JP3461355B2 - 免疫電気泳動方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試験対象中の免疫反応を惹起する、少なくと
も１種のハプテン、１種の高分子、１種の病原体又はこ
れらの１部分の存在を検出方法と、免疫反応を惹起す
る、少なくとも１種のハプテン、１種の高分子、１種の
病原体又はこれらの１部分に対する免疫反応を検出する
方法とに関する。

本発明はまた、少なくとも１種の病原体又は抗原によ
る汚染に関して試験対象を検査するため、少なくとも１
種の病原体による感染に関して検査するため及び／又は
少なくとも１種のハプテン若しくは抗原に対するアレル
ギーに関して検査するための前記方法の使用に関する。

本発明はまた、野生型病原体による汚染を修飾病原体
による汚染から識別するため、並びに野生型病原体によ
る汚染後の免疫反応を修飾ワクチンとの接触後の免疫反
応から識別するための該方法の使用に関する。

抗原に対して特異的な抗体を検出するために現在最も
頻繁に用いられている方法は、ELISA（酵素結合イムノ
ソルベント分析法）である。ELISAでは、酵素呈色反応
によって抗体−抗原複合体を検出する。

抗原特異的抗体を検出するために頻繁に用いられてい
る他の方法は、RIA（ラジオイムノアッセイ）とIRMA
（イムノラジオメトリックアッセイ）であり、これらの
方法では抗原−抗体複合体が放射能標識剤を用いて検出
される。

放射能を含む研究に関連した最大の欠点は、費用及び
環境と方法を実施する個人とが汚染される危険性であ
る。

ELISAは放射能に関連した上記欠点を付随せず、また
この試験が非常に敏感であり、多数のサンプルを処理す
る場合に費用が非常に安いという点でRIA及びIRMAより
も有利である。しかし、ELISAも幾つかの欠点を有す
る。ELISAは多数回の激しい洗浄工程が必要であるため
に、多くの疑似陽性分析及び疑似陰性分析を与える可能
性がある。洗浄工程が誤った結果を生じない、比較的狭
い限界のみが存在し；緩和な洗浄は常に疑似陽性の読取
り値を生じ、激しい洗浄は形成された免疫複合体を除去
するので、これらの免疫複合体は検出されず、疑似陰性
結果が得られることになる。最後に挙げた状況は、例え
ば、完全な微生物が複合体化している場合の細菌測定に
おいて、免疫複合体が大きくなればなるほど頻繁に生ず
る。さらに、ELISA法は多くの工程を必要とするので、
かなり労力集約的である。さらに、ELISAは酵素反応を
用いて免疫複合体の存在を間接的に明らかにする。さら
に、病原体Ｂに対する免疫反応を検出する目的でELISA
を実施している場合に、病原体Ａに対する試験対象の免
疫反応をELISAによって検出することは不可能である。
幾つかの障害の同時の識別をELISA法によって効果的に
実施することはできない。しかし、例えば、ELISAに用
いられるマイクロタイタープレートの孔を種々な病原体
に特異的な、幾つかの抗原で被覆することができるの
で、種々な病原体感染に特有の、幾つかの抗体をサンプ
ルからできるかぎり結合させることができる、但し、こ
の場合には、分析の感度がかなり低下する。さらに、こ
の場合には、試験対象が病原体の１種類に免疫反応を示
すことを実証することができるにすぎず、いずれの病原
体に対してであるかを知ることはできない。

特に、病原体に特有のタンパク質による感染の場合
に、試験対象がそれに対して抗体を形成した抗原の直接
の測定方法が必要とされている。このためには、試験対
象のサンプル中のタンパク質を相互から分離しなければ
ならない、及び／又は免疫複合体を他の非複合体化タン
パク質から分離しなければならない。

電気泳動はタンパク質を一般に分離するためにしばし
ば用いられる方法である。例えば、SDSゲル電気泳動、
ネイティブゲル（native gel）電気泳動及び等電点電気
泳動（IEF）のような、多様な種類の電気泳動が存在す
る。SDSゲル電気泳動では、タンパク質が変性する；こ
のことは最後に挙げた２種類には該当しない。最初の２
方法では、タンパク質のサイズによって分離が行われ、
最後に挙げた種類では、等電点に基づいてこれが行われ
る。

幾つかの抗体がサイズ、電荷及び質量に関するそれら
の大きな類似性のために、同じ点において電気泳動する
という事実を考慮すると、またゲル上でのインシトゥ
（insitu）での特定抗原に対する特異的抗体の直接の検
出が不可能であるという事実を考慮すると、抗体を適所
に維持すると同時にゲル中に抗原を導入することは不可
能であるので、ゲルに移したサンプル中のある種の抗原
又は抗体の特定の検出のために電気泳動そのものを使用
することは不可能である。適用すべき免疫複合体の成分
がサンプルの成分に達し、適当な場合には、それと反応
するためには、適用すべき免疫複合体の成分がゲル全体
に拡散しなければならず、サンプルの成分も当然、同時
に拡散するという事実のために、これは信頼できる検出
パターンの展開を不可能にする。

免疫化学に電気泳動を適用する場合の、この問題を解
決するために、ブロット法が開発された。これらのブロ
ット法では、タンパク質結合ペーパーを、タンパク質が
その上で分離しているゲルと接触させる。その後に、圧
力又は電気泳動を適用することによって、タンパク質を
ペーパー上に転写すると、タンパク質成分がゲル上で分
離していた通りに、タンパク質成分の固定したインプレ
ッション（impression）がペーパー上に形成される。そ
の結果として、ELISA及びRIAにおけるのと同様に、検出
すべき病原体、病原体の一部、ハプテン又はタンパク質
に対する特異的抗体の適用によって特異的な、検出可能
な免疫複合体を形成することができる、又は抗体のイン
プレッションをペーパー上に形成することができ、次
に、特異的抗原をそれと接触させて、生ずる免疫複合体
を検出可能にすることができる。このブロット法も欠点
を有する。この方法は緩慢であり、費用がかかり、非効
率的であり、感度が不良である。ブロット時に、すなわ
ちペーパー上へのゲルの複写時に、分離したサンプル成
分の一部のみがペーパーに転写されるので、この試験は
効率的ではない。さらに、ELISA及びRIAに関して上記で
報告した欠点が同様に該当する。

試験対象がそれに対して抗体を形成している抗原を直
接検出するために、既存の方法は不充分である。試験対
象が汚染され、恐らく感染されていることを効果的でか
つ簡単な方法で実証し、同時に、何が試験対象を汚染
し、恐らく感染させているかを示す試験は存在しない。

J.Clin.Chem.Clin.Biochem.21巻,1983,841〜844頁に
おいて、Merlini G.等は電気泳動によって分離した血
漿中のタンパク質を同定するためのイムノサブトラクシ
ョン（immunosubtraction）法の使用を述べている。こ
の方法は電気泳動によって精製した単一特異的抗体層に
血漿を押し通し、それによって特異的タンパク質を沈殿
させることからなり、得られる電気泳動図にはこのタン
パク質は結果として存在しない。イムノサブトラクショ
ン法は２工程： １）抗血清のγ画分の電気泳動精製と、 ２）精製した抗体を通してのサンプルの電気泳動と から成る。抗体をミクロシリンジによってアガロースゲ
ルに供給し、抗血清を交互の孔に供給し、隣接孔を対照
（すなわち、非イムノサブトラクテッド（non−immunos
ubtracted）血清）のためにフリーに残す。抗血清はひ
と度吸収されたならば、20v/cmで45分間の電気泳動を受
けた。この予備電気泳動後に、アガロースゲルのストリ
ップ（1.5cm幅）を、これは抗血清の非γ画分によって
汚染されているので、プレートの沈着側から除去し、そ
の代わりに、同じゲルの新しいストリップを適用した。
次に、ブロモフェノール−ブルーを含む生理食塩水で希
釈したサンプルを予め抗血清を充填した孔と、比較分析
のためにフリーに残した隣接孔との両方に入れた。それ
故、イムノサブトラクテッドサンプルと非イムノサブト
ラクテッドサンプルとが平行して移動した。第２電気泳
動ランを逆極性によって実施し、次にサンプルを最初の
15分間、10V/cmにおいて電気泳動させ、次の30〜40分
間、20V/cmにおいて電気泳動させた。抗原抗体反応を促
進させるために、電流密度を最初は低く維持した。この
方法の欠点は非常に多く存在する。この方法によって
は、γ−グロブリンよりも遅く移動する抗原は、このこ
とがγ−グロブリンに抗原が追いついて、それらと免疫
複合体を形成することができないことを意味するので、
検出されることができない。また、これらのイタリア人
が記載している方法によってはIgMを検出することがで
きない。免疫グロブリンのIgGを検出することのみが可
能である。

Merlini等の方法では、血清の全ての非γ画分が切断さ
れている。

Merlini等による方法は、２つの電気泳動工程が必要で
あり、かつ電気泳動を緩慢に実施しなければならない、
さもなければ、抗原が免疫グロブリンと反応せずに免疫
グロブリンを追い越して移動し、それによって疑似陰性
試験結果を生じるという、他の欠点も有する。

Merlini等による方法は、サンプル中の検出しなけれ
ばならない物質の移動速度に依存する。この物質はゲル
中に予め混入された結合パートナーよりも迅速にゲルを
通して移動しなければならない。それ故、Merlini等に
よる方法は、物質が検出されることができるか否かを知
るためにどちらの物質が迅速に移動するかの予備分析を
必要とする。特に、サンプル中の例えばウイルスのよう
な、特定の病原体の存在の測定に関心を有し、ウイルス
を破壊したならば、ウイルス断片は恐らくIgG画分より
も迅速に移動せず、それ故に免疫複合体を生成するもの
として検出されないことになる。特に、初期に感染を検
出することに関心がもたれる場合に、IgMの存在を感染
の最初にこれが産生されたときに検出することが重要視
されるが、感染の開始時のIgG産生は非常に少量であ
り、しばしば検出不能である。それ故、Merlini等の方
法は、感染の初期にIgMを検出することができる本発明
の方法とは対照的に、感染の遅い段階において感染を検
出するために用いることができるにすぎない。

本発明の優先権特許出願の出願後に発行された（すな
わち、1993年７月20日に発行）、但し本発明の優先権出
願前に出願された（すなわち、1992年７月17日に出願）
米国特許第5,228,960号では、モノクローナルガンモパ
シー（gammopathy）の分析を実施する手段として、サン
プルの毛管電気泳動イムノサブトラクション（capillar
y electrophoretic immunosubtraction）のための方法
が開示されている。特に、開示されている方法は毛管電
気泳動イムノサブトラクション法である。分離すべき成
分部分を含むサンプルについて、好ましくは、前記方法
は下記工程： （１）サンプルの第１アリコートを毛管電気泳動法によ
って成分部分に分離し、前記部分を検出する工程と； （２）前記サンプルの第２アリコートを、前記サンプル
の成分に対する少なくとも１種の特異的結合パートナー
であって、前記アリコートから実質的に除去されること
ができる特異的結合パートナーと混合する工程と； （３）前記アリコートを毛管電気泳動法によって成分部
分に分離し、前記部分を検出する工程と； （４）工程（３）の分離した成分部分を工程（１）の分
離した成分部分と比較する工程と を含む。

好ましくは、サンプルは臨床サンプルであり、成分部
分は免疫グロブリンを含み、それによって特異的結合パ
ートナーは抗免疫グロブリン抗体である。最も好ましく
は、特異的結合パートナーを不溶化してから、第２アリ
コートをそれと混合するか、又はアリコートと混合した
後に、特異的結合パートナーを不溶化することができる
ことである。

この米国特許に開示される方法では、サンプルから免
疫複合体を免疫沈殿させるか又は除去することが必要で
ある、さもなくば、毛管が大きい免疫複合体によって迅
速にブロックされるからである。

EP−Ａ−0504810はpH7〜10に等電点を有する複合糖質
（glycoconjugate）の存在を検出するための体液の特異
的分析法に関する。好ましい実施態様では、血清の総タ
ンパク質含量を6.5〜9.5のpH範囲における等電点電気泳
動（IEF）によって分離する。分離したタンパク質を膜
に移し、その後、炭水化物を含む化合物類を免疫学的に
表示する（要約と第３頁の最後のパラグラフを参照のこ
と）。

EP−Ａ−3811083は電気的に中性である抗原を検出す
るためのイムノアッセイに関する。この抗原を電気的に
荷電した抗体と反応させる。その後、反応生成物を電気
泳動によって処理してから、問題の抗原を定量分析す
る。

Journal of Diary Research,59巻,1992,273〜285
頁において、L.K.Rantamtiは乳腺炎の乳からのα_２−
マクログロブリンの単離と特徴付けとを述べている。乳
腺炎の乳からのホエー成分をSDS−Page法とネイティブR
AGE法によって分析している。

意外なことには、試験対象、実験動物又はヒトがそれ
に対して抗体を形成している抗原を電気泳動を用いて直
接、検出することができる方法が今回発見された。

本発明は、試験対象における、免疫反応を惹起する少
なくとも１種のハプテン、高分子、病原体又はその一部
の可能な存在を検出し、及び／又は免疫反応を惹起する
少なくともハプテン、高分子、病原体又はその一部に対
する免疫反応を検出する方法であって、 （ａ）試験すべき試験対象の液体サンプルを採取するか
又は用意し、 （ｂ）サンプルをストック溶液と共にインキュベート
し、ここでストック溶液が、試験すべき病原体、試験す
べき病原体の一部、試験すべき高分子若しくは試験すべ
きハプテンの少なくとも１種の特徴的な抗原を含むか、
又は試験すべき病原体、試験すべき病原体の一部、試験
すべき高分子若しくは試験すべきハプテンに対して特異
的である少なくとも１種の抗体を含むものであり、 （ｃ）インキュベーション後に、インキュベートした混
合物を非変性条件下での電気泳動に適した基体に供給
し、 （ｄ）工程（ｂ）で用いた同じストック溶液を基準とし
て同じ基体に供給し、 （ｅ）工程（ｃ）の混合物と工程（ｄ）のストック溶液
とを非変性条件下で電気泳動させ、インキュベーション
混合物とストック溶液との成分を分離し、 （ｆ）インキュベーション混合物とストック溶液との成
分を上記工程の１つにおいて検出可能にし、 （ｇ）インキュベーション混合物とストック溶液との電
気泳動後に得られたシグナルパターンを比較する上記方
法に関する。ストック溶液とサンプルとの間の電気泳動
後の、免疫複合体の可能な形成による差異を分析する。

例えば、検出すべき少なくとも１種の特定の抗原を含
むストック溶液を加えた液体サンプルのインキュベーシ
ョン工程中に、ストック溶液中に存在する抗原に対して
特異的であるサンプル中の抗体がそれらの対応抗原と反
応して、免疫複合体を形成することができる。本発明に
よる方法は例えばIgG、IgM、IgE、IgAのような、免疫グ
ロブリンの任意の種類の存在を検出するために使用可能
である。特に、IgM検出の可能性は、感染の初期段階が
感染として有効に診断することができるので、特に有利
である。試験対象が免疫反応を、検出すべき特定抗原に
よる汚染又は接種に対する反応として示しているとき
に、この抗原に対して特異的な対応抗体が試験対象の血
清サンプル中に存在すると考えられる。抗体はストック
溶液中に存在する抗原に結合すると、免疫複合体が形成
される。免疫複合体の形成によって、このように結合し
た抗原の分子パラメータが未結合抗原に比べて変化す
る。電気泳動にインキュベーション混合物の他にストッ
ク溶液を基準として用いる場合に、例えば、等電点及び
分子量のような、パラメータの変化を電気泳動において
観察することができる。この方法によって、特に抗体−
抗原のタンパク質複合体をモニターすることが意図され
るので、非変性条件下で電気泳動を実施することが必要
である。驚くべきことには、形成された免疫複合体が例
えばグリセロール又はアンホリン（ampholine）のよう
なゲル成分の影響下で変性又は解離せず、それ故、所定
目的を達成することができることが判明している。タン
パク質分野のエキスパートはゲル電気泳動におけるタン
パク質分離にどのような非変性条件が通常用いられるか
を知っており、本発明による方法を実施する場合にこの
ような条件を容易に適用することができる。

SDS−PAGEはブロット法に関して最も良い結果を与え
るが、タンパク質の変性が行われるので、これは所定の
目的に不適切である。本発明による方法にはネイティブ
（native）PAGE及びIEFを用いることができる。しか
し、両方法の間には顕著な差異が存在する。IEFの分離
能はネイティブPAGEの分離能よりもずっと大きい。ネイ
ティブPAGE電気泳動は固定pHにおいて可能であるが、IE
Fでは固定pHは不可能である。本発明を用いる場合に、
いずれかの方法が好ましい。当業者はどのような状況に
おいてはどちらの方法が好ましいかを理解するであろ
う。毛管電気泳動は、免疫複合体が毛管をブロックする
恐れがあるので、本発明の方法に有用ではない。あらゆ
る場合に、形成された免疫複合体は完全な状態で留まら
なければならないので、変性環境は避けなければならな
い。

注目すべきは、電気泳動の前に免疫複合体の可能な形
成が生ずるので、既存方法とは対照的に、反応パートナ
ーはゲル中に相互を見いだす必要がなく、それによっ
て、例えばMerlini等の方法で生ずるような不正確な結
果の可能なソースを排除する。本発明の方法の前には、
当業者は電気泳動の前にサンプルを結合パートナーと反
応させることを考えなかったと思われる、というのは、
生ずる免疫複合体があまりに大きくて、ゲルに入ること
ができないと考えられたからである。意外にも、例え
ば、４％アクリルアミドゲルが500〜600,000ダルトンの
オーダーのサイズを有する免疫複合体の電気泳動を事実
上可能にすることが判明した。特に、多重の抗原が抗体
に結合する状況及び多重の抗体が抗原に結合する状況を
も検出することさえ可能である。免疫グロブリンの一般
的なサイズは160,000ダルトンである。特に、今までの
方法との相違点は、本発明の方法では、免疫複合体の不
存在又は存在が判定されるが、今までは免疫複合体が廃
棄されていたことである。

本発明の利点は、ELISA等によって通常必要とされ
る、サンプルの多重の洗浄工程及び操作が不必要である
ことである。疑似陽性又は疑似陰性の読取り値が生ずる
ことはなく、本発明の方法は容易な操作のために多数の
サンプルに関して実施することができる。本発明の方法
の他の利点は、任意の種類の抗体、IgGのみでなく、IgM
又はIgAをも検出することができるという事実にある。
少量の抗体を含むサンプルに過剰の抗原を用いてこの方
法を適用すること、又は多くの抗体を含むサンプルに対
して少量の抗原を添加してこの方法を適用することも可
能である。抗体と等しい量の抗原が存在する場合に、本
発明の方法を適用することも可能である。それ故、一言
で述べると、特異的結合パートナーの量の投与は試験の
成果に関係しない。全ての変形（variants）が所望の結
果を生ずる。さらに、電気泳動を簡単な１工程で実施す
ることができ、検出を簡単化して、費用を下げることが
できる。さらに、この方法は、抗原が特異的結合パート
ナーよりも迅速に移動する要素でなければならないこと
をもはや必要としない。また、この特異的結合パートナ
ーと検出すべき要素との間の反応が電気泳動の前に生
じ、それによって、この方法を印加電圧から独立したも
のにするので、疑似陰性を阻止するために電気泳動を緩
慢に実施する必要がない。Merlini等が開示した方法で
は、疑似陰性を避けるために低い電圧が必要である。本
発明による方法では、一般的に言って、免疫グロブリン
Ｇの産生が非常に少量であるが、IgMが多量に産生され
る感染の初期段階をも、本発明の方法はIgMの検出をも
可能にするので、検出することが可能である。

本発明の方法によると、“全面的な”病原体のみでな
く、特定の高分子又はハプテンを検査することも可能で
ある。高分子とは、特にタンパク質又はペプチドを意味
すると理解することができる。ストック溶液の組成に依
存して、１回操作で２種以上の障害を検出することも可
能である。

同時に、本発明による方法では、特定の障害に関して
重要であるpH範囲を正確に用いることが可能である。IE
Fを電気泳動工程として用いる場合には、電気泳動を例
えば３〜10のpH範囲で実施することができるが、その特
徴的な抗原が６〜７のpHにおいて電気泳動する特定の汚
染に関して検査を実施する場合には、特定の結果がより
迅速にかつより明白に得られるように、まさにこのpH範
囲において電気泳動を実施することができる。

タンパク質に関する通常の呈色反応を用いることによ
って、全ての免疫複合体及びゲルのタンパク質成分を検
出可能にすることができる。本発明による方法は、工程
（ｂ）におけるストック溶液の特徴的な抗原又は特異的
抗体の各々に標識剤を与えるようなやり方で実施するこ
ともできる。このやり方では、何を検出すべきかに依存
して、種々な標識でストック溶液の種々な抗原又は抗体
を別々に又はグループとして標識することも可能であ
る。

本発明はまた、少なくとも１種の病原体若しくはその
一部の存在に関して試験対象を検査するため、又は少な
くとも１種の病原体若しくはその一部による感染若しく
は接種の場合の免疫反応に関して試験対象を検査するた
めの本発明による方法（簡明さのために、この方法を電
気泳動プロフィルと呼ぶ）の使用にも関する。

このやり方で用いる場合に、電気泳動後の基準のシグ
ナルパターンと比較した、インキュベーション混合物の
シグナルパターンの少なくとも１種のシグナルの置換及
び／又は消失の検出が、適用した病原体、免疫反応を惹
起する病原体の部分、用いた高分子又はハプテンによる
汚染及び恐らく感染も実証する。このシグナルはゲル上
の１個以上のバンド若しくはストリップの形状である
か、又は電気泳動図のピークの形状であることができる
か、或いはゲル中のサンプルの塗布部位の近く若しくは
塗布部位における大きなしみ若しくはピークの出現若し
くは不存在であることができる。特定の病原体による汚
染を検出するためには、ストック溶液にその病原体自体
を用いるか又はストック溶液にその病原体による感染に
特有の少なくとも１種の抗原を用いることが必要であ
る。幾つかの異なる病原体による汚染を検査によって検
出すべきである場合には、ストック溶液は対応する病原
体若しくは、感染に特有の免疫反応を生じる、その抗原
を含むべきである。

しかし、検査を免疫反応ではなく、汚染を検出するた
めにのみ用いる場合には、ストック溶液に検出すべき病
原体に特異的な抗体を用いて、その後に、複合体形成が
インキュベーション混合物中で行われたか否かを本発明
の電気泳動プロフィル法によってモニターすることがで
きる。このような複合体形成は、検出すべき抗原がサン
プル中に存在する場合にのみ行うことができる。図１は
本発明による方法、すなわち電気泳動プロフィルのＢ型
肝炎感染の検出への使用を説明する。試験を1500Vhにお
いて12％ゲル中で実施した。ピーク３は抗血清なしであ
り、４は抗血清を含み、５は10倍希釈抗血清を含む。図
２は1500Vhにおける４％ゲル中でのIBRによる感染を検
出するための電気泳動プロフィルの使用を説明する。ピ
ーク６は抗原なしである。ピーク７はウシ１によるもの
であり、ピーク８はウシ２によるものであり、ピーク９
はウシ３によるものである。事実上明らかに、ウシ１〜
３は感染している。図３は、本発明による方法を４％ゲ
ル上で用いた、アルブミンに対する抗体の存在の測定を
説明する。全ての図において、バンドの強度は縦軸に与
えられ、ゲル上の位置は横軸にmmで表現される。

本発明はまた、少なくとも１種のハプテン又は抗原に
対するアレルギーを検査するための本発明による電気泳
動プロフィル法の使用をも包含し、この場合には、本発
明の電気泳動プロフィル法によるインキュベーション混
合物中の複合体形成の検出と、電気泳動後の基準の複合
体形成の検出との比較が、用いたハプテン又はアレルゲ
ンに対するアレルギーを実証する。

本発明の電気泳動プロフィル法の他の使用も興味深
く、これは野生型病原体による汚染と修飾ワクチンによ
る免疫感作とを識別するための使用であり、この場合に
は、野生型病原体による感染に特徴的な全てのタンパク
質の、ゲル中又はゲル上のサンプル塗布部位中の免疫複
合体の同時出現によるシグナルの置換及び／又は消失
が、野生型病原体による感染が生じていることを実証
し、形成された免疫複合体における、免疫反応に特有の
少なくとも１種の抗原の存在及び／又は免疫反応に特有
の少なくとも１種の抗原の不存在が、病原体の免疫反応
を決定する少なくとも１種の抗原に対して抗体が形成さ
れていないことを実証し、このことは試験対象の免疫反
応が野生型病原体に対してではなく、修飾ワクチンに対
するものであることを実証する。本発明の場合には、修
飾ワクチンとは野生型病原体による汚染に対する特徴的
な免疫反応を惹起する少なくとも１種のタンパク質が欠
失しているワクチンを意味するか、又は感染中に対応野
生型タンパク質に対して産生される抗体との結合がもは
や生じないように突然変異した少なくとも１種のタンパ
ク質を含むワクチンを意味すると理解される。

本発明による電気泳動プロフィル法を用いると、 ・病原体の存在と不存在の両方を検出すること、 ・病原体、病原体の一部、抗原又はハプテンに対する試
験対象の体の反応を、必要に応じて、検出すること、及
び ・特定の病原体、病原体の一部、タンパク質、ハプテン
又は抗原に関する試験対象の健康状態を評価すること が可能である。

この方法は一般に、ヒト及び動物の体液中に存在する
タンパク質を診断するために適用可能である。このよう
な体液は血清、血液、血液細胞、尿、胸部乳及び唾液で
あることができる。

本発明による方法は特に、 ・撲滅（eradication）プログラムに、 ・自然免疫と修飾ワクチンの結果としての免疫との相違
の実証に、 ・病原体の存在又は病原体に対する免疫反応の発生に関
する、例えば飼育場動物のような、カンパニー集団を含
めた集団の予防検査に 適用可能である。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/561 G01N 27/447

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試験対象において免疫反応を惹起する少な
   くとも１種のハプテン、１種の高分子、１種の病原体又
   はその一部の可能な存在を検出する、及び／又は、免疫
   反応を惹起する少なくとも１種のハプテン、１種の高分
   子、１種の病原体又はその一部に対する免疫反応を検出
   する方法であって、 （ａ）試験すべき試験対象の液体サンプルを採取するか
   又は用意し、 （ｂ）サンプルをストック溶液と共にインキュベート
   し、ここで該ストック溶液が、試験すべき病原体、試験
   すべき病原体の一部、試験すべき高分子、若しくは試験
   すべきハプテンの少なくとも１種の特徴的な抗原を含む
   か、又は 該ストック溶液が、試験すべき病原体、試験すべき病原
   体の一部、試験すべき高分子、若しくは試験すべきハプ
   テンに対して特異的である少なくとも１種の抗体を含む
   ものであり、 （ｃ）インキュベーション後に、インキュベートした混
   合物を非変性条件下での電気泳動に適した基体に供給
   し、 （ｄ）工程（ｂ）で用いた同じストック溶液を基準とし
   て同じ基体に供給し、 （ｅ）工程（ｃ）の混合物と工程（ｄ）のストック溶液
   とを電気泳動させ、インキュベーション混合物とストッ
   ク溶液との成分を分離し、 （ｆ）インキュベーション混合物とストック溶液との成
   分を上記工程の１つにおいて検出可能にし、 （ｇ）インキュベーション混合物とストック溶液との電
   気泳動後に得られたシグナルパターンを比較し、これに
   より、免疫複合体の形成によるインキュベーション混合
   物とストック溶液との間のシグナルパターンの差が、上
   記ハプテン、高分子、病原体若しくはその一部の存在を
   指し示すものであるか、及び／又は上記ハプテン、高分
   子、病原体若しくはその一部に対する免疫反応の存在を
   指し示すものである、上記方法。
2. 【請求項２】工程（ｂ）のストック溶液の各特徴的な抗
   原又は特異的な抗体に標識剤を提供する請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】工程（ｅ）においてネイティブPAGEを実施
   する請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】工程（ｅ）においてIEFを実施する請求項
   １又は２に記載の方法。
5. 【請求項５】ストック溶液が少なくとも病原体自体を含
   む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 【請求項６】少なくとも１種の病原体の存在又は少なく
   とも１種の病原体による汚染及び／又は感染を検査する
   ための請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法の使用
   方法であって、電気泳動後の基準のシグナルパターンと
   比較した、インキュベーション混合物のシグナルパター
   ンの少なくとも１つのシグナルの置換及び／又は消失の
   検出、特にゲル中の免疫複合体の存在及び／又は供給部
   位における免疫複合体の存在によるゲル中のバンド若し
   くはピークパターンの少なくとも１つのバンド若しくは
   ピークの置換及び／又は消失、及び／又は１つ以上のバ
   ンド若しくはストリップの出現の検出が、使用した病原
   体による汚染を実証する上記使用方法。
7. 【請求項７】少なくとも１種のハプテン又は抗原に対す
   るアレルギーを検査するための請求項１〜４のいずれか
   一項に記載の方法の使用方法であって、電気泳動後の基
   準のシグナルパターンと比較した、インキュベーション
   混合物のシグナルパターンの少なくとも１つのシグナル
   の置換の検出、特に、ゲル中の免疫複合体の存在及び／
   又は供給部位における免疫複合体の存在によるゲル中の
   バンド若しくはピークパターンの少なくとも１つのバン
   ド若しくはピークの置換及び／又は消失、及び／又は１
   つ以上のバンド若しくはストリップの出現の検出が、使
   用したハプテン又はアレルゲンに対するアレルギーを実
   証する上記使用方法。
8. 【請求項８】野生型病原体による感染と修飾ワクチンに
   よる免疫感作とを識別するための請求項１〜５の１つ以
   上に記載の方法の使用方法であって、野生型病原体によ
   る感染に特徴的な全てのタンパク質の、シグナルパター
   ン（例えば、バンド）のシグナルの置換及び／又は消失
   と、ゲル中又は供給部位中の免疫複合体の同時出現と
   が、野生型病原体による感染が生じていることを実証
   し、形成された免疫複合体における、免疫反応に特徴的
   な少なくとも１種の抗原の存在及び／又は免疫反応に特
   徴的な少なくとも１種の抗原の不存在が、病原体の免疫
   反応に特徴的な少なくとも１種の抗原に対して抗体が形
   成されていないことを実証し、このことが試験対象が野
   生型病原体によって感染されていないが、修飾ワクチン
   との接触後に免疫反応を示したことを実証する上記使用
   方法。
9. 【請求項９】前記シグナルパターンがバンドである請求
   項８記載の使用方法。