JP3210315B2 - プロテアーゼ欠損 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
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-
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は所望のポリペプチド（本明細書で使用される
“ポリペプチド”はタンパク質を含む任意の有益なアミ
ノ酸鎖を意味する）の発現および分泌に有益なバシラス
（Bacillus）株に関する。
“ポリペプチド”はタンパク質を含む任意の有益なアミ
ノ酸鎖を意味する）の発現および分泌に有益なバシラス
（Bacillus）株に関する。
従来の技術 バシラス（Bacillus）は遺伝子工学によるベクターか
らの異種ポリペプチドを発現する為の宿主として用いら
れてきた。バシラス（Bacillus）のごときグラム陽性宿
主の使用により、大腸菌のごときグラム陰性菌中での異
種遺伝子の発現に付随するいくつかの問題が避けられ
る。例えば、グラム陰性菌は所望の生成物から分離する
のが困難な内毒素を産生する。さらに大腸菌のごときグ
ラム陰性菌は異種生成物の分泌に容易には適応せず、細
胞内に隔離された生成物の回収には多くの時間を要し、
長たらしく、潜在的に問題が多い。それに加え、バシラ
ス（Bacillus）株は非病原性であり、十分に特性付けら
れた機構によりタンパク質を分泌できる。
らの異種ポリペプチドを発現する為の宿主として用いら
れてきた。バシラス（Bacillus）のごときグラム陽性宿
主の使用により、大腸菌のごときグラム陰性菌中での異
種遺伝子の発現に付随するいくつかの問題が避けられ
る。例えば、グラム陰性菌は所望の生成物から分離する
のが困難な内毒素を産生する。さらに大腸菌のごときグ
ラム陰性菌は異種生成物の分泌に容易には適応せず、細
胞内に隔離された生成物の回収には多くの時間を要し、
長たらしく、潜在的に問題が多い。それに加え、バシラ
ス（Bacillus）株は非病原性であり、十分に特性付けら
れた機構によりタンパク質を分泌できる。
発現系にバシラス（Bacillus）宿主株を使用する際の
一般的問題点は培養培地から異種ポリペプチドを回収す
る前にそれを分解する多量のプロテアーゼを産生する事
である。このタンパク質分解活性の大多数の原因となる
プロテアーゼは栄養欠乏条件下（細胞が胞子形成の準備
をするような）指数増殖期の終りに産生される。２つの
主たる細胞外プロテアーゼ、apr遺伝子の生成物である
アルカリセリンプロテアーゼ（ズブチリシン）およびnp
r遺伝子の生成物である中性メタロプロテアーゼは培地
中に分泌されるが、主たる細胞内セリンプロテアーゼ
（Isp−１）は細胞内に産生される。これらの３つのプ
ロテアーゼの１つまたはそれ以上のレベルが正常より低
い遺伝的に異なったバシラス（Bacillus）株が作り出さ
れたが、しかしこれらの株においても精製に先立って異
種遺伝子産物の分解を起こす十分に高いレベルのプロテ
アーゼを産生する。
一般的問題点は培養培地から異種ポリペプチドを回収す
る前にそれを分解する多量のプロテアーゼを産生する事
である。このタンパク質分解活性の大多数の原因となる
プロテアーゼは栄養欠乏条件下（細胞が胞子形成の準備
をするような）指数増殖期の終りに産生される。２つの
主たる細胞外プロテアーゼ、apr遺伝子の生成物である
アルカリセリンプロテアーゼ（ズブチリシン）およびnp
r遺伝子の生成物である中性メタロプロテアーゼは培地
中に分泌されるが、主たる細胞内セリンプロテアーゼ
（Isp−１）は細胞内に産生される。これらの３つのプ
ロテアーゼの１つまたはそれ以上のレベルが正常より低
い遺伝的に異なったバシラス（Bacillus）株が作り出さ
れたが、しかしこれらの株においても精製に先立って異
種遺伝子産物の分解を起こす十分に高いレベルのプロテ
アーゼを産生する。
Stahlら（ジャーナル オブ バクテリオロジー、198
4,150:411）は、染色体のズブチリシン構造遺伝子がイ
ン ビトロで誘導された欠失突然変異により置き換えら
れたバシラス（Bacillus）プロテアーゼ突然変異体につ
いて記載している。この突然変異を運ぶ株は細胞外セリ
ンプロテアーゼ活性が野生株の10％のみである。Yangら
は（ジャーナル オブ バクテリオロジー,1984,160:1
5）染色体の天然プロテアーゼ遺伝子がイン ビトロで
誘導された欠失突然変異を持つ遺伝子に置き換えられた
バシラス（Bacillus）プロテアーゼ突然変異体について
記載している。Fahnestockらは（WO86/01825）天然染色
体遺伝子配列を不活性化セグメント挿入物をその中に持
つ部分的相同DNA配列で置換して構築されたズブチリシ
ン活性が欠除したバシラス（Bacillus）株について記載
している。Kawamuraらは（ジャーナル オブ バクテリ
オロジー,1984,160:442）nprおよびapr遺伝子中に障害
を運び、野生株の４％未満の細胞外プロテアーゼ活性の
レベルしか発現しないバシラス（Bacillus）株について
記載している。Koideらは（ジャーナル オブ バクテ
リオロジー,1986,167:110）isp−１遺伝子のクローニン
グおよび配列決定および人工的欠失遺伝子の染色体組込
みによるisp−１陰性突然変異体について記載してい
る。
4,150:411）は、染色体のズブチリシン構造遺伝子がイ
ン ビトロで誘導された欠失突然変異により置き換えら
れたバシラス（Bacillus）プロテアーゼ突然変異体につ
いて記載している。この突然変異を運ぶ株は細胞外セリ
ンプロテアーゼ活性が野生株の10％のみである。Yangら
は（ジャーナル オブ バクテリオロジー,1984,160:1
5）染色体の天然プロテアーゼ遺伝子がイン ビトロで
誘導された欠失突然変異を持つ遺伝子に置き換えられた
バシラス（Bacillus）プロテアーゼ突然変異体について
記載している。Fahnestockらは（WO86/01825）天然染色
体遺伝子配列を不活性化セグメント挿入物をその中に持
つ部分的相同DNA配列で置換して構築されたズブチリシ
ン活性が欠除したバシラス（Bacillus）株について記載
している。Kawamuraらは（ジャーナル オブ バクテリ
オロジー,1984,160:442）nprおよびapr遺伝子中に障害
を運び、野生株の４％未満の細胞外プロテアーゼ活性の
レベルしか発現しないバシラス（Bacillus）株について
記載している。Koideらは（ジャーナル オブ バクテ
リオロジー,1986,167:110）isp−１遺伝子のクローニン
グおよび配列決定および人工的欠失遺伝子の染色体組込
みによるisp−１陰性突然変異体について記載してい
る。
細胞外プロテアーゼ遺伝子（aprおよびnpr）が欠失し
た遺伝学的に改造された株は野生型バシラス（Bacillu
s）株が行うよりも有意に低いレベルのプロテアーゼ活
性を産生する。プロテアーゼ基質を含む培地上で増殖せ
しめた場合、これらの細菌はタンパク質分解活性がごく
わずかかまたは全くないことを示し、コロニーのまわり
の除去圏（かさ）の出現がないことで測定される。これ
らの二重の突然変異体から産生されるいくつかの異種ポ
リペプチドおよびタンパク質はバシラス（Bacillus）の
野生型株で産生された場合より安定であるが、それにも
かかわらず精製に先立って本質的には分解される。
た遺伝学的に改造された株は野生型バシラス（Bacillu
s）株が行うよりも有意に低いレベルのプロテアーゼ活
性を産生する。プロテアーゼ基質を含む培地上で増殖せ
しめた場合、これらの細菌はタンパク質分解活性がごく
わずかかまたは全くないことを示し、コロニーのまわり
の除去圏（かさ）の出現がないことで測定される。これ
らの二重の突然変異体から産生されるいくつかの異種ポ
リペプチドおよびタンパク質はバシラス（Bacillus）の
野生型株で産生された場合より安定であるが、それにも
かかわらず精製に先立って本質的には分解される。
発明が解決しようとする課題および課題を解決するため
の手段 本発明はまだ特性付けられていない３つのプロテアー
ゼ遺伝子の１つまたはそれ以上に突然変異を含む改良さ
れたバシラス（Bacillus）細胞を提供し；細胞はまた好
適には主たる細胞外プロテアーゼをコードしているapr
およびnpr遺伝子中にも突然変異を含み、その結果これ
らの細胞外プロテアーゼの細胞による産生を阻止する。
本発明の突然変異は、タンパク質分解活性epr遺伝子産
物の細胞による産生を阻害するepr遺伝子中の突然変
異、タンパク質分解活性残余プロテアーゼＩ（RP−Ｉ）
の細胞による産生を阻害するRP−Ｉをコードしている遺
伝子（ここでは“RP−I"遺伝子）中の突然変異、および
残余プロテアーゼII（RP−II）をコードしている遺伝子
（ここでは、“RP−II"遺伝子）中の突然変異を含んで
いる。epr遺伝子およびRP−II遺伝子でコードされてい
るプロテアーゼは新規タンパク質である。最も好適に
は、本発明の突然変異は遺伝子のコードしている領域内
の欠失であり、全部のコード領域の欠失を含んでおり；
もしくは、突然変異はプロテアーゼコード領域内の天然
に存在する塩基対の１つまたはそれ以上の塩基対の置換
または挿入から成っている。
の手段 本発明はまだ特性付けられていない３つのプロテアー
ゼ遺伝子の１つまたはそれ以上に突然変異を含む改良さ
れたバシラス（Bacillus）細胞を提供し；細胞はまた好
適には主たる細胞外プロテアーゼをコードしているapr
およびnpr遺伝子中にも突然変異を含み、その結果これ
らの細胞外プロテアーゼの細胞による産生を阻止する。
本発明の突然変異は、タンパク質分解活性epr遺伝子産
物の細胞による産生を阻害するepr遺伝子中の突然変
異、タンパク質分解活性残余プロテアーゼＩ（RP−Ｉ）
の細胞による産生を阻害するRP−Ｉをコードしている遺
伝子（ここでは“RP−I"遺伝子）中の突然変異、および
残余プロテアーゼII（RP−II）をコードしている遺伝子
（ここでは、“RP−II"遺伝子）中の突然変異を含んで
いる。epr遺伝子およびRP−II遺伝子でコードされてい
るプロテアーゼは新規タンパク質である。最も好適に
は、本発明の突然変異は遺伝子のコードしている領域内
の欠失であり、全部のコード領域の欠失を含んでおり；
もしくは、突然変異はプロテアーゼコード領域内の天然
に存在する塩基対の１つまたはそれ以上の塩基対の置換
または挿入から成っている。
本発明のバシラス（Bacillus）細胞はまた細胞内セリ
ンプロテアーゼＩをコードしているisp−１遺伝子中の
突然変異を含み、およびさらに胞子形成を阻止する突然
変異を含むであろうし、それにより胞子形成−依存性プ
ロテアーゼを産生する細胞の能力を減少させる；好適に
はこの突然変異は初期段階で胞子形成を阻止するが、精
製DNAにより形質転換される細胞の能力を除去するもの
ではなく；最も好適にはこの突然変異はspoOA突然変異
（以下に記載）である。本発明はさらに、aprおよびnpr
遺伝子およびepr遺伝子、RP−Ｉ遺伝子およびRP−II遺
伝子からなる遺伝子群の１つまたはそれ以上の遺伝子中
に突然変異を含むように宿主を改良することによりバシ
ラス（Bacillus）属宿主細胞中の安定な異種ポリペプチ
ドの産生のための方法を提供する。
ンプロテアーゼＩをコードしているisp−１遺伝子中の
突然変異を含み、およびさらに胞子形成を阻止する突然
変異を含むであろうし、それにより胞子形成−依存性プ
ロテアーゼを産生する細胞の能力を減少させる；好適に
はこの突然変異は初期段階で胞子形成を阻止するが、精
製DNAにより形質転換される細胞の能力を除去するもの
ではなく；最も好適にはこの突然変異はspoOA突然変異
（以下に記載）である。本発明はさらに、aprおよびnpr
遺伝子およびepr遺伝子、RP−Ｉ遺伝子およびRP−II遺
伝子からなる遺伝子群の１つまたはそれ以上の遺伝子中
に突然変異を含むように宿主を改良することによりバシ
ラス（Bacillus）属宿主細胞中の安定な異種ポリペプチ
ドの産生のための方法を提供する。
本発明はまた精製DNA,DNAを含む発現ベクターおよび
任意のプロテアーゼRP−I,RP−IIまたはepr遺伝子産生
物をコードしているDNAで形質転換された宿主バシラス
（Bacillus）細胞を特色とし；好適にはそのようなDNA
は枯草菌から誘導される。
任意のプロテアーゼRP−I,RP−IIまたはepr遺伝子産生
物をコードしているDNAで形質転換された宿主バシラス
（Bacillus）細胞を特色とし；好適にはそのようなDNA
は枯草菌から誘導される。
本発明はまた実質的に純粋なEpr、残余プロテアーゼ
Ｉ（RP−Ｉ）および残余プロテアーゼII（RP−II）と称
されるまだ特徴付けられていない他のプロテアーゼの分
離およびRP−ＩおよびRP−IIプロテアーゼの特徴付けを
特色とする；ここでは“実質的に純粋”とは重量で90％
を超えて純粋なことを意味する。
Ｉ（RP−Ｉ）および残余プロテアーゼII（RP−II）と称
されるまだ特徴付けられていない他のプロテアーゼの分
離およびRP−ＩおよびRP−IIプロテアーゼの特徴付けを
特色とする；ここでは“実質的に純粋”とは重量で90％
を超えて純粋なことを意味する。
術語“epr遺伝子”、“RP−Ｉ遺伝子”および“RP−I
I遺伝子”はここでは枯草菌中でのこれらの呼称に対応
している各々の遺伝子を意味し、他のバシラス（Bacill
us）種中のこれらの遺伝子の進化的相同性は（他のバシ
ラス（Bacillus）タンパク質の場合のごとく相同であ
り）種と種の間で重要でない点で変化していると予想で
きる。枯草菌のRP−ＩおよびRP−II遺伝子はまた各々bp
rおよびmpr遺伝子とも称されている。多くの場合、進化
相同体間の配列相同性は十分によく、そのため１つの種
から誘導された遺伝子は常法により、他の種からの進化
相同体を得るためのハイブリダイゼーションプローブと
して使用することができる。さらに、これらの術語はま
た、もちろん、遺伝コードの重複性のため、コードする
アミノ酸残基が変化しないような塩基変化がなされてい
る遺伝子も含んでいる。
I遺伝子”はここでは枯草菌中でのこれらの呼称に対応
している各々の遺伝子を意味し、他のバシラス（Bacill
us）種中のこれらの遺伝子の進化的相同性は（他のバシ
ラス（Bacillus）タンパク質の場合のごとく相同であ
り）種と種の間で重要でない点で変化していると予想で
きる。枯草菌のRP−ＩおよびRP−II遺伝子はまた各々bp
rおよびmpr遺伝子とも称されている。多くの場合、進化
相同体間の配列相同性は十分によく、そのため１つの種
から誘導された遺伝子は常法により、他の種からの進化
相同体を得るためのハイブリダイゼーションプローブと
して使用することができる。さらに、これらの術語はま
た、もちろん、遺伝コードの重複性のため、コードする
アミノ酸残基が変化しないような塩基変化がなされてい
る遺伝子も含んでいる。
本明細書に記載された方法を用いると、プロテアーゼ
を産生する能力が著しく減少したバシラス（Bacillus）
株が作られ、それ故、培養培地内へ分泌されうる異種ポ
リペプチドの発現のための（著しい分解なしで）宿主と
して有益である。本発明のバシラス（Bacillus）細胞は
関連する活性をコードしている遺伝子中にいくつかの突
然変異を含んでいるけれど増殖可能であるだけでなく健
全である。
を産生する能力が著しく減少したバシラス（Bacillus）
株が作られ、それ故、培養培地内へ分泌されうる異種ポ
リペプチドの発現のための（著しい分解なしで）宿主と
して有益である。本発明のバシラス（Bacillus）細胞は
関連する活性をコードしている遺伝子中にいくつかの突
然変異を含んでいるけれど増殖可能であるだけでなく健
全である。
本発明に従って任意の望まれるポリペプチドが発現で
きる、例えば、ホルモン、ワクチン、抗ウイルスタンパ
ク質、抗腫瘍タンパク質、抗体または凝固タンパク質の
ごとき医学的に有益なタンパク質；および酵素または殺
虫剤のごとき農業および工業的に有益なタンパク質；お
よび本発明により阻害される１つまたはそれ以上のプロ
テアーゼを含むバシラス（Bacillus）宿主中で不安定な
任意の他のポリペプチド。
きる、例えば、ホルモン、ワクチン、抗ウイルスタンパ
ク質、抗腫瘍タンパク質、抗体または凝固タンパク質の
ごとき医学的に有益なタンパク質；および酵素または殺
虫剤のごとき農業および工業的に有益なタンパク質；お
よび本発明により阻害される１つまたはそれ以上のプロ
テアーゼを含むバシラス（Bacillus）宿主中で不安定な
任意の他のポリペプチド。
本発明の他の特色および利点は以下に記載するその好
適な実施態様の記載および特許請求の範囲から明らかに
なるであろう。
適な実施態様の記載および特許請求の範囲から明らかに
なるであろう。
好適な実施態様 最初に図を簡単に説明する。
図 図１は枯草菌中性プロテアーゼ遺伝子をコードしてい
る2.4kb Hind III挿入物および中性プロテアーゼ遺伝子
中に欠失を持つ同一挿入物を各々含むプラスミドp371お
よびp371Δ、およびバシラス（Bacillus）cat遺伝子を
含むp371ΔCMの一連の図による説明である。
る2.4kb Hind III挿入物および中性プロテアーゼ遺伝子
中に欠失を持つ同一挿入物を各々含むプラスミドp371お
よびp371Δ、およびバシラス（Bacillus）cat遺伝子を
含むp371ΔCMの一連の図による説明である。
図２はnpr遺伝子のヌクレオチド配列の一部に対応す
る32P−標識オリゴヌクレオチドで調べたHind III消化I
S75およびIS75NΔDNAのサザンブロットである。
る32P−標識オリゴヌクレオチドで調べたHind III消化I
S75およびIS75NΔDNAのサザンブロットである。
図３は枯草菌ズブチリシン遺伝子をコードしているプ
ラスミドpAS007の6.5kb挿入物および欠失プラスミドpAS
13の構築の説明である。
ラスミドpAS007の6.5kb挿入物および欠失プラスミドpAS
13の構築の説明である。
図４は細胞内部セリン プロテアーゼISP−１をコー
ドしている2.7kb BamH I挿入物を含むプラスミドpISP−
１、およびISP−１欠失プラスミドpAL6の構築を説明し
ている。
ドしている2.7kb BamH I挿入物を含むプラスミドpISP−
１、およびISP−１欠失プラスミドpAL6の構築を説明し
ている。
図５はクローン化epr遺伝子の図による説明であり、
制限酵素認識部位を示している。
制限酵素認識部位を示している。
図６はepr遺伝子のDNA配列である。
図７は欠失epr遺伝子およびバシラス（Bacillus）cat
遺伝子を含むプラスミドpNP9の構築の図による説明であ
る。
遺伝子を含むプラスミドpNP9の構築の図による説明であ
る。
図８はRP−Ｉの最初の28残基およびRP−Ｉ遺伝子をク
ローン化するのに使用されるプローブの対応するDNA配
列のアミノ酸配列である。
ローン化するのに使用されるプローブの対応するDNA配
列のアミノ酸配列である。
図９はRP−Ｉタンパク質をコードしているプラスミド
pCR83の6.5kbの挿入物の制限地図である。
pCR83の6.5kbの挿入物の制限地図である。
図10はRP−ＩプロテアーゼをコードしているDNAのDNA
配列である。
配列である。
図11は３つの内部RP−IIフラグメント（a,b,c）のア
ミノ酸配列および遺伝子（ａ），（ｂ）および（ｃ）の
クローン化に使用される３つの推測化合物のヌクレオチ
ド配列である。
ミノ酸配列および遺伝子（ａ），（ｂ）および（ｃ）の
クローン化に使用される３つの推測化合物のヌクレオチ
ド配列である。
図12はBRT90および707で調べたGP241染色体DNAのサザ
ン ブロットである。
ン ブロットである。
図13は（ａ）pLPIの3.6kb Pst I挿入物の制限地図、
（ｂ）欠失RP−II遺伝子の構築および（ｃ）バシラス
（Bacillus）染色体の中のRP−II欠失の作成に使用され
たプラスミドの図である。
（ｂ）欠失RP−II遺伝子の構築および（ｃ）バシラス
（Bacillus）染色体の中のRP−II欠失の作成に使用され
たプラスミドの図である。
図14はRP−IIをコードしているDNAのDNA配列である。
プロテアーゼ欠失を作り出す一般的戦略 バシラス（Bacillus）株 実質的にタンパク質分解活性が欠けているバシラス
（Bacillus）株を作り出すのに従った一般的戦略を以下
に概説する。
（Bacillus）株を作り出すのに従った一般的戦略を以下
に概説する。
２つの既知の主な細胞外プロテアーゼ遺伝子（aprお
よびnpr）の欠失突然変異体を最初に構築する。主な細
胞内プロテアーゼをコードしているisp−１遺伝子を続
いて欠失させ３重プロテアーゼ欠失突然変異体を作り出
す。２重かまたは３重欠失突然変異体にspoOA突然変異
を導入し、細胞中に存在する胞子形成依存プロテアーゼ
活性を著しく低下させる。これまで未知のプロテアーゼ
をコードしている遺伝子を単離し、その完全なヌクレオ
チド配列を決定する。遺伝子eprは645アミノ酸の１次生
成物をコードしており、それはズブチリシン（Apr）お
よび枯草菌の主たる内部セリン プロテアーゼ（Isp−
１）の両方と部分的に相同である。この遺伝子の欠失は
イン ビトロで作成され、３重プロテアーゼ欠失宿主内
に導入される。残余プロテアーゼRP−Ｉをコードしてい
る新しく同定された遺伝子中の欠失を続いて導入し、実
質的に減少したプロテアーゼ活性を持ち、RP−II活性の
みを発現する枯草菌の株を作り出す。RP−IIは精製され
ており、このプロテアーゼをコードしている遺伝子のク
ローン化に使用される核酸プローブの作製に使用するた
め、アミノ酸配列の一部が決定されている。遺伝子のク
ローニングにより、RP−II遺伝子が欠失しており、それ
故RP−IIを産生できないバシラス（Bacillus）株を作製
することが可能であった。
よびnpr）の欠失突然変異体を最初に構築する。主な細
胞内プロテアーゼをコードしているisp−１遺伝子を続
いて欠失させ３重プロテアーゼ欠失突然変異体を作り出
す。２重かまたは３重欠失突然変異体にspoOA突然変異
を導入し、細胞中に存在する胞子形成依存プロテアーゼ
活性を著しく低下させる。これまで未知のプロテアーゼ
をコードしている遺伝子を単離し、その完全なヌクレオ
チド配列を決定する。遺伝子eprは645アミノ酸の１次生
成物をコードしており、それはズブチリシン（Apr）お
よび枯草菌の主たる内部セリン プロテアーゼ（Isp−
１）の両方と部分的に相同である。この遺伝子の欠失は
イン ビトロで作成され、３重プロテアーゼ欠失宿主内
に導入される。残余プロテアーゼRP−Ｉをコードしてい
る新しく同定された遺伝子中の欠失を続いて導入し、実
質的に減少したプロテアーゼ活性を持ち、RP−II活性の
みを発現する枯草菌の株を作り出す。RP−IIは精製され
ており、このプロテアーゼをコードしている遺伝子のク
ローン化に使用される核酸プローブの作製に使用するた
め、アミノ酸配列の一部が決定されている。遺伝子のク
ローニングにより、RP−II遺伝子が欠失しており、それ
故RP−IIを産生できないバシラス（Bacillus）株を作製
することが可能であった。
プロテアーゼ遺伝子欠失の構成および減少したプロテ
アーゼ活性を示すバシラス（Bacillus）株の調製の詳細
な方法は以下に記載する。
アーゼ活性を示すバシラス（Bacillus）株の調製の詳細
な方法は以下に記載する。
一般的方法 多欠失バシラス（Bacillus）株の構築のための方法を
以下に記載する。枯草菌染色体DNAの単離はDubnauら（1
971,ジャーナル オブ モレキユラーバイオロジー、5
6:209）により記載されているごとくして行った。枯草
菌株をトリプトース血液寒天基剤（ディフコ ラボラト
リーズ）上または最小グルコース培地で増殖させ、Anag
nostopoulosらの方法（ジャーナル オブ バクテリオ
ロジー、1961,81:741）によりコンピテントにする。大
腸菌JM107を増殖し、Hanahanの方法（ジャーナル オブ
モレキユラー バイオロジー、1983,166:587）により
コンピテントにする。枯草菌および大腸菌からのプラス
ミドDNAはBirnboimらの溶菌法（ヌクレイック アシッ
ズ リサーチ、1979,７:1513）により調製する。枯草菌
におけるプラスミド形質転換はGryczanらにより（ジャ
ーナル オブ バクテリオロジー、1978,134:138）記載
されているごとくして実施する。
以下に記載する。枯草菌染色体DNAの単離はDubnauら（1
971,ジャーナル オブ モレキユラーバイオロジー、5
6:209）により記載されているごとくして行った。枯草
菌株をトリプトース血液寒天基剤（ディフコ ラボラト
リーズ）上または最小グルコース培地で増殖させ、Anag
nostopoulosらの方法（ジャーナル オブ バクテリオ
ロジー、1961,81:741）によりコンピテントにする。大
腸菌JM107を増殖し、Hanahanの方法（ジャーナル オブ
モレキユラー バイオロジー、1983,166:587）により
コンピテントにする。枯草菌および大腸菌からのプラス
ミドDNAはBirnboimらの溶菌法（ヌクレイック アシッ
ズ リサーチ、1979,７:1513）により調製する。枯草菌
におけるプラスミド形質転換はGryczanらにより（ジャ
ーナル オブ バクテリオロジー、1978,134:138）記載
されているごとくして実施する。
プロテアーゼ検定 ２つの異ったプロテアーゼ基質、アゾコールおよびカ
ゼイン（両方とも14Cまたは発色団レゾルフィンで標
識）、がプロテアーゼ検定に使用されるが、カゼイン基
質がタンパク質分解活性に対してより感度が良い。培養
上澄み液試料は定常期にはいって２または20時間で検出
された。アゾコールに基づいたプロテアーゼ検定は100
μの培養上澄み液を900μの50mMトリス、pH8.5mM C
aCl2および10mgのアゾコール（シグマ、タンパク質分解
切断された場合、可溶性発色団を放出するタンパク質コ
ラーゲンの共有結合で修飾された不溶性型）に添加する
事により実施する。溶液を37℃にて30分間一定に振とう
させながら30分間インキユベートする。反応液を遠心分
離して不溶性アゾコールを除去し、溶液のA520を決定す
る。阻害剤は反応混合物と37℃にて５分間前もってイン
キユベートする。非常に少量の残余プロテアーゼ活性を
測定せねばならない場合は、14C−カゼインまたはリゾ
ルフィン−標識カゼインを基質として使用する。14C−
カゼイン試験においては培養上澄み液（100μ）を１
×105cpmの14C−カゼイン（ニユー イングランド ヌ
クレア）を含む100μの50mMトリス、5mM CaCl2に加え
る。溶液を37℃にて30分間インキユベートする。反応液
を氷上に置き、20μｇのBSAを担体タンパク質として添
加する。冷10％TCA（600μ）を添加し、混合物は氷上
に10分間保つ。溶液を遠心分離して沈澱タンパク質を除
き、上澄み液はシンチレーション カウンターにて計数
する。レゾルフィン−標識カゼイン検定では、培養上澄
み液を等容量のトリス−Cl緩衝液、pH8.0中のレゾルフ
ィーン−標識カゼインと37℃にて種々の時間インキユベ
ートする。インキユベーションに続き、非加水分解基質
をTCAにて沈澱させ、得られる発色性上澄み液を分光々
度計により定量する。
ゼイン（両方とも14Cまたは発色団レゾルフィンで標
識）、がプロテアーゼ検定に使用されるが、カゼイン基
質がタンパク質分解活性に対してより感度が良い。培養
上澄み液試料は定常期にはいって２または20時間で検出
された。アゾコールに基づいたプロテアーゼ検定は100
μの培養上澄み液を900μの50mMトリス、pH8.5mM C
aCl2および10mgのアゾコール（シグマ、タンパク質分解
切断された場合、可溶性発色団を放出するタンパク質コ
ラーゲンの共有結合で修飾された不溶性型）に添加する
事により実施する。溶液を37℃にて30分間一定に振とう
させながら30分間インキユベートする。反応液を遠心分
離して不溶性アゾコールを除去し、溶液のA520を決定す
る。阻害剤は反応混合物と37℃にて５分間前もってイン
キユベートする。非常に少量の残余プロテアーゼ活性を
測定せねばならない場合は、14C−カゼインまたはリゾ
ルフィン−標識カゼインを基質として使用する。14C−
カゼイン試験においては培養上澄み液（100μ）を１
×105cpmの14C−カゼイン（ニユー イングランド ヌ
クレア）を含む100μの50mMトリス、5mM CaCl2に加え
る。溶液を37℃にて30分間インキユベートする。反応液
を氷上に置き、20μｇのBSAを担体タンパク質として添
加する。冷10％TCA（600μ）を添加し、混合物は氷上
に10分間保つ。溶液を遠心分離して沈澱タンパク質を除
き、上澄み液はシンチレーション カウンターにて計数
する。レゾルフィン−標識カゼイン検定では、培養上澄
み液を等容量のトリス−Cl緩衝液、pH8.0中のレゾルフ
ィーン−標識カゼインと37℃にて種々の時間インキユベ
ートする。インキユベーションに続き、非加水分解基質
をTCAにて沈澱させ、得られる発色性上澄み液を分光々
度計により定量する。
npr遺伝子の欠失 Yangら（ジャーナル オブ バクテリオロジー、198
4,160:15）に従うとnpr遺伝子は枯草菌DNAの重複EcoR I
およびHind III制限断片内に含まれており、遺伝子配列
の大多数は2.4kb Hind III断片上に位置している。この
断片がnpr欠失の作製のために選択された。
4,160:15）に従うとnpr遺伝子は枯草菌DNAの重複EcoR I
およびHind III制限断片内に含まれており、遺伝子配列
の大多数は2.4kb Hind III断片上に位置している。この
断片がnpr欠失の作製のために選択された。
2.4kb Hind III断片を含む個々のクローンは以下のご
とくして調製されたゲノムHind III断片のクローンバン
クから単離された。染色体DNAは枯草菌株JS75から単離
され、Hind IIIで消化され0.8％アガロースゲル上の電
気泳動により大きさで分画される。２−4kbの大きさのD
NAをゲルから電気的に溶出する。精製DNAはHind IIIで
消化され、アルカリホスファターゼで処理されたpUC9DN
A（ベセスダ リサーチ、ラボラトリーズ、ロックビ
ル、Mdから入手可能な大腸菌レプリコン）と結合し、大
腸菌株JM107のコンピテント細胞を形質転換し、LB＋50
μg/mlアムピシリン上に置くと1000のAmpRコロニーを得
る。
とくして調製されたゲノムHind III断片のクローンバン
クから単離された。染色体DNAは枯草菌株JS75から単離
され、Hind IIIで消化され0.8％アガロースゲル上の電
気泳動により大きさで分画される。２−4kbの大きさのD
NAをゲルから電気的に溶出する。精製DNAはHind IIIで
消化され、アルカリホスファターゼで処理されたpUC9DN
A（ベセスダ リサーチ、ラボラトリーズ、ロックビ
ル、Mdから入手可能な大腸菌レプリコン）と結合し、大
腸菌株JM107のコンピテント細胞を形質転換し、LB＋50
μg/mlアムピシリン上に置くと1000のAmpRコロニーを得
る。
クローン化中性プロテアーゼ遺伝子断片を含むコロニ
ーは常法のコロニーハイブリダイゼーション法（Maniat
isら、1983、“モレキユラークローニング、実験手引
書”コールド スプリング ハーバー、ニユーヨーク）
により同定される。簡単に記すと、形質転換体を、ニト
ロセルロースフィルターに移し、溶菌して核酸を放出さ
せnpr特異的プローブで調べる。ヌクレオチド520および
540の間のnpr遺伝子配列と相補的な20塩基のオリゴヌク
レオチド（Yangら、上記文献）がプローブとして使用さ
れた。配列は５′GGCACGCTTGTCTCAAGCAC3′である。2.4
kb Hind III挿入物を含む代表的クローンが同定され、p
371と名付けられた（図１）。
ーは常法のコロニーハイブリダイゼーション法（Maniat
isら、1983、“モレキユラークローニング、実験手引
書”コールド スプリング ハーバー、ニユーヨーク）
により同定される。簡単に記すと、形質転換体を、ニト
ロセルロースフィルターに移し、溶菌して核酸を放出さ
せnpr特異的プローブで調べる。ヌクレオチド520および
540の間のnpr遺伝子配列と相補的な20塩基のオリゴヌク
レオチド（Yangら、上記文献）がプローブとして使用さ
れた。配列は５′GGCACGCTTGTCTCAAGCAC3′である。2.4
kb Hind III挿入物を含む代表的クローンが同定され、p
371と名付けられた（図１）。
p371におけるnpr遺伝子の欠失型はインビトロで誘導
された。p371DNAをRsa IおよびHind IIIで消化すること
により、580bp内部Rsa I断片が欠失した。遺伝子の５′
末端につながっている600bp Hind III−Rsa Iフラグメ
ントおよび遺伝子の３′末端につながっている1220bp R
sa I−Hind III断片（図１参照）を単離し、Hind IIIお
よびアルカリホスファターゼ処理pUc9内へクローン化す
る。これによりnpr遺伝子の中心部分が欠失する。結合
されたDNAで大腸菌JM107を形質転換する。所望のnpr遺
伝子内欠失を持つクローンは制限酵素分析により同定さ
れた。このプラスミドはp371Δと称される。
された。p371DNAをRsa IおよびHind IIIで消化すること
により、580bp内部Rsa I断片が欠失した。遺伝子の５′
末端につながっている600bp Hind III−Rsa Iフラグメ
ントおよび遺伝子の３′末端につながっている1220bp R
sa I−Hind III断片（図１参照）を単離し、Hind IIIお
よびアルカリホスファターゼ処理pUc9内へクローン化す
る。これによりnpr遺伝子の中心部分が欠失する。結合
されたDNAで大腸菌JM107を形質転換する。所望のnpr遺
伝子内欠失を持つクローンは制限酵素分析により同定さ
れた。このプラスミドはp371Δと称される。
バシラス（Bacillus）中の要素の選択を容易にする為
にベクター上に選択可能マーカーをコードしている遺伝
子が導入された。クロラムフェニコール耐性（Cmr）を
コードしているバシラス（Bacillus）cat遺伝子を1.3kb
Sal I断片上のプラスミドpMI1101（Youngmanら、198
4、プラスミド12:1−９）から単離し、p371ΔのSal I部
位内へクローン化する。このDNAで大腸菌JM107を形質転
換し、形質転換体はクロラムフェニコール耐性でスクリ
ーニングする。欠失npr遺伝子およびcat遺伝子の両方を
含む代表的プラスミドはp371ΔCm（図１）と名付けられ
た。
にベクター上に選択可能マーカーをコードしている遺伝
子が導入された。クロラムフェニコール耐性（Cmr）を
コードしているバシラス（Bacillus）cat遺伝子を1.3kb
Sal I断片上のプラスミドpMI1101（Youngmanら、198
4、プラスミド12:1−９）から単離し、p371ΔのSal I部
位内へクローン化する。このDNAで大腸菌JM107を形質転
換し、形質転換体はクロラムフェニコール耐性でスクリ
ーニングする。欠失npr遺伝子およびcat遺伝子の両方を
含む代表的プラスミドはp371ΔCm（図１）と名付けられ
た。
ベクターp371ΔCmは大腸菌レプリコンpUC19から誘導
されており、それ故バシラス（Bacillus）宿主中では複
製できない。相同配列間の相互的組換えにより受容体宿
主の染色体中の野生型npr遺伝子がベクター上に含まれ
ている欠失npr遺伝子に交換された。Cmrマーカー遺伝子
はプロテアーゼ遺伝子配列を含めてベクターがすでに組
み込まれている細胞の選択を可能にする。
されており、それ故バシラス（Bacillus）宿主中では複
製できない。相同配列間の相互的組換えにより受容体宿
主の染色体中の野生型npr遺伝子がベクター上に含まれ
ている欠失npr遺伝子に交換された。Cmrマーカー遺伝子
はプロテアーゼ遺伝子配列を含めてベクターがすでに組
み込まれている細胞の選択を可能にする。
欠失npr遺伝子が組み込まれているベクター配列はそ
れにそったnpr遺伝子のコピーを取りながら、低い頻度
で染色体から自発的に分割される。染色体中の欠失プロ
テアーゼの保持はCms分離物中のプロテアーゼ活性の欠
落を検定することにより確認する。
れにそったnpr遺伝子のコピーを取りながら、低い頻度
で染色体から自発的に分割される。染色体中の欠失プロ
テアーゼの保持はCms分離物中のプロテアーゼ活性の欠
落を検定することにより確認する。
特に、コンピテント枯草菌IS75細胞がp371ΔCmで形質
転換され、Cmrで選択された。野生型遺伝子に隣接し
て、または置き換わった欠失npr遺伝子がおそらく組み
込まれている約2000のコロニーが選択され、それらはク
ロラムフェニコール耐性であった。コロニーの約25％が
でんぷん寒天上により小さい除去圏を形成し、野生型遺
伝子が遺伝子の欠失型に置き換えられていた事を示して
いる。これらの細胞培養物からの上澄み液では中性プロ
テアーゼ活性は検出されなかった。対照的に、野生型IS
75細胞からの培養液内には高水準の中性プロテアーゼ活
性が検出された。欠失プロテアーゼ遺伝子の１つの組込
みコピーを含むが、ベクター配列が除去されている分離
物は以下のごとくして続いて選択された。
転換され、Cmrで選択された。野生型遺伝子に隣接し
て、または置き換わった欠失npr遺伝子がおそらく組み
込まれている約2000のコロニーが選択され、それらはク
ロラムフェニコール耐性であった。コロニーの約25％が
でんぷん寒天上により小さい除去圏を形成し、野生型遺
伝子が遺伝子の欠失型に置き換えられていた事を示して
いる。これらの細胞培養物からの上澄み液では中性プロ
テアーゼ活性は検出されなかった。対照的に、野生型IS
75細胞からの培養液内には高水準の中性プロテアーゼ活
性が検出された。欠失プロテアーゼ遺伝子の１つの組込
みコピーを含むが、ベクター配列が除去されている分離
物は以下のごとくして続いて選択された。
Cmrコロニーの培養物は選択することなく液体培地中
で一夜増殖させた後TBAB培地上に塗布する。これらのコ
ロニーは続いてクロラムフェニコールを含む培地上に写
し取り、クロラムフェニコール存在下で増殖しないもの
を同定しオリジナルのプレートから選択する。そのよう
なNpr陰性コロニーの１つが選択されIS75NΔと称され
た。
で一夜増殖させた後TBAB培地上に塗布する。これらのコ
ロニーは続いてクロラムフェニコールを含む培地上に写
し取り、クロラムフェニコール存在下で増殖しないもの
を同定しオリジナルのプレートから選択する。そのよう
なNpr陰性コロニーの１つが選択されIS75NΔと称され
た。
IS75NΔ中のnpr遺伝子内の欠失は枯草菌IS75NおよびI
S75NΔから単離されたHind III消化DNAを32P−標識npr
−特異性オリゴヌクレオチドで調べる標準的サザンブロ
ット分析（サザン、1977、ジャーナル オブ モレキユ
ラー バイオロジー 98:503）により確認する。野生型
IS75N DNA中の2.4kb Hind III断片およびIS75NΔDNA中
の1.8kb断片とハイブリダイズするプローブはIS75NΔに
おいて600bpのnpr遺伝子が欠失している事を示している
（図２参照）。
S75NΔから単離されたHind III消化DNAを32P−標識npr
−特異性オリゴヌクレオチドで調べる標準的サザンブロ
ット分析（サザン、1977、ジャーナル オブ モレキユ
ラー バイオロジー 98:503）により確認する。野生型
IS75N DNA中の2.4kb Hind III断片およびIS75NΔDNA中
の1.8kb断片とハイブリダイズするプローブはIS75NΔに
おいて600bpのnpr遺伝子が欠失している事を示している
（図２参照）。
apr遺伝子の欠失 ズブチリシン遺伝子（apr）をクローン化するため最
初にIS75DNAからのゲノム ライブラリーが調製され
た。染色体DNAが単離され、EcoR Iで消化し、0.8％アガ
ロースゲルを通した電気泳動により分離する。５−8kb
の大きさの範囲の断片をゲルからの電気的溶出により精
製する。断片にEcoR I消化pBR328DNA（ニユー イング
ランド バイオラボから一般でも入手可能である）を結
合し、コンピテント大腸菌JM107細胞を形質転換する。
形質転換体はヌクレオチド503および520の間のapr遺伝
子配列と相同の合成32P−標識17−merオリゴヌクレオチ
ドプローブとハイブリダイズするかによりapr遺伝子挿
入物を含むプラスミドをスクリーニングする（Stahl
ら、1984、ジャーナル オブ バクテリオロジー 158:
411）。プローブとハイブリダイズする6.5kb EcoR I挿
入物を持つクローンを選択し、pAS007と名付ける（図
３）。6.5kb断片はズブチリシン遺伝子を完全にコード
している配列を含んでいる。
初にIS75DNAからのゲノム ライブラリーが調製され
た。染色体DNAが単離され、EcoR Iで消化し、0.8％アガ
ロースゲルを通した電気泳動により分離する。５−8kb
の大きさの範囲の断片をゲルからの電気的溶出により精
製する。断片にEcoR I消化pBR328DNA（ニユー イング
ランド バイオラボから一般でも入手可能である）を結
合し、コンピテント大腸菌JM107細胞を形質転換する。
形質転換体はヌクレオチド503および520の間のapr遺伝
子配列と相同の合成32P−標識17−merオリゴヌクレオチ
ドプローブとハイブリダイズするかによりapr遺伝子挿
入物を含むプラスミドをスクリーニングする（Stahl
ら、1984、ジャーナル オブ バクテリオロジー 158:
411）。プローブとハイブリダイズする6.5kb EcoR I挿
入物を持つクローンを選択し、pAS007と名付ける（図
３）。6.5kb断片はズブチリシン遺伝子を完全にコード
している配列を含んでいる。
apr遺伝子の突然変異体は２つの内部Hpa I断片を欠失
させることにより作製する（図３）。pAS007を最初にHp
a Iで消化し、希釈溶液中（５μg/ml）で結合して再環
化することにより２つのHpa I断片を除去する。JM107細
胞の形質転換により約200のAmprコロニーが生じた。こ
れらの形質転換体の１つは１つの内部Hpa I部位を持つ
4.8kb EcoR I挿入物を含んでいた。それはpAS12と名付
けられた。apr遺伝子の欠失は遺伝子の３′末端を超え
て500bp伸びていたが、ここのDNAには枯草菌に必須のど
んな遺伝子も含まれてはいなかった。
させることにより作製する（図３）。pAS007を最初にHp
a Iで消化し、希釈溶液中（５μg/ml）で結合して再環
化することにより２つのHpa I断片を除去する。JM107細
胞の形質転換により約200のAmprコロニーが生じた。こ
れらの形質転換体の１つは１つの内部Hpa I部位を持つ
4.8kb EcoR I挿入物を含んでいた。それはpAS12と名付
けられた。apr遺伝子の欠失は遺伝子の３′末端を超え
て500bp伸びていたが、ここのDNAには枯草菌に必須のど
んな遺伝子も含まれてはいなかった。
バシラス（Bacillus）cat遺伝子を含む1.3kb Sal I断
片をバシラス（Bacillus）宿主染色体中の組み込み体の
選択のためpAS12のSal I部位内へクローン化する（前記
のごとく）。プラスミドDNAで大腸菌JM107を形質転換
し、アムピシリン含有培地上に塗布すると約50のAmprコ
ロニーが回収され、7.5μg/mlクロラムフェニコール含
有培地上でレプリカ平板法を行う。50のうち３つがCmr
であった。これらの３つのコロニーからプラスミドDNA
を単離し、制限消化により分析した。プラスミドの１つ
が所望の制限パターンを持っており、pAS13と名付けら
れた（図３）。
片をバシラス（Bacillus）宿主染色体中の組み込み体の
選択のためpAS12のSal I部位内へクローン化する（前記
のごとく）。プラスミドDNAで大腸菌JM107を形質転換
し、アムピシリン含有培地上に塗布すると約50のAmprコ
ロニーが回収され、7.5μg/mlクロラムフェニコール含
有培地上でレプリカ平板法を行う。50のうち３つがCmr
であった。これらの３つのコロニーからプラスミドDNA
を単離し、制限消化により分析した。プラスミドの１つ
が所望の制限パターンを持っており、pAS13と名付けら
れた（図３）。
枯草菌染色体内への欠失プロテアーゼ遺伝子の組み込
みを促進するため、pAS13がIS75NΔ株内へ導入されCmr
形質転換体として選択された。形質転換体は続いて５μ
g/ml Cmおよび1.5％カゼインを含むTBABプレート上に塗
布することにより野生型apr遺伝子が欠失遺伝子で置換
されているかをスクリーニングする。かさを産生しない
いくつかのコロニーが上に記載したごとくCmr遺伝子が
喪失したとして選択された。代表的な形質転換体が選択
されGP199と名付けられた。
みを促進するため、pAS13がIS75NΔ株内へ導入されCmr
形質転換体として選択された。形質転換体は続いて５μ
g/ml Cmおよび1.5％カゼインを含むTBABプレート上に塗
布することにより野生型apr遺伝子が欠失遺伝子で置換
されているかをスクリーニングする。かさを産生しない
いくつかのコロニーが上に記載したごとくCmr遺伝子が
喪失したとして選択された。代表的な形質転換体が選択
されGP199と名付けられた。
欠失中性プロテアーゼ遺伝子のみを持つ株と同様に２
重プロテアーゼ欠失株からの培養液中のプロテアーゼ活
性が検定された。Npr-,Apr-突然変異細胞中のプロテア
ーゼ活性は野生型のレベルの約４−７％であり、一方Np
r-突然変異体はより高いレベルのプロテアーゼ活性を示
した。
重プロテアーゼ欠失株からの培養液中のプロテアーゼ活
性が検定された。Npr-,Apr-突然変異細胞中のプロテア
ーゼ活性は野生型のレベルの約４−７％であり、一方Np
r-突然変異体はより高いレベルのプロテアーゼ活性を示
した。
amy E突然変異 プロテアーゼ欠損株をバシラス（Bacillus）アミラー
ゼの産生に関して試験した。種々のプラスミド構築物に
より産生されるアミラーゼのレベルを検定するには野生
型遺伝子のかわりに宿主内へ突然変異体アミラーゼ遺伝
子を導入する必要がある。この工程は本発明には必須で
はなくまたプロテアーゼ活性のレベルには影響を及ぼさ
ない；これは染色体がコードするアミラーゼ存在下では
プラスミドがコードしているアミラーゼレベルを決定で
きないので実施されるのである。amy E対立遺伝子は枯
草菌株JF206（trp C2,amy E）からGP199内へコングレッ
ションとして知られている形質転換／選択法により形質
転換された。この方法は形質転換を行うDNAが過剰に与
えられた場合１つ以上の染色体DNAにより形質転換され
るコンピテント枯草菌細胞の能力に頼っている。この方
法においては最初に、アミラーゼの産生不能のごとき選
択不可能なマーカーの共転移のためのスクリーニングを
容易にするための選択可能マーカー遺伝子の発現を検定
することにより集団中のコンピテント細胞を選択する。
ゼの産生に関して試験した。種々のプラスミド構築物に
より産生されるアミラーゼのレベルを検定するには野生
型遺伝子のかわりに宿主内へ突然変異体アミラーゼ遺伝
子を導入する必要がある。この工程は本発明には必須で
はなくまたプロテアーゼ活性のレベルには影響を及ぼさ
ない；これは染色体がコードするアミラーゼ存在下では
プラスミドがコードしているアミラーゼレベルを決定で
きないので実施されるのである。amy E対立遺伝子は枯
草菌株JF206（trp C2,amy E）からGP199内へコングレッ
ションとして知られている形質転換／選択法により形質
転換された。この方法は形質転換を行うDNAが過剰に与
えられた場合１つ以上の染色体DNAにより形質転換され
るコンピテント枯草菌細胞の能力に頼っている。この方
法においては最初に、アミラーゼの産生不能のごとき選
択不可能なマーカーの共転移のためのスクリーニングを
容易にするための選択可能マーカー遺伝子の発現を検定
することにより集団中のコンピテント細胞を選択する。
JF206またはamy E突然変異を含む類似の株から全染色
体DNAを単離する。飽和濃度（〜１μｇ）でコンピテン
トGP199（met-,leu-,his-）を形質転換し、His+形質転
換体をメチオニンおよびロイシンを補充した最小培地上
で選択する。形質転換体はでんぷん−アズール含有上面
寒天層を持つ平板上でアミラーゼマイナス表現型のスク
リーニングを行う。His+の５％のコロニーはかさを産生
する事ができずアミラーゼ遺伝子に欠損がある事を示し
ている。そのような形質転換体の１つがプロテアーゼ欠
損表現型で検定され、GP200と名付けられた。
体DNAを単離する。飽和濃度（〜１μｇ）でコンピテン
トGP199（met-,leu-,his-）を形質転換し、His+形質転
換体をメチオニンおよびロイシンを補充した最小培地上
で選択する。形質転換体はでんぷん−アズール含有上面
寒天層を持つ平板上でアミラーゼマイナス表現型のスク
リーニングを行う。His+の５％のコロニーはかさを産生
する事ができずアミラーゼ遺伝子に欠損がある事を示し
ている。そのような形質転換体の１つがプロテアーゼ欠
損表現型で検定され、GP200と名付けられた。
２重プロテアーゼ突然変異体の培養液からの上澄み液
試料はアゾコールを基質として使用するプロテアーゼ活
性の検定を行った。この基質で検定した場合、２重プロ
テアーゼ突然変異株のプロテアーゼ活性は野性型レベル
の４％であった。より高感度基質である14C−カゼイン
をプロテアーゼ検定に使用した場合、２重突然変異は野
生型枯草菌活性の５−７％の活性を示した。この株にお
いてはプロテアーゼ活性は低いけれども、これらのプロ
テアーゼ欠損細胞により産生されるある種の異種遺伝子
産生物が安定ではなく残余プロテアーゼ活性の存在を示
している。そこで残余プロテアーゼ活性の原因となる遺
伝子の同定および変更が考えられた。
試料はアゾコールを基質として使用するプロテアーゼ活
性の検定を行った。この基質で検定した場合、２重プロ
テアーゼ突然変異株のプロテアーゼ活性は野性型レベル
の４％であった。より高感度基質である14C−カゼイン
をプロテアーゼ検定に使用した場合、２重突然変異は野
生型枯草菌活性の５−７％の活性を示した。この株にお
いてはプロテアーゼ活性は低いけれども、これらのプロ
テアーゼ欠損細胞により産生されるある種の異種遺伝子
産生物が安定ではなく残余プロテアーゼ活性の存在を示
している。そこで残余プロテアーゼ活性の原因となる遺
伝子の同定および変更が考えられた。
残余プロテアーゼ活性の特徴付けをする為に、２重プ
ロテアーゼ突然変異株の培養液のプロテアーゼレベルを
下げる多数の概知のプロテアーゼ阻害剤の能力を試験し
た。セリン プロテアーゼ活性の阻害剤として知られて
いるPMSF（フェニルメチル スルホニル フルオリド）
が最も有効である事が観察された。Apr-Npr-バシラス
（Bacillus）細胞の増殖培養液へのPMSFの添加はうま
く、これらの細胞で合成および分泌される異種ペプチド
およびタンパク質の安定性を増加させた。これらの結果
は残余分解活性の少くとも一部はセリン プロテアーゼ
によるものである事を示している。
ロテアーゼ突然変異株の培養液のプロテアーゼレベルを
下げる多数の概知のプロテアーゼ阻害剤の能力を試験し
た。セリン プロテアーゼ活性の阻害剤として知られて
いるPMSF（フェニルメチル スルホニル フルオリド）
が最も有効である事が観察された。Apr-Npr-バシラス
（Bacillus）細胞の増殖培養液へのPMSFの添加はうま
く、これらの細胞で合成および分泌される異種ペプチド
およびタンパク質の安定性を増加させた。これらの結果
は残余分解活性の少くとも一部はセリン プロテアーゼ
によるものである事を示している。
ズブチリシンは枯草菌により分泌される主たるセリン
プロテアーゼである；しかしながら、isp−１遺伝子
（ISP−１）によりコードされているセリン プロテア
ーゼは胞子形成の間細胞内に蓄積されていることが示さ
れている（Srivastavaら、1981、アルヒーブ フォー
マイクロバイオロジー、129:227）。残余プロテアーゼ
活性がISP−１によるものかを明らかにするため、isp−
１遺伝子が欠失したものをイン ビトロで作製し、２重
−プロテアーゼ欠失株内へ取り込ませた。
プロテアーゼである；しかしながら、isp−１遺伝子
（ISP−１）によりコードされているセリン プロテア
ーゼは胞子形成の間細胞内に蓄積されていることが示さ
れている（Srivastavaら、1981、アルヒーブ フォー
マイクロバイオロジー、129:227）。残余プロテアーゼ
活性がISP−１によるものかを明らかにするため、isp−
１遺伝子が欠失したものをイン ビトロで作製し、２重
−プロテアーゼ欠失株内へ取り込ませた。
isp−１遺伝子の欠失 isp−１遺伝子は枯草菌染色体DNAの2.7kb BamH I断片
内に含まれている（Koideら、1986、ジャーナル オブ
バクテリオロジー、167:110）。精製DNAをBamH Iで消
化し、2.7kbの大きさの範囲をアガロースゲルから電気
的に溶出し、BamH I消化pBR328内へ連結し、大腸菌JM10
7細胞を形質転換する。１％カゼイン含有LB培地上でか
さを産生する１つのAmprコロニーが選択されpISP−１と
名付けられた。DNAの制限分析によると、pISP−１はisp
−１遺伝子配列と相同の合成25塩基32P−標識オリゴヌ
クレオチドプローブ〔５′ATGAATGGTGAAATCCGCTTGATCC
3′〕（Koideら前記文献）とハイブリダイズする2.7kb
BamH I挿入物を運んでいる。Sal IおよびEcoR I消化に
より発生する制限パターンからもpISP−１中のisp−１
遺伝子の存在が確認された。
内に含まれている（Koideら、1986、ジャーナル オブ
バクテリオロジー、167:110）。精製DNAをBamH Iで消
化し、2.7kbの大きさの範囲をアガロースゲルから電気
的に溶出し、BamH I消化pBR328内へ連結し、大腸菌JM10
7細胞を形質転換する。１％カゼイン含有LB培地上でか
さを産生する１つのAmprコロニーが選択されpISP−１と
名付けられた。DNAの制限分析によると、pISP−１はisp
−１遺伝子配列と相同の合成25塩基32P−標識オリゴヌ
クレオチドプローブ〔５′ATGAATGGTGAAATCCGCTTGATCC
3′〕（Koideら前記文献）とハイブリダイズする2.7kb
BamH I挿入物を運んでいる。Sal IおよびEcoR I消化に
より発生する制限パターンからもpISP−１中のisp−１
遺伝子の存在が確認された。
欠失は遺伝子の中央に位置している独特のSal I部位
を利用してisp−１遺伝子内に作製された。ベクター中
に別のSal I部位があるので、最初に2.7kb BamH I遺伝
子挿入物をpBR322の誘導体（pAL4）のBamH I部位にクロ
ーン化し、それによりSal I部位を除く（図４）。生じ
るプラスミド、pAL5はそれ故isp−１遺伝子内に独特のS
al I部位を持っている。pAL5DNAをSal Iで消化し、Bal3
1エキソヌクレアーゼで37℃にて５分間処理して遺伝子
配列の一部を欠失させ再連結する。このDNAでJM107を形
質転換し、得られるAmprコロニーの小さくなったBamH I
挿入物をスクリーニングする。BamH I挿入物内に1.2kb
の欠失を持つプラスミドを選択し、pAL6と名付けた（図
４）。
を利用してisp−１遺伝子内に作製された。ベクター中
に別のSal I部位があるので、最初に2.7kb BamH I遺伝
子挿入物をpBR322の誘導体（pAL4）のBamH I部位にクロ
ーン化し、それによりSal I部位を除く（図４）。生じ
るプラスミド、pAL5はそれ故isp−１遺伝子内に独特のS
al I部位を持っている。pAL5DNAをSal Iで消化し、Bal3
1エキソヌクレアーゼで37℃にて５分間処理して遺伝子
配列の一部を欠失させ再連結する。このDNAでJM107を形
質転換し、得られるAmprコロニーの小さくなったBamH I
挿入物をスクリーニングする。BamH I挿入物内に1.2kb
の欠失を持つプラスミドを選択し、pAL6と名付けた（図
４）。
Sal I断片上の大腸菌プラスミドpMI1101から前記のご
とくしてcat遺伝子を精製し、pAL6のEcoR V部位へクロ
ーン化する。得られるDNAで２重プロテアーゼ突然変異
株を形質転換し（GP200）、欠失ISP−１遺伝子を含む組
込み体を前記のごとく選択する。３重−プロテアーゼ欠
失株はGP208（aprΔ,nprΔ,isp−１Δ）と称されてい
る。カゼイン基質を用い、３重−突然変異株（Apr-,Npr
-,Isp−1-）のプロテアーゼ活性が測定され、大体２重
突然変異株と同じの野生型レベルの４％であることが観
察された。
とくしてcat遺伝子を精製し、pAL6のEcoR V部位へクロ
ーン化する。得られるDNAで２重プロテアーゼ突然変異
株を形質転換し（GP200）、欠失ISP−１遺伝子を含む組
込み体を前記のごとく選択する。３重−プロテアーゼ欠
失株はGP208（aprΔ,nprΔ,isp−１Δ）と称されてい
る。カゼイン基質を用い、３重−突然変異株（Apr-,Npr
-,Isp−1-）のプロテアーゼ活性が測定され、大体２重
突然変異株と同じの野生型レベルの４％であることが観
察された。
残った４％の残余プロテアーゼ活性は明らかに前に記
載したバシロペプチダーゼＦと呼ばれているエステラー
ゼ（Roitschら、1983、ジャーナル オブ バクテリオ
ロジー、155:145）かまたは未知の未同定プロテアーゼ
遺伝子（群）によるものであろう。
載したバシロペプチダーゼＦと呼ばれているエステラー
ゼ（Roitschら、1983、ジャーナル オブ バクテリオ
ロジー、155:145）かまたは未知の未同定プロテアーゼ
遺伝子（群）によるものであろう。
胞子形成突然変異の導入 ある種のプロテアーゼの産生が枯草菌の胞子形成に伴
っていることが示されている為、我々のプロテアーゼ欠
損宿主中の胞子形成を阻止する突然変異が含まれていた
方が有益であろうし、それによりこれらの株における胞
子形成−依存プロテアーゼ産生を更に減少させるであろ
う。胞子形成過程を段階Ｏで阻止する突然変異は産生さ
れるプロテアーゼのレベルを減少させるが、精製DNAに
より形質転換される細胞の能力を除去しない。spoOA突
然変異はプロテアーゼ合成を減少させるのに特に有効で
あることが示されてきた（Ferrariら、1986、ジャーナ
ル オブ バクテリオロジー166:173）。
っていることが示されている為、我々のプロテアーゼ欠
損宿主中の胞子形成を阻止する突然変異が含まれていた
方が有益であろうし、それによりこれらの株における胞
子形成−依存プロテアーゼ産生を更に減少させるであろ
う。胞子形成過程を段階Ｏで阻止する突然変異は産生さ
れるプロテアーゼのレベルを減少させるが、精製DNAに
より形質転換される細胞の能力を除去しない。spoOA突
然変異はプロテアーゼ合成を減少させるのに特に有効で
あることが示されてきた（Ferrariら、1986、ジャーナ
ル オブ バクテリオロジー166:173）。
セリン プロテアーゼ（Isp−１）の産生を除去する
ための我々の戦略の第１の状況のごとく最初に２重プロ
テアーゼ欠損株内へspoOA突然変異を導入する。最終的
には３重−および４重プロテアーゼ欠損株内へspoOA突
然変異を導入する。この我々の発明の特色は枯草菌宿主
における異種遺伝子生成物の産生のための発現ベクター
内に含まれるプロモーターが胞子形成−特異性プロモー
ター（例えばspoVGプロモーター）でない場合にのみ有
益である。
ための我々の戦略の第１の状況のごとく最初に２重プロ
テアーゼ欠損株内へspoOA突然変異を導入する。最終的
には３重−および４重プロテアーゼ欠損株内へspoOA突
然変異を導入する。この我々の発明の特色は枯草菌宿主
における異種遺伝子生成物の産生のための発現ベクター
内に含まれるプロモーターが胞子形成−特異性プロモー
ター（例えばspoVGプロモーター）でない場合にのみ有
益である。
枯草菌株JH646（spoOA,Prot+,Amy+,Met+）または類似
のspoOA突然変異を持つ株から染色体DNAの飽和量を調製
し、コンピテントGP200細胞（Spo+,Prot-,Amy-,Met-）
を形質転換する。Met+形質転換体は最小培地プレート上
の増殖により選択される。得られる形質転換体は胞子形
成欠損表現型のための胞子形成培地（ディフコ）上の検
定（なめらかなコロニー形態および褐色のピグメント産
生）によりspoOA対立遺伝子の共形質転換でスクリーニ
ングする。約９％のMet+形質転換体がspoOA対立遺伝子
で共形質転換されているらしい；これらの多くはでんぷ
ん−アズールまたはカゼイン含有プレート上で再スクリ
ーニングして、受容体がドナーDNAから無傷のアミラー
ゼまたはプロテアーゼ遺伝子で共形質転換されていない
ことを確認する。検出可能なプロテアーゼ活性を示さな
い１つの形質転換体がGP205（spoOA,amy E,apr A,npr
E）と命名された。この宿主により産生されるプロテア
ーゼレベルは、カゼインが基質である場合、Spo+宿主の
細胞外液で観察されるレベルの0.1％であった。
のspoOA突然変異を持つ株から染色体DNAの飽和量を調製
し、コンピテントGP200細胞（Spo+,Prot-,Amy-,Met-）
を形質転換する。Met+形質転換体は最小培地プレート上
の増殖により選択される。得られる形質転換体は胞子形
成欠損表現型のための胞子形成培地（ディフコ）上の検
定（なめらかなコロニー形態および褐色のピグメント産
生）によりspoOA対立遺伝子の共形質転換でスクリーニ
ングする。約９％のMet+形質転換体がspoOA対立遺伝子
で共形質転換されているらしい；これらの多くはでんぷ
ん−アズールまたはカゼイン含有プレート上で再スクリ
ーニングして、受容体がドナーDNAから無傷のアミラー
ゼまたはプロテアーゼ遺伝子で共形質転換されていない
ことを確認する。検出可能なプロテアーゼ活性を示さな
い１つの形質転換体がGP205（spoOA,amy E,apr A,npr
E）と命名された。この宿主により産生されるプロテア
ーゼレベルは、カゼインが基質である場合、Spo+宿主の
細胞外液で観察されるレベルの0.1％であった。
同様の方法で、３重プロテアーゼ欠失突然変異体GP20
8（aprΔ,nprΔ,isp−１Δ）および４重プロテアーゼ欠
失突然変異体GP216（aprΔ,nprΔ,isp−１Δ,eprΔ，以
下に記載される）内へspoOA突然変異が導入された。得
られるSpo-株は各々GP210およびGP235である。これらの
株は発現ベクターが胞子形成依存プロモーターに基づい
ていない場合に有益である。
8（aprΔ,nprΔ,isp−１Δ）および４重プロテアーゼ欠
失突然変異体GP216（aprΔ,nprΔ,isp−１Δ,eprΔ，以
下に記載される）内へspoOA突然変異が導入された。得
られるSpo-株は各々GP210およびGP235である。これらの
株は発現ベクターが胞子形成依存プロモーターに基づい
ていない場合に有益である。
新プロテアーゼ遺伝子の同定 残余プロテアーゼ活性の原因となる遺伝子の同定およ
びクローニングは、細胞がカゼインプレート上のかさの
出現で検出するには十分多量の酵素（群）を産生しない
ので、常法を用いては困難であろうと予測された。も
し、それが高コピーベクター上複製され、遺伝子（群）
のコピー数（およびそれ故のプロテアーゼ産生）が検出
可能なレベルまで増幅されるなら遺伝子（群）の単離が
可能であろうと判断された。この戦略により、バシラス
（Bacillus）遺伝子バンクからの新規プロテアーゼ遺伝
子の単離が可能であった。これらの新規プロテアーゼ遺
伝子の最初のものはepr（細胞外プロテアーゼの略）命
名された。この新規遺伝子の欠失突然変異体はイン ビ
トロで誘導され、前記遺伝子置換法によりApr-,Npr-,Is
p-バシラス（Bacillus）宿主株へ導入された。
びクローニングは、細胞がカゼインプレート上のかさの
出現で検出するには十分多量の酵素（群）を産生しない
ので、常法を用いては困難であろうと予測された。も
し、それが高コピーベクター上複製され、遺伝子（群）
のコピー数（およびそれ故のプロテアーゼ産生）が検出
可能なレベルまで増幅されるなら遺伝子（群）の単離が
可能であろうと判断された。この戦略により、バシラス
（Bacillus）遺伝子バンクからの新規プロテアーゼ遺伝
子の単離が可能であった。これらの新規プロテアーゼ遺
伝子の最初のものはepr（細胞外プロテアーゼの略）命
名された。この新規遺伝子の欠失突然変異体はイン ビ
トロで誘導され、前記遺伝子置換法によりApr-,Npr-,Is
p-バシラス（Bacillus）宿主株へ導入された。
epr遺伝子のクローニング 残余プロテアーゼ活性の原因となる遺伝子を運ぶクロ
ーンを得るため、枯草菌GP208DNAのSau3Aライブラリー
が調製された。染色体DNAを単離し、Sau3Aの部分消化に
かけ、アガロースゲル上で大きさによる分画を行う。３
−7kbの大きさの範囲の断片をゲルから溶出し、大腸菌
およびバシラス（Bacillus）の両方で複製可能なシャト
ルベクターpEc224（pBR322のラージEcoR I−Pvu II断片
とpBD64のラージEcoR I−Pvu IIフラグメントとの連結
により誘導される（Gryczanら、1978,PNAS75:1428））
のBgl II部位内へクローン化する。連結DNAで大腸菌JM1
07を形質転換し、カゼインを含む培地に塗布する。1200
の大腸菌コロニーのどれもカゼインプレート上でかさを
産生しなかったが、精製プラスミドDNAの制限分析によ
るとクローンの約90％が約4kbの平均の大きさの挿入物
を含んでいた。クローンでバシラス（Bacillus）宿主を
形質転換し、以下のごとくプロテアーゼ活性でスクリー
ニングした。大腸菌形質転換体は各々100コロニーの12
の群（G1−G12）に分けプールされた。プールされたコ
ロニーを液体培地（LB＋50μg/mlアムピシリン）中で増
殖させてプラスミドDNAを単離し、枯草菌GP208（aprΔ,
nprΔ,isp−１Δ）を形質転換し、カゼインプレート上
に塗布する。プールされたG11からの形質転換体の約５
％のまわりにかさが観察された。陽性コロニーの各々か
らプラスミドDNAを単離し、制限酵素消化により地図を
作製した。形質転換体のすべてが約4kbの同一の挿入物
（図５）を含んでいた。これらのプラスミドのうちの１
つを選択しpNP1と命名した。
ーンを得るため、枯草菌GP208DNAのSau3Aライブラリー
が調製された。染色体DNAを単離し、Sau3Aの部分消化に
かけ、アガロースゲル上で大きさによる分画を行う。３
−7kbの大きさの範囲の断片をゲルから溶出し、大腸菌
およびバシラス（Bacillus）の両方で複製可能なシャト
ルベクターpEc224（pBR322のラージEcoR I−Pvu II断片
とpBD64のラージEcoR I−Pvu IIフラグメントとの連結
により誘導される（Gryczanら、1978,PNAS75:1428））
のBgl II部位内へクローン化する。連結DNAで大腸菌JM1
07を形質転換し、カゼインを含む培地に塗布する。1200
の大腸菌コロニーのどれもカゼインプレート上でかさを
産生しなかったが、精製プラスミドDNAの制限分析によ
るとクローンの約90％が約4kbの平均の大きさの挿入物
を含んでいた。クローンでバシラス（Bacillus）宿主を
形質転換し、以下のごとくプロテアーゼ活性でスクリー
ニングした。大腸菌形質転換体は各々100コロニーの12
の群（G1−G12）に分けプールされた。プールされたコ
ロニーを液体培地（LB＋50μg/mlアムピシリン）中で増
殖させてプラスミドDNAを単離し、枯草菌GP208（aprΔ,
nprΔ,isp−１Δ）を形質転換し、カゼインプレート上
に塗布する。プールされたG11からの形質転換体の約５
％のまわりにかさが観察された。陽性コロニーの各々か
らプラスミドDNAを単離し、制限酵素消化により地図を
作製した。形質転換体のすべてが約4kbの同一の挿入物
（図５）を含んでいた。これらのプラスミドのうちの１
つを選択しpNP1と命名した。
eprプロテアーゼ活性の特徴付け GP208（aprΔ,nprΔ,isp−１Δ）培養液中に残ってい
る残余プロテアーゼ活性は宿主により産生される総プロ
テアーゼ活性のほんの少しのパーセントの活性により説
明された。epr遺伝子によりコードされているプロテア
ーゼの型を特徴付けるため、枯草菌GP208/pNP1により分
泌されるプロテアーゼに対する異った阻害剤の効果を試
した。
る残余プロテアーゼ活性は宿主により産生される総プロ
テアーゼ活性のほんの少しのパーセントの活性により説
明された。epr遺伝子によりコードされているプロテア
ーゼの型を特徴付けるため、枯草菌GP208/pNP1により分
泌されるプロテアーゼに対する異った阻害剤の効果を試
した。
定常期にはいって２時間の培養培地を得、14C−カゼ
インを基質として用いて検定する。GP208に存在するプ
ロテアーゼ活性のレベルは前記標準的プロテアーゼ検定
法で検出される程十分高くはないが、増幅epr遺伝子を
運んでいるGP208/pNP1の培養培地中では認知できるプロ
テアーゼ活性が検出された。eprプロテアーゼ活性は10m
M EDTAおよび1mM RMSFの両方の存在下で阻止され、それ
は陽イオンの存在を活性に必要とするセリン−プロテア
ーゼをコードしている（他のセリンプロテアーゼIsp−
１もまたEDTAおよびRMSFで阻害される）。
インを基質として用いて検定する。GP208に存在するプ
ロテアーゼ活性のレベルは前記標準的プロテアーゼ検定
法で検出される程十分高くはないが、増幅epr遺伝子を
運んでいるGP208/pNP1の培養培地中では認知できるプロ
テアーゼ活性が検出された。eprプロテアーゼ活性は10m
M EDTAおよび1mM RMSFの両方の存在下で阻止され、それ
は陽イオンの存在を活性に必要とするセリン−プロテア
ーゼをコードしている（他のセリンプロテアーゼIsp−
１もまたEDTAおよびRMSFで阻害される）。
epr遺伝子のサブクローニング pNP1挿入物から2.7kb Hpa I−Sal I副断片が単離さ
れ、pBD64の誘導体であるpBs81/6（合成リンカーを用い
Pvu II部位をHind III部位に変えることにより誘導され
る）内へクローン化された。このサブクローン化断片を
運ぶ形質転換体はカゼインプレート上にかさを産生で
き、全プロテアーゼ遺伝子がこの断片内に存在している
ことを示している。代表的クローンはpNP3と命名され
た。
れ、pBD64の誘導体であるpBs81/6（合成リンカーを用い
Pvu II部位をHind III部位に変えることにより誘導され
る）内へクローン化された。このサブクローン化断片を
運ぶ形質転換体はカゼインプレート上にかさを産生で
き、全プロテアーゼ遺伝子がこの断片内に存在している
ことを示している。代表的クローンはpNP3と命名され
た。
1.6kb EcoR V副断片をpBs81/6内へサブクローニング
し、カゼインプレートにハローを作るコロニーを選択す
ることによりpNP3挿入物内の遺伝子の位置がさらに規定
された。ハローを形成し、且つ1.6kb挿入物を含む第５
図のクローンは、pNP5と名付けられた。この断片内のプ
ロテアーゼ遺伝子の存在はさらにpNP1からの4kb挿入物
のこの部分を欠失させることにより確認された。pNP1を
EcoR Vで消化し、1.6kb EcoR V挿入物の取り込みを起こ
さずにベクターの再環化が起こるような条件下再結合す
る。このDNAでGP208を形質転換し、コロニーをカゼイン
プレート上でスクリーニングした。95％を超える形質転
換体がかさを作らず、これらのクローンからプロテアー
ゼ遺伝子はすでに欠失していることを示している。代表
的クローンが選択されpNP6と名付けられた。（かさを産
生するわずかなパーセントのクローンは遺伝子の染色体
コピーとプラスミド内の相同配列の間の組換えにより生
じる天然epr遺伝子を運ぶベクターを持っていると推定
される。） epr遺伝子のヌクレオチドおよび推論されるアミノ酸配
列 サブクローニングおよび欠失実験によりプロテアーゼ
遺伝子の大部分は1.6kb EcoR V断片（図５）上に含まれ
ていたことが確立された。1.6kb EcoR V断片のヌクレオ
チド配列決定（図６）は、左端から450bpから始まり右
端まで進むほとんど完全な断片をおおうオープンリーデ
ィングフレームを明らかにした（図２参照）。推定され
たアミノ酸配列とGENBANKの他のアミノ酸配列との比較
はORFによりコードされているタンパク質がズブチリシ
ン（Stahlら、1984、ジャーナル オブ バクテリオロ
ジー、158:411）および枯草菌168からのIsp−１（Koide
ら、1986、ジャーナル オブ バクテリオロジー、167:
110）の両方と強い相同性（約40％）を持っていること
を示している。このプロテアーゼ遺伝子の最も可能性の
ある開始コドンは図６の位置１のATGである。このATG
（ORFの第２のコドン）に先立って優れた共通枯草菌リ
ボソーム結合部位（AAAGGAGATGA）が存在する。さら
に、このメチオニンに続く最初の26アミノ酸は典型的枯
草菌シグナル配列に似ている;2つの陽性荷電アミノ酸の
短い配列、続いての15疎水性アミノ酸、ヘリックス−破
壊プロリン、および典型的Ala X Alaシグナル ペプチ
ダーゼ切断部位（Perlmanら、1983、ジャーナル オブ
モレキユラー バイオロジー、167:391）。
し、カゼインプレートにハローを作るコロニーを選択す
ることによりpNP3挿入物内の遺伝子の位置がさらに規定
された。ハローを形成し、且つ1.6kb挿入物を含む第５
図のクローンは、pNP5と名付けられた。この断片内のプ
ロテアーゼ遺伝子の存在はさらにpNP1からの4kb挿入物
のこの部分を欠失させることにより確認された。pNP1を
EcoR Vで消化し、1.6kb EcoR V挿入物の取り込みを起こ
さずにベクターの再環化が起こるような条件下再結合す
る。このDNAでGP208を形質転換し、コロニーをカゼイン
プレート上でスクリーニングした。95％を超える形質転
換体がかさを作らず、これらのクローンからプロテアー
ゼ遺伝子はすでに欠失していることを示している。代表
的クローンが選択されpNP6と名付けられた。（かさを産
生するわずかなパーセントのクローンは遺伝子の染色体
コピーとプラスミド内の相同配列の間の組換えにより生
じる天然epr遺伝子を運ぶベクターを持っていると推定
される。） epr遺伝子のヌクレオチドおよび推論されるアミノ酸配
列 サブクローニングおよび欠失実験によりプロテアーゼ
遺伝子の大部分は1.6kb EcoR V断片（図５）上に含まれ
ていたことが確立された。1.6kb EcoR V断片のヌクレオ
チド配列決定（図６）は、左端から450bpから始まり右
端まで進むほとんど完全な断片をおおうオープンリーデ
ィングフレームを明らかにした（図２参照）。推定され
たアミノ酸配列とGENBANKの他のアミノ酸配列との比較
はORFによりコードされているタンパク質がズブチリシ
ン（Stahlら、1984、ジャーナル オブ バクテリオロ
ジー、158:411）および枯草菌168からのIsp−１（Koide
ら、1986、ジャーナル オブ バクテリオロジー、167:
110）の両方と強い相同性（約40％）を持っていること
を示している。このプロテアーゼ遺伝子の最も可能性の
ある開始コドンは図６の位置１のATGである。このATG
（ORFの第２のコドン）に先立って優れた共通枯草菌リ
ボソーム結合部位（AAAGGAGATGA）が存在する。さら
に、このメチオニンに続く最初の26アミノ酸は典型的枯
草菌シグナル配列に似ている;2つの陽性荷電アミノ酸の
短い配列、続いての15疎水性アミノ酸、ヘリックス−破
壊プロリン、および典型的Ala X Alaシグナル ペプチ
ダーゼ切断部位（Perlmanら、1983、ジャーナル オブ
モレキユラー バイオロジー、167:391）。
配列分析は1.6kb EcoR V断片はEprプロテアーゼ活性
を十分にコードしているけれども、ORFは下流EcoR V部
位の末端を越して続いていることを示している。遺伝子
の３′末端の地図作製のため、重なっているKpn IからS
al I断片のDNA配列が決定された（図６）。図２に示し
たごとく、ORFの末端はEcoR V部位の717bp下流であるこ
とが観察されており、また全epr遺伝子は645のアミノ酸
タンパク質をコードしている事が見い出されており、そ
の最初の380のアミノ酸はズブチリシンと相同である
（図６）。1.6kb EcoR V断片中にコードされているＮ−
末端405のアミノ酸でプロテアーゼ活性には十分である
のでＣ−末端の240のアミノ酸はタンパク質分解活性に
は明らかに必須ではない。
を十分にコードしているけれども、ORFは下流EcoR V部
位の末端を越して続いていることを示している。遺伝子
の３′末端の地図作製のため、重なっているKpn IからS
al I断片のDNA配列が決定された（図６）。図２に示し
たごとく、ORFの末端はEcoR V部位の717bp下流であるこ
とが観察されており、また全epr遺伝子は645のアミノ酸
タンパク質をコードしている事が見い出されており、そ
の最初の380のアミノ酸はズブチリシンと相同である
（図６）。1.6kb EcoR V断片中にコードされているＮ−
末端405のアミノ酸でプロテアーゼ活性には十分である
のでＣ−末端の240のアミノ酸はタンパク質分解活性に
は明らかに必須ではない。
eprタンパク質の構造 イン ビトロでの転写−翻訳実験がタンパク質の大き
さの確立に使用された。プラスミドpNP3DNA（全epr遺伝
子を持つ2.7kbのHpa I−Sal I断片を含む）をS30−結合
転写／翻訳系（ニユー イングランドヌクレア）に添加
したところ約75,000ダルトンのタンパク質が合成され
た。（更に60,000および34,000ダルトンのタンパク質も
また観察されたが多分75,000ダルトンのタンパク質の部
分切断または分解型を表わしているのであろう。）この
大きさは推定されたアミノ酸配列に基づいた第１次産物
の予想分子量69,702ダルトンと非常によく一致してい
る。
さの確立に使用された。プラスミドpNP3DNA（全epr遺伝
子を持つ2.7kbのHpa I−Sal I断片を含む）をS30−結合
転写／翻訳系（ニユー イングランドヌクレア）に添加
したところ約75,000ダルトンのタンパク質が合成され
た。（更に60,000および34,000ダルトンのタンパク質も
また観察されたが多分75,000ダルトンのタンパク質の部
分切断または分解型を表わしているのであろう。）この
大きさは推定されたアミノ酸配列に基づいた第１次産物
の予想分子量69,702ダルトンと非常によく一致してい
る。
eprプロテアーゼのアミノ−末端の半分とズブチリシ
ンの間の相同性はEprもまたズブチリシンのプロ配列と
同じ大きさの（70−80アミノ酸）プロ配列でプレプロ酵
素として産生されるであろう事を示唆している。もし本
当なら、およびもし更なる部分切断がなければ成熟Epr
酵素は約58,000の分子量を持つと議論されるであろう。
しかしながら培養上澄の試験では本タンパク質は約34,0
00の分子量を持つ事を示している。epr遺伝子（pNP3ま
たはpNP5）を持つプラスミドまたはただ親プラスミド単
独（pBs81/6）を含む枯草菌株GP203により分泌されるタ
ンパク質のSDS−PAGEによる比較ではpNP3にクローン化
された2.7kb Hpa I−Sal I断片は約34,000および38,000
ダルトンのタンパク質の産生を指示し、一方、ｐ pNP5
中に同じ方向性で（図１）クローン化した1.6kb EcoR V
断片はただ34,000ダルトンタンパク質の産生のみを指示
した。この２つのタンパク質は部分切断またはタンパク
質加水分解性分解により生じたEprタンパク質の異った
型であろう。明らかに、epr遺伝子の３′の1/3を欠く1.
6kb EcoR V断片は全遺伝子が存在する場合に観察される
ものと同じような大きさの活性プロテアーゼの産生を指
示できる。この事はプロテアーゼは通常Ｃ−末端の部分
切断を受けることを示唆している。
ンの間の相同性はEprもまたズブチリシンのプロ配列と
同じ大きさの（70−80アミノ酸）プロ配列でプレプロ酵
素として産生されるであろう事を示唆している。もし本
当なら、およびもし更なる部分切断がなければ成熟Epr
酵素は約58,000の分子量を持つと議論されるであろう。
しかしながら培養上澄の試験では本タンパク質は約34,0
00の分子量を持つ事を示している。epr遺伝子（pNP3ま
たはpNP5）を持つプラスミドまたはただ親プラスミド単
独（pBs81/6）を含む枯草菌株GP203により分泌されるタ
ンパク質のSDS−PAGEによる比較ではpNP3にクローン化
された2.7kb Hpa I−Sal I断片は約34,000および38,000
ダルトンのタンパク質の産生を指示し、一方、ｐ pNP5
中に同じ方向性で（図１）クローン化した1.6kb EcoR V
断片はただ34,000ダルトンタンパク質の産生のみを指示
した。この２つのタンパク質は部分切断またはタンパク
質加水分解性分解により生じたEprタンパク質の異った
型であろう。明らかに、epr遺伝子の３′の1/3を欠く1.
6kb EcoR V断片は全遺伝子が存在する場合に観察される
ものと同じような大きさの活性プロテアーゼの産生を指
示できる。この事はプロテアーゼは通常Ｃ−末端の部分
切断を受けることを示唆している。
プラスミドpNP3上にepr遺伝子を含むバシラス（Bacil
lus）株GP208はEprプロテアーゼの過産生に使用でき、
それは続いて常法により精製できる。
lus）株GP208はEprプロテアーゼの過産生に使用でき、
それは続いて常法により精製できる。
枯草菌染色体上のeprの位置 枯草菌染色体上のeprの地図作製のため、染色体のepr
遺伝子部位に薬剤耐性マーカーが導入され、挿入の位置
決定のためファージPBS1−開始形質導入が使用された。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ca
t）遺伝子を含む1.3kbのEcoR I断片をepr遺伝子を含む
大腸菌プラスミド上の独特のEcoR I部位（pNP2は図７に
示してある）内にクローン化する。得られるプラスミド
（pNP7）を枯草菌GP208の形質転換に使用し、クロラム
フェニコール耐性形質転換体を選択する。このプラスミ
ドは枯草菌中では自律的に複製できないので、Cmr形質
転換体はプラスミド上のクローン化epr遺伝子および遺
伝子の染色体コピー間の１回の相互組換えによって生じ
たことが予想される。地図作製実験は挿入されたcat遺
伝子およびepr遺伝子はsac A321に強く結合されており
（77％共形質導入）、pur A16には弱く結合されており
（５％共形質導入）、またhis A1には結合されていな
い。これらの発見は、他の概知のプロテアーゼ遺伝子が
含まれていない遺伝地図の領域のsac Aの近くにepr遺伝
子が位置している事を示唆している。
遺伝子部位に薬剤耐性マーカーが導入され、挿入の位置
決定のためファージPBS1−開始形質導入が使用された。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ca
t）遺伝子を含む1.3kbのEcoR I断片をepr遺伝子を含む
大腸菌プラスミド上の独特のEcoR I部位（pNP2は図７に
示してある）内にクローン化する。得られるプラスミド
（pNP7）を枯草菌GP208の形質転換に使用し、クロラム
フェニコール耐性形質転換体を選択する。このプラスミ
ドは枯草菌中では自律的に複製できないので、Cmr形質
転換体はプラスミド上のクローン化epr遺伝子および遺
伝子の染色体コピー間の１回の相互組換えによって生じ
たことが予想される。地図作製実験は挿入されたcat遺
伝子およびepr遺伝子はsac A321に強く結合されており
（77％共形質導入）、pur A16には弱く結合されており
（５％共形質導入）、またhis A1には結合されていな
い。これらの発見は、他の概知のプロテアーゼ遺伝子が
含まれていない遺伝地図の領域のsac Aの近くにepr遺伝
子が位置している事を示唆している。
epr欠失突然変異体の構築 プロテアーゼ活性を欠く突然変異体バシラス（Bacill
us）を作製するには５′末端が欠失したクローン化遺伝
子を構築し、染色体中の野生型遺伝子との置き換えに使
用する。最初にpNP2をBamH Iで消化し（epr遺伝子内の
非反復部位を切断する）、それから直線状プラスミドDN
AをBal31エキソヌクレアーゼで32℃にて５分間処理し、
再結合して大腸菌JM107を形質転換する。20の形質転換
体からプラスミドDNAを単離し、EcoR IおよびHind III
で消化してepr遺伝子挿入物を除去し、ゲル電気泳動に
より分析する。プラスミドの１つは2.7kb断片が2.3kb E
coR I−Hind III断片で置き換わっており、epr遺伝子配
列から400塩基対が失われていた事を示している。この
プラスミドはpNP8と称される（図７）。この欠失突然変
異体が前記の遺伝子置換法により枯草菌GP208内へ導入
された。pEcc IからのEcoR I断片を含むcat遺伝子がpNP
8のEcoR I部位に導入されpNP9が作製された（図７）。
この大腸菌プラスミドを枯草菌GP208の形質転換に使用
し、Cmrコロニーを選択する。この形質転換体の大部分
は非常に小さいかさを産生し、残りの30％はカゼインプ
レート上かさを産生しなかった。かさすなわちプロテア
ーゼ活性がないことは染色体DNAおよびプラスミドDNAの
コンカテマーからの相同配列間の２重の交差により生じ
る；これらの株は大腸菌レプリコンおよび欠失epr遺伝
子の２つのコピーが側面に接したcat遺伝子を含んでい
る。重複を解くためepr遺伝子の２つのコピー間の組み
換えを受けた（しかし、それはcat遺伝子および大腸菌
レプリコンが捨てられている）株をスクリーニングし、
単一のコロニーが選択され、薬剤選択なしでリッチ培地
中で一夜増殖させる。この培養から生じた個々のコロニ
ーを薬剤耐性でスクリーニングするとこれらの約0.1％
がCmsであることが観察された。４つのプロテアーゼ遺
伝子（apr,npr,isp−１およびepr）内に欠失を含むその
ような株の１つ、GP216が更なる研究のため選択され
た。
us）を作製するには５′末端が欠失したクローン化遺伝
子を構築し、染色体中の野生型遺伝子との置き換えに使
用する。最初にpNP2をBamH Iで消化し（epr遺伝子内の
非反復部位を切断する）、それから直線状プラスミドDN
AをBal31エキソヌクレアーゼで32℃にて５分間処理し、
再結合して大腸菌JM107を形質転換する。20の形質転換
体からプラスミドDNAを単離し、EcoR IおよびHind III
で消化してepr遺伝子挿入物を除去し、ゲル電気泳動に
より分析する。プラスミドの１つは2.7kb断片が2.3kb E
coR I−Hind III断片で置き換わっており、epr遺伝子配
列から400塩基対が失われていた事を示している。この
プラスミドはpNP8と称される（図７）。この欠失突然変
異体が前記の遺伝子置換法により枯草菌GP208内へ導入
された。pEcc IからのEcoR I断片を含むcat遺伝子がpNP
8のEcoR I部位に導入されpNP9が作製された（図７）。
この大腸菌プラスミドを枯草菌GP208の形質転換に使用
し、Cmrコロニーを選択する。この形質転換体の大部分
は非常に小さいかさを産生し、残りの30％はカゼインプ
レート上かさを産生しなかった。かさすなわちプロテア
ーゼ活性がないことは染色体DNAおよびプラスミドDNAの
コンカテマーからの相同配列間の２重の交差により生じ
る；これらの株は大腸菌レプリコンおよび欠失epr遺伝
子の２つのコピーが側面に接したcat遺伝子を含んでい
る。重複を解くためepr遺伝子の２つのコピー間の組み
換えを受けた（しかし、それはcat遺伝子および大腸菌
レプリコンが捨てられている）株をスクリーニングし、
単一のコロニーが選択され、薬剤選択なしでリッチ培地
中で一夜増殖させる。この培養から生じた個々のコロニ
ーを薬剤耐性でスクリーニングするとこれらの約0.1％
がCmsであることが観察された。４つのプロテアーゼ遺
伝子（apr,npr,isp−１およびepr）内に欠失を含むその
ような株の１つ、GP216が更なる研究のため選択され
た。
染色体epr遺伝子の欠失はサザン ハイブリダイゼー
ションにより確認された。Cmr親株同様GP216はカゼイン
プレート上にかさを産生することができない。しかしな
がら液体培養における14C−カゼインプロテアーゼ検定
はepr突然変異単独では残余プロテアーゼ活性を完全に
除去しない事を示している。epr,apr,nprおよびispが欠
失している株はapr,nprおよびispのみに突然変異を持つ
株よりも有意に少ないプロテアーゼの産生とはならなか
った。最後に、４重プロテアーゼ欠失株の増殖および胞
子形成が標準実験室培地を用いて検定された。野生型と
比較した場合、LB培地中での増殖は何の差異も観察され
なかった。同様に30時間DSM培地上で増殖させた後の胞
子形成頻度においても何ら評価する程の差異は見られな
かった（GP208およびGP216に対して１×108胞子/ml）。
ションにより確認された。Cmr親株同様GP216はカゼイン
プレート上にかさを産生することができない。しかしな
がら液体培養における14C−カゼインプロテアーゼ検定
はepr突然変異単独では残余プロテアーゼ活性を完全に
除去しない事を示している。epr,apr,nprおよびispが欠
失している株はapr,nprおよびispのみに突然変異を持つ
株よりも有意に少ないプロテアーゼの産生とはならなか
った。最後に、４重プロテアーゼ欠失株の増殖および胞
子形成が標準実験室培地を用いて検定された。野生型と
比較した場合、LB培地中での増殖は何の差異も観察され
なかった。同様に30時間DSM培地上で増殖させた後の胞
子形成頻度においても何ら評価する程の差異は見られな
かった（GP208およびGP216に対して１×108胞子/ml）。
新しいタンパク分解活性の同定 枯草菌の株の４つの非必須プロテアーゼ遺伝子apr np
r isp−１およびeprが欠失させられている。これらの欠
失は野生株に比較して約96％Spo+宿主の培養上澄液中の
総細胞外プロテアーゼを減少させているが、バシラス
（Bacillus）中でのプロテアーゼ−不安定化生成物の産
生には残っている４％の残余プロテアーゼ活性を減少ま
たは除去することが望ましい。
r isp−１およびeprが欠失させられている。これらの欠
失は野生株に比較して約96％Spo+宿主の培養上澄液中の
総細胞外プロテアーゼを減少させているが、バシラス
（Bacillus）中でのプロテアーゼ−不安定化生成物の産
生には残っている４％の残余プロテアーゼ活性を減少ま
たは除去することが望ましい。
アゾコール検定を使用し、多プロテアーゼ欠失枯草菌
株（aprΔ,nprΔ,eprΔ,isp−１Δ）でまた制御タンパ
ク質をコードしているsacQ＊遺伝子も含んでいるGP227
中のこの残余活性を説明する２つの新規プロテアーゼが
同定された。sacQ＊遺伝子産物は残余プロテアーゼ活性
を含むバシラス（Bacillus）中の分解性酵素の産生を促
進するように機能し、それは同一譲り受け人に対して譲
渡された同時係属中の出願U.S.S.N921.343号の主題であ
り、引例としてここに含まれている。sacQ＊による促進
のため、GP227株はsacQ＊を欠くGP216よりも本質的に多
いプロテアーゼ活性を産み出す。
株（aprΔ,nprΔ,eprΔ,isp−１Δ）でまた制御タンパ
ク質をコードしているsacQ＊遺伝子も含んでいるGP227
中のこの残余活性を説明する２つの新規プロテアーゼが
同定された。sacQ＊遺伝子産物は残余プロテアーゼ活性
を含むバシラス（Bacillus）中の分解性酵素の産生を促
進するように機能し、それは同一譲り受け人に対して譲
渡された同時係属中の出願U.S.S.N921.343号の主題であ
り、引例としてここに含まれている。sacQ＊による促進
のため、GP227株はsacQ＊を欠くGP216よりも本質的に多
いプロテアーゼ活性を産み出す。
一般には、枯草菌GP227の培養液からの上澄液は濃宿
され、ゲル過カラムを通して分画されプロテアーゼ活
性が検定される。２つの別々の活性のピークがカラムか
ら溶出され、より大きなおよびより小さな分子量種に対
し各々RP−ＩおよびRP−II（残余プロテアーゼの略）と
呼ぶ。続いてのこれら２つのピークの分析により、各々
は異った酵素活性で説明されることが確認された。RP−
ＩおよびRP−IIタンパク質の単離および特徴付け、およ
びRP−ＩおよびRP−II遺伝子各々の欠失突然変異体の作
製を以下に記載する。
され、ゲル過カラムを通して分画されプロテアーゼ活
性が検定される。２つの別々の活性のピークがカラムか
ら溶出され、より大きなおよびより小さな分子量種に対
し各々RP−ＩおよびRP−II（残余プロテアーゼの略）と
呼ぶ。続いてのこれら２つのピークの分析により、各々
は異った酵素活性で説明されることが確認された。RP−
ＩおよびRP−IIタンパク質の単離および特徴付け、およ
びRP−ＩおよびRP−II遺伝子各々の欠失突然変異体の作
製を以下に記載する。
RP−Ｉの単離および特徴付け 簡単で効率の良い精製スキームが廃培養液からのRP−
Ｉの単離の為に開発された。培養菌をMRSラクトバシラ
ス培地（ディフコ、マルトースをグルコースに置換し
て）中で増殖させ、S1Y10らせん状カートリッジを付け
たアミコンCH2PR系を用いて約10倍に濃縮する。濃縮上
澄み液を50mM MES.0.4M NaCl,pH6.8に対して透析し、同
じ緩衝液で平衡化したSW3000HPLCゲル過カラムで分画
する。プロテアーゼ活性を含む分画は前記のアゾコール
検定を改良して使用し同定する。
Ｉの単離の為に開発された。培養菌をMRSラクトバシラ
ス培地（ディフコ、マルトースをグルコースに置換し
て）中で増殖させ、S1Y10らせん状カートリッジを付け
たアミコンCH2PR系を用いて約10倍に濃縮する。濃縮上
澄み液を50mM MES.0.4M NaCl,pH6.8に対して透析し、同
じ緩衝液で平衡化したSW3000HPLCゲル過カラムで分画
する。プロテアーゼ活性を含む分画は前記のアゾコール
検定を改良して使用し同定する。
プロテアーゼ活性が陽性の分画（より大きな分子量の
種に対応する）をプールし、YM5メンブランを付けた攪
拌セルを用いて濃縮し、50mM MES,100mM KCl,pH6.7に対
して透析し、同一の緩衝液で平衡化したベンズアミジン
−セファロース液体アフィニティ カラムに加える。カ
ラムに加えられたほとんどのタンパク質（97％）は樹脂
に結合しないが、RP−Ｉタンパク質は定量的に結合し、
250mM KClでカラムから溶出される。
種に対応する）をプールし、YM5メンブランを付けた攪
拌セルを用いて濃縮し、50mM MES,100mM KCl,pH6.7に対
して透析し、同一の緩衝液で平衡化したベンズアミジン
−セファロース液体アフィニティ カラムに加える。カ
ラムに加えられたほとんどのタンパク質（97％）は樹脂
に結合しないが、RP−Ｉタンパク質は定量的に結合し、
250mM KClでカラムから溶出される。
ベンズアミジン精製RP−ＩのSDS−PAGE分析によりタ
ンパク質は95％を超える均質性を持ち、約47,000ダルト
ンの分子量を持っていた事が明らかにされた。上に概説
した方法による精製により比活性が140倍増加し、全回
収率は約10％であった。
ンパク質は95％を超える均質性を持ち、約47,000ダルト
ンの分子量を持っていた事が明らかにされた。上に概説
した方法による精製により比活性が140倍増加し、全回
収率は約10％であった。
等電点電気泳動ゲルによりRP−Ｉは4.4から4.7の間の
pIを持ち、高酸性／塩基性残基組成であることを示して
いる。酵素は8.0の全適pHを持ち、アゾコールが基質と
して用いられた場合最高温度は60℃であった。PMSFで完
全に阻害され、それがセリン プロテアーゼである事を
示唆しているが、EDTAでは50mMのような高濃度でも阻害
されない。
pIを持ち、高酸性／塩基性残基組成であることを示して
いる。酵素は8.0の全適pHを持ち、アゾコールが基質と
して用いられた場合最高温度は60℃であった。PMSFで完
全に阻害され、それがセリン プロテアーゼである事を
示唆しているが、EDTAでは50mMのような高濃度でも阻害
されない。
RP−ＩはＮ−α−ベンゾリル−Ｌ−アルギニン エチ
ル エステル、フェニルアラニン メチルエステル、チ
ロシン エチルエステルおよびフェニルアラニン エチ
ルエステルのごときエステル基質同様変性コラーゲンお
よびカゼインのごときタンパク質基質（Ｏ＝Ｃ−Ｏ−対
Ｏ＝Ｃ−Ｎ−結合）の加水分解を触媒するが、合成基質
Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニ
リド中のアルギニンペプチド結合の加水分解は触媒しな
い。ひとまとめにして、これらのデータはRP−Ｉがセリ
ン エンドプロテイナーゼであり、エステラーゼ活性を
持ち、セリン プロテアーゼのズブチリシン スーパー
ファミリーに属していることを示している。さらに、こ
れらの特徴はRP−Ｉは普通バシロペプチダーゼＦと呼ば
れている（Boyerら、1968、アルキーブオブバイオケミ
ストリーアンドバイオフィジックス、128:442およびRoi
tschら、1983、ジャーナル オブ バクテリオロジー、
155,145）酵素かもしれない事を示している。バシロペ
プチダーゼＦは糖タンパク質であることが報告されてい
るが、RP−Ｉに炭水化物が伴われているのは観察されな
かった。
ル エステル、フェニルアラニン メチルエステル、チ
ロシン エチルエステルおよびフェニルアラニン エチ
ルエステルのごときエステル基質同様変性コラーゲンお
よびカゼインのごときタンパク質基質（Ｏ＝Ｃ−Ｏ−対
Ｏ＝Ｃ−Ｎ−結合）の加水分解を触媒するが、合成基質
Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニ
リド中のアルギニンペプチド結合の加水分解は触媒しな
い。ひとまとめにして、これらのデータはRP−Ｉがセリ
ン エンドプロテイナーゼであり、エステラーゼ活性を
持ち、セリン プロテアーゼのズブチリシン スーパー
ファミリーに属していることを示している。さらに、こ
れらの特徴はRP−Ｉは普通バシロペプチダーゼＦと呼ば
れている（Boyerら、1968、アルキーブオブバイオケミ
ストリーアンドバイオフィジックス、128:442およびRoi
tschら、1983、ジャーナル オブ バクテリオロジー、
155,145）酵素かもしれない事を示している。バシロペ
プチダーゼＦは糖タンパク質であることが報告されてい
るが、RP−Ｉに炭水化物が伴われているのは観察されな
かった。
RP−Ｉのための遺伝子のクローニング RP−Ｉのアミノ末端の28のアミノ酸の配列が連続エド
マン分解により自動気相配列決定装置上で決定され、こ
れは図８に示してある。DNAプローブ配列（81ヌクレオ
チド）は枯草菌においてこれらのアミノ酸のための最も
頻繁な使用コドンに基づいて合成された（図８）。RP−
ＩのＮ−末端アミノ酸配列は２つのトリプトファン残基
を含んでいる（位置７および18）。トリプトファンには
コドン縮重がないので、この事はRP−Ｉをコードしてい
る遺伝子のための高度に特異的なプローブの構築を容易
にする。
マン分解により自動気相配列決定装置上で決定され、こ
れは図８に示してある。DNAプローブ配列（81ヌクレオ
チド）は枯草菌においてこれらのアミノ酸のための最も
頻繁な使用コドンに基づいて合成された（図８）。RP−
ＩのＮ−末端アミノ酸配列は２つのトリプトファン残基
を含んでいる（位置７および18）。トリプトファンには
コドン縮重がないので、この事はRP−Ｉをコードしてい
る遺伝子のための高度に特異的なプローブの構築を容易
にする。
高分子量DNAは枯草菌株GP216から単離され、いく種類
かの制限酵素で各々消化され、断片は0.8％アガロース
ゲルを通した電気泳動を通して分離する。ゲルはサザ
ンの方法（前記文献）によりニトロセルロースフィルタ
ー上へブロットされ、半−ストリンジェントな条件下
（5XSSC,20％ホルムアミド、1Xデンハーツ、37℃にて）
32P末端−標識合成RP−Ｉ特異的プローブと一夜ハイブ
リダイズさせる。ハイブリダイゼーションに続き、ブロ
ットを2XSSC、0.1％SDS中室温にて、１時間洗浄する。
かの制限酵素で各々消化され、断片は0.8％アガロース
ゲルを通した電気泳動を通して分離する。ゲルはサザ
ンの方法（前記文献）によりニトロセルロースフィルタ
ー上へブロットされ、半−ストリンジェントな条件下
（5XSSC,20％ホルムアミド、1Xデンハーツ、37℃にて）
32P末端−標識合成RP−Ｉ特異的プローブと一夜ハイブ
リダイズさせる。ハイブリダイゼーションに続き、ブロ
ットを2XSSC、0.1％SDS中室温にて、１時間洗浄する。
RP−Ｉ特異的プローブは制限消化物の各々のただ１つ
のバンドのみにハイブリダイズし、プローブがRP−Ｉ遺
伝子に対し特異的であることを示している。Pst I消化
物においてはプローブは6.5kbフラグメントにハイブリ
ダイズし、それはクローニングのためには都合のよい大
きさであり、またRP−Ｉ遺伝子のほとんどまたはすべて
を含むのに十分な大きさである。
のバンドのみにハイブリダイズし、プローブがRP−Ｉ遺
伝子に対し特異的であることを示している。Pst I消化
物においてはプローブは6.5kbフラグメントにハイブリ
ダイズし、それはクローニングのためには都合のよい大
きさであり、またRP−Ｉ遺伝子のほとんどまたはすべて
を含むのに十分な大きさである。
以下のごとくして枯草菌DNAから６−7kbの大きさの範
囲のPst I挿入物を含むクローンバンクが調製された。
株GP216の染色体DNAをPst Iで消化し、0.8％アガロース
ゲル上で分離する。６−7kbのDNA断片をゲルから電気的
溶出により精製し、リガーゼ処理によるベクターの再環
化を防ぐため子ウシ腸ホスファターゼで前もって処理し
てあるPst I消化pBR322と連結する。連結DNAでコンピテ
ント大腸菌DH5細胞を形質転換し、テトラサイクリン含
有培地上に塗布する。約３×104のTetr形質転換体を
得、その80％は６−7kbの範囲の大きさの挿入物を持つ
プラスミドを含んでいた。
囲のPst I挿入物を含むクローンバンクが調製された。
株GP216の染色体DNAをPst Iで消化し、0.8％アガロース
ゲル上で分離する。６−7kbのDNA断片をゲルから電気的
溶出により精製し、リガーゼ処理によるベクターの再環
化を防ぐため子ウシ腸ホスファターゼで前もって処理し
てあるPst I消化pBR322と連結する。連結DNAでコンピテ
ント大腸菌DH5細胞を形質転換し、テトラサイクリン含
有培地上に塗布する。約３×104のTetr形質転換体を
得、その80％は６−7kbの範囲の大きさの挿入物を持つ
プラスミドを含んでいた。
一組の550形質転換体を32P−標識RP−Ｉ特異性プロー
ブでのコロニーハイブリダイゼーションによりRP−Ｉ挿
入物の存在をスクリーニングしたところ、これらの形質
転換体の７つがプローブと強くハイブリダイズすること
が観察された。６つの陽性クローンからプラスミドDNA
を単離し、Pst IおよびHind IIIによる制限消化パター
ンが分析された。６つすべてのクローンが同一の制限パ
ターンを持っており、それらの１つからのプラスミドは
pCR83と名付けられた。
ブでのコロニーハイブリダイゼーションによりRP−Ｉ挿
入物の存在をスクリーニングしたところ、これらの形質
転換体の７つがプローブと強くハイブリダイズすること
が観察された。６つの陽性クローンからプラスミドDNA
を単離し、Pst IおよびHind IIIによる制限消化パター
ンが分析された。６つすべてのクローンが同一の制限パ
ターンを持っており、それらの１つからのプラスミドは
pCR83と名付けられた。
種々の制限酵素を用い、図９に示されたpCR83挿入物
の制限地図が作製された。成熟RP−ＩプロテアーゼのＮ
−末端の28のアミノ酸をコードしているRP−Ｉオリゴマ
ー プローブがサザンの方法（上記文献）によりpCR83
の制限消化物とハイブリダイズされた。プローブが0.65
kbのCla I−EcoR V断片とハイブリダイズすることが観
察され、この断片は遺伝子の５′末端を含んでいること
が示唆された。RP−Ｉ遺伝子の方向性を決定するため、
Cla I−EcoR V断片の鎖を別々に単鎖ファージM13内へク
ローン化した。M13クローンがRP−Ｉオリゴマーで調べ
られ、その結果はRP−Ｉ遺伝子が図９の地図に従うと左
側から右側の方向に配向していることが示された。
の制限地図が作製された。成熟RP−ＩプロテアーゼのＮ
−末端の28のアミノ酸をコードしているRP−Ｉオリゴマ
ー プローブがサザンの方法（上記文献）によりpCR83
の制限消化物とハイブリダイズされた。プローブが0.65
kbのCla I−EcoR V断片とハイブリダイズすることが観
察され、この断片は遺伝子の５′末端を含んでいること
が示唆された。RP−Ｉ遺伝子の方向性を決定するため、
Cla I−EcoR V断片の鎖を別々に単鎖ファージM13内へク
ローン化した。M13クローンがRP−Ｉオリゴマーで調べ
られ、その結果はRP−Ｉ遺伝子が図９の地図に従うと左
側から右側の方向に配向していることが示された。
図９に示したごとくPst I挿入物の一部のDNA配列が決
定され、81の塩基対配列（図10で下線を引いた）がタン
パク質の最初の28のアミノ酸をコードしている配列と正
確に対応していることが観察された。図10で示したBql
IIおよびCla I部位は図９で示したそれらと同一であ
り、さらに、EcoR V部位は図９に示された制限酵素地図
中に示されたものと同一である。RP−Ｉコード領域を取
り囲む非翻訳領域の部分もまた図10に示されている;5′
非翻訳領域内の下線を付けたDNA配列は推定リボソーム
結合部位に対応する。
定され、81の塩基対配列（図10で下線を引いた）がタン
パク質の最初の28のアミノ酸をコードしている配列と正
確に対応していることが観察された。図10で示したBql
IIおよびCla I部位は図９で示したそれらと同一であ
り、さらに、EcoR V部位は図９に示された制限酵素地図
中に示されたものと同一である。RP−Ｉコード領域を取
り囲む非翻訳領域の部分もまた図10に示されている;5′
非翻訳領域内の下線を付けたDNA配列は推定リボソーム
結合部位に対応する。
DNA配列はオープンリーディングフレームが15の位置
（図10中）で始まり、2270の位置まで伸びていることを
明らかにした。最も可能性の高いこのオープンリーディ
ングフレームのための開始コドンは図10の１の位置のAT
Gであろう。このATGに先立ってリポソーム結合部位（AA
AGGGGGATGA）があり、それは−17.4KcalのΔＧ計算値を
持っていた。このMetに続く最初の29アミノ酸は枯草菌
シグナル配列と似ている;5つの陽性に荷電したアミノ酸
を含む短い配列、続いての16の疎水性残基、ヘリックス
−破壊プロリン、および典型的Ala−Ｘ−Alaシグナルペ
プナダーゼ切断部位。シグナル ペプチダーゼ切断部位
らしい後に164残基の“プロ”領域があり、続いて成熟
タンパク質が始まっていることがＮ−末端アミノ酸配列
の決定により確認された。タンパク質配列からは不確か
であったＮ−末端の最初のアミノ酸はDNA配列の583−58
5の位置のAla残基と確認された。全成熟タンパク質は49
6のアミノ酸を含み予想分子量は52,729ダルトンであ
る。この大きさは47,000ダルトンの精製タンパク質の決
定された分子量とかなりの一致を示した。さらに、成熟
酵素の予測等電点（4.04）は観察された4.4−4.7のpIと
良く一致していた。GENBANKからRP−Ｉがズブチリン,IS
P−Ｉに対して部分的に相同であり（30％）、epr遺伝子
産物に対してより低い程度（27％）で相同である事が示
された。
（図10中）で始まり、2270の位置まで伸びていることを
明らかにした。最も可能性の高いこのオープンリーディ
ングフレームのための開始コドンは図10の１の位置のAT
Gであろう。このATGに先立ってリポソーム結合部位（AA
AGGGGGATGA）があり、それは−17.4KcalのΔＧ計算値を
持っていた。このMetに続く最初の29アミノ酸は枯草菌
シグナル配列と似ている;5つの陽性に荷電したアミノ酸
を含む短い配列、続いての16の疎水性残基、ヘリックス
−破壊プロリン、および典型的Ala−Ｘ−Alaシグナルペ
プナダーゼ切断部位。シグナル ペプチダーゼ切断部位
らしい後に164残基の“プロ”領域があり、続いて成熟
タンパク質が始まっていることがＮ−末端アミノ酸配列
の決定により確認された。タンパク質配列からは不確か
であったＮ−末端の最初のアミノ酸はDNA配列の583−58
5の位置のAla残基と確認された。全成熟タンパク質は49
6のアミノ酸を含み予想分子量は52,729ダルトンであ
る。この大きさは47,000ダルトンの精製タンパク質の決
定された分子量とかなりの一致を示した。さらに、成熟
酵素の予測等電点（4.04）は観察された4.4−4.7のpIと
良く一致していた。GENBANKからRP−Ｉがズブチリン,IS
P−Ｉに対して部分的に相同であり（30％）、epr遺伝子
産物に対してより低い程度（27％）で相同である事が示
された。
多コピーレプリコン上のRP−Ｉ遺伝子のクローニング pCR83からPst I断片を取り、エリスロマイシンおよび
カナマイシン耐性をコードしている多コピーバシラス
（Bacillus）レプリコンである線状pBD9のPst I内へ結
合する。結合DNAでコンピテントGP227細胞（sacQ＊促進
株）を形質転換し、カナマイシン耐性形質転換体を選択
する。6.5kb Pst I挿入物を運んでいるプラスミドを選
びpCR88と呼ぶ。
カナマイシン耐性をコードしている多コピーバシラス
（Bacillus）レプリコンである線状pBD9のPst I内へ結
合する。結合DNAでコンピテントGP227細胞（sacQ＊促進
株）を形質転換し、カナマイシン耐性形質転換体を選択
する。6.5kb Pst I挿入物を運んでいるプラスミドを選
びpCR88と呼ぶ。
この挿入物がRP−Ｉ遺伝子をコードしていることを確
認するため、pCR88またはpBD9を含むGP227細胞を選択的
条件下MRS培地中、37℃にて50時間増殖させる。上澄み
液試料を集め、プロテアーゼ活性を検定する。pCR88培
養物からの上澄み液はpBD9培養物からのものより約10倍
以上のプロテアーゼ活性を含んでいた。さらに、この分
泌プロテアーゼ活性はPMSFにより阻害を受け、および変
性タンパク質ゲル上で分画すると、pCR88試料からの上
澄み液は47kdの余分のタンパク質を含んでいた。これら
の結果からRP−Ｉ遺伝子が6.5kb断片内にコードされて
おり、多コピーレプリコン中への配列のクローニングは
RP−Ｉタンパク質の過生産を導くことが確立された。
認するため、pCR88またはpBD9を含むGP227細胞を選択的
条件下MRS培地中、37℃にて50時間増殖させる。上澄み
液試料を集め、プロテアーゼ活性を検定する。pCR88培
養物からの上澄み液はpBD9培養物からのものより約10倍
以上のプロテアーゼ活性を含んでいた。さらに、この分
泌プロテアーゼ活性はPMSFにより阻害を受け、および変
性タンパク質ゲル上で分画すると、pCR88試料からの上
澄み液は47kdの余分のタンパク質を含んでいた。これら
の結果からRP−Ｉ遺伝子が6.5kb断片内にコードされて
おり、多コピーレプリコン中への配列のクローニングは
RP−Ｉタンパク質の過生産を導くことが確立された。
枯草菌染色体上のRP−Ｉ遺伝子の位置 RP−Ｉ遺伝子（bpr）部位での染色体への薬剤耐性マ
ーカーの組み込みおよびcat挿入物の位置を決定するた
めのファージPBSI−開始形質導入を用いて、枯草菌染色
体上のbprの位置の地図作製を行った。クロラムフェニ
コール アセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子を
含む1.3kbのSma I断片をpCR92（pCR83の3.0kb Bgl IIが
pUC18にクローン化されている）の非連続EcoR V部位内
へクローン化する。EcoR V部位はbprのコード領域にあ
る（図10）。得られるプラスミドpAS112はEcoR Iで消化
して線状となし、枯草菌株GP216の形質転換に使用し、
クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択する（GP23
8）。Cmr形質転換体は線状プラスミドおよび染色体の間
の２重交差の結果と予測される（マーカー置換）。bpr
遺伝子を中断させて染色体中にcat遺伝子が組み込まれ
ていることを確認するためサザン ハイブリダイゼーシ
ョンが使用された。地図作製実験は、挿入されたcat遺
伝子およびbprは強くpyr D1（89％）と結合しており、m
et Cと弱く結合している（４％）ことを示している。中
性プロテアーゼ遺伝子（npr）をコードしている遺伝子
もまた染色体のこの領域で地図作製を行ったところ、np
rはpyrとはbprより弱く結合し（45％および32％）、met
Cとはbprより強く結合（18％および21％）していた。
ーカーの組み込みおよびcat挿入物の位置を決定するた
めのファージPBSI−開始形質導入を用いて、枯草菌染色
体上のbprの位置の地図作製を行った。クロラムフェニ
コール アセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子を
含む1.3kbのSma I断片をpCR92（pCR83の3.0kb Bgl IIが
pUC18にクローン化されている）の非連続EcoR V部位内
へクローン化する。EcoR V部位はbprのコード領域にあ
る（図10）。得られるプラスミドpAS112はEcoR Iで消化
して線状となし、枯草菌株GP216の形質転換に使用し、
クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択する（GP23
8）。Cmr形質転換体は線状プラスミドおよび染色体の間
の２重交差の結果と予測される（マーカー置換）。bpr
遺伝子を中断させて染色体中にcat遺伝子が組み込まれ
ていることを確認するためサザン ハイブリダイゼーシ
ョンが使用された。地図作製実験は、挿入されたcat遺
伝子およびbprは強くpyr D1（89％）と結合しており、m
et Cと弱く結合している（４％）ことを示している。中
性プロテアーゼ遺伝子（npr）をコードしている遺伝子
もまた染色体のこの領域で地図作製を行ったところ、np
rはpyrとはbprより弱く結合し（45％および32％）、met
Cとはbprより強く結合（18％および21％）していた。
RP−Ｉ遺伝子欠失物の構築 RP−Ｉ配列内の内部欠失はイン ビトロで発生させ
た。pCR83挿入物中のCla IおよびEcoR V部位間の650bp
の欠失は事実上、成熟RP−Ｉタンパク質のアミノ末端側
のほとんど半分をコードしている配列を除去することに
なる。欠失は以下の方法により行った。
た。pCR83挿入物中のCla IおよびEcoR V部位間の650bp
の欠失は事実上、成熟RP−Ｉタンパク質のアミノ末端側
のほとんど半分をコードしている配列を除去することに
なる。欠失は以下の方法により行った。
pCR78（6.5kb Pst I断片を含むpBR322クローン）の4.
5kb Pst I−EcoR I断片を単離し、前もってEcoR Iおよ
びPst Iで消化してあるpUC18（β−ガラクトシダーゼを
コードしている大腸菌lac Z遺伝子を含む）に結合す
る。結合混合物で大腸菌DH5細胞を形質転換する。Xgal
およびアムピシリン含有LB培地上へ塗布すると、８つの
白色コロニーが生じ、β−ガラクトシダーゼをコードし
ている遺伝子内への断片の挿入を示している。これらの
コロニーから調製されたプラスミドDNAは８つのコロニ
ーのうちの７つが4.5kb挿入物を持つプラスミドを含む
ことを示した。そのようなプラスミドの１つ、pKT2をEc
oR VおよびCla Iで消化し、クレノー断片で処理してCla
I末端を平滑化し、自己結合により再環化する。その後
結合されたDNAで大腸菌DH5細胞を形質転換する。約100
の形質転換体が生じ、Ampr形質転換体からプラスミドDN
Aが単離され、制限消化により分析された。８つのコロ
ニーのうち８つともCla I−EcoR V断片が欠失してい
た。そのようなプラスミドの１つをpKT2′と名付けた。
前記のごとくバシラス（Bacillus）組み込み体の選択に
使用するため、pEcc IからのEcoR I断片上に運ばれてい
るcat遺伝子をpKT2′内へ結合する。
5kb Pst I−EcoR I断片を単離し、前もってEcoR Iおよ
びPst Iで消化してあるpUC18（β−ガラクトシダーゼを
コードしている大腸菌lac Z遺伝子を含む）に結合す
る。結合混合物で大腸菌DH5細胞を形質転換する。Xgal
およびアムピシリン含有LB培地上へ塗布すると、８つの
白色コロニーが生じ、β−ガラクトシダーゼをコードし
ている遺伝子内への断片の挿入を示している。これらの
コロニーから調製されたプラスミドDNAは８つのコロニ
ーのうちの７つが4.5kb挿入物を持つプラスミドを含む
ことを示した。そのようなプラスミドの１つ、pKT2をEc
oR VおよびCla Iで消化し、クレノー断片で処理してCla
I末端を平滑化し、自己結合により再環化する。その後
結合されたDNAで大腸菌DH5細胞を形質転換する。約100
の形質転換体が生じ、Ampr形質転換体からプラスミドDN
Aが単離され、制限消化により分析された。８つのコロ
ニーのうち８つともCla I−EcoR V断片が欠失してい
た。そのようなプラスミドの１つをpKT2′と名付けた。
前記のごとくバシラス（Bacillus）組み込み体の選択に
使用するため、pEcc IからのEcoR I断片上に運ばれてい
るcat遺伝子をpKT2′内へ結合する。
cat遺伝子を挿入するにはpKT2′をEcoR Iで消化し、
子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、cat遺伝子
を含む1.3kb EcoR I断片に結合する。結合DNAでDH5細胞
を形質転換し、Amprコロニーはクロラムフェニコール含
有LB培地上に移す。100のコロニーのうち２つがCmrであ
った。これらの２つのコロニーからプラスミドDNAが単
離され、プラスミドDNAの制限酵素分析により1.3kb cat
遺伝子断片の存在が確認された。これらのプラスミドの
うちの１つ、pKT3が遺伝子置換法によるGP216株内への
欠失遺伝子の導入に使用された。
子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、cat遺伝子
を含む1.3kb EcoR I断片に結合する。結合DNAでDH5細胞
を形質転換し、Amprコロニーはクロラムフェニコール含
有LB培地上に移す。100のコロニーのうち２つがCmrであ
った。これらの２つのコロニーからプラスミドDNAが単
離され、プラスミドDNAの制限酵素分析により1.3kb cat
遺伝子断片の存在が確認された。これらのプラスミドの
うちの１つ、pKT3が遺伝子置換法によるGP216株内への
欠失遺伝子の導入に使用された。
このDNAでGP216を形質転換し、クロラムフェニコール
耐性コロニーが選択された。８つのCmRコロニーから染
色体DNAが抽出され、サザン ハイブリダイゼーション
により分析された。１つのクローンはベクター上および
染色体内の相同配列間の２重交差により生じる欠失RP−
Ｉ遺伝子の２つのコピーを含んでいた。クロラムフェニ
コール選択なしで増殖させ、その後クロラムフェニコー
ル含有TBAB培地上でレプリカ平板法を行う。１つのCms
コロニーが単離され、サザン分析で欠失した遺伝子が染
色体中の野生型RP−Ｉ遺伝子で置換されていた。この株
は、GP240と呼ぶことにする。GP240の培養液からの上澄
み液の分析によりRP−Ｉ活性が存在しないことが確認さ
れた。
耐性コロニーが選択された。８つのCmRコロニーから染
色体DNAが抽出され、サザン ハイブリダイゼーション
により分析された。１つのクローンはベクター上および
染色体内の相同配列間の２重交差により生じる欠失RP−
Ｉ遺伝子の２つのコピーを含んでいた。クロラムフェニ
コール選択なしで増殖させ、その後クロラムフェニコー
ル含有TBAB培地上でレプリカ平板法を行う。１つのCms
コロニーが単離され、サザン分析で欠失した遺伝子が染
色体中の野生型RP−Ｉ遺伝子で置換されていた。この株
は、GP240と呼ぶことにする。GP240の培養液からの上澄
み液の分析によりRP−Ｉ活性が存在しないことが確認さ
れた。
RP−IIの単離および特徴付け RP−IIはベソズアミジン−セファロースまたは例えば
アルギニン−セファロースおよびヘモグロビン−アガロ
ースのごとき他のプロテアーゼ−アフィニティ樹脂に結
合せず、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル過およ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき通常の精製
技術を使う必要があることが認められたのでRP−IIのた
めの精製スキームはRP−Ｉよりもより大がかりである。
アルギニン−セファロースおよびヘモグロビン−アガロ
ースのごとき他のプロテアーゼ−アフィニティ樹脂に結
合せず、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル過およ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき通常の精製
技術を使う必要があることが認められたのでRP−IIのた
めの精製スキームはRP−Ｉよりもより大がかりである。
GP227培養物の濃縮粗上澄み液をpH6.8で平衡化したDE
AE−セファセル（陰イオン交換）で分画する。このpHで
はRP−IIタンパク質は樹脂に結合できない；しかしなが
ら、加えた全タンパク質の約80％（RP−Ｉを含む）が樹
脂に結合し、それ故試料から除去される。カラム溶出物
は次にpH6.8で平衡化したCM−セファロースCL−6Bを用
いる陽イオン交換クロマトグラフィーにより分画する。
これらの条件下、RP−IIは樹脂に結合でき、カラムから
0.5MKClで溶出する。陽イオン交換工程の分解能を更に
促進させるため、RP−II溶出物は次にNaClの直線濃度勾
配により展開する4.6×250mm WCX（弱陽イオン交換）HP
LCカラムにより再分画する。WCXプールは続いてTSK−12
5HPLCカラムにより大きさで分画される。RP−IIピーク
をその後同じカラムで２度分画すると、SDS−PAGEによ
る分析でほとんど均一なRP−II調製試料を得る。プロテ
アーゼは6900倍以上精製され、GP227の培養液中の総タ
ンパク質の約0.01％であることを示している。もしく
は、RP−I-であり、sacQ＊促進配列を含むバシラス（Ba
cillus）株から約30倍以上のRP−IIが精製できる（U.S.
S.N921,343号、同一譲り受け人に対して譲渡され、ここ
に引例として含まれている）。なぜなら、そのような株
により産生されるRP−IIの量は本質的に増加し、培養液
中の総タンパク質の約0.3％を示している。
AE−セファセル（陰イオン交換）で分画する。このpHで
はRP−IIタンパク質は樹脂に結合できない；しかしなが
ら、加えた全タンパク質の約80％（RP−Ｉを含む）が樹
脂に結合し、それ故試料から除去される。カラム溶出物
は次にpH6.8で平衡化したCM−セファロースCL−6Bを用
いる陽イオン交換クロマトグラフィーにより分画する。
これらの条件下、RP−IIは樹脂に結合でき、カラムから
0.5MKClで溶出する。陽イオン交換工程の分解能を更に
促進させるため、RP−II溶出物は次にNaClの直線濃度勾
配により展開する4.6×250mm WCX（弱陽イオン交換）HP
LCカラムにより再分画する。WCXプールは続いてTSK−12
5HPLCカラムにより大きさで分画される。RP−IIピーク
をその後同じカラムで２度分画すると、SDS−PAGEによ
る分析でほとんど均一なRP−II調製試料を得る。プロテ
アーゼは6900倍以上精製され、GP227の培養液中の総タ
ンパク質の約0.01％であることを示している。もしく
は、RP−I-であり、sacQ＊促進配列を含むバシラス（Ba
cillus）株から約30倍以上のRP−IIが精製できる（U.S.
S.N921,343号、同一譲り受け人に対して譲渡され、ここ
に引例として含まれている）。なぜなら、そのような株
により産生されるRP−IIの量は本質的に増加し、培養液
中の総タンパク質の約0.3％を示している。
RP−IIはPMSF処理に対して敏感でなく、それ故セリン
プロテアーゼではない。SDS−PAGE分析はRP−IIが27.
3kdの分子量を持っていることを示している。RP−IIがp
H6.7でDEAEに、pH8.3でPAE−300（HPLC陰イオンカラ
ム）に結合しない事は、タンパク質が8.3を超える塩基
性等電点を持っている事を示している（pI＝8.7クロマ
トフォーカシングによる）。RP−IIはジチオスレイトー
ル（DTT、スルフヒドリル還元剤）に対して非常に敏感
で、アゾコール検定においては1mMの低い濃度で定量的
に阻害される。RP−IIはまた他のスルフヒドリル試薬と
金属キレート剤の組合せ（即ちメルカプトエタノールと
EDTA）に対しても敏感である。スルフヒドリル試薬によ
るプロテアーゼの阻害は比較的希であり、C.ヒストリチ
カム（histolyticum）からのコラゲナーゼおよびカルボ
キシペプチダーゼＡのごとき少数のプロテアーゼでしか
記載されていない。RP−IIはまたフェニルアラニン メ
チルエステルおよびｎ−ｔ−BOC−Ｌ−グルタミン酸−
α−フェニル エステルを加水分解するその能力で示さ
れるごときエステラーゼ活性も持っている。
プロテアーゼではない。SDS−PAGE分析はRP−IIが27.
3kdの分子量を持っていることを示している。RP−IIがp
H6.7でDEAEに、pH8.3でPAE−300（HPLC陰イオンカラ
ム）に結合しない事は、タンパク質が8.3を超える塩基
性等電点を持っている事を示している（pI＝8.7クロマ
トフォーカシングによる）。RP−IIはジチオスレイトー
ル（DTT、スルフヒドリル還元剤）に対して非常に敏感
で、アゾコール検定においては1mMの低い濃度で定量的
に阻害される。RP−IIはまた他のスルフヒドリル試薬と
金属キレート剤の組合せ（即ちメルカプトエタノールと
EDTA）に対しても敏感である。スルフヒドリル試薬によ
るプロテアーゼの阻害は比較的希であり、C.ヒストリチ
カム（histolyticum）からのコラゲナーゼおよびカルボ
キシペプチダーゼＡのごとき少数のプロテアーゼでしか
記載されていない。RP−IIはまたフェニルアラニン メ
チルエステルおよびｎ−ｔ−BOC−Ｌ−グルタミン酸−
α−フェニル エステルを加水分解するその能力で示さ
れるごときエステラーゼ活性も持っている。
配列決定のためのRP−IIの可能な最もきれいな試料を
得るため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離
を含む最終精製工程を実施した。電気泳動に続いてタン
パク質を電気泳動的にゲルからポリビニリデン ジフル
オリド（PVDF）膜のシートに移す。RP−IIは疎水性膜上
“ぬれた点”として視覚化され、相当する領域をシート
から切り出し、そのアミノ末端アミノ酸配列が決定され
た。RP−IIの15アミノ酸末端残基の配列は（Ser−Ile−
Ile−Gly−Thr−Asp−Glu−Arg−Thr−Arg−Ile−Ser−
Ser−Thr−Thr）セリンおよびアルギニン残基に富んで
いる。セリンおよびアルギニンは高い度合いのコドン縮
重を持っているので、この事は高度に特異的なプローブ
の作製の困難さを増加させる。それ故、更なるアミノ酸
配列情報を１つまたはそれ以上の非縮重アミノ酸残基を
含む内部ペプチドから得た。
得るため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離
を含む最終精製工程を実施した。電気泳動に続いてタン
パク質を電気泳動的にゲルからポリビニリデン ジフル
オリド（PVDF）膜のシートに移す。RP−IIは疎水性膜上
“ぬれた点”として視覚化され、相当する領域をシート
から切り出し、そのアミノ末端アミノ酸配列が決定され
た。RP−IIの15アミノ酸末端残基の配列は（Ser−Ile−
Ile−Gly−Thr−Asp−Glu−Arg−Thr−Arg−Ile−Ser−
Ser−Thr−Thr）セリンおよびアルギニン残基に富んで
いる。セリンおよびアルギニンは高い度合いのコドン縮
重を持っているので、この事は高度に特異的なプローブ
の作製の困難さを増加させる。それ故、更なるアミノ酸
配列情報を１つまたはそれ以上の非縮重アミノ酸残基を
含む内部ペプチドから得た。
RP−IIの内部ペプチド断片の配列分析 精製RP−IIのトリプシンペプチドを産生し、逆相HPLC
を用いて単離する。アミノ酸トリプトファンおよびメチ
オニンそれぞれはただ１つのアミノ酸コドンによりコー
ドされているので、これらのアミノ酸の両方の１つまた
はそれ以上をコードしている合成ヌクレオチド プロー
ブまたは“推測体”はその相補ヌクレオチド配列に対し
て非常に特異的であろう。
を用いて単離する。アミノ酸トリプトファンおよびメチ
オニンそれぞれはただ１つのアミノ酸コドンによりコー
ドされているので、これらのアミノ酸の両方の１つまた
はそれ以上をコードしている合成ヌクレオチド プロー
ブまたは“推測体”はその相補ヌクレオチド配列に対し
て非常に特異的であろう。
RP−IIトリプシン消化混合物のHPLCクロマドグラムは
３つの波長でモニターされた:210nm（ペプチド結合）、
227nm（芳香族残基、即ちフェニルアラニン、チロシ
ン、トリプトファン）および292nm（トリプトファンの
共役環構造）。292nmでの跡がトリプトファン残基を含
むRP−IIのペプチドの同定に使用された。210nmの跡は
配列分析のための分離された（即ち単一種のペプチド）
断片の基線を得るために使用された。210nmおよび292nm
の跡に基づいて配列決定のため３つの断片が選択され
た:T90,T94およびT92。推測体オリゴマーがこれらの断
片のアミノ酸配列に基づいて合成された。
３つの波長でモニターされた:210nm（ペプチド結合）、
227nm（芳香族残基、即ちフェニルアラニン、チロシ
ン、トリプトファン）および292nm（トリプトファンの
共役環構造）。292nmでの跡がトリプトファン残基を含
むRP−IIのペプチドの同定に使用された。210nmの跡は
配列分析のための分離された（即ち単一種のペプチド）
断片の基線を得るために使用された。210nmおよび292nm
の跡に基づいて配列決定のため３つの断片が選択され
た:T90,T94およびT92。推測体オリゴマーがこれらの断
片のアミノ酸配列に基づいて合成された。
図11（ａ）はRP−II断片T90において得られたアミノ
末端配列である。全体で15残基が得られ、その67％はた
だ１つまたは２つのみの可能なコドンを持っている。断
片T90の配列に基づいて構築されたプローブ（BRT90）の
特異性は予想されるトリプトファン残基（位置12）の存
在により促進された。各々の位置のかっこ内の数は各々
の残基に対する可能な数のコドンを示している。
末端配列である。全体で15残基が得られ、その67％はた
だ１つまたは２つのみの可能なコドンを持っている。断
片T90の配列に基づいて構築されたプローブ（BRT90）の
特異性は予想されるトリプトファン残基（位置12）の存
在により促進された。各々の位置のかっこ内の数は各々
の残基に対する可能な数のコドンを示している。
RP−II断片T94のアミノ末端配列が図11（ｂ）に示さ
れている。決定された30残基のどれにもトリプトファン
は観察されなかった。ただの36％の残基が（番号１−2
5）２つの可能なコドンを持つが、対応する75の塩基か
ら成るプローブ（707）はT90プローブにより行われる確
証ハイブリダイゼーション実験のために有益である。
れている。決定された30残基のどれにもトリプトファン
は観察されなかった。ただの36％の残基が（番号１−2
5）２つの可能なコドンを持つが、対応する75の塩基か
ら成るプローブ（707）はT90プローブにより行われる確
証ハイブリダイゼーション実験のために有益である。
第３のおよび最後のプローブはRP−IIフラグメントT9
2から得られる配列情報に基づいて構築された（図11
（Ｃ））。この配列の始まりおよび終りの比較的高い度
合の縮重のため、プローブは残基15−27に基づいて構築
された。得られた39−員のプローブ（715）は残基の半
分がただ１つまたは２つの可能なコドンしか持たないペ
プチドをコードしている。さらにこのプローブの特異性
は位置26および27のメチオニンおよびトリプトファンの
縦に並んだ位置により促進される。
2から得られる配列情報に基づいて構築された（図11
（Ｃ））。この配列の始まりおよび終りの比較的高い度
合の縮重のため、プローブは残基15−27に基づいて構築
された。得られた39−員のプローブ（715）は残基の半
分がただ１つまたは２つの可能なコドンしか持たないペ
プチドをコードしている。さらにこのプローブの特異性
は位置26および27のメチオニンおよびトリプトファンの
縦に並んだ位置により促進される。
RP−IIのクローニング 染色体DNAを種々の制限酵素で切断し、放射性オリゴ
マープローブBRT90および707を用いる一連のハイブリダ
イゼーションを実施する。両方のプローブとも32Pで標
識されており、半−ストリンジェント条件下（５×SS
C、10％ホルムアミド、１×デンハート、100μg/ml変性
サケ精子DNA、37℃）BamH I,Bgl II,Hinc II,Pst Iまた
はEcoR Iで消化したGP241DNAのサザン ブロットにハイ
ブリダイズさせる。18時間のハイブリダイゼーションの
後、ブロットを２×SSC、0.1％SDSで37℃にて１時間洗
浄し、その後同じ緩衝液で45℃にて１時間洗浄する。結
果を図12に示した。両方のプローブが同一の制限断片に
ハイブリダイズした:Hinc II,〜1kb;Pst I,3−4kbおよ
びEcoR I,6−7kb。プローブはまたBamH IおよびBgl II
−消化DNAの非常に大きな断片とハイブリダイズした。
マープローブBRT90および707を用いる一連のハイブリダ
イゼーションを実施する。両方のプローブとも32Pで標
識されており、半−ストリンジェント条件下（５×SS
C、10％ホルムアミド、１×デンハート、100μg/ml変性
サケ精子DNA、37℃）BamH I,Bgl II,Hinc II,Pst Iまた
はEcoR Iで消化したGP241DNAのサザン ブロットにハイ
ブリダイズさせる。18時間のハイブリダイゼーションの
後、ブロットを２×SSC、0.1％SDSで37℃にて１時間洗
浄し、その後同じ緩衝液で45℃にて１時間洗浄する。結
果を図12に示した。両方のプローブが同一の制限断片に
ハイブリダイズした:Hinc II,〜1kb;Pst I,3−4kbおよ
びEcoR I,6−7kb。プローブはまたBamH IおよびBgl II
−消化DNAの非常に大きな断片とハイブリダイズした。
３−4kbのPst I断片が以下のごとくDNAライブラリー
の構成に使用された。pBR322をPst Iで消化し、CIAPで
処理する。大きさで選択した３−4.5kbのPst I−消化GP
241染色体DNAを0.8％アガロース ゲルから電気的に溶
出する。約0.1μｇのPst I−切断pBR322および0.2μｇ
のサイズ−選択DNAを16℃にて一夜結合する。結合DNAで
大腸菌DH5細胞を形質転換する。約10,000のコロニーが
得られ、その60％が挿入DNAを持つプラスミドを含んで
いた。1400のコロニーをニトロセルロースフィルターで
15μg/mlテトラサイクリン含有のLBプレート上へパッチ
する。コロニーを37℃にて一夜増殖させた後、コロニー
を溶解し、DNAを変性し、および細胞破片を除去するた
めにフィルターを処理する。フィルターはその後80℃に
て２時間焼く。コロニーハイブリダイゼーションは放射
性標識プローブ707を用いて実施された。ハイブリダイ
ゼーション条件はサザン ブロット実験で用いた条件と
同一である。４つの陽性コロニーからのプラスミドDNA
の分析により、両方のプローブと強くハイブリダイズす
る3.6kb挿入物を持つプラスミドDNAを含む１つが同定さ
れた。このプラスミド（pLP1）は図13（ｂ）に示してあ
る。
の構成に使用された。pBR322をPst Iで消化し、CIAPで
処理する。大きさで選択した３−4.5kbのPst I−消化GP
241染色体DNAを0.8％アガロース ゲルから電気的に溶
出する。約0.1μｇのPst I−切断pBR322および0.2μｇ
のサイズ−選択DNAを16℃にて一夜結合する。結合DNAで
大腸菌DH5細胞を形質転換する。約10,000のコロニーが
得られ、その60％が挿入DNAを持つプラスミドを含んで
いた。1400のコロニーをニトロセルロースフィルターで
15μg/mlテトラサイクリン含有のLBプレート上へパッチ
する。コロニーを37℃にて一夜増殖させた後、コロニー
を溶解し、DNAを変性し、および細胞破片を除去するた
めにフィルターを処理する。フィルターはその後80℃に
て２時間焼く。コロニーハイブリダイゼーションは放射
性標識プローブ707を用いて実施された。ハイブリダイ
ゼーション条件はサザン ブロット実験で用いた条件と
同一である。４つの陽性コロニーからのプラスミドDNA
の分析により、両方のプローブと強くハイブリダイズす
る3.6kb挿入物を持つプラスミドDNAを含む１つが同定さ
れた。このプラスミド（pLP1）は図13（ｂ）に示してあ
る。
pLP1の制限地図（図13（ａ）は種々の制限エンドヌク
レアーゼを用いるpLP1の消化、大きさで分画した消化物
のニトロセルロース上への移動、および固定化された制
限断片の前記放射性標識オリゴマーによる探査により作
製された。RP−IIタンパク質内の全53アミノ酸をコード
している３つのオリゴマーのすべてが1.1kb Hinc II断
片とハイブリダイズする事が決定された。
レアーゼを用いるpLP1の消化、大きさで分画した消化物
のニトロセルロース上への移動、および固定化された制
限断片の前記放射性標識オリゴマーによる探査により作
製された。RP−IIタンパク質内の全53アミノ酸をコード
している３つのオリゴマーのすべてが1.1kb Hinc II断
片とハイブリダイズする事が決定された。
1.1kb Hinc II断片が単離されM13mp18内へクローン化
された。Hinc II断片を含むファージクローンはオリゴ
マープローブの１つとのハイブリダイゼーションにより
同定された。Hinc II断片のDNA配列は断片のほとんどに
わたる（図14中の−24位から939位）オープンリーディ
ングフレームを明らかにした。このオープンリーディン
グフレームに対しての最も可能性のある開始コドンは図
14の位置１のATGである。このATGに先立って−16.0Kcal
のΔＧ計算値を持つ枯草菌リボソーム結合部位（AAAGGA
GG）がある。このMetに続く最初の33のアミノ酸は枯草
菌シグナル配列に似ている;4つの陽性に荷電したアミノ
酸、続いての18の疎水性残基、ヘリックス−破壊プロリ
ンおよび典型的なAla−Ｘ−Alaシグナルペプチダーゼ切
断部位。推測されたシグナルペプチダーゼ切断部位の後
には58残基の“プロ”領域が観察され、続いて精製タン
パク質のＮ−末端アミノ酸配列で決定されているごとく
成熟タンパク質の開始となる。アミノ末端の16残基には
下縁が引かれており“Ｎ−末端”と示されている。３つ
の推測体が推論されたアミノ酸配列にもまた下線が引か
れており、T94,T92およびT90で表わされている。決定さ
れたペプチドのアミノ酸配列はヌクレオチド379−381で
コードされているセリン残基およびヌクレオチド391−3
93でコードされているシスティン残基を除いて推論アミ
ノ酸配列と一致している。決定されたアミノ酸配列は各
々システイン（T94ペプチド、14位）およびアスパラギ
ン残基（T94ペプチド、18位）を予言していた（図1
1）。全成熟タンパク質は221のアミノ酸を含むと推論さ
れ、予言される分子量は23,941ダルトンである。この大
きさは精製タンパク質の決定された分子量28,000ダルト
ンと大体一致している。
された。Hinc II断片を含むファージクローンはオリゴ
マープローブの１つとのハイブリダイゼーションにより
同定された。Hinc II断片のDNA配列は断片のほとんどに
わたる（図14中の−24位から939位）オープンリーディ
ングフレームを明らかにした。このオープンリーディン
グフレームに対しての最も可能性のある開始コドンは図
14の位置１のATGである。このATGに先立って−16.0Kcal
のΔＧ計算値を持つ枯草菌リボソーム結合部位（AAAGGA
GG）がある。このMetに続く最初の33のアミノ酸は枯草
菌シグナル配列に似ている;4つの陽性に荷電したアミノ
酸、続いての18の疎水性残基、ヘリックス−破壊プロリ
ンおよび典型的なAla−Ｘ−Alaシグナルペプチダーゼ切
断部位。推測されたシグナルペプチダーゼ切断部位の後
には58残基の“プロ”領域が観察され、続いて精製タン
パク質のＮ−末端アミノ酸配列で決定されているごとく
成熟タンパク質の開始となる。アミノ末端の16残基には
下縁が引かれており“Ｎ−末端”と示されている。３つ
の推測体が推論されたアミノ酸配列にもまた下線が引か
れており、T94,T92およびT90で表わされている。決定さ
れたペプチドのアミノ酸配列はヌクレオチド379−381で
コードされているセリン残基およびヌクレオチド391−3
93でコードされているシスティン残基を除いて推論アミ
ノ酸配列と一致している。決定されたアミノ酸配列は各
々システイン（T94ペプチド、14位）およびアスパラギ
ン残基（T94ペプチド、18位）を予言していた（図1
1）。全成熟タンパク質は221のアミノ酸を含むと推論さ
れ、予言される分子量は23,941ダルトンである。この大
きさは精製タンパク質の決定された分子量28,000ダルト
ンと大体一致している。
推論されたアミノ酸配列はGENBANKの他の配列とわず
かな相同性しか示さなかった。最も強い相同性はヒト
プロテアーゼＥおよびウシ プロカルボキシペプチダー
ゼＡに対するRP−II内の25のアミノ酸配列（131−155、
ヌクレオチド391−465でコードされている；図14）であ
った。
かな相同性しか示さなかった。最も強い相同性はヒト
プロテアーゼＥおよびウシ プロカルボキシペプチダー
ゼＡに対するRP−II内の25のアミノ酸配列（131−155、
ヌクレオチド391−465でコードされている；図14）であ
った。
さらにRP−II遺伝子の正体を確認するため、3.6kb Ps
t I断片が多−コピーバシラス（Bacillus）レプリコン
上に遺伝子組換えされ、RP−IIタンパク質の過生産が試
験された。この目的のためには、バシラス（Bacinnus）
プラスミドpBs81/6（Cmr,Neor）がRP−II遺伝子を含む
大腸菌クローン内へ挿入された。プラスミドpLP1（8.0k
b）をEcoR Iで消化し（Pst I挿入物の外側の１つの部位
で切断）、EcoR I−消化pBs81/6（4.5kb;図13（ａ））
に結合させる。得られるプラスミド（pCR130）でGP241
を形質転換し、クロラムフェニコールまたはネオマイシ
ン耐性形質転換体を選択する。この形質転換体の培養液
からの上澄み試料はプラスミドpBs81/6のみを含む細胞
からの上澄み液よりも３−４倍以上のアゾコール−加水
分解活性を含んでいることが観察され、RP−IIのための
遺伝子は3.6kb Pst I断片内に全部含まれていた。
t I断片が多−コピーバシラス（Bacillus）レプリコン
上に遺伝子組換えされ、RP−IIタンパク質の過生産が試
験された。この目的のためには、バシラス（Bacinnus）
プラスミドpBs81/6（Cmr,Neor）がRP−II遺伝子を含む
大腸菌クローン内へ挿入された。プラスミドpLP1（8.0k
b）をEcoR Iで消化し（Pst I挿入物の外側の１つの部位
で切断）、EcoR I−消化pBs81/6（4.5kb;図13（ａ））
に結合させる。得られるプラスミド（pCR130）でGP241
を形質転換し、クロラムフェニコールまたはネオマイシ
ン耐性形質転換体を選択する。この形質転換体の培養液
からの上澄み試料はプラスミドpBs81/6のみを含む細胞
からの上澄み液よりも３−４倍以上のアゾコール−加水
分解活性を含んでいることが観察され、RP−IIのための
遺伝子は3.6kb Pst I断片内に全部含まれていた。
枯草菌染色体上のRP−II遺伝子の位置 枯草菌染色体上のRP−II遺伝子（mpr）の地図を作る
ため、以下に記載するmpr遺伝子の部位で染色体に挿入
されているcat遺伝子を含むGP261株が使用され、cat挿
入の位置の決定のためにファージPBS1形質導入が使用さ
れる。
ため、以下に記載するmpr遺伝子の部位で染色体に挿入
されているcat遺伝子を含むGP261株が使用され、cat挿
入の位置の決定のためにファージPBS1形質導入が使用さ
れる。
地図作製実験は挿入されたcat遺伝子およびmprはcys
A14（７％共形質導入）およびaro I906（36％共形質導
入）に結合されており、pur A16およびdalには結合され
ていなかった。このデータはmprはcys Aおよびaro Iの
間にある事を示しており、遺伝子地図のこの領域にプロ
テアーゼ遺伝子が含まれていることはこれまで知られて
いない。
A14（７％共形質導入）およびaro I906（36％共形質導
入）に結合されており、pur A16およびdalには結合され
ていなかった。このデータはmprはcys Aおよびaro Iの
間にある事を示しており、遺伝子地図のこの領域にプロ
テアーゼ遺伝子が含まれていることはこれまで知られて
いない。
バシラス（Bacillus）染色体上のRP−II 遺伝子の欠失 他の枯草菌プロテアーゼのために記載されたごとく、
RP−IIバシラス（Bacillus）欠失突然変異体は染色体上
の完全コピーをRP−II遺伝子の欠失作りかえ物で置換し
て構築する。全RP−II遺伝子の欠失を確かめるため、挿
入物中の２つのHpa I部位の間のDNA領域を欠失させる
（図13（ａ））。この領域は1.1kb Hinc II断片の全部
およびさらにHinc II断片の上流の0.9kbのDNAを含んで
いる。
RP−IIバシラス（Bacillus）欠失突然変異体は染色体上
の完全コピーをRP−II遺伝子の欠失作りかえ物で置換し
て構築する。全RP−II遺伝子の欠失を確かめるため、挿
入物中の２つのHpa I部位の間のDNA領域を欠失させる
（図13（ａ））。この領域は1.1kb Hinc II断片の全部
およびさらにHinc II断片の上流の0.9kbのDNAを含んで
いる。
欠失を作製するには、プラスミドpLP1（3.6kb Pst I
断片を含むpBR322クローン）をHpa Iで消化し、アガロ
ースゲル上大きさによる分画を行う。pLP1の消化により
2kbの内部Hpa I断片およびベクター中心部およびPst I
挿入物と接したセグメントを含むより大きなHpa I断片
が放出される（図13（ｃ））。より大きなHpa I断片を
精製し、pMI1101からのクロラムフェニコール−耐性（c
at）遺伝子（Youngmanら1984、上記文献）かまたはpUB1
10の誘導体であるpKT4からのプレオマイシン耐性（bl
e）遺伝子（バシラス ストック センター、コロンバ
ス オハイオ、から入手可能）を含む精製平滑端化DNA
断片と結合する。
断片を含むpBR322クローン）をHpa Iで消化し、アガロ
ースゲル上大きさによる分画を行う。pLP1の消化により
2kbの内部Hpa I断片およびベクター中心部およびPst I
挿入物と接したセグメントを含むより大きなHpa I断片
が放出される（図13（ｃ））。より大きなHpa I断片を
精製し、pMI1101からのクロラムフェニコール−耐性（c
at）遺伝子（Youngmanら1984、上記文献）かまたはpUB1
10の誘導体であるpKT4からのプレオマイシン耐性（bl
e）遺伝子（バシラス ストック センター、コロンバ
ス オハイオ、から入手可能）を含む精製平滑端化DNA
断片と結合する。
cat遺伝子はpEcclから1.6kbのSma I断片として単離さ
れている。このDNAを単離されたpLP1のより大きなHpa I
断片と結合する。その後結合DNAで大腸菌DH5細胞を形質
転換する。約20のTetrコロニーを生じる。コロニーをLB
培地＋５μg/mlクロラムフェニコール上にパッチした場
合１つのコロニーがCmrであることが見い出された。こ
のコロニーからのプラスミドDNAを分析するとcat遺伝子
の存在が確認された。このプラスミドはpLP2と称され
た。
れている。このDNAを単離されたpLP1のより大きなHpa I
断片と結合する。その後結合DNAで大腸菌DH5細胞を形質
転換する。約20のTetrコロニーを生じる。コロニーをLB
培地＋５μg/mlクロラムフェニコール上にパッチした場
合１つのコロニーがCmrであることが見い出された。こ
のコロニーからのプラスミドDNAを分析するとcat遺伝子
の存在が確認された。このプラスミドはpLP2と称され
た。
プラスミドpLP2（図13（ｃ））をPst Iで消化し、GP2
41を形質転換する。この形質転換体は約280のCmrコロニ
ーを与えた；更なる研究のため１つのコロニーが選択さ
れた（GP261）。GP261のコンピテント細胞が調製され、
pDP104（sacQ＊）で形質転換された;10のTetrコロニー
が生じた。４つのコロニーをMRS培地中で増殖させ、sac
Q＊の存在は上昇したアミノペプチダーゼレベルにより
確認される。この株はGP262と称される。
41を形質転換する。この形質転換体は約280のCmrコロニ
ーを与えた；更なる研究のため１つのコロニーが選択さ
れた（GP261）。GP261のコンピテント細胞が調製され、
pDP104（sacQ＊）で形質転換された;10のTetrコロニー
が生じた。４つのコロニーをMRS培地中で増殖させ、sac
Q＊の存在は上昇したアミノペプチダーゼレベルにより
確認される。この株はGP262と称される。
cat遺伝子はしばしば他のベクターの選択に使用され
るので、バシラス（Bacillus）染色体上のRP−II遺伝子
の欠失の印を付けるのに異った抗生物質耐性もまた使用
される；即ちpUB110のプレオマイシン耐性遺伝子。ble
遺伝子はpUB110の誘導体であるプラスミドpKT4からEcoR
V−Sma I断片として単離され、大腸菌DH5細胞を形質転
換する前に精製したより大きなHpa I断片に結合する
（図13（ｃ））；テトラサイクリン耐性形質転換体を選
択し、２μg/mlの最終濃度でフレオマイシン（ブレオマ
イシンの誘導体）を含むTBABプレート上にパッチングす
ることによりフレオマイシンに対する耐性でスクリーニ
ングする。47のTetr形質転換体がそのようにしてスクリ
ーニングされ、７つはまたフレオマイシン耐性でもあっ
た。ble遺伝子の挿入はこれらのクローンから単離され
るプラスミドの制限分析により確認された。これらのプ
ラスミドの１つpCR125（図13（ｃ））が以下に記載する
ごとく遺伝子置換法によりGP241株内へのble遺伝子マー
カーを含む欠失遺伝子の導入に使用される。
るので、バシラス（Bacillus）染色体上のRP−II遺伝子
の欠失の印を付けるのに異った抗生物質耐性もまた使用
される；即ちpUB110のプレオマイシン耐性遺伝子。ble
遺伝子はpUB110の誘導体であるプラスミドpKT4からEcoR
V−Sma I断片として単離され、大腸菌DH5細胞を形質転
換する前に精製したより大きなHpa I断片に結合する
（図13（ｃ））；テトラサイクリン耐性形質転換体を選
択し、２μg/mlの最終濃度でフレオマイシン（ブレオマ
イシンの誘導体）を含むTBABプレート上にパッチングす
ることによりフレオマイシンに対する耐性でスクリーニ
ングする。47のTetr形質転換体がそのようにしてスクリ
ーニングされ、７つはまたフレオマイシン耐性でもあっ
た。ble遺伝子の挿入はこれらのクローンから単離され
るプラスミドの制限分析により確認された。これらのプ
ラスミドの１つpCR125（図13（ｃ））が以下に記載する
ごとく遺伝子置換法によりGP241株内へのble遺伝子マー
カーを含む欠失遺伝子の導入に使用される。
プラスミドpCR125をEcoR Iで消化し、線状プラスミド
DNAをGP241のフレオマイシン耐性への形質転換に使用す
る。耐性形質転換体はプレートに渡った０−５μg/mlフ
レオマイシンの濃度勾配を含むTBAB寒天プレート上に形
質転換細胞を塗布することにより選択された。プレート
上約2.5μg/mlのフレオマイシンに耐性の形質転換体はT
BABフレオマイシンプレート上で単集落精製され、その
後選択用抗生物質を含まないTBAB上で増殖させる（GP26
3株）。
DNAをGP241のフレオマイシン耐性への形質転換に使用す
る。耐性形質転換体はプレートに渡った０−５μg/mlフ
レオマイシンの濃度勾配を含むTBAB寒天プレート上に形
質転換細胞を塗布することにより選択された。プレート
上約2.5μg/mlのフレオマイシンに耐性の形質転換体はT
BABフレオマイシンプレート上で単集落精製され、その
後選択用抗生物質を含まないTBAB上で増殖させる（GP26
3株）。
陽性制御要素、sacQ＊と共に、RP−II欠失およびRP−
II遺伝子中にcatまたはble挿入物を持つ株の細胞外酵素
産生、特にプロテアーゼおよびエステラーゼ活性が評価
された。
II遺伝子中にcatまたはble挿入物を持つ株の細胞外酵素
産生、特にプロテアーゼおよびエステラーゼ活性が評価
された。
下記の表１に与えられたデータは５つのプロテアーゼ
遺伝子apr（ズブチリシン）、npr（中性プロテアー
ゼ）、epr（細胞外プロテアーゼ）、isp（内部セリンプ
ロテアーゼ）およびbprに無効な突然変異を運ぶ枯草菌
株GP239中のsacQ＊の存在はRP−IIプロテアーゼ（これ
はまたエステラーゼ活性も持っている）の産生を促進し
ていることを示している。sacQ＊制御要素を運ぶ枯草菌
の株からRP−IIを削った場合のプロテアーゼ産生への影
響を評価するため、以下の実験が実施された。
遺伝子apr（ズブチリシン）、npr（中性プロテアー
ゼ）、epr（細胞外プロテアーゼ）、isp（内部セリンプ
ロテアーゼ）およびbprに無効な突然変異を運ぶ枯草菌
株GP239中のsacQ＊の存在はRP−IIプロテアーゼ（これ
はまたエステラーゼ活性も持っている）の産生を促進し
ていることを示している。sacQ＊制御要素を運ぶ枯草菌
の株からRP−IIを削った場合のプロテアーゼ産生への影
響を評価するため、以下の実験が実施された。
RP−II欠失株GP262の独立したクローンは無視できる
量しかエステラーゼ活性を産生せず、アゾコールを基質
として用いると検出可能なレベルのエンドプロテアーゼ
活性がない事が示された（表１）。プロテアーゼ活性が
存在しないのを確認するため、GP262からの培養上澄み
液を上澄み液の1mlと等価物が検出できるような程度ま
で濃縮する。上澄み液の1mlと等価物とアゾコール基質
を2.5時間インキユベートした後でさえ欠失RP−II株に
おいては検出可能なプロテアーゼ活性はなかった。それ
に比較して、50μのGP239からの上澄み液は典型的に
は55℃で１時間のインキユベーション後アゾコール検定
において2.0以上のA520を与える。（sacQ＊の存在はこ
の株の培養液中に存在するアミノペプチダーゼの量を測
定する事により確認され、それはsacQ＊を欠く類似の株
より50−80倍高い。）従って、バシラス（Bacillus）中
の２つの残余プロテアーゼRP−ＩおよびRP−IIの欠失で
前記条件下アゾコールを基質として用いて測定されるご
とく、細胞外エンドプロテアーゼの産生がほとんどでき
ない株を得ることになる。
量しかエステラーゼ活性を産生せず、アゾコールを基質
として用いると検出可能なレベルのエンドプロテアーゼ
活性がない事が示された（表１）。プロテアーゼ活性が
存在しないのを確認するため、GP262からの培養上澄み
液を上澄み液の1mlと等価物が検出できるような程度ま
で濃縮する。上澄み液の1mlと等価物とアゾコール基質
を2.5時間インキユベートした後でさえ欠失RP−II株に
おいては検出可能なプロテアーゼ活性はなかった。それ
に比較して、50μのGP239からの上澄み液は典型的に
は55℃で１時間のインキユベーション後アゾコール検定
において2.0以上のA520を与える。（sacQ＊の存在はこ
の株の培養液中に存在するアミノペプチダーゼの量を測
定する事により確認され、それはsacQ＊を欠く類似の株
より50−80倍高い。）従って、バシラス（Bacillus）中
の２つの残余プロテアーゼRP−ＩおよびRP−IIの欠失で
前記条件下アゾコールを基質として用いて測定されるご
とく、細胞外エンドプロテアーゼの産生がほとんどでき
ない株を得ることになる。
アミノペプチダーゼはＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニ
リドを基質として用いて測定された（１単位＝１分当り
マイクロモルの基質が加水分解）。プロテアーゼは標準
アゾコール検定を使用して測定された（１単位＝0.5のA
520/時間）。エステラーゼはＮ−ｔ−BOC−グルタミン
酸−α−フェニル エステルを基質として使用して測定
された（１単位＝１分当りマイクロモルの基質が加水分
解される）。株GP238は遺伝子型Δapr,Δnpr,Δepr,Δi
sp,Δrp−１を持ち；株GP239は遺伝子型Δapr,Δnpr,Δ
epr,Δisp,Δrp−1,sacQ＊を持ち；およびGP262A I,A I
I,B IおよびB IIはsacQ＊およびcat挿入によるRP−II中
の欠失を含むGP262の独立したクローンである。NDは検
出できなかった事を意味している。
リドを基質として用いて測定された（１単位＝１分当り
マイクロモルの基質が加水分解）。プロテアーゼは標準
アゾコール検定を使用して測定された（１単位＝0.5のA
520/時間）。エステラーゼはＮ−ｔ−BOC−グルタミン
酸−α−フェニル エステルを基質として使用して測定
された（１単位＝１分当りマイクロモルの基質が加水分
解される）。株GP238は遺伝子型Δapr,Δnpr,Δepr,Δi
sp,Δrp−１を持ち；株GP239は遺伝子型Δapr,Δnpr,Δ
epr,Δisp,Δrp−1,sacQ＊を持ち；およびGP262A I,A I
I,B IおよびB IIはsacQ＊およびcat挿入によるRP−II中
の欠失を含むGP262の独立したクローンである。NDは検
出できなかった事を意味している。
表２を参照すると、前記のより高感度レゾルフィン−
標識カゼイン検定を用いて、いくつかのプロテアーゼ−
欠失株のプロテアーゼ活性がまた試験されている。表２
に示したごとく、６つのプロテアーゼ遺伝子が欠失した
株GP263はアゾコール試験では検出可能なプロテアーゼ
活性を示していないが、そのような活性でもレゾルフィ
ン−標識カゼイン試験においては検出された。GP263のs
poOA誘導体であるGP271は両方の試験で検出可能なプロ
テアーゼ活性を示さず、GP263で検出されたプロテアー
ゼ活性は胞子形成制御下であるらしい事を示している。
GP263の培養液中に存在する少ないカゼイン−検出可能
活性はそのPMSFによる阻害に対する感度から明らかにセ
リン プロテアーゼ群に属している。PMSF存在下では、
GP263の培養物中に検出可能なプロテアーゼ活性は存在
しない。
標識カゼイン検定を用いて、いくつかのプロテアーゼ−
欠失株のプロテアーゼ活性がまた試験されている。表２
に示したごとく、６つのプロテアーゼ遺伝子が欠失した
株GP263はアゾコール試験では検出可能なプロテアーゼ
活性を示していないが、そのような活性でもレゾルフィ
ン−標識カゼイン試験においては検出された。GP263のs
poOA誘導体であるGP271は両方の試験で検出可能なプロ
テアーゼ活性を示さず、GP263で検出されたプロテアー
ゼ活性は胞子形成制御下であるらしい事を示している。
GP263の培養液中に存在する少ないカゼイン−検出可能
活性はそのPMSFによる阻害に対する感度から明らかにセ
リン プロテアーゼ群に属している。PMSF存在下では、
GP263の培養物中に検出可能なプロテアーゼ活性は存在
しない。
他の実施態様 他の実施態様も特許請求の範囲に含まれる。例えば、
いくつかの例において本発明のプロテアーゼ（群）をコ
ードしている遺伝子または遺伝子群の突然変異または欠
失を起こすよりむしろ発現する方が望まれるであろう。
例えばクリーニング屋の洗濯活性の改良または工業過程
での使用のごとき目的のためプロテアーゼを生産するに
はこれをやらなければならない。この事は制御DNA（適
当なバシラス（Bacillus）プロモーターおよび必要なら
リボソーム結合部位および／またはシグナルコード配
列）をプロテアーゼ−コード遺伝子の上流に挿入するか
または、もしくはプロテアーゼ−コード遺伝子をバシラ
ス（Bacillus）発現または分泌ベクター内へ挿入するこ
とにより達成される；ベクターはプロテアーゼ産生（ま
たは分泌）へバシラス（Bacillus）株を形質転換でき、
常法により単離する。もしくは、sacQ＊のごとき制御遺
伝子を含む宿主株内へベクター上のプロテアーゼ遺伝子
の１つまたはそれ以上のコピーを挿入することによりプ
ロテアーゼが過剰生産できる。
いくつかの例において本発明のプロテアーゼ（群）をコ
ードしている遺伝子または遺伝子群の突然変異または欠
失を起こすよりむしろ発現する方が望まれるであろう。
例えばクリーニング屋の洗濯活性の改良または工業過程
での使用のごとき目的のためプロテアーゼを生産するに
はこれをやらなければならない。この事は制御DNA（適
当なバシラス（Bacillus）プロモーターおよび必要なら
リボソーム結合部位および／またはシグナルコード配
列）をプロテアーゼ−コード遺伝子の上流に挿入するか
または、もしくはプロテアーゼ−コード遺伝子をバシラ
ス（Bacillus）発現または分泌ベクター内へ挿入するこ
とにより達成される；ベクターはプロテアーゼ産生（ま
たは分泌）へバシラス（Bacillus）株を形質転換でき、
常法により単離する。もしくは、sacQ＊のごとき制御遺
伝子を含む宿主株内へベクター上のプロテアーゼ遺伝子
の１つまたはそれ以上のコピーを挿入することによりプ
ロテアーゼが過剰生産できる。
図１は、プラスミドp371,p371Δおよびp371ΔCMの模式
図である。 図２は、Hind III消化IS75およびIS75NΔDNAのサザンブ
ロット分析の模式図である。 図３は、プラスミドpAS007の6.5kb挿入物およびプラス
ミドpAS13の構築を説明する図である。 図４は、プラスミドpISP−１からプラスミドpAL6を構築
する工程図である。 図５は、epr遺伝子の制限部位を示す図である。 図６−1,6−2,6−３および６−４は、epr遺伝子のDNA配
列を示す一連の図である。 図７は、プラスミドpN9の構築の工程図である。 図８は、RP−Ｉの最初の28残基およびRP−Ｉ遺伝子をク
ローン化するのに使用されるプローブに相当するDNA配
列に対応するアミノ酸配列の図である。 図９は、プラスミドpCR83の6.5kb挿入物の制限地図であ
る。 図10−1,10−2,10−３および10−４は、RP−１プロテア
ーゼをコードしているDNAの配列を示す一連の図であ
る。 図11aは、RP−II断片T90のアミノ末端配列を示す図であ
る。 図11bは、RP−II断片T94のアミノ末端配列を示す図であ
る。 図11cは、RP−II断片T92の配列情報に基いて構築された
プローブの配列を示す図である。 図12は、GP241染色体DNAのサザンブロット分析の模式図
である。 図13aは、pLPIの3.6kbのPst I挿入物の制限地図であ
る。 図13bは、欠失RP−II遺伝子を構築する工程図である。 図13cは、バシラス染色体中のRP−II欠失の作成に使用
されたプラスミドの図である。 図14−１および図14−２は、RP−IIをコードしているDN
Aの配列を示す一連の図である。
図である。 図２は、Hind III消化IS75およびIS75NΔDNAのサザンブ
ロット分析の模式図である。 図３は、プラスミドpAS007の6.5kb挿入物およびプラス
ミドpAS13の構築を説明する図である。 図４は、プラスミドpISP−１からプラスミドpAL6を構築
する工程図である。 図５は、epr遺伝子の制限部位を示す図である。 図６−1,6−2,6−３および６−４は、epr遺伝子のDNA配
列を示す一連の図である。 図７は、プラスミドpN9の構築の工程図である。 図８は、RP−Ｉの最初の28残基およびRP−Ｉ遺伝子をク
ローン化するのに使用されるプローブに相当するDNA配
列に対応するアミノ酸配列の図である。 図９は、プラスミドpCR83の6.5kb挿入物の制限地図であ
る。 図10−1,10−2,10−３および10−４は、RP−１プロテア
ーゼをコードしているDNAの配列を示す一連の図であ
る。 図11aは、RP−II断片T90のアミノ末端配列を示す図であ
る。 図11bは、RP−II断片T94のアミノ末端配列を示す図であ
る。 図11cは、RP−II断片T92の配列情報に基いて構築された
プローブの配列を示す図である。 図12は、GP241染色体DNAのサザンブロット分析の模式図
である。 図13aは、pLPIの3.6kbのPst I挿入物の制限地図であ
る。 図13bは、欠失RP−II遺伝子を構築する工程図である。 図13cは、バシラス染色体中のRP−II欠失の作成に使用
されたプラスミドの図である。 図14−１および図14−２は、RP−IIをコードしているDN
Aの配列を示す一連の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ジェランド・エイ・ルフォ・ジュニアー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01930，バーリントン，バロン・パー ク・レーン ６，アパートメント 30 (72)発明者 キャシー・フェイ・ルドルフ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02072，ストウトン，サンディ・リッ ジ・ロード 38 (72)発明者 バーバラ・ジェイ・サリヴァン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01803，バーリントン，ビーコン，ヴィ レッジ 19ビー (72)発明者 ジャニス・ペロ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02173，レキシントン，ソロモン・ピア ース・ロード 20 (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．70，Ｎｏ．２ （30．Ｏｃｔ．1988），ｐ．351−361 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．160，Ｎｏ．１ （1984），ｐ．442−444 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．167，Ｎｏ．１ （1986），ｐ．110−116 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．166，Ｎｏ．１ （1986），ｐ．173−179 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
Claims (31)
- 【請求項１】epr遺伝子内に突然変異を有することを特
徴とする細胞であって、上記epr遺伝子は図６のアミノ
酸配列 からなる蛋白質をコードし、上記変異は蛋白質分解活性
epr遺伝子産物の上記細胞による生成の阻害をもたらす
が、但し図６のアミノ酸配列はプロテアーゼ活性を保持
する範囲で一つまたはいくつかのアミノ酸残基が欠失、
置換または付加されてよい、バシラス細胞。 - 【請求項２】RP−Ｉコーディング遺伝子内に突然変異を
さらに含むことを特徴とし、RP−Ｉコーディング遺伝子
は図10のアミノ酸配列 からなる蛋白質をコードし、上記変異は蛋白質分解活性
RP−Ｉ遺伝子産物の上記細胞による生成の阻害をもたら
すが、但し図10のアミノ酸配列はプロテアーゼ活性を保
持する範囲で一つまたはいくつかのアミノ酸残基が欠
失、置換または付加されてよい、請求項１記載のバシラ
ス細胞。 - 【請求項３】RP−Ｉコーディング遺伝子内に突然変異を
有することを特徴とする細胞であって、上記RP−Ｉ遺伝
子は図10のアミノ酸配列 からなる蛋白質をコードし、上記変異は蛋白質分解活性
RP−Ｉ遺伝子産物の上記細胞による生成の阻害をもたら
すが、但し図10のアミノ酸配列はプロテアーゼ活性を保
持する範囲で一つまたはいくつかのアミノ酸残基が欠
失、置換または付加されてよい、バシラス細胞。 - 【請求項４】RP−IIコーディング遺伝子内に突然変異を
さらに含むことを特徴とし、RP−IIコーディング遺伝子
は図14のアミノ酸配列 からなる蛋白質をコードし、上記変異は蛋白質分解活性
RP−II遺伝子産物の上記細胞による生成の阻害をもたら
すが、但し図14のアミノ酸配列はプロテアーゼ活性を保
持する範囲で一つまたはいくつかのアミノ酸残基が欠
失、置換または付加されてよい、請求項１乃至３の何れ
か１項記載のバシラス細胞。 - 【請求項５】RP−IIコーディング遺伝子内に突然変異を
有することを特徴とする細胞であって、上記RP−II遺伝
子は図14のアミノ酸配列 からなる蛋白質をコードし、上記変異は蛋白質分解活性
RP−II遺伝子産物の上記細胞による生成の阻害をもたら
すが、但し図14のアミノ酸配列はプロテアーゼ活性を保
持する範囲で一つまたはいくつかのアミノ酸残基が欠
失、置換または付加されてよい、バシラス細胞。 - 【請求項６】細胞外プロテアーゼをコードするaprおよ
びnpr遺伝子内に突然変異をさらに含むことをさらに特
徴とし、その変異によりコードされる蛋白質分解活性の
細胞による生成阻害をもたらす、請求項１乃至５の何れ
か１項記載のバシラス細胞。 - 【請求項７】変異が遺伝子コーディング領域内の欠失を
含むことをさらに特徴とする、請求項１乃至６の何れか
１項記載のバシラス細胞。 - 【請求項８】細胞外プロテアーゼをコードするisp−１
遺伝子内に突然変異をさらに含むことをさらに特徴と
し、その変異により、蛋白質分解が活性なisp−１遺伝
子産物の細胞による生成阻害をもたらす、請求項１乃至
７の何れか１項記載のバシラス細胞。 - 【請求項９】一つまたは複数の胞子形成依存性プロテア
ーゼを生成する細胞の能力を減じさせる変異をさらに含
むことを特徴とする、請求項１乃至８の何れか１項記載
のバシラス細胞。 - 【請求項１０】胞子依存性プロテアーゼ突然変異が、初
期段階において胞子形成をブロックするが、細胞が精製
されたDNAにより形質転換される能力を排除しないこと
をさらに特徴とする、請求項９記載のバシラス細胞。 - 【請求項１１】胞子依存性プロテアーゼ突然変異がspoO
A遺伝子内にあることをさらに特徴とする、請求項10記
載のバシラス細胞。 - 【請求項１２】バシラスサチルス細胞であることをさら
に特徴とする、請求項１乃至11の何れか１項記載のバシ
ラス細胞。 - 【請求項１３】異種ポリペプチドをコードする遺伝子を
さらに含むことを特徴とする、請求項１乃至12の何れか
１項記載のバシラス細胞。 - 【請求項１４】異種ポリペプチドがホルモン、ワクチ
ン、抗ウイルスタンパク質、抗腫瘍タンパク質、抗体ま
たは血液凝固タンパク質であることをさらに特徴とす
る、請求項13記載の細胞。 - 【請求項１５】異種ポリペプチドが殺虫剤または酵素で
ある、請求項13記載の細胞。 - 【請求項１６】バシラス細胞において異種ポリペプチド
を生産させるための方法であって、上記細胞中で発現す
るように修飾された異種ポリペプチドをコードする遺伝
子を細胞に導入することからなるが、その際、上記バシ
ラス細胞はaprおよびnpr遺伝子中に突然変異を有し、さ
らにEprプロテアーゼ、RP−ＩまたはRP−IIをコードす
る遺伝子一つまたは複数中に突然変異を含み、但し、上
記Epr,RP−ＩおよびRP−IIはそれぞれ図６のアミノ酸配
列 図10のアミノ酸配列 および 図14のアミノ酸配列 からなり、上記突然変異はタンパク質分解活性Eprプロ
テアーゼ、RP−ＩまたはRP−IIの、上記細胞による生産
の阻害をもたらすが、但し図６、10および14のアミノ酸
配列はプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加されてよ
い、上記異種ポリペプチド生産方法。 - 【請求項１７】さらに、細胞内プロテアーゼＩをコード
するisp−１遺伝子内に突然変異を含み、該突然変異が
タンパク質分解活性isp−１遺伝子産物の細胞による生
産の阻害をもたらす、請求項16載の方法。 - 【請求項１８】異種ポリペプチドが通常はバシラス細胞
内で不安定な、請求項16または17記載の方法。 - 【請求項１９】細胞がバシラスサチルス細胞であること
をさらに特徴とする、請求項16乃至18の何れか１項記載
の方法。 - 【請求項２０】細胞がさらに一つまたは複数の胞子依存
性プロテアーゼを生産する細胞の能力を減じる突然変異
を含み、該突然変異がspoOA遺伝子内にあることをさら
に特徴とする、請求項16乃至19の何れか１項記載の方
法。 - 【請求項２１】異種ポリペプチドがホルモン、ワクチ
ン、抗ウイルスタンパク質、抗腫瘍タンパク質、抗体、
血液凝固タンパク質、殺虫剤または酵素であることをさ
らに特徴とする、請求項16乃至20の何れか１項記載の方
法。 - 【請求項２２】図６のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
６のアミノ酸配列をコードするバシラスepr遺伝子から
なる精製DNA。 - 【請求項２３】図10のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
10のアミノ酸配列をコードするバシラスRP−Ｉ遺伝子か
らなる精製DNA。 - 【請求項２４】図14のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
14のアミノ酸配列をコードするバシラスRP−II遺伝子か
らなる精製DNA。 - 【請求項２５】図６のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
６のアミノ酸配列をコードするバシラスepr遺伝子、お
よび該遺伝子に操作可能なように連結した制御DNAを含
むベクター。 - 【請求項２６】図10のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
10のアミノ酸配列をコードするバシラスRP−Ｉ遺伝子、
および該遺伝子に操作可能なように連結した制御DNAを
含むベクター。 - 【請求項２７】図14のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
14のアミノ酸配列をコードするバシラスRP−II遺伝子、
および該遺伝子に操作可能なように連結した制御DNAを
含むベクター。 - 【請求項２８】請求項25乃至27の何れか１項記載のベク
ターにより形質転換されたバシラス細胞。 - 【請求項２９】図６のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
６のアミノ酸配列からなる実質上純粋なバシラスEprプ
ロテアーゼ。 - 【請求項３０】図10のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
10のアミノ酸配列からなる実質上純粋なバシラス残余プ
ロテアーゼＩ（RP−Ｉ）。 - 【請求項３１】図14のアミノ酸配列 またはプロテアーゼ活性を保持する範囲で一つまたはい
くつかのアミノ酸残基が欠失、置換または付加された図
14のアミノ酸配列からなる実質上純粋なバシラス残余プ
ロテアーゼII（RP−II）。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27342388A | 1988-11-18 | 1988-11-18 | |
| US273423 | 1988-11-18 | ||
| US34742889A | 1989-05-04 | 1989-05-04 | |
| US347428 | 1989-05-04 | ||
| US39652189A | 1989-08-21 | 1989-08-21 | |
| US396521 | 1989-08-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0367582A JPH0367582A (ja) | 1991-03-22 |
| JP3210315B2 true JP3210315B2 (ja) | 2001-09-17 |
Family
ID=27402569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30064589A Expired - Lifetime JP3210315B2 (ja) | 1988-11-18 | 1989-11-18 | プロテアーゼ欠損 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5620880A (ja) |
| EP (1) | EP0369817B1 (ja) |
| JP (1) | JP3210315B2 (ja) |
| AT (1) | ATE137265T1 (ja) |
| AU (1) | AU4476689A (ja) |
| CA (1) | CA2003078A1 (ja) |
| DE (1) | DE68926333T2 (ja) |
| DK (1) | DK577989A (ja) |
Cited By (1)
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