JP3354975B2 - 蛍光標識試薬および蛍光免疫測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛍光免疫測定法による
生理活性物質等の測定に用いる蛍光標識試薬、それを用
いた蛍光免疫測定法および蛍光免疫測定キットに関す
る。さらに詳しくは、半導体レーザを励起光源とした場
合の蛍光標識試薬と蛍光免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、抗
原、抗体の濃度の測定方法としてはラジオアイソトープ
や酵素で抗原抗体を標識する方法が用いられてきたが、
これらの方法は感度、安全性などの面で問題があり、こ
れらの方法に代わって蛍光色素で抗原抗体を標識し、こ
れを用いて抗原抗体の濃度を測定する方法が種々研究さ
れている。

【０００３】例えば、特開昭５９−５０１８７３号（米
国特許番号４８５２８０９号）などでは、光ファイバー
の側面に抗原、抗体を結合させ、蛍光色素で標識した抗
体、抗原をこの光ファイバー表面で免疫反応させるとと
もに、この光ファイバーに励起光を導波することによ
り、光ファイバー上の蛍光色素を励起させ、この蛍光を
光ファイバーの出射端面で反射させ、光ファイバーの入
射端面から蛍光と残余の励起光を取り出し、これをビー
ムスプリッターを経由することにより分光させ、蛍光の
みを測定する方法が記載されている。

【０００４】従来よりこのような蛍光免疫測定法におい
ては、標識物としてフルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミンイソチオシアネートなどの蛍光色素で修
飾された蛍光標識抗原や蛍光標識抗体が用いられてき
た。しかしながら、このような蛍光標識抗原や蛍光標識
抗体は、抗原又は抗体一つに結合する蛍光色素の量が一
つであるため，感度の改善が困難であった。また、ロー
ダミンやフルオレセイン等の蛍光色素は、励起波長が４
００ｎｍ付近であるため、励起光源が大型で、高価であ
るという欠点を持っていた。そのため、これらの蛍光色
素に代えて、６３０ｎｍ帯で励起するシアニン色素で修
飾されたアビジンをビオチン化抗原やビオチン化抗体で
標識することにより、Ｈｅ−Ｎｅレーザを光源として使
用可能な蛍光標識抗体が開発されている（ＷＯ９０／１
３０２９公報）。

【０００５】しかし、Ｈｅ−Ｎｅレーザは、小型化を図
ると低出力になり、高出力化を図ると大型でかつ高価格
なものとなってしまうという問題がある。一方、Ｈｅ−
Ｎｅレーザより小型のレーザとして半導体レーザが市販
されているが、６３０ｎｍ帯では、実用的で安価で高出
力な半導体レーザは市販されていない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、前
記の課題を解決するために鋭意検討した。その結果、小
型、低価格、高出力の光源として実用化されている、赤
外域の半導体レーザにより励起できるような蛍光色素を
見いだし、これをアビジン等の親水性多官能基高分子に
結合させて測定試薬とすることにより、さらに高感度で
低価格な免疫測定を実現でき、また、測定装置の小型
化、低価格化が可能となることを見いだし、本発明を完
成するに至った。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、 （１）一般式（１）、（２) 又は（３) により表される
シアニン色素により標識された親水性多官能基高分子よ
りなる蛍光標識試薬、

【化４】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
Ｃ（ＣＨ₃ ）₂ を表し、ｎは０〜３、ｍは０〜２の整数
を示す。） （２）蛍光免疫測定において、前記（１）に記載の蛍光
標識試薬を用い、７５０〜８５０ｎｍの半導体レーザを
励起光源とすることを特徴とする蛍光免疫測定法、 （３）蛍光色素により標識された親水性多官能基高分子
と、該親水性多官能基高分子と直接的または間接的に結
合する生理活性物質よりなる蛍光免疫測定キットにおい
て、該蛍光色素が一般式（１）、（２) 又は（３) によ
り表されるシアニン色素であることを特徴とする蛍光免
疫測定キット、並びに （４）一般式（１）、（２) 又は（３) により表される
蛍光色素により直接的またはアミノグリカン及び／又は
ポリペプチドを介して間接的に標識されたアビジン及び
／又はプロテインＡよりなる結合体、およびビオチン及
び／又は免疫グロブリンが直接的またはアミノグリカン
及び／又はポリペプチドを介して間接的に生理活性物質
に結合した結合体より構成されることを特徴とする蛍光
免疫測定キットに関する。

【０００８】本発明の蛍光標識試薬は、一般式（１）、
（２) 又は（３) により表されるシアニン色素により標
識された親水性多官能基高分子よりなるものである。シ
アニン色素としては、一般式（１）、（２) 又は（３)
に示される一般式で表されるものであれば特に限定され
るものではなく、例えば表１および表２に示す色素Ａ
（日本感光色素研究所製、ＮＫ３６２５）、色素Ｂ（日
本感光色素研究所製、ＮＫ３７９２）、色素Ｄ、色素
Ｅ、色素Ｇ、色素Ｈが挙げられる。本発明で用いるこれ
らのシアニン色素は、赤外域を吸収する蛍光色素である
ため、小型で高出力かつ低価格な半導体レーザを光源と
して使用することができる。従って、装置全体としても
小型化、低価格化を実現することができる。

【０００９】

【表１】

【００１０】

【表２】

【００１１】本発明の蛍光標識試薬においてシアニン色
素により標識される親水性多官能基高分子としては、特
に限定されるものではなく、例えばアビジン、プロテイ
ンＡ、アミノグリカン、またはポリペプチド等が好適に
使用される。アミノグリカンとしては、例えばキトサ
ン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン酸等が例示さ
れ、ポリペプチドとしては、ポリリジン等が挙げられ
る。

【００１２】シアニン色素により親水性多官能基高分子
を標識するには、公知の方法により容易に行われる。シ
アニン色素と親水性多官能基高分子の結合は、シアニン
色素のカルボキシル基と親水性多官能基高分子のアミノ
基とを有機溶媒中で、縮合剤を用いて、常法により縮合
させてアミド結合させることができる。シアニン色素と
親水性多官能基高分子との反応終了後、未反応物はなる
べく除去することが好ましく、例えば透析法、遠心分離
法、ゲル濾過法又は限外濾過法などによって除くことが
できる。ここで、縮合剤としては１−エチル−３−
（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジ
−ｐ−トレオイルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド、水溶性カルボジイミド（ＣＨＭＣ）のよ
うなカルボジイミド類や、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、Ｎ−ブロモスクシンイミド等が使用される。

【００１３】例えば、親水性多官能基高分子としてアビ
ジンを使用する場合について、さらに具体的な態様を例
示すると、通常、４．０×１０^-6〜５．０×１０^-3Ｍの
シアニン色素をエタノールに溶かし、その溶液１０ｍｌ
に１〜２ｍｇ／ｍｌのアビジン５００μｌを加え、前記
のような縮合剤を９．０×１０^-5〜３．０×１０^-3Ｍ加
え、室温で一晩放置する。一晩放置後、遠心分離により
アビジンを回収し、未反応の色素については、エタノー
ル溶解にて除去する。未反応色素を除去した後、沈澱を
弱酸性の緩衝液に溶かし、その上清をシアニン色素修飾
アビジンとして採取する。この場合、１分子のアビジン
の表面に結合するシアニン色素の数が、１〜２分子では
効率が悪くなり、また５分子以上では溶解性に問題が生
じるため、３〜４分子程度が適当と考えられる。

【００１４】次に、本発明の蛍光標識試薬を用いて蛍光
免疫測定を行う方法について、本発明のシアニン色素修
飾アビジンを使用する態様を例示して説明する。 工程Ａ：まず、生理活性物質（例えば、測定物質である
抗原）に対する抗体を光ファイバーのコアー表面に固定
する。次いで、該抗体の結合した光ファイバーと生理活
性物質（抗原）を特異的に反応させて、光ファイバーの
コア表面上に抗体と生理活性物質（抗原）の結合した免
疫複合体（光ファイバーのコア表面−抗体−生理活性物
質）を形成する。

【００１５】工程Ｂ：前記の生理活性物質（抗原）に対
して特異的な結合能を有する抗体の結合したビオチン化
アミノグリカン（抗体−アミノグリカン−ビオチン）と
本発明のシアニン色素修飾アビジン（アビジン−シアニ
ン色素）を反応させて、ビオチン−アビジンの結合を介
したシアニン色素標識抗体を調製する（抗体−アミノグ
リカン−ビオチン−アビジン−シアニン色素）。

【００１６】工程Ｃ：工程Ａで調製した免疫複合体と工
程Ｂで調製したシアニン色素標識抗体を特異的に反応さ
せて、光ファイバーのコア表面−抗体−生理活性物質
（測定物質）−抗体−アミノグリカン−ビオチン−アビ
ジン−シアニン色素の免疫複合体を形成し、７５０〜８
５０ｎｍの半導体レーザを励起光源とする蛍光測定装置
を用いて光ファイバーのコア表面に固定されたシアニン
色素の蛍光を測定する。

【００１７】前記の説明においては、親水性多官能基高
分子としてアビジンを例としたものであるが、本発明に
おける親水性多官能基高分子は前記のようにアビジン以
外にもプロテインＡ、アミノグリカン、またはポリペプ
チド等が使用される。光ファイバーのコア表面にシアニ
ン色素を固定するために介在する化合物として、アビジ
ンの場合にはビオチンが使用されるように、使用する親
水性多官能基高分子と特異的に結合する化合物が選択さ
れる。具体的は、アビジンとビオチン、プロテインＡと
抗体などが好ましく、特にアビジンとビオチンの組み合
わせが最適である。

【００１８】尚、本発明の測定方法における別の態様と
して、シアニン色素修飾アビジンを免疫反応後に反応さ
せて免疫複合体に結合させることにより、シアニン色素
の加水分解や酸化に伴う蛍光強度の低下を防止すること
ができる。即ち、予め光ファイバーのコア表面−抗体−
生理活性物質−抗体−アミノグリカン−ビオチンからな
る免疫複合体を形成させ、これにシアニン色素修飾アビ
ジンを反応させることにより、前記と同様に光ファイバ
ーのコア表面にシアニン色素を固定することができ、前
記と同様にして蛍光を測定する。

【００１９】本発明の免疫測定方法は、前記のように蛍
光免疫測定において、本発明の蛍光標識試薬を用い、７
５０〜８５０ｎｍの半導体レーザを励起光源とすること
に特徴を有するものであって、免疫測定の各手順は特に
限定されるものではなく、公知の方法をそのまま適用す
ることができる。また、前記の説明では光ファイバーの
コア表面上に生理活性物質を抗体でサンドイッチ状に結
合させてシアニン色素を固定する態様を示したが、測定
試料である生理活性物質と本発明の蛍光標識試薬とを競
合させて、光ファイバー表面に結合した抗原あるいは抗
体と結合させて光ファイバーのコア表面上にシアニン色
素を固定する方法であってもよい。

【００２０】本発明の蛍光免疫測定キットには、次のよ
うな２つの態様がある。 （１）第１の態様 本発明の蛍光免疫測定キットの第１の態様としては、前
記のようなシアニン色素により標識された親水性多官能
基高分子と、該親水性多官能基高分子と直接的または間
接的に結合する生理活性物質よりなるものである。ここ
でいう生理活性物質とは、測定対象としての生理活性物
質ではなく、測定対象となる抗原、抗体等に対して特異
的に結合する抗体、抗原等を意味する。即ち、シアニン
色素により標識された親水性多官能基高分子としては、
前記のような例えばシアニン色素修飾アビジン（アビジ
ン−シアニン色素）やシアニン色素により修飾されたプ
ロテインＡ、シアニン色素により修飾されたアミノグリ
カン、またはシアニン色素により修飾されたポリペプチ
ド等が挙げられる。

【００２１】一方、親水性多官能基高分子と直接的また
は間接的に結合する生理活性物質としては、例えば測定
対象となる抗原に対して特異的な結合能を有する生理活
性物質（例えば、抗体）の結合したビオチン化アミノグ
リカン（抗体−アミノグリカン−ビオチン）が親水性多
官能基高分子に間接的に結合する場合として例示され
る。この場合、生理活性物質である抗体は、親水性多官
能基高分子であるアビジンとアミノグリカン−ビオチン
を介して間接的に結合する。また、親水性多官能基高分
子に直接的に結合する場合としては、例えばシアニン色
素修飾アミノグリカン（アミノグリカン−シアニン色
素）、またはシアニン色素修飾ポリペプチド（ポリペプ
チド−シアニン色素）等が測定対象となる抗原や抗体に
対して特異的な結合能を有する生理活性物質（例えば、
抗体や抗原）と直接的に結合する態様が挙げられる。

【００２２】（２）第２の態様 本発明の蛍光免疫測定キットの第２の態様としては、前
記のようなシアニン色素により直接的またはアミノグリ
カン及び／又はポリペプチドを介して間接的に標識され
たアビジン及び／又はプロテインＡよりなる結合体（結
合体ａ）、およびビオチン及び／又は免疫グロブリンが
直接的またはアミノグリカン及び／又はポリペプチドを
介して間接的に生理活性物質に結合した結合体（結合体
ｂ）より構成されるものである。例えば、結合体ａとし
ては、アビジン−シアニン色素、プロテインＡ−シアニ
ン色素、アビジン−アミノグリカン−シアニン色素、プ
ロテインＡ−アミノグリカン−シアニン色素等の種々の
例が挙げられる。また、結合体ｂとしてはビオチン−生
理活性物質、免疫グロブリン−生理活性物質、ビオチン
−アミノグリカン−生理活性物質、免疫グロブリン−ア
ミノグリカン−生理活性物質等の種々の例が挙げられ
る。

【００２３】なお、本発明において用いる光ファイバー
は、樹脂製光ファイバーが用いられる。樹脂製光ファイ
バーを構成する樹脂としては、特に限定されるものでは
ないが、免疫物質を吸着しない材質で透光性のよいもの
であることが必要であり、例えば、ポリスチレン、ポリ
アクリル酸エステル、ポリエステル、ポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリカーボネート、あるいはこれらの共重合体等が
挙げられる。なかでもポリアクリル酸エステルが好まし
い。ポリアクリル酸エステルは、アクリル樹脂のうちエ
ステル構造を有するものであって、例えば、アクリル
酸、メタクリル酸などのエステル誘導体の重合体からな
る合成樹脂であり、具体的にはアクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、メタクリル酸メチルなどの重合体が挙げ
られる。これらのポリアクリル酸エステルのうち、本発
明において特に好適に用いられるものは、ポリメタクリ
ル酸メチルである。これはポリメタクリル酸メチルが他
の樹脂に比べ、特に透光性がよいからである。また、本
発明において用いられる樹脂製光ファイバーは、例え
ば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル
酸メチルなどのモノマーとスチレンなどのモノマーとの
共重合体であってもよい。

【００２４】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。なお、実施例で使用
する色素Ａ〜色素Ｈは、表１および表２に示す化学構造
式を有するものである。但し、色素Ｃ、色素Ｆを用いる
例は参考例である。

【００２５】実施例１ （１）２．５ｍｇのＮＫ３６２５（色素Ａ）をエタノー
ル：トリエチルアミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かし
た。 （２）アビジン１ｍｇを５００μｌの水に溶かして、前
記（１）の溶液に加え、攪拌し、さらにジシクロヘキシ
ルカルボジイミド０．３ｍｌを加えて、一晩放置した。

【００２６】（３）前記（２）の溶液を限外濾過を用い
て、エタノール：トリエチルアミン混合液で３〜４回洗
浄して未反応色素を除去した。 （４）得た沈殿を２０ｍＭ酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．
５〜６）に懸濁し、「ＮＫ３６２５修飾アビジン」（以
下、Ｆ₁ アビジンと略す。）とした。

【００２７】（５）別途、ウサギ由来抗ヒト膵アミラー
ゼ抗体（以下、ＲＨＡＡｂと略す）を光ファイバーに固
定し、これとヒト膵アミラーゼ（以下、ＨＡと略す）を
特異的に反応させて、「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ
抗体＋ヒト膵アミラーゼ」（以下、ＲＨＡＡｂ−ＨＡと
略す）とした。 （６）また多数のアミノ基をビオチン化したキトサン
（以下、Ｂ−Ｃと略す）に、ヒツジ由来抗ヒト膵アミラ
ーゼ抗体（以下、ＳＨＡＡｂと略す）を結合させ、「ビ
オチン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗
体」（以下、Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂと略す）とした。

【００２８】（７）さらに前記（４）のＦ₁ アビジンと
前記（６）のＢ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを反応させて、「ＮＫ
３６２５修飾アビジン＋ビオチン化キトサン＋ヒツジ由
来抗ヒト膵アミラーゼ抗体」（以下、Ｆ₁ アビジン−Ｂ
−Ｃ−ＳＨＡＡｂと略す）とした。 （８）前記（５）のＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（７）のＦ
₁ アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを特異的に反応させ、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋ＮＫ３６２５修飾アビジン」として、それを７
８０ｎｍＬＤ（３０ｍＷ）で励起させ、その蛍光を測定
した結果、ヒト膵アミラーゼは１．２×１０^-4ｍｇ／ｍ
ｌで検出でき、７８０ｎｍＬＤの素子は１０φ×１０
で、低価格になり、装置としても小型化低価格化が実現
できた。

【００２９】比較例１ （１）２．０ｍｇのＮＫ１１６０（下記の化学構造式を
有するシアニン系の色素、日本感光色素研究所製）をエ
タノール：トリエチルアミン＝４：１混合液１ｍｌに溶
かした。

【００３０】

【化５】

【００３１】（２）実施例１の（２）〜（４）と同様の
操作を行い、「ＮＫ１１６０修飾アビジン」（以下Ｆ^,
アビジンと略す）を作った。

【００３２】（３）実施例１の（５）〜（６）と同様に
反応させ、さらに前記（２）のＦ^, アビジンと実施例１
のＢ−Ｃ−ＳＨＡＡｂとを反応させ、「ＮＫ１１６０修
飾アビジン＋ビオチン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵
アミラーゼ抗体」（以下、Ｆ^,アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨ
ＡＡｂと略す）とした。 （４）実施例１のＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（３）のＦ^,
アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを特異的に反応させて、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋Ｆ^, アビジン」とし、これをＨｅ−Ｎｅレーザ
（６３３ｎｍ）で励起させ、その蛍光を測定したとこ
ろ、ヒト膵アミラーゼは１．９×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検
出できたが、Ｈｅ−Ｎｅレーザは３０ｍＷのもので長さ
約１ｍで、高価格であるため、装置は大型で高価なもの
となってしまった。

【００３３】実施例２ （１）３．０ｍｇの色素Ｄをエタノール：トリエチルア
ミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かした。 （２）実施例１の（２）〜（３）と同様の操作を行っ
た。 （３）得た沈殿を２０ｍＭ酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）
に懸濁して、「色素Ｄ修飾アビジン」（Ｆ₂ アビジン）
とした。

【００３４】（４）実施例１の（５）〜（６）と同様に
し、さらに前記（３）で作成したＦ₂アビジンと実施例
１のＢ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを反応させ、「色素Ｄ修飾アビ
ジン＋ビオチン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラ
ーゼ抗体」（以下、Ｆ₂ アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂ
と略す）とした。 （５）実施例１のＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（４）のＦ₂
アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを特異的に反応させ、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋Ｆ₂ アビジン」として、それを８１０ｎｍＬＤ
（３０ｍＷ）で励起させ、その蛍光を測定したところ、
ヒト膵アミラーゼは１．５×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出で
き、８１０ｎｍＬＤ素子は、１０φ×１０で低価格にな
り、装置としても小型化、低価格化が実現できた。

【００３５】実施例３ （１）２．５ｍｇのＮＫ３７９２（色素Ｂ）をエタノー
ル：トリエチルアミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かし
た。 （２）実施例１の（２）〜（３）と同様の操作を行っ
た。 （３）得た沈殿を２０ｍＭ酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．
５）に懸濁し、「ＮＫ３７９２修飾アビジン」（以下、
Ｆ₃ アビジンと略す）とした。

【００３６】（４）ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（以下、
ｈＣＧと略す）と光ファイバーに固定したウサギ由来抗
ｈＣＧ抗体（以下、ＲｈＣＧＡｂと略す）を特異的に反
応させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ抗体＋ｈＣＧ」（以下、
ＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧと略す）とした。 （５）また多数のアミノ基をビオチン化したポリガラク
トサミン（以下、Ｂ−ｐＧと略す）に、ヤギ由来抗ｈＣ
Ｇ抗体（以下、ＧｈＣＧＡｂと略す）を結合させ、「ビ
オチン化ポリガラクトサミン＋ヤギ由来抗ｈＣＧ抗体」
（以下、Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂと略す）とした。

【００３７】（６）さらに前記（３）のＦ₃ アビジンと
前記（５）のＢ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂを反応させて、
「ＮＫ３７９２修飾アビジン＋ビオチン化ポリガラクト
サミン＋ヤギ由来抗ｈＣＧ抗体」（以下、Ｆ₃ アビジン
＋Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂと略す）とした。 （７）前記（４）のＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧと前記（６）
のＦ₃ アビジン＋Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂを特異的に反
応させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ抗体＋ｈＣＧ＋ヤギ由来
抗ｈＣＧ抗体＋ビオチン化ポリガラクトサミン＋ＮＫ３
７９２修飾アビジン」とした。これを８１０ｎｍＬＤで
励起させ、その蛍光を測定した結果、ｈＣＧは２．０×
１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、８１０ｎｍＬＤ素子は１
０φ×１０で低価格となり、小型化低価格化が実現でき
た。

【００３８】実施例４ （１）２ｍｇの色素Ｅをエタノール：トリエチルアミン
＝４：１混合液１ｍｌに溶かした。 （２）実施例１の（２）〜（３）と同様な操作を行い、
得た沈殿を２０ｍＭ酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５〜
６）に懸濁し、「色素Ｅ修飾アビジン」（以下、Ｆ₄ ア
ビジンと略す）とした。

【００３９】（３）実施例３の（６）〜（７）と同様の
操作をし、さらにＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧとＢ−ｐＧ−Ｇ
ｈＣＧＡｂを特異的に反応させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ
抗体＋ｈＣＧ＋ビオチン化ポリガラクトサミン＋ヤギ由
来抗ｈＣＧ抗体」（以下、ＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧ−Ｂ−
ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂと略す）とした。 （４）さらに前記（２）のＦ₄ アビジンと前記（３）の
ＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧ−Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂを反応
させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ抗体＋ｈＣＧ＋ヤギ由来抗
ｈＣＧ抗体＋ビオチン化ポリガラクトサミン＋色素Ｅ修
飾アビジン」とし、これを８１０ｎｍＬＤで励起させ、
その蛍光を測定した結果、ｈＣＧは２．３×１０^-4ｍｇ
／ｍｌで検出でき、８１０ｎｍＬＤ素子は１０φ×１０
で低価格となり、小型化低価格化が実現できた。

【００４０】実施例５ （１）３．０ｍｇのＮＫ２９６８（色素Ｃ）をエタノー
ル：トリエチルアミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かし
た。 （２）アビジン２ｍｇを５００μｌの水に溶かして、前
記（１）の溶液に加え、さらにジシクロヘキシルカルボ
ジイミド０．２ｍｌを加えて、一晩放置した。 （３）実施例１の（３）まで同様の操作を行い、得た沈
殿を２０ｍＭ酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５〜６）に懸
濁し、「ＮＫ２９６８修飾アビジン」（以下、Ｆ₅ アビ
ジンと略す）を作成した。

【００４１】（４）ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体
（以下、ＧＨＣＡｂと略す）を光ファイバーに固定し、
これとヒトカルシトニン（以下、ＨＣと略す）を特異的
に反応させて、「ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ヒ
トカルシトニン」（以下、ＧＨＣＡｂ−ＨＣと略す）と
した。 （５）また多数のアミノ基をビオチン化したポリノイラ
ミン酸（以下、Ｂ−ｐＮと略す）に、ウサギ由来抗ヒト
カルシトニン抗体を結合させ、「ウサギ由来抗ヒトカル
シトニン抗体＋ビオチン化ポリノイラミン酸」（以下、
ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮと略す）とし、前記（４）のＧＨ
ＣＡｂ−ＨＣを特異的に反応させ、「ヤギ由来抗ヒトカ
ルシトニン抗体＋ヒトカルシトニン＋ウサギ由来抗ヒト
カルシトニン抗体＋ビオチン化ポリノイラミン酸」（以
下、ＧＨＣＡｂ−ＨＣ−ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮと略す）
とした。

【００４２】（６）さらに前記（３）のＦ₅ アビジンと
前記（５）のＧＨＣＡｂ−ＨＣ−ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮ
を反応させ、「ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ヒト
カルシトニン＋ウサギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ビ
オチン化ポリノイラミン酸＋ＮＫ２９６８修飾アビジ
ン」とし、これを８１０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光
を測定したところ、ヒトカルシトニンは、４．３×１０
^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、８１０ｎｍＬＤ素子は１０φ
×１０で低価格となり、小型化低価格化が実現できた。

【００４３】実施例６ （１）２．５ｍｇの色素Ｆをエタノール：トリエチルア
ミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かした。 （２）実施例１の（２）〜（４）と同様の操作を行い、
「色素Ｆ修飾アビジン」（以下、Ｆ₆ アビジンと略す）
を作成した。 （３）ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）と光ファイバ
ーに固定したヤギ由来抗ｈＦＳＨ抗体（以下、ＧｈＦＳ
ＨＡｂと略す）を特異的に反応させ、「ヤギ由来抗ｈＦ
ＳＨ抗体＋ｈＦＳＨ」（以下、ＧｈＦＳＨＡｂ−ｈＦＳ
Ｈと略す）とした。

【００４４】（４）また多数のアミノ基をビオチン化し
たキトサン（Ｂ−Ｃ）にウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体（以
下、ＲｈＦＳＨＡｂと略す）を結合させ、「ビオチン化
キトサン＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体」（以下、Ｂ−Ｃ
−ＲｈＦＳＨＡｂと略す）とした。 （５）さらに前記（２）のＦ₆ アビジンと前記（４）の
Ｂ−Ｃ−ＲｈＦＳＨＡｂを反応させて、「色素Ｆ修飾ア
ビジン＋ビオチン化キトサン＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗
体」（以下、ＲｈＦＳＨＡｂ−Ｂ−Ｃ−Ｆ₆ アビジンと
略す）とした。

【００４５】（６）前記（３）のＧｈＦＳＨＡｂ−ｈＦ
ＳＨと前記（５）のＲｈＦＳＨＡｂ−Ｂ−Ｃ−Ｆ₆ アビ
ジンを特異的に反応させて、「ヤギ由来抗ｈＦＳＨ抗体
＋ｈＦＳＨ＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋色素Ｆ修飾アビジン」とし、これを８３０ｎｍ
ＬＤで励起させ、その蛍光を測定した結果、ｈＦＳＨは
５．２×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、８３０ｎｍＬＤ
は１０φ×１０で低価格となり、小型化低価格化が実現
できた。

【００４６】実施例７ （１）２ｍｇの色素Ｇをエタノール：トリエチルアミン
＝４：１混合液１ｍｌに溶かした。 （２）実施例１の（２）〜（４）と同様の操作を行い、
「色素Ｇ修飾アビジン」（以下、Ｆ₇ アビジンと略す）
とした。

【００４７】（３）実施例１の（５）〜（６）と同様に
反応させ、さらに前記（２）のＦ₇ アビジンとＢ−Ｃ−
ＧＨＡＡｂを反応させて、「色素Ｇ修飾アビジン＋ビオ
チン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体」
（以下、ＳＨＡＡｂ−Ｂ−Ｃ−Ｆ₇ アビジンと略す）と
した。 （４）ＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（３）のＳＨＡＡｂ−Ｂ
−Ｃ−Ｆ₇ アビジンを特異的に反応させて、「ウサギ由
来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラーゼ＋ヒツジ
由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キトサン＋色
素Ｇ修飾アビジン」とし、それを８１０ｎｍＬＤで励起
させ、その蛍光を測定した結果、ヒト膵アミラーゼは
２．３×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、８１０ｎｍＬＤ
の素子は１０φ×１０で低価格であり、小型化低価格化
が実現できた。

【００４８】実施例８ （１）２．０ｍｇの色素Ｈをエタノール：トリエチルア
ミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かした。 （２）実施例１の（２）〜（４）と同様の操作を行い、
「色素Ｈ修飾アビジン」（以下、Ｆ₈ アビジンと略す）
を作った。

【００４９】（３）実施例１の（５）〜（６）と同様に
反応させ、これらＲＨＡＡｂ−ＨＡとＳＨＡＡｂ−Ｂ−
Ｃを特異的に反応させ、「ウサギ由来抗ヒト膵アミラー
ゼ抗体＋ヒト膵アミラーゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラ
ーゼ抗体＋ビオチン化キトサン」（以下、ＲＨＡＡｂ−
ＨＡ−ＳＨＡＡｂ−Ｂ−Ｃと略す）とした。 （４）さらに前記（２）のＦ₈ アビジンと前記（３）の
ＲＨＡＡｂ−ＨＡ−ＳＨＡＡｂ−Ｂ−Ｃを反応させて、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋色素Ｈ修飾アビジン」とし、これを８１０ｎｍ
ＬＤで励起させ、その蛍光を測定したところ、ヒト膵ア
ミラーゼは２．３×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、８１
０ｎｍＬＤの素子は１０φ×１０で低価格となり、小型
化低価格化が実現できた。

【００５０】実施例９ （１）２．５ｍｇのＮＫ３７９２（色素Ｂ）をエタノー
ル１ｍｌに溶解した。 （２）キトサン１ｍｇを０．５ｍｌの水に溶解し、前記
（１）の溶液に加え、攪拌し、さらにジシクロヘキシル
カルボジイミド０．３ｍｌを加えて、一晩放置した。 （３）前記（２）の溶液を限外濾過を用いて、エタノー
ルで３〜４回洗浄し、未反応色素を除去し、ＮＫ３７９
２が結合したキトサン（以下、３７９２キトサンと略
す。）を得た。

【００５１】（４）得た３７９２キトサンをエタノール
１ｍｌに懸濁し、０．５ｍｌのプロテインＡ水溶液（濃
度２ｍｇ／ｍｌ）と混合、さらにジシクロヘキシルカル
ボジイミド０．３ｍｌを加えて、攪拌しながら一晩放置
した。 （５）前記（４）の溶液を限外濾過を用いて、ＰＢＳで
３〜４回洗浄し、未反応プロテインＡを除去し、プロテ
インＡと３７９２キトサンの結合体（以下、ＰｒＡ−３
７９２キトサンと略す。）を得た。

【００５２】（６）得たＰｒＡ−３７９２キトサンをＰ
ＢＳ１ｍｌに懸濁し、１ｍｌのウサギ由来のＣ反応性タ
ンパク質（以下、ＣＲＰと略す。）に対する免疫グロブ
リンＧ（以下、ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧと略す。）水
溶液（濃度５ｍｇ／ｍｌ）と混合、攪拌しながら、一晩
放置した。 （７）前記（６）の溶液を限外濾過を用いて、ＰＢＳで
３〜４回洗浄し、未反応ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧを除
去し、ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧをＰｒＡ−３７９２キ
トサンの結合体（以下、抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ−３７
９２キトサンと略す。）を得、ＰＢＳに懸濁、溶解する
ことにより、抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ−３７９２キトサ
ン溶液とした。

【００５３】（８）別途、マウス由来抗ＣＲＰモノクロ
ーナル抗体を光ファイバーに固定し、これとＣＲＰを特
異的に反応させて、光ファイバー上にマウス由来抗ＣＲ
Ｐモノクローナル抗体−ＣＲＰの複合体（以下、抗ＣＲ
Ｐ−ＣＲＰ複合体と略す。）を形成した。 （９）前記（８）の抗ＣＲＰ−ＣＲＰ複合体を固定化し
た光ファイバーを前記（７）の抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ
−３７９２キトサン溶液に浸漬、特異的に反応させ、光
ファイバー上に、抗ＣＲＰ−ＣＲＰ複合体と抗ＣＲＰＩ
ｇＧ−ＰｒＡ−３７９２キトサンの結合体を形成し、こ
れを８１０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光を測定した結
果、ＣＲＰは、２．５×１０^-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、
８１０ｎｍＬＤ素子は１０φ×１０で低価格となり、小
型化低価格化が実現できた。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、特定のシアニン色素に
より標識された蛍光標識試薬を用いることにより、蛍光
免疫測定において赤外域の半導体レーザを励起光源とし
て用いることができる。従って、高感度で、低価格の免
疫測定が可能となり、測定装置の小型化、低価格化が実
現できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−287266（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−40097（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−126833（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−238126（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−66725（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501873（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／13029（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/533 G01N 21/64 G01N 21/78

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１）、（２) 又は（３) により
   表されるシアニン色素により標識された親水性多官能基
   高分子よりなる蛍光標識試薬。 【化１】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
   Ｃ（ＣＨ₃ ）₂ を表し、ｎは０〜３、ｍは０〜２の整数
   を示す。）
2. 【請求項２】 親水性多官能基高分子がアビジン、プロ
   テインＡ、アミノグリカン、またはポリペプチドである
   請求項１記載の蛍光標識試薬。
3. 【請求項３】 蛍光免疫測定において、請求項１または
   ２記載の蛍光標識試薬を用い、７５０〜８５０ｎｍの半
   導体レーザを励起光源とすることを特徴とする蛍光免疫
   測定法。
4. 【請求項４】 蛍光色素により標識された親水性多官能
   基高分子と、該親水性多官能基高分子と直接的または間
   接的に結合する生理活性物質よりなる蛍光免疫測定キッ
   トにおいて、該蛍光色素が一般式（１）、（２) 又は
   （３) により表されるシアニン色素であることを特徴と
   する蛍光免疫測定キット。 【化２】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
   Ｃ（ＣＨ₃ ）₂ を表し、ｎは０〜３、ｍは０〜２の整数
   を示す。）
5. 【請求項５】 一般式（１）、（２) 又は（３) により
   表される蛍光色素により直接的またはアミノグリカン及
   び／又はポリペプチドを介して間接的に標識されたアビ
   ジン及び／又はプロテインＡよりなる結合体、およびビ
   オチン及び／又は免疫グロブリンが直接的またはアミノ
   グリカン及び／又はポリペプチドを介して間接的に生理
   活性物質に結合した結合体より構成されることを特徴と
   する蛍光免疫測定キット。 【化３】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
   Ｃ（ＣＨ₃ ）₂ を表し、ｎは０〜３、ｍは０〜２の整数
   を示す。）