレームの外側にあるスキャンされた画像の領域に
由来するシグナルを消し）；ゴミによる人工産物を取り
除き；特徴を検出および定量し;GIF形式において画像フ
ァイルを造る。バックグラウンドを有する潜在的蛋白質
スポットのコンピューター媒介比較によって特徴を検出
して、バックグラウンド染色を表す所与の閾値を超える
シグナルに関係するゲルの領域を選択した。
検出された特徴の相互作用的編集および各試料の二連
ゲルを適合させるために第二プログラムを用いた。ま
ず、画像を評価して、著しい異常を有する、または余り
にも低い負荷または総画像強度の、または余りにも貧弱
は分解能の、または二連が余りにも異なる画像を拒絶し
た。二連のうち一の画像が拒絶されたならば、二連に属
する他の画像は、画像質にかかわらず拒絶された。反復
分析のために拒絶された試料の表を作った。
ランドマーク同定を用いて、ゲルの泳動におけるいず
れの変動も補正する。このプロセスは、いずれの所与の
生物学的試料において見出されるのが期待されるある種
の蛋白質の同定も含む。これらの共通な蛋白質は、試料
で同一の等電点および分子量を示すので、標準品として
用いていずれの可能なゲル変動またはゆがみも補正でき
る。参照ゲル中のランドマークについてのpIおよび分子
量値は、ヒト血漿中の公知蛋白質に関して先にキャリブ
レートされたE.coli蛋白質と試料とを共泳動させること
によって決定した。主にゲル画像の端における人工産物
と考えられた特徴、とりわけ試料適用ポイントおよび染
料フロントによる特徴を除去した。次いで、ランドマー
クおよび二連ゲルの同一スポットを対合するように行っ
た適合プロセスを介して、二連ゲルを整列させた。これ
は、対合スポットが分離の再現性を示すので、続いて測
定された等電点および分子量が正確であるという増大し
た保証を供した。補正されたゲルは、その後の分析に使
用に加えて、視的明記のためにプリントアウトした。
画像の生成に続いて各蛋白質のＸ、Ｙ座標のコンピュ
ーター測定を行い、これはランドマーク蛋白質または標
準品と参照して個々の等電点および分子量と相関した。
各蛋白質スポットの強度の測定を行い、貯蔵した。各蛋
白質スポットに識別コードを割り当て、マスターゲル、
すなわち、各タイプの試料に見られた大部分または全て
の蛋白質スポットを含む参照ゲルのスポットに合わせ、
他の試料の蛋白質スポットを合わせる鋳型として用い
た。この工程は、多くの異なるゲルを横切る推定相関ス
ポットの同定を可能とした。セクション5.1に記載され
たごとく、オリジナルの生物学的試料の収集間に集めら
れたデータを、ゲルデータと再結合させ、それによっ
て、年齢または臨床的成果のごとき情報に基づく試料の
コンピューター選択された断面図の分析を可能とした。
分析のこの態様の結末は、各同定されたスポットにつ
いて含まれたデジタルプロフィールの生成であった:1）
ユニークな任意の同定暗号;2）Ｘ、Ｙ座標;3）等電点;
4）分子量;5）シグナル値、６）前記の各測定について
の標準偏差、および７）このスポットに合ったマスター
ゲルのスポットのMCIに対するポインター。LIMSによっ
て、ゲルプロフィールデータベースのコンピューター分
析によって同定された蛋白質は遡及できたので、このプ
ロフィールはそれが生成した実際の貯蔵されたゲルまで
追跡可能であった。また、LIMSは、プロフィールがオリ
ジナルの試料および患者に遡ることを可能とした。
6.7.ゲルのデジタル分析 一旦プロフィールが生成されたならば、分析は注目す
る蛋白質の選択の方へ向けられた。
対合する血清および関節液試料からの個々の画像にお
ける蛋白質の特徴を電子的に比較した。画像のセットを
横切るいずれか１つの特徴の分子同一性を、2D分離の位
置の同一性としてこの分析において定義する。個々の画
像中の個々の特徴の豊富さの定量的測定は、その画像中
の特徴について測定された正規化された蛍光強度に基づ
いた。その豊富さが血清および滑液試料のセット間で異
なる蛋白質が全関連画像中の全ての検出された特徴の電
子的比較によって明らかにされた。
6.8. 選択された蛋白質の回収および分析 異なって発現された蛋白質をロボットにより切り出
し、処理してトリプシンペプチドを生成し；これらのペ
プチドの部分的アミノ酸配列はde novo配列決定を用い
て、質量分析によって決定した。
6.9. 結果 これらの初期の実験は、対合した血清試料中よりヒト
RA滑液中により高レベルで存在する12種の蛋白質、およ
び対合した血清試料中よりヒトRA滑液中により低レベル
で存在する９種の蛋白質を同定した。部分的アミノ酸配
列を各々のこれら異なって発現した蛋白質について決定
した。公的データベースのコンピューター分析は、これ
らの部分的に配列決定された蛋白質のうち16種の当該技
術において公知であり、５種は、調査されたいずれかの
公的データベースにおいて記載されていなかったことを
明かにした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アメス，ロバート イギリス、オーエックス２・９キューエ ス、オックスフォードシャー、カマー、 ザ・パーク21番 (72)発明者 ブルース，ジェイムズ・アレキサンダー イギリス、オーエックス８・８ジェイピ ー、オックスフォードシャー、ロング・ ハンボロ、マールボロ・クレセント14番 (72)発明者 プライム，サリー・バーバラ イギリス、オーエックス２・０エヌエ イ、オックスフォードシャー、オックス フォード、ノース・ヒンクシー・ビレッ ジ37番 (72)発明者 プラット，アルバート・エドワード イギリス、オーエックス14・３エックス ビー、オックスフォードシャー、アビン グドン、ザ・ウォーレン47番 (72)発明者 ストーニー，リチャード・マイケル イギリス、オーエックス14・１エヌエイ チ、オックスフォードシャー、アビング ドン、インカーマン・クロース53番 (56)参考文献 特開 平７−132079（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−91564（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−260742（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−15206（ＪＰ，Ａ) 国際公開95／025281（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/447 G01N 27/62

Claims (28)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】複数の生体分子を第一の物理的または化学
    的特性によって分離して、生体分子の一次元アレイを形
    成する第一分離工程、および生体分子の該一次元アレイ
    を第二の物理的または化学的特性によって分離して、該
    二次元アレイを形成する第二分離工程を含むプロセスに
    より調製された二次元アレイに存在する１以上の生体分
    子の単離を選択および指令するコンピューター利用方法
    であって、 該二次元アレイまたはそのレプリカを第一のデバイスで
    画像化して、該二次元アレイにおいて検出された各々の
    複数の生体分子に対し、X,Y座標の対およびシグナル値
    を含むコンピューター可読出力を生成させ； 少なくとも１つのコンピューターにおいて該出力を処理
    して、先に定められたまたはオペレーター指定基準によ
    り１以上の該検出された生体分子を選択し； 該二次元アレイから該選択生体分子のうち少なくとも１
    つを単離するように、第二の物理的に分かれたロボット
    デバイスを指令する機械可読命令を生成し；次いで、 該機械可読命令に応じて該ロボットデバイスによって該
    二次元アレイから該選択生体分子のうち少なくとも１つ
    を単離することを含むことを特徴とする該方法。
  2. 【請求項２】該コンピューター可読出力が、該二次元ア
    レイに存在する各々の複数の生体分子に対し、X,Y座標
    の対を含み、該機械可読命令が該ロボットデバイスのＸ
    およびＹ移動を指令することを特徴とする請求項１記載
    の方法。
  3. 【請求項３】該二次元アレイの画像化を蛍光スキャナー
    を用いて行うことを特徴とする請求項１または２記載の
    方法。
  4. 【請求項４】ロボットデバイスを指令して、該二次元ア
    レイから１を超える選択生体分子を単離する機械可読命
    令を生成することを特徴とする請求項１ないし３のいず
    れか１記載の方法。
  5. 【請求項５】複数の該生体分子が、生物学的試料からの
    ものであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれ
    か１記載の方法。
  6. 【請求項６】二連アレイが生物学的試料から生成され、
    該ゲルの画像化から生成したコンピューター可読出力が
    適合することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか
    １記載の方法。
  7. 【請求項７】該生体分子がオリゴ糖であることを特徴と
    する請求項１ないし６のいずれか１記載の方法。
  8. 【請求項８】該生体分子が蛋白質であることを特徴とす
    る請求項１ないし６のいずれか１記載の方法。
  9. 【請求項９】該蛋白質が、糖蛋白質を含むことを特徴と
    する請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】該二次元アレイが、ゲルに含まれること
    を特徴とする請求項１ないし９のいずれか１記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】該二次元アレイが、ポリアクリルアミド
    ゲルに含まれることを特徴とする請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】該二次元アレイが、等電点電気泳動に続
    いて、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下での電気泳動に
    よって調製されることを特徴とする請求項11記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】該ゲルが二次元空間安定性を有するよう
    な略平面の固体支持体に結合し、該支持体が生体分子に
    よって担持された検出可能な標識の検出について、実質
    的に非干渉性であることを特徴とする請求項10ないし12
    のいずれか１記載の方法。
  14. 【請求項１４】ポリアクリルアミドゲルが、該固体支持
    体に共有結合することを特徴とする請求項13記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】該検出可能な標識が、蛍光性標識である
    ことを特徴とする請求項13または14記載の方法。
  16. 【請求項１６】該固体支持体が、ガラスであることを特
    徴とする請求項13ないし15のいずれか１記載の方法。
  17. 【請求項１７】選択生体分子の単離が、該選択生体分子
    を含有する一部分のゲルの切り出しを含むことを特徴と
    する請求項10ないし16のいずれか１記載の方法。
  18. 【請求項１８】切り出された部分のゲル内に含有した生
    体分子を分析することをさらに含むことを特徴とする請
    求項17記載の方法。
  19. 【請求項１９】該生体分子が蛋白質であって、該分析が
    蛋白質分解を含むことを特徴とする請求項18記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】質量分析により該蛋白質のペプチド配列
    を決定することをさらに含むことを特徴とする請求項19
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】複数の生体分子を第一の物理的または化
    学的特性によって分離して、生体分子の一次元アレイを
    形成する第一分離工程、および生体分子の該一次元アレ
    イを第二の物理的または化学的特性によって分離して、
    該二次元アレイを形成する第二分離工程を含むプロセス
    により調製したポリアクリルアミドゲルに含まれた二次
    元アレイに存在する１以上の選択生体分子のコンピュー
    ター利用単離用装置であって、 該二次元アレイ中の各々の複数の生体分子に対し、X,Y
    座標の対およびシグナル値を含むコンピューター可読出
    力を生成するための該二次元アレイを画像化できる検出
    器； 先に定められたまたはオペレーター指定の基準により該
    出力に表される１以上の生体分子を選択し、ロボットデ
    バイスを指令して、該選択生体分子のうち少なくとも１
    つを単離する機械可読命令を生成するようにプログラム
    された１以上のコンピューター；および 該指示により選択生体分子を含有する一部分のゲルの取
    り出しによって該選択生体分子のうち少なくとも１つを
    単離できるロボットデバイスを含み、 ここに、該検出器は、該１以上のコンピューターのうち
    少なくとも１つに操作可能に連結し、該１以上のコンピ
    ューターのうち少なくとも１つは該ロボットデバイスに
    操作可能に連結し、 ここに、該検出器は該ロボットデバイスとは物理的に分
    かれていることを特徴とする該装置。
  22. 【請求項２２】該ロボットデバイスが、該機械可読命令
    の指令下、ＸおよびＹ移動を行うのに適合する請求項21
    記載の装置。
  23. 【請求項２３】該ロボットデバイスが、移動用シャトル
    を含むチップを含む切断ヘッドを含む請求項21または22
    記載の装置。
  24. 【請求項２４】該検出器が、蛍光スキャナーである請求
    項21ないし23のいずれか１記載の装置。
  25. 【請求項２５】該生体分子が、請求項７ないし９のいず
    れかに定義される請求項21ないし24のいずれか１記載の
    装置。
  26. 【請求項２６】該ポリアクリルアミドゲルが、ゲルが二
    次元空間安定性を有するように略平面の固体支持体に結
    合し、該支持体が生体分子によって担持された検出可能
    な標識の検出について実質的に非干渉性である請求項21
    ないし25のいずれか１記載の装置。
  27. 【請求項２７】ポリアクリルアミドゲルが該固体支持体
    に共有結合した請求項26記載の装置。
  28. 【請求項２８】該固体支持体がガラスである請求項26ま
    たは27記載の装置。
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