JP3360557B2

JP3360557B2 - 融合ｄｎａ配列、融合蛋白質及び該蛋白質を発現させる方法

Info

Publication number: JP3360557B2
Application number: JP35673996A
Authority: JP
Inventors: 英一上野; 信之藤井; 政久岡田
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 2002-12-24
Anticipated expiration: 2016-12-27
Also published as: JPH09234071A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、融合蛋白質の発現
に関するものである。更に詳しくは、耐熱性蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を含む融合ＤＮＡ配列、該融合ＤＮ
Ａ配列により発現される融合蛋白質及び該融合蛋白質を
発現させる方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子工学の進歩は、これまで天然物か
ら精製していた蛋白質を遺伝子レベルで解析し、目的蛋
白質を人工的に増幅させることを可能にした（Itakura
et.al,Science, 198 1056 (1977））。その後発明され
たチオレドキシン（以下本明細書中ではＴＲＸと記載す
る）（特表平５−５０７２０９）や、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（以下本明細書中ではＧＳＴと記
載する）（特表平１−５０３４４１）等を融合させたＤ
ＮＡ配列の応用によって、本来発現しにくいような蛋白
質をも発現させることができるようになり、融合蛋白質
を発現させる技術は広く用いられるようになった。

【０００３】しかしながら、ＴＲＸやＧＳＴは様々な発
現しにくい蛋白質の融合発現に応用できるものの、本
来、可溶性の融合蛋白質を発現させる目的であったＧＳ
Ｔにおいても融合する蛋白質によっては融合蛋白質が不
溶性になり生産性が落ちてしまったり、ＴＲＸを融合さ
せた融合蛋白質は非特異反応が生じやすい等の問題が出
ることがあり、更に操作性や生産性に優れた融合蛋白質
の提供が望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、目的とする蛋白質またはペプチドを発現させるため
に操作性や生産性に優れた新たな融合ＤＮＡ配列、該融
合ＤＮＡ配列から発現される融合蛋白質及び該融合ＤＮ
Ａ配列を用いた融合蛋白質の発現方法を提供することで
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく鋭意研究した結果、選択された蛋白質ま
たはペプチドをコードするＤＮＡ配列と耐熱性蛋白質を
コードするＤＮＡ配列とを直接または間接に融合し、該
融合ＤＮＡ配列から融合蛋白質を発現させると、目的蛋
白質またはペプチドの生産性が上がり、該融合蛋白質は
熱耐性を得て精製操作が簡便になることを見い出して、
本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、耐熱性蛋白質または
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む融合ＤＮＡ配
列、該融合ＤＮＡ配列が発現する融合蛋白質及び該ＤＮ
Ａ配列を用いた融合蛋白質の発現方法に関するものであ
る。

【０００７】本発明の融合蛋白質は、可溶性が高く、耐
熱性蛋白質遺伝子由来の耐熱性をも維持し得る。融合蛋
白質のこのような特性により、融合蛋白質を精製する場
合に、熱処理により簡便に不要物質を除去することがで
き、融合蛋白質を収量よく得ることができるのである。

【０００８】また、融合蛋白質として広く用いられてい
る大腸菌由来のＴＲＸや日本住血吸虫由来のＧＳＴで
は、大腸菌や日本住血吸虫が哺乳類やその他の生物体内
で生息し得るため、ＴＲＸやＧＳＴを用いた融合蛋白質
を免疫反応の抗原として用いるような場合には、大腸菌
や日本住血吸虫に起因する非特異反応を生じることがあ
った。これに対し、本発明の融合蛋白質は哺乳類やその
他の生物の生体内では生息し得ない好熱菌由来の耐熱性
蛋白質を用いているため、本発明の融合蛋白質を免疫反
応の抗原として用いる場合等にも、融合蛋白質由来の非
特異反応が生じにくいのが大きな特徴である。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】本発明の耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡ
配列は、摂氏５５℃以上、好ましくは摂氏７５℃以上で
も熱変性しない蛋白質をコードするＤＮＡ配列を意味す
る。熱変性の具体的な現象としては、蛋白質の失活、不
溶化等を挙げることができる。摂氏５５℃以上で熱変性
しない蛋白質をコードするＤＮＡ配列としては、例え
ば、摂氏５５℃以上で生息できる好熱菌の有するＤＮＡ
配列を挙げることができる。発現される蛋白質の性状あ
るいは後処理のしやすさから、摂氏７５℃以上で生息で
きるいわゆる高度好熱菌の有するＤＮＡ配列の使用が好
ましい。高度好熱菌としては、例えば、サーモフィラ
ス、サルフォロボス、フィロコッカス、サーモトガ、フ
ィロバクラム、フィロディクチウム、サーモコッカス、
サーモディスカス、メタノサーマス、メタノコッカス
（FEMS. MICRO. BIOL. REV., Vol.75, p117-124, (199
0) 、ANU. REV. MICROBIOL., Vol.47, p627-658, (199
3) ）等を挙げることが出来る。また、耐熱性蛋白質と
しては、例えば、サルファロボス菌由来アデニレートキ
ナーゼ（Sulfolobus acidocaldalius 由来Adenylate Ki
nase: Arch. Biochem. Biophys., Vol.307, p405-410,
(1993) ）（以下本明細書中ではＡＫと記載する）、サ
ーモフィラス菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、フィロコッカ
スフリオシス菌由来フェレドキシン（Pyrococcus furio
sus 由来Ferredoxin :Biochemistry, Vol.31, p1192-11
96, (1992) ）（以下本明細書中ではＦＤＸと記載す
る）、フィロコッカスフリオシス菌由来グルコシダーゼ
（Pyrococcus furiosus 由来Glucosidase ）、フィロコ
ッカスフリオシス菌由来ルブレドキシン（Pyrococcus f
uriosus 由来Rubredoxin : Biochemistry, Vol.30, p10
885-10895,(1991) ）、フィロコッカスフリオシス菌由
来グルタミン酸脱水素酵素（Pyrococcus furiosus 由来
Glutamate dehydrogenase : Gene, Vol.132, p189-197,
(1988) ）、メタノサーマスフェリビダス菌由来グリセ
ルアルデヒドリン酸脱水素酵素（Metanothermus fervid
us由来 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase: G
ene, Vol.64, p189-197, (1988) ）、メタノコッカス
ボレイト菌由来グルタミン酸合成酵素（Metanococcus v
olate 由来Glutamate synthetase : Res. Microbiol.,
Vol.140, P355-371, (1989) ）、サーモトガマリティナ
菌由来L-乳酸脱水素酵素（Thermotoga maritina 由来L-
lactate dehydrogenase : Eur. J. Biochem., Vol.216,
p709-715, (1993) ）、サーモコッカスセレール菌由来
エロンゲーションファクター（Thermococcus celer由来
Elongation Factor 1-alpha : Nucleic acid res., Vo
l.18, p3989, (1990) ）等を挙げることができるが、
本発明のＤＮＡ配列がコードしている耐熱性蛋白質はこ
れらに限定されるものではない。本発明の耐熱性蛋白質
をコードするＤＮＡは、これら高度好熱菌から精製する
こともできるが、既知のＤＮＡ配列を基に合成すること
もできる。耐熱性蛋白質のＤＮＡ合成には、β−シアノ
エチルフォスフォアミダイト法（Sinha et.al, Nucleic
Acids Bos., 12, 4539, (1984)）、Letsinger. R. L e
t. al, J. Am. Chem. Soc., 88 5319 (1966) に記載の
方法等の公知の技術を適宜用いることができる。本発明
の一実施態様である実施例では、配列表１及び３に示す
アミノ酸配列を有するフィロコッカス菌由来ＦＤＸ及び
サルファロボス菌由来ＡＫのＤＮＡをβ−シアノエチル
フォスフォアミダイト法で合成した。合成したＤＮＡ配
列を配列表２及び４に示す。

【００１１】本発明の選択された目的蛋白質またはペプ
チドをコードするＤＮＡ配列は、特定のＤＮＡ配列に限
定されるものではない。融合蛋白質として発現させよう
と所望する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配
列であれば、いずれのＤＮＡ配列をも用いることができ
る。選択された目的蛋白質またはペプチドをコードする
ＤＮＡそれ自体では必要な発現量が得にくいような蛋白
質またはペプチドを発現させる場合には、本発明が特に
有用である。

【００１２】本発明の融合ＤＮＡ配列は、ライゲーショ
ン法、リンカーライゲーション法等の既知の方法を用い
て融合することができる。融合に当たっては、選択され
た目的蛋白質またはペプチドのＤＮＡ配列の５’末端と
耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列の３’末端とを直接融合させ
ても、必要に応じて間接融合させてもよい。間接融合さ
せる場合には、目的蛋白質またはペプチドをコードする
ＤＮＡ配列の５’末端と耐熱性蛋白質またはペプチドを
コードするＤＮＡ配列の３’末端との間にリンカー配列
を挿入する。該リンカー配列としては、目的蛋白質また
はペプチドと耐熱性蛋白質とを相互に結合させるための
ポリペプチドをコードする配列の他、公知の化学的方
法、酵素的方法等により、選択的に開裂または消化でき
るポリペプチドをコードする配列を用いることができ
る。目的蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列
と耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡ配列との間にリンカ
ー配列を挿入した場合は、融合蛋白質を発現させた後、
ブロムシアン等の化学的方法や、トロンビン、ファクタ
ーＸａ等の酵素的方法等でリンカー配列を開裂または消
化し、選択された目的蛋白質またはペプチド部分だけを
精製することもできる。

【００１３】本発明の融合蛋白質を発現させるには、通
常の遺伝子工学技術を用いることができる。例えば、本
発明の融合ＤＮＡ配列を発現に適したベクターに挿入
し、該ベクターを培養宿主に導入し、融合蛋白質の発現
を誘導する。宿主を培養等により増やした後、宿主破
砕、カラム操作等の精製手段を経て、目的の融合蛋白質
またはペプチドを入手する。用いる宿主細胞は、異種蛋
白質またはペプチドを発現させることができる細胞であ
れば、細菌細胞、真核生物細胞、哺乳類細胞等いずれの
細胞であってもよく、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、
バキュロウイルス、ＣＯＳ細胞等を挙げることができ
る。

【００１４】本発明の融合蛋白質は、融合蛋白質として
そのまま用いることも、目的蛋白質またはペプチド部分
を分離精製して用いることもできる。

【００１５】

【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。

【００１６】実施例１ＦＤＸ発現ベクターｐＷＦ６Ａ
の作製フィロコッカスフリオシス菌由来ＦＤＸの既知のＤＮＡ
配列をもとにＤＮＡ合成装置（モデル３９２、パーキン
エルマー社製）を用いて作製した５３ｍｅｒのプライマ
ーを８個使用し、アセンブルＰＣＲ法により、フィロコ
ッカスフリオシス菌由来ＦＤＸの遺伝子を合成した。ア
センブルＰＣＲ法にはＴａｑポリメラーゼ（東洋紡社
製）を使用し、９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−
１分、３０サイクルの条件で、総塩基数２４８ｂｐを増
幅した。５’末に制限酵素ＮｄｅＩ部位を、３’末に制
限酵素ＥｃｏＲＩ部位を、Ｃ末にはトロンビン切断部位
を付加した。この断片をｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社
製）とｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシアバイオテック社
製）より作製した４．６ＫｂのｐＷ６ＡベクターのＮｄ
ｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に組込み、ＦＤＸを発現するベク
ターとしてｐＷＦ６Ａを作製した。ｐＷ６Ａの詳細図を
図１に、ｐＷＦ６Ａの詳細図を図２に示す。ｐＷＦ６Ａ
はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位に、ＦＤＸ由来の６７ア
ミノ酸、トロンビン開裂部位由来の１０アミノ酸及びｐ
Ｗ６Ａマルチクローニングサイト由来の１９アミノ酸を
含む９６アミノ酸からなる融合蛋白質の遺伝子を含んで
いる。挿入断片はＤＮＡシーケンスキット（シーケナー
ゼキットVer.2.0 、アマーシャムユナイテッドステイ
ツバイオケミカル社製）によりＤＮＡ配列を確認し
た。ｐＷ６Ａに挿入したＦＤＸのＤＮＡ配列及び該配列
がコードするアミノ酸配列を、配列表１及び２に、ｐＷ
６ＡのＤＮＡ配列を配列表５に示す。配列表には、制限
酵素部位ＮｄｅＩのＡＴＧを１番として、マルチクロー
ニングサイトのストップコドンの前までの配列を示し
た。ｐＷＦ６Ａを宿主大腸菌に導入後、１％バクトトリ
プトン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナ
トリウム、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．５培
地（以下本明細書中ではＬＢ培地と記す）で２時間培養
後、１ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（以下
本明細書中ではＩＰＴＧと記す）を添加し２時間培養し
て、発現を誘導した。大腸菌の沈渣に１０ｍＭトリス−
塩酸ｐＨ７．５、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以
下本明細書中ではＥＤＴＡと記載する）（以下この緩衝
液を本明細書中ではＴＥ緩衝液と記載する）を加え超音
波破砕し、レムリー法による１５％ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下本明細書中
ではＳＤＳ−ＰＡＧＥと記載する）を行った。クマシー
ブリリアントブルー染色（以下本明細書中ではＣＢＢ染
色と記す）で約２２Ｋｄａ付近にバンドを確認し、二量
体を形成したフィロコッカスフリオシスのＦＤＸと認め
た。

【００１７】実施例２ＦＤＸの精製実施例１で作製したｐＷＦ６Ａを宿主大腸菌に導入後、
ＬＢ培地３７℃の条件下で培養した。培養液の大腸菌濃
度を予備培養にて波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁
度とした後、１ｍＭＩＰＴＧを添加し発現誘導を行っ
た。３時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収
した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０
（以下本明細書中ではトリス緩衝液と記載する）を２０
０ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現し
た融合蛋白質は、遠心後可溶性成分として上清に回収さ
れた。この上清について８５℃１５分間熱処理を行った
ところ、約８０％の大腸菌蛋白は熱変性沈殿し、熱処理
後の遠心上清に９０％以上のＦＤＸを回収した。

【００１８】この上清を、トリス緩衝液で平衡化したＱ
ＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシアバイオテック社
製）でイオン交換精製した。塩化ナトリウムを含むカラ
ム平衡緩衝液で溶出したところ、約０．３Ｍ塩化ナトリ
ウム濃度溶出画分にＦＤＸを回収した。次いでこのＦＤ
Ｘ画分を、２０ｍＭ水酸化ナトリウムで平衡化したリソ
ースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオテック社
製）で精製した。アセトニトリルで溶出したところ、約
１０％アセトニトリル溶出画分に精製ＦＤＸを回収し
た。

【００１９】参考例１ＴＲＸの精製実施例１で作製したｐＷＦ６Ａ同様にＴＲＸを発現する
ベクターとして作製したｐＷＴ８Ａを宿主大腸菌に導入
後、ＬＢ培地３７℃の条件下で培養した。実施例１と同
様の発現誘導を行った後、遠心で大腸菌を回収した。回
収した大腸菌にオスモテックショックを与え、ペリプラ
ズム画分にあるＴＲＸを抽出した。抽出ＴＲＸは２０ｍ
Ｍ水酸化ナトリウムで平衡化したリソースＲＰＣ逆相カ
ラム（ファルマシアバイオテック社製）で一回目の精製
を行った。アセトニトリルで溶出したところ、約１０％
〜２０％アセトニトリル溶出画分にＴＲＸを回収した。
回収したＴＲＸを４Ｍグアニジン塩酸に透析後、同条件
下での逆相カラムで二回目の精製を行った。一回目同
様、約１０％〜２０％アセトニトリル溶出画分に精製Ｔ
ＲＸを回収した。

【００２０】実施例３ウエスタンブロット法によるＦ
ＤＸとＴＲＸの特異性試験非特異反応物質として抗大腸菌抗体を想定し、実施例２
で精製したＦＤＸと参考例１で精製したＴＲＸの反応性
を調べた。

【００２１】大腸菌ＤＨ５αのＳＤＳ可溶化物、超音波
破砕物上清及びｐＷ５０ベクター（自家製）導入大腸菌
のＳＤＳ可溶化物を免疫源として、それぞれウサギ３羽
づつ計９種の抗大腸菌ウサギ血清を作製した。実施例２
で精製したＦＤＸと参考例１で精製したＴＲＸをレムリ
ー法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後ニトロセルロー
ス膜に転写した。ニトロセルロース膜上の残っている蛋
白吸着部分を１％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキ
ングした後、これに１次抗体としてそれぞれ５００倍希
釈した上記の抗大腸菌ウサギ血清９種を、２次抗体とし
てペルオキシダーゼ（以下本明細書中ではＰＯＤと記載
する）標識抗ウサギ抗体を用いて、ウエスタンブロット
法を行った。発色には４−クロロ−１−ナフトール及び
過酸化水素を用いた。ＦＤＸ分子量相当部分に抗大腸菌
ウサギ抗体と反応するバンドは確認されなかったが、Ｔ
ＲＸ分子量相当部分では、抗大腸菌ウサギ血清９種中、
大腸菌ＤＨ５αの超音波破砕物上清及びｐＷ５０ベクタ
ー導入大腸菌のＳＤＳ可溶化物を免疫源とした６種が反
応した。

【００２２】上記と同様に、１次抗体としてヒト検体Ｈ
ＴＬＶ−Ｉ／ＩＩミックスパネル２０４血清（ボストン
バイオメデイカ社製）２５例をそれぞれ５０倍希釈
し、２次抗体としてＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧを用い、ウ
エスタンブロット法を行った。ＦＤＸが転写された部位
での反応性は確認されなかったが、ＴＲＸが転写された
部位では２５例中２例の反応が確認された。結果を表１
に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】実施例４ヒト検体を用いたＥＬＩＳＡ法
によるＦＤＸとＴＲＸの特異性試験ＥＬＩＳＡプレ−ト（ベクトンデッキンソン社製）に
実施例２で精製したＦＤＸと参考例１で精製したＴＲＸ
を各々２５μｇ／ｍｌで５０μｌずつ感作した。

【００２５】ＥＬＩＳＡプレートのウエル上の残ってい
る蛋白吸着部分を１％スキムミルクを含むＰＢＳでブロ
ッキングした後、１次抗体として実施例３で使用したボ
ストンバイオメデイカ社製ヒト検体５００倍希釈物
を、２次抗体としてＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧを用いて、
ＥＬＩＳＡ法による特異性試験を行った。発色にはＡＢ
ＴＳ及び過酸化水素を用いた。測定結果は波長４０５ｎ
ｍと波長４９２ｎｍの吸光度の差で表示した（吸光度の
差は、Ａ４０５／４９２ｎｍと記載した）。検体との反
応において、ＦＤＸではブランクの２倍を越える検体は
なかったのに対し、ＴＲＸでは２５例中６例でブランク
の２倍を越える検体が確認された。フィロコッカスフリ
オシス由来のＦＤＸは大腸菌由来ＴＲＸと異なり、大腸
菌由来の非特異反応、交叉反応は認められなかった。結
果を図３に示す。

【００２６】実施例５ＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ１９
融合蛋白質及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９融合蛋
白質の発現ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩを発現している感染細
胞株から、MolecularCloning Ｊ.Sambrook 等の方法で
ゲノミックＤＮＡを抽出した。次にＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩ部位を付加したプライマーを用い実施例１と同様の
方法でＰＣＲ法を行って、それぞれのｇａｇ領域のｐ１
９ＤＮＡ断片約４００ｂｐを得、これらをｐＷＦ６Ａに
組み込み、ＨＴＬＶ−Ｉのｐ１９を発現するベクターと
してｐＷＦＩＰ１９を、ＨＴＬＶ−ＩＩのｐ１９を発現
するベクターとしてｐＷＦＩＩＰ１９を作製した。ベク
ターに挿入したＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ１９及びＦＤ
Ｘ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９のＤＮＡ配列を配列表６及
び８に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列
表７及び９に示す。これらのベクターを実施例１と同様
に大腸菌に導入し各融合蛋白質の発現を誘導した。実施
例１と同一条件で泳動用サンプルを調製し、レムリー法
による１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、１枚のゲルはＣ
ＢＢ染色、他の１枚は実施例３に示した方法でニトロセ
ルロース膜に転写した。一次抗体として、抗ネイティブ
ＨＴＬＶ−Ｉｐ１９モノクローナル抗体（ＧＩＮ−７抗
体、Tanaka,Y.et .al Gann., 74, 327-330,(1983) ）又
は抗ネイティブＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９モノクローナル抗
体を、二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用
い、実施例３と同様の方法で融合蛋白と反応させ４ーク
ロロー１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったと
ころ、各融合蛋白質に対応したモノクローナル抗体が反
応する融合蛋白質の発現が認められた。これらの融合蛋
白質はＣＢＢ染色ゲルと同位置約３４Ｋｄａ付近にバン
ドを生じた。ＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ１９及びＦＤＸ
融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９は、ＨＴＬＶ−Ｉのｐ１９及
びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ１９を直接発現させた場合と比較
すると、約数１００倍発現量が増加した。

【００２７】実施例６ＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０
Ｅ（ｇｐ２１）融合蛋白質及びＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０Ｅ
（ｇｐ２１）融合蛋白質の発現実施例５と同様の方法で、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−
ＩI 感染細胞のＤＮＡを用いＰＣＲ法により各々ｅｎｖ
領域のｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）ＤＮＡ断片約５００ｂｐを
得た。これらのＤＮＡ断片を実施例１で作製したｐＷＦ
６ＡのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位に組込み、ＨＴＬＶ
−Ｉのｐ２０Ｅを発現するベクターとしてｐＷＦＩＥ
１、ＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２０Ｅを発現するベクターとし
てｐＷＦＩＩＥ１０を作製した。ベクターに挿入したＦ
ＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０Ｅ及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ
−ＩＩｐ２０ＥのＤＮＡ配列を配列表１０及び１２に、
該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表１１及
び１３に示す。これらのベクターを大腸菌に導入し、実
施例１と同様の条件でＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０Ｅ
融合蛋白質（以下本明細書中ではＦＤＸ−２０（Ｉ）と
記載する）及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０Ｅ融合
蛋白質（以下本明細書中ではＦＤＸ−２０（ＩＩ）と記
載する）の発現を誘導した。実施例１と同様に大腸菌を
超音波破砕し、レムリー法による１２．５％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ後、１枚のゲルはＣＢＢ染色を行い、他の１枚の
ゲルは１２０ｍＡ、３時間でニトロセルロース膜に転写
した。ニトロセルロース膜上の残っている蛋白吸着部分
を１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキング後、ネ
イティブのＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２０Ｅ
（ｇｐ２１）に反応する抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノク
ローナル抗体（Ｆ−１０ Sugamura,K.et.al J.Immuno
l.,132,3180-3184(1984)）１μｇ／ｍｌと融合蛋白とを
室温で１時間反応させ、次いで、ＰＯＤ標識抗マウスＩ
ｇＧを室温で１時間反応させた。続いて、４ークロロー
１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったところ、
各融合蛋白質に対応して抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノク
ロナール抗体と反応する融合蛋白質の発現が認められ
た。これらの融合蛋白質は、ＣＢＢ染色ゲルと同位置の
約３２Ｋｄａ付近にバンドを生じた。

【００２８】ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（Ｉ
Ｉ）共に、ＨＴＬＶ−Ｉのｐ２０Ｅ及びＨＴＬＶ−ＩＩ
のｐ２０Ｅを直接発現させた場合と比較すると、発現量
が約数１００倍増加した。

【００２９】実施例７ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ
−２０（ＩＩ）融合蛋白質の精製実施例６で作製したｐＷＦＩＥ１とｐＷＦＩＩＥ１０を
各々宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地３７℃の条件下で培
養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養として波長６０
０ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭＩＰ
ＴＧを添加し発現誘導を行った。ＩＰＴＧ添加３時間
後、遠心を行い菌の回収を行った。回収した大腸菌に１
％トライトンＸ１００、２Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス
−塩酸ｐＨ８．０緩衝液２００ｍｌを加え、氷冷下で超
音波破砕処理を行った。遠心を行って不溶体（inclusio
n body）の回収を行った。４Ｍグアニジン塩酸１０ｍＭ
ジチオスレイトール（以下本明細書中ではＤＴＴと記
す）溶液で不溶体を可溶化した。２０％アセトニトリ
ル、２０ｍＭ水酸化ナトリウムで平衡化したリソースＲ
ＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオテック社製）にて
可溶化物を精製した。アセトニトリル溶出を行ったとこ
ろ、約３０−４０％アセトニトリル溶出画分にそれぞれ
精製ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）融合
蛋白質を回収した。

【００３０】参考例２ＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０
Ｅ融合蛋白質及びＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０Ｅ融
合蛋白質の精製参考例１で作製したＴＲＸ発現ベクターｐＷＴ８Ａに、
実施例６と同様にＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩのｅ
ｎｖ領域のｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）を導入しｐＷＴＩＥ１
とｐＷＴＩＩＥ１０を作製し発現を行った。実施例７と
同様にリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオ
テック社製）を用いた精製法によりＴＲＸ融合ＨＴＬＶ
−Ｉｐ２０Ｅ融合蛋白質（以下本明細書中ではＴＲＸ−
２０（Ｉ）と記載する）及びＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩ
ｐ２０Ｅ融合蛋白質（以下本明細書中ではＴＲＸ−２０
（ＩＩ）と記載する）を精製した。

【００３１】実施例８融合蛋白質の反応性試験（１）ウエスタンブロット法による試験実施例７で精製したＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２
０（ＩＩ）と、参考例２で精製したＴＲＸ−２０（Ｉ）
及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とを用い、ウエスタンブロッ
ト法におけるヒトＨＴＬＶ検体との反応性を比較した。

【００３２】１次抗体としてボストンバイオメデイカ
社製ヒト検体ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩミックスパネルの５０
倍稀釈物を、２次抗体としてＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧを
用いて、実施例３と同様にウエスタンブロット法を行っ
た。ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）とＴ
ＲＸ−２０（Ｉ）及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とは同様の
検体と反応した。結果を表２に示す。

【００３３】

【表２】

【００３４】（２）ＥＬＩＳＡ法による比較実施例７で精製したＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２
０（ＩＩ）と、参考例２で精製したＴＲＸ−２０（Ｉ）
及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とをそれぞれ３μｇ／ｍｌの
濃度で、ＥＬＩＳＡプレート（ベクトンデッキンソン
社製）に５０μｌずつ感作した。

【００３５】このＥＬＩＳＡプレートを用い、実施例４
と同様に１次抗体として５００倍希釈したボストンバ
イオメデイカ社製ヒト検体を、２次抗体としてＰＯＤ標
識抗ヒトＩｇＧを用いてＥＬＩＳＡ法を行った。ＦＤＸ
−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）と、ＴＲＸ−２
０（Ｉ）及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とは同様の検体と反
応した。結果を図４、５に示す。

【００３６】（３）ＥＬＩＳＡ法による濃度依存性試験抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノクローナル抗体及び陰性血
清に対する反応性試験を調べるために、実施例７で精製
したＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）と、
参考例２で精製したＴＲＸ−２０（Ｉ）及びＴＲＸ−２
０（ＩＩ）とを、をそれぞれ１０μｇ／ｍｌから１／２
稀釈系列を作製して、ＥＬＩＳＡプレート（ベクトン
デッキンソン社製）に５０μｌずつ感作した。

【００３７】このＥＬＩＳＡプレートを用い、１次抗体
として５００倍希釈した抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノク
ローナル抗体を、２次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩ
ｇＧを用いてＥＬＩＳＡ法を行った。陰性血清は、実施
例４と同様の方法でＥＬＩＳＡ法を行った。モノクロー
ナル抗体との反応性に差はなく、陰性血清との反応性
は、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ共にＦＤＸとの融
合蛋白質の方が低かった。結果を図６、７に示す。

【００３８】参考例３ＧＳＴと梅毒トレポネマ１５Ｋ
ｄａ抗原との融合蛋白質の作製梅毒菌継代ウサギ睾丸から精製した梅毒菌（トレポネー
マパリダムニコルス株）から、ゲノミックＤＮＡを抽出
した。これを鋳型として、既知のＤＮＡ配列をもとに、
ＤＮＡ合成機（モデル３９２、パーキンエルマー社製）
を用いてプライマーを作製した。このプライマーを用い
て、サーマルサイクラー（モデルＰＪ１０００、パーキ
ンエルマー社製）で、梅毒トレポネマ（以下本明細書中
ではＴｐと記載する）の１５Ｋｄａの表面抗原（以下本
明細書中ではＴｐ１５と記載する）をコードするＤＮＡ
断片約３７０ｂｐを増幅した。このＤＮＡ断片を、ｐＷ
６ＡにＧＳＴのＤＮＡ配列を挿入したＧＳＴ発現型ベク
ターｐＷＧ６ＡのＥｃｏＲＩ部位に組込み、ＧＳＴとＴ
ｐ１５との融合蛋白質（以下本明細書中ではＧＳＴ−１
５と記載する）を発現するベクターｐＷＧＴｐ１５を得
た。ベクターに挿入したＧＳＴ−１５のＤＮＡ配列を配
列表１４に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を
配列表１５に示す。これを実施例１と同様に大腸菌に導
入しＧＳＴ−１５の発現を誘導した。実施例１と同条件
で電気泳動用サンプルを調製し、レムリー法による１
２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、１枚のゲルはＣＢＢ染
色、他の１枚は実施例３に示した方法でニトロセルロー
ス膜に転写した。一次抗体として抗Ｔｐ１５モノクロナ
ール抗体を、二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ
を用いて実施例３と同様の方法で反応させ４ークロロー
１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったところ、
ＣＢＢ染色ゲルと同位置約４２Ｋｄａ付近にバンドを生
じた。

【００３９】参考例４ＴＲＸとＴｐ１５との融合蛋白
質の作製参考例３で増幅したＴｐ１５のＤＮＡ断片を、ｐＷ６Ａ
にＴＲＸのＤＮＡ配列を挿入したＴＲＸ発現型ベクター
ｐＷＴ８ＡのＥｃｏＲＩ部位に組込み、ＴＲＸとＴｐ１
５との融合蛋白質（以下本明細書中ではＴＲＸ−１５と
記載する）を発現するベクターｐＷＴＴｐ１５を得た。
ベクターに挿入したＴＲＸ−１５のＤＮＡ配列を配列表
１６に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列
表１７に示す。これを実施例１と同様に大腸菌に導入し
ＴＲＸ−１５の発現を誘導した。実施例１と同条件で電
気泳動用サンプルを調製し、レムリー法による１２．５
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、1 枚のゲルはＣＢＢ染色、他の
１枚は実施例３に示した方法でニトロセルロース膜に転
写した。一次抗体として抗Ｔｐ１５モノクロナール抗体
を、二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用い実
施例３と同様の方法で反応させ４ークロロー１ーナフト
ール及び過酸化水素で発色を行ったところ、ＣＢＢ染色
ゲルと同位置約２７Ｋｄａ付近にバンドを生じた。

【００４０】実施例９ＦＤＸとＴｐ１５との融合蛋白
質の作製参考例３で増幅したＴｐ１５のＤＮＡ断片を、実施例１
で作製したＦＤＸ発現型ベクターｐＷＦ６ＡのＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩ部位に組込み、ＦＤＸとＴｐ１５との融
合蛋白質（以下本明細書中ではＦＤＸ−１５と記載す
る）を発現するベクターｐＷＦＴｐ１５を得た。ベクタ
ーに挿入したＦＤＸ−１５のＤＮＡ配列を配列表１８
に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表１
９に示す。これを実施例１と同様に大腸菌に導入しＦＤ
Ｘ−１５の発現を誘導した。実施例１と同条件で電気泳
動用サンプルを調製し、レムリー法による１２．５％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後、1 枚のゲルはＣＢＢ染色、他の１枚
は実施例３に示した方法でニトロセルロース膜に転写し
た。一次抗体として抗Ｔｐ１５モノクロナール抗体を、
二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用い実施例
３と同様の方法で反応させ４ークロロー１ーナフトール
及び過酸化水素で発色を行ったところ、ＣＢＢ染色ゲル
と同位置約３０Ｋｄａ付近にバンドを生じた。

【００４１】実施例１０ＦＤＸ−１５、ＧＳＴ−１５
及びＴＲＸ−１５の耐熱試験実施例９、参考例３及び参考例４で作製したＦＤＸ−１
５、ＧＳＴ−１５及びＴＲＸ−１５を発現するベクター
を宿主大腸菌に導入後、それぞれＬＢ培地１リッター３
７℃の条件下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培
養として波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした
後、１ｍＭＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。遠心
により菌体の回収を行った後、菌体にトリス緩衝液２０
０ｍｌを加え、氷冷下で超音波破砕処理後、遠心上清に
それぞれ融合蛋白質を回収した。これを各々８００μｌ
ずつ取り、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び８０℃
の恒温槽にて１３分間振盪した。それぞれのサンプルを
遠心後、上清と沈殿に分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウ
ェスタンブロット法にて分析した。ウェスタンブロット
法のブロッキング剤として１％スキムミルク、一次抗体
には抗ＴＰウサギ抗体を用いた。二次抗体にＰＯＤ標識
抗ウサギ抗体、発色剤に４ークロロー１ーナフトール及
び過酸化水素を用いた。ウェスタンブロットの発色結果
はデンシトメーターにより確認した。結果を図８、９に
示す。ＴＲＸ−１５及びＧＳＴ−１５は４０℃で熱変性
により一部沈殿を生じ、６０℃で約８０％、７０℃で約
１００％が沈殿した。ＦＤＸ−１５は４０℃〜８０℃で
はほとんど熱変性による沈殿を生じることがなく、８０
℃でもほぼ１００％が上清に存在した。

【００４２】実施例１１ＦＤＸ−１５の熱処理による
精製実施例９で作製したｐＷＦＴｐ１５を宿主大腸菌に導入
後、ＬＢ培地１リッター３７℃の条件下で培養した。培
養液の大腸菌濃度を予備培養として波長６００ｎｍで吸
光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭＩＰＴＧを添加
し発現誘導を行った。遠心により菌体の回収を行った。
菌体にトリス緩衝液２００ｍｌを加え、超音波破砕処理
により菌体を破砕し、遠心上清にＦＤＸ−１５を回収し
た。次いで、ホットプレート及び恒温槽を用いて７０℃
１０分間の熱処理を行い、遠心上清にＦＤＸ−１５を回
収した。トリス緩衝液で平衡化したＱＦＦ陰イオン交換
カラム（ファルマシアバイオテック社製）で熱処理上清
を精製した。塩化ナトリウムを含むカラム平衡緩衝液に
よる溶出を行ったところ、約０．３Ｍ〜０．４Ｍ塩化ナ
トリウム濃度溶出画分にＦＤＸ−１５を回収した。次い
でＱＦＦ回収画分に１０ｍＭＤＴＴを加え、２０ｍＭ
水酸化ナトリウム溶液で平衡化したリソースＲＰＣ逆相
カラム（ファルマシアバイオテック社製）で精製した。
アセトニトリルにより溶出を行ったところ、約２０％〜
２５％アセトニトリル溶出画分にＦＤＸ−１５を回収し
た。この逆相回収画分をセントリプレップ（アミコン社
製）にて濃縮し、スーパーデックス２００カラム（ファ
ルマシアバイオテック社製）にてゲルろ過した。６Ｍ尿
素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス−塩酸ｐ
Ｈ８．０緩衝液により溶出したところ、分子量約５万付
近に精製ＦＤＸ−１５を回収した。６０℃の熱処理で大
腸菌蛋白の約８０％は熱変性により沈殿し、ＦＤＸ−１
５は７０℃でもほぼ１００％が上清に回収され、熱処理
のみにより約５倍精製度が上昇した。

【００４３】また、参考例３で作製したｐＷＧＴｐ１５
を宿主大腸菌に導入後、同様に誘導、発現操作を行い熱
処理を行わず通常のカラム操作により精製したＧＳＴ−
１５と熱処理により精製ＦＤＸ−１５とを抗Ｔｐウサギ
抗体を用いて実施例１０と同様にウエスタンブロット法
を行った。熱処理精製したにもかかわらずＦＤＸ−１５
は反応性を保持していることが示された。結果を図１０
に示す。

【００４４】実施例１２ＡＫ発現ベクターｐＷ６ＡＫ
の作製サルファロボス菌由来ＡＫの既知のＤＮＡ配列をもとに
ＤＮＡ合成装置（パーキンエルマー社製）を用いて作製
した５３ｍｅｒのプライマーを１６個使用し、アセンブ
ルＰＣＲ法により、サルファロボスアシドカルダリウス
ＡＫの遺伝子を合成した。アセンブルＰＣＲ法にはＴａ
ｑポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用し、９４℃−１
分、５５℃−１分、７２℃−１分、３０サイクルの条件
で、総塩基数６３０ｂｐを増幅した。５’末に制限酵素
ＮｄｅＩ部位を、３’末に制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を、
Ｃ末にはトロンビン切断部位を付加した。この断片をｐ
ＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）とｐＧＥＸ−２Ｔ（フ
ァルマシアバイオテック社製）より作製した４．６Ｋｂ
のｐＷ６ＡベクターのＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に組込
み、ＡＫを発現するベクターとしてｐＷ６ＡＫを作製し
た。ｐＷ６ＡＫの詳細図を図１１に示す。ｐＷ６ＡＫは
ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位に、ＡＫ由来の１９４アミ
ノ酸、トロンビン開裂部位由来の１０アミノ酸及びｐＷ
６Ａマルチクローニングサイト由来の１９アミノ酸を含
む２２３アミノ酸からなる融合蛋白質の遺伝子を含んで
いる。挿入断片はＤＮＡシーケンスキット（シーケナー
ゼキットVer.2.0 、アマーシャムユナイテッドステ
イツバイオケミカル社製）によりＤＮＡ配列を確認し
た。ｐＷ６Ａに挿入したＡＫのＤＮＡ配列を配列表３
に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表４
に示す。宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地で２時間培養
後、１ｍＭＩＰＴＧを添加し２時間培養して、発現を誘
導した。大腸菌の沈渣にＴＥ緩衝液を加え超音波破砕
し、レムリー法による１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っ
た。ＣＢＢ染色で約４０Ｋｄａ付近にバンドを確認し
た。

【００４５】実施例１３ＡＫの精製実施例１２で作製したｐＷ６ＡＫを宿主大腸菌に導入
後、ＬＢ培地３７℃の条件下で培養した。培養液の大腸
菌濃度を予備培養にて波長６００ｎｍで吸光度約１．０
の濁度とした後、１ｍＭＩＰＴＧを添加し発現誘導を
行った。３時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。
回収した大腸菌にトリス緩衝液を２００ｍｌ加え、氷冷
下で超音波破砕処理を行った。発現した融合蛋白質は、
遠心後可溶性成分として上清に回収された。この上清に
ついて６５℃１０分間熱処理を行ったところ、約７０％
の大腸菌蛋白は熱変性沈殿し、熱処理後の遠心上清に８
０％以上のＡＫを回収した。

【００４６】この上清を、トリス緩衝液で平衡化したハ
イドロキシアパタイトカラム（バイオラド社製）で精製
した。リン酸ナトリウム緩衝液で溶出したところ、約
０．２Ｍリン酸ナトリウム濃度溶出画分にＡＫを回収し
た。次いでこのＡＫ画分を、６Ｍ尿素０．５Ｍ塩化ナト
リウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．４で平衡化
したスーパーデックス２００２６／６０カラムでゲル
ろ過精製した。分子量約２万の画分に精製ＡＫを回収し
た。

【００４７】実施例１４ＡＫとＴｐ１５との融合蛋白
質の作製参考例３で増幅したＴｐ１５のＤＮＡ断片を、実施例１
２で作製したＡＫ発現型ベクターｐＷ６ＡＫのＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩ部位に組込み、ＡＫとＴｐ１５との融合
蛋白質（以下本明細書中ではＡＫ−１５と記載する）を
発現するベクターｐＷ６ＡＫＴｐ１５を得た。ベクター
に挿入したＡＫ−１５のＤＮＡ配列を配列表２０に、該
ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表２１に示
す。これを実施例１と同様に大腸菌に導入しＡＫ−１５
の発現を誘導した。実施例１と同条件で電気泳動用サン
プルを調製し、レムリー法による１２．５％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ後、1 枚のゲルはＣＢＢ染色、他の１枚は実施例
３に示した方法でニトロセルロース膜に転写した。一次
抗体として抗Ｔｐ１５モノクロナール抗体を、二次抗体
としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用い実施例３と同様
の方法で反応させ４ークロロー１ーナフトール及び過酸
化水素で発色を行ったところ、ＣＢＢ染色ゲルと同位置
約４０Ｋｄａ付近にバンドを生じた。

【００４８】実施例１５ＡＫ−１５の熱処理による精
製実施例１４で作製したｐＷＡＫＴｐ１５を宿主大腸菌に
導入後、ＬＢ培地１リッター３７℃の条件下で培養し
た。培養液の大腸菌濃度を予備培養として波長６００ｎ
ｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭＩＰＴＧ
を添加し発現誘導を行った。遠心により菌体の回収を行
った。菌体に５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウムｐＨ
１０．０緩衝液２００ｍｌを加え、超音波破砕処理によ
り菌体を破砕し、遠心上清にＡＫ−１５を回収した。次
いで、ホットプレートを用いて６０℃１０分間の熱処理
を行い、遠心上清にＡＫ−１５を回収した。４Ｍ尿素５
０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に透析後、同緩
衝液で平衡化したＳＦＦ陽イオン交換カラム（ファルマ
シアバイオテック社製）で熱処理上清を精製した。塩化
ナトリウムを含む平衡化緩衝液による溶出を行ったとこ
ろ、約０．２Ｍ〜０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度溶出画分
にＡＫ−１５を回収した。回収したＡＫ−１５画分を、
６Ｍ尿素０．５Ｍ塩化ナトリウム２０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液ｐＨ９．４で平衡化したス−パ−デックス２００
２６／６０カラムでゲルろ過精製した。分子量約４万
の画分に精製ＡＫ−１５を回収した。

【００４９】実施例１１と同様に抗Ｔｐウサギ抗体を用
いてウエスタンブロットを行ったところ、熱処理したに
もかかわらずＡＫ−１５は反応性を保持していることが
示された。結果を図１２に示す。

【００５０】

【発明の効果】本発明により、従来の融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列よりも操作性や生産性に優れた融合Ｄ
ＮＡ配列、該融合ＤＮＡ配列から発現される融合蛋白質
及び該ＤＮＡ配列を用いた融合蛋白質の発現方法を提供
することができる。

【００５１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２９１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ ATGGCGTGGA AGGTTTCTGT CGACCAAGAC ACCTGTATAG GAGATGCCAT CTGTGCAAGC 30 60 CTCTGTCCAG ACGTCTTTGA GATGAACGAT GAAGGAAAGG CCCAACCAAA GGTAGAGGTT 90 120 ATTGAGGACG AAGAGCTCTA CAACTGTGCT AAGGAAGCTA TGGAGGCCTG TCCAGTTAGT 150 180 GCTATTACTA TTGAGGAGGC TGGTGGTTCT TCTCTGGTTC CGCGTGGATC GGAATTCGTC 210 240 GACCTCGAGG GATCCGGGCC CTCTAGATGC GGCCGCATGC ATGGTACCTA A 270

【００５２】配列番号：２配列の長さ：９６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Ala Trp Lys Val Ser Val Asp Gln Asp Thr Cys Ile Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ile Cys Ala Ser Leu Cys Pro Asp Val Phe Glu Met Asn Asp 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Gln Pro Lys Val Glu Val Ile Glu Asp Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Asn Cys Ala Lys Glu Ala Met Glu Ala Cys Pro Val Ser 50 55 60 Ala Ile Thr Ile Glu Glu Ala Gly Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg 65 70 75 Gly Ser Glu Phe Val Asp Leu Glu Gly Ser Gly Pro Ser Arg Cys 80 85 90 Gly Arg Met His Gly Thr 95

【００５３】配列番号：３配列の長さ：６７２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ ATGAAGATTG GTATTGTAAC TGGTATCCCT GGTGTAGGGA AAAGTACTGT CTTGGCTAAA 30 60 GTTAAAGAGA TATTGGATAA TCAAGGTATA AATAACAAGA TCATAAATTA TGGAGATTTT 90 120 ATGTTAGCAA CAGCATTAAA ATTAGGCTAT GCTAAAGATA GAGACGAAAT GAGAAAATTA 150 180 TCTGTAGAAA AGCAGAAGAA ATTGCAGATT GATGCGGCTA AAGGTATAGC TGAAGAGGCA 210 240 AGAGCAGGTG GAGAAGGATA TCTGTTCATA GATACGCACG CTGTGATACG TACACCCTCT 270 300 GGATATTTAC CTGGTTTACC GTCAGATATA ATTACAGAAA TAAATCCGTC TGTTATCTTT 330 360 TTACTGGAAG CTGATCCTAA GATAATATTA TCAAGGCAAA AGAGAGATAC AACAAGGAAT 390 420 AGAAATGATT ATAGTGACGA ATCAGTTATA TTAGAAACCA TAAACTTCGC TAGATATGCA 450 480 GCTACTGCTT CTGCAGTATT AGCCGGTTCT ACTGTTAAGG TAATTGTAAA CGTGGAAGGA 510 540 GATCCTAGTA TAGCAGCTAA TGAGATAATA AGGTCTATGA AGGGTGGTTC TTCTCTGGTT 570 600 CCGCGTGGAC TGGAATTCGT CGACCTCGAG GGATCCGGGC CCTCTAGATG CGGCCGCATG 630 660 CATGGTACCT AA

【００５４】配列番号：４配列の長さ：２２３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser 1 5 10 15 Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile 20 25 30 Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala 35 40 45 Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu 50 55 60 Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly 65 70 75 Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile 80 85 90 Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly 95 100 105 Leu Pro Ser Asp Ile Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe 110 115 120 Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg 125 130 135 Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile 140 145 150 Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala 155 160 165 Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly 170 175 180 Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys Gly 185 190 195 Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Leu Glu Phe Val Asp Leu Glu 200 205 210 Gly Ser Gly Pro Ser Arg Cys Gly Arg Met His Gly Thr 215 220

【００５５】配列番号：５配列の長さ：４５５７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：環状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGGCTAGCG AATTCGTCGA CCTCGAGGGA TCCGGGCCCT CTAGATGCGG CCGCATGCAT 30 60 GGTACCTAAC TAACTAAGCT TGAGTATTCT ATAGTGTCAC CTAAATCCCA GCTTGATCCG 90 120 GCTGCTAACA AAGCCCGAAA GGAAGCTGAG TTGGCTGCTG CCACCGCTGA GCAATAACTA 150 180 GCATAACCCC TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTGCTGAA AGGAGGAACT 210 240 ATATCCGGAT AACCTGGCGT AATAGCGAAG AGGCCCGCAC CGAATTAATT CATCGTGACT 270 300 GACTGACGAT CTGCCTCGCG CGTTTCGGTG ATGACGGTGA AAACCTCTGA CACATGCAGC 330 360 TCCCGGAGAC GGTCACAGCT TGTCTGTAAG CGGATGCCGG GAGCAGACAA GCCCGTCAGG 390 420 GCGCGTCAGC GGGTGTTGGC GGGTGTCGGG GCGCAGCCAT GACCCAGTCA CGTAGCGATA 450 480 GCGGAGTGTA TAATTCTTGA AGACGAAAGG GCCTCGTGAT ACGCCTATTT TTATAGGTTA 510 540 ATGTCATGAT AATAATGGTT TCTTAGACGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG 570 600 GAACCCCTAT TTGTTTATTT TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT 630 660 AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC 690 720 GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA 750 780 CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC 810 840 TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA 870 900 TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG 930 960 AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA 990 1020 CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA 1050 1080 TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGAGCTAA 1110 1140 CCGCTTTTTT GCACAACATG GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC 1170 1200 TGAATGAAGC CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGCAGCA ATGGCAACAA 1230 1260 CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA CAATTAATAG 1290 1320 ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG CTCGGCCCTT CCGGCTGGCT 1350 1380 GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC 1410 1440 TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA 1470 1500 CTATGGATGA ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT 1530 1560 AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT 1590 1620 TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG 1650 1680 AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC 1710 1740 CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 1770 1800 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 1830 1860 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 1890 1920 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG 1950 1980 GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC 2010 2040 GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 2070 2100 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 2130 2160 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG 2190 2220 GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA CTTGAGCGTC 2250 2280 GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT 2310 2340 TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC 2370 2400 CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC 2430 2460 GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCTG ATGCGGTATT 2490 2520 TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC ACCGCATAAA TTCCGACACC ATCGAATGGT 2550 2580 GCAAAACCTT TCGCGGTATG GCATGATAGC GCCCGGAAGA GAGTCAATTC AGGGTGGTGA 2610 2640 ATGTGAAACC AGTAACGTTA TACGATGTCG CAGAGTATGC CGGTGTCTCT TATCAGACCG 2670 2700 TTTCCCGCGT GGTGAACCAG GCCAGCCACG TTTCTGCGAA AACGCGGGAA AAAGTGGAAG 2730 2760 CGGCGATGGC GGAGCTGAAT TACATTCCCA ACCGCGTGGC ACAACAACTG GCGGGCAAAC 2790 2820 AGTCGTTGCT GATTGGCGTT GCCACCTCCA GTCTGGCCCT GCACGCGCCG TCGCAAATTG 2850 2880 TCGCGGCGAT TAAATCTCGC GCCGATCAAC TGGGTGCCAG CGTGGTGGTG TCGATGGTAG 2910 2940 AACGAAGCGG CGTCGAAGCC TGTAAAGCGG CGGTGCACAA TCTTCTCGCG CAACGCGTCA 2970 3000 GTGGGCTGAT CATTAACTAT CCGCTGGATG ACCAGGATGC CATTGCTGTG GAAGCTGCCT 3030 3060 GCACTAATGT TCCGGCGTTA TTTCTTGATG TCTCTGACCA GACACCCATC AACAGTATTA 3090 3120 TTTTCTCCCA TGAAGACGGT ACGCGACTGG GCGTGGAGCA TCTGGTCGCA TTGGGTCACC 3150 3180 AGCAAATCGC GCTGTTAGCG GGCCCATTAA GTTCTGTCTC GGCGCGTCTG CGTCTGGCTG 3210 3240 GCTGGCATAA ATATCTCACT CGCAATCAAA TTCAGCCGAT AGCGGAACGG GAAGGCGACT 3270 3300 GGAGTGCCAT GTCCGGTTTT CAACAAACCA TGCAAATGCT GAATGAGGGC ATCGTTCCCA 3330 3360 CTGCGATGCT GGTTGCCAAC GATCAGATGG CGCTGGGCGC AATGCGCGCC ATTACCGAGT 3390 3420 CCGGGCTGCG CGTTGGTGCG GATATCTCGG TAGTGGGATA CGACGATACC GAAGACAGCT 3450 3480 CATGTTATAT CCCGCCGTTA ACCACCATCA AACAGGATTT TCGCCTGCTG GGGCAAACCA 3510 3540 GCGTGGACCG CTTGCTGCAA CTCTCTCAGG GCCAGGCGGT GAAGGGCAAT CAGCTGTTGC 3570 3600 CCGTCTCACT GGTGAAAAGA AAAACCACCC TGGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC 3630 3660 GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG GAAAGCGGGC 3690 3720 AGTGAGCGCA ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT AGGCACCCCA GGCTTTACAC 3750 3780 TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA 3810 3840 AACAGCTATG ACCATGATTA CGGATTCACT GGCCGTCGTT TTACAACGTC GTGACTGGGA 3870 3900 AAACCCTGGC GTTACCCAAC TTAATCGCCT TGCAGCACAT CCCCCTTTCG CCAGCTGGCG 3930 3960 TAATAGCGAA GAGGCCCGCA CCGATCGCCC TTCCCAACAG TTGCGCAGCC TGAATGGCGA 3990 4020 ATGGCGCTTT GCCTGGTTTC CGGCACCAGA AGCGGTGCCG GAAAGCTGGC TGGAGTGCGA 4050 4080 TCTTCCTGAG GCCGATACTG TCGTCGTCCC CTCAAACTGG CAGATGCACG GTTACGATGC 4110 4140 GCCCATCTAC ACCAACGTAA CCTATCCCAT TACGGTCAAT CCGCCGTTTG TTCCCACGGA 4170 4200 GAATCCGACG GGTTGTTACT CGCTCACATT TAATGTTGAT GAAAGCTGGC TACAGGAAGG 4230 4260 CCAGACGCGA ATTATTTTTG ATGGCGTTGG AATTACGTTA TCGACTGCAC GGTGCACCAA 4290 4320 TGCTTCTGGC GTCAGGCAGC CATCGGAAGC TGTGGTATGG CTGTGCAGGT CGTAAATCAC 4350 4380 TGCATAATTC GTGTCGCTCA AGGCGCACTC CCGTTCTGGA TAATGTTTTT TGCGCCGACA 4410 4440 TCATAACGGT TCTGGCAAAT GGGAATTGGG AAATTAATAC GACTCACTAT ATGGAATTGT 4470 4500 GAGCGGATAA CAATTCCTAG AAATAATTTT GTTTAACTTT AAGAAGGAGA TATACAT 4530

【００５６】配列番号：６配列の長さ：６７２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGGCGTGGA AGGTTTCTGT CGACCAAGAC ACCTGTATAG GAGATGCCAT CTGTGCAAGC 30 60 CTCTGTCCAG ACGTCTTTGA GATGAACGAT GAAGGAAAGG CCCAACCAAA GGTAGAGGTT 90 120 ATTGAGGACG AAGAGCTCTA CAACTGTGCT AAGGAAGCTA TGGAGGCCTG TCCAGTTAGT 150 180 GCTATTACTA TTGAGGAGGC TGGTGGTTCT TCTCTGGTTC CGCGTGGATC GGAATTCATG 210 240 GGCCAAATCT TTTCCCGTAG CGCTAGCCCT ATTCCGCGGC CGCCCCGGGG GCTGGCCGCT 270 300 CATCACTGGC TTAACTTCCT CCAGGCGGCA TATCGCCTAG AACCCGGTCC CTCCAGTTAC 330 360 GATTTCCACC AGTTAAAAAA ATTTCTTAAA ATAGCTTTAG AAACACCGGT CTGGATCTGC 390 420 CCCATTAACT ACTCCCTCCT AGCCAGCCTA CTCCCAAAAG GATACCCCGG CCGGGTGAAT 450 480 GAAATTTTAC ACATACTCAT CCAAACCCAA GCCCAGATCC CGTCCCGCCC CGCGCCGCCG 510 540 CCGCCGTCAT CCTCCACCCA CGACCCCCCG GATTCTGACC CACAAATCCC CCCTCCCTAT 570 600 GTTGAGCCTA CAGCCCCCCA AGTCCTTTAA GGATCCGGGC CCTCTAGATG CGGCCGCATG 630 660 CATGGTACCT AA

【００５７】配列番号：７配列の長さ：２０９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Ala Trp Lys Val Ser Val Asp Gln Asp Thr Cys Ile Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ile Cys Ala Ser Leu Cys Pro Asp Val Phe Glu Met Asn Asp 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Gln Pro Lys Val Glu Val Ile Glu Asp Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Asn Cys Ala Lys Glu Ala Met Glu Ala Cys Pro Val Ser 50 55 60 Ala Ile Thr Ile Glu Glu Ala Gly Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg 65 70 75 Gly Ser Glu Phe Met Gly Gln Ile Phe Ser Arg Ser Ala Ser Pro 80 85 90 Ile Pro Arg Pro Pro Arg Gly Leu Ala Ala His His Trp Leu Asn 95 100 105 Phe Leu Gln Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Pro Gly Pro Ser Ser Tyr 110 115 120 Asp Phe His Gln Leu Lys Lys Phe Leu Lys Ile Ala Leu Glu Thr 125 130 135 Pro Val Trp Ile Cys Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Ser Leu 140 145 150 Leu Pro Lys Gly Tyr Pro Gly Arg Val Asn Glu Ile Leu His Ile 155 160 165 Leu Ile Gln Thr Gln Ala Gln Ile Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro 170 175 180 Pro Pro Ser Ser Ser Thr His Asp Pro Pro Asp Ser Asp Pro Gln 185 190 195 Ile Pro Pro Pro Tyr Val Glu Pro Thr Ala Pro Gln Val Leu 200 205

【００５８】配列番号：８配列の長さ：６９０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGGCGTGGA AGGTTTCTGT CGACCAAGAC ACCTGTATAG GAGATGCCAT CTGTGCAAGC 30 60 CTCTGTCCAG ACGTCTTTGA GATGAACGAT GAAGGAAAGG CCCAACCAAA GGTAGAGGTT 90 120 ATTGAGGACG AAGAGCTCTA CAACTGTGCT AAGGAAGCTA TGGAGGCCTG TCCAGTTAGT 150 180 GCTATTACTA TTGAGGAGGC TGGTGGTTCT TCTCTGGTTC CGCGTGGATC GGAATTCATG 210 240 GGACAAATCC ACGGGCTTTC CCCAACTCCA ATACCCAAAG CCCCCAGGGG GCTATCAACC 270 300 CACCACTGGC TTAACTTTCT CCAGGCTGCT TACCGCTTGC AGCCTAGGCC CTCCGATTTC 330 360 GACTTCCAGC AGCTACGACG CTTTCTAAAA CTAGCCCTTA AAACGCCCAT TTGGCTAAAT 390 420 CCTATTGACT ACTCGCTTTT AGCTAGCCTT ATCCCCAAGG GATATCCAGG AAGGGTGGTA 450 480 GAGATTATAA ATATCCTTGT CAAAAATCAA GTCTCCCCTA GCGCCCCCGC CGCCCCAGTT 510 540 CCGACACCTA TCTGCCCTAC TACTACTCCT CCGCCACCTC CCCCCCCTTC CCCGGAGGCC 570 600 CATGTTCCCC CCCCTTACGT GGAACCCACC ACCACGCAAT GCTTCTAAGG ATCCGGGCCC 630 660 TCTAGATGCG GCCGCATGCA TGGTACCTAA 690

【００５９】配列番号：９配列の長さ：２１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Ala Trp Lys Val Ser Val Asp Gln Asp Thr Cys Ile Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ile Cys Ala Ser Leu Cys Pro Asp Val Phe Glu Met Asn Asp 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Gln Pro Lys Val Glu Val Ile Glu Asp Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Asn Cys Ala Lys Glu Ala Met Glu Ala Cys Pro Val Ser 50 55 60 Ala Ile Thr Ile Glu Glu Ala Gly Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg 65 70 75 Gly Ser Glu Phe Met Gly Gln Ile His Gly Leu Ser Pro Thr Pro 80 85 90 Ile Pro Lys Ala Pro Arg Gly Leu Ser Thr His His Trp Leu Asn 95 100 105 Phe Leu Gln Ala Ala Tyr Arg Leu Gln Pro Arg Pro Ser Asp Phe 110 115 120 Asp Phe Gln Gln Leu Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ala Leu Lys Thr 125 130 135 Pro Ile Trp Leu Asn Pro Ile Asp Tyr Ser Leu Leu Ala Ser Leu 140 145 150 Ile Pro Lys Gly Tyr Pro Gly Arg Val Val Glu Ile Ile Asn Ile 155 160 165 Leu Val Lys Asn Gln Val Ser Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro Val 170 175 180 Pro Thr Pro Ile Cys Pro Thr Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro 185 190 195 Pro Ser Pro Glu Ala His Val Pro Pro Pro Tyr Val Glu Pro Thr 200 205 210 Thr Thr Gln Cys Phe 215

【００６０】配列番号：１０配列の長さ：８１０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGGCGTGGA AGGTTTCTGT CGACCAAGAC ACCTGTATAG GAGATGCCAT CTGTGCAAGC 30 60 CTCTGTCCAG ACGTCTTTGA GATGAACGAT GAAGGAAAGG CCCAACCAAA GGTAGAGGTT 90 120 ATTGAGGACG AAGAGCTCTA CAACTGTGCT AAGGAAGCTA TGGAGGCCTG TCCAGTTAGT 150 180 GCTATTACTA TTGAGGAGGC TGGTGGTTCT TCTCTGGTTC CGCGTGGATC GGAATTCGCA 210 240 GTACCGGTGG CGGTCTGGCT TGTCTCCGCC CTGGCCATGG GAGCCGGAGT GGCTGGCAGG 270 300 ATTACCGGCT CCATGTCCCT CGCCTCAGGA AAGAGCCTCC TACATGAGGT GGACAAAGAT 330 360 ATTTCCCAAT TAACTCAAGC AATAGTCAAA AACCACAAAA ATCTGCTCAA AATTGCACAG 390 420 TATGCTGCCC AGAACAGACG AGGCCTTGAT CTCCTGTTCT GGGAGCAAGG AGGATTATGC 450 480 AAAGCATTAC AAGAACAGTG CTGTTTTCTA AATATTACTA ATTCCCATGT CTCAATACTA 510 540 CAAGAGAGAC CCCCCCTTGA AAATCGAGTC CTGACTGGCT GGGGCCTTAA CTGGGACCTT 570 600 GGCCTCTCAC AGTGGGCTCG AGAAGCCTTA CAAACTGGAA TCACCCTTGT CGCGCTACTC 630 660 CTTCTTGTTA TCCTTGCAGG ACCATGCATC CTCCGTCAGC TACGACACCT CCCCTCGCGC 690 720 GTCAGATACC CCCATTACTC TCTTATAAAC CCTGAGTCAT CCCTGTAAGG ATCCGGGCCC 750 780 TCTAGATGCG GCCGCATGCA TGGTACCTAA 810

【００６１】配列番号：１１配列の長さ：２５５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Ala Trp Lys Val Ser Val Asp Gln Asp Thr Cys Ile Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ile Cys Ala Ser Leu Cys Pro Asp Val Phe Glu Met Asn Asp 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Gln Pro Lys Val Glu Val Ile Glu Asp Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Asn Cys Ala Lys Glu Ala Met Glu Ala Cys Pro Val Ser 50 55 60 Ala Ile Thr Ile Glu Glu Ala Gly Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg 65 70 75 Gly Ser Glu Phe Ala Val Pro Val Ala Val Trp Leu Val Ser Ala 80 85 90 Leu Ala Met Gly Ala Gly Val Ala Gly Arg Ile Thr Gly Ser Met 95 100 105 Ser Leu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Leu His Glu Val Asp Lys Asp 110 115 120 Ile Ser Gln Leu Thr Gln Ala Ile Val Lys Asn His Lys Asn Leu 125 130 135 Leu Lys Ile Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp 140 145 150 Leu Leu Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu Cys Lys Ala Leu Gln Glu 155 160 165 Gln Cys Cys Phe Leu Asn Ile Thr Asn Ser His Val Ser Ile Leu 170 175 180 Gln Glu Arg Pro Pro Leu Glu Asn Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly 185 190 195 Leu Asn Trp Asp Leu Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg Glu Ala Leu 200 205 210 Gln Thr Gly Ile Thr Leu Val Ala Leu Leu Leu Leu Val Ile Leu 215 220 225 Ala Gly Pro Cys Ile Leu Arg Gln Leu Arg His Leu Pro Ser Arg 230 235 240 Val Arg Tyr Pro His Tyr Ser Leu Ile Asn Pro Glu Ser Ser Leu 245 250 255

【００６２】配列番号：１２配列の長さ：８１６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGGCGTGGA AGGTTTCTGT CGACCAAGAC ACCTGTATAG GAGATGCCAT CTGTGCAAGC 30 60 CTCTGTCCAG ACGTCTTTGA GATGAACGAT GAAGGAAAGG CCCAACCAAA GGTAGAGGTT 90 120 ATTGAGGACG AAGAGCTCTA CAACTGTGCT AAGGAAGCTA TGGAGGCCTG TCCAGTTAGT 150 180 GCTATTACTA TTGAGGAGGC TGGTGGTTCT TCTCTGGTTC CGCGTGGATC GGAATTCGCC 210 240 GTTCCAATAG CAGTGTGGCT TGTCTCCGCC CTAGCGGCCG GAACAGGTAT CGCTGGTGGA 270 300 GTAACAGGCT CCCTATCTCT GGCTTCCAGT AAAAGCCTTC TCCTCGAGGT TGACAAAGAC 330 360 ATCTCCCACC TTACCCAGGC CATAGTCAAA AATCATCAAA ACATCCTCCG GGTTGCACAG 390 420 TATGCAGCCC AAAATAGACG AGGATTAGAC CTCCTATTCT GGGAACAAGG GGGTTTGTGC 450 480 AAGGCCATAC AGGAGCAATG TTGCTTCCTC AACATCAGTA ACACTCATGT ATCCGTCCTC 510 540 CAGGAACGGC CCCCTCTTGA AAAACGTGTC ATCACCGGCT GGGGACTAAA CTGGGATCTT 570 600 GGACTGTCCC AATGGGCACG AGAAGCCCTC CAGACAGGCA TAACCATTCT CGCTCTACTC 630 660 CTCCTCGTCA TATTGTTTGG CCCCTGTATC CTCCGCCAAA TCCAGGCCCT TCCACAGCGG 690 720 TTACAAAACC GACATAACCA GTATTCCCTT ATCAACCCAG AAACCATGCT ATAAGGATCC 750 780 GGGCCCTCTA GATGCGGCCG CATGCATGGT ACCTAA 810

【００６３】配列番号：１３配列の長さ：２５７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Ala Trp Lys Val Ser Val Asp Gln Asp Thr Cys Ile Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ile Cys Ala Ser Leu Cys Pro Asp Val Phe Glu Met Asn Asp 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Gln Pro Lys Val Glu Val Ile Glu Asp Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Asn Cys Ala Lys Glu Ala Met Glu Ala Cys Pro Val Ser 50 55 60 Ala Ile Thr Ile Glu Glu Ala Gly Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg 65 70 75 Gly Ser Glu Phe Ala Val Pro Ile Ala Val Trp Leu Val Ser Ala 80 85 90 Leu Ala Ala Gly Thr Gly Ile Ala Gly Gly Val Thr Gly Ser Leu 95 100 105 Ser Leu Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Leu Glu Val Asp Lys Asp 110 115 120 Ile Ser His Leu Thr Gln Ala Ile Val Lys Asn His Gln Asn Ile 125 130 135 Leu Arg Val Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp 140 145 150 Leu Leu Phe Trp Glu Gln Gly Gly Leu Cys Lys Ala Ile Gln Glu 155 160 165 Gln Cys Cys Phe Leu Asn Ile Ser Asn Thr His Val Ser Val Leu 170 175 180 Gln Glu Arg Pro Pro Leu Glu Lys Arg Val Ile Thr Gly Trp Gly 185 190 195 Leu Asn Trp Asp Leu Gly Leu Ser Gln Trp Ala Arg Glu Ala Leu 200 205 210 Gln Thr Gly Ile Thr Ile Leu Ala Leu Leu Leu Leu Val Ile Leu 215 220 225 Phe Gly Pro Cys Ile Leu Arg Gln Ile Gln Ala Leu Pro Gln Arg 230 235 240 Leu Gln Asn Arg His Asn Gln Tyr Ser Leu Ile Asn Pro Glu Thr 245 250 255 Met Leu

【００６４】配列番号：１４配列の長さ：１１１９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT 30 60 TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 90 120 TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 150 180 GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 210 240 ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 270 300 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 330 360 GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 390 420 ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 450 480 GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA 510 540 AAACGTATTG AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA 570 600 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 630 660 CTGGTTCCGC GTGGATCGGA ATTCTGTTCA TTTAGTTCTA TCCCGAATGG CACGTACCGG 690 720 GCGACGTATC AGGATTTTGA TGAGAATGGT TGGAAGGACT TTCTCGAGGT TACTTTTGAT 750 780 GGTGGCAAGA TGGTGCAGGT GGTTTACGAT TATCAGCATA AAGAAGGGCG GTTTAAGTCC 810 840 CAGGACGCTG ACTACCATCG GGTCATGTAT GCATCCTCGG GCATAGGTCC TGAAAAGGCC 870 900 TTCAGAGAGC TCGCCGATGC TTTGCTTGAA AAGGGTAATC CCGAGATGGT GGATGTGGTC 930 960 ACCGGTGCAA CTGTTTCTTC CCAGAGTTTC AGGAGGTTGG GTCGTGCGCT TCTGCAGAGT 990 1020 GCGCGGCGCG GCGAGAAGGA AGCCATTATT AGCAGGTAGG AATTCGTCGA CCTCGAGGGA 1050 1080 TCCGGGCCCT CTAGATGCGG CCGCATGCAT GGTACCTAA 1110

【００６５】配列番号：１５配列の長さ：３５２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln 1 5 10 15 Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu 20 25 30 His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys 35 40 45 Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp 50 55 60 Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile 65 70 75 Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala 80 85 90 Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly 95 100 105 Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 110 115 120 Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp 125 130 135 Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His 140 145 150 Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met 155 160 165 Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 170 175 180 Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser 185 190 195 Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe 200 205 210 Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly 215 220 225 Ser Glu Phe Cys Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr Arg 230 235 240 Ala Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu 245 250 255 Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln Val Val Tyr Asp 260 265 270 Tyr Gln His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp Tyr 285 280 285 His Arg Val Met Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ala 290 295 300 Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu 305 310 315 Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser Phe 320 325 330 Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu Leu Gln Ser Ala Arg Arg Gly Glu 335 340 345 Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg 350

【００６６】配列番号：１６配列の長さ：８５８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGTTACACC AACAACGAAA CCAACACGCC AGGCTTATTC CTGTGGAGTT ATATATGAGC 30 60 GATAAAATTA TTCACCTGAC TGACGACAGT TTTGACACGG ATGTACTCAA AGCGGACGGG 90 120 GCGATCCTCG TCGATTTCTG GGCAGAGTGG TGCGGTCCGT GCAAAATGAT CGCCCCGATT 150 180 CTGGATGAAA TCGCTGACGA ATATCAGGGC AAACTGACCG TTGCAAAACT GAACATCGAT 210 240 CAAAACCCTG GCACTGCGCC GAAATATGGC ATCCGTGGTA TCCCGACTCT GCTGCTGTTC 270 300 AAAAACGGTG AAGTGGCGGC AACCAAAGTG GGTGCACTGT CTAAAGGTCA GTTGAAAGAG 330 360 TTCCTCGACG CTAACCTGGC GGAGCTCGGT GGTTCTTCTC TGGTTCCGCG TGGATCGGAA 390 420 TTCTGTTCAT TTAGTTCTAT CCCGAATGGC ACGTACCGGG CGACGTATCA GGATTTTGAT 450 480 GAGAATGGTT GGAAGGACTT TCTCGAGGTT ACTTTTGATG GTGGCAAGAT GGTGCAGGTG 510 540 GTTTACGATT ATCAGCATAA AGAAGGGCGG TTTAAGTCCC AGGACGCTGA CTACCATCGG 570 600 GTCATGTATG CATCCTCGGG CATAGGTCCT GAAAAGGCCT TCAGAGAGCT CGCCGATGCT 630 660 TTGCTTGAAA AGGGTAATCC CGAGATGGTG GATGTGGTCA CCGGTGCAAC TGTTTCTTCC 690 720 CAGAGTTTCA GGAGGTTGGG TCGTGCGCTT CTGCAGAGTG CGCGGCGCGG CGAGAAGGAA 750 780 GCCATTATTA GCAGGTAGGA ATTCGTCGAC CTCGAGGGAT CCGGGCCCTC TAGATGCGGC 810 840 CGCATGCATG GTACCTAA

【００６７】配列番号：１７配列の長さ：２６５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Leu His Gln Gln Arg Asn Gln His Ala Arg Leu Ile Pro Val 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser 20 25 30 Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp 35 40 45 Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile 50 55 60 Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala 65 70 75 Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly 80 85 90 Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val 95 100 105 Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu 110 115 120 Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Glu Leu Gly Gly Ser Ser Leu Val 125 130 135 Pro Arg Gly Ser Glu Phe Cys Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly 140 145 150 Thr Tyr Arg Ala Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys 155 160 165 Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln Val 170 175 180 Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp 185 190 195 Ala Asp Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro 200 205 210 Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys Gly 215 220 225 Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr Val Ser Ser 230 235 240 Gln Ser Phe Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu Leu Gln Ser Ala Arg 245 250 255 Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg 260 265

【００６８】配列番号：１８配列の長さ：６７２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGGCGTGGA AGGTTTCTGT CGACCAAGAC ACCTGTATAG GAGATGCCAT CTGTGCAAGC 30 60 CTCTGTCCAG ACGTCTTTGA GATGAACGAT GAAGGAAAGG CCCAACCAAA GGTAGAGGTT 90 120 ATTGAGGACG AAGAGCTCTA CAACTGTGCT AAGGAAGCTA TGGAGGCCTG TCCAGTTAGT 150 180 GCTATTACTA TTGAGGAGGC TGGTGGTTCT TCTCTGGTTC CGCGTGGATC GGAATTCTGT 210 240 TCATTTAGTT CTATCCCGAA TGGCACGTAC CGGGCGACGT ATCAGGATTT TGATGAGAAT 270 300 GGTTGGAAGG ACTTTCTCGA GGTTACTTTT GATGGTGGCA AGATGGTGCA GGTGGTTTAC 330 360 GATTATCAGC ATAAAGAAGG GCGGTTTAAG TCCCAGGACG CTGACTACCA TCGGGTCATG 390 420 TATGCATCCT CGGGCATAGG TCCTGAAAAG GCCTTCAGAG AGCTCGCCGA TGCTTTGCTT 450 480 GAAAAGGGTA ATCCCGAGAT GGTGGATGTG GTCACCGGTG CAACTGTTTC TTCCCAGAGT 510 540 TTCAGGAGGT TGGGTCGTGC GCTTCTGCAG AGTGCGCGGC GCGGCGAGAA GGAAGCCATT 570 600 ATTAGCAGGT AGGAATTCGT CGACCTCGAG GGATCCGGGC CCTCTAGATG CGGCCGCATG 630 660 CATGGTACCT AA

【００６９】配列番号：１９配列の長さ：２０３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Ala Trp Lys Val Ser Val Asp Gln Asp Thr Cys Ile Gly Asp 1 5 10 15 Ala Ile Cys Ala Ser Leu Cys Pro Asp Val Phe Glu Met Asn Asp 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Gln Pro Lys Val Glu Val Ile Glu Asp Glu Glu 35 40 45 Leu Tyr Asn Cys Ala Lys Glu Ala Met Glu Ala Cys Pro Val Ser 50 55 60 Ala Ile Thr Ile Glu Glu Ala Gly Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg 65 70 75 Gly Ser Glu Phe Cys Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr 80 85 90 Arg Ala Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe 95 100 105 Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln Val Val Tyr 110 115 120 Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp 125 130 135 Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys 140 145 150 Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro 155 160 165 Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser 170 175 180 Phe Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu Leu Gln Ser Ala Arg Arg Gly 185 190 195 Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg 200

【００７０】配列番号：２０配列の長さ：１０３５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGAAGATTG GTATTGTAAC TGGTATCCCT GGTGTAGGGA AAAGTACTGT CTTGGCTAAA 30 60 GTTAAAGAGA TATTGGATAA TCAAGGTATA AATAACAAGA TCATAAATTA TGGAGATTTT 90 120 ATGTTAGCAA CAGCATTAAA ATTAGGCTAT GCTAAAGATA GAGACGAAAT GAGAAAATTA 150 180 TCTGTAGAAA AGCAGAAGAA ATTGCAGATT GATGCGGCTA AAGGTATAGC TGAAGAGGCA 210 240 AGAGCAGGTG GAGAAGGATA TCTGTTCATA GATACGCACG CTGTGATACG TACACCCTCT 270 300 GGATATTTAC CTGGTTTACC GTCAGATATA ATTACAGAAA TAAATCCGTC TGTTATCTTT 330 360 TTACTGGAAG CTGATCCTAA GATAATATTA TCAAGGCAAA AGAGAGATAC AACAAGGAAT 390 420 AGAAATGATT ATAGTGACGA ATCAGTTATA TTAGAAACCA TAAACTTCGC TAGATATGCA 450 480 GCTACTGCTT CTGCAGTATT AGCCGGTTCT ACTGTTAAGG TAATTGTAAA CGTGGAAGGA 510 540 GATCCTAGTA TAGCAGCTAA TGAGATAATA AGGTCTATGA AGGGTGGTTC TTCTCTGGTT 570 600 CCGCGTGGAT CGGAATTCTG TTCATTTAGT TCTATCCCGA ATGGCACGTA CCGGGCGACG 630 660 TATCAGGATT TTGATGAGAA TGGTTGGAAG GACTTTCTCG AGGTTACTTT TGATGGTGGC 690 720 AAGATGGTGC AGGTGGTTTA CGATTATCAG CATAAAGAAG GGCGGTTTAA GTCCCAGGAC 750 780 GCTGACTACC ATCGGGTCAT GTATGCATCC TCGGGCATAG GTCCTGAAAA GGCCTTCAGA 810 840 GAGCTCGCCG ATGCTTTGCT TGAAAAGGGT AATCCCGAGA TGGTGGATGT GGTCACCGGT 870 900 GCAACTGTTT CTTCCCAGAG TTTCAGGAGG TTGGGTCGTG CGCTTCTGCA GAGTGCGCGG 930 960 CGCGGCGAGA AGGAAGCCAT TATTAGCAGG TAGGGATCCG GGCCCTCTAG ATGCGGCCGC 990 1020 ATGCATGGTA CCTAA

【００７１】配列番号：２１配列の長さ：３３０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：遺伝子発現蛋白質配列 Met Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Ile Pro Gly Val Gly Lys Ser 1 5 10 15 Thr Val Leu Ala Lys Val Lys Glu Ile Leu Asp Asn Gln Gly Ile 20 25 30 Asn Asn Lys Ile Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Met Leu Ala Thr Ala 35 40 45 Leu Lys Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Arg Asp Glu Met Arg Lys Leu 50 55 60 Ser Val Glu Lys Gln Lys Lys Leu Gln Ile Asp Ala Ala Lys Gly 65 70 75 Ile Ala Glu Glu Ala Arg Ala Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Phe Ile 80 85 90 Asp Thr His Ala Val Ile Arg Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Pro Gly 95 100 105 Leu Pro Ser Asp Ile Ile Thr Glu Ile Asn Pro Ser Val Ile Phe 110 115 120 Leu Leu Glu Ala Asp Pro Lys Ile Ile Leu Ser Arg Gln Lys Arg 125 130 135 Asp Thr Thr Arg Asn Arg Asn Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Val Ile 140 145 150 Leu Glu Thr Ile Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Ala Thr Ala Ser Ala 155 160 165 Val Leu Ala Gly Ser Thr Val Lys Val Ile Val Asn Val Glu Gly 170 175 180 Asp Pro Ser Ile Ala Ala Asn Glu Ile Ile Arg Ser Met Lys Gly 185 190 195 Gly Ser Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Glu Phe Cys Ser Phe Ser 200 205 210 Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr Arg Ala Thr Tyr Gln Asp Phe Asp 215 220 225 Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly 230 235 240 Lys Met Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly Arg 245 250 255 Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser 260 265 270 Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala 275 280 285 Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly 290 295 300 Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser Phe Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu 305 310 315 Leu Gln Ser Ala Arg Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg 320 325 330

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＷ６Ａの詳細図である。

【図２】発現ベクターｐＷＦ６Ａの詳細図である。

【図３】融合蛋白質と陰性検体との反応性を示すグラフ
である。

【図４】ＨＴＬＶ−Ｉ融合蛋白質と陽性検体との反応性
を示すグラフである。

【図５】ＨＴＬＶ−ＩＩ融合蛋白質と陽性検体との反応
性を示すグラフである。

【図６】ＨＴＬＶ−Ｉ融合蛋白質の濃度依存反応性を示
すグラフである。

【図７】ＨＴＬＶ−ＩＩ融合蛋白質の濃度依存反応性を
示すグラフである。

【図８】熱処理上清の融合蛋白質活性を示すグラフであ
る。

【図９】熱処理沈殿の融合蛋白質活性を示すグラフであ
る。

【図１０】熱処理精製後の融合蛋白質活性を示す図であ
る。

【図１１】発現ベクターｐＷ６ＡＫの詳細図である。

【図１２】熱処理精製後の融合蛋白質活性を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. （1995），10，ｐ．77−84 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（1994）, 176（15），ｐ．4790−4703 ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ（1993），307（２），ｐ．405 −410 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】選択された蛋白質またはペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列の５’末端に直接または間接に融合さ
れた摂氏５５℃以上で熱変性しない耐熱性蛋白質のＤＮ
Ａ配列を含む融合ＤＮＡ配列。
【請求項２】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列が摂氏７５℃
以上で熱変性しない耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列である請
求項１に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列が好熱菌由来
のＤＮＡ配列である請求項１または２に記載のＤＮＡ配
列。
【請求項４】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列が高度好熱菌
由来のＤＮＡ配列である請求項１または２に記載のＤＮ
Ａ配列。
【請求項５】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列がサーモフィ
ラス菌、サルフォロボス菌、フィロコッカス菌、サーモ
トガ菌、フィロバクラム菌、フィロディクチウム菌、サ
ーモコッカス菌、サーモディスカス菌、メタノサーマス
菌又はメタノコッカス菌由来のＤＮＡ配列である請求項
１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列がフィロコッ
カス菌またはサルファロボス菌由来のＤＮＡ配列である
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列が耐熱性フェ
レドキシンまたは耐熱性アデニレートキナーゼのＤＮＡ
配列である請求項１ないし６のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡ配列。
【請求項８】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列がサルファロ
ボス菌由来アデニレートキナーゼ、サーモフィラス菌由
来ＤＮＡポリメラーゼ、フィロコッカスフリオシス菌由
来フェレドキシン、フィロコッカスフリオシス菌由来グ
ルコシダーゼ、フィロコッカスフリオシス菌由来ルブレ
ドキシン、フィロコッカスフリオシス菌由来グルタミン
酸脱水素酵素、メタノサーマスフェリビダス菌由来グリ
セルアルデヒドリン酸脱水素酵素、メタノコッカスボレ
イト菌由来グルタミン酸合成酵素、サーモトガマリティ
ナ菌由来Ｌ−乳酸脱水素酵素およびサーモコッカスセレ
ール菌由来エロンゲーションファクターのＤＮＡ配列か
らなる群より選択されることを特徴とする請求項１また
は２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列がフィロコッ
カス菌由来フェレドキシンまたはサルファロボス菌由来
アデニレートキナーゼのＤＮＡ配列である請求項１ない
し８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】請求項１ないし９のいずれか１項に記
載のＤＮＡ配列から発現された融合蛋白質。
【請求項１１】請求項１ないし９のいずれか１項に記
載のＤＮＡ配列を用いた融合蛋白質を発現させる方法。