JP3107567B2

JP3107567B2 - 基質再生型バイオセンサー

Info

Publication number: JP3107567B2
Application number: JP03508241A
Authority: JP
Inventors: ヒル，ノーマン; キヤス，アンソニー・エドワード・ジヨージ; スミツト，マーク・ハーバート
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1990-05-01
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 2000-11-13
Anticipated expiration: 2015-11-13
Also published as: DK0532516T3; GB2258530B; GB2258530A; GB9221838D0; GB9009761D0; DE69119766T2; ATE138416T1; DE69119766D1; WO1991017259A1; US5496452A; EP0532516A1; JPH05507195A; EP0532516B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、特に、ただし非限定的にシアン化物の感知
に用いられる基質再生型バイオセンサーに基づく検出の
方法及び装置に係わる。シアン化物を検出し、その濃度
を測定する方法は様々なものが考案されており、それら
の中には高感度比色法、電気化学的分析法、並びに原子
吸光分析及びコンピュータ援用パターン識別のように精
巧な機器類を必要とする諸方法が含まれる。しかし、シ
アン化物の精製または揮発を要する操作の多くには、シ
アン化物を検出測定するうえでの問題点が幾つか内在す
る。そのうえ、ほとんどの方法が特異性の欠如と干渉の
問題とを免れない。連続的な監視の方法に物理学的技術
を応用することがなお求められている。

シトクロム酸化酵素の生化学的活性に対するシアン化
物の毒性に基づくシアン化物用バイオセンサーが研究さ
れている。ミトコンドリアの電子伝達系の末端成分であ
るシトクロム酸化酵素に結合することによって、シアン
化物は電子伝達をブロックし、従って呼吸鎖における電
子流を停止する。

シトクロム酸化酵素の電気化学的活性を監視すること
により、電流が阻止されることからシアン化物、硫化物
及びアジ化物のような毒性化合物の存在を検出し得る。
シトクロム酸化酵素に基づくような酵素阻害センサー
は、信号が電子伝達限定的でなく酵素限定的であるとい
う前提で機能し、即ち該センサーは酵素活性の変化に感
応する。

残念ながら、酵素阻害センサーは酵素及び特異的酵素
阻害物質の非特異的変性の影響を被り、前記変性は酵素
から発せられる信号を酵素阻害物質が存在しない場合も
漸次減少させ、またセンサーの寿命を制限する。そのう
え、基質使用の結果、基質が尽きるとバイオセンサーが
故障しかねない。

即ち、シアン化物のような毒素の濃度を検出測定する
方法であって、上述の諸方法の欠点を克服するか、少な
くとも緩和する方法が必要とされている。従って本発明
は、酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の濃度を検出測
定する方法であって、（ａ）前記毒素と結合するとその電子伝達活性を阻害
されるペルオキシダーゼ、カタラーゼ及びオキシゲナー
ゼの中から選択した酵素を環境中に存在させるステッ
プ、（ｂ）前記酵素を酸化する過酸化水素を環境中に存在
させるステップ、（ｃ）酸化した酵素を電子伝達物質で還元し、その過
程で電子伝達物質を酸化するステップ、（ｄ）電子伝達物質が酸化状態から再生される変化及
び程度によって阻害毒素の存在及び濃度を検出するステ
ップを含む方法を提供する。

電子伝達物質の再生能力は酵素の電子伝達物質酸化能
力に依存するので、両者の間には相関関係が成り立つ。
酵素の電子伝達活性が電気的に能動的または受動的な干
渉体（interferents）に阻害されて低下する酵素限定的
な系では、酸化された電子伝達物質は比較的少量しか元
の還元状態へと再生されないという結果がみられる。従
って、電子伝達物質は酵素の電子伝達活性を阻害する毒
性を有する化合物用の検出器の基盤を成す。電子伝達物
質の再生レベルの低下を見いだすことによって検出を行
ない、また電子伝達物質の再生が酵素阻害によって影響
される程度を、存在する酵素阻害物質の濃度の指標とす
る。

好ましくは、酵素はペルオキシダーゼとする。

好ましい環境は、溶解した酸素から過酸化水素が生じ
るような水性の環境であり、過酸化水素は酵素の酸化レ
ベルが上昇すると実質的に還元されて水となる。環境は
有機性等とすることも可能だが、いずれにしても、外部
の供給源から追加しなくともよいだけの過酸化水素を生
じさせる十分なプロトン及び溶解酸素を用意し得る環境
が好ましい。好ましくは、酸素の過酸化水素への還元は
一次電極において生起させ、電子伝達物質の再生は二次
電極において生起させる。一次電極での過酸化水素発生
の速度は印加電圧によって制御する。電子伝達物質再生
の結果として二次電極に生じる電流は酵素の触媒状態を
示唆し、従って毒素による阻害のレベルを示唆する。

好ましくは、水溶液は酸素を大気か、またはいずれか
他の供給源から、一次電極が基質の過酸化水素を連続的
に発生し、かつ二次電極が電子伝達物質の再生を保証す
るように吸収し得る。酸素供給源が大気である場合は水
溶液を緩衝することが好ましい。この種のセンサーは従
って自律的であり得、恒常的な保守及び補充を必要とし
ない。

酵素の触媒活性はその基質にきわめて特異的であるの
で、それは酵素の触媒活性を阻害する特異的化合物の存
在に非常に敏感であり得る。従って、本発明の方法は化
合物の検出において非常に特異的にすることができ、そ
の際用いる酵素は、検出を必要とする化合物が酵素の活
性に対して有する阻害作用との関連で選択する。更に、
酵素に対して高い毒性を示す化合物はより低い毒性を示
す化合物に比べてより深刻な影響を酵素活性に及ぼし、
従って電子伝達物質の再生にもより多く影響するので、
より容易に検出できる。

本発明のバイオセンサーは、主に気相中の毒素に用い
るべく企図されている。しかし、毒素は、最終的に酵素
活性を阻害し得るのであれば、気相中でなく液相または
固相中に存在してもよい。

用いる酵素を固定すれば、酵素の触媒活性をより良く
制御し、かつバイオセンサーの寿命を延長するうえで好
都合である。酵素を一次電極に固定することによって二
次電極へのタンパク質付着を防止し得、かつ酵素を特定
の地点に限定配置することで触媒活性をより良く制御す
ることが可能となる。酵素を二次電極に固定した場合
は、一次電極に固定した場合に起こりがちなフェリシニ
ウムの減少が制限されるという利点が得られる。場合に
よっては、酵素を一次及び二次電極以外のいずれかの地
点に固定することが好ましくなり得る。

酵素の固定によって電極の効率も上昇し得、即ちバイ
オセンサーの検出部の小型化が可能となる。

酵素の固定は、好ましくはウシ血清アルブミン（BS
A）リンカーを用いて行ない、それによってアミノ酸が
電極に直接付着するのを回避する。この措置は酵素の変
性を低減するという利点を有し得る。

好ましくは酵素をBSAに、予めNaIO₄で酸化した炭水化
物分子を介して結合させる。炭水化物の付着には、酵素
の活性部位への基質の拡散を制限してしまう危険が減少
するようにして酵素を固定できるという利点が有る。そ
のうえ、酵素の大型の炭水化物複合体は多数の固定化部
位を有し得、このことは酵素を電極上で不動化及び安定
化する一助となる。BSAリンカーは、酵素を還元電位か
ら保護するタンパク質クッションを創出するという更に
別の利点を有し、その際BSAリンカーは電極表面の電気
化学特性（pH変化など）のために緩衝性のミクロ環境を
整え、また電子伝達物質が電極において直接還元される
のを防止する。

くわえて、検出系に電子伝達物質を別途添加しなくと
もよいように、電子伝達物質をペルオキシダーゼであり
得る酵素に結合させることも可能である。それによっ
て、電極と、酵素と、電子伝達物質とが互いに結合した
より一体的な検出系を開発することが可能となる。電子
伝達物質としてアミノフェロセンを固定することは、酵
素と結合した炭水化物基を過ヨウ化ナトリウムで酸化
し、かつアミノフェロセンと反応させてシッフ塩基を形
成することによって達成し得る。不安定な上記イミン
は、次いでホウ水素化ナトリウムで還元する。

本発明の発明者は、シアン化物を検出しなければなら
ない場合、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HR
P）が好ましいことを発見した。HRPは、固定すると非常
に安定となり、また高純度製剤として市販されていると
いう点で有利である。

HRPバイオセンサーの全酵素反応は、次のように表わ
すことができる。

化合物１はHRPの酸化形態で、静止状態より二つ高い
酸化状態に有る。この酵素を電子伝達物質［Ｄ（re
d）］で還元して化合物２とし、その後静止状態とす
る。

電子伝達物質は好ましくはメタロセン化合物である。
理想的には、電子伝達物質はフェロセンまたはフェロセ
ン類似体である。フェロセンの利点は、二次電極におい
て容易に還元できること、及び還元形態で安定であるこ
とである。そのうえ、フェロセンは光やpHに感応しな
い。

フェロセンの特に有用な特徴は、多くの類似体の合成
を可能にする構造を有することであり、従ってフェロセ
ンは、特定酵素に対して電気的に活性な電子供与体とす
ることができる。HRPと共に用いるうえで好ましいフェ
ロセン誘導体は、ヒドロキシメチルフェロセン、モノカ
ルボキシレートフェロセン、ジメチルアミノメチルフェ
ロセン及び1,1′−ジカルボキシレートフェロセンであ
る。

過酸化水素発生のために一次電極において還元電流を
用いることにより、再生フェロセンは、二次電極の陰極
電流に表われる酵素酸化を経てのみ生じる。

検出及び測定は、二次電極電流の抑制を定常状態の速
度論でか、または結合方程式で解析することによって実
施し得る。

系のpHは検出方法に適した酵素活性のための限界値以
内に選択するべきであり、HRPを用いる場合はpH5〜８が
好ましい。理想的なpHは、酵素が最も安定となる７であ
る。

系の作業可能温度が５〜40℃であり得るが、系の温度
を前記範囲の中程から上限の値に近付けると、化学平衡
をより迅速に達成できるので好ましい。

HRPに基づく上述のような水性系を用いれば、二次電
極におけるフェロセン再生電流の抑制によって、シアン
化物のサブマイクロモル濃度（ppb）を最適条件下に検
出し得る。

導入シアン化物の検出に掛かる典型的応答時間は１秒
未満である。シアン化物検出速度を制限する要因は、気
相から水相中への拡散である。

シアン化物のHRPへの結合が可逆的反応であるため、
本発明のセンサーはシアン化物の検出に繰り返し用いる
ことができ、また本発明によるセンサーはその固有の安
定性ゆえに、６ヵ月を越える長期にわたって安定に作動
させ得る。

本発明はまた、酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の
濃度を検出測定するバイオセンサーも提供し、このセン
サーは（ｉ）過酸化水素発生手段と、（ii）（ｉ）によって酸化され得る、ペルオキシダー
ゼ、カタラーゼ及びオキシゲナーゼの中から選択された
酵素と、（iii）酸化された酵素（ii）を還元し得る電子伝達
物質と、（iv）電子伝達物質再生手段と、（ｖ）電子伝達物質が酸化状態から再生される変化及
び程度を検出する手段とを含む。

上記バイオセンサーは基質再生を利用する本発明の検
出測定方法に則って機能するので、先に述べた本発明方
法の様々な例はバイオセンサー自体に関連付けて適用可
能であり、従ってそれらを細部まで繰り返して説明する
必要は無い。

好ましい酵素はペルオキシダーゼである。特に好まし
い酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである。

過酸化水素は好ましくは、酵素及び電子伝達物質を含
有する溶液から発生される。溶液は水性であることが好
ましい。

電子伝達物質は好ましくはメタロセン化合物であり、
理想的にはフェロセンまたはフェロセン類似体である。

好ましくは、過酸化水素発生手段及び電子伝達物質再
生手段は電極である。用いられる電極システムは回転リ
ング−ディスク電極（RRDE）であり得る。あるいは他の
場合には、噛み合い型（interdigitated type）やマイ
クロバンド型の電極を用いることも可能である。噛み合
い型電極を用いることは、該電極が高い集電効率を有す
る点で有利である。RRDEではディスクが一次電極を構成
し、好ましくは少なくとも表面が酸化炭素から成る。酸
化炭素電極が用いられた場合、BSAは電極にカルボジイ
ミド活性化によって固定され得る。電極への溶液移送は
ディスクの回転速度によって制御され、その際溶液は実
質的にディスクの回転運動によってディスクから二次電
極リングへと移送される。

本発明の非限定的な例を、添付図面を参照しつつ以下
に詳述する。

第１図は２個の作用電極を用いるHRP活性監視の説明
図である。

第２図は回転リング−ディスク電極の表面で生起する
第１図の反応を示す。

第３図は、リングを0Vに維持し、走査速度を0.1V/sと
し、電極（ディスク）回転速度を4cpsとし、かつ0.3mM
のヒドロキシメチルフェロセンと、1.25μＭのHRPと、
0.1MのKClと、0.05Mの緩衝液KHPO₄（pH7）とを存在させ
た時にリング−ディスク電極の一次及び二次電極で得ら
れる電流のグラフである。

第４図は、1mMのヒドロキシメチルフェロセンと、2.5
μＭのHRPとが存在し、かつ0.1V/sのディスク電位掃引
においてディスク電位が−1.2Vとなった時に一次電極
（ディスク）回転速度が二次電極（リング）電流に及ぼ
す影響を示す。

第５図はフェロセンの酵素酸化を電流測定手段及び分
光測定手段で測定した結果を示す。電流測定解析では1.
25μＭのHRPと0.3mMのヒドロキシメチルフェロセンとを
存在させ、分光測光アッセイでは1.25μＭのHRPと0.5mM
のヒドロキシメチルフェロセンと、10mMのH₂O₂とを存在
させた。緩衝液としてpH3〜5.5の酢酸塩と、pH5〜7.5の
リン酸カリウムと、pH7〜９のTrisとを50mMずつ用い
た。

第６図はシアン化カリウム導入後に残存する部分的リ
ング電流を示す。ヒドロキシメチルフェロセン0.3mM、H
RP 2.5μＭ、ディスク電位−1.2V、ディスク掃引0.1V/
s、及びリング電位0V。電流はシアン化物添加後に１分
間平衡化を行なってから測定した。

第７図は、第４図に示したデータを方程式％ I/［CN］＝−％ I/K₁＋I_max/K₁ を用いてScatchcard解析した結果を示す。点は５回の測
定の平均値を表わし、標準偏差を加えて表示されてい
る。K₁は、50％阻害に必要なシアン化物の自由濃度であ
る。

第８図は、1.25μＭのHRPと、0.3mMのヒドロキシメチ
ルフェロセンとの存在下にディスク電位によって決定さ
れる様々なH₂O₂発生速度において測定した、シアン化物
に関する阻害定数を示す。

第９図は閉ループ型シアン化物センサーを示す。

第１図及び第２図に関して、双対作用電極系（１）は
回転リング−ディスク電極（RRDE）を含み、この電極の
回転ディスクは一次電極（２）を、またリングは二次電
極（３）を構成する。一次電極（２）はガラス状炭素デ
ィスクとして形成され、かつアラルダイト（登録商標）
またはKel−Ｆによって密に包囲されており、前記ディ
スクの直径は0.7cmである。二次電極（３）は白金リン
グとして形成され、かつやはりアラルダイトまたはKel
−Ｆによって密に包囲されており、この電極は0.75cmの
内径と0.8cmの外径とを有し、0.05cmスペーサーによっ
てディスクから隔てられている。両電極は0.3μｍ酸化
アルミニウムのスラリーで研磨され、その後水浴中で音
波処理される。装置のその他の構成要素については図面
を参照せずに説明する。

場合によってはコンピューター制御される四電極アナ
ログポテンシオスタット（図示せず）が、作用電極
（２）及び（３）の電位を制御するのに用いられる。デ
ィスク電極（２）は電位掃引のための三角波発生器（図
示せず）と接続されており、リング電極（３）は定DC電
圧源と接続されている。電極の回転はUrsar Scientific
回転装置によって制御される。電位はいずれも、対極と
して用いられる、1cm²白金網を具備した飽和カロメル電
極（SCE）との関連で採用される。

電極（２）、（３）は容量５〜10mlの電気化学的セル
内に装入されており、前記セルは温度調整用の水ジャケ
ットを具備し、かつ水浴から水を供給されている。電極
は、溶液の抵抗を最小限とするように配置されている。
使用時、フェロセンモノカルボキシレートを用いた実験
によって集電効率を測定したところ0.16となり、この値
は予想値に一致した。Biozyme社から高純度製剤（RZ＞
3.0）として得られるセイヨウワサビペルオキシダーゼ
（HRP）の純度を、SDSゲル電気泳動によって測定した。
酵素の濃度は90,000M^-1cm^-1の消衰係数を用いて、403nm
での吸光から測定した。Kodak社から得られるヒドロキ
シメチルフェロセンは、重量に基づき所望の濃度とし
た。溶解酵素をWinker法で測定したところ240μＭとな
り、この値はノモグラムから得られる値に一致した。

実験は総て22℃で実施した。

ガラス状炭素ディスクを、Bourdillon,J.Am.Chem.So
c.106,pp.4701−4706,1984に述べられているような、化
学的技術と電気化学的技術との組み合わせによって活性
化した。ディスクを30秒間＋2.2Vに維持し、その間白金
リングを−0.2Vに維持した。電極を0.5M NaKPO₄溶液（p
H7）中に移し、白金リングを−0.3Vと＋1.0Vとの間での
サイクリングによって、安定なボルタモグラムが得られ
るまで数時間クリーニングした。その後、ディスクをカ
ルボジイミド［0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）中
に0.1M存在］で活性化した（１時間）。脱イオン水で洗
浄後、電極を、Sigma社から得られるウシ血清アルブミ
ン（BSA）を0.1M酢酸ナトリウム（pH5.0）に20mg/mlの
量で溶解させた溶液に２時間浸漬した。HRPのグリコシ
ド部分をNaIO₄［0.1M NaHCO₃中に8mM存在（pH8.3）］で
２時間酸化し、未反応のNaIO₄を、エタンジオールを過
剰に添加してからこのタンパク質をセファデックスＧ−
25カラムに通すことによって除去した。BSA改変電極を
酸化ペルオキシダーゼ溶液に浸漬し、0.1M重炭酸ナトリ
ウム緩衝液（pH9.0）中で２時間低速で回転した。この
結果得られた、BSAをHRPに連結するイミン結合を5mg/ml
HaBH₄溶液100mlで１時間還元し、この還元を１回繰り
返した。電極を0.1M NaKPO₄中で回転し、かつリングに
−0.3Vと＋1.0Vとの間でのサイクリングを２時間施し
て、弱く吸収されたタンパク質の離脱を助長した。

酵素改変電極を比色法によって、ペルオキシダーゼ活
性について解析した。電極をアッセイ混合物に浸漬し、
いかなる拡散制限も克服する速度（＞20rpm）で回転し
た。単一波長において、吸光度の変化を分光光度計で監
視した。このように、電極を、固定したタンパク質の量
ではなく活性に関して試験した。固定酵素の、その活性
に基づいて決まる量は約２×10^-13mol/cm²で、これは他
の固定法によって得られる濃度に類似する。

第１図及び第２図に示したHRPの電極触媒活性は典型
的には、ペルオキシダーゼ及びヒドロキシメチルフェロ
セン媒介物質を含有する緩衝溶液に回転リング−ディス
ク電極を浸漬することによって評価した。電極を一定速
度で回転し、それによって、ディスク電極に向かい、そ
の後更にリングへと向かう物質の移動を制御した。ガラ
ス状炭素ディスクにカソード電位掃引を、0.1V/sで適用
した。白金リングを0Vの一定電圧に維持し、ディスク電
位に従属してリングに発生する電流を測定した。ペルオ
キシダーゼによって発生されるリング電流を測定する前
に、電極浸漬に続いてリング電流（背景電流）を安定化
した（約５分間）。その後、酵素によって酸化された媒
介物質の還元がもたらすカソードリング電流を、分子状
酸素の部分的な還元を惹起するディスク電位において測
定した。触媒電流を、ディスク電位0Vで起きる正味の還
元電流と定義した。

リング電極においてみられる還元電流の実際のプロフ
ィールは、酵素及び基質の濃度、並びにディスクの回転
速度、ディスクにおける掃引速度、及びリングの電位の
関数である。この還元電流の強さは、酵素によって発生
されるフェリシニウム（酸化されたフェロセン）の、実
際にリングに到達する部分にも依存する。

第３図は、リング電流をディスク電位の関数として表
わしたグラフである。実際はリングにおけるフェロセン
の還元を示し、点線はディスクにおける酸素の還元を示
す（×10^-2）。ディスクがよりカソード的になるにつれ
て、リングでは別個のファラデー活性領域が実現する。
まず、水平である線（ａ）は、フェロセンによって媒介
される電気的活性がリングに存在しないことを示してい
る。−0.3Vよりも小さい負電位（ｂ）では、ディスクで
の還元が進むほどカソードリング電流は強まる。この電
流強化はディスクでの過酸化水素発生に正比例する。過
酸化物発生速度が上昇するにつれて、リング電流の強さ
は酵素の反応速度によって制御されるようになる。即
ち、区域（ｃ）では酵素反応速度が電流プロフィールを
支配し、フェリシニウムからのフェロセン再生によって
生じる電流はHRPの酵素反応速度によって支配される。

表Ｉに掲げた数種のフェロセンを、HRP還元のための
媒介物質として機能する能力について試験した。HRP 2.
5μＭ及びディスク電位−1.2Vにおいて得られる、フェ
ロセンの構造と酸化還元電位とに従属するリング電流が
明示される。表Ｉ中、Ep_1/2は酸化還元電位であり、こ
のデータは発生される電流と酸化還元電位との間に関連
性が無く、従って還元剤のフェロセンは酸化されやすい
という理由のみで媒介物質として選択されるべきでない
ということを明示している。

HRP、ヒドロキシメチルフェロセン、過酸化水素及び
緩衝液の存在下にフェロセン酸化速度を測定する分光測
定アッセイを実施し、吸光度変化の速度をPhilips PU 8
720分光光度計を用いて330nmにおいて監視した。

回転速度がリング電流に及ぼす影響を測定したとこ
ろ、回転速度を上げるとリング電流が弱まることが判明
した。第４図に示した条件下では、2cpsの回転速度にお
いて最強の電流が得られた。回転速度が2cps未満の時の
リング電流は集電効率の低下によって複雑化した。

電流は、酸素還元によって制限される反応速度の優位
性が向上することによっても弱まった。従ってほとんど
の実験を、リングに向かう良好なフェリシニウム流と、
溶液中での酵素反応にとって十分な遷移時間との両方が
得られる4cpsの回転速度で実施した。

第５図はpHがリング電流に及ぼす影響を示しており、
この図によればpH4の時応答が最大となる。しかし、好
ましいpH値として選択したのは7.0で、なぜならこの値
ではリング電流があまり変動せず、しかも酵素の安定性
が改善されるからである。

HRPによって発生されるリング電流にシアン化物が及
ぼす抑制作用を、定常条件下に測定した。シアン化物を
ストック溶液から電気化学的系に添加し、結合を平衡に
達するまで進行させた（約30秒間）。反応速度が基質の
酸化によって制限される条件下に発生されたリング電流
を、ディスクに0Vと−1.2Vとの間でのサイクリングを施
すことによって測定した。0Vにおいて起きるリング電流
を減算することによって、H₂O₂発生領域におけるHRPの
触媒活性によってもたらされる正味リング電流を決定し
た。即ち、リング電流はHRPのフェロセン酸化能力の直
接の測定値となる。

第６図は、シアン化物が触媒反応に基づくリング電流
に及ぼす影響を示す。リング電流の抑制は、全電流の抑
制パーセンテージとして表わすことにより標準化でき
る。得られる結果は、何よりもまず結合方程式を用いて
解析し得る。シアン化物がHRPと一対一の塩基で結合
し、錯体形成は電流の抑制に正比例すると仮定すれば、となり、その際（CN）は酵素阻害物質の自由濃度［（C
N）＝（CN）_Ｔ−（HRP−CN）で、（CN）_Ｔは添加シアン
化物の総量］であり、また上記式から（HRP−CN）＝（H
RP）_Ｔ×抑制％である。

第７図は、典型的な一組のデータのScatchcard解析を
示す。K₁はシアン化物に関する見掛けの阻害定数であ
る。阻害曲線からK₁を、線形及び非線形回帰法の両方で
求めたところ、約２μＭであった。この濃度は52×10^-6
mg/mlもしくは52ppbに対応する。

第８図は、シアン化物に関する見掛けの阻害定数K₁の
値をディスク電位の関数として示す。負数であるディス
ク電位値がより小さくなるにつれて、K₁の値も小さくな
る。過酸化水素の発生が少ないという条件の下では、リ
ング電流はディスク電流に比例し、過剰な酵素が存在す
る。即ち、リング電流は発生する過酸化物によって決定
され、電流抑制は酵素阻害に比例しない。ディスク電位
が−0.8Vを下回ると、シアン化物によるHRP阻害は最高
効率に達する。

改変電極は、pH7の1Mリン酸塩緩衝液中で保存した場
合６ヵ月より長期にわたって安定なままであることが判
明した。

第９図は、閉ループ型シアン化物センサーの一例を示
す。表面積の大きい気体透過膜（４）を通過して、過酸
化水素発生に必要な酸素、及びシアン化物がセンサーに
進入する。これらの気体は溶液に溶解し、溶液はポンプ
（５）によって一次電極（２）と二次電極（３）との間
を、矢印で示したように連続的に移送される。HRP（図
示せず）の結合した一次電極は過酸化水素を発生する。
二次電極は、過酸化水素によって酸化されたHRPによる
フェロセンの酸化によって生じたフェリシニウムを検出
する。メーター（６）はフェロセンのフェリシニウムへ
の転換度を、フェロセンに戻す還元の際に流れる電流に
よって示す。第三の電極（７）は、未反応の過酸化物や
未還元のフェリシニウム等を探し出す。この電極は一次
及び二次電極の下流に配置されているが、気体透過膜よ
りは上流に位置する。環境気体に対して開かれているこ
の自足型系はHRP酵素活性の阻害によって、シアン化物
または類似の阻害性気体の存在及び濃度を検出し得る。

本発明に従って生産される検出装置は、連続的な監視
を行ない得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３０１Ｇ 27/416 27/30 ３５３Ｒ (72)発明者キヤス，アンソニー・エドワード・ジヨージイギリス国、ロンドン・エス・ダブリユ・12・９・アール・ダブリユ、ベルサム、フエーンリー・ロード・108 (72)発明者スミツト，マーク・ハーバートイギリス国、ロンドン・エス・ダブリユ・７、ケンジントン、センター・オブ・バイオテクノロジー、インペリアル・カレツジ・オブ・サイエンス（番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66 G01N 27/30 - 27/416 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の濃度
を検出測定する方法であって、前記毒素がシアン化物、
硫化物及びアジ化物より成る群から選択され、（ａ）前記毒素と結合するとその電子伝達活性を阻害さ
れるペルオキシダーゼ、カタラーゼ及びオキシゲナーゼ
の中から選択した酵素を環境中に存在させるステップ、（ｂ）前記酵素を酸化する過酸化水素を環境中に存在さ
せるステップ、（ｃ）酸化した酵素を電子伝達物質で還元し、その過程
で電子伝達物質を酸化するステップ、（ｄ）電子伝達物質が酸化状態から再生される変化及び
程度によって阻害毒素の存在及び濃度を検出するステッ
プを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】酵素がペルオキシダーゼであることを特徴
とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】環境が水性環境であることを特徴とする請
求項１に記載の方法。
【請求項４】水性環境を緩衝することを特徴とする請求
項３に記載の方法。
【請求項５】酸素の過酸化水素への還元を一次電極にお
いて生起させ、電子伝達物質の再生を二次電極において
生起させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】用いる酵素を固定してその触媒活性をより
良く制御し、かつバイオセンサーの寿命を延長すること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】酵素を一次電極に固定することを特徴とす
る請求項６に記載の方法。
【請求項８】酵素の固定をウシ血清アルブミン（BSA）
リンカーを用いて行なうことを特徴とする請求項７に記
載の方法。
【請求項９】酵素をBSAに、予めNaIO₄で酸化した炭水化
物分子を介して結合させることを特徴とする請求項８に
記載の方法。
【請求項１０】酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼ
であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】電子伝達物質がメタロセン化合物である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】電子伝達物質がフェロセンまたはフェロ
セン類似体であることを特徴とする請求項11に記載の方
法。
【請求項１３】電子伝達物質をヒドロキシメチルフェロ
セン、モノカルボキシレートフェロセン、ジメチルアミ
ノメチルフェロセン及び1,1′−ジカルボキシレートフ
ェロセンの中から選択することを特徴とする請求項12に
記載の方法。
【請求項１４】電子伝達物質がヒドロキシメチルフェロ
センであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
【請求項１５】pHが５〜８であることを特徴とする請求
項10に記載の方法。
【請求項１６】pHが７であることを特徴とする請求項15
に記載の方法。
【請求項１７】系の作業可能温度が５〜40℃であること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】酵素の電子伝達活性を阻害する毒素の濃
度を検出測定するバイオセンサーであって、前記毒素が
シアン化物、硫化物及びアジ化物より成る群から選択さ
れ、（ｉ）過酸化水素発生手段と、（ii）（ｉ）によって酸化され得る、ペルオキシダー
ゼ、カタラーゼ及びオキシゲナーゼの中から選択された
酵素と、（iii）酸化された酵素（ii）を還元し得る電子伝達物
質と、（iv）電子伝達物質再生手段と、（ｖ）電子伝達物質が酸化状態から再生される変化及び
程度を検出する手段とを含むバイオセンサー。
【請求項１９】酵素がペルオキシダーゼであることを特
徴とする請求項18に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼ
であることを特徴とする請求項19に記載のバイオセンサ
ー。
【請求項２１】酵素及び電子伝達物質が水性環境中に存
在することを特徴とする請求項18に記載のバイオセンサ
ー。
【請求項２２】過酸化水素が酵素及び電子伝達物質を含
有する溶液から発生されることを特徴とする請求項21に
記載のバイオセンサー。
【請求項２３】過酸化水素発生手段及び電子伝達物質再
生手段が電極であることを特徴とする請求項18に記載の
バイオセンサー。
【請求項２４】用いられる電極システムが回転リング−
ディスク電極（RRDE）であることを特徴とする請求項23
に記載のバイオセンサー。