JP3200631B2 - 細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定するためのバイオセンサー - Google Patents
細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定するためのバイオセンサーInfo
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- JP3200631B2 JP3200631B2 JP25443299A JP25443299A JP3200631B2 JP 3200631 B2 JP3200631 B2 JP 3200631B2 JP 25443299 A JP25443299 A JP 25443299A JP 25443299 A JP25443299 A JP 25443299A JP 3200631 B2 JP3200631 B2 JP 3200631B2
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞の代謝活性に
及ぼす影響を測定するためのバイオセンサーに関する。
詳しくは、細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定すること
により環境ホルモン等を検出するバイオセンサーに関す
る。
及ぼす影響を測定するためのバイオセンサーに関する。
詳しくは、細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定すること
により環境ホルモン等を検出するバイオセンサーに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】環境ホルモンは、外因性のホルモン様物
質である。このような物質は、内分泌撹乱物質とも称さ
れ、近年では、このような物質が生体において異常なホ
ルモン制御を行い、それにより生体の内分泌系を撹乱し
ていることが明らかにされた。そのため、その暴露によ
る人体や野生動物への影響が世界的な問題となってい
る。
質である。このような物質は、内分泌撹乱物質とも称さ
れ、近年では、このような物質が生体において異常なホ
ルモン制御を行い、それにより生体の内分泌系を撹乱し
ていることが明らかにされた。そのため、その暴露によ
る人体や野生動物への影響が世界的な問題となってい
る。
【０００３】従来では、このような環境ホルモンは、ホ
ルモンレセプターとの結合試験及び細胞増殖試験等のイ
ンビトロでの試験、並びに生殖器異常を解剖学的に観察
するインビボでの試験等により検出又は定量がなされて
いる。しかしながら、それらの試験は操作が煩雑であっ
たり、測定に時間を要するなどの問題がある。
ルモンレセプターとの結合試験及び細胞増殖試験等のイ
ンビトロでの試験、並びに生殖器異常を解剖学的に観察
するインビボでの試験等により検出又は定量がなされて
いる。しかしながら、それらの試験は操作が煩雑であっ
たり、測定に時間を要するなどの問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、簡便
に、迅速に、且つ高感度で細胞の代謝活性の変化を測定
するための装置を提供することである。特に、環境ホル
モンを簡便且つ高感度で検出するための装置を提供する
ことである。
に、迅速に、且つ高感度で細胞の代謝活性の変化を測定
するための装置を提供することである。特に、環境ホル
モンを簡便且つ高感度で検出するための装置を提供する
ことである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、発明者らは鋭意研究の結果以下の手段を見出した。
即ち；被検物質が細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定す
るためのバイオセンサーであって、半導体層、該半導体
の主面に積層された絶縁層、該絶縁層に接触してその上
に配置された生細胞又は生細胞群、及び該生細胞又は生
細胞群を浸漬し且つ前記絶縁層に接触した培養液層とか
らなるＭＩＳ構造体と、前記ＭＩＳ構造体にバイアス電
圧を印加するためのバイアス電極手段と、前記ＭＩＳ構
造体に光起電力を発生させるために、前記ＭＩＳ構造体
に制御された光を照射するための光源手段と、前記培養
液層に、被検物質を添加するための手段と、並びに、前
記ＭＩＳ構造に発生した光起電力の変化をモニターする
ための手段とを具備し、前記被検物質を添加する前後に
おける前記光起電力の変化から、前記被検物質が前記細
胞の代謝活性に及ぼす影響を測定することを特徴とする
バイオセンサーである。
に、発明者らは鋭意研究の結果以下の手段を見出した。
即ち；被検物質が細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定す
るためのバイオセンサーであって、半導体層、該半導体
の主面に積層された絶縁層、該絶縁層に接触してその上
に配置された生細胞又は生細胞群、及び該生細胞又は生
細胞群を浸漬し且つ前記絶縁層に接触した培養液層とか
らなるＭＩＳ構造体と、前記ＭＩＳ構造体にバイアス電
圧を印加するためのバイアス電極手段と、前記ＭＩＳ構
造体に光起電力を発生させるために、前記ＭＩＳ構造体
に制御された光を照射するための光源手段と、前記培養
液層に、被検物質を添加するための手段と、並びに、前
記ＭＩＳ構造に発生した光起電力の変化をモニターする
ための手段とを具備し、前記被検物質を添加する前後に
おける前記光起電力の変化から、前記被検物質が前記細
胞の代謝活性に及ぼす影響を測定することを特徴とする
バイオセンサーである。
【０００６】
【発明の実施の形態】１．装置 本発明の装置は、生体材料とトランスデューサーを組み
合わせたバイオセンサーである。詳しくは、表面光電位
デバイス［surface photovoltage;以後、ＳＰＶとも称
するが、また、一般的にＬＡＰＳ（Light-Addressable
PotentiometricSensor）又はミクロメーター（Microphy
siometer）とも称される］に、生細胞又は生組織片等を
組み込んだバイオセンサーである。
合わせたバイオセンサーである。詳しくは、表面光電位
デバイス［surface photovoltage;以後、ＳＰＶとも称
するが、また、一般的にＬＡＰＳ（Light-Addressable
PotentiometricSensor）又はミクロメーター（Microphy
siometer）とも称される］に、生細胞又は生組織片等を
組み込んだバイオセンサーである。
【０００７】具体的な構造の１例を図１に示す。本発明
のバイオセンサーは、半導体層２と該半導体層２の主面
に積層された絶縁層３と、該絶縁層に接触してその上に
配置された生細胞又は生細胞群４、及び該生細胞又は生
細胞群を浸漬し且つ前記絶縁層に接触した培養液層８と
からなるＭＩＳ構造と、前記ＭＩＳ構造にバイアス電圧
を印加するためのバイアス電極手段７と、前記ＭＩＳ構
造体に光起電力を発生させるために、前記ＭＩＳ構造体
に制御された光を照射するための光源手段９と、前記培
養液層８に被検物質を添加するための手段と、並びに前
記ＭＩＳ構造に発生した光起電力の変化をモニターする
ための手段１１とを具備し、前記被検物質を添加する前
後における前記光起電力の変化から、前記被検物質が前
記細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定することを特徴と
するバイオセンサーである。
のバイオセンサーは、半導体層２と該半導体層２の主面
に積層された絶縁層３と、該絶縁層に接触してその上に
配置された生細胞又は生細胞群４、及び該生細胞又は生
細胞群を浸漬し且つ前記絶縁層に接触した培養液層８と
からなるＭＩＳ構造と、前記ＭＩＳ構造にバイアス電圧
を印加するためのバイアス電極手段７と、前記ＭＩＳ構
造体に光起電力を発生させるために、前記ＭＩＳ構造体
に制御された光を照射するための光源手段９と、前記培
養液層８に被検物質を添加するための手段と、並びに前
記ＭＩＳ構造に発生した光起電力の変化をモニターする
ための手段１１とを具備し、前記被検物質を添加する前
後における前記光起電力の変化から、前記被検物質が前
記細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定することを特徴と
するバイオセンサーである。
【０００８】ここで、絶縁層３は、酸化膜又は窒化膜
等、一般的に用いられる何れの絶縁膜を使用することが
可能である。
等、一般的に用いられる何れの絶縁膜を使用することが
可能である。
【０００９】また、生細胞又は生細胞群４は、絶縁層３
の上側面に直接固定されている。前記細胞群４は、その
栄養源を前記ＭＩＳ構造体に含まれる培養液層８から得
ることが可能である。
の上側面に直接固定されている。前記細胞群４は、その
栄養源を前記ＭＩＳ構造体に含まれる培養液層８から得
ることが可能である。
【００１０】培養液層８は、絶縁層を有した半導体層
と、シリコンゴム等とにより保持手段を形成し、そこに
培養液等の溶液を添加することにより形成することが可
能である。前記シリコンゴム以外にも、ポリエチレンフ
ィルム等の非腐食性の絶縁性材料を使用することも可能
である。また、培養液層８は、電極７から前記ＭＩＳ構
造に電場を伝える伝導体の役割も果たす。更に、この培
養液層８に接して、電極７が配置される。電極７はバイ
アス電圧を印加し電位を保持することを目的とする。
と、シリコンゴム等とにより保持手段を形成し、そこに
培養液等の溶液を添加することにより形成することが可
能である。前記シリコンゴム以外にも、ポリエチレンフ
ィルム等の非腐食性の絶縁性材料を使用することも可能
である。また、培養液層８は、電極７から前記ＭＩＳ構
造に電場を伝える伝導体の役割も果たす。更に、この培
養液層８に接して、電極７が配置される。電極７はバイ
アス電圧を印加し電位を保持することを目的とする。
【００１１】また、培養液層８への溶液の流入及び流出
は、流入路６を経て行なうことが可能であり、また、流
出は、流出路１０を経て行なうことが可能である。流入
路及び流出路は、シリコンチューブ、ポリエチレンチュ
ーブ、及びフッ素樹脂（ＦＥＰ）チューブ等の非腐蝕性
の絶縁性材料を使用することが可能である。流入路及び
流出路は、流入出路として１本で行なってもよいが、継
続的に溶液を流し込み、且つ継続的に測定することが可
能であるため、夫々別々に配置することが好ましい。
は、流入路６を経て行なうことが可能であり、また、流
出は、流出路１０を経て行なうことが可能である。流入
路及び流出路は、シリコンチューブ、ポリエチレンチュ
ーブ、及びフッ素樹脂（ＦＥＰ）チューブ等の非腐蝕性
の絶縁性材料を使用することが可能である。流入路及び
流出路は、流入出路として１本で行なってもよいが、継
続的に溶液を流し込み、且つ継続的に測定することが可
能であるため、夫々別々に配置することが好ましい。
【００１２】また、検出対象となる試料は、培養液層８
に添加することが必要である。培養液層８に、被検物質
を添加するための手段は、培養液層８に試料が添加でき
ればどのような手段でもよく、培養液層８に対して試料
の注入が可能な試料注入口を配置しても、また、培養液
又は緩衝液を添加するための何れかの手段を用いてもよ
いが、培養液又は緩衝液に予め被験物質を混合して試料
を調製し、流入路６を経て培養液層８に添加することが
好ましい。
に添加することが必要である。培養液層８に、被検物質
を添加するための手段は、培養液層８に試料が添加でき
ればどのような手段でもよく、培養液層８に対して試料
の注入が可能な試料注入口を配置しても、また、培養液
又は緩衝液を添加するための何れかの手段を用いてもよ
いが、培養液又は緩衝液に予め被験物質を混合して試料
を調製し、流入路６を経て培養液層８に添加することが
好ましい。
【００１３】本装置で使用可能な生細胞又は生細胞群
は、絶縁層に単層で配置されても、多層で配置されても
よく、また、組織切片であってもよい。例えば、子宮頸
部癌由来のＨｅＬａ細胞、乳癌細胞のＭＣＦ−７細胞、
Ｔ４７Ｄ細胞、Ｔ細胞リンパ腫細胞のＪＵＲＫＡＴ細胞
等の種々の癌細胞、及び肝細胞、心筋、血管系の細胞、
平滑筋、中枢系細胞等の正常細胞細胞である。また、組
織切片の例は、肝臓、心臓、腎臓等の臓器組織、大脳及
び小脳等の中枢系組織、皮膚組織、筋肉組織、並びに血
管系組織等、生体の如何なる組織の切片でもよい。しか
し、これらに限られるものではなく、また、どのような
細胞若しくは細胞群又は組織切片を使用するかは、検出
物質に応じて決定する必要がある。例えば、環境ホルモ
ンを検出する場合には、環境ホルモンに対する受容体を
有する細胞を選択することが必要である。
は、絶縁層に単層で配置されても、多層で配置されても
よく、また、組織切片であってもよい。例えば、子宮頸
部癌由来のＨｅＬａ細胞、乳癌細胞のＭＣＦ−７細胞、
Ｔ４７Ｄ細胞、Ｔ細胞リンパ腫細胞のＪＵＲＫＡＴ細胞
等の種々の癌細胞、及び肝細胞、心筋、血管系の細胞、
平滑筋、中枢系細胞等の正常細胞細胞である。また、組
織切片の例は、肝臓、心臓、腎臓等の臓器組織、大脳及
び小脳等の中枢系組織、皮膚組織、筋肉組織、並びに血
管系組織等、生体の如何なる組織の切片でもよい。しか
し、これらに限られるものではなく、また、どのような
細胞若しくは細胞群又は組織切片を使用するかは、検出
物質に応じて決定する必要がある。例えば、環境ホルモ
ンを検出する場合には、環境ホルモンに対する受容体を
有する細胞を選択することが必要である。
【００１４】細胞を固定する方法は、細胞が機能を失わ
ないような何れの方法によっても行なうことが可能であ
る。例えば、半導体チップ上に直接培養して細胞を固定
することが可能である。また、組織を固定する方法も、
細胞が機能を失わないような何れの方法によっても行な
うことが可能である。例えば、組織生切片を切片製作装
置にて製作した後、これを直接センサー表面などの担体
上に物理的に配置して固定する。
ないような何れの方法によっても行なうことが可能であ
る。例えば、半導体チップ上に直接培養して細胞を固定
することが可能である。また、組織を固定する方法も、
細胞が機能を失わないような何れの方法によっても行な
うことが可能である。例えば、組織生切片を切片製作装
置にて製作した後、これを直接センサー表面などの担体
上に物理的に配置して固定する。
【００１５】細胞を固定する場合、固定される細胞の密
度は、１ｃｍ２当たり約１Ｘ１０４個から２Ｘ１０６個
が好ましい。また、固定される細胞層は、単層でも複数
層でもよい。一層を使用する場合には、刺激に対する応
答が速いという利点があり、複数層を使用する場合に
は、刺激に対する信号が強くなるという利点がある。ま
た、組織切片を使用する場合には、刺激に対する応答は
遅いものの、信号は非常に強くなる。本発明で使用する
組織片の厚さは、約５μｍから約１００μｍが好まし
く、約３０μｍが好ましい。
度は、１ｃｍ２当たり約１Ｘ１０４個から２Ｘ１０６個
が好ましい。また、固定される細胞層は、単層でも複数
層でもよい。一層を使用する場合には、刺激に対する応
答が速いという利点があり、複数層を使用する場合に
は、刺激に対する信号が強くなるという利点がある。ま
た、組織切片を使用する場合には、刺激に対する応答は
遅いものの、信号は非常に強くなる。本発明で使用する
組織片の厚さは、約５μｍから約１００μｍが好まし
く、約３０μｍが好ましい。
【００１６】本発明の装置では、細胞の代謝活性の変化
が検出可能である。本発明において、細胞の代謝活性の
変化は、細胞周囲のｐＨの微妙な変化及び細胞膜電位の
変化等を測定することにより検出することが可能であ
る。また、環境ホルモンに対する受容体を有する細胞を
使用すれば、細胞の代謝活性の変化を検出することによ
って、添加した被検物質が、環境ホルモンであるのかど
うかをスクリーニングすることも、或いは定量すること
も可能である。また更に、所望する被検物質に反応性の
ある細胞を用いることにより、該被験物質の検出及び定
量を行なうことも可能である。
が検出可能である。本発明において、細胞の代謝活性の
変化は、細胞周囲のｐＨの微妙な変化及び細胞膜電位の
変化等を測定することにより検出することが可能であ
る。また、環境ホルモンに対する受容体を有する細胞を
使用すれば、細胞の代謝活性の変化を検出することによ
って、添加した被検物質が、環境ホルモンであるのかど
うかをスクリーニングすることも、或いは定量すること
も可能である。また更に、所望する被検物質に反応性の
ある細胞を用いることにより、該被験物質の検出及び定
量を行なうことも可能である。
【００１７】細胞又は組織切片を維持する培養液は、緩
衝作用のある何れの培地又は緩衝液も使用することが可
能である。好ましくは、使用する細胞又は組織に最も適
切な溶液を用いることが好ましい。例えば、培地の例
は、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ（minimum essential me
dium）、Ｌ−１５培地(L-15 medium modified)及びＤＭ
ＥＭ(Dulbecco Modify Eagle Medium)等であるが、これ
に限られるものではない。培地及び緩衝液のｐＨは、約
７から約８に保持することが好ましい。また、温度は３
７℃に維持することが好ましい。
衝作用のある何れの培地又は緩衝液も使用することが可
能である。好ましくは、使用する細胞又は組織に最も適
切な溶液を用いることが好ましい。例えば、培地の例
は、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ（minimum essential me
dium）、Ｌ−１５培地(L-15 medium modified)及びＤＭ
ＥＭ(Dulbecco Modify Eagle Medium)等であるが、これ
に限られるものではない。培地及び緩衝液のｐＨは、約
７から約８に保持することが好ましい。また、温度は３
７℃に維持することが好ましい。
【００１８】前記ＭＩＳ構造体に光起電力を発生させる
ために、前記ＭＩＳ構造体に制御された光を照射するた
めの光源手段として、本発明の装置で使用することが可
能である光源の例は、発光ダイオード、レーザー光源、
種々のランプ等であり、これらを単数個又は複数個で配
置することが可能であるが、これに限るものではない。
また、光源からの光を制御する方法は、それ自身公知の
方法により行なうことが可能である。
ために、前記ＭＩＳ構造体に制御された光を照射するた
めの光源手段として、本発明の装置で使用することが可
能である光源の例は、発光ダイオード、レーザー光源、
種々のランプ等であり、これらを単数個又は複数個で配
置することが可能であるが、これに限るものではない。
また、光源からの光を制御する方法は、それ自身公知の
方法により行なうことが可能である。
【００１９】バイアス電圧を印加するための電極７は、
即ち、培養液層８に電場を印加するための電極であり、
電位を制御することが可能な電極又は電極群を配置する
ことが必要である。電極７には、例えば、金、白金、
銅、ニッケル等を使用することが可能であるが、金及び
白金電極の使用は、溶液中で安定であることから好まし
い。また、培養液層８と絶縁層３との間の表面電位を一
定に保つために、培養液層８に接して参照電極を配置し
てもよい。本発明の参照電極は、電極７の近傍に配置し
ても、また、培養液層８を形成している溶液が流出され
る先に設置される廃液槽内に配置してもよい。参照電極
の設置は、例えば、鉄イオン等の酸化還元性物質の存在
等により生じる表面電位の変化を制御できることから好
ましい。本発明に使用できる参照電極は、飽和カロメル
電極、銀・塩化銀電極等であるが、これに限られるもの
ではない。
即ち、培養液層８に電場を印加するための電極であり、
電位を制御することが可能な電極又は電極群を配置する
ことが必要である。電極７には、例えば、金、白金、
銅、ニッケル等を使用することが可能であるが、金及び
白金電極の使用は、溶液中で安定であることから好まし
い。また、培養液層８と絶縁層３との間の表面電位を一
定に保つために、培養液層８に接して参照電極を配置し
てもよい。本発明の参照電極は、電極７の近傍に配置し
ても、また、培養液層８を形成している溶液が流出され
る先に設置される廃液槽内に配置してもよい。参照電極
の設置は、例えば、鉄イオン等の酸化還元性物質の存在
等により生じる表面電位の変化を制御できることから好
ましい。本発明に使用できる参照電極は、飽和カロメル
電極、銀・塩化銀電極等であるが、これに限られるもの
ではない。
【００２０】また、前記ＭＩＳ構造に発生した光起電力
の変化をモニターするための手段は、半導体層２の下側
面に接して導伝体１を配置し、この導伝体１に接触して
電極１１が配置することにより得られる。電極１１及び
導伝体１は、種々の電極を使用することが可能である。
例えば、アルミニウム及び金等であり、また、光透過性
導伝体を用いることも可能である。ここで、導伝体１
は、その下方に位置する光源からの照射光を遮らないよ
うに配置することが望ましい。また、電極１１と導伝体
１は一体化されて配置されてもよい。
の変化をモニターするための手段は、半導体層２の下側
面に接して導伝体１を配置し、この導伝体１に接触して
電極１１が配置することにより得られる。電極１１及び
導伝体１は、種々の電極を使用することが可能である。
例えば、アルミニウム及び金等であり、また、光透過性
導伝体を用いることも可能である。ここで、導伝体１
は、その下方に位置する光源からの照射光を遮らないよ
うに配置することが望ましい。また、電極１１と導伝体
１は一体化されて配置されてもよい。
【００２１】２．バイオセンサーの測定原理 本発明のバイオセンサーは、前記ＭＩＳ構造に適当なバ
イアス電圧を印加しながら、下側の界面に光を照射する
と光起電力が生じることを利用している。
イアス電圧を印加しながら、下側の界面に光を照射する
と光起電力が生じることを利用している。
【００２２】ここで、前記バイアス電圧の印加は、培養
液層８に接して電極７を配置することにより好ましく行
なうことが可能である。
液層８に接して電極７を配置することにより好ましく行
なうことが可能である。
【００２３】図２にバイオセンサーを用いた代謝活性測
定装置の１例を示す。本バイオセンサーの電極７は電圧
印加装置に接続しており、伝導体１と接続している電極
１１は、電流量又は電位変化を検出するために測定メー
タに接続される。前記測定メータは、更に、パーソナル
コンピューター（図２ではパソコンと示す）等に接続さ
れ、測定条件の管理及びデータ処理等を行なうことが可
能である。また、図には示していないが、参照電極を培
養液層８内に配置することも、廃液槽内に配置すること
も可能である。
定装置の１例を示す。本バイオセンサーの電極７は電圧
印加装置に接続しており、伝導体１と接続している電極
１１は、電流量又は電位変化を検出するために測定メー
タに接続される。前記測定メータは、更に、パーソナル
コンピューター（図２ではパソコンと示す）等に接続さ
れ、測定条件の管理及びデータ処理等を行なうことが可
能である。また、図には示していないが、参照電極を培
養液層８内に配置することも、廃液槽内に配置すること
も可能である。
【００２４】また、本バイオセンサーの培養液層８への
送入及び排出はペリスタポンプ、シリンジポンプ及びプ
ランジャーポンプ等の手段を用いることが可能である。
また、本発明のバイオセンサーは、所望に応じて、送液
を行なわないバッチ方式で使用することも可能である。
送入及び排出はペリスタポンプ、シリンジポンプ及びプ
ランジャーポンプ等の手段を用いることが可能である。
また、本発明のバイオセンサーは、所望に応じて、送液
を行なわないバッチ方式で使用することも可能である。
【００２５】また、本バイオセンサーの応答を得るため
には、一定のバイアス電圧で光電流量の変化を検出する
方法と、変曲点の電位変化を検出する方法とを行なうこ
とが可能である。リアルタイムでの測定には、バイアス
電圧を固定する方法が好ましい。
には、一定のバイアス電圧で光電流量の変化を検出する
方法と、変曲点の電位変化を検出する方法とを行なうこ
とが可能である。リアルタイムでの測定には、バイアス
電圧を固定する方法が好ましい。
【００２６】本発明のバイオセンサーにより測定が可能
な試料は、あらゆる合成化合物及びあらゆる天然物質で
ある。また、本発明のバイオセンサーを用いることによ
り、試験試料について、生細胞若しくは細胞群又は生組
織切片における代謝活性に対する影響を測定することが
可能である。また、使用する細胞若しくは細胞群又は組
織切片の選択により、検出物質を選択することが可能で
ある。例えば、環境ホルモンを検出する場合には、環境
ホルモンに対する受容体を有する細胞を選択することが
必要である。それにより環境ホルモンであるかどうかの
スクリーニング、又は定量を行なうことが可能である。
また更に、所望する他の検出物質に対して特異的に反応
性を有する細胞若しくは細胞群又は組織を使用すること
により、特異的に所望する物質を検出及び定量すること
が可能である。
な試料は、あらゆる合成化合物及びあらゆる天然物質で
ある。また、本発明のバイオセンサーを用いることによ
り、試験試料について、生細胞若しくは細胞群又は生組
織切片における代謝活性に対する影響を測定することが
可能である。また、使用する細胞若しくは細胞群又は組
織切片の選択により、検出物質を選択することが可能で
ある。例えば、環境ホルモンを検出する場合には、環境
ホルモンに対する受容体を有する細胞を選択することが
必要である。それにより環境ホルモンであるかどうかの
スクリーニング、又は定量を行なうことが可能である。
また更に、所望する他の検出物質に対して特異的に反応
性を有する細胞若しくは細胞群又は組織を使用すること
により、特異的に所望する物質を検出及び定量すること
が可能である。
【００２７】３．実施例 ３−１．装置 ［表面光電位デバイス］本発明の好ましい実施の態様を
以下に示す。ＳＰＶデバイスの測定装置として、ミクロ
フィジオメーター（テクノローグ SE1030）、テクノロ
ーグＳＰＶ用半導体チップ（新電元社製）、制御用コン
ピューター（ＮＥＣ９８０１ｎｓ／ｔ）、測定プログラ
ム（テクノローグＳＰＶ Measurement System）、ペリ
スタポンプを使用した。
以下に示す。ＳＰＶデバイスの測定装置として、ミクロ
フィジオメーター（テクノローグ SE1030）、テクノロ
ーグＳＰＶ用半導体チップ（新電元社製）、制御用コン
ピューター（ＮＥＣ９８０１ｎｓ／ｔ）、測定プログラ
ム（テクノローグＳＰＶ Measurement System）、ペリ
スタポンプを使用した。
【００２８】［細胞の培養並びに固定化］生細胞群とし
て乳癌細胞Ｔ４７Ｄを使用した。乳癌細胞Ｔ４７Ｄは接
着細胞であるため、培養容器の底に接着して増殖する。
従って、６０ｍｍディッシュに半導体チップを置き、乳
癌細胞Ｔ４７Ｄ懸濁液を加え、１０％ウシ胎児血清含有
ＲＰＭＩ１６４０培地（以後、ＲＰＭＩ１６４０−１０
％ＦＢＳ培地と称する）で該ディッシュを満たし、これ
を３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養することによ
り、半導体チップに該乳癌細胞を接着した。この培養
後、顕微鏡により細胞接着を確認した。
て乳癌細胞Ｔ４７Ｄを使用した。乳癌細胞Ｔ４７Ｄは接
着細胞であるため、培養容器の底に接着して増殖する。
従って、６０ｍｍディッシュに半導体チップを置き、乳
癌細胞Ｔ４７Ｄ懸濁液を加え、１０％ウシ胎児血清含有
ＲＰＭＩ１６４０培地（以後、ＲＰＭＩ１６４０−１０
％ＦＢＳ培地と称する）で該ディッシュを満たし、これ
を３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養することによ
り、半導体チップに該乳癌細胞を接着した。この培養
後、顕微鏡により細胞接着を確認した。
【００２９】［バイオセンサー］上記のＳＰＶデバイス
及び細胞を使用し、バイオセンサーを具備した測定装置
を、図１及び図２に従って組み立てた。
及び細胞を使用し、バイオセンサーを具備した測定装置
を、図１及び図２に従って組み立てた。
【００３０】参照極には白金、バイアス電圧を印加する
ための対極には金を使用した。装置に印加するバイアス
電流は、０〜４Ｖの間で任意に設定した。光源には、ピ
ーク発光波長９４０ｎｍ、周波数７５０Ｈｚの発光ダイ
オード（以下、ＬＥＤとも称する）を１つ使用した。
ための対極には金を使用した。装置に印加するバイアス
電流は、０〜４Ｖの間で任意に設定した。光源には、ピ
ーク発光波長９４０ｎｍ、周波数７５０Ｈｚの発光ダイ
オード（以下、ＬＥＤとも称する）を１つ使用した。
【００３１】［バイオセンサーの測定方法］先ず、溶媒
を一定流速で流し、次に、バイアス電圧を増加させたと
きの応答曲線を測定した。このときの変曲点におけるバ
イアス電圧値を算出する。以下の試験は、バイアス電圧
をこの条件で変曲点の電圧に保ち、測定試料を流した際
に見られる光電流量の経時変化を測定して行なった。
を一定流速で流し、次に、バイアス電圧を増加させたと
きの応答曲線を測定した。このときの変曲点におけるバ
イアス電圧値を算出する。以下の試験は、バイアス電圧
をこの条件で変曲点の電圧に保ち、測定試料を流した際
に見られる光電流量の経時変化を測定して行なった。
【００３２】［緩衝液を用いたｐＨ変化の測定］ＳＰＶ
デバイスはｐＨの微小な変化を光電流の変化として測定
することができる。そこで、以下の方法により光電流と
ｐＨの関係を確認した。
デバイスはｐＨの微小な変化を光電流の変化として測定
することができる。そこで、以下の方法により光電流と
ｐＨの関係を確認した。
【００３３】細胞や組織切片等を固定化していない半導
体チップを、ＳＰＶデバイスにセットし、流速０．１ｍ
ｌ／ｍｉｎでリン酸緩衝液（ｐＨ７）を流した。次にフ
ローを硼酸緩衝液（ｐＨ９）に切り替え、ｐＨによる光
電流変化を測定した。
体チップを、ＳＰＶデバイスにセットし、流速０．１ｍ
ｌ／ｍｉｎでリン酸緩衝液（ｐＨ７）を流した。次にフ
ローを硼酸緩衝液（ｐＨ９）に切り替え、ｐＨによる光
電流変化を測定した。
【００３４】［リン酸緩衝液を溶媒に用いた光電流量の
測定］乳癌細胞Ｔ４７Ｄを固定化した半導体チップをＳ
ＰＶデバイスにセットし、流速０．１ｍｌ／ｍｉｎでリ
ン酸緩衝液(以下、ＰＢＳと称す)を流した。この流速
は、測定前後において接着した細胞が剥離しない速度を
検討することにより決定した（データは示さず）。
測定］乳癌細胞Ｔ４７Ｄを固定化した半導体チップをＳ
ＰＶデバイスにセットし、流速０．１ｍｌ／ｍｉｎでリ
ン酸緩衝液(以下、ＰＢＳと称す)を流した。この流速
は、測定前後において接着した細胞が剥離しない速度を
検討することにより決定した（データは示さず）。
【００３５】ＰＢＳにおける光電流応答が安定したとこ
ろで、流入液をＰＢＳで調製した５０μＭ−エストラジ
オール１７β溶液に切り替えることにより培養液層８の
溶液を入れ替えて光電流応答の経時変化を測定した。ま
た、対照として、細胞を固定しない半導体チップについ
ても同様に測定した。
ろで、流入液をＰＢＳで調製した５０μＭ−エストラジ
オール１７β溶液に切り替えることにより培養液層８の
溶液を入れ替えて光電流応答の経時変化を測定した。ま
た、対照として、細胞を固定しない半導体チップについ
ても同様に測定した。
【００３６】３−２．測定結果 ［動物細胞の培養及び固定化］半導体チップ上への細胞
接着を顕微鏡で観察した（図３）。図３の上図は、使用
した３５ｍｍ×１８ｍｍの半導体チップであり、１．５
ｍｍ×１．５ｍｍの５つの領域は、シリコン基板上にシ
リコン酸化膜とシリコン窒化膜をコートした絶縁膜であ
り、この部分が電位変化を感知する役割を果たす。図３
の下の写真はこの領域に固定された細胞を示す。この結
果より、半導体チップ上に細胞を培養できることが確認
された。
接着を顕微鏡で観察した（図３）。図３の上図は、使用
した３５ｍｍ×１８ｍｍの半導体チップであり、１．５
ｍｍ×１．５ｍｍの５つの領域は、シリコン基板上にシ
リコン酸化膜とシリコン窒化膜をコートした絶縁膜であ
り、この部分が電位変化を感知する役割を果たす。図３
の下の写真はこの領域に固定された細胞を示す。この結
果より、半導体チップ上に細胞を培養できることが確認
された。
【００３７】［緩衝液を用いたｐＨ変化の測定］ｐＨ７
の緩衝液からｐＨ９の緩衝液に溶媒を変化させたこと
ろ、３０ｎＡ程度の光電流量の変化が見られた（図
４）。このことから、本ＳＰＶデバイスはｐＨの変化を
光電流量の変化として測定できることを確認した。
の緩衝液からｐＨ９の緩衝液に溶媒を変化させたこと
ろ、３０ｎＡ程度の光電流量の変化が見られた（図
４）。このことから、本ＳＰＶデバイスはｐＨの変化を
光電流量の変化として測定できることを確認した。
【００３８】ここで、光電流量の上昇はアルカリ性に変
化したことを意味し、光電流量の減少は酸性に変化した
ことを意味する。
化したことを意味し、光電流量の減少は酸性に変化した
ことを意味する。
【００３９】［リン酸緩衝液を溶媒に用いた光電流量の
測定］結果を図５に示す。図中の「細胞なし」は、シリ
コンチップのみによる光電流量の経時変化を示し、「細
胞あり」は、シリコンチップに前述の通りに細胞を固定
したチップを使用した場合の光電流量の経時変化を示
す。また、矢印の時点で培養液層８の溶液をエストラジ
オール１７β溶液に変え、この時点を時間０分とし、光
電流量の経時変化を測定した。
測定］結果を図５に示す。図中の「細胞なし」は、シリ
コンチップのみによる光電流量の経時変化を示し、「細
胞あり」は、シリコンチップに前述の通りに細胞を固定
したチップを使用した場合の光電流量の経時変化を示
す。また、矢印の時点で培養液層８の溶液をエストラジ
オール１７β溶液に変え、この時点を時間０分とし、光
電流量の経時変化を測定した。
【００４０】細胞なしでは、エストラジオール１７β注
入前後において変化はなく、経時的に連続して光電流量
は増加した。このことは、ＰＢＳとエストラジオールの
ＰＢＳ溶液との間にｐＨの差が存在しないことを意味す
る。更に、エストラジオールの該半導体チップへの吸着
はないことをも示す。
入前後において変化はなく、経時的に連続して光電流量
は増加した。このことは、ＰＢＳとエストラジオールの
ＰＢＳ溶液との間にｐＨの差が存在しないことを意味す
る。更に、エストラジオールの該半導体チップへの吸着
はないことをも示す。
【００４１】一方、細胞ありでは、約１５分から光電流
量は減少している。即ち、これは、添加されたエストラ
ジオールにより該細胞群の代謝が活性化されたことを示
す。
量は減少している。即ち、これは、添加されたエストラ
ジオールにより該細胞群の代謝が活性化されたことを示
す。
【００４２】また、光電流量測定の前後における、流速
による細胞脱離の有無を顕微鏡で観察したところ、細胞
の接着に対するフローの影響は顕著ではなかった。
による細胞脱離の有無を顕微鏡で観察したところ、細胞
の接着に対するフローの影響は顕著ではなかった。
【００４３】
【発明の効果】本発明の装置により、種々の物質につい
ての細胞の代謝活性に及ぼす影響を簡便に、迅速に且つ
感度良く測定することが可能である。また、環境ホルモ
ンに対する受容体を有する細胞を使用することにより、
非常に高感度に、且つ迅速且つ簡便に環境ホルモンの検
出及び定量を行なうことが可能である。また、環境ホル
モンの検出以外にも、所望する物質に対して反応性を有
する細胞を使用することにより、所望する物質、その細
胞の代謝活性の変化を測定することによって、該細胞の
おかれた環境の栄養状態をも容易に分析することが可能
である。従って、本発明の装置は、例えば、農薬、重金
属及び発癌物質等を検出するための環境モニタリング、
また、例えば、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を検出又
は定量するための食品モニタリング等への応用も可能で
ある。
ての細胞の代謝活性に及ぼす影響を簡便に、迅速に且つ
感度良く測定することが可能である。また、環境ホルモ
ンに対する受容体を有する細胞を使用することにより、
非常に高感度に、且つ迅速且つ簡便に環境ホルモンの検
出及び定量を行なうことが可能である。また、環境ホル
モンの検出以外にも、所望する物質に対して反応性を有
する細胞を使用することにより、所望する物質、その細
胞の代謝活性の変化を測定することによって、該細胞の
おかれた環境の栄養状態をも容易に分析することが可能
である。従って、本発明の装置は、例えば、農薬、重金
属及び発癌物質等を検出するための環境モニタリング、
また、例えば、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を検出又
は定量するための食品モニタリング等への応用も可能で
ある。
【図１】 本発明のバイオセンサーを示す図。
【図２】 本発明のバイオセンサーを示す図。
【図３】 半導体チップ上に固定した細胞を示す顕微鏡
写真
写真
【図４】 本発明の装置を用いてｐＨを測定した結果を
示すグラフ。
示すグラフ。
【図５】 本発明の装置を用いて細胞の代謝活性に及ぼ
すエストロジェンの影響を測定した結果を示すグラフ。
すエストロジェンの影響を測定した結果を示すグラフ。
１．伝導体 ２．半導体 ３．絶縁層 ４．生細
胞又は生細胞群 ７．電極 ８．培養液層 ９．
発光ダイオード １０．流出路 １１．電極
胞又は生細胞群 ７．電極 ８．培養液層 ９．
発光ダイオード １０．流出路 １１．電極
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/34 C12Q 1/00 G01N 27/416 G01N 33/48 - 33/98
Claims (1)
- 【請求項１】 被検物質が細胞の代謝活性に及ぼす影響
を測定し、環境ホルモンを検出するためのバイオセンサ
ーであって、 半導体層、該半導体の主面に積層された絶縁層、該絶縁
層に接触してその上に配置された環境ホルモンに感受性
のある生細胞又は生細胞群、及び該生細胞又は生細胞群
を浸漬し且つ前記絶縁層に接触した培養液層とからなる
ＭＩＳ構造体と、前記ＭＩＳ構造体にバイアス電圧を印
加するためのバイアス電極手段と、 前記ＭＩＳ構造体に光起電力を発生させるために、前記
ＭＩＳ構造体に制御された光を照射するための光源手段
と、 前記培養液層に、被検物質を添加するための手段と、 並びに、前記ＭＩＳ構造に発生した光起電力の変化をモ
ニターするための手段とを具備し、 前記被検物質を添加する前後における前記光起電力の変
化から、前記被検物質が前記細胞の代謝活性に及ぼす影
響を測定することを特徴とするバイオセンサー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25443299A JP3200631B2 (ja) | 1999-09-08 | 1999-09-08 | 細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定するためのバイオセンサー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25443299A JP3200631B2 (ja) | 1999-09-08 | 1999-09-08 | 細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定するためのバイオセンサー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001078748A JP2001078748A (ja) | 2001-03-27 |
| JP3200631B2 true JP3200631B2 (ja) | 2001-08-20 |
Family
ID=17264917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25443299A Expired - Lifetime JP3200631B2 (ja) | 1999-09-08 | 1999-09-08 | 細胞の代謝活性に及ぼす影響を測定するためのバイオセンサー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3200631B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7462324B2 (en) | 1997-08-07 | 2008-12-09 | Panasonic Corporation | Measurement device and method for measuring electric signal from biological sample |
| JP2006521786A (ja) * | 2002-08-19 | 2006-09-28 | バイオプロセッサーズ コーポレイション | マイクロリアクター構造および方法 |
-
1999
- 1999-09-08 JP JP25443299A patent/JP3200631B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 電気学会化学センサシステム研究会資料 Ｖｏｌ．ＣＳ−９７，ＮＯ．４１−５３（１９９７）ｐ．４１−４６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001078748A (ja) | 2001-03-27 |
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