JP3267293B2 - 改変された結合性を有する変異タンパク質の豊富化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、標的分子に対して改変された結合性を有す
る新規な結合タンパク質の製造および体系的な選択に関
する。さらに具体的には、本発明は、天然の結合パート
ナーの結合活性を模倣した外性ポリペプチドを製造する
ための方法に関する。好ましい態様においては、本発明
は、ホルモン、薬物およびその他の小分子（特に、成長
ホルモンなどの生物学的に活性な分子）などのタンパク
質または非ペプチジル分子を模倣する治療用または診断
用化合物の製造に関する。

発明の背景 結合パートナーとは、通常は非共有性の相互作用によ
って互いに特異的に結合する物質である。結合パートナ
ーの例には、リガンド−受容体、抗体−抗原、薬物−標
的、および酵素−基質の相互作用が含まれる。結合パー
トナーは、治療および診断の両分野で極めて有用であ
る。

過去において、結合パートナーは、天然からの収集
（例えば、抗体−抗原、およびリガンド−受容体ペアリ
ング）を含む種々の方法によって、および偶発的な同定
（例えば、候補分子のランダムスクリーニングを用いる
伝統的な薬物開発）によって調製されている。ある場合
には、これら２種類の方法が組合せられている。例え
ば、結合に関与している鍵となる機能的残基を含むタン
パク質またはポリペプチドの変異体（ポリペプチドフラ
グメントなど）が調製されている。次いで、これらのポ
リペプチドフラグメントは、伝統的な薬物開発と同種の
方法によって誘導体化されている。このような誘導体化
の例には、ポリペプチドフラグメントを立体配座的に制
約して新規な候補結合パートナーを得るための環化など
の方法が含まれるであろう。

従来の方法を用いたときの問題は、天然のリガンドが
すべての治療学的応用に適した性質を有していないこと
があることである。さらに、ポリペプチドリガンドは一
部の標的物質に対して使用できないこともある。また、
非天然の合成結合パートナーを製造するための方法は高
価かつ困難であることが多く、通常はそれぞれの候補を
得るために複雑な合成法を必要とする。候補分子をさら
に最適化するために合理的な薬物設計法を適用すること
ができるように、得られた候補の構造の特徴を調べるこ
とができないことが、これらの方法の一層の妨げとなっ
ている。

これらの問題を克服しようとする試みにおいて、Geys
en［Immun.Today 6:364−369（1985）］およびGeysenら
［Mol.Immun.23:709−715（1986）］は、体系的な反復
結合パートナーの同定および製造のための骨組みを与え
るポリペプチド合成の使用を提案した。Geysenら（同
上）によると、初めにジペプチドなどの短いポリペプチ
ドを、標的分子に結合する能力についてスクリーニング
する。次いで、最も活性なジペプチドを次の試験用に選
択する。この試験は、出発ジペプチドに別の残基を結合
させ（または、最初の出発ジペプチドの構成成分を内部
修飾することによる）、次いでこの一組の候補を所望の
活性についてスクリーニングすることからなる。所望の
性質を有する結合パートナーが同定されるまでこの過程
を繰り返す。

Geysenらの方法は、その方法の基礎となっている化
学、即ちペプチド合成が明白ではないかまたは変化に富
んだ２次および３次構造を有する分子を生成するという
不都合が障害となっている。選択の繰り返し回数が増え
るにつれて、ランダムな相互作用がポリペプチドの種々
の置換基の間で加速度的に増え、再現性ある高次構造を
有する相互作用分子の真のランダム集団が得られなくな
る。例えば、アミノ酸の側鎖（これらは配列的には大き
く離れているが、空間的には隣接している）の間の相互
作用が任意に起こる。さらに、立体配座的に安定な２次
構造を促進しない配列は複雑なペプチド−側鎖の相互作
用を与え、これがあるアミノ酸の標的分子との側鎖相互
作用を妨げることもある。このような複雑な相互作用
は、ポリペプチド候補のポリアミド骨格の柔軟性によっ
て促進される。また、候補は多数の立体配座において存
在することができ、最大の親和性または特異性を有する
標的と相互作用するかまたはそれに結合する配座異性体
の同定を困難にし、合理的な薬物設計を困難にする。

Geysenの反復ポリペプチド法を用いたときの最後の問
題は、現在のところ、多様性の高い別種ペプチドを製
造、スクリーニングおよび分析しうる実際的な方法が存
在しないことである。20種の天然アミノ酸を用いると、
合成しなければならないヘキサペプチドのすべての組合
せの合計数は64,000,000である。このような多様性の高
いペプチドを製造したとしても、このような多様性の高
いペプチドの混合物を迅速にスクリーニングして標的分
子に対して高い親和性を有するペプチドを選択すること
ができる利用可能な方法が存在しない。現在のところ、
それぞれの「付着」ペプチドは、タンパク質の配列決定
を行なうに十分な多量で回収されなければならない。

Geysenの方法に固有の多くの問題を克服するために、
生物学的な選択およびスクリーニングが代替法として選
ばれた。生物学的な選択およびスクリーニングは、タン
パク質機能の探索および所望の性質を有する変異タンパ
ク質の単離のための強力な手段である［Shortle,Protei
n Engineering,OxenderおよびFox編,A.R.Liss,Inc.,NY,
pp.103−108（1988）；およびBowieら,Science 247:130
6−1310（1990）］。しかし、得られる選択またはスク
リーニングは、１つだけかまたは少数の関連タンパク質
に適用できるにすぎない。

最近になって、Smithとその共同研究者［Smith,Scien
ce 228:1315−1317（1985）；およびParmleyおよびSmit
h,Gene 73:305−318（1985）］は、短い遺伝子フラグメ
ントをfdファージ（「融合ファージ」）の遺伝子III中
に挿入することにより、小さなタンパク質フラグメント
（10〜50アミノ酸）を線状ファージの表面に効率的に
「表示（顕示）」させうることを示した。遺伝子IIIの
副コートタンパク質（ビリオンの一方の末端に約５コピ
ー存在する）は、適切なファージ組立ておよび大腸菌の
線毛への付着による感染に重要である［Raschedら,Micr
obiol.Rev.50:401−427（1986）］。最近、「融合ファ
ージ」は、外性タンパク質［Devlinら,Science 249:404
−406（1990）］または抗体［Scottら,Science 249:386
−390（1990）；およびCwirlaら,Proc.Natl.Acad.USA 8
7:6378−6382（1990）］と反応しうるペプチドを同定す
るための短い突然変異ペプチド配列を表示させるのに有
用であることがわかった。

しかし、このような「融合ファージ」を、新規または
増強された結合性を有する改変されたペプチドまたはタ
ンパク質を同定するために使用する際には、いくつかの
重要な制限が存在する。第１に、大きな挿入体は恐らく
は遺伝子IIIの機能を破壊し、従ってファージの組立て
および感染性を破壊するので、100未満、好ましくは50
未満のアミノ酸残基のタンパク質を表示させるときにの
み融合ファージが有用であることが示されている［Parm
leyら,Gene 73:305−318（1988）］。第２に、従来の方
法は、標的分子に対して最大の結合親和性を有するライ
ブラリーからペプチドを選択することができない。例え
ば、ランダムペプチドライブラリーを抗−βエンドルフ
ィン モノクローナル抗体で徹底的に選別した後には、
Cwirlaとその共同研究者はファージに融合させた高親和
性ペプチド（Kd〜0.4μＭ）から中親和性ペプチド（Kd
〜10μＭ）を分離することができなかったであろう。さ
らに、極めて高い親和性（Kd〜7nM）を有する親のβ−
エンドルフィンペプチド配列は、エピトープライブラリ
ーから選別されなかった。

Ladner［WO 90/02802］は、ウイルス粒子および細胞
の外側表面に表示された新規な結合タンパク質を選択す
るための方法を開示している（異種タンパク質は164個
までのアミノ酸残基を有していてよいとされている）。
この方法は、表示されたタンパク質を単離および増幅し
て標的分子に対して所望の親和性を有する新しい群の結
合タンパク質を設計することを意図している。さらに具
体的には、Ladnerは、M13遺伝子IIIコートタンパク質に
融合させた46残基（クラムビン）から164残基（T4リソ
チーム）までの範囲の「最初のタンパク質結合ドメイ
ン」を有するタンパク質を表示する「融合ファージ」を
開示している。Ladnerは、比較的小さいアミノ酸配列に
制限部位をアレンジするのは比較的容易であるので、
「必要以上に大きくない」これらタンパク質の使用を教
示し、58アミノ酸残基のウシ膵臓トリプシンインヒビタ
ー（BPTI）を好んで用いている。BPTIなどの小さい融合
タンパク質は標的がタンパク質または巨大分子であると
きに好ましく、一方、T4リソチームなどの比較的大きい
融合タンパク質はステロイドなどの小さい標的分子に好
ましいが、これはこのような大きいタンパク質が小さい
分子を嵌め込むことができる裂け目および溝を有してい
るためである。この好ましいタンパク質BPTIをSmithら
またはde la Cruzら［J.Biol.Chem.263:4318−4322（19
88）］が開示した遺伝子IIIの部位に、またはその末端
の一方に、遺伝子IIIの第２の合成コピーと共に融合さ
せて、「一部」の未改変遺伝子IIIタンパク質が存在す
るようにすることが提案されている。Ladnerは、従来技
術の生物学的な選択およびスクリーニング法の障害とな
る、ランダムペプチドライブラリーから高親和性ペプチ
ドを成功裏に選別する際の問題についてはふれていな
い。

ヒト成長ホルモン（hGH）は、正常なヒトの成長およ
び発達の調節に多大に関与している。この22,000ダルト
ンの脳下垂体ホルモンは、特に、線状成長（体形成）、
泌乳、マクロファージの活性化、インスリン様および糖
尿発生作用を含む多数の生物学的作用を示す［Chawla,
R.K.,Ann.Rev,Med.34:519（1983）;Edwards,C.K.ら,Sci
ence 239:769（1988）;Thomer,M.O.ら,J.Clin.Invest.8
1:745（1988）］。子供における成長ホルモンの欠損は
小人症を導くが、これは10年以上にわたるhGHの外部投
与によって成功裏に治療されている。hGHは、胎盤ラク
トゲン、プロラクチン、ならびに他の遺伝的および種的
変異体または成長ホルモンを含む一群の相同ホルモンの
一員である［Nicoll,C.S.ら,Endocrine Reviews 7:169
（1986）］。hGHはこれらの中で独特であり、広い種特
異性を示し、クローン化した体形成受容体［Leung,D.W.
ら,Nature 330:537（1987）］またはプロラクチン受容
体［Boutin,J.M.ら,Ce 53:69（1988）］に結合する。ク
ローン化されたhGHの遺伝子は大腸菌において分泌型で
発現されており［Chang,C.N.ら,Gene 55:189（198
7）］、そのDNAおよびアミノ酸配列が報告されている
［Goeddelら,Nature 281:544（1979）;Grayら,Gene 39:
247（1985）］。hGHの３次元構造は利用することができ
ない。しかし、ブタ成長ホルモン（pGH）の３次元折り
畳みパターンは普通の分解能および精度で報告されてい
る［Abdel−Meguid,S.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4:6434（1987）］。ヒト成長ホルモンの受容体および抗
体エピトープは、ホモログ−スキャニング突然変異誘発
によって同定されている［Cunninghamら,Science 243:1
330（1989）］。ヒスチジン18とヒスチジン21を含むヒ
ト成長ホルモンのスプライスされた配列を含有する新規
なアミノ末端メチオニル ウシ成長ホルモンの構造が示
されている［米国特許No.4,880,910］。

ヒト成長ホルモン（hGH）は、種々の動物モデルにお
いて線状骨格成長、泌乳、マクロファージの活性化、イ
ンスリン様および糖尿作用などを含む多種の生理学的お
よび代謝作用を引き起こす［R.K.Chawlaら,Annu.Rev.Me
d.34:519（1983）;O.G.P.Isakssonら,Annu.Rev.Physio
l.47:483（1985）;C.K.Edwardsら,Science 239:769（19
88）;M.O.ThornerおよびM.L.Vance,J.Clin.Invest.82:7
45（1988）;J.P.HughesおよびH.G.Friesen,Ann.Rev.Phy
siol.47:469（1985）］。これらの生物学的作用は、hGH
と特異的な細胞受容体の間の相互作用によって導かれ
る。

従って、本発明の目的は、候補の結合物質の体系的製
造のための迅速かつ効率的な方法を提供することであ
る。

本発明の別の目的は、ファージミド粒子の表面に表示
される立体配座的に安定な候補結合物質を製造すること
である。

本発明の他の目的は、ファージのコートタンパク質と
異種ポリペプチドの融合タンパク質からなる候補結合物
質を製造することである［ここで、該ポリペプチドは長
さが100アミノ酸以上であり、１サブユニット以上であ
ってよく、そしてファージミド粒子上に表示されるもの
である（該ポリペプチドはこのファージミドのゲノムに
コードされている）］。

本発明のさらに別の目的は、非共有性の結合相互作用
に関与する可能性のあるすべてのペプチジル部分を与え
るかまたは表示し、また、立体的に制限された様式でこ
れらの部分を与えるに十分な融通性を備えた結合物質を
製造および選択するための方法を提供するものである。

本発明の他の目的は、成長ホルモン受容体および結合
タンパク質に対してさらに強い親和性を示す成長ホルモ
ン変異体の製造である。

本発明の別の目的は、検出可能な融合タンパク質がサ
プレッサー宿主細胞において産生され、異種ポリペプチ
ドだけが非サプレッサー宿主細胞において産生されるよ
うに、異種ポリペプチドとファージコートタンパク質の
間に機能的に設置された抑制可能な終止コドンを含有す
る発現ベクターファージミドを製造することである。

最後に、本発明の目的は、ファージミド粒子の外側表
面に１を越える候補結合タンパク質のコピーをめったに
表示することがなく、従って高親和性の結合タンパク質
の効率的な選択を達成することができるファージミド粒
子を製造することである。

本発明のこれらおよび他の目的は、本発明を全体とし
て考慮することにより明らかであろう。

発明の要約 上記の目的は、 （ａ）ポリペプチドをコードしている第１の遺伝子と天
然または野生型ファージコートタンパク質の少なくとも
一部をコードしている第２の遺伝子を含有する複製可能
な発現ベクター（ここで、第１および第２の遺伝子は異
種であり、転写調節要素が第１および第２の遺伝子に機
能的に結合されており、従って融合タンパク質をコード
している遺伝子融合が得られる）を構築し； （ｂ）該ベクターの第１の遺伝子内の１またはそれ以上
の選択した位置において突然変異を行なって一群の関連
プラスミドを生成させ； （ｃ）該プラスミドで適当な宿主細胞を形質転換し； （ｄ）該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタン
パク質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファー
ジに感染させ； （ｅ）該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換え
ファージミド粒子の形成に適切かつ宿主を形質転換しう
る条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タン
パク質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するよう
に該条件を調節して、該形質転換して感染させた宿主細
胞を培養し； （ｆ）該ファージミド粒子を標的分子と接触させて、フ
ァージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合さ
せ；そして （ｇ）結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分
離する； ことからなる新規な結合ポリペプチドを選択するための
方法を提供することによって達成した。この方法は、さ
らに、標的分子に結合する組換えファージミド粒子で適
切な宿主細胞を形質転換し、工程（ｄ）〜（ｇ）を１ま
たはそれ以上の回数繰り返す工程を含んでいるのが好ま
しい。

さらに、１を越えるサブユニットからなる新規な結合
タンパク質を選択する方法を、次のように新規な結合ペ
プチドを選択することによって達成する：即ち、この選
択法は、 ・１またはそれ以上のサブユニットを含む所望のタンパ
ク質をコードしているDNAに機能的に結合させた転写調
節要素を含有する複製可能な発現ベクター（ここで、該
サブユニットの少なくとも１つをコードしているDNAは
ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードし
ているDNAに融合している）を構築し； ・１またはそれ以上の選択した位置において該所望のタ
ンパク質をコードしているDNAに突然変異を行なって一
群の関連ベクターを生成させ； ・該ベクターで適当な宿主細胞を形質転換し； ・該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタンパク
質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに
感染させ； ・該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換えファ
ージミド粒子の形成に適切かつ宿主を形質転換しうる条
件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパク
質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該
条件を調節して、該形質転換して感染させた宿主細胞を
培養し； ・該ファージミド粒子を標的分子と接触させて、ファー
ジミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合させ；
そして ・結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離す
る； ことからなる。

本発明の方法においては、プラスミドが転写調節要素
の厳格な制御下にあり、粒子の表面に融合タンパク質の
１を越えるコピーを表示するファージミド粒子の量また
は数が約１％未満となるように培養条件が調節されてい
るのが好ましい。また、融合タンパク質の１を越えるコ
ピーを表示するファージミド粒子の量が、融合タンパク
質の単一コピーを表示するファージミド粒子の量の10％
未満であるのが好ましい。最も好ましいのは、この量が
20％未満である。

通常、本発明の方法においては、発現ベクターはポリ
ペプチドのそれぞれのサブユニットをコードしているDN
Aに融合させた分泌シグナル配列をさらに含有し、転写
調節要素はプロモーター系であろう。好ましいプロモー
ター系は、LacZ、λ_PL、TAC、T7ポリメラーゼ、トリプ
トファン、およびアルカリホスファターゼプロモーター
ならびにこれらの組合せから選択される。

また、第１の遺伝子は通常は哺乳動物タンパク質をコ
ードしているであろう。好ましいタンパク質は次のもの
から選択されるであろう：ヒト成長ホルモン（hGH）、
Ｎ−メチオニル ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモ
ン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリンＡ鎖、
インスリンＢ鎖、プロインスリン、レラキシンＡ鎖、レ
ラキシンＢ鎖、プロレラキシン、糖タンパク質ホルモ
ン、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホル
モン（TSH）およびロイチナイジング（Leutinizing）ホ
ルモン（LH）、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシト
ニン、グルカゴン、因子VIII、抗体、肺表面活性物質、
ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）、ボンベシン、因子I
X、トロンビン、造血成長ホルモン、腫瘍壊死因子αお
よびβ、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ミ
ュラー阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、
微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ、組織因子
タンパク質、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因
子、ホルモンまたは成長因子の受容体；インテグリン、
トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リウマトイ
ド因子、神経成長因子、例えばNGF−β、血小板成長因
子、トランスフォーミング成長因子（TGF）、例えばTGF
−αおよびTGF−β、インスリン様成長因子ＩおよびI
I、インスリン様成長因子結合タンパク質、CD−４、DN
アーゼ、潜在性関連ペプチド、エリトロポエチン、骨誘
導因子、インターフェロン、例えばインターフェロン
α、βおよびγ、コロニー刺激因子（CSF）、例えばＭ
−CSF、GM−CSFおよびＧ−CSF、インターロイキン（I
L）、例えばIL−１、IL−２、IL−３、IL−４、スーパ
ーオキシドジスムターゼ；崩壊促進因子、ウイルス抗
原、HIVエンベロープタンパク質、例えばGP120、GP14
0、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢまたはＣ、免
疫グロブリン、ならびに上記タンパク質のいずれかのフ
ラグメント。

好ましくは、第１の遺伝子は約100以上のアミノ酸残
基を含む１またはそれ以上のサブユニットのポリペプチ
ドをコードしており、標的と相互作用しうる複数のアミ
ノ酸を表示する複数の堅い２次構造を形成するように折
り畳まれているであろう。好ましくは、第１の遺伝子
は、堅い２次構造の完全性が保存されるように、標的と
相互作用しうるアミノ酸にのみ対応するコドンのところ
で突然変異が為されているであろう。

通常、本発明の方法は、M13KO7、M13R408、M13−VCS
およびPhiX174から選択されるヘルパーファージを用い
るであろう。好ましいヘルパーファージはM13KO7であ
り、好ましいコートタンパク質はM13ファージの遺伝子I
IIコートタンパク質である。好ましい宿主は大腸菌であ
り、大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。本発明の方法
によって選択される新規なhGH変異体を検出した。この
ポリペプチドとファージコートタンパク質をコードして
いる核酸の間に機能的に設置した抑制可能な終止コドン
を含有するファージミド発現ベクターを構築した。

図面の簡単な説明 図1:線状ファージの表面に大きいタンパク質を表示
（顕示）させるための方法および改変させた受容体結合
性を豊富化する方法を示すものである。hGHの全暗号配
列をM13遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメインに融合させ
たプラスミドphGH−M13g IIIを構築した。この融合タン
パク質の転写はlacプロモーター／オペレーター配列の
支配下にあり、分泌はst IIシグナル配列によって指令
されている。ファージミド粒子は「ヘルパー」ファージ
M13KO7による感染によって得られ、pGHを表示する粒子
はhGH受容体を含む親和性マトリックスに結合させるこ
とによって豊富化することができる。野生型遺伝子III
（M13KO7ファージから導く）はファージの先端の４〜５
コピーの複数矢印により図示し、融合タンパク質（ファ
ージミドphGH−M13g IIIから導く）はhGHの折り畳み図
形（矢印の頭部を置換）によって図示した。

図2:全ファージ粒子の免疫ブロットはhGHがファージ
と同時移動することを示す。塩化セシウム勾配で精製し
たファージミド粒子を二重のウエルに付し、375mMトリ
ス、40mMグリシン（pH9.6）緩衝液中、１％アガロース
ゲルで電気泳動を行なった。このゲルを、２％SDSおよ
び２％β−メルカプトエタノールを含む移転緩衝液［25
mMトリス（pH8.3）、200mMグリシン、20％メタノール］
中に２時間浸漬し、次いで移転緩衝液中で６時間すすい
だ。次いで、ゲル中のタンパク質をイモビロン膜（Mill
ipore）上に電気ブロットした。１組の試料を含む膜は
クーマシーブルーで染色してファージタンパク質の位置
を示した（Ａ）。二重の膜をポリクローナルウサギ抗−
hGH抗体と反応させ、次いで西洋ワサビペルオキシダー
ゼ−コンジュゲート化したヤギ抗−ウサギIgG抗体と反
応させることによって、膜のhGHを免疫染色した
（Ｂ）。レーン１はM13KO7親ファージを含み、これはhG
Hを欠いているのでクーマシーブルー染色した膜におい
てのみ観察することができた。レーン２および３はホル
モン ファージミド粒子の別の調製物を含んでおり、ク
ーマシーおよびhGH免疫染色の両方で観察することがで
きた。親のM13KO7ファージとホルモン ファージミド粒
子の間の移動距離の差異は、内部にパッケージされたゲ
ノムの大きさの相違を反映するものである（それぞれ、
8.7kbと5.1kb）。

図3:コドン172、174、176および178のところをランダ
ム化したhGH−ファージライブラリーの選択法における
各工程をまとめる図である。hGH（R178G、I179T）遺伝
子および唯一のKpn I制限部位を含有する鋳型分子pH041
5を本明細書に記載のように突然変異誘発し、大腸菌株W
JM101中に電気導入して最初のファージミドライブラリ
ー（ライブラリー１）を得た。ライブラリー１の一部
（約２％）を、本明細書に記載のように最初の選択ラウ
ンドに直接用いてライブラリー1Gを得た。一方、２本鎖
DNA（dsDNA）をライブラリー１から調製し、制限酵素Kp
n Iで消化して鋳型のバックグラウンドを排除し、WJM10
1中に電気導入してライブラリー２を得た。これらに続
く選択ラウンド（または、Kpn I消化；陰影を付けた
箱）とその後のファージミドの増殖は、本明細書に記載
した方法に従い、矢印で示したように行なった。ライブ
ラリー4G⁴からの４種の独立したクローンおよびライブ
ラリー5G⁶からの４種の独立したクローンをジデオキシ
配列決定法によって配列決定した。これらクローンのす
べてが、hGH突然変異体（Glu 174 Ser、Phe 176 Tyr）
に一致する同一DNA配列を有していた。

図4:結晶学により決定したブタ成長ホルモンの2.8Å
折り畳み図から導いたhGHの構造モデルを示すものであ
る。hGH−結合タンパク質への結合を強く変調させるhGH
中の残基の位置を陰影を付けた円内に示した。結合親和
性において10倍以上の減少（●）、４〜10倍の減少
（・）、増加（○）、または２〜４倍の減少（・）を引
き起こすアラニン置換が示されている。α−ヘリックス
領域におけるらせん輪投影により、これらの両極性が明
らかになった。黒くした、陰影を付けた、あるいは陰影
を付けていない残基は、それぞれ荷電、極性、または非
極性を示す。ヘリックス４において、突然変異のための
最も重要な残基は親水性の面上にある。

図5:表示した経路（hGH溶離、グリシン溶離、または
予吸着後のグリシン溶離）に対するラウンド１および３
の選択工程からの多数のクローンを配列決定した後にわ
かったhGHの172、174、176および178位のアミノ酸置換
を示すものである（例えば、KSYRという表示はhGH突然
変異体172K/174S/176Y/178Rを表す）。非機能的な配列
（即ち、ベクター バックグラウンド、または他の未成
熟に終わった突然変異体および／またはフレームシフト
した突然変異体）は「NF」として示している。非サイレ
ントの疑似突然変異（即ち、上に挙げた組の標的残基以
外）を含む機能的な配列は「＋」で示している。すべて
の配列決定クローンの中で１回を越えて現れたが異なる
DNA配列を有するタンパク質配列は「＃」で示してい
る。配列決定クローンの中で１回を越えて現れ、そして
同じDNA配列を有するタンパク質配列は「＊」で示して
いる。３ラウンドの選択の後に２種の異なる汚染配列が
見い出されたことに注意すべきである（これらのクロー
ンはカセット突然変異体に一致しなかったが、先に構築
したホルモン ファージに一致した）。pS0643汚染体は
野生型hGH−ファージに一致する（hGH「KEFR」）。第３
ラウンドのグリシン選択したファージのプールに多いpH
0457汚染体は、先に同定したhGHの突然変異体「KSYR」
に一致する。これら汚染体の増幅は、まれにした発生し
ない突然変異体を選択するためのホルモン−ファージ選
択法の能力を強調するものである。また、これらの配列
の集中性は３種すべての経路において顕著であった（即
ち、ＲまたはＫは172および178位に最も多く発生し、Ｙ
またはＦは176位に最も多く発生し、そしてＳ、Ｔ、Ａ
およびその他の残基は174位に発生する）。

図6:亜鉛の存在下にhPRLbp−ビーズ上で選択したファ
ージからの配列を示すものである。表示は図５で説明し
たものと同じである。ここでは、配列の集中性は予測で
きないが、最もストリンジェントな（グリシン）選択条
件下で疎水性配列への偏りがあるようである（Ｌ、Ｗお
よびＰ残基がこのプールに多く見い出される）。

図7:亜鉛の非存在下にhPRLbp−ビーズ上で選択したフ
ァージからの配列を示すものである。表示は図５で説明
したものと同じである。図６の配列とは対照的に、ここ
での配列は比較的親水性が高いようである。hGH溶離に
よる４ラウンドの選択の後、２種類のクローン（ANHQお
よびTLDT/171V）がプールに多く存在する。

図8:ブランクのビーズ上で選択したファージからの配
列を示すものである。表示は図５で説明したものと同じ
である。グリシン溶離による３ラウンドの選択の後、同
胞体は観察されず、非機能的な配列のバックグラウンド
水準が保持された。

図9:pHO415からのファージミドfl起点（ori）の構築
を示すものである。カセット突然変異誘発およびhGH−
遺伝子III融合タンパク質の発現のためのこのベクター
を次のように構築した。pBR322およびflの複製起点を含
有し、大腸菌phoAプロモーターの制御下にhGH−遺伝子I
II融合タンパク質（hGHの残基１〜191に１個のGly残基
が続き、これが遺伝子IIIのPro−198に融合している）
を発現する、pS0132のオリゴヌクレオチド指向性の突然
変異誘発によって、プラスミドpS0643を構築した。以下
のオリゴヌクレオチド： を用いて突然変異誘発を行なった。このオリゴヌクレオ
チドは、hGHのPhe−191に続いてXba I部位（下線部）と
アンバー終止コドン（TAG）を導入した。

図10:Aは、HER−２受容体に指向性のFabヒト化抗体の
軽鎖および重鎖（可変および不変ドメイン１）をコード
しているDNAを含有するプラスミドpDH188挿入体を図示
したものである。V_LおよびV_Hはそれぞれ軽鎖および重鎖
の可変領域である。C_kはヒトκ軽鎖の不変領域である。
CH1_G1はヒトγ１鎖の最初の不変領域である。両暗号領
域は細菌性のst IIシグナル配列から始まっている。Ｂ
は、5Aに示した挿入体を含有する全プラスミドpBH188を
図示するものである。このプラスミドを大腸菌SR101細
胞に導入し、ヘルパーファージを添加した後、このプラ
スミドはファージ粒子にパッケージされる。これら粒子
の一部はFab−p III融合体を表示する（ここで、p III
はM13遺伝子III DNAによってコードされているタンパク
質である）。このプラスミド図中のセグメントは5Aに示
した挿入体に対応している。

図11（図11のＡ〜Ｃをまとめて説明する）：ファージ
ミド表面に発現された4D5 Fab分子をコードしているDNA
のヌクレオチド配列（配列番号25）を示すものである。
軽鎖のアミノ酸配列（配列番号26）も、重鎖p III融合
体のアミノ酸配列（配列番号27）と同様に示されてい
る。

図12:変異Fabファージミドからの野生型4D5 Fabファ
ージミドの豊富化を示すものである。1:1,000の比の野
生型ファージミドと変異4D5 Fabファージミドの混合物
を、HER−２受容体の細胞外ドメインタンパク質で被覆
したプレートで選択した。各ラウンドの選択の後、溶離
したファージミドの一部を大腸菌に感染させ、プラスミ
ドDNAを調製した。次いで、このプラスミドDNAをEcoR V
およびPst Iで消化し、５％ポリアクリルアミドゲルで
分離し、臭化エチジウムで染色した。バンドをUV光のも
とで可視化した。野生型および変異プラスミドに起因す
るバンドは矢印で示した。第１ラウンドの選択は酸条件
のもとでのみ溶離した。以後のラウンドは、酸溶離（図
の左側）または実施例VIIIに記載した方法を用いるヒト
化4D5抗体洗浄工程とその後の酸溶離（図の右側）のい
ずれかによって溶離した。３種の変異4D5 Fab分子を調
製した。即ち、H91A（V_L鎖の91位のアミノ酸ヒスチジン
をアラニンに突然変異させた；図中の「Ａ」レーンに示
す）、Y49A（V_L鎖の49位のアミノ酸チロシンをアラニン
に突然変異させた；図中の「Ｂ」レーンに示す）、なら
びにY92A（V_L鎖の92位のアミノ酸チロシンをアラニンに
突然変異させた；図中の「Ｃ」レーンに示す）である。
アミノ酸位置の数え方はKabatらに従った［「免疫学的
挿入体のタンパク質の配列」，第４版,U.S.Dept of Hea
lth and Human Services,Public Health Service,Nat'
l.Institute of Health,Bethesda,MD（1987）］。

図13:実験プロトコール中に記載したRIA親和性測定の
スカッチャード分析が示されている。結合した標識化EC
D抗原の量がｘ軸に示されており、結合量を遊離量で割
った数値がｙ軸に示されている。線の傾きはKaを示し、
計算したKdは1/Kaである。

発明の詳細な説明 以下の議論は、図１を参照することによって最も良く
理解されるであろう。最も単純な形態においては、本発
明の方法は、標的分子に対して所望の通常は高い親和性
を有する新規な結合ポリペプチド（タンパク質リガンド
など）を構造的に関連した結合ポリペプチドのライブラ
リーから選択する方法からなる。ファージコートタンパ
ク質に融合させた構造的に関連したポリペプチドのライ
ブラリーは突然変異誘発によって調製し、好ましくはそ
れぞれの関連ポリペプチドの単一コピーを、該ポリペプ
チドをコードしているDNAを含有するファージミド粒子
の表面に表示（顕示）する。次いで、これらのファージ
ミド粒子を標的分子と接触させ、標的に対して最も高い
親和性を有する粒子を低親和性の粒子から分離する。次
いで、高親和性の結合体を細菌宿主の感染によって増幅
し、競合結合工程を繰り返す。所望の親和性のポリペプ
チドが得られるまでこの過程を繰り返す。

本発明の方法によって製造される新規な結合ポリペプ
チドまたはリガンドは、それ自体が生物学的有機体の処
置において用いられる診断薬または治療薬（例えば、ア
ゴニストまたはアンタゴニスト）として有用である。ま
た、選択したポリペプチドの構造分析を用いて合理的な
薬物設計を進めることもできる。

本明細書において用いる「結合ポリペプチド」は、選
択性の親和性でもって標的分子に結合するあらゆるポリ
ペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドは
タンパク質であり、最も好ましくは約100以上のアミノ
酸残基を含有するタンパク質である。通常、このポリペ
プチドはホルモンもしくは抗体またはそれらのフラグメ
ントであろう。

本明細書において用いる「高親和性」は、生理学的条
件下で＜10^-5M、好ましくは＜10^-7Mの親和定数（Kd）を
意味する。

本明細書において用いる「標的分子」は、それに対し
てリガンドを製造するのが所望であるあらゆる分子であ
り、必ずしもタンパク質に限られない。しかし、この標
的はタンパク質であるのが好ましく、最も好ましくは、
この標的はホルモン受容体などの受容体である。

本明細書において用いる「ヒト化抗体」は、マウスま
たは他の非ヒト抗体の相補性決定領域（CDR）がヒト抗
体のフレームワーク（枠組み構造）に結合している抗体
を意味する。ヒト抗体のフレームワークはCDRを除く全
ヒト抗体を意味する。

I.ファージの表面に表示させるためのポリペプチドの選
択 本発明の方法における第１の工程は、ファージの表面
に表示させるためのポリペプチドの表面に露出される堅
い２次構造を有するポリペプチドを選択することであ
る。

本明細書において用いる「ポリペプチド」は、特異的
なDNA配列によって発現させることができる任意の分子
を意味する。本発明のポリペプチドは１を越えるサブユ
ニットからなり、それぞれのサブユニットは別個のDNA
配列によってコードされている。

本明細書において用いる「堅い２次構造」は、例え
ば、α−ヘリックス、3₁₀ヘリックス、πヘリックス、
平行および逆平行β−シート、ならびに逆ターンなどに
おいて見い出される規則的な反復構造を示す任意のポリ
ペプチドセグメントを意味する。また、認識しうる幾何
秩序を欠くある種の「非秩序」構造も、それらが標的と
の相互作用が可能なアミノ酸残基のドメインまたは「パ
ッチ」を形成し、構造の全体形状が構造中のアミノ酸の
置換によって破壊されない限り、堅い２次構造の定義中
に含まれる。ある種の非秩序構造は逆ターンの組合せで
あると考えられている。これら堅い２次構造の幾何は、
ペプチド「骨格」のα−炭素のまわりのφおよびψねじ
れ角によって十分に定義される。

２次構造をポリペプチド表面に露出させるのに必要な
ことは、標的分子に対して露出され標的分子と結合する
ことができるアミノ酸残基のドメインまたは「パッチ」
を提供することである。これは基本的には突然変異誘発
によって置換されるアミノ酸残基であり、この突然変異
誘発によってファージの表面に表示される構造的に関連
した（突然変異体）結合ポリペプチドの「ライブラリ
ー」が得られ、これから新規なポリペプチドリガンドが
選択される。通常、ポリペプチドの内部に向かうアミノ
酸残基の突然変異誘発または置換は避けられ、これによ
り堅い２次構造の全体構造が保存される。堅い２次構造
の内部領域のアミノ酸の、特に疎水性アミノ酸残基によ
る置換の一部は、これら保存性の置換がポリペプチドの
全体構造を歪めるようには考えられないので許容される
であろう。

「ポリペプチド」選択の組返しサイクルを用い、複数
の選択サイクルによって選択した複数のアミノ酸変化の
ファージミド選択によってさらに高い親和性の結合を選
択する。第１ラウンドのファージミド選択（リガンドポ
リペプチド中のアミノ酸の選択または第１領域が関係す
る）に続いて、リガンドポリペプチドの他の領域または
アミノ酸において追加ラウンドのファージミド選択を行
なう。リガンドポリペプチドの所望の親和性が達成され
るまでこのファージミド選択サイクルを繰り返す。この
方法を説明するために、実施例VIIIのhGHのファージミ
ド選択をサイクルで行なった。第１サイクルにおいて、
hGHのアミノ酸172、174、176および178に突然変異を行
ない、ファージミドを選択した。第２サイクルにおい
て、hGHのアミノ酸167、171、175および179をファージ
ミド選択した。第３サイクルにおいて、hGHのアミノ酸1
0、14、18および21をファージミド選択した。先のサイ
クルからの最適アミノ酸変化は、次サイクルの選択の前
にポリペプチド中に導入することができる。例えば、hG
Hのアミノ酸置換174（セリン）および176（チロシン）
を、hGHのアミノ酸167、171、175および179のファージ
ミド選択の前にhGH中に導入した。

上記から、ポリペプチドの結合ドメインを形成するア
ミノ酸残基が連続的に結合したものではなく、ポリペプ
チドの異なるサブユニット上に存在していてよいことが
理解されるであろう。即ち、結合ドメインは、結合部位
における特定の２次構造をたどるものであって、１次構
造をたどるものではない。従って、突然変異はポリペプ
チドの内部から外側へ向かう部位の特定の２次構造内の
アミノ酸をコードしているコドンに導入して、それらが
標的と相互作用する可能性を持つようにするのが普通で
ある。説明のため、hGH−結合タンパク質への結合を強
力に変調させることが知られているhGH中の残基の位置
を図２に示す［Cunninghamら,Science 247:1461−1465
（1990）］。即ち、突然変異誘発に適切な代表的な部位
には、ヘリックスの残基172、174、176および178、なら
びに「非秩序」２次構造内の残基64が含まれる。

ある標的に対するリガンドとして選択したポリペプチ
ドが該標的に正常に結合する必要はない。即ち、例えば
TSHなどの糖タンパク質ホルモンをFSH受容体のリガンド
として選択することができ、突然変異STH分子のライブ
ラリーを本発明の方法に用いて新規な薬物候補を得る。

即ち、本発明は標的分子に結合する任意のポリペプチ
ドを意図したものであり、抗体を包含している。好まし
いポリペプチドは医薬用途を有しているポリペプチドで
ある。さらに好ましいポリペプチドには次のものが含ま
れる：即ち、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン、デス−
Ｎ−メチオニル ヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホ
ルモンを含む）；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモ
ン；チロキシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プ
ロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；ロイ
チナイジング ホルモン；グルカゴン；因子VIII;抗
体；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子［例
えば、ウロキナーゼまたはヒト組織型プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ−PA）］；ボンベシン；因子IX;トロン
ビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケ
ファリナーゼ；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アル
ブミン）；ミュラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキ
シンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連
ペプチド；微生物タンパク質（例えば、β−ラクタマー
ゼ）；組織因子タンパク質；インヒビン；アクチビン；
血管内皮成長因子；ホルモンまたは成長因子の受容体；
インテグリン；トロンボポエチン；プロテインＡまたは
D;リウマトイド因子；神経成長因子（例えば、NGF−
β）；血小板由来の成長因子；線維芽細胞成長因子（例
えば、aFGFおよびbFGF）；表皮成長因子；トランスフォ
ーミング成長因子（TGF）（例えば、TGF−αおよびTGF
−β）；インスリン様成長因子ＩおよびII;インスリン
様成長因子結合タンパク質;CD−4;DNアーゼ；潜在性関
連ペプチド；エリトロポエチン；骨誘導因子；インター
フェロン（例えば、インターフェロンα、βおよび
γ）；コロニー刺激因子（CSF）（例えば、Ｍ−CSF、GM
−CSFおよびＧ−CSF）；インターロイキン（IL）（例え
ば、IL−１、IL−２、IL−３、IL−４）；スーパーオキ
シドジスムターゼ；崩壊促進因子；心房性ナトリウム利
尿ペプチドＡ、ＢまたはC;ウイルス抗原（例えば、HIV
エンベロープの一部）；免疫グロブリン；ならびに上記
ポリペプチドのいずれかのフラグメントである。さら
に、ポリペプチド上の１またはそれ以上の予め決定した
アミノ酸残基に置換、挿入または削除を行なって、例え
ば改善された生物学的性質を有する生成物を得ることが
できる。また、これらポリペプチドのフラグメント、特
に生物学的に活性なフラグメントが包含される。本発明
のさらに好ましいポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、
心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢおよびＣ、エンド
トキシン、スブチリシン、トリプシン、ならびに他のセ
リンプロテアーゼ類である。

さらに好ましいポリペプチドホルモンは、第１の細胞
において産生される任意のアミノ酸配列であって、同じ
細胞種（自己分泌ホルモン）または第２の細胞種（非自
己分泌）上の受容体に特異的に結合し、受容体保持細胞
に特徴的な生理学的反応を引き起こすアミノ酸配列とし
て定義しうるポリペプチドホルモンである。このような
ポリペプチドホルモンには、サイトカイン類、リンホカ
イン類、神経栄養ホルモンおよび脳下垂体腺ポリペプチ
ドホルモン、例えば成長ホルモン、プロラクチン、胎盤
性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、
チロトロピン、絨毛ゴナドトロピン、コルチコトロピ
ン、αまたはβ−メラノサイト刺激ホルモン、β−リポ
トロピン、γ−リポトロピンおよびエンドルフィン類；
視床下部放出抑制ホルモン、例えばコルチコトロピン放
出因子、成長ホルモン放出抑制ホルモン、成長ホルモン
放出因子；ならびに心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、
ＢおよびＣなどの他のポリペプチドホルモンが含まれ
る。

II.所望のポリペプチドをコードしている第１遺伝子
（遺伝子１）の入手 所望のポリペプチド（即ち、堅い２次構造を有するポ
リペプチド）をコードしている遺伝子は、当分野で既知
の方法によって得ることができる［一般には、Sambrook
ら,Molecular Biology:A laboratory Manual,Cold Spri
ng Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York（198
9）を参照］。この遺伝子の配列が既知である場合に
は、この遺伝子をコードしているDNAを化学的に合成し
てもよい［Merrfield,J.Am.Chem.Soc.85:2149（196
3）］。この遺伝子の配列が未知である場合、またはこ
の遺伝子がそれまでに単離されていない場合には、cDNA
ライブラリー（所望の遺伝子が発現される適当な組織か
ら得たRNAから調製する）から、または適当なゲノムDNA
ライブラリーからクローン化することができる。次い
で、適当なプローブを用いて遺伝子を単離する。cDNAラ
イブラリーのための適当なプローブには、モノクローナ
ルもしくはポリクローナル抗体（ただし、cDNAライブラ
リー発現ライブラリーであるとき）、オリゴヌクレオチ
ド、および相補性もしくは相同性cDNAまたはそれらのフ
ラグメントが含まれる。ゲノムDNAライブラリーから所
望の遺伝子を単離するのに用いることができるプローブ
には、同一もしくは類似の遺伝子をコードしているcDNA
もしくはそのフラグメント、相同なゲノムDNAもしくはD
NAフラグメント、およびオリゴヌクレオチドが含まれ
る。選択したプローブによるcDNAもしくはゲノムライブ
ラリーのスクリーニングは、Sambrookら（上記）の第10
〜12章に記載されている標準法を用いて行なう。

所望のタンパク質をコードしている遺伝子を単離する
ための別の方法は、Sambrookら（上記）のセクション14
に記載されているポリメラーゼ連鎖反応性（PCR）を使
用することである。この方法は、所望の遺伝子にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。
即ち、オリゴヌクレオチドを得るために、この遺伝子の
DNA配列の少なくと一部が既知でなければならない。

遺伝子を単離した後、これをSambrookら（上記）が一
般的に記載しているように増幅用の適当なベクター（好
ましくは、プラスミド）中に挿入することができる。

III.複製可能な発現ベクターの構築 いくつかの型のベクターが利用可能であり、本発明の
実施に用いることができるが、プラスミドベクターが本
発明において使用するに好ましいベクターである。これ
は、これらベクターを比較的容易に構築することがで
き、容易に増幅することができるためである。一般にプ
ラスミドベクターは、当業者には既知のように、プロモ
ーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部
位、および他の必要な成分を含む種々の構成成分を含有
している。

原核性ベクターにおいて最も普通に用いられるプロモ
ーターには、lacZプロモーター系、アルカリホスファタ
ーゼphoAプロモーター、バクテリオファージλP_Lプロモ
ーター（温度感受性プロモーター）、tacプロモーター
（lacリプレッサーによって調節されるハイブリッドtrp
−lacプロモーター）、トリプトファンプロモーター、
およびバクテリオファージT7プロモーターが含まれる。
プロモーターの全般的な説明については、Sambrookら
（上記）のセクション17を参照。最もよく用いられるプ
ロモーターが存在するが、他の適当な微生物プロモータ
ーも同様に用いることができる。

本発明の実施に好ましいプロモーターは、融合遺伝子
の発現を制御しうるように厳格に調節することができる
プロモーターである。従来技術において認識されないま
まであった問題は、ファージミド粒子の表面における融
合タンパク質の複数コピーの表示がファージミドと標的
との複数点結合を導くことであったと考えられる。「キ
レート作用」と呼ばれるこの作用は、融合タンパク質の
複数コピーが互いにすぐ近接してファージミド粒子上に
表示されて標的が「キレート化」されたときに、誤った
「高親和性」ポリペプチドを選択する結果を与えると考
えられる。複数点結合が起こったときには、有効または
見掛けKdは表示された融合タンパク質のそれぞれのコピ
ーに対する個々のKdの積と同程度に高いであろう。この
作用が、Cwirlaとその共同研究者（上記）が比較的高親
和性のペプチドから中親和性のペプチドを分離できなか
った理由であるのかもしれない。

少量（即ち、約１％よりも少ない）のファージミド粒
子だけが複数コピーの融合タンパク質を含有するように
融合タンパク質の発現を厳格に調節することによって、
「キレート作用」が克服され、高親和性のポリペプチド
の適切な選択が可能になることを発見した。即ち、プロ
モーターに依存して、宿主の培養条件を調節して単一コ
ピーの融合タンパク質を含有するファージミド粒子の数
を最大にし、複数コピーの融合タンパク質を含有するフ
ァージミド粒子の数を最少にする。

本発明の実施に用いられる好ましいプロモーターは、
lacZプロモーターおよびphoAプロモーターである。この
lacZプロモーターはlacリプレッサータンパク質lac iに
よって調節され、従って融合遺伝子の転写をlacリプレ
ッサータンパク質の量の操作によって制御することがで
きる。説明のためであるが、このlacZプロモーターを含
有するファージミドは、lacZプロモーターのリプレッサ
ーであるlac iリプレッサー遺伝子のコピーを含有する
細胞株中で増殖させる。lac i遺伝子を含有する細胞株
の例には、JM101およびXL1−Blueが含まれる。別法によ
れば、リプレッサーlac iおよびlacZプロモーターの両
方を含有するプラスミドで宿主細胞を同時トランスフェ
クトすることができる。ときには上記方法の両方を同時
に用いる。即ち、lacZプロモーターを含有するファージ
ミド粒子をlac i遺伝子を含有する細胞株中で増殖さ
せ、この細胞株をlacZおよびlac i遺伝子の両方を含有
するプラスミドで同時トランスフェクトする。通常、上
記のトランスフェクトされた宿主に遺伝子を発現させた
いときには、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）な
どの誘導物質を加える。しかし、本発明においては、こ
の工程を割愛して、（ａ）遺伝子III融合タンパク質の
発現を最少にしてコピー数を最少にし（即ち、ファージ
ミド数に対する遺伝子III融合体の数）、そして、
（ｂ）低濃度であってもIPTGなどの誘導物質によって引
き起こされるファージミドの劣るかまたは不適切なパッ
ケージングを防止する。通常、誘導物質を加えないとき
には、ファージミド粒子あたりの融合タンパク質の数は
約0.1である（バルク融合タンパク質の数／ファージミ
ド粒子の数）。本発明の実施に用いられる最も好ましい
プロモーターはphoAである。このプロモーターは細胞中
の無機リン酸の量によって調節されると考えられてお
り、このリン酸がプロモーターの活性を下方調節する。
即ち、細胞のリン酸を減少させることによって、プロモ
ーターの活性を高めることができる。所望の結果は、2Y
TまたはLBなどのリン酸に富む培地で細胞を増殖させ、
遺伝子III融合体の発現を制御することによって達成さ
れる。

本発明の実施に用いられるベクターの他の有用な成分
はシグナル配列である。通常、この配列は融合タンパク
質をコードしている遺伝子のすぐ5'側に位置しており、
従って融合タンパク質のアミノ末端に転写される。しか
し、ある種の場合には、このシグナル配列は、分泌させ
ようとするタンパク質をコードしている遺伝子の他の5'
の位置に存在することが示されている。この配列は、細
菌細胞の内部膜を越えてこの配列が結合しているタンパ
ク質を標的とする。このシグナル配列をコードしている
DNAは、シグナル配列を有するタンパク質をコードして
いる任意の遺伝子から制限エンドヌクレアーゼフラグメ
ントとして得ることができる。適当な原核性シグナル配
列は、例えば、LamBもしくはOmpF［Wongら,Gene 68:193
（1983）］、MalE、PhoAおよびその他の遺伝子をコード
している遺伝子から得ることができる。本発明の実施に
好ましい原核性シグナル配列は、Changら［Gene 55:189
（1987）］が記載している大腸菌の熱安定性エンテロト
キシンII（ST II）シグナル配列である。

本発明の実施に用いられるベクターの別の有用な成分
は、表現型選択遺伝子である。通常の表現型選択遺伝子
は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコー
ドしている遺伝子である。説明のためのものであるが、
アンピシリン耐性遺伝子（amp）およびテトラサイクリ
ン耐性遺伝子（tet）がこの目的に使用するのが容易で
ある。

上記の成分ならびに所望のポリペプチドをコードして
いる遺伝子（遺伝子１）を含有する適当なベクターの構
築は、Sambrookら（上記）が記載している標準的な組換
えDNA法を用いて行なう。ベクターを形成させるために
結合される単離したDNAフラグメントを切断し、加工
し、そして特定の順序および配向で一緒に連結して所望
のベクターを創製する。

適当な緩衝液中で適当な制限酵素または酵素群を用い
てDNAを切断する。通常、約20μｌの緩衝溶液におい
て、約0.2〜１μｇのプラスミドまたはDNAフラグメント
を約１〜２単位の適当な制限酵素と共に用いる。適当な
緩衝液、DNA濃度、ならびにインキュベート時間および
温度は、制限酵素の製造元によって指定されている。通
常、37℃で約１または２時間のインキュベート時間が適
切であるが、いくつかの酵素はさらに高い温度を必要と
する。インキュベート後に、酵素および他の不純物をフ
ェノールとクロロホルムの混合物による消化溶液の抽出
によって除去し、DNAをエタノールによる沈澱によって
水性分画から回収する。

DNAフラグメントを共に連結して機能的なベクターを
得るためには、これらDNAフラグメントの末端を互いに
適合させなければならない。ある場合には、エンドヌク
レアーゼ消化の後にこれら末端はそのまま適合性であ
る。しかし、これらを連結に対して適合するようにする
ために、通常はエンドヌクレアーゼ消化によって生成す
る接着末端を初めに平滑末端に変換することが必要にな
ることもある。末端を平滑にするために、DNAを、適当
な緩衝液中、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存
在下に10単位のDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメ
ント（クレノウ）を用いて15℃で少なくとも15分間処理
する。次いで、このDNAのフェノール−クロロホルム抽
出とエタノール沈澱により精製する。

DNAゲル電気泳動を用いて、切断したDNAフラグメント
をサイズ分離し、選択することができる。アガロースま
たはポリアクリルアミドマトリックスのどちらかにより
DNAを電気泳動することができる。マトリックスの選択
は、分離しようとするDNAフラグメントのサイズに依存
するであろう。電気泳動の後、Sambrookら（上記）のセ
クション6.30〜6.33の記載のように、電気溶離によっ
て、または、低溶融アガロースをマトリックスとして使
用したときにはアガロースの溶融とそれからのDNAの抽
出によって、DNAをマトリックスから抽出する。

共に連結しようとするDNAフラグメント（連結しよう
とするそれぞれのフラグメントの末端が適合するように
適切な制限酵素により予め消化）を、ほぼ等しい量で溶
液に入れる。この溶液は、ATP、リガーゼ緩衝液および
リガーゼ、例えば0.5μｇのDNAあたり約10単位のT4 DNA
リガーゼをも含んでいるであろう。DNAフラグメントを
ベクター中に連結するときには、最初にこのベクターを
適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）で切断することに
よって直線化する。次いで、この直線化したベクターを
アルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼで
処理する。このホスファターゼ処理は連結工程中のベク
ターの自己連結を防止する。

連結の後、外来遺伝子が挿入されているベクターを適
当な宿主細胞に導入する。原核生物が本発明に好ましい
宿主細胞である。適当な原核性宿主細胞には、大腸菌株
JM101、大腸菌K12株294（ATCC No.31,446）、大腸菌株W
3110（ACTT No.27,325）、大腸菌X1776（ACTT No.31,53
7）、大腸菌XL−1Blue（stratagene）、および大腸菌Ｂ
が含まれるが、大腸菌の他の多数の株（例えば、HB10
1、NM522、NM538、NM539）、ならびに他の多数の原核生
物の属および種も同様に用いることができる。上に挙げ
た大腸菌株に加えて、バチルス（例えば、Bacillus Sub
tilis）、他の腸内細菌（例えば、Salmonella typhimur
iumあるいはSerratia marcesans）、および種々のPseud
omonas種もすべて宿主として使用することができる。

原核細胞の形質転換は、Sambrookら（上記）のセクシ
ョン1.82に記載の塩化カルシウム法を用いて容易に達成
される。別法によれば、電気穿孔法［Neumannら,EMBO
J.1:841（1982）］を用いてこれら細胞を形質転換する
ことができる。通常はテトラサイクリン（tet）または
アンピシリン（amp）などの抗生物質上で増殖させるこ
とによって、形質転換した細胞を選択する（形質転換細
胞は、ベクター上のtetおよび／またはamp耐性遺伝子の
存在によりこれら抗生物質に対して耐性になってい
る）。

形質転換細胞の選択の後、これら細胞を培養増殖さ
せ、次いでプラスミドDNA（または、外来遺伝子が挿入
された他のベクター）を単離する。プラスミドDNAは当
分野で既知の方法を用いて単離することができる。２つ
の適当な方法は、Sambrookら（上記）のセクション1.25
〜1.33に記載されている小スケールのDNA調製および大
スケールのDNA調製である。単離したDNAは、Sambrookら
（上記）のセクション1.40に記載されている方法のよう
な当分野で既知の方法によって精製することができる。
次いで、この精製したプラスミドDNAを、制限マッピン
グおよび／またはDNA配列決定によって分析する。通
常、DNAの配列決定は、Messingら［Nucleic Acids Res.
9:309（1981）］の方法またはMaxamら［Meth.Enzymol.6
5:499（1980）］の方法のいずれかによって行なう。

IV.遺伝子の融合 本発明は、転写中に融合タンパク質が生成するよう
に、所望のポリペプチドをコードしている遺伝子（遺伝
子１）を第２の遺伝子（遺伝子２）に融合させることを
意図している。通常、遺伝子２はファージのコートタン
パク質遺伝子であり、ファージM13の遺伝子IIIコートタ
ンパク質またはそのフラグメントであるのが好ましい。
遺伝子１および２の融合は、遺伝子１を含むプラスミド
上の特定の部位に遺伝子２を挿入することによって、ま
たは遺伝子２を含むプラスミド上の特定の部位に遺伝子
１を挿入することによって達成することができる。

プラスミド中への遺伝子の挿入は、遺伝子を挿入しよ
うとする正確な位置においてプラスミドが切断されるこ
とを必要とする。即ち、この位置に制限エンドヌクレア
ーゼ部位が存在していなければならない（制限エンドヌ
クレアーゼ消化中にプラスミドが１カ所でのみ切断され
るように唯一の部位であるのが好ましい）。上記のよう
にプラスミドを消化し、ホスファターゼ処理し、精製す
る。次いで、２つのDNAを共に連結することによって、
この直線化したプラスミドに遺伝子を挿入する。プラス
ミドの末端が挿入しようとする遺伝子の末端に適合する
ときに、連結を達成することができる。制限酵素を用い
てプラスミドを切断し、挿入すべき遺伝子を単離すると
きには（平滑末端または適合性の接着末端を創製す
る）、Sambrookら（上記）のセクション1.68の記載のよ
うに、バクテリオファージT4 DNAリガーゼなどのリガー
ゼを用い、ATPおよびリガーゼ緩衝液の存在下に混合物
を16℃で１〜４時間インキュベートすることによって、
DNAを直接一緒に連結することができる。末端が適合性
ではないときには、最初にこれらを、DNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメントあるいはバクテリオファージ
T4 DNAポリメラーゼ（これらは、消化されたDNAの突出
１本鎖末端を充填するために４種のデオキシリボヌクレ
オチド三リン酸を必要とする）の使用によって平滑にし
なければならない。別法によれば、これら末端を、ヌク
レアーゼS1あるいは緑豆ヌクレアーゼ（これらは、DNA
の突出１本鎖を後退切断することによって機能する）な
どのヌクレアーゼを用いて平滑にすることができる。次
いで、DNAを上記のリガーゼを用いて連結する。ある場
合には、暗号領域の読み枠が変化するので、挿入すべき
遺伝子の末端を平滑にすることができないこともある。
この問題を克服するために、オリゴヌクレオチドリンカ
ーを用いてもよい。このリンカーは、プラスミドと挿入
すべき遺伝子を接続する橋となる。これらリンカーは、
常法を用いて２本鎖または１本鎖DNAとして合成により
調製することができる。これらリンカーは、挿入すべき
遺伝子の末端に適合する一方の末端を有しており、上記
の連結法を用いて初めにこの遺伝子に連結する。リンカ
ーの他の末端は、連結用のプラスミドに適合するように
設計されている。リンカーを設計する際には、挿入すべ
き遺伝子の読み枠またはプラスミド上に含まれる遺伝子
の読み枠を破壊しないように注意しなければならない。
ある場合には、これらがアミノ酸の一部をコードするよ
うに、または１またはそれ以上のアミノ酸をコードする
ようにリンカーを設計することが必要になることもあ
る。

遺伝子１と遺伝子２の間に終止コドンをコードしてい
るDNAを挿入することもできる。このような終止コドン
はUAG（アンバー）、UAA（オーカー）およびUGA（オペ
ル）である［Davisら,Microbiology,Harper ＆ Row,New
York,pp.237,245−47および274（1980）］。野生型宿
主細胞において発現される終止コドンは、遺伝子２のタ
ンパク質の結合していない遺伝子１のタンパク質産物の
合成の結果を与える。しかし、サプレッサー宿主細胞中
での増殖は検出可能な量の融合タンパク質の合成の結果
を与える。このようなサプレッサー宿主細胞は、mRNAの
終止コドン位置にアミノ酸を挿入するように修飾された
tRNAを含有しており、従って検出可能な量の融合タンパ
ク質を産生する結果を与える。このようなサプレッサー
宿主細胞は、例えば大腸菌のサプレッサー株［Bullock
ら,Bio Techniques 5:376−379（1987）］のように周知
であり、開示されている。任意の受け入れられている方
法を用いて、このような終止コドンを融合ポリペプチド
をコードしているmRNA中に設置することができる。

この抑制可能なコドンを、ポリペプチドをコードして
いる第１の遺伝子とファージコートタンパク質の少なく
とも一部をコードしている第２の遺伝子の間に挿入する
ことができる。別法によれば、この抑制可能な終止コド
ンを、ポリペプチド中の最後のアミノ酸トリプレットま
たはファージコートタンパク質中の最初のアミノ酸の置
換によって融合部位に隣接して挿入することができる。
この抑制可能なコドンを含有しているファージミドをサ
プレッサー宿主細胞中で増殖させると、ポリペプチドと
コートタンパク質を含有する融合ポリペプチドが検出可
能に産生される結果が得られる。このファージミドを非
サプレッサー宿主細胞中で増殖させると、UAG、UAAまた
はUGAをコードしている挿入された抑制可能なトリプレ
ットのところでの終止により、ファージコートタンパク
質に融合していないポリペプチドが実質的に合成され
る。非サプレッサー細胞においては、ポリペプチドが合
成され、融合したファージコートタンパク質（他の方法
ではポリペプチドを宿主細胞に固定する）が存在しない
ことにより宿主細胞から分泌される。

V.選択した位置における遺伝子１の改変（突然変異） 所望のポリペプチドをコードしている遺伝子１を、１
またはそれ以上の選択したコドンにおいて改変すること
ができる。改変は、ポリペプチドをコードしている遺伝
子中の１またはそれ以上のコドンの置換、削除または挿
入と定義される。この改変によって、同じポリペプチド
の未改変または天然の配列と比較してポリペプチドのア
ミノ酸配列が変化することになる。好ましくは、この改
変は、分子の１またはそれ以上の領域において少なくと
も１個のアミノ酸を他のいずれかのアミノ酸で置換する
ことによる。この改変は、当分野で既知の種々の方法に
よって行なうことができる。これらの方法には、オリゴ
ヌクレオチド媒介の突然変異誘発およびカセット突然変
異誘発が含まれるが、これらに限定はされない。

A.オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発 オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発は、遺伝子１
の置換、削除および挿入変異体を調製するのに好ましい
方法である。この方法は、Zollerら［Nucleic Acids Re
s.10:6487−6504（1987）］が記載しているように当分
野で周知である。簡単に説明すると、未改変または天然
のDNA配列の遺伝子１を含有するプラスミドの１本鎖形
のDNA鋳型に所望の突然変異をコードしているオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイズさせることによって遺伝子
１を改変する。ハイブリダイゼーションの後、DNAポリ
メラーゼを用いて、該オリゴヌクレオチドプライマーが
導入されて遺伝子１中の選択した改変をコードしてい
る、この鋳型の完全な第２相補鎖を合成する。

通常、長さが少なくとも25ヌクレオチドのオリゴヌク
レオチドを用いる。最適オリゴヌクレオチドは、突然変
異をコードしているヌクレオチド（群）の両側に鋳型に
完全に相補性である12〜15ヌクレオチドを有するもので
あろう。これにより、オリゴヌクレオチドが１本鎖DNA
鋳型分子に適切にハイブリダイズすることが確実にな
る。このオリゴヌクレオチドは、当分野で既知の方法、
例えばCreaら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:5765（197
8）］が記載している方法を用いて容易に合成される。

このDNA鋳型は、バクテリオファージM13ベクター（市
販品から入手可能なM13mp18およびM13mp19ベクターが適
当である）から導かれるベクター、またはVeiraら［Met
h.Enzymol.153:3（1987）］が記載しているような一本
鎖ファージ複製起点を含有するベクターによってのみ得
ることができる。即ち、突然変異を行なうべきDNAは、
１本鎖の鋳型を創製するために、これらベクターのいず
れかに挿入しなければならない。１本鎖鋳型の調製はSa
mbrookら（上記）のセクション4.21〜4.41に記載されて
いる。

天然のDNA配列を改変するために、このオリゴヌクレ
オチドを適当なハイブリダイゼーション条件のもとで一
本鎖の鋳型とハイブリダイズさせる。次いで、DNA重合
酵素、通常はDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トを加え、このオリゴヌクレオチドを合成のためのプラ
イマーとして用いて鋳型の相補鎖を合成する。このよう
にして、DNAの一方の鎖が遺伝子１の突然変異形をコー
ドしており、他方の鎖（最初の鋳型）が遺伝子１の天然
の未改変配列をコードしているヘテロ２本鎖分子が形成
される。次いで、このヘテロ２本鎖分子を適当な宿主細
胞、通常は大腸菌JM101などの原核生物に導入する。こ
の細胞を増殖させた後、アガロースプレートにプレーテ
ィングし、32−リン酸で放射標識したオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いてスクリーニングして、突然変異し
たDNAを含有する細菌コロニーを同定する。

すぐ上に記載した方法を、プラスミドの両方の鎖が突
然変異（群）を含むヘテロ２本鎖分子が創製されるよう
に修飾することができる。この修飾は次のようである。
１本鎖のオリゴヌクレオチドを上記のように１本鎖鋳型
にアニールさせる。２種のデオキシリボヌクレオチド、
即ちデオキシリボアデノシン（dATP）、デオキシリボグ
アノシン（dGTP）およびデオキシリボチミジン（dTTP）
の混合物を、dCTP−（aS）と呼ばれる修飾されたチオ−
デオキシリボシトシン（Amershamから入手することがで
きる）と混合する。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオ
チドのコンプレックスに加える。この混合物にDNAポリ
メラーゼを加えると、突然変異した塩基を除いて鋳型と
同一のDNA鎖が創製される。さらに、この新規なDNA鎖は
dCTPの代わりにdCTP−（aS）を含有しており、これがこ
の鎖を制限エンドヌクレアーゼ消化から保護するように
働く。ヘテロ２本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニック
を入れた後、この鋳型鎖を、突然変異すべき部位（群）
を含む領域を越えてExo IIIヌクレアーゼまたは別の適
当なヌクレアーゼで消化することができる。次いで、こ
の反応を停止させて一部だけが１本鎖である分子を残
す。次いで、４種すべてのデオキシリボヌクレオチド三
リン酸、ATPおよびDNAリガーゼの存在下にDNAポリメラ
ーゼを用いて、完全なDNAホモ２本鎖を形成させる。次
いで、このホモ２本鎖分子を、上記のように大腸菌JM10
1などの適当な宿主細胞に導入することができる。

１を越える置換すべきアミノ酸を有する突然変異体
は、いくつかの方法のいずれかにより創製することがで
きる。これらアミノ酸がポリペプチド鎖中に互いに近接
して存在しているときには、所望のアミノ酸置換のすべ
てをコードしている１つのオリゴヌクレオチドを用いて
同時に突然変異させることができる。しかし、アミノ酸
が互いにある程度の距離を置いて存在しているときには
（約10以上のアミノ酸によって隔てられている）、所望
の変化のすべてをコードしている単一のオリゴヌクレオ
チドを創製するのは比較的困難である。これに代えて、
２種類の異なる方法のいずれかを用いることができる。

第１の方法においては、独立してオリゴヌクレオチド
を置換すべきアミノ酸のそれぞれに対して創製する。次
いで、これらオリゴヌクレオチドを１本鎖鋳型DNAに同
時にアニールさせると、この鋳型から合成される第２の
DNA鎖は所望のアミノ酸置換のすべてをコードしている
であろう。この第１のラウンドは単一突然変異について
説明したものと同じである。即ち、野生型DNAを鋳型に
用い、第１の所望のアミノ酸置換（群）をコードしてい
るオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせ、次い
でヘテロ２本鎖DNA分子を創製する。突然変異誘発の第
２ラウンドは、第１ラウンドの突然変異誘発で得られた
突然変異DNAを鋳型として用いる。即ち、この鋳型は既
に１またはそれ以上の突然変異を含んでいる。次いで、
別の所望のアミノ酸置換（群）をコードしているオリゴ
ヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせると、得られる
DNA鎖は第１および第２ラウンドの突然変異誘発の両方
に由来する突然変異をコードしている。この得られたDN
Aを、第３ラウンドの突然変異誘発における鋳型などと
して用いることができる。

B.カセット突然変異誘発 この方法も遺伝子１の置換、削除および挿入変異体を
調製するのに好ましい方法である。この方法は、Wells
ら［Gene 34:315（1985）］の記載の方法に基づいてい
る。出発材料は、突然変異させようとする遺伝子である
遺伝子１を含有するプラスミド（または、他のベクタ
ー）である。突然変異させようとする遺伝子１中のコド
ンは決定されている。決定された突然変異部位（群）の
両側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在してい
なければならない。このような制限部位が存在していな
ければ、上記のオリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発
法を用いてこれら部位を創製し、遺伝子１中の適当な位
置に導入することができる。プラスミド中に制限部位を
導入した後、プラスミドをこれら部位のところで切断し
て直線化する。これら制限部位の間のDNA配列をコード
しており、そして所望の突然変異を含んでいる２本鎖オ
リゴヌクレオチドを常法により合成する。この２本の鎖
は別々に合成し、次いで常法により一緒にハイブリダイ
ズさせる。この２本鎖のオリゴヌクレオチドをカセット
と呼ぶ。このカセットは直線化したプラスミドの両末端
に適合する3'および5'末端を有するように設計して、こ
れをプラスミドに直接連結できるようにする。これによ
り、このプラスミドは遺伝子１の突然変異DNA配列を含
むことになる。

VI.所望のタンパク質をコードしているDNAの調製 別の態様においては、本発明は１またはそれ以上のサ
ブユニットを含有する所望のタンパク質の変異体の製造
を意図するものである。通常、それぞれのサブユニット
は別の遺伝子によってコードされている。それぞれのサ
ブユニットをコードしているそれぞれの遺伝子は、当分
野で既知の方法によって得ることができる（例えば、セ
クションIIを参照）。ある場合には、セクションIIに記
載した任意の方法から選択した独立した複数の方法を用
いて、種々のサブユニットをコードしている遺伝子を得
るのが必要であることもある。

所望のタンパク質が１を越えるサブユニットを含有し
ている複製可能な発現ベクターを構築するときには、す
べてのサブユニットを、通常はサブユニットをコードし
ているDNAの5'側に位置する同一のプロモーターによっ
て調節するか、または各サブユニットを、ベクター中で
適切に配向された独立したプロモーターであってそれぞ
れのプロモーターが調節しようとするDNAに機能的に連
結されたプロモーターによって調節することもできる。
プロモーターの選択は上記セクションIIIの記載のよう
に行なう。

複数サブユニットを有する所望のタンパク質をコード
しているDNAを含有する複製可能な発現ベクターを構築
する際には図10を参照すべきであり、この図には説明の
ためにベクターが図示されており、抗体フラグメントの
各サブユニットをコードしているDNAが示されている。
この図は、通常、所望のタンパク質のサブユニットの１
つがM13遺伝子IIIなどのファージコートタンパク質に融
合されることを示している。通常、この遺伝子融合体は
それ自体のシグナル配列を含有しているであろう。別の
遺伝子が他のサブユニットまたはサブユニット群をコー
ドしており、各サブユニットが通常はそれ自体のシグナ
ル配列を有していることがわかる。また、図10は、単一
のプロモーターが両サブユニットの発現を調節しうるこ
とを示している。これとは異なり、各サブユニットが異
なるプロモーターによって独立して調節されていてもよ
い。所望のタンパク質サブユニット−ファージコートタ
ンパク質の融合構築物は、上記セクションIVの記載のよ
うに調製することができる。

所望の複数サブユニットタンパク質の一群の変異体を
構築するときには、ベクター中の各サブユニットをコー
ドしているDNAを、各サブユニット中の１またはそれ以
上の位置において突然変異させてもよい。複数サブユニ
ットの抗体変異体が構築されるときには、好ましい突然
変異誘発部位は、軽鎖、重鎖または両鎖のいずれかの相
補性決定領域（CDR）中に位置するアミノ酸残基をコー
ドしているコドンに一致する。通常、このCDRは超可変
領域と呼ばれている。所望のタンパク質の各サブユニッ
トをコードしているDNAを突然変異させる方法は、実質
的に上記セクションＶの記載のように実施する。

VII.標的分子の調製およびファージミドとの結合 受容体などの標的タンパク質は、当分野で既知の方法
により、天然供給源から単離するかまたは組換え法によ
って調製することができる。例示すると、糖タンパク質
ホルモン受容体はMcFarlandら［Science 245:494−499
（1989）］が記載している方法によって調製することが
でき、大腸菌中で発現させた非グリコシル化型はFuhら
［J.Biol.Chem.265:3111−3115（1990）］が記載してい
る。他の受容体は常法によって調製することができる。

精製した標的タンパク質を、アガロースビーズ、アク
リルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々の
アクリル系コポリマー、メタクリル酸ヒドロキシアルキ
ル、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸コポリマ
ー、ナイロン、中性およびイオン性担体などの適当なマ
トリックスに結合させることができる。マトリックスへ
の標的タンパク質の結合は、文献［Mothods in Enzymol
ogy 44（1976）］に記載の方法によって、または当分野
で既知の他の手段によって行なうことができる。

マトリックスに標的タンパク質を結合させた後、固定
化した標的を、ファージミド粒子の少なくとも一部を固
定化標的と結合させるに適切な条件下で、ファージミド
粒子のライブラリーと接触させる。通常、pH、イオン強
度、温度などを含む条件は生理学的条件に類似したもの
であろう。

固定化標的に対して高親和性を有する結合ファージミ
ド粒子（「結合体」）を、洗浄により低親和性の粒子
（従って、標的に結合しない粒子）から分離する。結合
体は種々の方法によって固定化標的から解離させること
ができる。これら方法には、野生型リガンド、pHおよび
／またはイオン強度の変更を用いる競合解離、ならびに
当分野で既知の方法が含まれる。

適当な宿主細胞を結合体とヘルパーファージに感染さ
せ、この宿主細胞をファージミド粒子の増幅に適切な条
件下で培養する。次いで、ファージミド粒子を集め、標
的分子に対して所望の親和性を有する結合体が選択され
るまで選択工程を１またはそれ以上の回数繰り返す。

所望により、ファージミド粒子のライブラリーを、１
を越える固定化標的に連続的に接触させて特定の標的に
対する選択性を改善することができる。例えば、hGHな
どのリガンドは１を越える天然受容体を有していること
が多い。このhGHの場合には、成長ホルモン受容体とプ
ロラクチン受容体の両方がhGHリガンドに結合する。hGH
の選択性を、プロラクチン受容体に対する以上に成長ホ
ルモン受容体に対して改善するのが望ましいであろう。
これは、初めにファージミド粒子ライブラリーを固定化
プロラクチン受容体と接触させ、これを低親和性（即
ち、野生型hGHよりも低い）でプロラクチン受容体につ
いて溶離し、次いでこの低親和性プロラクチン「結合
体」または非結合体を固定化成長ホルモン受容体と接触
させ、高親和性成長ホルモン受容体結合体を選択するこ
とによって達成することができる。この場合、プロラク
チン受容体に対して低親和性を有するhGHの突然変異体
は、成長ホルモン受容体に対する親和性が野生型hGHの
親和性よりも若干低いときであっても、治療用途を有し
ているであろう。これと同じ方法を用いて、特定ホルモ
ンまたはタンパク質の、そのクリアランス受容体を凌ぐ
１次機能受容体に対する選択性を改善することができ
る。

本発明の別の態様においては、改良された基質アミノ
酸配列を得ることができる。これらは、タンパク質リン
カーのためのより良好な「切断部位」を作成する際に、
またはより良好なプロテアーゼ基質／阻害物質のために
有用であろう。この態様においては、固定化しうる分子
（例えば、hGH−受容体、ビオチン−アビジン、または
マトリックスと共有結合しうる分子）をリンカーによっ
て遺伝子IIIに融合させる。このリンカーは、好ましく
は長さが３〜10アミノ酸であり、プロテアーゼの基質と
して作用する。ファージミドを上記のように構築する
（ここで、リンカー領域をコードしているDNAにランダ
ム突然変異を行なって、結合部位に異なるアミノ酸配列
を有するファージミド粒子のランダムライブラリーを調
製する）。次いで、このファージミド粒子のライブラリ
ーをマトリックス上に固定化し、所望のプロテアーゼに
暴露する。所望のプロテアーゼのライナー領域に好まし
いかまたはより良好な基質アミノ酸配列を有するファー
ジミド粒子が溶離され、好ましいリンカーをゴードして
いるファージミド粒子の豊富化されたプールが最初に得
られるであろう。次いで、さらに数回これらファージミ
ド粒子を反復処理し、コンセンス配列（群）をコードし
ている粒子の豊富化されたプールを得る（実施例XIIIお
よびXIVを参照）。

VIII.成長ホルモン変異体および使用方法 hGHのクローン化遺伝子がEschericha colaにおいて分
泌型で発現され［Chang,C.N.ら,Gene 55:189（198
7）］、そのDNAおよびアミノ酸配列が報告されている
［Goeddelら,Nature 281:544（1979）］;Grayら,Gene 3
9:247（1985）］。本発明は、ファージミド選択法を用
いて得た新規なhGH変異体を記載するものである。10、1
4、18、21、167、171、172、174、175、176、178および
179位に置換を含むヒト成長ホルモン変異体が記載され
ている。比較的高い結合親和性を有する変異体を表VI
I、XIIIおよびXIVに記載している。これら変異体を記載
するためのアミノ酸命名法は後記する。成長ホルモン変
異体は、正規の成長ホルモンと同じように投与および製
剤化してよい。本発明の成長ホルモン変異体は、天然ま
たはmet hGHを発現しうる任意の組換え系において発現
させることができる。

治療用投与のためのhGHの製剤は、所望の精製度のhGH
を所望により生理学的に許容しうる担体、賦形剤または
安定剤［Remington's Pharmaceutical Sciences,第16
版,Osol,A.編（1980）］と混合することにより、凍結乾
燥ケーキまたは水溶液の形態で保存用に調製される。許
容しうる担体、賦形剤または安定剤は使用される用量お
よび濃度で受容対象に対して非毒性であり、これらに
は、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有
機酸の緩衝液）；抗酸化剤（アスコルビン酸を含む）；
低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；タンパク質
（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、あるいは免疫グ
ロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロ
リドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、
アスパラギン、アルギニン、あるいはリジン）；単糖
類、二糖類およびその他の炭水化物（グルコース、マン
ノースあるいはデキストリンを含む）；キレート化剤
（例えば、EDTA）；二価の金属イオン（例えば、亜鉛、
コバルトあるいは銅）；糖アルコール（例えば、マンニ
トールあるいはソルビトール）；塩を形成する対イオン
（例えば、ナトリウム）；および／またはノニオン系界
面活性化剤［例えば、ツイーン、プルロニックあるいは
ポリエチレングリコール（PEG）］が含まれる。本発明
の製剤は、薬学的に許容しうる緩衝剤、アミノ酸、増量
剤、および／またはノニオン系界面活性剤をさらに含有
していてもよい。これらには、例えば緩衝液、キレート
化剤、抗酸化剤、保存剤、共溶媒などが含まれる。これ
らの具体例には、トリメチルアマイン塩（「トリス緩衝
液」）、および二ナトリウム・エデテートが含まれるで
あろう。本発明のファージミドを用いてファージタンパ
ク質を含まない多量のhGH変異体を製造することができ
る。融合体の遺伝子III部分を含まないhGH変異体を発現
させるために、単にpS0643および誘導体を16C9などの非
サプレッサー株中で増殖させることができる。この場合
には、アンバーコドン（TAG）が翻訳の終止を導き、独
立したDNAの構築を必要とすることなく遊離のホルモン
が得られる。hGH変異体は宿主から分泌され、これを培
養培地から単離することができる。

８つのhGHアミノ酸F10、M14、H18、H21、R167、D17
1、T175および1179のうちの１またはそれ以上のアミノ
酸を、ここに示した天然hGH中の該位置に見い出される
アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸に置換することがで
きる。即ち、ここに示したアミノ酸F10、M14、H18、H2
1、R167、D171、T175および1179のうちの１、２、３、
４、５、６、７、または８個全部を、以下に挙げる20ア
ミノ酸のうちの他の19アミノ酸のいずれかで置換するこ
とができる。好ましい態様においては、ここに挙げた８
個全部のアミノ酸を別のアミノ酸で置換する。置換され
るべき最も好ましい８個のアミノ酸は、実施例XII 中
の表XIVに示す。

アミノ酸の命名 Ala（Ａ） Arg（Ｒ） Asn（Ｎ） Asp（Ｄ） Cys（Ｃ） Gln（Ｑ） Glu（Ｅ） Gly（Ｇ） His（Ｈ） Ile（Ｉ） Ieu（Ｌ） Lys（Ｋ） Met（Ｍ） Phe（Ｆ） Pro（Ｐ） Ser（Ｓ） Thr（Ｔ） Trp（Ｗ） Tyr（Ｙ） Val（Ｖ） １文字のhGH変異体の命名法は、削除されるhGHアミノ酸
（例えば、グルタメート179）を最初に記し、次に挿入
されるアミノ酸（例えば、セリン）を記し、結果として
（E1795S）となる。

実施例 さらに説明することなく、当業者なら以上の説明およ
び例示の実施例を用いて本発明を完全に実施および利用
することができると考えられる。即ち、以下の具体的な
実施例は本発明の好ましい態様を示すものであり、いか
なる意味においても開示の残部を限定するとみなすべき
ではない。

実施例１ プラスミドの構築およびhGH−ファージミド
粒子の調製 プラスミドphGH−M13g III（図１）を、M13KO7⁷およ
びhGH産生プラスミドpBO473［Cunningham,B.C.ら,Scien
ce 243:1330−1336（1989）］から構築した。合成オリ
ゴヌクレオチド： を用いて、pBO473中のhGHの最後のPhe191コドンの後に
唯一のApa I制限部位（下線部）を導入した。オリゴヌ
クレオチド： を用いて、唯一のApa I制限部位（最初の下線部）、お
よびGlu197−アンバー停止コドン（２番目の下線部）を
M13KO7遺伝子III中に導入した。オリゴヌクレオチド： により、遺伝子III暗号配列の3'末端の後に唯一のNhe I
部位（下線部）を導入する。二重に突然変異させたM13K
O7の遺伝子III由来の得られた650塩基対（bp）のApa I
−Nhe Iフラグメントを、pBO473の大きいApa I−Nhe I
フラグメント中にクローン化してプラスミドpSO132を創
製した。これにより、Apa I部位からコードされるグリ
シン残基を挿入しつつhGHのカルボキシ末端（Phe191）
を遺伝子IIIタンパク質のPro198残基に融合させ、この
融合タンパク質を大腸菌アルカリホスファターゼ（pho
A）プロモーターおよびst II分泌シグナル配列［Chang,
C.N.ら,Gene 55:189−196（1987）］の支配下に置い
た。豊富培地中での融合タンパク質の誘導可能な発現の
ために、このphoAプロモーターをlacプロモーターおよ
びオペレーターで置換した。lacプロモーター、オペレ
ーター、およびCap結合部位を含有する138bpのEcoR I−
Xba Iフラグメントを、オリゴヌクレオチド： ［これらは、所望のlac配列と境界を接し、EcoR Iおよ
びXba I制限部位（下線部）を導入する］ を用いるプラスミドpUC119のPCRによって調製した。こ
のlacフラグメントをゲル精製し、pSO132の大きいEcoR
I−Xba Iフラグメントに連結してプラスミドphGH−M13g
IIIを創製した。すべての加工したDNA連結点の配列は
ジデオキシ配列決定法によって確認した［Sanger,F.ら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467（1977）］。R6
4A変異hGHファージミドは次のようにして構築した。即
ち、Arg64のAla置換（R64A）［Cunningham,B.C.,Wells,
J.A,Science 244:1081−1085（1989）］をコードしてい
るhGH［Cunninghamら（上記））のNsi I−Bg III突然変
異フラグメントを、phGH−M13g IIIプラスミド（図１）
中の対応する制限部位の間にクローン化して野生型hGH
配列を置換した。このR64A hGHファージミド粒子を、野
生型hGH−ファージミドについて以下に記載したように
して増殖させ、滴定した。

プラスミドを大腸菌の雄性株（JM101）中に導入し、
カルベニシリン・プレート上で選択した。単一の形質転
換体を2YT培地（2ml）中にて37℃で４時間増殖させ、M1
3KO7ヘルパーファージ（50μｌ）に感染させた。この感
染培養物を2YT（30ml）に希釈し、一晩培養し、ポリエ
チレングリコールによる沈澱によってファージミド粒子
を集めた［Vierra,J.,Messing,J.,Methods in Enzymolo
gy 153:3−11（1987）］。通常、ファージミド粒子の力
価は２〜5x10¹¹cfu/mlの範囲内であった。この粒子をCs
Cl密度遠心［Day,L.A.,J.Mol.Biol.39:265−277（196
9）］によって均質になるまで精製し、ビリオンに未結
合のすべての融合タンパク質を除去した。

実施例II 融合ファージ上のhGHの免疫化学分析 hGHに対するウサギポリクローナル抗体をプロテイン
Ａを用いて精製し、50mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH10）
中、２μg/mlの濃度にて４℃で16〜20時間、微量滴定プ
レート（Nunc）に被覆した。0.05％ツイーン20を含むPB
S中で洗浄した後、hGHまたはhGH−ファージミド粒子を
緩衝液Ａ［50mMトリス（pH7.5）、50mM NaCl、2mM EDT
A、5mg/mlウシ血清アルブミン、および0.05％ツイーン2
0］中で2.0〜0.002nMに連続希釈した。室温（rt）で２
時間の後、このプレートを十分に洗浄し、示したMab［C
unninghamら（上記）］をrtで２時間、緩衝液Ａ中１μg
/mlで加えた。洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼ
−コンジュゲート化したヤギ抗−マウスIgG抗体をrtで
１時間結合させた。最後の洗浄の後、ペルオキシダーゼ
活性を、基質ｏ−フェニレンジアミンを用いて検定し
た。

実施例III hGH結合タンパク質のポリアクリルアミドビ
ーズへの結合および結合の豊富化 オキシラン ポリアクリルアミドビーズ（Sigma）
を、237位に部位指向性突然変異誘発により導入した余
分のシステイン残基（hGHの結合に悪影響を及ぼさない;
J.Wells:未公表）を含むhGH受容体の精製した細胞外ド
メイン（hGHbp）［Fuh,G.ら,J.Biol.Chem.265:3111−31
15（1990）］とコンジュゲート化した。このhGHbpは、
供給元の推奨のように、樹脂に対する［¹²⁵I］hGHの結
合によって測定したときに1.7pモルhGHbp/mg乾燥オキシ
ランビーズの量となるようにコンジュゲート化した。次
いで、すべての未反応オキシラン基をBSAおよびトリス
でブロックした。ファージミド粒子の非特異的結合の対
照として、BSAを同様にビーズに結合させた。吸着およ
び洗浄のための緩衝液は、10mMトリス−HCl（pH7.5）、
1mM EDTA、50mM NaCl、1mg/ml BSAおよび0.02％ツイー
ン20を含有していた。溶離緩衝液は、洗浄緩衝液に加え
て200nM hGHまたは0.2Mグリシン（pH2.1）を含有してい
た。親ファージM13KO7をhGHファージミド粒子とほぼ300
0:1（最初の混合物）の比で混合し、50μｌ容量中、室
温でいずれかの吸収剤（５μｌづつ;0.2mgのアクリルア
ミドビーズ）と８〜12時間混合した。このビーズを遠心
によってペレット化し、上清を注意深く除去した。この
ビーズを洗浄緩衝液（200μｌ）に再懸濁し、室温で４
時間混合した（洗浄液１）。２回目の洗浄の後（洗浄液
２）、このビーズを２回、それぞれ200nMのhGHで６〜10
時間溶離した（溶出液１、溶出液２）。最後の溶離はグ
リシン緩衝液（pH2.1）を用いて４時間行ない、残存す
るhGHファージミド粒子を除去した（溶出液３）。それ
ぞれの分画を2YT培地で適切に希釈し、新鮮なJM101と混
合し、37℃で５分間インキュベートし、そして2YT軟寒
天（3ml）を用いてLBまたはLBカルベニシリンプレート
にプレーティングした。

実施例IV 遺伝子III産物の混合物によるhGH−ファージ
ミド粒子の構築 遺伝子IIIタンパク質は410残基からなり、可変リンカ
ー配列によって隔てられた２つのドメインに分かれてい
る［Armstrong,J.ら,FEBS Lett.135:167−172（198
1）］。アミノ末端ドメインは大腸菌の線毛に付着する
ために必要であり、一方、カルボキシ末端ドメインはフ
ァージのコート（外殻）に組込まれ、適切なファージ組
立てに必要である［Crissman,J.W.,Smith,G.P.,Virolog
y 132:445−455（1984）］。遺伝子IIIのシグナル配列
およびアミノ末端ドメインを、遺伝子IIIのカルボキシ
末端ドメイン中の残基198への融合により、st IIシグナ
ルおよび全hGH遺伝子［Changら（上記）］で置換した
（図１）。このhGH−遺伝子III融合体を、pBR322のβ−
ラクタマーゼ遺伝子およびColE1複製起点ならびにファ
ージflの遺伝子間領域を含むプラスミド（pbGH−M13g I
II;図１）中のlacプロモーター／オペレーターの支配下
に置いた。このベクターは、カルベニシリンによる選択
によって小さなプラスミドベクターとして容易に維持す
ることができ、これにより増殖のために機能的な遺伝子
III融合体に依存することが回避される。また、このプ
ラスミドは、M13KO7［Vieraら（上記）］などのヘルパ
ーファージによる感染によってビリオン（即ち、ファー
ジミド粒子）に効率的にパッケージングされることがで
き、これによりファージ組立ての問題が回避される。こ
の系におけるカルベニシリン耐性に対する形質導入に基
づくファージミドの感染性力価は、２〜5x10¹¹コロニー
形成単位（cfu）/mlに変化した。これらのファージミド
保存物におけるM13KO7ヘルパーファージの力価は〜10¹⁰
プラーク形成単位（pfu）/mlである。

この系を用いて、遺伝子IIIに融合した大きいタンパ
ク質の均質発現がファージの生成に有害であるという以
前の研究［Parmley,Smith（上記）］を確認した（デー
タは示していない）。例えば、IPTGの添加によるphGH−
M13g III中のlacプロモーターの誘導により、低いファ
ージミド力価が得られた。さらに、遺伝子III中にアン
バー突然変異を含むM13KO7による同時感染によって得ら
れたファージミド粒子は、極めて低いファージミド力価
（＜10¹⁰cfu/ml）を与えた。我々は、ファージミド表面
に結合した複数コピーの遺伝子III融合体が、固定化標
的タンパク質への融合ファージの複数点結合（「キレー
ト作用」）を導きうるものと考えた。従って、融合タン
パク質のコピー数を制御するために、構成的に高レベル
のlacリプレッサータンパク質を含有する大腸菌JM101
（lacl^Q）中でプラスミドを培養することによって、hGH
−遺伝子III融合体の転写を制限した。phGH−M13g III
を含有する大腸菌JM101培養物を最高に増殖させ、1acオ
ペロン誘導物質（IPTG）の非存在下にM13KO7に感染させ
た（しかし、この系は柔軟性を持っており、他の遺伝子
III融合タンパク質の同時発現と平衡させることができ
る）。我々は、ピリオンあたりのhGH量の比（CsCl勾配
で精製したファージミド中のhGH免疫反応性物質に基づ
く）から、約10％のファージミド粒子が１コピーのhGH
遺伝子III融合タンパク質を含有しているものと概算し
ている。従って、hGH遺伝子III融合体を表示する融合フ
ァージの力価は約２〜5x10¹⁰/mlである。この数値は、
これらを導いた培養物中の大腸菌の力価（〜10⁸〜10⁹/m
l）よりも相当に大きい。即ち、平均的に全大腸菌細胞
は、hGH遺伝子III融合タンパク質で装飾されたファージ
を10〜100コピー生成する。

実施例Ｖ hGH−遺伝子III融合体の構造的完全性 hGH−遺伝子IIIファージミドの免疫ブロット分析（図
２）により、hGH交差反応性物質がアガロースゲル中で
ファージミド粒子と同時移動することがわかる。このこ
とは、hGHがファージミド粒子に強固に結合しているこ
とを示すものである。このファージミド粒子からのhGH
−遺伝子III融合タンパク質は単一の免疫染色されるバ
ンドとして移動し、hGHが遺伝子IIIに結合したときにhG
Hの分解がわずかしかないことを示す。約25％のファー
ジミド粒子が感染性であるので、野生型遺伝子IIIタン
パク質が明らかに存在する。これは、UV吸収によって評
価した濃度、および同様に精製（CsCl密度勾配法によ
る）した野生型M13ファージに対して行なった比感染性
評価に類似する［Smith,G.P.（上記）およびParmley,Sm
ith（上記）］。即ち、野生型遺伝子IIIおよびhGH−遺
伝子III融合タンパク質の両方がファージプール中に表
示される。

結合選択による結果が天然タンパク質に転換するとい
う信頼性を得るために、表示されたhGHの３次構造が維
持されていることを確認するのが重要であった。hGHに
対するモノクローナル抗体（Mab）を用いて、表示され
たhGH遺伝子III融合タンパク質の構造的完全性を評価し
た（表Ｉ）。

これらMabに対するhGH上のエピトープはマッピングさ
れており［Cunninghamら（上記）］、８種のMabのうち
の７種に対する結合はhGHが適切に折り畳まれることを
必要とする。すべてのMabのIC₅₀値は、Mab 5および６を
除いて野生型hGHと等価であった。Mab 5および６の両方
は、遺伝子III融合タンパク質中でブロックされるhGHの
カルボキシ末端の近くに結合決定基を有していることが
知られている。天然および変性hGHの両方と反応するMab
1の相対IC₅₀値は、立体配座的に敏感なMab 2〜５、７
および８と比較して変わることがない。即ち、Mab 1
は、hGH−遺伝子III融合体の濃度に対するhGH標準の濃
度を適合させる際のあらゆる過誤の良好な内部対照とし
て働く。

実施例VI 受容体親和性ビーズに対する結合の豊富化 これまでの研究者［Parmley,Smith（上記）;Smith
（上記）;Cwirlaら（上記）；およびDevlinら（上
記）］は、ストレプトアビジン被覆したポリスチレン製
ペトリ皿または微量滴定プレートで選別することによっ
てファージを分画していた。しかし、クロマトグラフィ
ー系は、異なる結合親和性を有する突然変異タンパク質
を表示するファージミド粒子のさらに効率的な分画を可
能にする。我々は、非多孔性のオキシランビーズ（Sigm
a）を選択してクロマトグラフィー樹脂中のファージミ
ド粒子の捕捉を回避した。さらに、これらビーズは小さ
い粒子サイズ（１μｍ）を有しており、量に対する表面
積の比が最大になる。遊離のシステイノ残基を含有する
hGH受容体の細胞外ドメイン（hGHbp）［Fuhら（上
記）］はこれらビーズに効率的に結合し、ファージミド
粒子はウシ血清アルブミンにのみ結合させたビーズに対
して極めて低い非特異的な結合を示した（表II）。

代表的な豊富化実験（表II）において、１部のhGHフ
ァージミドを＞3,000部のM13KO7ファージと混合した。
１サイクルの結合と溶離の後、10⁶のファージが回収さ
れ、ファージミドのM13KO7ファージに対する比は2:1で
あった。即ち、１回の結合選択工程によって、＞5000倍
の豊富化が得られた。残存するファージミドを除去する
ための遊離hGHまたは酸処理による追加の溶離によっ
て、さらに高い豊富化が得られた。この豊富化は、被覆
ポリスチレンプレートからのバッチ溶離を用いてSmith
およびその共同研究者が得た豊富化に匹敵した［Smith,
G.P.（上記）およびParmley,Smith（上記）］。しか
し、さらに少ない容量がビーズに対して用いられている
（200μl vs 6ml）。BSAにのみ結合させたビーズを用い
たときには、M13KO7を凌ぐhGHファージミドの豊富化は
ほとんど存在しなかった。対照ビーズに対して観察され
たわずかな豊富化（pH2.1溶離に対して〜10倍；表２）
は、ビーズに結合するBSA中に存在するウシ成長ホルモ
ン結合タンパク質の微量の不純物に由来するものであろ
う。それにもかかわらず、これらのデータは、hGHファ
ージの豊富化がビーズ上のhGHbpの存在に依存すること
を示し、結合がhGHとhGHbpの間の特異的な相互作用によ
って起こることを示唆する。

我々は、融合ファージミド上のhGHの比較的弱い結合
変異体を凌ぐ野生型hGHの豊富化を評価して、豊富化の
特異性をさらに調べ、精製ホルモンに対する結合親和性
の減少を融合ファージミド選別後の豊富化因子と関連さ
せた。Arg64がAlaで置換されたhGH突然変異体（R64A）
を用いて融合ファージミドを構築した。このR64A変異ホ
ルモンは、hGHと比べて受容体結合親和性が約20倍減少
している［それぞれ、Kd値が7.1nMおよび0.34nM;Cunnin
gham,Wells（上記）］。R64A hGH−遺伝子III融合ファ
ージミドの力価は、野生型hGHファージミドの力価と同
等であった。１ラウンドの結合と溶離の後（表III）、
野生型hGHファージミドは、２種類のファージミドとM13
KO7の混合物から、ファージミドR64Aに対しては８倍お
よびM13KO7ヘルパーファージに対しては〜10⁴で豊富化
された。

結 論 ファージミド粒子上に野生型遺伝子IIIおよび遺伝子I
II融合タンパク質の混合物を表示させることにより、遺
伝子IIIに対する融合体として大きな適切に折り畳まれ
たタンパク質を表示するビリオンを組立てそして増殖さ
せることができる。遺伝子III融合タンパク質のコピー
数を有効に制御して、ファージミドプールにおいて十分
に高いレベルになお維持されている「キレート作用」を
避け、大きいエピトープライブラリー（＞10¹⁰）の選別
をすることができる。我々は、hGH（22kDのタンパク
質）を天然の折り畳まれた形態で表示させうることを示
した。遊離のhGHで溶離し、受容体親和性ビーズ上で行
なった結合選択は、低い受容体結合親和性を有すること
が示された突然変異hGHファージミド以上に野生型hGHフ
ァージミドを効率的に豊富化した。即ち、結合定数がナ
ノモル範囲で低下しているファージミド粒子を選別する
ことができる。

タンパク質−タンパク質および抗体−抗原の相互作用
は、不連続エピトープによって支配されている［Janin,
J.ら,J.Mol.Biol.204:155−164（1988）;Argos,P.,Pro
t.Eng.2:101−113（1988）;Barlow,D.J.ら,Nature 322:
747−748（1987）；およびDavies,D.R.ら,J.Biol.Chem.
263:10541−10544（1988）］。即ち、結合に直接関与し
ている残基は３次構造において近接しているが、結合に
関与していない残基によって隔てられている。本発明に
より提供されるスクリーニング系は、さらに好都合にタ
ンパク質−受容体の相互作用を分析し、新規かつ高親和
性の結合性を有するタンパク質中の不連続エピトープを
単離することを可能にするものである。

実施例VII hGHコドン172、174、176、178においてラン
ダム化したライブラリーからのhGH突然変異体の選択 鋳型の構築 hGH−遺伝子III融合タンパク質の突然変異体は、Kunk
elら［Meth.Enzymol.154:367−382（1987）］の方法を
用いて構築した。鋳型DNAは、M13−K07ファージをヘル
パーとして加えて、プラスミドpS0132（M13遺伝子IIIの
カルボキシ末端側半分に融合させた天然hGH遺伝子をア
ルカリホスファターゼプロモーターの支配下に含有す
る）をCJ236細胞中で増殖させることによって調製し
た。１本鎖のウラシル含有DNAを突然変異誘発用に調製
して、（１）hGH結合タンパク質（hGHbp）に対する結合
を大きく減少させるhGH中の突然変異；および（２）親
のバックグラウンドファージを検定し、それに対して選
択するために使用しうる唯一の制限部位（Kpn I）を導
入した。T7 DNAポリメラーゼおよび以下のオリゴデオキ
シヌクレオチド： を用いてオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発を行
なった。このオリゴは、hGH中に突然変異（R178G、I179
T）と共にKpn I部位（上に示す）を導入する。突然変異
誘発からのクローンをKpn I消化によってスクリーニン
グし、ジデオキシDNA配列決定によって確認した。ラン
ダム突然変異誘発の鋳型として使用されるこの得られた
構築物をpHO415と命名した。

hGHのヘリックス４中のランダム突然変異誘発 ここでもKunkelの方法を用いて、コドン172、174、17
6、178をhGH中のランダム突然変異誘発の標的とした。
上記のようにpHO415から１本鎖鋳型を調製し、以下のオ
リゴ： hGHコドン： のプールを用いて突然変異誘発を行なった。上に示した
ように、このオリゴプールはコドン179を野生型（Ile）
に復帰させ、pH0415の唯一のKpn I部位を破壊し、そし
て172、174、176および178位にランダムコドン（NNS;こ
こで、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、ＳはＧまたはＣ
である）を導入する。上記の配列に対してこのコドン選
択を用いて、付加的なKpn I部位を創製することはでき
ない。このNNS同義性配列の選択により、４つの部位に3
2種の可能なコドン（１つの「停止」コドンおよび少な
くとも１つの各アミノ酸のためのコドン）が得られ、合
計（32）^４＝1,048,576の可能なヌクレオチド配列（こ
の12％は少なくとも１つの停止コドンを含有する）、ま
たは（20）^４＝160,000の可能なポリペプチド配列と34,
481の未成熟で終止した配列（即ち、少なくとも１つの
停止コドンを含有する配列）が得られる。

最初のライブラリーの増殖 突然変異誘発産物をフェノール：クロロホルム（50:5
0）で２回抽出し、後の電気穿孔工程を面倒にする塩の
添加を避けるために過剰のキャリアーtRNAを用いてエタ
ノール沈澱させた。約50ng（15fモル）のDNAを、0.2cm
キュベット中の全容積45μｌにおいて、単一パルスの電
圧設定2.49kV（時間定数＝4.7m秒）でWJM101細胞（2.8x
10¹⁰細胞/ml）に電気穿孔導入した。

この細胞を振盪しながら37℃で１時間回復させ、次い
で2YT培地（25ml）、100μg/mlカルベニシリン、および
M13−K07（感染の多重度＝1000）と混合した。この培養
物からの連続希釈物をカルベニシリン含有培地にプレー
ティングすることにより、8.2x10⁶の電気形質転換体が
得られたことがわかった。23℃で10分間の後、培養物を
振盪しながら37℃で一晩（15時間）インキュベートし
た。

一晩インキュベートの後、細胞をペレット化し、pLIB
1と命名した２本鎖DNA（dsDNA）をアルカリ溶解法によ
って調製した。この上清をもう一度遠心してすべての残
存細胞を除去し、ファージプールφ１と命名したファー
ジをPEG沈澱させ、STE緩衝液［10mMトリス（pH7.6）、1
mM EDTA、50mM NaCl］（1ml）に再懸濁した。ファージ
力価は、hGH−g3p遺伝子III融合（hGH−g³）プラスミド
を含有する組換えファージミドについてはコロニー形成
単位（CFU）として、そしてM13−K07ヘルパーファージ
についてはプラーク形成単位（PFU）として測定した。

固定化hGHbpを用いる結合選択 1.結合：ファージプールφ１（6x10⁹CFU、6x10⁷PFU）の
一部を緩衝液Ａ［リン酸緩衝食塩水、0.5％BSA、0.05％
ツイーン20、0.01％チメロサール］で4.5倍に希釈し、
1.5mlのシラン処理したポリプロピレン試験管におい
て、Ser237Cys突然変異を含むhGHbp（350fモル）と結合
させたオキシラン−ポリアクリルアミドビーズの懸濁液
（５μｌ）と混合した。対照として、等量のファージ
を、BSAだけで被覆したビーズと別の試験管で混合し
た。このファージを、ゆっくり回転（約7rpm）させなが
ら室温（23℃）で３時間インキュベートすることによっ
て、ビーズと結合させた。以下の工程は、200μｌの一
定容量を用い、室温で行なった。

2.洗浄：ビーズを15秒間回転させ、上清を除去した（上
清１）。非特異的に結合したファージ／ファージミドを
除去するため、このビーズを緩衝液Ａに再懸濁すること
により２回洗浄し、次いでペレット化した。最後の洗浄
は、緩衝液Ａ中で２時間、このビーズを回転させること
により行なった。

3.hGH溶離：ビーズに弱く結合したファージ／ファージ
ミドを、hGHによる段階溶離によって除去した。最初の
工程において、ビーズを2nM hGH含有の緩衝液Ａを用い
て回転させた。17時間後に、このビーズをペレット化
し、20nM hGH含有の緩衝液Ａに再懸濁し、３時間回転さ
せ、次いでペレット化した。最後のhGH洗浄において、
このビーズを200nM hGH含有の緩衝液Ａに懸濁させ、３
時間回転させ、次いでペレット化した。

4.グリシン溶離：最も強固に結合したファージミド（即
ち、hGH洗浄後になお結合しているファージミド）を除
去するため、ビーズをグリシン緩衝液［1Mグリシン、HC
lでpH2.0］に懸濁させ、２時間回転させ、ペレット化し
た。この上清（分画「Ｇ」;200μｌ）を、1Mトリス塩基
（30μｌ）の添加によって中和した。

hGHbp−ビーズから溶出した分画Ｇ（1x10⁶CFU、5x10⁴
PFU）は、実質的にK07ヘルパーファージ以上にファージ
ミドに富むことはなかった。我々は、これは、組換えフ
ァージミドの増殖中にパッケージされたK07ファージがh
GH−g3p融合体を表示するということに起因するものと
考えている。

しかし、BSA被覆された対照ビーズから溶出した分画
Ｇと比較すると、hGHbp−ビーズは14倍高いCFUを与え
た。これは、非特異的に結合したファージミド以上の、
強固に結合したhGHを表示するファージミドの豊富化を
反映するものである。

5.増殖:hGHbp−ビーズから溶出した分画Ｇの一部（4.3x
10⁵CFU）を用いて対数増殖期のWJM101細胞を感染させ
た。形質導入は、分画Ｇ（100μｌ）をWJM101細胞（1m
l）と混合し、37℃で20分間インキュベートし、次いでK
07（感染の多重度＝1000）を加えることによって行なっ
た。培養物（25mlの2YTとカルベニシリン）を上記のよ
うに増殖させ、ファージの第２プール（ライブラリー1
G、第１のグリシン溶離用）を上記のように調製した。

ライブラリー1Gからのファージ（図３）を、上記のよ
うに、hGHbpビーズへの結合について選択した。hGHbpビ
ーズから溶出した分画Ｇは、この選択においてBSAビー
ズから溶出した分画Ｇに比べて30倍高いCFUを含んでい
た。もう一度、分画Ｇの一部をWJM101細胞中で増殖さ
せ、ライブラリー1G²（グリシン溶離によってこのライ
ブラリーを２回選択したことを示す）を得た。また、２
本鎖DNA（pLIB 1G²）をこの培養物から調製した。

dsDNAのKpn I検定および制限選択 バックグラウンド（Kpn I⁺）鋳型の量を減少させるた
め、pLIB 1G²の一部（約0.5μｇ）をKpn Iで消化し、WJ
M101細胞中に電気穿孔導入した。これらの細胞を、最初
のライブラリーについて記載したようにK07（感染の多
重度＝100）の存在下で増殖させ、新しいファージプー
ルpLIB3を調製した（図３）。

さらに、最初のライブラリー（pLIB1）由来のdsDNAの
一部（約0.5μｇ）をKpn Iで消化し、WJM101細胞中に直
接電気穿孔導入した。形質転換体を上記のように回復さ
せ、M13−K07に感染させ、一晩増殖させてファージライ
ブラリー２と命名した新しいファージライブラリーを得
た（図３）。

連続ラウンドの選択 （１）過剰（CFUの10倍）の精製K07ファージ（hGHを
表示しない）をビーズ結合カクテル中に添加した；およ
び（２）hGH段階溶離を緩衝液Ａ単独の短い洗浄に換え
たことを除き、上記のようにしてpLIB2およびpLIB3の両
方に由来するファージミドに対して連続ラウンドでファ
ージミドの結合、溶離および増殖を行なった。また、一
部においてはXL1−Blue細胞をファージミドの増殖に用
いた。

Kpn IによるdsDNAの追加の消化を、最終ラウンドのビ
ーズ結合選択の前にpLIB 2G³およびpLIB 3G⁵に対して実
施した（図３）。

選択したファージミドのDNA配列決定 LIB 4G⁴由来の４種の独立して単離したクローンおよ
びLIB 5G⁶由来の４種の独立して単離したクローンを、
ジデオキシ配列決定によって配列決定した。これら８種
クローンのすべてが、同一のDNA配列： hGHコドン： を有していた。即ち、これらのすべてがhGHの同一突然
変異体（E174S、F176Y）をコードしている。これらクロ
ーン中の残基172は野生型と同様にLysである。また、17
2に対して選択されたコドンも野生型hGHと同一である。
このことは、AAGが同義「NNS」コドンのセットから可能
な唯一のリジン−コドンであるので驚くには当たらな
い。さらに、残基178−Argも野生型と同一であるが、こ
こではライブラリーから選択されたコドンはAAGであっ
て野生型hGHで見い出されるCGCではなかった（後者コド
ンも「NNS」コドンのセットを用いて可能である）。

K07感染の多重度 K07感染の感染多重度は、組換えファージミドの増殖
において重要なパラメーターである。K07の感染多重度
は、ファージミドで形質転換またはトランスフェクショ
ンされた実質的にすべての細胞が新しいファージミド粒
子をパッケージしうることを確保するに十分に高いもの
でなければならない。さらに、それぞれの細胞中の野生
型遺伝子IIIの濃度は高く維持されて、複数のhGH−遺伝
子III融合分子がそれぞれのファージミド粒子上に表示
される可能性を減少させ、それによって結合におけるキ
レート作用を減少させるものであるべきである。しか
し、K07の感染多重度が高すぎるときには、K07のパッケ
ージングは組換えファージミドのパッケージングと競合
するであろう。我々は、１〜10％のバックグラウンドK0
7ファージしか持たない許容しうるファージミド収量
が、K07の感染多重度が100であるときに得られることを
見い出した。

ファージプールを先に示したように標識した（図
３）。感染多重度（moi）はファージミドの増殖の際のK
07感染の多重度（PFU/細胞）を意味する。PFUを越えるC
FUの豊富化は、精製したK07を結合工程に加えたときに
示される。BSAビーズから溶出したCFUを越える、hGHbp
ビーズから溶出されるCFUの比が示されている。プール
中に残存するKpn I含有鋳型（即ち、pH0415）の分画
は、dsDNAをKpn IおよびEcoR Iで消化し、生成物を１％
アガロースゲルで移動させ、陰性の臭化エチジウム染色
DNAをレーザー−スキャニングすることによって測定し
た。

ホルモンhGH（E174S、F176Y）の受容体結合の親和性 単一のクローンが２種類の異なる選択経路（図３）か
ら単離されたという事実は、二重突然変異体（E174S、F
176Y）がhGHbpに強く結合することを示唆した。hGHbpに
対するこのhGH突然変異体の親和性を測定するために、
我々はこのhGH突然変異体を、プラスミドpB0720を用い
る部位指向性突然変異誘発によって構築した。このプラ
スミドは、鋳型としての野生型hGH遺伝子、ならびにコ
ドン174および176を変化させる次のオリゴヌクレオチ
ド： hGHコドン： を含有している。得られた構築物pH0458Bを、突然変異
ホルモンの発現のために大腸菌株16C9に導入した。hGHb
pに対するhGH（E174S、F176Y）と¹²⁵I−hGHの競合結合
のスカッチャード分析により、この（E174S、F176Y）突
然変異体が野生型hGHの結合親和性よりも少なくとも5.0
倍強固な結合親和性を有していることがわかった。

実施例VIII ホルモン−ファージのヘリックス４ランダ
ムカセットライブラリーからのhGH変異体の選択 ヒト成長ホルモン変異体を、図９に記載のファージミ
ドを用いる本発明の方法によって調製した。

脱−融合性のホルモン−ファージベクターの構築 我々は、（１）ファージ上でhGH部分の表示をさらに
有利にするように、hGHと遺伝子III部分の間の結合を改
良する；（２）実質的に「一価の表示」を得るために融
合タンパク質の発現を限定する；（３）出発ベクターに
対する制限ヌクレアーゼの選択を可能にする；（４）出
発ベクターからの融合タンパク質の発現を排除する；お
よび（５）あるhGH−遺伝子III融合突然変異体からの対
応する遊離ホルモンの容易な発現を達成する；という目
的をもって、カセット突然変異誘発［Wellsら,Gene 34:
315−323（1985）］およびhGH−遺伝子III融合タンパク
質の発現のためのベクターを設計した。

pBR322およびf1の複製起点を含有し、大腸菌phoAプロ
モーター［Bassら,Proteins 8:309−314（1990）］の支
配下にhGH−遺伝子III融合タンパク質（hGH残基１〜19
1、これに１個のGly残基が続き、遺伝子IIIのPro−198
に融合している）を発現する、pS0132のオリゴヌクレオ
チド指向性の突然変異誘発［Kunkelら,Methods Enzymo
l.154:367−382（1987）］によってプラスミドpS0643を
構築した（図９）。オリゴヌクレオチド： を用いて突然変異誘発を行った［このオリゴヌクレオチ
ドは、hGHのPhe−191に続いてXba I部位（下線部）およ
びアンバー停止コドン（TAG）を導入する］。得られた
構築物pS0643においては、遺伝子IIIの一部が削除さ
れ、２つのサイレント突然変異誘発（下線部）が生じ、
hGHと遺伝子IIIの間に次の連結点が生成する： これは、融合タンパク質の全体サイズをpS0132中の401
残基からpS0643中の350残基まで短縮する。hGHに対する
モノクローナル抗体を用いた実験により、ファージ粒子
に組立てられる新しい融合タンパク質のhGH部分は以前
の長い融合体よりも接近しやすいことがわかった。

ホルモンを表示するファージを増殖させるため、pS06
43および誘導体をJM101またはXL1−Blueなどの大腸菌の
アンバー−サプレッサー株［Bullockら,BioTechniques
5:376−379（1987）］中で増殖させることができる。上
に示したのは、supEサプレッサー株中で起こるアンバー
コドンにおけるGluの置換である。また、他のアミノ酸
による抑制が、周知かつ一般に入手可能な種々の大腸菌
株において可能である。

融合体の遺伝子III部分を含まないhGH（または、突然
変異体）を発現させるために、pS0643および誘導体を単
に16C9などの非サプレッサー株において増殖させること
ができる。この場合にはアンバーコドン（TAG）は翻訳
の終止を導き、独立したDNA構築を必要とすることなく
遊離のホルモンを与える。

カセット突然変異誘発のための部位を創製するため、
pS0643をオリゴヌクレオチド： ［これは、pS0643の唯一のBg III部位を破壊する］； ［これは、唯一のBstE II部位、１塩基のフレームシフ
ト、および非アンバー停止コドン（TGA）を挿入す
る］；および ［これは、新規なBg III部位を導入する］ で突然変異させて出発ベクターpH0509を得た。TGA停止
コドンと共にフレームシフトを加えることにより、出発
ベクターから遺伝子III融合体が産生され得ないことが
確保される。BstE II−Bg IIIセグメントをpH0509から
切出し、所望のコドンのところで突然変異させたDNAカ
セットで置換した。また、hGH中の他の位置におけるカ
セット突然変異誘発のための他の制限部位も、このホル
モン−ファージベクター中に導入した。

hGHのヘリックス内のカセット突然変異誘発 hGHのコドン172、174、176および178をランダム突然
変異誘発の標的とした。この理由は、これらすべてがhG
Hの表面またはその近くに存在し、受容体結合に有意に
寄与し［CunninghamおよびWells,Science 244:1081−10
85（1989）］；これらすべてが十分に定義された構造内
に存在し、ヘリックス４の同じ側の２「ターン」を占
め；そして、これらのそれぞれがhGHの既知の進化変異
体の中の少なくとも１つのアミノ酸で置換されているた
めである。

我々は、それぞれの標的残基にNNS（Ｎ＝A/G/C/T;S＝
G/C）の置換を選択した。このNNS同義性配列の選択によ
り、４つの部位に32種の可能なコドン（少なくとも１つ
の各アミノ酸のためのコドン）が得られ、合計（32）^４
＝1,048,576の可能なヌクレオチド配列、または（20）
^４＝160,000の可能なポリペプチド配列が得られる。唯
一の停止コドンであるアンバー（TAG）がこのコドン選
択により可能であり、このコドンは大腸菌のsupE株にお
いてGlu1として抑制することができる。

コドン172、174、176および178にNNSを有する２種類
の同義性（縮重）オリゴヌクレオチドを合成し、ホスホ
リル化し、アニールさせて突然変異カセットを構築し
た： BstE IIに続いてBg IIIでpH0509を消化することによっ
てベクターを調製した。生成物を１％アガロースゲル上
で移動させ、大きいフラグメントを切り出し、フェノー
ル抽出し、エタノール沈澱させた。このフラグメントを
ウシ腸ホスファターゼ（Boehringer）で処理し、次いで
フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈澱さ
せ、突然変異用カセットとの連結用に再懸濁した。

XL1−Blue細胞における最初のライブラリーの増殖 連結の後、反応生成物をBstE IIでもう一度消化し、
次いでフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈
澱させ、水に再懸濁した［BstE II認識部位（GGTNACC）
が、コドン172の３位にＧおよび174にACC（Thr）コドン
を含むカセット内に創製される。しかし、この工程での
BstE IIによる処理は、あらゆる可能な突然変異カセッ
トに対して選択しないはずである。この理由は、実質的
にすべてのカセットがヘテロ２本鎖であり、この酵素に
よって切断され得ないためである］。約150ng（45fモ
ル）のDNAを、0.2cmキュベット中のXL1−Blue細胞（0.0
45ml中に1.8x10⁹細胞）に、単一パルスの電圧設定2.49k
V（時間定数＝4.7m秒）で電気穿孔導入した。

この細胞を振盪しながらS.O.C.培地において37℃で１
時間回復させ、次いで2YT培地（25ml）、100mg/mlカル
ベニシリン、およびM13−K07（moi＝100）と混合した。
23℃で10分間の後、培養物を振盪しながら37℃で一晩
（15時間）インキュベートした。この培養物からの連続
希釈物をカルベニシリン含有培地にプレーティングする
ことにより、3.9x10⁷の電気形質転換体が得られたこと
がわかった。

一晩インキュベートの後、細胞をペレット化し、pH05
29E（最初のライブラリー）と命名した２本鎖DNA（dsDN
A）をアルカリ溶解法によって調製した。この上清をも
う一度遠心してすべての残存細胞を除去し、ファージプ
ールφH0529E（最初のファージライブラリー）と命名し
たファージをPEG沈澱させ、STE緩衝液［10mMトリス（pH
7.6）、1mM EDTA、50mM NaCl］（1ml）に再懸濁した。
ファージ力価は、hGH−g3pを含有する組換えファージミ
ドについてコロニー形成単位（CFU）として測定した。
出発ライブラリーから約4.5x10¹³CFUが得られた。

出発ライブラリーの同義性（縮重） 電気形質転換体のプールからの58のクローンを、BstE
II−Bg IIIカセットの領域において配列決定した。こ
れらの中で、17％が出発ベクターに対応しており、17％
が少なくとも１つのフレームシフトを含有しており、そ
して７％が４つの標的コドンの外側に非サイレント（非
終止）突然変異を含有していた。我々は、41％のクロー
ンが上記基準のいずれかによる欠点を有しており、2.0x
10⁷の当初形質転換体の合計機能的プールが残るものと
結論した。それでもなお、この数は可能性あるDNA配列
数をほぼ20倍越えている。従って、我々は出発ライブラ
リーにおいて示されるすべての可能性ある配列を有する
ことを確信している。

我々は、選択されなかったファージの配列を調べて突
然変異誘発におけるコドンの偏向度を評価した（表
Ｖ）。これらの結果により、一部のコドン（および、ア
ミノ酸）がランダムな予想に比べて多いかまたは少ない
ことが示されるが、このライブラリーは極めて多様性が
高く、大量の「兄弟」縮従の証拠は存在しないことがわ
かった（表VI）。

固定化pGHbpおよびhPRLbpの調製 野生型hGHbp［Fuhら,J.Biol.Chem.265:3111−3115（1
990）］を用いたことを除き、文献［Bassら,Proteins
8:309−314（1990）］に記載のようにして固定化hGHbp
（「hGHbp−ビーズ」）を調製した。［¹²⁵I］hGHとの競
合結合実験により、１μｌのビーズ懸濁液あたり58fモ
ルの機能的hGHbpが結合することがわかった。

プロラクチン受容体［Cunninghamら,Science 250:170
9−1712（1990）］の211残基の細胞外ドメインを用い
て、上記のように固定化hPRLbp（「hPRLbp−ビーズ」）
を調製した。50μＭの亜鉛の存在下での［¹²⁵I］hGHと
の競合結合実験により、１μｌのビーズ懸濁液あたり2.
1fモルの機能的hPRLbpが結合することがわかった。

「ブランクビーズ」は、オキシラン−アクリルアミド
ビーズを0.6Mエタノールアミン（pH9.2）により４℃で1
5時間処理することによって調製した。

固定化hGHbpおよびhPRLbpを用いる結合選択 ビーズに対するホルモン−ファージの結合を、次の緩
衝液のいずれかにおいて実施した:hGHbpおよびブランク
ビーズを用いる選択に対しては緩衝液Ａ［PBS、0.5％BS
A、0.05％ツイーン20、0.01％メチロサール］；亜鉛の
存在下（＋Zn²⁺）にhPRLbpを用いる選択に対しては緩衝
液Ｂ［50mMトリス（pH7.5）、10mM MgCl₂、0.5％BSA、
0.05％ツイーン20、100mM ZnCl₂］；または、亜鉛の非
存在下（＋EDTA）にhPRLbpを用いる選択に対しては緩衝
液Ｃ［PBS、0.5％BSA、0.05％ツイーン20、0.01％チメ
ロサール、10mM EDTA］。結合選択は、次の経路のそれ
ぞれに従って実施した：（１）ブランクビーズに対する
結合、（２）hGHbp−ビーズに対する結合、（３）hPRLb
p−ビーズに対する結合（＋Zn²⁺）、（４）hPRLbp−ビ
ーズに対する結合（EDTA）、（５）hGHbpビーズによる
２回の予備吸着とその後の未吸着分画のhPRLbp−ビーズ
への結合（「−hGHbp、＋hPRLbp」選択）、または
（６）hPRLbp−ビーズによる２回の予備吸着とその後の
未吸着分画のhGHbp−ビーズへの結合（「−hPRLbp、＋h
GHbp」選択）。後者の２つの操作は、それぞれhPRLbpと
結合するがhGHbpとは結合しない突然変異体、またはhGH
bpと結合するがhPRLbpとは結合しない突然変異体を豊富
化するものと予想される。各サイクルにおけるファージ
の結合と溶離は、次のように実施した： 1.結合：ホルモンファージの一部（通常は10⁹〜10¹⁰CF
U）を等量の非ホルモンファージ（pCAT）と混合し、適
当な緩衝液（Ａ、ＢまたはＣ）で希釈し、1.5mlのポリ
プロピレン試験管において200mlの総容量でhGHbp、hPRL
bpまたはブランクビーズの緩衝液（10ml）と混合した。
このファージを、ゆっくり回転（約7rpm）させながら室
温（23℃）で１時間インキュベートすることによってビ
ーズと結合させた。以下の工程は、200μｌの一定容量
を用い、室温で行なった。

2.洗浄：ビーズを15秒間回転させ、上清を除去した。非
特異的に結合したファージ数を減少させるため、このビ
ーズを適当な緩衝液に短時間再懸濁することにより５回
洗浄し、次いでペレット化した。

3.hGH溶離：ビーズに弱く結合したファージを、hGHによ
る溶離によって除去した。このビーズを400nM hGH含有
の適当な緩衝液と共に15〜17時間回転させた。この上清
を「hGH溶出液」およびビーズとした。このビーズを緩
衝液に短時間再懸濁し、ペレット化することによって洗
浄した。

4.グリシン溶離：最も強固に結合したファージ（即ち、
hGH洗浄後になお結合しているファージ）を除去するた
め、ビーズをグリシン緩衝液［緩衝液Ａに0.2Mグリシン
を追加し、HClでpH2.0にする］に懸濁させ、１時間回転
させ、ペレット化した。この上清（「グリシン溶出
液」;200μｌ）を、1Mトリス塩基（30ml）の添加によっ
て中和し、４℃で保存した。

5.増殖：各組の条件のもと各組のビーズからのhGH溶出
液およびグリシン溶出液の一部を用いて対数増殖期のXL
1−Blue細胞の独立した培養物を感染させた。形質導入
は、ファージをXL1−Blue細胞（1ml）と混合し、37℃で
20分間インキュベートし、次いでK07（moi＝100）を加
えることによって行なった。培養物（25mlの2YTとカル
ベニシリン）を上記のように増殖させ、ファージの次の
プールを上記のように調製した。

ファージの結合、溶離および増殖を、上記のサイクル
に従って、連続ラウンドで行なった。例えば、hGHbpビ
ーズからのhGH溶出液から増幅したファージをhGHbpビー
ズでもう一度選択し、hGHで溶離し、次いでXL1−Blue細
胞の新鮮培養物の感染に用いた。上記の選択法のそれぞ
れに対して５ラウンドの選択および増殖の３ラウンドを
実施した。

選択したファージミドのDNA配列決定 各サイクルのhGHおよびグリシン溶離工程からのファ
ージの一部をXL1−Blue細胞の接種に用い、これをカル
ベニシリンおよびテトラサイクリン含有のLB培地にプレ
ーティングして各ファージプールに由来する独立したク
ローンを得た。単離したコロニーから１本鎖DNAを調製
し、突然変異カセット領域の配列決定を行なった。この
DNA配列決定の結果を、図５、図６、図７および図８に
推定アミノ酸配列としてまとめる。

hGH突然変異体の発現および検定 hGHbpに対する選択したhGH突然変異体の一部の結合親
和性を測定するため、配列決定したクローン由来のDNA
を大腸菌株16C9に導入した。上記のように、この株は非
サプレッサー株であって、hGHの最後のPhe−191残基の
後でタンパク質の翻訳を終止させる。１本鎖DNAをこれ
らの形質転換に用いたが、２本鎖DNAまたは全ファージ
であっても、遊離ホルモンの発現用の非サプレッサー株
中に容易に電気穿孔導入することができる。

hGHの突然変異体は、hGHについて記載されているよう
に、硫酸アンモニウム沈澱により浸透圧ショックを与え
た細胞から調製した［Olsonら,Nature 293:408−411（1
981）］。また、タンパク質濃度は、hGHを標準として用
いて、クーマシー染色SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動ゲルのレーザー・デンシトメトリーによって測定
した［CunninghamおよびWells,Science 244:1081−1085
（1989）］。

各突然変異体の結合親和性は、抗−受容体モノクロー
ナル抗体（Mab263）を用い、文献［Spencerら,J.Biol.C
hem.263:7862−7867（1988）;Fuhら,J.Biol.Chem.265:3
111−3115（1990）］記載のように¹²⁵I hGHを置換する
ことによって測定した。

異なる経路（図６）によって選択したhGH突然変異体
数の結果を表VIIに示す。これら突然変異体の多くが、h
GHbpに対して野生型hGHよりも強い結合親和性を有して
いる。最も改善された突然変異体であるKSYRは、野生型
hGHよりも5.6倍高い結合親和性を有している。これら検
定した突然変異体の中で選択された最も弱い突然変異体
は、hGHに比べて結合親和性が約10倍低いものでしかな
かった。

結合検定は、hPRLbp−結合に対して選択した突然変異
体について実施することもできる。

結合に及ぼす加成および非加成効果 一部の残基において、特定アミノ酸の置換が周囲残基
とは独立した実質的に同じ作用を有している。例えば、
172R/174SのバックグラウンドにおいてF176Yの置換は結
合親和性を2.0倍減少させる（RSFR対RSYR）。同様に、1
72K/174AのバックグラウンドにおいてF176Y突然変異体
（KAYR）の結合親和性は、対応する176F突然変異体［KA
FR;CunninghamおよびWells（1989）］よりも2.9倍弱
い。

他方、いくつかの選択したhGH突然変異体について測
定した結合定数は、残基172、174、176および178におけ
る一部のアミノ酸置換の非加成性の効果を示す。例え
ば、172K/176Yのバックグラウンドにおいて、E174Sの置
換は、E174Aを含有する対応する突然変異体（KAYR）よ
りも3.7倍強固にhGHbpと結合する突然変異体（KSYR）を
与える結果になる。しかし、172R/176Yのバックグラウ
ンドにおいて、これらE174置換の効果は逆になる。この
場合、E174A突然変異体（RAYR）はE174S突然変異体（RS
YR）よりも1.5倍強固に結合する。

このような近接残基における置換の結合に及ぼす非加
成性効果は、いくつかの位置においてランダム化された
ライブラリーから最適突然変異体を選択する手段として
のタンパク質−ファージ結合選択の用途を示すものであ
る。詳細な構造の情報が存在せず、このような選択法が
ないと、最適突然変異体の発見までに多数の置換の組合
せが試されることになるであろう。

実施例IX ホルモン−ファージのヘリックス１ランダム
カセットライブラリーからのhGH突然変異体の選択 実施例VIIIに記載した方法を用いて、hGHbpおよび／
またはhPRLbpへの結合に関与しているhGHの別の領域、
即ちヘリックス１の残基10、14、18、21をphGHam−g3p
ベクター（pS0643としても知られている；実施例VIIIを
参照）におけるランダム突然変異誘発の標的とした。

我々は「アンバー」hGH−g3構築物（phGHam−g3pと呼
ぶ）の使用を選択したが、この理由はそれが結合に対し
てより接近しやすい標的タンパク質hGHを作成するよう
であるためである。このことは、モノクローナル抗体結
合の比較ELISA検定からのデータによって支持される。p
S0132［S.Bass,R.Greene,J.A.Wells,Proteins 8:306（1
990）］およびphGHam−g3の両方から生成したファージ
を、hGHのカルボキシ末端の近くに結合決定基を有する
ことが知られている３種の抗体（Medix2、1B5.G2、およ
び5B7.C10）［B.C.Cunningham,P.Jhurani,P.Ng,J.A.Wel
ls,Science 243:1330（1989）;B.C.CunninghamおよびJ.
A.Wells,Science 244:1081（1989）;L.JinおよびJ.Well
s（未公表の結果）］、ならびにヘリックス１および３
中の決定基を認識する１種の抗体（Medix1）［B.C.Cunn
ingham,P.Jhurani,P.Ng,J.A.Wells,Science 243:1330
（1989）;B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells,Science 24
4:1081（1989）］を用いて試験した。pbGHam−g3からの
ファージミド粒子は、pS0132からのファージミド粒子よ
りも抗体Medix2、1B5.G2および5B7.C10とさらに強く反
応した。特に、pS0132粒子の結合は、Medix1に対する結
合と比較して、Medix2および5B7.C10の両方に対しては
＞2000倍減少し、1B5.G2に対しては＞25倍減少した。一
方、phGHam−g3ファージの結合は、Medix1に対する結合
と比較して、Medix2、1B5.G2および5B7.C10抗体に対し
てそれぞれ約1.5倍、1.2倍および2.3倍弱くなるにすぎ
なかった。

カセット突然変異誘発によるヘリックス１ライブラリー
の作成 アラニン−スキャニング突然変異誘発［B.C.Cunningh
am,P.Jhurani,P.Ng.J.A.Wells,Science 243:1330（198
9）;B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells,Science 244:1081
（1989）,15,16］によって以前に同定されていたヘリッ
クス１中の残基に突然変異を行なって、hGHおよび／ま
たはhPRL受容体（それぞれ、hGHbpおよびhPRLbpと呼
ぶ）の細胞外ドメインの結合を変調させた。カセット突
然変異誘発は実質的に文献［J.A.Wells,M.Vasser,D.B.P
owers,Gene 34:315（1985）］記載のように行なった。
このライブラリーは、オリゴヌクレオチド： 5'−GCC TTT GAC AGG TAC CAG GAG TTT G−3'および 5'−CCA ACT ATA CCA CTC TCG AGG TCT ATT CGA TAA
C−3' をそれぞれ用いる突然変異誘発によって唯一のKpn I（h
GHコドン28のところ）およびXho I（hGHコドン６のとこ
ろ）制限部位（下線部）が挿入されたphGHam−g3［T.A.
Kunkel,J.D.Roberts,R.A.Zakour,Methods Enzymol.154:
367−382］の突然変異体を用いる、４残基を一度にすべ
て突然変異させるカセット突然変異誘発（実施例VIIIを
参照）によって作成した。また、後者のオリゴは＋１の
フレームシフト（下線部の最後のＧ）を導入し、これが
出発ベクターからの翻訳を終止させ、ファージミドライ
ブラリー中の野生型のバックグラウンドを最少にした。
この出発ベクターをpH0508Bと命名した。hGH残基10、1
4、18、21を突然変異させたヘリックス１ライブラリー
は、相補性オリゴヌクレオチド： から調製したカセットを、pH0508Bの大きいXho I−Kpn
Iフラグメントに連結することによって作成した。このK
pn I部位は連結生成物の連結部において破壊され、非突
然変異バックグラウンドの分析に制限酵素消化を使用す
ることを可能にした。

このライブラリーは少なくとも10⁷の別個の形質転換
体を含んでおり、このライブラリーが完全にランダム
（10⁶の異なるコドン組合せ）であるときには、平均し
て約10コピーのそれぞれ可能な突然変異hGH遺伝子が得
られる。Kpn Iを用いる制限分析により、ヘリックス１
ライブラリー構築物の少なくとも80％が挿入されたカセ
ットを含有していることがわかった。

このライブラリーからのhGH−ファージの結合豊富化
を、既述（実施例VIII）のようにオキシラン−ポリアク
リルアミドビーズ（Sigma Chemical Co.）上に固定化し
たhGHbpを用いて行なった。ヘリックス１中の４つの残
基（F10、M14、H18およびH21）が同じように突然変異さ
れ、４および６サイクル後に非野生型コンセンサスが現
れた（表VIII）。ヘリックス１の疎水性面の10位は疎水
性である傾向にあり、一方、親水性面の21および18位は
傾向的にAsnが優勢であり、14位には明白なコンセンサ
スが認められなかった（表IX）。

hGHbpに対するこれらhGH突然変異体の結合定数は、非
サプレッサー大腸菌株16C9中で遊離のホルモン変異体を
発現させ、このタンパク質を精製し、そしてhGHbpから
の標識化wt−hGHの競合置換により検定することによっ
て測定した（実施例VIIIを緩衝）。示したように、いく
つかの突然変異体がwt−hGHが結合するよりもhGHbpに強
く結合する。

実施例Ｘ ホルモン−ファージの豊富化により予め見い
出した突然変異を含むヘリックス４ランダムカセットラ
イブラリーからのhGH変異体の選択 ホルモン−ファージを用いる反復選択による改善された
結合性を有する突然変異タンパク質の設計 hGH進化変異体の新入の非結合相同体を用いる我々の
実験から、多数の独立したアミノ酸置換を組合せること
によって特定受容体との結合に関してhGHの累積して改
善された突然変異体を得ることができると示唆される
［B.C.Cunningham,D.J.Henner,J.A.Wells,Science 247:
1461（1990）;B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 88:3407（1991）;H.B.Lowman,B.C.Cun
ningham,J.A.Wells,J.Biol.Chem.266,印刷中（199
1）］。

hGH受容体にさらに強固に結合することがわかったヘ
リックス4aライブラリーから選択したヘリックス４の二
重突然変異体（E174S/F176Y;実施例VIIIを参照）をさら
に改善する試みにおいて、ヘリックス4bライブラリーを
作成した。E174S/F176Y hGH突然変異体をバックグラウ
ンドの出発ホルモンとして用いて、ヘリックス４の親水
性面上の174および176位の周りの残基に突然変異を行な
った。

カセット突然変異誘発によるヘリックス4bライブラリー
の作成 実質的に文献［J.A.Wells,M.Vasser,D.B.Powers,Gene
34:315（1985）］記載のようにしてカセット突然変異
誘発を行なった。唯一のBstE IIおよびBg III制限部位
が予め挿入されたphGHam−g3（実施例VIII）の突然変異
体を用い、４残基を一度にすべて突然変異させるカセッ
ト突然変異誘発（実施例VIIIを参照）を用いて、E174S/
F176Yバックグラウンド内で残基167、171、175および17
9を突然変異させたヘリックス4bライブラリーを作成し
た。相補性オリゴヌクレオチド： から調製したカセットを、ベクターのBstE II−Bg III
部位に挿入した。このBstE II部位は連結したカセット
において削除された。このヘリックス4bライブラリー由
来の15の選択されなかったクローンを配列決定した。こ
れらのうち、カセット挿入体を欠くものはなく、20％が
フレームシフトしており、７％が非サイレント突然変異
を有していた。

hGHbp豊富化の結果 このライブラリーからのhGH−ファージの結合豊富化
を、既述（実施例VIII）のようにオキシラン−ポリアク
リルアミドビーズ（Sigma Chemical Co.）上に固定化し
たhGHbpを用いて行なった。６サイクルの結合の後に、
合理的かつ明白なコンセンサスが現れた（表XI）。興味
あることに、すべての位置が極性の残基、特にSer、Thr
およびAsnを含有する傾向があった（表XII）。

hGH突然変異体の検定 hGHbpに対するこれらhGH突然変異体の一部の結合定数
を、非サプレッサー大腸菌株16C9中で遊離のホルモン変
異体を発現させ、このタンパク質を精製し、そしてhGHb
pからの標識化wt−hGHの競合置換により検定することに
よって測定した（実施例VIIIを参照）。示したように、
いくつかのヘリックス4b突然変異体のhGHbpに対する結
合親和性はwt−hGHのものよりも強固であった（表XII
I）。

hGH変異体の受容体選択性 最後に、我々は、hPRLbpに結合する能力について、い
くつかの一層強固なhGHbp結合突然変異体の結合親和性
の分析を始めた。E174S/F176Y突然変異体は、hGHに比べ
てhPRLbpに200倍弱く結合する。E174T/F176Y/R178Kおよ
びR167N/D171S/E174S/F176Y/I179T突然変異体のそれぞ
れは、hGHに比べhPRLbpに＞500倍弱く結合する。即ち、
ファージ表示法によってhGHの新規な受容体選択性突然
変異体を得ることができる。

ホルモン−ファージミド選択によって同定される特定残
基の情報内容 ３種のhGH−ファージミドライブラリー（実施例VII
I、IX、Ｘ）において突然変異させた12残基のうち、４
種が野生型残基の強い（他を排除するものではない）保
存を示した（K172、T175、F176およびR178）。驚くべき
ことではないが、Alaに変換したときにhGHbpに対する結
合親和性に最大の破壊（４〜60倍）を引き起こす残基が
存在した。Ala置換が結合に対してより弱い作用（２〜
７倍）を引き起こす一群の４個の他の残基（F10、M14、
D171およびI179）が存在し、これらの位置はわずかの野
生型コンセンサスしか示さなかった。最後に、hPRLbpへ
の結合を促進したがhGHbpへの結合は促進しなかった別
の４残基（H18、H21、R167およびE174）は、hGHbp−ビ
ーズによる選択によって野生型hGH配列に対してどのよ
うなコンセンサスも示さなかった。事実、２つの残基
（E174およびH21）は、Ala置換したときにhGHbpに対す
る結合親和性を２〜４倍に高める［B.C.Cunningham,P.J
hurani,P.Ng.J.A.Wells,Science 243:1330（1989）;B.
C.CunninghamおよびJ.A.Wells,Science 244:1081（198
9）;B.C.Cunningham,D.J.Henner,J.A.Wells,Science 24
7:1461（1990）;B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells,Proc,
Natl.Acad.Sci.USA 88:3407（1991）］。即ち、アラニ
ン−スキャニング突然変異誘発データは、それぞれの位
置を置換する可変性と十分合理的に関係している。事
実、アラニン置換によって引き起こされる結合親和性の
減少［B.C.Cunningham,P.Jhurani,P.Ng,J.A.Wells,Scie
nce 243:1330（1989）;B.C.CunninghamおよびJ.A.Well
s,Science 244:1081（1989）;B.C.Cunningham,D.J.Henn
er,J.A.Wells,Science 247:1461（1990）;B.C.Cunningh
amおよびJ.A.Wells,Proc.Natl.Acad.sci.USA 88:3407
（1991）］は、３〜６ラウンドの選択後にファージミド
プール中に野生型残基が見い出される割合を合理的に予
言するものとなる。アラニン−スキャニングの情報は結
合を変調させる側鎖を標的化するのに有用であり、ファ
ージ選択は側鎖の最適化に、および置換のための各部位
（および／または部位の組合せ）の可変性を定義するの
に適している。スキャニング突然変異法［B.C.Cunningh
am,P.Jhurani,P.Ng,J.A.Wells,Science 243:1330（198
9）;B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells,Science 244:1081
（1989）］とファージ表示の組合せは、受容体−リガン
ドの界面の設計およびインビトロでの分子進化の研究に
対する強力な手段である。

ホルモン−ファージミドライブラリーの反復豊富化の変
異 hGH中の組合せ突然変異が受容体に対する結合親和性
に加成効果を有している場合には、結合を改良するため
のホルモン−ファージミド豊富化により既知となった突
然変異を、単に制限フラグメントの切断と連結または突
然変異誘発によって組合わせてhGHの累積して最適化さ
れた突然変異体を得ることができる。

一方、受容体結合を最適化するhGHの１つの領域にお
ける突然変異が、分子の重なり合うかまたは別の領域に
おける突然変異と構造的または機能的に適合しないこと
もある。このような場合には、以下に挙げる反復豊富化
法のいくつかの変法のいずれかによってホルモン−ファ
ージミド豊富化を行なうことができる：（１）カセット
または他の突然変異誘発法によって分子の２つ（また
は、恐らくはそれ以上）の領域のそれぞれにおいてラン
ダムDNAライブラリーを創製することができる：次い
で、これら２つのDNAライブラリーからの制限フラグメ
ントの連結によって混合ライブラリーを創製することが
できる；（２）分子の１つの領域における突然変異によ
り結合を最適化されたhGH変異体を、ヘリックス4bライ
ブラリーの例のように分子の第２の領域においてランダ
ムに突然変異させることができる；（３）２またはそれ
以上のランダムライブラリーを、ホルモン−ファージミ
ド豊富化により、改善された結合について部分的に選択
することができる：この最適化結合部位の「粗選択」の
後、なお部分的な別のライブラリーを制限フラグメント
の連結によって再混合して、分子の２またはそれ以上の
領域において部分的に異なっている単一のライブラリー
を得ることができ、次いでこのライブラリーをホルモン
−ファージミド豊富化を用いて最適化結合についてさら
に選択することができる。

実施例XI ファージミド表面におけるFab分子の組立て プラスミドの構築 プラスミドpDH188は、HER−２受容体を認識する4D5と
呼ばれるヒト化IgG抗体のFab部分をコードしているDNA
を含有する。このプラスミドは大腸菌株SR101中に含ま
れ、ATCC［Rockville,MD］に寄託されている。

簡単に説明すると、このプラスミドは次のようにして
調製された。出発プラスミドは、上記のアルカリホスフ
ァターゼプロモーターを含有するpS0132である。ヒト成
長ホルモンをコードしているDNAを切り出し、プラスミ
ドの末端を連結に適合するようにする一連の操作を行な
った後、4D5をコードしているDNAを挿入した。この4D5
DNAは２つの遺伝子を含有している。第１の遺伝子は、
軽鎖の可変および不変領域をコードしており、その5'末
端にst IIシグナル配列をコードしているDNAを含有す
る。第２の遺伝子は４つの部分を含有し、その第１は5'
末端のst IIシグナル配列をコードしているDNAである。
これに重鎖の可変ドメインをコードしているDNAが続
き、次いで重鎖不変領域の第１ドメインをコードしてい
るDNAが続き、さらにM13遺伝子IIIをコードしているDNA
が続く。この構築物の顕著な特徴が図10に示されてい
る。4D5をコードしているDNAの配列を図11に示す。

大腸菌の形質転換およびファージの生成 ポリエチレングリコール（PEG）および電気穿孔の両
方を用いて、SR101細胞にプラスミドを導入した。PEGコ
ンピテントな細胞は、ChungおよびMiler［Nucleic Acid
s Res.16:3580（1988）］の方法に従って調製し、形質
転換した。電気穿孔にコンピテントな細胞は、Zabarovs
kyおよびWinberg［Nucleic Acids Res.18:5912（199
0）］の方法に従って調製し、次いで電気穿孔により形
質転換した。SOC培地［Sambrookら（上記）が記載］（1
ml）に細胞を蒔いた後、振盪しながら37℃で１時間増殖
させた。この時点で、細胞濃度をOD₆₀₀の光分散を用い
て測定した。滴定したKO7ファージストックを加えて感
染多重度（MOI）が100となるようにし、このファージを
室温で20分間、細胞に付着させた。次いで、この混合物
を2YTブロス［Sambrookら（上記）が記載］（25ml）中
に希釈し、振盪しながら37℃で一晩インキュベートし
た。翌日、5000xgで10分間遠心することによって細胞を
ペレット化し、上清を集め、0.5M NaClおよび４％PEG
（最終濃度）を用いて室温で10分間、ファージ粒子を沈
澱させた。10,000xgで10分間遠心することによってファ
ージ粒子をペレット化し、TEN［10mMトリス（pH7.6）、
1mM EDTA、および150mM NaCl］（1ml）に再懸濁し、４
℃で保存した。

抗原被覆したプレートの調製 0.1M炭酸水素ナトリウム（pH8.5）中のBSA（対照抗
原）の0.5mg/ml溶液またはHER−２抗原の細胞外ドメイ
ン（EDC）の0.1mg/ml溶液からの0.5mlづつを用いて、Fa
lcon12ウエル組織培養プレートのウエルを被覆した。溶
液をウエルに適用した後、このプレートを揺れ台の上に
て４℃で一晩インキュベートした。次いで、最初の溶液
を除去し、ブロック緩衝液［0.1M炭酸水素ナトリウム中
に30mg/ml BSA］（0.5ml）を適用し、そして室温で１時
間インキュベートすることによって、プレートをブロッ
クした。最後に、このブロック緩衝液を除去し、緩衝液
Ａ［PBS、0.5％BSA、および0.05％ツイーン20］（1ml）
を加え、そしてこのプレートをファージ選択に使用する
まで４℃で10日間まで保存した。

ファージの選択法 約10⁹のファージ粒子を100倍過剰のKO7ヘルパーファ
ージおよび緩衝液Ａ（1ml）と混合した。この混合物を
0.5mlづつ２つに分け、その１つをECD被覆ウエルに適用
し、他方をBSA被覆ウエルに適用した。これらのプレー
トを振盪させながら室温で１〜３時間インキュベート
し、次いで緩衝液Ａ（1mlづつ）を用いて30分間、３回
洗浄した。プレートからのファージの溶離は次の２つの
方法のいずれかにより室温で行なった：（１）0.025mg/
mlの精製Mu4D5抗体（ネズミ）の最初の一晩インキュベ
ートとそれに続いて酸溶離緩衝液［0.2Mグリシン（pH2.
1）、0.5％BSA、および0.05％ツイーン20］（0.5ml）に
よる30分間インキュベート、または（２）酸溶離緩衝液
単独によるインキュベート。次いで、溶出液を1Mトリス
塩基で中和し、TEN（0.5mlづつ）を加えた。次に、これ
ら試料を増殖させ、滴定し、４℃で保存した。

ファージの増殖 溶出したファージの一部を2YTブロス（0.4ml）に加
え、約10⁸の中間対数期雄性大腸菌株SR101と混合した。
ファージを室温で20分間、細胞に付着させ、次いで50μ
g/mlカルベニシリンおよび５μg/mlテトラサイクリンを
含有する2YTブロス（5ml）に加えた。これら細胞を、中
間対数相に到達するまで37℃で４〜８時間増殖させた。
OD₆₀₀を測定し、細胞をファージ生成用のKO7ヘルパーフ
ァージに重感染させた。ファージ粒子を得た後、これら
を滴定してコロニー形成単位（cfu）数を測定した。こ
れは、あるファージストックの連続希釈液の一部を取
り、中間対数期のSR101に感染させ、50νg/mlカルベニ
シリン含有のLBプレートにプレーティングすることによ
り行なった。

RIA親和性の測定 ECD抗原に対するFabファージおよびh4D5 Fabフラグメ
ントの親和性を、競合受容体結合RIA［Burt,D.R.,Recep
tor Binding in Drug Research,O'Brien,R.A.（編）,p
p.3−29,Dekker,New York（1986）］を用いて測定し
た。このECD抗原は連続クロラミン−Ｔ法［De Larco,J.
E.ら,J.Cell.Physiol.109:143−152（1981）］を用いて
¹²⁵Iで標識した。これにより、受容体１モルあたり0.47
モルのヨウ素が導入された14μCi/μｇの比活性を有す
る放射活性トレーサーが得られた。0.5ng（ELISAによ
る）のFabまたはFabファージ、50nCiの¹²⁵I−ECDトレー
サー、およびある範囲量の未標識ECD（6.4ng〜3277ng）
を含有する一連の0.2ml溶液を調製し、室温で一晩イン
キュベートした。標識化ECD−FabまたはECD−Fabファー
ジ コンプレックスを、抗ヒトIgG（Fitzgerald 40−GH
23）と６％PEG8000の添加により誘導される集合コンプ
レックスを形成させることによって、未結合の標識化抗
原から分離した。このコンプレックスを遠心（15,000xg
で20分間）によってペレット化し、標識化ECDの量（cp
m）をガンマカウンターで測定した。解離定数（Kd）
は、スカッチャード分析［Scatchard,G.,Ann.N.Y.Acad.
Sci.51:660−672（1949）］を用いるプログラムLIGAND
の改良バージョン［Munson,P.およびRothbard,D.,Anal.
Biochem.107:220−239（1980）］を用いて計算した。こ
のKd値を図13に示す。

競合細胞結合の検定 ロドゲン法を用い、¹²⁵Iによりネズミ4D5抗体を40〜5
0μCi/μｇの比活性に標識した。一定量の標識化抗体と
増加量の未標識変異Fabを含有する溶液を調製し、96ウ
エル微量滴定皿中のほぼ全面のSK−BR−３細胞培養物に
加えた（標識化抗体の最終濃度は0.1mMであった）。４
℃で一晩インキュベートした後、上清を除去し、細胞を
洗浄し、細胞に結合した放射活性をガンマカウンターで
測定した。プログラムLIGANDの改良バージョン［Munso
n,P.およびRothbard,D.（上記）］を用いてデータを分
析することによってKd値を決定した。

プラスミドpDH188（ATCC No.68663）の寄託は、特許
手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約の規定およびその規則（ブダペスト条約）のもとに為
されている。これにより、寄託日から30年間の生存微生
物の維持が確保されている。この微生物は、ブダペスト
条約の条項のもとで、およびジェネンテク，インコーポ
レイテッドとATCCの間の同意のもとでATCCから入手可能
となるものであり、関連米国特許の発行またはいずれか
の米国もしくは外国特許出願の公開のいずれか早い方に
より、だれでもこの培養物の子孫を永続的かつ制限され
ずに入手可能になることが保証されており、また、35US
C §122に従って権利を付与された米国特許商標庁長官
およびそれに従う規則（886 OG 638に具体的に言及して
いる37 CFR §1.14を含む）によって決定された者に該
子孫が入手可能になることが保証されている。

本出願の譲受人は、寄託微生物が適切な条件下で培養
されたときに死滅しているか、失われているか、または
破壊されているときには、通知により該培養物の生存試
料と速やかに交換することに同意している。寄託培養物
の入手可能性は、各国特許法に従っていずれかの政府の
権限のもとに認可された権利に違反して本発明を実施す
るライセンスと解釈すべきではない。

以上に既述した明細書は、当業者に本発明の実施を可
能ならしめるに十分であると考えられる。寄託が為され
た態様は本発明の特定態様の独立した例示として意図さ
れており、機能的に等価なあらゆる培養物が本発明の範
囲内にあるので、本発明は寄託された微生物によってそ
の範囲を限定されるものではない。本明細書中の物質の
寄託は、本明細書中に含まれる既述が本発明のいずれか
の態様（最良の態様を含む）の実施を可能にするに不適
切であるということを認めたものではなく、また、特許
請求の範囲をその特定の例示に限定することを意図する
ものでもない。実際には、本明細書中で説明および示し
たものに加えて本発明の種々の修飾が上記既述から当業
者には明白になるものであり、これらは添付した請求の
範囲内に入るものである。

必然的に本発明を好ましい態様との関係で説明した
が、上記明細書を読んだ後に当業者なら、本発明の思想
および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載し
た対象に種々の変化、等価置換、変異を加えることがで
きるであろう。即ち、本発明は本明細書に具体的に記載
した方法以外の方法で実施することができる。従って、
本願の特許証により認められる保護は添付した請求の範
囲およびその等価物によってのみ限定されるものであ
る。

実施例XII ヘリックス１およびヘリックス４ ホルモ
ン−ファージ変異体の組合せ体からのhGH変異体の選択 hGHの加成変異体の作成 加成性の原理［J.A.Wells,Biochemistry 29:8509（19
90）］によると、タンパク質の異なる部分の突然変異が
相互に作用を及ぼしていないときであっても、それらを
組合せることによって、別の分子に対する結合の遊離エ
ネルギーにおいて加成的な変化が得られることが予想さ
れる（変化はΔΔG_bindingの点で加法的であるか、また
はKd＝exp［−ΔG/RT］の点で乗法的である）。即ち、
結合親和性において２倍の増加を与える突然変異は、３
倍の増加を引き起こす第２の突然変異と組合せたとき
に、出発変異体の６倍増加した親和性を有する二重突然
変異を与えることが予想される。

hGH−ファージ選択によって得た複数の突然変異がhGH
bp（hGH−結合タンパク質;hGH受容体の細胞外ドメイ
ン）結合において累積的に良好な効果を与えるか否かを
試験するため、ヘリックス１ライブラリーに由来するhG
Hの最も強固に結合する３種の変異体（実施例IX:F10A/M
14W/H18D/H21N、F10H/M14G/H18N/H21N、およびF10F/M14
S/H18F/H21L）に見い出される突然変異を、ヘリックス4
bライブラリーにおいて見い出される最も強固に結合す
る３種の変異体（実施例X:R167N/D171S/T175/I179T、R1
67E/D171S/T175/I179、およびR167N/D171N/T175/I179
T）に見い出される突然変異と組合せた。

１ヘリックス変異体のそれぞれからhGH−ファージミ
ド２本鎖DNA（dsDNA）を単離し、制限酵素EcoR Iおよび
BstX Iで消化した。次いで、それぞれのヘリックス4b変
異体から大きいフラグメントを単離し、それぞれのヘリ
ックス１変異体からの小さいフラグメントと連結して表
XIIIに示す新規な２ヘリックス変異体を得た。さらに、
これら変異体のすべては先のhGH−ファージ結合選択に
おいて得られたE174S/F176Yの突然変異を含有していた
（詳細には実施例Ｘを参照）。

hGHの選択組合せライブラリーの作成 加成性の原理は多数の突然変異の組合せに当てはまる
ようであるが、一部の組合せ（例えば、F176Yを伴うE17
4S）は明らかに非加成性である（実施例VIIIおよびＸを
参照）。例えば、ヘリックス１中に４つの突然変異とヘ
リックス４中に４つの突然変異を有する最も強固に結合
する変異体を確実性をもって同定するためには、理想的
には８残基全部を一度に突然変異させ、次いで全体的に
最も強固に結合する変異体のプールを選別することにな
るであろう。しかし、このようなプールは、2.6x10¹⁰の
異なるポリペプチドをコードしている1.1x10¹²のDNA配
列（NNSコドンの縮重を用いて）からなる。全変異体
（恐らく、10¹³の形質転換体）の表示を確実にするに十
分大きなランダムファージミドライブラリーを得ること
は、現在の形質転換法によっては実際的ではない。

我々は、第１に、連続ラウンドの突然変異誘発を用
い、１つのライブラリーから最も強固に結合する変異を
取り、次いで他の残基を突然変異させてさらに結合を改
善することによってこの難題に取り組んだ（実施例
Ｘ）。第２の方法において、我々は、加成性の原理を用
いて２つの独立して選別したライブラリーからの最良の
突然変異を組合わせて、改善された結合を有する複数の
突然変異体を創製した（上記）。ここで我々は、ランダ
ムまたは部分的ランダム突然変異体の組合せライブラリ
ーを創製することによって、hGH中の10、14、18、21、1
67、171、175、および179位における可能な突然変異の
組合せをさらに探索した。ヘリックス１ライブラリーか
らのプールしたファージミド（独立して０、２または４
サイクル選別；実施例IX）およびヘリックス4bライブラ
リーからのプール（独立して０、２または４サイクル選
別；実施例Ｘ）を用いてhGH−ファージミドの３つの異
なる組合せライブラリーを作成し、この組合せ変異体プ
ールをhGHbp結合について選別した。ある量の配列多様
性がこれらプールのそれぞれに存在するので、得られる
組合せライブラリーは手で作成しうる配列の組合せより
も多くの配列組合せを調べることができる（例えば、表
XIII）。

１ヘリックスライブラリーのプール（０、２または４
ラウンド選択）のそれぞれからhGH−ファージミドの２
本鎖DNA（dsDNA）を単離し、制限酵素Acc IおよびBstX
Iで消化した。次いで、それぞれのヘリックス１変異体
プールから大きいフラグメントを単離し、それぞれのヘ
リックス4b変異体プールからの小さいフラグメントと連
結して、３つの組合せライブラリーpH0707A（実施例IX
およびＸに記載の未選択のヘリックス１およびヘリック
ス4bプール）、pH0707B（２回選択したヘリックス１プ
ールと２回選択したヘリックス4bプール）、およびpH07
07C（４回選択したヘリックス１プールと４回選択した
ヘリックス4bプール）を得た。さらに、より少ないDNA
を用いて同じ連結を行ない、pH0707D、pH0707EおよびpH
0707F（それぞれ、０、２および４ラウンドの出発ライ
ブラリーに対応する）と命名した。また、これら変異体
プールのすべては、先のhGH−ファージ結合選択で得ら
れた突然変異E174S/F176Yを含有していた（詳細につい
ては実施例Ｘを参照）。

hGH−ファージ変異体の組合せライブラリーの選別 連結生成物pH0707A〜Ｆを加工処理し、記載（実施例V
III）のようにXL1−Blue細胞に電気導入した。コロニー
形成単位（CFU）に基づいて、それぞれのプールから得
られた形質転換体の数は次のようであった:pH0707Aから
2.4x10⁶、pH0707Bから1.8x10⁶、pH0707Cから1.6x10⁶、p
H0707Dから8x10⁵、pH0707Eから3x10⁵、およびpH0707Fか
ら4x10⁵。hGH−ファージミド粒子を調製し、実施例VIII
の記載のように２〜７サイクルにわたってhGHbp−結合
について選択した。

hGH−ファージミドライブラリーの迅速な選別 平衡結合親和性によって測定したときの強固に結合す
るタンパク質変異体についてのファージミドライブラリ
ーの選別に加えて、受容体あるいは他の分子に対する結
合のオン−速度（k_on）またはオフ−速度（k_off）のど
ちらかが変化した変異体を選別することも重要である。
熱力学から、これら速度は平衡解離定数Kd＝（k_off/
k_on）に関係している。我々は、特定タンパク質の一部
の変異体は結合に対して類似したKdを有しているが、非
常に異なったk_onおよびk_offを有しているものと想定し
ている。逆に、ある変異体と別の変異体のKdの変化は、
k_onに対する効果、k_offに対する効果、またはその両方
によるものであろう。タンパク質の薬理学的性質は、結
合親和性またはk_onもしくはk_offに依存していることも
ある（作用の詳細な機序に依存する）。ここで我々は、
より高いオン−速度を有するhGH変異体を同定してk_onの
変化の効果を調べようとした。我々は、結合時間を増加
させることによって、ならびに同族リガンド（hGH）に
よる洗浄時間および／または濃縮を増加させることによ
って、選択をk_offの方に選択的に加重することができる
と想定している。

固定化hGHbpに対する野生型hGH−ファージミド結合の
経時分析から、最終のpH2洗浄液中に溶出されうる全hGH
−ファージミド粒子（全体の結合および溶離プロトコー
ルについては実施例VIIIを参照）のうち、10％未満が１
分間のインキュベートの後に結合するが、90％以上は15
分間のインキュベート後に結合するようである。

「迅速な結合選択」のために、pH0707Bプール由来の
ファージミド粒子（ヘリックス１および４に対して独立
して２回選択）を固定化hGHbpと１分間だけインキュベ
ートし、次いで結合緩衝液（1ml）で６回洗浄した［hGH
洗浄工程は削除し、残存するhGH−ファージミド粒子はp
H2（結合緩衝液中の0.2Mグリシン）洗浄液で溶離し
た］。非表示粒子に対するhGH−ファージミド粒子の豊
富化は、短時間の結合を用い、同族リガンド（hGH）チ
ャレンジを用いないときであっても、hGH−ファージミ
ド結合選択がランダム化プールから強固に結合する変異
体を選別することを示した。

hGH突然変異体の検定 これらhGH突然変異体の一部のhGHbpに対する結合定数
を、非サプレッサー大腸菌株16C9または34B8中で遊離の
ホルモン変異体を発現させ、このタンパク質を精製し、
そして放射免疫沈澱検定法におけるhGHbpからの標識化w
t−hGHの競合置換（実施例VIIIを参照）により検定する
ことによって測定した。以下の表XIII−Ａにおいて、す
べての変異体はセリン₁₇₄によって置換されたグルタメ
ート₁₇₄およびチロシン₁₇₆によって置換されたフェニル
アラニン₁₇₆（E174SおよびF176Y）に加えて、hGHアミノ
酸の10、14、18、21、167、171、175および179位に表中
に示した追加の置換を有している。

以下の表XIVにおいて、hGH変異体を、ファージミド結
合選択法によって組合せライブラリーから選択した。表
XIV中のすべてのhGH変異体は２つのバックグラウンド突
然変異（E174S/F176Y）を含んでいる。ライブラリーpH0
707A（パートＡ）、pH0707BおよびpH0707E（パートＢ）
またはpH0707C（パートＣ）からのhGH−ファージミドプ
ールを、hGHbpに対する結合について２〜７サイクルで
選別した。数値Ｐは、それぞれのプールから配列決定し
た１組のクローン中のそれぞれの変異体型の分数発生率
を示す。

以下の表XVにおいて、hGH変異体を、ファージミド結
合選択法によって組合せライブラリーから選択した。表
XV中のすべてのhGH変異体は２つのバックグラウンド突
然変異（E174S/F176Y）を含んでいる。数値Ｐは、４サ
イクルの迅速結合選択の後に配列決定した全クローン中
の特定変異体の分数発生率である。

以下の表XVIにおいて、hGHbp（１〜238）およびMab5
またはMab263のいずれかを用いる¹²⁵I−標識化ホルモン
H0650BDまたは標識化hGHの競合置換によって結合定数を
測定した。変異H0650BDは野生型hGHよりも30倍強固に結
合するようである。

実施例XIII プロテアーゼ基質配列を含有するhGH−フ
ァージと非基質ファージの選択豊富化 実施例Ｉに記載したように、プラスミドpS0132は、余
分のグリシン残基の挿入を伴って遺伝子IIIタンパク質
の残基Pro198に融合したhGHの遺伝子を含有している。
このプラスミドを用いて、hGH−遺伝子III融合産物がフ
ァージ表面に１価で表示されるhGH−ファージ粒子を得
ることができる（実施例IV）。この融合タンパク質は、
可変性リンカー配列によって遺伝子IIIのカルボキシ末
端ドメインに融合した全hGHタンパク質を含有してい
る。

あるタンパク質加水分解酵素の好ましい基質配列を選
択するためにファージ表示法を使用することの可能性を
調べるために、スブチリシンBPN'の遺伝子操作変異体を
用いた［Carter,P.ら,Proteins:Structure,function an
d genetics 6:240−248（1989）］。この変異体（以下
においてはA64SALスブチリシンと呼ぶ）は以下の突然変
異:Ser24Cys、His64Ala、Glu156Ser、Gly169AlaおよびT
yr217Leuを含んでいる。この酵素は必須の触媒残基His6
4を欠いているので、その基質特異性が大きく制限され
ており、ある種のヒスチジン含有基質が優先的に加水分
解される［Carterら,Science 237:394−399（198
7）］。

hGH−基質−ファージベクターの構築 pS0132中のリンカー領域の配列を、オリゴヌクレオチ
ド： を用いて突然変異させ、A64SALスブチリシンの基質配列
を創製した。これにより、タンパク質配列： がhGHと遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメインの間のリン
カー領域中に導入される結果が得られた（上記配列中の
最初のPhe残基はhGHのPhe191である）。

配列： はA64SALスブチリシンの良好な基質であることが既知で
ある［Carterら（1989）；上記］。得られたプラスミド
をpS0640と命名した。

hGH−基質−ファージの選択豊富化 pS0132およびpS0640から導かれるファージミド粒子を
実施例Ｉの記載のように作成した。最初の実験におい
て、それぞれのファージプール（10μｌづつ）を、20mM
トリス−HCl（pH8.6）および2.5M NaClを含有する緩衝
液（100μｌ）中でオキシランビーズ（実施例IIの記載
のように調製:30μｌ）と別々に混合した。結合と洗浄
工程は実施例VIIの記載のように行なった。次いで、こ
のビーズを50nMのA64SALスブチリシンを含むかまたは含
まない同緩衝液（400μｌ）に再懸濁した。10分間イン
キュベートした後、上清を集め、ファージ力価（cfu）
を測定した。表XVIIは、約10倍多い基質含有ファージミ
ド粒子（pS0640）が、酵素の非存在下よりも酵素の存在
下において溶出され、また、酵素の存在下もしくは非存
在下の非基質ファージミド（pS0132）の場合よりも多く
溶出されることを示している。酵素、ファージミドまた
はビーズ濃度の増加はこの比率を変えることはなかっ
た。

選択豊富化法の改良 固定化ファージミドの非特異的溶離を減少させる試み
において、強固に結合するhGH変異体を野生型hGH遺伝子
の代わりにpS0132およびpS0640に導入した。使用したhG
H変異体は実施例XIに記載した変異体（pH0650bp）であ
り、突然変異Phe10Ala、Met14Trp、His18Asp、His21As
n、Arg167Asn、Asp171Ser、Glu174Ser、Phe176Tryおよ
びIle179Thrを含有している。これにより、２つの新規
なファージミド:pDM0390（強固に結合するhGHを含有
し、基質配列を含まない）およびpDM0411（強固に結合
するhGHおよび基質配列Ala−Ala−His−Tyr−Thr−Arg
−Gluを含有する）が構築された。また、結合の洗浄お
よび溶離のプロトコールは次のように変えた： （ｉ）結合:COSTAR 12ウエル組織培養プレートを、0.5m
l/ウエルの炭酸ナトリウム緩衝液（pH10.0）中の２μg/
ml hGHbpで16時間被覆した。次いで、このプレートを、
1ml/ウエルのブロック緩衝液［0.1％w/vウシ血清アルブ
ミンを含有するリン酸緩衝食塩水（PBS）］とともに２
時間インキュベートし、10mMトリス−HCl（pH7.5）、1m
M EDTAおよび100mM NaClを含有する検定緩衝液で洗浄し
た。ファージミドを再び実施例Ｉの記載のように調製
し、ファージプールを上記検定緩衝液で1:4に希釈し、
ウエルあたり0.5mlのファージを２時間インキュベート
した。

（ii）洗浄：このプレートをPBS＋0.05％ツイーン20で
徹底的に洗浄し、この洗浄緩衝液（1ml）とともに30分
間インキュベートした。この洗浄工程を３回繰返した。

（iii）溶離：このプレートを、20mMトリス−HCl（pH8.
6）＋100mM NaClからなる溶離緩衝液中で10分間インキ
ュベートし、次いで500nMのA64SALスブチリシンを含む
かまたは含まない上記緩衝液（0.5ml）でファージを溶
離した。

表XVIIは、pS0640およびpS0132について先に記載した
方法と比較して、特異的に溶出した基質−ファージミド
粒子の割合が劇的に増加したことを示している。この結
果、強固に結合するhGH突然変異体が、野生型hGHに比べ
てhGH結合タンパク質への結合に対して有意に低いオフ
−速度を有していることによるものと考えられる。

実施例XIV 基質配列ライブラリーの選択豊富化を用い
るA64SALスブチリシンの好ましい基質の同定 実施例XIIIに記載した選択的豊富化法を用いてランダ
ム基質配列のライブラリーから良好な基質配列を同定し
ようとした。

ランダム化基質カセットの挿入のためのベクターの構築 ランダム化基質カセットの導入およびその後の基質配
列ライブラリーの発現に適したベクターを設計した。出
発点は実施例VIIIに記載したベクターpS0643であった。
オリゴヌクレオチド： を用いて部位指向性の突然変異誘発を行ない、これによ
ってhGHと遺伝子IIIの間にApa I（GGGCCC）およびSal I
（GTCGAC）制限部位が導入された。この新規な構築物を
pDM0253と命名した（pDM0253の実際の配列は、 であり、下線を引いた塩基の置換は突然変異オリゴヌク
レオチド中の偽錯誤によるものである）。また、pDM041
1（実施例XIII）由来のフラグメントを交換することに
よって、実施例中に記載した強固に結合するhGH変異体
を導入した。得られたライブラリーベクターをpDM0454
と命名した。

ライブラリーカセットベクチーの調製および突然変異カ
セットの挿入 ライブラリーカセットを導入するために、pDM0454をA
pa I、次いでSal Iで消化し、次に13％PEG8000＋10mM M
gCl₂で沈澱させ、70％エタノールで２回洗浄し、再懸濁
した。これによりベクターが効率的に沈澱するが、小さ
いApa I−Sal Iプラグメントが溶液中に残る［Paithank
ar,K.R.およびPrasad,K.S.N.,Nucleic Acids Research
19:1346］。この生成物を１％アガロースゲル上を移動
させ、Apa I−Sal I消化したベクターを切り出し、Band
prepキット（Pharmacia）を用いて精製し、そして突然
変異カセットとの連結用に再懸濁した。

挿入するカセットはpS0640およびpDM0411のリンカー
領域中のDNA配列と同様の配列を含有していたが、ラン
ダム化コドンによって置換された基質配列中のヒスチジ
ンおよびチロシン残基のコドンを有していた。実施例VI
IIに記載したようにランダム化位置のそれぞれにおいて
NNS（Ｎ＝G/A/T/C;S＝G/C）を置換することを選択し
た。突然変異カセット中に用いたオリゴヌクレオチド
は、 であった。また、このカセットはSal I部位を破壊し、
従ってSal Iによる消化を用いてベクター バックグラ
ウンドを減少させることができる。これらオリゴヌクレ
オチドはApa−Salカセット部位への挿入の前にホスホリ
ル化しなかった。この理由は、続いて起こるカセット小
集団のオリゴマー化が複数カセット挿入体による偽の結
果を導くことがあることを恐れたためである。アニール
と連結の後、反応生成物をフ２ェノール：クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱させ、そして水に再懸濁した。
最初は、バックグラウンドベクターを減少させるための
Sal Iによる消化を行なわなかった。実施例VIIIに記載
したように、約200ngをXL1−Blue細胞に電気穿孔導入
し、ファージミドライブラリーを調製した。

基質ライブラリーからの切断されやすい基質の選択 使用した選択法は、実施例XIIIにおいてpDM0411およ
びpDM0390について記載した方法と同じである。各ラウ
ンドの選択の後、実施例VIIIにおいてhGH−ファージに
ついて記載されているように、新鮮なXL1−Blue細胞の
培養物に形質導入し、新しいファージミドライブラリー
を増殖させることによって、溶出したファージを増殖さ
せた。選択法の進行は、溶出ファージの力価の測定およ
び各ラウンドの選択後の個々のクローンの配列決定によ
ってモニターした。

表Ａは、１、２および３ラウンドの選択後の酵素の存
在下および非存在下での溶離に対する連続ファージ力価
を示すものである。特異的に溶出したファージ：非特異
的に溶出したファージ（即ち、酵素を溶いて溶出したフ
ァージ：酵素を用いずに溶出したファージ）の比がラウ
ンド１からラウンド３まで劇的に増加しているのが明ら
かであり、このことは、良好な基質集団が各選択ラウン
ドにつれて増加していることを示唆する。

出発ライブラリーからの10個の単離体の配列決定は、
これらのすべてが野生型pDM0464配列からなることを示
した。このことは、Apa Iによる消化の後にSal I部位が
DNAフラグメントの末端に非常に近接しており、従って
低効率の消化を導くことに起因している。それにもかか
わらず、ライブラリー中に400の可能な配列が存在して
いるにすぎず、従ってこの集団はなお特筆されるべきで
ある。

表B1およびB2は、ラウンド２およびラウンド３の選択
後に得られた単離体の配列を示すものである。２ラウン
ドの選択の後に、ヒスチジン残基の高い発生が明確に存
在する。これは正に予想されていたことである（実施例
XIIIに記載したように、A64SALスブチリシンは基質中に
ヒスチジン残基を必要とするが、この理由はそれが基質
−助力の触媒機序を使用するためである）。３ラウンド
の選択の後に、配列決定した10個のクローンのそれぞれ
がランダム化カセット中にヒスチジンを有している。し
かし、これら配列の２つはpDM0411のものであり、出発
ライブラリー中に存在していなかったものであり、従っ
て不純物であることに注意すべきである。

配 列 表 （１） 一般的情報 （ｉ） 特許出願人：ジェネンテク，インコーポレイ
テッド ゲイラード，ライザ・ジェイ ヘンナー，デニス・ジェイ バース，スティーブン グリーン，ロナルド ロウマン，ヘンリー・ビー ウエルズ，ジェームズ・エー マシューズ，デイビッド・ジェ
イ （ii） 発明の名称：改変された結合性を有する変異
タンパク質の豊富化法 （iii） 配列の数:27 （iv） 連絡先： （Ａ） 名宛人：ジェネンテク，インコーポレイテ
ッド （Ｂ） 通り：ポイント・サン・ブルーノ・ブール
バード460番 （Ｃ） 市：サウス・サン・フランシスコ （Ｄ） 州：カリフォルニア （Ｅ） 国：アメリカ合衆国 （Ｆ） ZIP:94080 （ｖ） コンピューター解読書式： （Ａ） 媒体型:5,25インチ、360Kbフロッピーディ
スク （Ｂ） コンピューター:IBM PC適合 （Ｃ） オペレーティング・システム:PC−DOS/MS
−DOS （Ｄ） ソフトウエア:patin（ジェネンテク） （vi） 本出願のデータ： （Ａ） 出願番号：未 定 （Ｂ） 出願日：本 日 （Ｃ） 分類：未 定 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号:07/743614 （Ｂ） 出願日:1991年８月９日 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号:07/715300 （Ｂ） 出願日:1991年６月14日 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号:07/683400 （Ｂ） 出願日:1991年４月10日 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号:07/621667 （Ｂ） 出願日:1990年12月３日 （viii） 弁理士／代理人情報： （Ａ） 氏名：ベンソン，ロバート・エイチ （Ｂ） 登録番号:30,446 （Ｃ） 参照／整理番号:645P4 （ix） 電話連絡先情報： （Ａ） 電話番号:415/266−1489 （Ｂ） ファックス番号:415/952−9881 （Ｃ） テレックス番号:910/371−7168 （２） 配列番号１の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:36塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号1: （２） 配列番号２の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:36塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号2: （２） 配列番号３の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:33塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号3: （２） 配列番号４の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:30塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号4: （２） 配列番号５の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:24塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号5: （２） 配列番号６の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:23塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号6: （２） 配列番号７の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:21塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号7: （２） 配列番号８の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:63塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号8: （２） 配列番号９の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:24塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号9: （２） 配列番号10の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:33塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号10: （２） 配列番号11の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:36塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号11: （２） 配列番号12の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:36塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号12: （２） 配列番号13の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:12アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号13: （２） 配列番号14の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:27塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号14: （２） 配列番号15の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:38塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号15: （２） 配列番号16の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:30塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号16: （２） 配列番号17の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:66塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号17: （２） 配列番号18の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:64塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号18: （２） 配列番号19の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:25塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号19: （２） 配列番号20の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:33塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号20: （２） 配列番号21の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:66塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号21: （２） 配列番号22の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:58塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号22: （２） 配列番号23の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:65塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号23: （２） 配列番号24の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:64塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号24: （２） 配列番号25の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:2178塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号25: （２） 配列番号26の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:237アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号26: （２） 配列番号27の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:461アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号27:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ７１５，３００ (32)優先日 平成３年６月14日(1991．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 バース，スティーブン アメリカ合衆国カリフォルニア94061、 レッドウッド・シティー、シーラ・スト リート1355番 (72)発明者 グリーン，ロナルド アメリカ合衆国ノース・キャロライナ 27707、ダラム、ノーウッド・アベニュ ー1014番 (72)発明者 ロウマン，ヘンリー・ビー アメリカ合衆国カリフォルニア94547、 ハーキュリーズ、ファルコン・ウェイ 205番 (72)発明者 ウエルズ，ジェームズ・エー アメリカ合衆国カリフォルニア94010、 バーリンゲーム、コロンブス・アベニュ ー1341番 (72)発明者 マシューズ，ディビッド・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア94122、 サン・フランシスコ、ノリエガ・ストリ ート1527番 (56)参考文献 特表 平５−508076（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／2809（ＷＯ，Ａ１) ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒ ｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ，８（1990）ｐ. (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 7/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】融合タンパク質をコードしている遺伝子融
   合体に機能的に結合させた転写調節要素を含有するファ
   ージミド発現ベクターであって、該遺伝子融合体がポリ
   ペプチドをコードしている第１の遺伝子とファージコー
   トタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の
   遺伝子を含有し、そして、 （ａ）該ベクターは成熟コートタンパク質をコードして
   いる遺伝子を含まず、 （ｂ）完全なファージゲノムを含まず、又は （ｃ）該ベクターによる宿主細胞の形質転換はヘルパー
   ファージの不存在下ではファージ粒子を作らず、かつ （ｄ）mRNAの抑制可能な終止コドンをコードしているDN
   Aトリプレットコドンが該第１および第２の遺伝子の融
   合末端の間に挿入されているか、または該遺伝子融合連
   結点に隣接するアミノ酸コード化トリプレットコドンの
   代わりに置換されている ファージミド発現ベクター。
2. 【請求項２】終止コドンがUAG、UAAまたはUGAである請
   求項１に記載のファージミドベクター。
3. 【請求項３】ファージコートタンパク質が、繊維状ファ
   ージの遺伝子IIIによってコードされている請求項１又
   は２に記載のファージミド発現ベクター。
4. 【請求項４】哺乳動物タンパク質がヒトタンパク質であ
   る請求項３に記載のファージミド発現ベクター。
5. 【請求項５】タンパク質が、成長ホルモン、ヒト成長ホ
   ルモン（hGH）、デス−Ｎ−メチオニル ヒト成長ホル
   モン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシ
   ン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリ
   ン、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシ
   ン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（T
   SH）、ロイチナイジング ホルモン（LH）、糖タンパク
   質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、因子VI
   II、抗体、肺表面活性物質、ウロキナーゼ、ストレプト
   キナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ
   −PA）、ボンベシン、因子IX、トロンビン、造血成長因
   子、腫瘍壊死因子αおよびβ、エンケファリナーゼ、ヒ
   ト血清アルブミン、ミュラー阻害物質、マウスゴナドト
   ロピン関連ペプチド、β−ラクタマーゼ、組織因子タン
   パク質、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、
   インテグリン受容体、トロンボポエチン、プロテインＡ
   およびＤ、リウマトイド因子、神経成長因子（NGF−
   β）、血小板成長因子、トランスフォーミング成長因子
   （TGF）;TGF−αおよびTGF−β、インスリン様成長因子
   ＩおよびII、インスリン様成長因子結合タンパク質、CD
   −４、DNアーゼ、潜在性関連ペプチド、エリトロポエチ
   ン、骨誘導因子、インターフェロンα、βおよびγ、コ
   ロニー刺激因子（CSF）、Ｍ−CSF、GM−CSFおよびＧ−C
   SF、インターロイキン（IL）、IL−１、IL−２、IL−
   ３、IL−４、スーパーオキシドジスムターゼ；崩壊促進
   因子、ウイルス抗原、HIVエンベロープタンパク質GP120
   およびGP140、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、Ｂお
   よびＣ、上記タンパク質の１を超えるサブユニットを有
   するタンパク質、免疫グロブリン、ならびにフラグメン
   トからなる群から選択される請求項１〜４のいずれかに
   記載のファージミド発現ベクター。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載のファージ
   ミド発現ベクター、及びコートタンパク質をコードする
   遺伝子を有するヘルパーファージを含有する宿主細胞。
7. 【請求項７】ファージミド粒子が請求項１〜５のいずれ
   かに記載のファージミド発現ベクターの少なくとも一部
   分を含み、その粒子表面に融合タンパク質の２コピー以
   上を表示するファージミド粒子の量又は数が、20％未満
   であるファージミド粒子の群。
8. 【請求項８】新規な結合ポリペプチドを選択するための
   方法であって、 （ａ）請求項１〜５のいずれかに記載のファージミド発
   現ベクターのファミリーを構築し（ここで、ファージミ
   ド発現ベクターは、変異体のポリペプチドをコードする
   変異体の第１遺伝子を含有する）； （ｂ）ファージミド発現ベクターで適当な宿主細胞を形
   質転換し； （ｃ）該形質転換した宿主細胞を、組換えファージミド
   粒子を製造するのに十分な該ファージコートタンパク質
   をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感
   染させ； （ｄ）該発現ベクターの少なくとも一部を含有する組換
   えファージミド粒子の形成に適切でかつ宿主を形質転換
   しうる条件のもと、該形質転換して感染させた宿主細胞
   を培養し（ここで、その粒子表面に融合タンパク質の２
   コピー以上を表示するファージミド粒子の量又は数が、
   20％未満である）； （ｅ）該組換えファージミド粒子を標的分子と接触させ
   て、ファージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子と
   結合させ；そして （ｆ）標的分子に結合するファージミド粒子を未結合の
   粒子から分離する； 工程を含む方法。
9. 【請求項９】請求項８に記載の方法により製造されるフ
   ァージミド粒子の群。
10. 【請求項１０】第１の遺伝子がリンカーアミノ酸配列に
    結合したポリペプチドをコードし、ファージミド発現ベ
    クターが変異体リンカーアミノ酸配列をコードする変異
    体の第１遺伝子を含有する、請求項８に記載の方法であ
    って、工程（ｆ）を、 （ｆ）結合したファージミド粒子を、該結合したファー
    ジミド粒子の少なくとも一部の結合アミノ酸配列を加水
    分解できるプロテアーゼと接触させ；そして （ｇ）加水分解したファージミド粒子を単離し；そして
    場合により、 （ｈ）さらに、適切な宿主細胞を、その加水分解したフ
    ァージミド粒子と接触させ、そして工程（ｄ）〜（ｇ）
    を繰り返すこと； によって置換する請求項８に記載の方法。