JP3176373B2 - ポリマー含有溶液を使用する生体分子のキャピラリー電気泳動分子量分離 - Google Patents
ポリマー含有溶液を使用する生体分子のキャピラリー電気泳動分子量分離Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は生体分子（例えばポリペプチド類、核酸類、
およびオリゴ糖類）の分離、特に、分子篩マトリックス
およびキャピラリー電気泳動のための非共役壁コーティ
ングの両方として有効である約0.01および1.0％の間の
電荷パーセントを有する親水性ポリマーを含有する低粘
度溶液の使用に関する。
およびオリゴ糖類）の分離、特に、分子篩マトリックス
およびキャピラリー電気泳動のための非共役壁コーティ
ングの両方として有効である約0.01および1.0％の間の
電荷パーセントを有する親水性ポリマーを含有する低粘
度溶液の使用に関する。
参考文献 アルスチン，ジェイ・エム・ヴィら、米国特許第4,69
0,749号、発行9/1/87. アウスベル，エフ・エムら、Current Protocols in M
olecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media P
A. ボード，エイチ・ジェイ、Physiol.Chem.Bd.359S:123
7−1238（1978）． ボヒンスキ，アール・シイ、Modern Concepts in Bio
chemistry,2版、Allyn and Bacon,Inc. カンター，シイ・アールら、PCT国際出願 83/US1826
111883,WO Al 840524（1984）． カンター，シイ・アールら、Biochem.27:9216−9221
（1988）． コーエン，エイ・エスら、Anal Chem,59:1021（198
7）． コーエン，エイ・エスら、J.Chromatography,458:323
（1988）． コーエン，エイら、米国特許第4,997,537号、発行3/5
/91. コンプトン，エス・ダブリュら、BioTechniques,6
（５）:432（1988）． ドロッスマン，エイチら、Anal.Chem.,62:900（199
0）． ジェン，ユン、カナダ特許第579（222）号、発行1959
年７月７日． カーガー，ビイ・エルら、ヨーロッパ特許第EP417925
号、発行3/20/91. カスパー，ティ・ジェイら、J Chromatography,458:3
03（1988）． クリッケ，ダブリュ・エムら、Prog Polym.Sci,8:373
（1982）． マキノ，アールら、PCR Methods and Applicaions 2
（１）:10（1992）． マニアチス，ティら、Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,コールド・スプリング，ハーバー・ラボラト
リイ（1982）． マシュウ，エム・ケイら、Biochem.27:9222−9226（1
988）． マシュウ，エム・ケイら、Biochem.27:9204−9210（1
988）． マシュウ，エム・ケイら、Biochem.27:9210−9216（1
988）． マックコーミック，シイ・エルら、J.Macromol.Sci.C
hem.A16（８）:1441−1462（1981）． ムリス，ケイ・ビイ、米国特許第4,683,202号、発行1
987年７月28日． ムリス，ケイ・ビイら、米国特許第4,683,195号、発
行1987年７月28日． オガワ，エム、米国特許第4,657,656号、発行4/14/8
7. オガワ，エムら、米国特許第4,963,243号、発行10/16
/90. タカギ，ティら、Electrophoresis,12:436−438（199
1）． ウィクトロウィクツ、米国特許第5,015,350号． ウィドハルム，エイら、Chromatographs 549:446−45
1（1991）． ヅー，ディ−ゼットら、米国特許第5,069,766号、発
行1991年12月３日。
0,749号、発行9/1/87. アウスベル，エフ・エムら、Current Protocols in M
olecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media P
A. ボード，エイチ・ジェイ、Physiol.Chem.Bd.359S:123
7−1238（1978）． ボヒンスキ，アール・シイ、Modern Concepts in Bio
chemistry,2版、Allyn and Bacon,Inc. カンター，シイ・アールら、PCT国際出願 83/US1826
111883,WO Al 840524（1984）． カンター，シイ・アールら、Biochem.27:9216−9221
（1988）． コーエン，エイ・エスら、Anal Chem,59:1021（198
7）． コーエン，エイ・エスら、J.Chromatography,458:323
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/91. コンプトン，エス・ダブリュら、BioTechniques,6
（５）:432（1988）． ドロッスマン，エイチら、Anal.Chem.,62:900（199
0）． ジェン，ユン、カナダ特許第579（222）号、発行1959
年７月７日． カーガー，ビイ・エルら、ヨーロッパ特許第EP417925
号、発行3/20/91. カスパー，ティ・ジェイら、J Chromatography,458:3
03（1988）． クリッケ，ダブリュ・エムら、Prog Polym.Sci,8:373
（1982）． マキノ，アールら、PCR Methods and Applicaions 2
（１）:10（1992）． マニアチス，ティら、Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,コールド・スプリング，ハーバー・ラボラト
リイ（1982）． マシュウ，エム・ケイら、Biochem.27:9222−9226（1
988）． マシュウ，エム・ケイら、Biochem.27:9204−9210（1
988）． マシュウ，エム・ケイら、Biochem.27:9210−9216（1
988）． マックコーミック，シイ・エルら、J.Macromol.Sci.C
hem.A16（８）:1441−1462（1981）． ムリス，ケイ・ビイ、米国特許第4,683,202号、発行1
987年７月28日． ムリス，ケイ・ビイら、米国特許第4,683,195号、発
行1987年７月28日． オガワ，エム、米国特許第4,657,656号、発行4/14/8
7. オガワ，エムら、米国特許第4,963,243号、発行10/16
/90. タカギ，ティら、Electrophoresis,12:436−438（199
1）． ウィクトロウィクツ、米国特許第5,015,350号． ウィドハルム，エイら、Chromatographs 549:446−45
1（1991）． ヅー，ディ−ゼットら、米国特許第5,069,766号、発
行1991年12月３日。
発明の背景 電気泳動はDNA種、タンパク質、ペプチド、および誘
導化アミノ酸を含む種々の生体分子の分離に広く使用さ
れる。高速高分解分離ができる１つの電気泳動技術はキ
ャピラリー電気泳動（CE）である（コーエン、1987、19
88;コンプトン；カスパー）。一般的には、CEは内径が
約10−200ミクロンで、長さが約５−100cmまたはそれ以
上の範囲にある融解シリカキャピラリーチューブを用い
る。
導化アミノ酸を含む種々の生体分子の分離に広く使用さ
れる。高速高分解分離ができる１つの電気泳動技術はキ
ャピラリー電気泳動（CE）である（コーエン、1987、19
88;コンプトン；カスパー）。一般的には、CEは内径が
約10−200ミクロンで、長さが約５−100cmまたはそれ以
上の範囲にある融解シリカキャピラリーチューブを用い
る。
通常の電気泳動方法では、電気泳動チューブ、または
スラブは流動性電気泳動媒体で充填され、流動性媒体は
非流動性安定化ゲル分離媒体を形成するように共有架橋
または温度固化される。試料容量はチューブの一端に引
き入れまたは添加され、電界は媒体を介して試料を引き
出すようにチューブを横切って配置される。マトリック
ス内の電気泳動分離は、変性タンパク質および核酸種
（これらは電荷密度がほぼ同じである）の場合には分子
の大きさに、或いはペプチドおよびタンパク質の場合に
は、大きさと電荷の組合せに基づかせることができる。
スラブは流動性電気泳動媒体で充填され、流動性媒体は
非流動性安定化ゲル分離媒体を形成するように共有架橋
または温度固化される。試料容量はチューブの一端に引
き入れまたは添加され、電界は媒体を介して試料を引き
出すようにチューブを横切って配置される。マトリック
ス内の電気泳動分離は、変性タンパク質および核酸種
（これらは電荷密度がほぼ同じである）の場合には分子
の大きさに、或いはペプチドおよびタンパク質の場合に
は、大きさと電荷の組合せに基づかせることができる。
分離媒体のポリマー濃度および／または架橋度を変え
て広範囲の分子量および電荷の種の分離を行うことがで
きる。約1,000塩基よりも大きい核酸フラグメントを分
離するため、例えば、好ましい温度固化物質はアガロー
スであり、アガロースの濃度は、５〜60キロ塩基の大き
さの範囲でフラグメントを分離するため、約0.3％か
ら、100〜3,000塩基対の範囲でフラグメントを分離する
ため、約２％まで変えることができる（マニアチス）。
さらに小さいフラグメント、一般的には約1,000塩基対
以下では、通常架橋したポリアクリルアミドで分離され
る。アクリルアミドポリマーの濃度は、100〜1,000塩基
対の範囲でフラグメントを分離するために、約3.5％か
ら、10〜100塩基対の大きさの範囲で分離するために、
約20％までの範囲にあることができる。タンパク質を分
離するため、約３％〜20パーセントの間の濃度で架橋し
たポリアクリルアミドが一般に適当である。一般に、分
離される分子種が小さい程、架橋ポリマーの濃度は高
い。
て広範囲の分子量および電荷の種の分離を行うことがで
きる。約1,000塩基よりも大きい核酸フラグメントを分
離するため、例えば、好ましい温度固化物質はアガロー
スであり、アガロースの濃度は、５〜60キロ塩基の大き
さの範囲でフラグメントを分離するため、約0.3％か
ら、100〜3,000塩基対の範囲でフラグメントを分離する
ため、約２％まで変えることができる（マニアチス）。
さらに小さいフラグメント、一般的には約1,000塩基対
以下では、通常架橋したポリアクリルアミドで分離され
る。アクリルアミドポリマーの濃度は、100〜1,000塩基
対の範囲でフラグメントを分離するために、約3.5％か
ら、10〜100塩基対の大きさの範囲で分離するために、
約20％までの範囲にあることができる。タンパク質を分
離するため、約３％〜20パーセントの間の濃度で架橋し
たポリアクリルアミドが一般に適当である。一般に、分
離される分子種が小さい程、架橋ポリマーの濃度は高
い。
上述のタイプの固化電気泳動媒体において得られる分
解能は限られており、小さい分子量種の場合には、電気
泳動チューブ内、および特にキャピラリーチューブ内
で、高ポリマー濃度にて均質で均一なポリマーマトリッ
クスを形成することが難しい。チューブ内に高濃度の固
化マトリックスを形成するための通常の方法では、高濃
度のモノマー溶液（アクリルアミドおよびビスアクリル
アミド）は、流動性の形態で流体がチューブ内に導かれ
る。流動性物質を次に、例えば、過硫酸塩の存在で光を
照射して重合化させる。
解能は限られており、小さい分子量種の場合には、電気
泳動チューブ内、および特にキャピラリーチューブ内
で、高ポリマー濃度にて均質で均一なポリマーマトリッ
クスを形成することが難しい。チューブ内に高濃度の固
化マトリックスを形成するための通常の方法では、高濃
度のモノマー溶液（アクリルアミドおよびビスアクリル
アミド）は、流動性の形態で流体がチューブ内に導かれ
る。流動性物質を次に、例えば、過硫酸塩の存在で光を
照射して重合化させる。
高いポリマー濃度にて、チューブ内に形成された反応
熱勾配は、マトリックスの不均質に導くことができる不
均一な反応速度および熱乱流を生成する傾向がある。ま
た、架橋反応中に生成した閉じ込められたガスの気泡は
マトリックス中に空隙を生成する。マトリックス中の非
均一性は、特に、密接に関連した小さい分子量の種の中
で達成できる分解能の度合を制限する。
熱勾配は、マトリックスの不均質に導くことができる不
均一な反応速度および熱乱流を生成する傾向がある。ま
た、架橋反応中に生成した閉じ込められたガスの気泡は
マトリックス中に空隙を生成する。マトリックス中の非
均一性は、特に、密接に関連した小さい分子量の種の中
で達成できる分解能の度合を制限する。
あるいはまた、温度固化ポリマーの場合には、ポリマ
ーが流動性形態で電気泳動チューブに導かれ、次に冷却
によってゲルを固体の形態にすることができる。このア
プローチは、しかしながら、諸性質を設定する必要な温
度固化硬化性を有することが知られている寒天やアガロ
ースのようなポリマーは、高ポリマー濃度でも、低分子
量の種を分離するために有効ではないので、小さいペプ
チドやオリゴヌクレオチドのような、低分子量の種を分
離するためには一般に適さない。
ーが流動性形態で電気泳動チューブに導かれ、次に冷却
によってゲルを固体の形態にすることができる。このア
プローチは、しかしながら、諸性質を設定する必要な温
度固化硬化性を有することが知られている寒天やアガロ
ースのようなポリマーは、高ポリマー濃度でも、低分子
量の種を分離するために有効ではないので、小さいペプ
チドやオリゴヌクレオチドのような、低分子量の種を分
離するためには一般に適さない。
架橋または温度固化マトリックスと関連する第２の制
限は、電気泳動分離後、マトリックス内の分離した分子
種を回収することが困難なことである。標本スケールの
電気泳動チューブの場合では、固化したマトリックスは
マトリックスを除くことができる前にチューブ壁から注
意して分離する必要があり、この方法は直径が小さいチ
ューブでは事実上不可能である。マトリックスが除去さ
れ、所望の分子種を含有するマトリックス領域が同定さ
れた後でも、関係のある種を長い溶出手順によって、あ
るいは電気泳動溶出によってのみマトリックス領域から
回収することができる。
限は、電気泳動分離後、マトリックス内の分離した分子
種を回収することが困難なことである。標本スケールの
電気泳動チューブの場合では、固化したマトリックスは
マトリックスを除くことができる前にチューブ壁から注
意して分離する必要があり、この方法は直径が小さいチ
ューブでは事実上不可能である。マトリックスが除去さ
れ、所望の分子種を含有するマトリックス領域が同定さ
れた後でも、関係のある種を長い溶出手順によって、あ
るいは電気泳動溶出によってのみマトリックス領域から
回収することができる。
CEでは、コーティング物質は一般的にマイクロキャピ
ラリーチューブ壁に共有結合していた（コーエンら、19
91;カーガーら、1989;アルスチンら、1987）。最も普通
に重合したマトリックスはコーティング物質を共有結合
した後に導かれる（コーエンら、1991;カーガーら、198
9）。水溶性ポリマーは架橋重合電気泳動媒体に脆弱性
を減らすため、すなわち取扱容易性を改善するため、そ
して移動速度特性を改善するために添加された（オガ
ワ、1987;オガワら、1990）。
ラリーチューブ壁に共有結合していた（コーエンら、19
91;カーガーら、1989;アルスチンら、1987）。最も普通
に重合したマトリックスはコーティング物質を共有結合
した後に導かれる（コーエンら、1991;カーガーら、198
9）。水溶性ポリマーは架橋重合電気泳動媒体に脆弱性
を減らすため、すなわち取扱容易性を改善するため、そ
して移動速度特性を改善するために添加された（オガ
ワ、1987;オガワら、1990）。
グロッスマン（米国特許第5,126,021号、1992年６月3
0日発行）は、生体ポリマーのキャピラリー電気泳動分
離のために有用なメッシュ寸法を有する低粘度溶液中に
荷電していない水溶性ポリマーを使用することを記載し
ている。
0日発行）は、生体ポリマーのキャピラリー電気泳動分
離のために有用なメッシュ寸法を有する低粘度溶液中に
荷電していない水溶性ポリマーを使用することを記載し
ている。
ウィクトロウィッツ（米国特許第5,015,350号）は生
体ポリマーの分離のために電気浸透流を調整するため非
共有コーティングを使用することを記載している。キャ
ピラリーチューブはアノードとカソードの電解質貯蔵器
との間に連結し、電界を貯蔵器を横切って配置し、チュ
ーブ内に電気浸透流を生成させる。電気浸透流の間に、
チューブの表面電荷を変えることができる化合物をチュ
ーブ内に引き入れチューブに通し、チューブ内の電気浸
透流の割合をモニターする。前記モニタリングから測定
されるように、チューブ内の所望の電気浸透流の割合が
得られるまで、化合物をチューブ内に引き入れチューブ
に通すことを続ける。
体ポリマーの分離のために電気浸透流を調整するため非
共有コーティングを使用することを記載している。キャ
ピラリーチューブはアノードとカソードの電解質貯蔵器
との間に連結し、電界を貯蔵器を横切って配置し、チュ
ーブ内に電気浸透流を生成させる。電気浸透流の間に、
チューブの表面電荷を変えることができる化合物をチュ
ーブ内に引き入れチューブに通し、チューブ内の電気浸
透流の割合をモニターする。前記モニタリングから測定
されるように、チューブ内の所望の電気浸透流の割合が
得られるまで、化合物をチューブ内に引き入れチューブ
に通すことを続ける。
ヅーら（米国特許第5,069,766号）は１または両方の
電極室溶液に粘度上昇添加物を含有させてキャピラリー
電気泳動中に電気浸透流を抑えることを記載している。
電極室溶液に粘度上昇添加物を含有させてキャピラリー
電気泳動中に電気浸透流を抑えることを記載している。
タンパク質の大きさによる分離は、液体ポリアクリル
アミドを用いて行われた（ウィドハルムら、1991;タカ
ギら、1991;ボード、1978）。しかしながら、CEにおい
て液体ポリアクリルアミドを用いるタンパク質分離は
（ｉ）タンパク質またはタンパク質複合体の移動の電気
浸透流の効果（ウィドハルムら、1991）、（ii）試料の
タンパク質またはタンパク質複合体を別々のバンドに分
離するために十分に高いポリアクリルアミド濃度の使用
（タカギら、1991）、および（iii）タンパク質バンド
の追跡（ボード、1978）を含む付随する問題がある。
アミドを用いて行われた（ウィドハルムら、1991;タカ
ギら、1991;ボード、1978）。しかしながら、CEにおい
て液体ポリアクリルアミドを用いるタンパク質分離は
（ｉ）タンパク質またはタンパク質複合体の移動の電気
浸透流の効果（ウィドハルムら、1991）、（ii）試料の
タンパク質またはタンパク質複合体を別々のバンドに分
離するために十分に高いポリアクリルアミド濃度の使用
（タカギら、1991）、および（iii）タンパク質バンド
の追跡（ボード、1978）を含む付随する問題がある。
発明の概要 本発明は試料中の生体分子を分離する方法を提供す
る。２つの端部をもつキャピラリーチューブを用意す
る。このキャピラリーチューブは （ｉ）その内壁表面に荷電した化学基を有し、そして （ii）（ａ）分子量が20および5,000キロダルトンの
間、および（ｂ）0.01ないし1.0％の間の電荷パーセン
トを有する少なくとも１つのポリマーまたはコポリマー
種を含有する非架橋親水性ポリマーまたはコポリマー溶
液の重量（w/w）に対し0.05ないし30重量％を含有する
電解質溶液を充填する。電荷パーセントは全ポリマーサ
ブユニットに対し荷電したモノマーサブユニットのモル
パーセントによって測定され、そこでは荷電したモノマ
ーサブユニットは選択された電気泳動のpHで壁電荷と逆
の電荷を有する。チューブ端は電解質溶液を含有するア
ノードとカソードの貯蔵器に浸す。分離される生体分子
を含有する試料は、チューブの１端に導入される。次に
試料中の前記生体分子を分離するために有効な極性を用
いて貯蔵器を横切って電界を印加する。
る。２つの端部をもつキャピラリーチューブを用意す
る。このキャピラリーチューブは （ｉ）その内壁表面に荷電した化学基を有し、そして （ii）（ａ）分子量が20および5,000キロダルトンの
間、および（ｂ）0.01ないし1.0％の間の電荷パーセン
トを有する少なくとも１つのポリマーまたはコポリマー
種を含有する非架橋親水性ポリマーまたはコポリマー溶
液の重量（w/w）に対し0.05ないし30重量％を含有する
電解質溶液を充填する。電荷パーセントは全ポリマーサ
ブユニットに対し荷電したモノマーサブユニットのモル
パーセントによって測定され、そこでは荷電したモノマ
ーサブユニットは選択された電気泳動のpHで壁電荷と逆
の電荷を有する。チューブ端は電解質溶液を含有するア
ノードとカソードの貯蔵器に浸す。分離される生体分子
を含有する試料は、チューブの１端に導入される。次に
試料中の前記生体分子を分離するために有効な極性を用
いて貯蔵器を横切って電界を印加する。
本発明に有用なポリマーまたはコポリマーは次の群を
含む：ポリアクリルアミド類（例えば、ポリアクリルア
ミド、ポリ（N,N−ジメチルアクリルアミド）およびポ
リメタクリルアミド）、ポリオキシド類（例えば、ポリ
エチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド）、ポ
リエーテル類（例えば、ポリビニルメチルエーテル）、
ビニルポリマー類（例えば、ポリビニルピロリジン、ポ
リビニルアルコール、およびポリビニルアセテート）、
セルロースポリマー類（例えば、メチルセルロース、ヒ
ドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロ
ース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース）、
アクリルポリマー類（例えば、ポリヒドロキシエチルメ
タクリレートおよびオリエチレングリコールモノメタク
リレート）、天然ゴムおよび多糖類（例えば、キサンタ
ン類、デキストラン類、寒天、ガール、および澱粉
類）。
含む：ポリアクリルアミド類（例えば、ポリアクリルア
ミド、ポリ（N,N−ジメチルアクリルアミド）およびポ
リメタクリルアミド）、ポリオキシド類（例えば、ポリ
エチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド）、ポ
リエーテル類（例えば、ポリビニルメチルエーテル）、
ビニルポリマー類（例えば、ポリビニルピロリジン、ポ
リビニルアルコール、およびポリビニルアセテート）、
セルロースポリマー類（例えば、メチルセルロース、ヒ
ドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロ
ース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース）、
アクリルポリマー類（例えば、ポリヒドロキシエチルメ
タクリレートおよびオリエチレングリコールモノメタク
リレート）、天然ゴムおよび多糖類（例えば、キサンタ
ン類、デキストラン類、寒天、ガール、および澱粉
類）。
ポリマーまたはコポリマー溶液はホモポリマー、コポ
リマー、またはこれら２種の混合物を含むことができ
る。
リマー、またはこれら２種の混合物を含むことができ
る。
本発明の実施に用いられるポリマーまたはコポリマー
分子は少なくとも１つの荷電した基を含み、これは第１
アミン、第２アミン、第４アミン、カルボン酸、スルホ
ン酸、リン酸、硫酸、およびホスホン酸から成る群から
選ばれる電荷を有する。ポリマーまたはコポリマー分子
は、第１アミン、第２アミン、および第４アミンから成
る群から選ばれる少なくとも１つの荷電した基、および
カルボン酸、スルホン酸、リン酸、硫酸、およびホスホ
ン酸から成る群から選ばれる少なくとも１個の荷電した
基を含むことができる。
分子は少なくとも１つの荷電した基を含み、これは第１
アミン、第２アミン、第４アミン、カルボン酸、スルホ
ン酸、リン酸、硫酸、およびホスホン酸から成る群から
選ばれる電荷を有する。ポリマーまたはコポリマー分子
は、第１アミン、第２アミン、および第４アミンから成
る群から選ばれる少なくとも１つの荷電した基、および
カルボン酸、スルホン酸、リン酸、硫酸、およびホスホ
ン酸から成る群から選ばれる少なくとも１個の荷電した
基を含むことができる。
本発明の１の具体例では、ポリマーはアクリルアミド
およびジアリルジメチルアンモニウムクロリド（DADMA
C）のコポリマーであり、このコポリマーは分子量が約2
00と600kdの間にある。さらに、ポリマー分子は１サブ
ユニットのアクリルアミドにつき0.02ないし0.4％の第
４アミンN,N−ジメチル−ピロリジンを含む。
およびジアリルジメチルアンモニウムクロリド（DADMA
C）のコポリマーであり、このコポリマーは分子量が約2
00と600kdの間にある。さらに、ポリマー分子は１サブ
ユニットのアクリルアミドにつき0.02ないし0.4％の第
４アミンN,N−ジメチル−ピロリジンを含む。
本発明の他の具体例では、ポリマーはアクリルアミド
とテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）のコポリマ
ーであり、このコポリマーは約100と500キロダルトンの
間の分子量を有する。さらに、ポリマー分子は１サブユ
ニットのアクリルアミドにつき0.05ないし0.5％の第３
アミンテトラメチルエチレンジアミンを含有する。
とテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）のコポリマ
ーであり、このコポリマーは約100と500キロダルトンの
間の分子量を有する。さらに、ポリマー分子は１サブユ
ニットのアクリルアミドにつき0.05ないし0.5％の第３
アミンテトラメチルエチレンジアミンを含有する。
他の具体例では、壁電荷と逆の電荷を含むポリマー分
子の濃度は壁表面を非共有的に被覆し、約２×10-5cm2/
秒・Ｖ以下に電気浸透流（EOF）を有意にコントロール
し減らすために十分である。
子の濃度は壁表面を非共有的に被覆し、約２×10-5cm2/
秒・Ｖ以下に電気浸透流（EOF）を有意にコントロール
し減らすために十分である。
さらに本発明の方法はチューブ中の生体分子の電気化
学的、光学的（例えばUV吸収または蛍光）またはラジオ
アイソトープによる性質を測定することによって電気泳
動キャピラリーチューブ中の分離した生体分子の存在を
検出することを含むことができる。
学的、光学的（例えばUV吸収または蛍光）またはラジオ
アイソトープによる性質を測定することによって電気泳
動キャピラリーチューブ中の分離した生体分子の存在を
検出することを含むことができる。
本方法はタンパク質類、ポリペプチド類、およびペプ
チド類の分離に応用することができる：これらの生体分
子は電気泳動媒体のpHで正味の正または負の電荷を有す
ることができる。１つの具体例では、生体分子は、例え
ば、ドデシル硫酸ナトリウムを用いて分離の前に変性さ
せることができる。変性剤、例えばドデシル硫酸ナトリ
ウムは、また電解質溶液に存在させることもできる。
チド類の分離に応用することができる：これらの生体分
子は電気泳動媒体のpHで正味の正または負の電荷を有す
ることができる。１つの具体例では、生体分子は、例え
ば、ドデシル硫酸ナトリウムを用いて分離の前に変性さ
せることができる。変性剤、例えばドデシル硫酸ナトリ
ウムは、また電解質溶液に存在させることもできる。
さらに、本方法は核酸フラグメントの分離に応用する
ことができる。核酸フラグメントは１本鎖または２本鎖
のDNAまたはRNAであることができる。２本鎖核酸の示差
移動度はフラグメントに内位添加剤を添加して調整さ
れ、ポリマー溶液を介して一層小さい分子量のフラグメ
ントの移動速度を優先的に増加させることができる。こ
のような内位添加剤の例としては臭化エチジウムおよび
アクリジンオレンジがある。本発明の方法は、−−試料
を１またはそれ以上の選ばれた制限エンドヌクレアーゼ
を用いて処理した後、DNA試料の制限消化分析を行うた
めに応用することができる。
ことができる。核酸フラグメントは１本鎖または２本鎖
のDNAまたはRNAであることができる。２本鎖核酸の示差
移動度はフラグメントに内位添加剤を添加して調整さ
れ、ポリマー溶液を介して一層小さい分子量のフラグメ
ントの移動速度を優先的に増加させることができる。こ
のような内位添加剤の例としては臭化エチジウムおよび
アクリジンオレンジがある。本発明の方法は、−−試料
を１またはそれ以上の選ばれた制限エンドヌクレアーゼ
を用いて処理した後、DNA試料の制限消化分析を行うた
めに応用することができる。
本発明の方法はまた線状、分枝状、天然および化学的
に改変されたオリゴ糖類の分離に応用することもでき
る。
に改変されたオリゴ糖類の分離に応用することもでき
る。
本発明はさらに本発明の方法に使用するため充填され
たキャピラリーチューブから成る。このキャピラリーチ
ューブはその内壁表面に荷電した化学基を有し、（ａ）
20と5,000キロダルトンの間の分子量、および（ｂ）0.0
1ないし1.0％の間の電荷パーセントを有する少なくとも
１のポリマーまたはコポリマー種を含有する非架橋、親
水性ポリマーまたはコポリマー溶液の重量（w/w）に対
し0.05ないし30重量％を含有する電解質溶液で充填され
ている。上記のように、電荷パーセントは全ポリマーサ
ブユニットに対し荷電したモノマーサブユニットのモル
パーセントによって測定され、そこでは荷電したモノマ
ーサブユニットは選択された電気泳動pHにて壁電荷に対
し逆の電荷を有する。
たキャピラリーチューブから成る。このキャピラリーチ
ューブはその内壁表面に荷電した化学基を有し、（ａ）
20と5,000キロダルトンの間の分子量、および（ｂ）0.0
1ないし1.0％の間の電荷パーセントを有する少なくとも
１のポリマーまたはコポリマー種を含有する非架橋、親
水性ポリマーまたはコポリマー溶液の重量（w/w）に対
し0.05ないし30重量％を含有する電解質溶液で充填され
ている。上記のように、電荷パーセントは全ポリマーサ
ブユニットに対し荷電したモノマーサブユニットのモル
パーセントによって測定され、そこでは荷電したモノマ
ーサブユニットは選択された電気泳動pHにて壁電荷に対
し逆の電荷を有する。
上記のポリマーおよび荷電した基はキャピラリーチュ
ーブを充填するために使用することができる。
ーブを充填するために使用することができる。
図面の簡単な説明 図１は本発明の方法を実施する際に使用されるキャピ
ラリー電気泳動システムの概略図である。
ラリー電気泳動システムの概略図である。
図２はパルス電圧と一定電圧のモードを同時に操作す
るために設計されたキャピラリー電気泳動システムの概
略図であり； 図３はキャピラリー電気泳動チューブの拡大断片図で
あり、右から左への方向に電気浸透流（ｅ）を示してい
る。
るために設計されたキャピラリー電気泳動システムの概
略図であり； 図３はキャピラリー電気泳動チューブの拡大断片図で
あり、右から左への方向に電気浸透流（ｅ）を示してい
る。
図４は重合化反応でTEMED濃度を増加させることによ
る２％（w/v）ポリアクリルアミドの粘度とEOFの効果を
示す。
る２％（w/v）ポリアクリルアミドの粘度とEOFの効果を
示す。
図５は重合化反応でDADMAC濃度を増加させることによ
る２％（w/v）ポリアクリルアミドの粘度とEOFの効果を
示す。
る２％（w/v）ポリアクリルアミドの粘度とEOFの効果を
示す。
図６は多成分を有するタンパク質混合物の別々のピー
クへの分離を示す。分離に使用したコポリマーDADMAC/
〔AAm〕％は各電気泳動図の右側に示す。
クへの分離を示す。分離に使用したコポリマーDADMAC/
〔AAm〕％は各電気泳動図の右側に示す。
図７は上述したタンパク質混合物の別々のピークへの
分離を示す。分離のために使用したコポリマーDADMAC/
〔AAm〕％は各電気泳動図の右側に示す。
分離を示す。分離のために使用したコポリマーDADMAC/
〔AAm〕％は各電気泳動図の右側に示す。
図８はアクリルアミドとDADMACサブユニットから作成
された線状コポリマーについて提案された構造を示す。
された線状コポリマーについて提案された構造を示す。
図９はパルス幅と最大電圧Vmaxを有する印加した矩形
波電圧に関して、比較的小さい核酸フラグメント（点
線）と比較的大きい核酸フラグメント（一点鎖線）に対
する仮定的な速度曲線を示す。
波電圧に関して、比較的小さい核酸フラグメント（点
線）と比較的大きい核酸フラグメント（一点鎖線）に対
する仮定的な速度曲線を示す。
図10は最も早い移動成分に関してタンパク質混合物の
成分のための較正曲線の結果を示す。プロットはタンパ
ク質成分の相対移動度に対する対数（分子量）を示す。
成分のための較正曲線の結果を示す。プロットはタンパ
ク質成分の相対移動度に対する対数（分子量）を示す。
図11は本発明のポリマー溶液を用いるタンパク質分離
の50連続行程から標本を取った３行程の結果を示し、そ
こではキャピラリーチューブはポリマー溶液を用いてだ
け行程間にフラッシさせた。
の50連続行程から標本を取った３行程の結果を示し、そ
こではキャピラリーチューブはポリマー溶液を用いてだ
け行程間にフラッシさせた。
図12は１、２、および３％（w/v）での本発明のカチ
オンコポリマー中の２本鎖DNA分子の分離を示す。
オンコポリマー中の２本鎖DNA分子の分離を示す。
図13はポリアクリルアミド分子量標準の対数に対する
対数比粘度のプロットを示す。
対数比粘度のプロットを示す。
図14は単一分子量のポリアクリルアミド（367kD）の
パーセント濃度に対する対数比粘度のプロットを示す。
パーセント濃度に対する対数比粘度のプロットを示す。
図15は一番早い移動成分に関して、ポリアクリルアミ
ド％値の範囲を超えるポリアクリルアミド％に対するタ
ンパク質混合物中のタンパク質の相対移動時間のプロッ
トを示す（ファーガソン回帰分析）。
ド％値の範囲を超えるポリアクリルアミド％に対するタ
ンパク質混合物中のタンパク質の相対移動時間のプロッ
トを示す（ファーガソン回帰分析）。
語の定義 本発明におけるポリマーの語は特徴的な型：すなわ
ち、同一のサブユニットから成るホモポリマー、におい
て一緒に共有結合したさらに小さいモノマーサブユニッ
トから成る大きい分子をその伝統的な意味で用る。コポ
リマーの語は同一分子中に２種またはそれ以上の種類の
モノマー単位を含むポリマーに適用するために用いられ
る。共重合によっていずれかのホモポリマーの性質とは
異なる性質をもつコポリマー物質を作ることができる。
本発明におけるコポリマーの例は図８に示される提案さ
れた構造を有する線状ポリマーを形成するためのアクリ
ルアミドとDADMACの混合物である。明細書中では、ポリ
マー溶液はポリマー、ポリマーの混合物、コポリマー、
コポリマーの混合物、またはポリマーとコポリマーの混
合物を含んだ溶液に適用される。
ち、同一のサブユニットから成るホモポリマー、におい
て一緒に共有結合したさらに小さいモノマーサブユニッ
トから成る大きい分子をその伝統的な意味で用る。コポ
リマーの語は同一分子中に２種またはそれ以上の種類の
モノマー単位を含むポリマーに適用するために用いられ
る。共重合によっていずれかのホモポリマーの性質とは
異なる性質をもつコポリマー物質を作ることができる。
本発明におけるコポリマーの例は図８に示される提案さ
れた構造を有する線状ポリマーを形成するためのアクリ
ルアミドとDADMACの混合物である。明細書中では、ポリ
マー溶液はポリマー、ポリマーの混合物、コポリマー、
コポリマーの混合物、またはポリマーとコポリマーの混
合物を含んだ溶液に適用される。
親水性の語は水または水緩衝液系に溶解できるポリマ
ー／コポリマーを記述する。
ー／コポリマーを記述する。
本発明の文脈において、生体分子の語は一般にタンパ
ク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、一本鎖および二
本鎖DNAおよび／またはRNAに関連する。オリゴ糖類また
は糖タンパク質のような他の生体分子もまた本発明の方
法によって分析することができる。生体分子は線状、分
枝状、天然または化学的に改変することができる。
ク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、一本鎖および二
本鎖DNAおよび／またはRNAに関連する。オリゴ糖類また
は糖タンパク質のような他の生体分子もまた本発明の方
法によって分析することができる。生体分子は線状、分
枝状、天然または化学的に改変することができる。
タンパク質は一般にポリマーを基礎としたアミノ酸の
長鎖である（ポリペプチド）。タンパク質は１、２また
はそれ以上のポリペプチド鎖から成り、さらに例えば鉄
または炭水化物のようなポリペプチド鎖と会合する若干
の他の型の物質を含むことができる。タンパク質の大き
さは（任意の数の）5,000ないし数10万グラム／モルの
むしろ広い範囲をカバーする。5,000の数字は約40〜45
のアミノ酸の存在に相当する。約5,000g/モルよりも小
さいタンパク質は一般にポリペプチドまたは単にペプチ
ドと呼ばれる（ボヒンスキイ）。
長鎖である（ポリペプチド）。タンパク質は１、２また
はそれ以上のポリペプチド鎖から成り、さらに例えば鉄
または炭水化物のようなポリペプチド鎖と会合する若干
の他の型の物質を含むことができる。タンパク質の大き
さは（任意の数の）5,000ないし数10万グラム／モルの
むしろ広い範囲をカバーする。5,000の数字は約40〜45
のアミノ酸の存在に相当する。約5,000g/モルよりも小
さいタンパク質は一般にポリペプチドまたは単にペプチ
ドと呼ばれる（ボヒンスキイ）。
電解質溶液中のポリマーおよび／またはコポリマーに
対する電荷パーセントは全ポリマーサブユニットに関し
て荷電したモノマーサブユニットのモルパーセントとし
て測定される。
対する電荷パーセントは全ポリマーサブユニットに関し
て荷電したモノマーサブユニットのモルパーセントとし
て測定される。
発明の詳細な説明 本発明は生体分子の分離に使用するための電解質溶液
中の少なくとも１のポリマーまたはコポリマーの使用を
記載する。本発明の電解質溶液を含有するポリマー（ポ
リマー溶液）は一般にキャピラリーチューブに導入さ
れ、そこではキャピラリーチューブはその内壁表面に荷
電した化学基を有する：内表面壁の負に荷電した基をも
つキャピラリーの具体例はガラスまたは溶融シリカであ
る。次にキャピラリーチューブは非架橋の親水性ポリマ
ーまたはコポリマーの重量（w/w）に対し0.05ないし30
重量％を含有するポリマー溶液で充填される：溶液は１
またはそれ以上のポリマーまたはコポリマー種を含むこ
とができる。一般に、ポリマーまたはコポリマー種は
（ｉ）分子量が20と5,000キロダルトンの間であり、そ
して（ii）電荷パーセントが0.01と1.0％の間である。
選択された電気泳動のpHでは、ポリマーまたはコポリマ
ーの電荷はキャピラリーチューブの内壁表面上の荷電し
た化学基とは逆である。
中の少なくとも１のポリマーまたはコポリマーの使用を
記載する。本発明の電解質溶液を含有するポリマー（ポ
リマー溶液）は一般にキャピラリーチューブに導入さ
れ、そこではキャピラリーチューブはその内壁表面に荷
電した化学基を有する：内表面壁の負に荷電した基をも
つキャピラリーの具体例はガラスまたは溶融シリカであ
る。次にキャピラリーチューブは非架橋の親水性ポリマ
ーまたはコポリマーの重量（w/w）に対し0.05ないし30
重量％を含有するポリマー溶液で充填される：溶液は１
またはそれ以上のポリマーまたはコポリマー種を含むこ
とができる。一般に、ポリマーまたはコポリマー種は
（ｉ）分子量が20と5,000キロダルトンの間であり、そ
して（ii）電荷パーセントが0.01と1.0％の間である。
選択された電気泳動のpHでは、ポリマーまたはコポリマ
ーの電荷はキャピラリーチューブの内壁表面上の荷電し
た化学基とは逆である。
キャピラリーチューブの末端は電解質溶液を含有する
上記ポリマーを含むアノードまたはカソードの貯蔵器に
浸漬される。生体分子または生体分子混合物の試料はキ
ャピラリーチューブの１端に導かれ、貯蔵器を横切って
電界を印加する。荷電した生体分子は電界を通って移動
するので、それらはポリマー溶液によって確立された篩
分けマトリックスを通って示差移動によって寸法および
／または形状に基づいて分離される。
上記ポリマーを含むアノードまたはカソードの貯蔵器に
浸漬される。生体分子または生体分子混合物の試料はキ
ャピラリーチューブの１端に導かれ、貯蔵器を横切って
電界を印加する。荷電した生体分子は電界を通って移動
するので、それらはポリマー溶液によって確立された篩
分けマトリックスを通って示差移動によって寸法および
／または形状に基づいて分離される。
I.電気泳動システム 図１は本発明方法を実施するために適しているキャピ
ラリー電気泳動システム20（アプライド・バイオシステ
ムズ、フォスターシティ CA）の簡単な概略図である。
このシステムは好ましくは約10〜200cm、一般には約100
cm以下の長さ、および好ましくは約10〜200μｍ（ミク
ロン）、一般には約50μｍの内径を有するキャピラリー
チューブ22を含む。図に示した例では、チューブを水平
位置に支持し下方に曲げられた末端領域をもつ。ひとつ
の好ましいキャピラリーチューブは50μｍの内径をもつ
溶融シリカチューブであり、ポリマイクロ・テクノロジ
ーズ（フェニックス、AZ）から入手できる。
ラリー電気泳動システム20（アプライド・バイオシステ
ムズ、フォスターシティ CA）の簡単な概略図である。
このシステムは好ましくは約10〜200cm、一般には約100
cm以下の長さ、および好ましくは約10〜200μｍ（ミク
ロン）、一般には約50μｍの内径を有するキャピラリー
チューブ22を含む。図に示した例では、チューブを水平
位置に支持し下方に曲げられた末端領域をもつ。ひとつ
の好ましいキャピラリーチューブは50μｍの内径をもつ
溶融シリカチューブであり、ポリマイクロ・テクノロジ
ーズ（フェニックス、AZ）から入手できる。
さらに一般に、キャピラリーチューブは、好ましくは
200μｍまたはそれ以下のカラム内部または直径の厚さ
にて、ポリマー溶液のカラムを支持することができるチ
ューブまたは導管のいずれかであることができる。例え
ば、チューブはガラススライド等に形成された導管の形
にすることができる。
200μｍまたはそれ以下のカラム内部または直径の厚さ
にて、ポリマー溶液のカラムを支持することができるチ
ューブまたは導管のいずれかであることができる。例え
ば、チューブはガラススライド等に形成された導管の形
にすることができる。
一般にキャピラリーチューブの内側表面はその内壁表
面に荷電した化学基を有する。本発明の１の具体例で
は、チューブの内側表面に好ましくは約４〜９の間のpH
にて負に荷電した化学基をもつ。表面の化学基は表面が
負に荷電したシラノール基を有する溶融シリカチューブ
に対する場合のように、キャピラリー物質の固有の性質
であることができる。あるいは、または加えて、キャピ
ラリー壁は内側のキャピラリー壁に、酸基のような負の
化学基を共有結合するための既知の誘導化試薬、または
既知の負に荷電した表面被覆剤を用いて処理することが
できる。あるいは、内壁表面に共有結合した正に荷電し
た基をもつように内壁表面を電子対を共有するように改
変することができる。ガラス等を誘導または被覆するた
めの方法は当該分野では良く知られている。１の好まし
いキャピラリーチューブは内径が50μｍの溶融シリカチ
ューブであり、ポリマイクロ・テクノロジーズ（フェニ
ックス AZ）から入手できる。
面に荷電した化学基を有する。本発明の１の具体例で
は、チューブの内側表面に好ましくは約４〜９の間のpH
にて負に荷電した化学基をもつ。表面の化学基は表面が
負に荷電したシラノール基を有する溶融シリカチューブ
に対する場合のように、キャピラリー物質の固有の性質
であることができる。あるいは、または加えて、キャピ
ラリー壁は内側のキャピラリー壁に、酸基のような負の
化学基を共有結合するための既知の誘導化試薬、または
既知の負に荷電した表面被覆剤を用いて処理することが
できる。あるいは、内壁表面に共有結合した正に荷電し
た基をもつように内壁表面を電子対を共有するように改
変することができる。ガラス等を誘導または被覆するた
めの方法は当該分野では良く知られている。１の好まし
いキャピラリーチューブは内径が50μｍの溶融シリカチ
ューブであり、ポリマイクロ・テクノロジーズ（フェニ
ックス AZ）から入手できる。
以下に示した極性は分離される生体分子に依存して切
り換えることができる：検出器の側の貯蔵器および試料
の側の貯蔵器−−カソードからアノードまでまたはアノ
ードからカソードまで。工程の極性は、各貯蔵器の電荷
に関連して、多くのキャピラリー電気泳動機械につき選
択することができる。
り換えることができる：検出器の側の貯蔵器および試料
の側の貯蔵器−−カソードからアノードまでまたはアノ
ードからカソードまで。工程の極性は、各貯蔵器の電荷
に関連して、多くのキャピラリー電気泳動機械につき選
択することができる。
システム内のカソードの貯蔵器26は電解質ポリマー溶
液28を含む：このポリマー溶液は以下に記載される。22
aで示されたチューブのカソード端部を、図に示すよう
に、電気泳動の間、ポリマー溶液に浸す。
液28を含む：このポリマー溶液は以下に記載される。22
aで示されたチューブのカソード端部を、図に示すよう
に、電気泳動の間、ポリマー溶液に浸す。
システム内の試料チューブ30は、チューブのカソード
末端に装填される生体分子の混合物を含む。好ましくは
試料物質は希釈電解溶液または水に溶解する。試料とカ
ソードの貯蔵器は、チューブのカソード下端を貯蔵液に
浸すことができる位置に配置するために、カルーセル等
に支持することができる。図には示していないが、カル
ーセルは、例えば、電気泳動の工程または異なるポリマ
ー溶液の間でチューブを洗浄またはフラッシするための
溶液を含む追加の貯蔵器を備えることができる。
末端に装填される生体分子の混合物を含む。好ましくは
試料物質は希釈電解溶液または水に溶解する。試料とカ
ソードの貯蔵器は、チューブのカソード下端を貯蔵液に
浸すことができる位置に配置するために、カルーセル等
に支持することができる。図には示していないが、カル
ーセルは、例えば、電気泳動の工程または異なるポリマ
ー溶液の間でチューブを洗浄またはフラッシするための
溶液を含む追加の貯蔵器を備えることができる。
22bで示される、チューブの反対のアノード端部は、
アノード貯蔵器32内にシールされており、図に示すよう
に、貯蔵器に含まれる電解溶液34を含有するアノードポ
リマー浸す。貯蔵器内の第二のチューブ38は、例えば，
洗浄溶液、電気泳動ポリマー溶液のように液体をチュー
ブを介して引き出し、貯蔵器30の生体分子試料物質をチ
ューブに装填するために、微細に調整された真空装置
（図には示していない）に連結する。真空装置に代わる
ものとして、正圧システムを使用して洗浄溶液、試料等
を導くことができる。
アノード貯蔵器32内にシールされており、図に示すよう
に、貯蔵器に含まれる電解溶液34を含有するアノードポ
リマー浸す。貯蔵器内の第二のチューブ38は、例えば，
洗浄溶液、電気泳動ポリマー溶液のように液体をチュー
ブを介して引き出し、貯蔵器30の生体分子試料物質をチ
ューブに装填するために、微細に調整された真空装置
（図には示していない）に連結する。真空装置に代わる
ものとして、正圧システムを使用して洗浄溶液、試料等
を導くことができる。
システムの高圧電源40は、２つの貯蔵器間に選択され
た電位を印加するため、図に示すようにカソードとアノ
ードの貯蔵器に連結する。電力供給導線を、それぞれ、
カソード貯蔵器とアノード貯蔵器の白金電極41、42に連
結する。電源は電極を通る定電圧（DC）を、好ましくは
５〜50KVに設定した電圧で、印加するように設計するこ
とができる。また代わりに、あるいは加えて、電源を貯
蔵器間に選択された周波数のパルス電圧を印加するよう
に設計することができる。一般にキャピラリーチューブ
が短いほど、印加できる電界強度が高くなり、電気泳動
分離が迅速になる。パルスした電圧モードで操作すると
き、電源は好ましくは約50HzからKHzの範囲まで調整で
きる周波数で、また約10〜30KVのrms電圧出力で方形波
パルスを出力する。MHzの範囲でも、さらに高いパルス
周波数を、いくつかの応用のために合わせることができ
る。
た電位を印加するため、図に示すようにカソードとアノ
ードの貯蔵器に連結する。電力供給導線を、それぞれ、
カソード貯蔵器とアノード貯蔵器の白金電極41、42に連
結する。電源は電極を通る定電圧（DC）を、好ましくは
５〜50KVに設定した電圧で、印加するように設計するこ
とができる。また代わりに、あるいは加えて、電源を貯
蔵器間に選択された周波数のパルス電圧を印加するよう
に設計することができる。一般にキャピラリーチューブ
が短いほど、印加できる電界強度が高くなり、電気泳動
分離が迅速になる。パルスした電圧モードで操作すると
き、電源は好ましくは約50HzからKHzの範囲まで調整で
きる周波数で、また約10〜30KVのrms電圧出力で方形波
パルスを出力する。MHzの範囲でも、さらに高いパルス
周波数を、いくつかの応用のために合わせることができ
る。
図１に示したシステムの説明を完成させるには、シス
テムの検出器44を、チューブ中の光学検出ゾーン46を通
って移動する生体分子を光学的に（例えばUV吸収または
蛍光）モニターするために、チューブのアノード端部付
近に設置する。検出器はUVまたは可視吸収検出用および
／または蛍光発光検出またはラジオアイソトープ検出用
に設計することができる。UV吸収は、例えばフローセル
をキャピラリーホルダーと共に有する、アプライド・バ
イオシステム・モデル270キャピラリー電気泳動システ
ムに組み込まれたUV吸収検出器を用いて、200〜280nmで
一般に行うことができる。
テムの検出器44を、チューブ中の光学検出ゾーン46を通
って移動する生体分子を光学的に（例えばUV吸収または
蛍光）モニターするために、チューブのアノード端部付
近に設置する。検出器はUVまたは可視吸収検出用および
／または蛍光発光検出またはラジオアイソトープ検出用
に設計することができる。UV吸収は、例えばフローセル
をキャピラリーホルダーと共に有する、アプライド・バ
イオシステム・モデル270キャピラリー電気泳動システ
ムに組み込まれたUV吸収検出器を用いて、200〜280nmで
一般に行うことができる。
蛍光発光検出は好ましくは、下記に述べるように、生
体分子と関連する蛍光種によって、約240〜500nmに調整
できる選ばれた励起波長で行われる。蛍光検出器の一例
は、ヒューレート・パッカード（パロ・アルト、CA）か
ら入手でき、キャピラリーチューブ検出用に上述のよう
に改良されたHP1046A検出器である。この検出器は電気
泳動ピークを記録するため積分器／プロッタ45に連結す
る。
体分子と関連する蛍光種によって、約240〜500nmに調整
できる選ばれた励起波長で行われる。蛍光検出器の一例
は、ヒューレート・パッカード（パロ・アルト、CA）か
ら入手でき、キャピラリーチューブ検出用に上述のよう
に改良されたHP1046A検出器である。この検出器は電気
泳動ピークを記録するため積分器／プロッタ45に連結す
る。
ラジオアイソトープ検出は、3Hまたは14C用の改良さ
れたHPLCアイソトープ検出器を使用して行うことができ
る（Radiomatic Instruments ＆ Chemical Co.,Inc.,Me
riden,CT）。
れたHPLCアイソトープ検出器を使用して行うことができ
る（Radiomatic Instruments ＆ Chemical Co.,Inc.,Me
riden,CT）。
操作には実施例２に詳述したように、貯蔵器32を真空
にしてキャピラリーチューブに適当な洗浄とすすぎの溶
液を引き出し、このチューブを完全に洗浄する。本発明
の実施においてポリマー含有電解質溶液それ自体は試料
工程間のシステムをフラッシするために使用することが
できる。ポリマー含有電解溶液とは異なる洗浄溶液を使
用する場合、次にチューブに若干量の電解質ポリマー溶
液をフラッシする。少量の一般には１〜10ナノリットル
の試料物質をカソードチューブ端部に真空注入によって
装填する。生体分子ピークがすべて検出ゾーンを通過す
るまでカソードとアノードの貯蔵器の間に電圧をかけ
る。
にしてキャピラリーチューブに適当な洗浄とすすぎの溶
液を引き出し、このチューブを完全に洗浄する。本発明
の実施においてポリマー含有電解質溶液それ自体は試料
工程間のシステムをフラッシするために使用することが
できる。ポリマー含有電解溶液とは異なる洗浄溶液を使
用する場合、次にチューブに若干量の電解質ポリマー溶
液をフラッシする。少量の一般には１〜10ナノリットル
の試料物質をカソードチューブ端部に真空注入によって
装填する。生体分子ピークがすべて検出ゾーンを通過す
るまでカソードとアノードの貯蔵器の間に電圧をかけ
る。
図２はパルス電界の下に電気泳動工程の端部まで操作
できる電気泳動システム50の断面図を示す。システムの
キャピラリーチューブ52は、56で示した検出ゾーンの付
近の上流で小さいクリアランスブレーク54を有する。ブ
レークのいずれかの側のチューブ部はチューブの内外に
電気泳動により移動する有孔のガラススリーブ58によっ
て連結されている。チューブの連結部は適当なポリマー
含有電界溶液62を充填した貯蔵器60内に密封する。貯蔵
器の接地電極64は負の側が適当なカソード貯蔵器と連結
されているパルス電圧電源66の高圧側に連結する。接地
電極64は負の側が適当なアノード貯蔵器と連結されてい
るDC電源68の高圧側に連結する。
できる電気泳動システム50の断面図を示す。システムの
キャピラリーチューブ52は、56で示した検出ゾーンの付
近の上流で小さいクリアランスブレーク54を有する。ブ
レークのいずれかの側のチューブ部はチューブの内外に
電気泳動により移動する有孔のガラススリーブ58によっ
て連結されている。チューブの連結部は適当なポリマー
含有電界溶液62を充填した貯蔵器60内に密封する。貯蔵
器の接地電極64は負の側が適当なカソード貯蔵器と連結
されているパルス電圧電源66の高圧側に連結する。接地
電極64は負の側が適当なアノード貯蔵器と連結されてい
るDC電源68の高圧側に連結する。
操作する際、チューブのカソード端に試料物質を充填
した後、パルス電圧電源を所望の電圧と周波数レベルに
調整し、DC電源を所望の電圧レベルに調整する。試料中
の生体分子をブレーク54の上流内のパルス電場下に分離
する。その後に、フラグメントをパルス周波数ノイズ効
果なしに光学的に検出できる検出ゾーンを通って一定電
圧の電界にフラグメントを運搬する。
した後、パルス電圧電源を所望の電圧と周波数レベルに
調整し、DC電源を所望の電圧レベルに調整する。試料中
の生体分子をブレーク54の上流内のパルス電場下に分離
する。その後に、フラグメントをパルス周波数ノイズ効
果なしに光学的に検出できる検出ゾーンを通って一定電
圧の電界にフラグメントを運搬する。
ここでは示していないが、予備の電気泳動用の分離さ
れた生体分子を収集するためにも電気泳動システムを容
易に適合させることができることは高く評価されるであ
ろう。試料収集は例えばフラグメントを溶出できる一連
のカソード貯蔵器を用いることによって行われる。
れた生体分子を収集するためにも電気泳動システムを容
易に適合させることができることは高く評価されるであ
ろう。試料収集は例えばフラグメントを溶出できる一連
のカソード貯蔵器を用いることによって行われる。
II.粘度特性 ポリマーまたはコポリマー溶液の粘度は、従来のキャ
ピラリー電気泳動器具に見いだされる圧力を用いるキャ
ピラリーによって溶液を引っ張るまたは押す速度を決定
する本発明のファクターである。キャピラリーを通る溶
液の流速は逐次分析の間に溶液マトリックスを置換する
ためにどの位の時間が必要であるかを決定する。過度の
置換時間は本発明の実用性または便利さを小さくする。
キャピラリーチューブの端部間の圧力Ｐによって、長さ
Ｌ、そして半径ｒのキャピラリーチューブを通って移動
する粘度ηの流体の流速ｖは、ポアズイユの式： ｖ＝πpr4/8Lη によって表される。
ピラリー電気泳動器具に見いだされる圧力を用いるキャ
ピラリーによって溶液を引っ張るまたは押す速度を決定
する本発明のファクターである。キャピラリーを通る溶
液の流速は逐次分析の間に溶液マトリックスを置換する
ためにどの位の時間が必要であるかを決定する。過度の
置換時間は本発明の実用性または便利さを小さくする。
キャピラリーチューブの端部間の圧力Ｐによって、長さ
Ｌ、そして半径ｒのキャピラリーチューブを通って移動
する粘度ηの流体の流速ｖは、ポアズイユの式： ｖ＝πpr4/8Lη によって表される。
この式はキャピラリーチューブ中の全容量を置換する
ため、時間ｔを要する溶液の粘度を計算するために再配
列することができる： η＝tpr2/8L2 例えば、50cmの長さ（Ｌ＝50）、50μＭの直径（ｒ＝
0.0025cm）のキャピラリーに20″Hgの圧力（ｐ＝0.678
バール）をかけると、30分（ｔ＝1,800秒）（この時間
は従来のキャピラリー電気泳動には多すぎると考えられ
ていた。）以内で置き換えられる容量をもつように38セ
ンチポワズ（η＝0.38ポワズ）以下の溶液濃度を必要と
するだろう。
ため、時間ｔを要する溶液の粘度を計算するために再配
列することができる： η＝tpr2/8L2 例えば、50cmの長さ（Ｌ＝50）、50μＭの直径（ｒ＝
0.0025cm）のキャピラリーに20″Hgの圧力（ｐ＝0.678
バール）をかけると、30分（ｔ＝1,800秒）（この時間
は従来のキャピラリー電気泳動には多すぎると考えられ
ていた。）以内で置き換えられる容量をもつように38セ
ンチポワズ（η＝0.38ポワズ）以下の溶液濃度を必要と
するだろう。
ポリマー／コポリマー溶液の粘度は本発明ではポリマ
ーの分子量と溶液中のその濃度によって決定される。溶
液の比粘度ηspは一定の調整された圧力および温度にて
キャピラリーチューブを流れるように、ポリマー溶液に
ついて時間ｔ、および水について時間t0を測定して計算
される。ABIモデル270キャピラリー電気泳動は20″Hgの
圧力と30℃の温度の場合にはキャピラリー粘度計として
用いられる。比粘度は次のように計算される： ηsp＝（t/t0）−１ ２％溶液の標準MW線状ポリアクリルアミド類（アクリ
ルアミド分子の線状重合によって形成されるポリアクリ
ルアミドは広範囲の分子量で入手できる；ポリサイエン
シーズ・インコーポレイテッド、ウォリントン、PA）を
使用して、図13において比粘度（上述のように測定し
た）の対数と分子量の対数との間に良好な線状の相関性
が認められる。この相関性の勾配は1.042であり、従来
技術に従って、この粘度は溶液中のポリマー／コポリマ
ーの大きさを直接測定される。従って、38センチポワズ
（比粘度30）以下の粘度の我々の例を用いると、２％の
ポリマー溶液は過剰な置換時間を避けるため約790,000
以下のMWのポリアクリルアミドを使用する必要がある。
ーの分子量と溶液中のその濃度によって決定される。溶
液の比粘度ηspは一定の調整された圧力および温度にて
キャピラリーチューブを流れるように、ポリマー溶液に
ついて時間ｔ、および水について時間t0を測定して計算
される。ABIモデル270キャピラリー電気泳動は20″Hgの
圧力と30℃の温度の場合にはキャピラリー粘度計として
用いられる。比粘度は次のように計算される： ηsp＝（t/t0）−１ ２％溶液の標準MW線状ポリアクリルアミド類（アクリ
ルアミド分子の線状重合によって形成されるポリアクリ
ルアミドは広範囲の分子量で入手できる；ポリサイエン
シーズ・インコーポレイテッド、ウォリントン、PA）を
使用して、図13において比粘度（上述のように測定し
た）の対数と分子量の対数との間に良好な線状の相関性
が認められる。この相関性の勾配は1.042であり、従来
技術に従って、この粘度は溶液中のポリマー／コポリマ
ーの大きさを直接測定される。従って、38センチポワズ
（比粘度30）以下の粘度の我々の例を用いると、２％の
ポリマー溶液は過剰な置換時間を避けるため約790,000
以下のMWのポリアクリルアミドを使用する必要がある。
ポリマーまたはコポリマーの濃度が溶液中に増加する
場合、溶液の粘度が対応して増加する。この事実は図14
に示され、溶液中の367,000ダルトンMWの線状ポリアク
リルアミド（ポリサイエンシーズ・インコーポレイテッ
ド）の比粘度の対数と％（w/v）との間に良好な線状の
相関性がある。そこで、30以下の比粘度の例では、367K
Dポリアクリルアミドは過剰の置換時間を避けるため約
3.1％（w/v）以下で溶液中に存在する必要がある。
場合、溶液の粘度が対応して増加する。この事実は図14
に示され、溶液中の367,000ダルトンMWの線状ポリアク
リルアミド（ポリサイエンシーズ・インコーポレイテッ
ド）の比粘度の対数と％（w/v）との間に良好な線状の
相関性がある。そこで、30以下の比粘度の例では、367K
Dポリアクリルアミドは過剰の置換時間を避けるため約
3.1％（w/v）以下で溶液中に存在する必要がある。
ポリマー／コポリマーの粘度と濃度の間の関係は、混
合物中の生体分子を分解するために高い濃度を要する場
合、低分子量のポリマー／コポリマーを使用して粘度を
低く保つことができることを示唆している。逆に、さら
に低い濃度パーセントのポリマー／コポリマーではさら
に高い分子量のポリマー／コポリマーを使用することが
できる。
合物中の生体分子を分解するために高い濃度を要する場
合、低分子量のポリマー／コポリマーを使用して粘度を
低く保つことができることを示唆している。逆に、さら
に低い濃度パーセントのポリマー／コポリマーではさら
に高い分子量のポリマー／コポリマーを使用することが
できる。
ポリマーまたはコポリマーのMWは多くの異なる方法に
よって調整される。第一は、重合の条件を最終のポリマ
ー生成物のMWに変化を与えるために変える。コポリマー
／ポリマーの粘度平均MWは（１）反応温度を増加し、
（２）メタノールのような反応混合物中の水混和性溶媒
の中味を増加し、または（３）開始剤の濃度を増加し
て、減少させる。作られる特定のポリマー／コポリマー
に依存して、他の重合条件または添加剤を使用してMWを
調整するので、反応条件の上記リストは全部を含むもの
ではない。
よって調整される。第一は、重合の条件を最終のポリマ
ー生成物のMWに変化を与えるために変える。コポリマー
／ポリマーの粘度平均MWは（１）反応温度を増加し、
（２）メタノールのような反応混合物中の水混和性溶媒
の中味を増加し、または（３）開始剤の濃度を増加し
て、減少させる。作られる特定のポリマー／コポリマー
に依存して、他の重合条件または添加剤を使用してMWを
調整するので、反応条件の上記リストは全部を含むもの
ではない。
ポリマー／コポリマーの平均MWを調整する第２の方法
は、異なるMW画分に多分散ポリマー生成物を分別し次い
で単離および精製する。ポリマー／コポリマーの水溶液
は（１）大きさによるクロマトグラフィー分離（例えば
ゲル浸透クロマトグラフィー）、（２）規定されたMWカ
ットオフの膜を用いる透析、または（３）メタノールの
ような水混和性溶媒を用いる分別沈澱によって分離され
る。
は、異なるMW画分に多分散ポリマー生成物を分別し次い
で単離および精製する。ポリマー／コポリマーの水溶液
は（１）大きさによるクロマトグラフィー分離（例えば
ゲル浸透クロマトグラフィー）、（２）規定されたMWカ
ットオフの膜を用いる透析、または（３）メタノールの
ような水混和性溶媒を用いる分別沈澱によって分離され
る。
ポリマー／コポリマー溶液の濃度は（１）特定容量の
水性緩衝液に異なる重量の固体ポリマーを添加して固体
が完全に溶解するまで混合して、または（２）異なる重
量または容量の濃縮した水性ポリマー溶液を特定容量の
水性緩衝液に添加して濃縮物が完全に分散するまで混合
して、調整される。
水性緩衝液に異なる重量の固体ポリマーを添加して固体
が完全に溶解するまで混合して、または（２）異なる重
量または容量の濃縮した水性ポリマー溶液を特定容量の
水性緩衝液に添加して濃縮物が完全に分散するまで混合
して、調整される。
ポリマー／コポリマーMWおよび／または溶液中のその
濃度の上限は、主としてキャピラリーを通って押すかま
たは引っ張ることができるさらに上の粘度によって、指
示されるであろうことは明かである。このさらに上の粘
度は先の等式で表されるような器械のパラメーターによ
って用意される。従って、例えば、キャピラリー電気泳
動に半径の大きい（ｒ＝0.01cm）短いキャピラリー（Ｌ
＝20cm）を用いた場合、約38625センチポワズの粘度の
溶液を高圧（Ｐ＝100psi＝6.87バール）にて30分でキャ
ピラリーに通すことができる。図13のデータを用いる
（比粘度対数対ポリアクリルアミド濃度）と、さらに高
い濃度はMW＝367KDのポリアクリルアミドに対して約９
％（w/v）である。明らかに、さらに低いMWのポリアク
リルアミドを用いると、さらに高い濃度に対する溶液を
キャピラリーに通すことができ、20％（w/v）に近い濃
度を使用できることを予期することは非現実的ではな
い。
濃度の上限は、主としてキャピラリーを通って押すかま
たは引っ張ることができるさらに上の粘度によって、指
示されるであろうことは明かである。このさらに上の粘
度は先の等式で表されるような器械のパラメーターによ
って用意される。従って、例えば、キャピラリー電気泳
動に半径の大きい（ｒ＝0.01cm）短いキャピラリー（Ｌ
＝20cm）を用いた場合、約38625センチポワズの粘度の
溶液を高圧（Ｐ＝100psi＝6.87バール）にて30分でキャ
ピラリーに通すことができる。図13のデータを用いる
（比粘度対数対ポリアクリルアミド濃度）と、さらに高
い濃度はMW＝367KDのポリアクリルアミドに対して約９
％（w/v）である。明らかに、さらに低いMWのポリアク
リルアミドを用いると、さらに高い濃度に対する溶液を
キャピラリーに通すことができ、20％（w/v）に近い濃
度を使用できることを予期することは非現実的ではな
い。
上記の関係から明らかなように、さらに高い圧力を有
する器具は、さらに低い圧力を発生する器具に関係する
所定の濃度のポリマーに対し一層高い流速を与えること
ができる。さらに例として、大きい直径のキャピラリー
は小さい直径のキャピラリーチューブに対して大きい流
速を与えることができる。流速に影響を及ぼす要素は流
速に影響を及ぼす上記のパラメーターに基づき処理する
ことができる。
する器具は、さらに低い圧力を発生する器具に関係する
所定の濃度のポリマーに対し一層高い流速を与えること
ができる。さらに例として、大きい直径のキャピラリー
は小さい直径のキャピラリーチューブに対して大きい流
速を与えることができる。流速に影響を及ぼす要素は流
速に影響を及ぼす上記のパラメーターに基づき処理する
ことができる。
III.ポリマー溶液と電気浸透流 ポリマー溶液マトリックス中の電気浸透流の現象は、
キャピラリー電気泳動チューブ70の拡大した断片部分を
示している図３を参照して正味の負の電荷をもつ内側の
キャピラリーチューブ壁に対して記載される。
キャピラリー電気泳動チューブ70の拡大した断片部分を
示している図３を参照して正味の負の電荷をもつ内側の
キャピラリーチューブ壁に対して記載される。
図３に見られるように、「−」の符号で示した、チュ
ーブ内壁の負に荷電した基が、チューブ内の流体カラム
の周りに正に荷電したシェルを基本的に形成するポリマ
ー電界質溶液中に存在する緩くまたは堅く結合した正に
荷電したイオンによって遮蔽されている。壁表面で正の
イオンのシェルの厚さは電気二重層として知られてい
る。この電気二重層はキャピラリー壁にて電位の基準で
あるゼータ電位によって特徴づけられる。
ーブ内壁の負に荷電した基が、チューブ内の流体カラム
の周りに正に荷電したシェルを基本的に形成するポリマ
ー電界質溶液中に存在する緩くまたは堅く結合した正に
荷電したイオンによって遮蔽されている。壁表面で正の
イオンのシェルの厚さは電気二重層として知られてい
る。この電気二重層はキャピラリー壁にて電位の基準で
あるゼータ電位によって特徴づけられる。
電界の影響下で、（正の電荷のシェルによって囲まれ
ている）媒体中のポリマー溶液のこのカラムは正のシェ
ルの移動方向に（すなわち、カソードの方へ）電気浸透
により引き出される。チューブ内の電気浸透流の速度は
図中の矢印ｅで示される（矢印ｅは大きさｅのベクトル
及びチューブ軸に沿った方向と考えることができる）。
キャピラリーチューブ内の電気浸透流の速度ｅは次式で
表される： ｅ＝εζE/4πη 式中のε、η、ζ、およびＥはそれぞれ、二重層の誘
電率、その粘度；ゼータ電位；および電界強度である。
ている）媒体中のポリマー溶液のこのカラムは正のシェ
ルの移動方向に（すなわち、カソードの方へ）電気浸透
により引き出される。チューブ内の電気浸透流の速度は
図中の矢印ｅで示される（矢印ｅは大きさｅのベクトル
及びチューブ軸に沿った方向と考えることができる）。
キャピラリーチューブ内の電気浸透流の速度ｅは次式で
表される： ｅ＝εζE/4πη 式中のε、η、ζ、およびＥはそれぞれ、二重層の誘
電率、その粘度；ゼータ電位；および電界強度である。
本発明の方法では、電解質溶液中のポリマーまたはコ
ポリマーは逆に荷電したキャピラリー壁に結合するため
に十分な電荷パーセントを有する。この結合は電気二重
層の誘電率を減少し、または粘度を増加し、またはその
両方によって、キャピラリーチューブ中の電気浸透流を
有意に減少または除去する。電気浸透流の水準を十分に
下げてバンドの実質的なテーリング、または広がりのな
い、すなわち分解率を下げることなく分離生体分子の別
々のピークまたはバンドを可能にしなければならない。
上述したように、本発明の方法による生体分子の分離は
電解質溶液中のポリマーおよび／またはコポリマーによ
って与えられる篩分け効果を支配的に信頼する。電気浸
透流の特定のポリマー／コポリマー溶液における電荷パ
ーセントの効果は次のように評価することができる。
ポリマーは逆に荷電したキャピラリー壁に結合するため
に十分な電荷パーセントを有する。この結合は電気二重
層の誘電率を減少し、または粘度を増加し、またはその
両方によって、キャピラリーチューブ中の電気浸透流を
有意に減少または除去する。電気浸透流の水準を十分に
下げてバンドの実質的なテーリング、または広がりのな
い、すなわち分解率を下げることなく分離生体分子の別
々のピークまたはバンドを可能にしなければならない。
上述したように、本発明の方法による生体分子の分離は
電解質溶液中のポリマーおよび／またはコポリマーによ
って与えられる篩分け効果を支配的に信頼する。電気浸
透流の特定のポリマー／コポリマー溶液における電荷パ
ーセントの効果は次のように評価することができる。
電気浸透流は一般に一定のポリマー／コポリマー電解
質溶液を含有するキャピラリーチューブによって電気的
に中性の物質の移動度（cm2/秒・Ｖ）として測定される
（実施例２）。
質溶液を含有するキャピラリーチューブによって電気的
に中性の物質の移動度（cm2/秒・Ｖ）として測定される
（実施例２）。
IV.生体分子の分離 本発明の分離方法はポリマー含有電解質溶液の配合に
おいて多数のポリマーおよびコポリマーを用いることが
できる。
おいて多数のポリマーおよびコポリマーを用いることが
できる。
一般に、本発明の方法に用いられるポリマーまたはコ
ポリマーは分子量が20と5,000キロダルトンの間であ
る。本発明方法に有用なポリマーおよびコポリマーの例
には次のものを含む：ポリアクリルアミド類、例えばポ
リアクリルアミド、ポリ（N,N−ジメチルアクリルアミ
ド）およびポリメタクリルアミド；ポリオキシド類、例
えばポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシ
ド；ポリエーテル類、例えばポリビニルメチルエーテ
ル；ビニルポリマー類、例えばポリビニルピロリジン、
ポリビニルアルコール、およびポリビニルアセテート；
天然ゴム類または多糖類、例えばキサンタン、デキスト
ラン、寒天、グアールおよび澱粉類；セルロースポリマ
ー類、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロ
キシプロピル−メチルセルロース；およびアクリルポリ
マー類、例えばポリヒドロキシエチルメタクリレートお
よびポリエチレングリコールモノメタクリレート。ポリ
マーおよびコポリマーの混合物も本発明の実施において
使用することができる。
ポリマーは分子量が20と5,000キロダルトンの間であ
る。本発明方法に有用なポリマーおよびコポリマーの例
には次のものを含む：ポリアクリルアミド類、例えばポ
リアクリルアミド、ポリ（N,N−ジメチルアクリルアミ
ド）およびポリメタクリルアミド；ポリオキシド類、例
えばポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシ
ド；ポリエーテル類、例えばポリビニルメチルエーテ
ル；ビニルポリマー類、例えばポリビニルピロリジン、
ポリビニルアルコール、およびポリビニルアセテート；
天然ゴム類または多糖類、例えばキサンタン、デキスト
ラン、寒天、グアールおよび澱粉類；セルロースポリマ
ー類、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロ
キシプロピル−メチルセルロース；およびアクリルポリ
マー類、例えばポリヒドロキシエチルメタクリレートお
よびポリエチレングリコールモノメタクリレート。ポリ
マーおよびコポリマーの混合物も本発明の実施において
使用することができる。
選択されたポリマーまたはコポリマーの電荷パーセン
トは多くの方法で達成することができる（実施例１）。
本発明の方法においてホモポリマーを使用する場合、そ
れらを改変して特定の電荷パーセントを含むようにす
る。重合後または重合中に、ホモポリマーを、例えばビ
ニルアミンを生成するようにポリアクリルアミドにホフ
マン分解を行い（クリック）、改変して所望の平均電荷
パーセントを含むようにする。ホモポリマーの例は、広
範囲の分子量で入手でき、ポリアクリルアミド分子を形
成するように過硫酸アンモニウムの存在で線状に重合さ
れたポリアクリルアミドである。
トは多くの方法で達成することができる（実施例１）。
本発明の方法においてホモポリマーを使用する場合、そ
れらを改変して特定の電荷パーセントを含むようにす
る。重合後または重合中に、ホモポリマーを、例えばビ
ニルアミンを生成するようにポリアクリルアミドにホフ
マン分解を行い（クリック）、改変して所望の平均電荷
パーセントを含むようにする。ホモポリマーの例は、広
範囲の分子量で入手でき、ポリアクリルアミド分子を形
成するように過硫酸アンモニウムの存在で線状に重合さ
れたポリアクリルアミドである。
コポリマーもまた本発明の方法では有用である。コポ
リマーのひとつの利点は所望の電荷基を含むようにサブ
ユニットのひとつを特に選択することができることであ
る。このサブユニットは次に他のサブユニットとの重合
反応に所定の濃度で添加して、所望の電荷パーセント特
性をもつコポリマーを生成することができる。例えば、
アクリルアミド（［AAm］）およびテトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED）、またはアクリルアミドおよびジ
アリルジメチルアンモニウムクロリド（DADMAC）のコポ
リマーは、実施例１および２に記載したように生成する
ことができる。これらのコポリマーは広範囲の電荷パー
セント値、ならびにある範囲の粘度値をカバーすること
ができる。
リマーのひとつの利点は所望の電荷基を含むようにサブ
ユニットのひとつを特に選択することができることであ
る。このサブユニットは次に他のサブユニットとの重合
反応に所定の濃度で添加して、所望の電荷パーセント特
性をもつコポリマーを生成することができる。例えば、
アクリルアミド（［AAm］）およびテトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED）、またはアクリルアミドおよびジ
アリルジメチルアンモニウムクロリド（DADMAC）のコポ
リマーは、実施例１および２に記載したように生成する
ことができる。これらのコポリマーは広範囲の電荷パー
セント値、ならびにある範囲の粘度値をカバーすること
ができる。
実施例１および２の反応機構において他の型のアクリ
ルアミドを置換することによって、他の型の荷電したコ
ポリマー、例えばポリ（メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ
−メチルアクリルアミド）またはポリ（N,N−ジメチル
アクリルアミド）を合成することができる。例えば、ポ
リマーはN,N−ジメチルアクリルアミドおよびテトラメ
チルエチレンジアミン（TEMED）のコポリマーであるこ
とができ、コポリマーの分子量は約200と800キロダルト
ンの間であり、ポリマー分子はN,N−ジメチルアクリル
アミドのサブユニットにつき第３アミンテトラメチルエ
チレンジアミンを0.03ないし0.6％含む。
ルアミドを置換することによって、他の型の荷電したコ
ポリマー、例えばポリ（メタクリルアミド）、ポリ（Ｎ
−メチルアクリルアミド）またはポリ（N,N−ジメチル
アクリルアミド）を合成することができる。例えば、ポ
リマーはN,N−ジメチルアクリルアミドおよびテトラメ
チルエチレンジアミン（TEMED）のコポリマーであるこ
とができ、コポリマーの分子量は約200と800キロダルト
ンの間であり、ポリマー分子はN,N−ジメチルアクリル
アミドのサブユニットにつき第３アミンテトラメチルエ
チレンジアミンを0.03ないし0.6％含む。
さらに、グラフトまたはブロックコポリマーも本発明
の実施に有用である。水性グラフト荷電ポリマーは荷電
していないポリマーの存在で荷電したコポリマーの重合
によって生成することができる。このようなグラフト反
応の１例はデキストランへのアクリルアミドとDADMACの
グラフトコポリマーについて実施例1Dで示されている。
の実施に有用である。水性グラフト荷電ポリマーは荷電
していないポリマーの存在で荷電したコポリマーの重合
によって生成することができる。このようなグラフト反
応の１例はデキストランへのアクリルアミドとDADMACの
グラフトコポリマーについて実施例1Dで示されている。
本発明のポリマーおよびコポリマーの改良に有用な荷
電した基またはサブユニットは次のものを含む：第１ア
ミン類、例えばビニルアミン、グルコサミン；第２アミ
ン類、例えばエチレンイミン；第３アミン類、例えばビ
ニルピリジン、およびテトラメチルエチレンジアミン
（TEMED）；第４アミン類、例えばビニル−Ｎ−メチル
ピリジン、N,N−ジメチル−3,5−メチレンピペリジン
（DADMAC）；カルボン酸類；例えばアクリル酸、メタク
リル酸、およびリンゴ酸；スルホン酸類、例えばビニル
スルホン酸；リン酸類、例えばビニルリン酸；硫酸類、
例えばビニル硫酸；およびホスホン酸類、例えばビニル
ホスホン酸。
電した基またはサブユニットは次のものを含む：第１ア
ミン類、例えばビニルアミン、グルコサミン；第２アミ
ン類、例えばエチレンイミン；第３アミン類、例えばビ
ニルピリジン、およびテトラメチルエチレンジアミン
（TEMED）；第４アミン類、例えばビニル−Ｎ−メチル
ピリジン、N,N−ジメチル−3,5−メチレンピペリジン
（DADMAC）；カルボン酸類；例えばアクリル酸、メタク
リル酸、およびリンゴ酸；スルホン酸類、例えばビニル
スルホン酸；リン酸類、例えばビニルリン酸；硫酸類、
例えばビニル硫酸；およびホスホン酸類、例えばビニル
ホスホン酸。
実施例２の反応機構において、DADMACに対し荷電した
サブユニットの他の型を置換することによって、他の型
の荷電したコポリマーを合成することができ、例えばポ
リアクリルアミドは次の化合物から誘導された低いパー
セントの荷電したサブユニットを含む：［３−（メタク
リロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムク
ロリドまたはサブユニットの２−メタクリルオキシエチ
ル（トリメチルアンモニウム）クロリド。同様に、実施
例１のTEMEDは、ポリアクリルアミド、例えば2,2′−ア
ゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジクロリドに
荷電した基を導入する等しい反応性の化合物によって置
換することができる。
サブユニットの他の型を置換することによって、他の型
の荷電したコポリマーを合成することができ、例えばポ
リアクリルアミドは次の化合物から誘導された低いパー
セントの荷電したサブユニットを含む：［３−（メタク
リロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムク
ロリドまたはサブユニットの２−メタクリルオキシエチ
ル（トリメチルアンモニウム）クロリド。同様に、実施
例１のTEMEDは、ポリアクリルアミド、例えば2,2′−ア
ゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジクロリドに
荷電した基を導入する等しい反応性の化合物によって置
換することができる。
例えば、ポリマーはアクリルアミドおよび［３−（メ
タクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウ
ムクロリドのコポリマーであることができ、コポリマー
は約200と600キロダルトンの間の分子量を有し、ポリマ
ー分子はアクリルアミドのサブユニットにつき0.01ない
し0.2％の第４アミンＮ−［（プロピル）トリメチルア
ンモニウムクロリド］メタクリルアミドを含む。
タクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウ
ムクロリドのコポリマーであることができ、コポリマー
は約200と600キロダルトンの間の分子量を有し、ポリマ
ー分子はアクリルアミドのサブユニットにつき0.01ない
し0.2％の第４アミンＮ−［（プロピル）トリメチルア
ンモニウムクロリド］メタクリルアミドを含む。
荷電した基を含有する上記分子は当該分野で知られて
いる方法によってホモポリマーに配合することができる
（実施例１参照）。本発明に有用なポリマーおよびコポ
リマーはまた正および負の両方の電荷基を含む両性ポリ
マーであることができる：異なる荷電したユニットを同
じポリマーに導入し、正と負の電荷基のミックスを含ま
せることができる。例えば、ポリマーまたはコポリマー
分子は少なくとも第１アミン、第２アミン、および／ま
たは第４アミン基、および少なくともカルボン酸、スル
ホン酸、リン酸、硫酸、および／またはホスホン酸基を
含むことができる。このような両性ポリマーの使用は、
例えば、ポリマーの正の電荷が非共有的に負のキャピラ
リー壁と結合することができるので分離に有用であり、
ポリマーの僅かに負の電荷反発によって分離を改善する
ことができる。溶液中では、ポリマーの正と負の電荷が
電荷もまた非共有的に結合し、マトリックスの篩分けの
性質を改良することができる。
いる方法によってホモポリマーに配合することができる
（実施例１参照）。本発明に有用なポリマーおよびコポ
リマーはまた正および負の両方の電荷基を含む両性ポリ
マーであることができる：異なる荷電したユニットを同
じポリマーに導入し、正と負の電荷基のミックスを含ま
せることができる。例えば、ポリマーまたはコポリマー
分子は少なくとも第１アミン、第２アミン、および／ま
たは第４アミン基、および少なくともカルボン酸、スル
ホン酸、リン酸、硫酸、および／またはホスホン酸基を
含むことができる。このような両性ポリマーの使用は、
例えば、ポリマーの正の電荷が非共有的に負のキャピラ
リー壁と結合することができるので分離に有用であり、
ポリマーの僅かに負の電荷反発によって分離を改善する
ことができる。溶液中では、ポリマーの正と負の電荷が
電荷もまた非共有的に結合し、マトリックスの篩分けの
性質を改良することができる。
いくつかの場合において、上記の荷電した基を含有す
る分子はまた、例えばアクリルアミドとDADMACについて
実施例１で示したように、コポリマーに直接配合するこ
ともできる。
る分子はまた、例えばアクリルアミドとDADMACについて
実施例１で示したように、コポリマーに直接配合するこ
ともできる。
実施例２はアクリルアミド（［AAm］）とTEMEDまたは
DADMACのコポリマーの使用を記載する。電気浸透流の速
度は中性マーカーを使用して測定した。［AAm］に対す
るTEMEDまたはDADMACの割合は図４と５の下部に示した
値の範囲で変化させた。TEMEDおよびDADMACの両者の場
合において、電気浸透流（EOF）の速度は0.05％の電荷
パーセントの値で有意に減少した（約２×10-5cm2/sec
・Ｖ以下）。
DADMACのコポリマーの使用を記載する。電気浸透流の速
度は中性マーカーを使用して測定した。［AAm］に対す
るTEMEDまたはDADMACの割合は図４と５の下部に示した
値の範囲で変化させた。TEMEDおよびDADMACの両者の場
合において、電気浸透流（EOF）の速度は0.05％の電荷
パーセントの値で有意に減少した（約２×10-5cm2/sec
・Ｖ以下）。
図４は、重合反応において増加するTEMED濃度の粘度
とEOFの効果を示す。EOFを測定するため２％（w/w）の
一定のポリアクリルアミド濃度を用いると、TEMED％の
増加と共にEOFは減少し、図４に示した結果は約0.05％
ないし0.5％の範囲をカバーする電荷パーセント値に対
しEOFは２×10-5cm2/sec・Ｖ以下であることを示してい
る。ポリマー溶液の粘度はTEMED％の増加と共に減少
し、約0.2％以上の比較的一定の値であった。これらの
データーは正の電荷パーセントでは増加し、粘度では増
加がなく、その結果EOFが減少したことを示す。
とEOFの効果を示す。EOFを測定するため２％（w/w）の
一定のポリアクリルアミド濃度を用いると、TEMED％の
増加と共にEOFは減少し、図４に示した結果は約0.05％
ないし0.5％の範囲をカバーする電荷パーセント値に対
しEOFは２×10-5cm2/sec・Ｖ以下であることを示してい
る。ポリマー溶液の粘度はTEMED％の増加と共に減少
し、約0.2％以上の比較的一定の値であった。これらの
データーは正の電荷パーセントでは増加し、粘度では増
加がなく、その結果EOFが減少したことを示す。
図５は重合反応においてDADMAC濃度を増加すると２％
（w/w）ポリアクリルアミドの粘度とEOFに影響があるこ
とを示している。図５に示される結果から見られるよう
に、EOFはDADMAC％の増加と共に減少し、約0.05％ない
し0.26％の範囲にわたる電荷パーセント値に対し２×10
-5cm2/秒・Ｖ以下である。ポリマー溶液の粘度はDADMAC
％の増加と共に増減するが、同じ範囲の0.05ないし0.26
％では線状の形で増加する。0.05％ないし0.5％の範囲
での電荷パーセント値を有するDADMAC/［AAm］コポリマ
ーは異なる寸法および／または形状をもつ広範囲の生体
分子の分離のために有用である。従って、このデーター
はまたEOFの減少が正の電荷の％の増加に起因し、粘度
の増加に起因しないことを示している。
（w/w）ポリアクリルアミドの粘度とEOFに影響があるこ
とを示している。図５に示される結果から見られるよう
に、EOFはDADMAC％の増加と共に減少し、約0.05％ない
し0.26％の範囲にわたる電荷パーセント値に対し２×10
-5cm2/秒・Ｖ以下である。ポリマー溶液の粘度はDADMAC
％の増加と共に増減するが、同じ範囲の0.05ないし0.26
％では線状の形で増加する。0.05％ないし0.5％の範囲
での電荷パーセント値を有するDADMAC/［AAm］コポリマ
ーは異なる寸法および／または形状をもつ広範囲の生体
分子の分離のために有用である。従って、このデーター
はまたEOFの減少が正の電荷の％の増加に起因し、粘度
の増加に起因しないことを示している。
実施例２に記載された方法は、減少したEOFを得るた
めに、本発明の方法を実施する際に使用されるポリマー
またはコポリマーに含まれる電荷パーセントのコントロ
ールに有用である。
めに、本発明の方法を実施する際に使用されるポリマー
またはコポリマーに含まれる電荷パーセントのコントロ
ールに有用である。
生体分子の分離のために、キャピラリーチューブは一
般に、（ａ）20と5,000キロダルトンの間の分子量、お
よび（ｂ）全ポリマーサブユニットに対し荷電したモノ
マーサブユニットのモルパーセントによって測定される
ような0.01ないし1.0％の間の電荷パーセント、を有す
る少なくとも１のポリマーまたはコポリマー種を含有す
る非架橋の親水性ポリマーまたはコポリマー溶液の重量
に対し0.05ないし30重量％（w/w）を含有する電解質溶
液で充填される。溶液中のポリマーまたはコポリマーの
電荷は選択された電気泳動pHで壁電荷と正反対である。
般に、（ａ）20と5,000キロダルトンの間の分子量、お
よび（ｂ）全ポリマーサブユニットに対し荷電したモノ
マーサブユニットのモルパーセントによって測定される
ような0.01ないし1.0％の間の電荷パーセント、を有す
る少なくとも１のポリマーまたはコポリマー種を含有す
る非架橋の親水性ポリマーまたはコポリマー溶液の重量
に対し0.05ないし30重量％（w/w）を含有する電解質溶
液で充填される。溶液中のポリマーまたはコポリマーの
電荷は選択された電気泳動pHで壁電荷と正反対である。
図４と５に示される結果は、EOFの減少の原因である
ものは粘度ではなく、むしろポリマー／コポリマー分子
の電荷パーセントであることを示している。
ものは粘度ではなく、むしろポリマー／コポリマー分子
の電荷パーセントであることを示している。
実施例３は生体分子の分離のために多くのコポリマー
溶液を使用することを記載している。タンパク質の混合
物の分離は本方法の分子篩分け性能を示すために使用し
た。図６は次の成分を有するタンパク質混合物を別々の
ピークに分離することを示している：α−ラクトアルブ
ミン（14kd）、トリプシン阻害剤（20kd）、卵アルブミ
ン（45kd）、牛アルブミン（66kd）、およびβ−ガラク
トシダーゼ（116kd）。図６では、左から右へのピーク
順は、それぞれ前記タンパク質に対応する。分離のため
に使用したDADMAC/［AAm］％は各電気泳動図の右側に示
される。図６から認められるように、0.26、0.1、ない
し0.05％の範囲での電荷パーセント値はタンパク質混合
物中の各タンパク質の分離にすべて有効である。コポリ
マー電解質溶液（図６）の分解能力を同じコポリマー溶
液（図５）のEOFと比較すると、0.26、0.1、および0.05
％の各値は２×10-5cm2/秒・Ｖ以下のEOF移動値を有す
ることを示している。
溶液を使用することを記載している。タンパク質の混合
物の分離は本方法の分子篩分け性能を示すために使用し
た。図６は次の成分を有するタンパク質混合物を別々の
ピークに分離することを示している：α−ラクトアルブ
ミン（14kd）、トリプシン阻害剤（20kd）、卵アルブミ
ン（45kd）、牛アルブミン（66kd）、およびβ−ガラク
トシダーゼ（116kd）。図６では、左から右へのピーク
順は、それぞれ前記タンパク質に対応する。分離のため
に使用したDADMAC/［AAm］％は各電気泳動図の右側に示
される。図６から認められるように、0.26、0.1、ない
し0.05％の範囲での電荷パーセント値はタンパク質混合
物中の各タンパク質の分離にすべて有効である。コポリ
マー電解質溶液（図６）の分解能力を同じコポリマー溶
液（図５）のEOFと比較すると、0.26、0.1、および0.05
％の各値は２×10-5cm2/秒・Ｖ以下のEOF移動値を有す
ることを示している。
0.26％の値では、ベースラインがかなり下方に傾いて
いるが、長い走行時間でデータが不明確になったためで
ある。一般に、電荷パーセントの上限は有意のベースラ
インの不安の原因（すなわち、傾斜、スパイク等）とな
らない値として決定される。これはポリマーの種類に依
存するが、この上限値が１％を越えることはめったにな
い。
いるが、長い走行時間でデータが不明確になったためで
ある。一般に、電荷パーセントの上限は有意のベースラ
インの不安の原因（すなわち、傾斜、スパイク等）とな
らない値として決定される。これはポリマーの種類に依
存するが、この上限値が１％を越えることはめったにな
い。
図７は上記タンパク質混合物の別々のピークへの分離
を示す。分離のために使用されるDADMAC/［AAm］％は各
電気泳動図の右側に示される。図７から見られるよう
に、0.02％およびそれ以下の電荷パーセント値は、バン
ドがかなり広がり感度がなくなっているためタンパク質
混合物中の各タンパク質の分離には効果がない。コポリ
マー電解質溶液の分離能力（図７）を同じコポリマー溶
液のEOF（図５）と比較すると、0.02％およびそれ以下
の値の各々は２×10-5cm2/秒・Ｖ以上のEOF移動度値を
もつ。
を示す。分離のために使用されるDADMAC/［AAm］％は各
電気泳動図の右側に示される。図７から見られるよう
に、0.02％およびそれ以下の電荷パーセント値は、バン
ドがかなり広がり感度がなくなっているためタンパク質
混合物中の各タンパク質の分離には効果がない。コポリ
マー電解質溶液の分離能力（図７）を同じコポリマー溶
液のEOF（図５）と比較すると、0.02％およびそれ以下
の値の各々は２×10-5cm2/秒・Ｖ以上のEOF移動度値を
もつ。
生体分子の混合物の成分の分離に加えて、本発明の方
法はまた選択された生体分子の分子量の決定に有用であ
る。実施例3Bは選択された分子量の標準に対する既知の
タンパク質の標準の相対的移動に基づく分子量較正曲線
の生成を記載する。図10はα−ラクトアルブミン（選択
された参照標準）に関してタンパク質の標準の移動に対
する対数（MW）の較正曲線を示す。既知の分子量と電荷
を有する任意の数の化合物を相対的移動を確立するよう
に参照標準として使用することができる：例えば、荷電
した有機分子、染料、核酸、タンパク質、および他の荷
電した生体分子。実際に、未知の分子量を有する化合物
の移動は選択された参照標準、例えばα−ラクトアルブ
ミンに関して決定され、次に分子量は標準曲線と比較し
て決定される。
法はまた選択された生体分子の分子量の決定に有用であ
る。実施例3Bは選択された分子量の標準に対する既知の
タンパク質の標準の相対的移動に基づく分子量較正曲線
の生成を記載する。図10はα−ラクトアルブミン（選択
された参照標準）に関してタンパク質の標準の移動に対
する対数（MW）の較正曲線を示す。既知の分子量と電荷
を有する任意の数の化合物を相対的移動を確立するよう
に参照標準として使用することができる：例えば、荷電
した有機分子、染料、核酸、タンパク質、および他の荷
電した生体分子。実際に、未知の分子量を有する化合物
の移動は選択された参照標準、例えばα−ラクトアルブ
ミンに関して決定され、次に分子量は標準曲線と比較し
て決定される。
実施例3Cは本発明の方法の再現性を示す。３％w/vの
アクリルアミド/TEDMEDコポリマー溶液を使用してタン
パク質標準物の混合物を分離した。50の逐次実験をタン
パク質の同じ混合物を用いて行った。各実験の間にアク
リルアミド/TEMEDコポリマー溶液を用いてキャピラリー
をフラッシした。分離の結果を実験１、30および50に対
して図11に示す。図11からわかるように、タンパク質混
合物の成分の分離は本発明の方法によってきわめて再現
性がある。
アクリルアミド/TEDMEDコポリマー溶液を使用してタン
パク質標準物の混合物を分離した。50の逐次実験をタン
パク質の同じ混合物を用いて行った。各実験の間にアク
リルアミド/TEMEDコポリマー溶液を用いてキャピラリー
をフラッシした。分離の結果を実験１、30および50に対
して図11に示す。図11からわかるように、タンパク質混
合物の成分の分離は本発明の方法によってきわめて再現
性がある。
実施例3Dでは生体分子の相対移動度に関して溶液中の
ポリマー／コポリマーのパーセント濃度を変化する効果
を試験した。ポリマー／コポリマーの濃度パーセントが
変化するとき、タンパク質標準物間の相対移動度の差が
同様に変化する（図15）。各タンパク質標準物に対する
図15の線の傾斜は分子量に比例し、これはポリマー／コ
ポリマー溶液が真の篩分けマトリックスを提供している
ことを示す。また、この方法は所定の生体分子に対する
分子量を決定するための別の方法でもある：分子量標準
物の直線の傾きのプロットに対し未知の生体分子のため
の傾きを比較する。図15の相対移動度はα−ラクトアル
ブミンの移動、すなわち、各標準タンパク質の移動時間
によって分けられたα−ラクトアルブミンの移動時間に
関して特定のタンパク質の移動速度である。
ポリマー／コポリマーのパーセント濃度を変化する効果
を試験した。ポリマー／コポリマーの濃度パーセントが
変化するとき、タンパク質標準物間の相対移動度の差が
同様に変化する（図15）。各タンパク質標準物に対する
図15の線の傾斜は分子量に比例し、これはポリマー／コ
ポリマー溶液が真の篩分けマトリックスを提供している
ことを示す。また、この方法は所定の生体分子に対する
分子量を決定するための別の方法でもある：分子量標準
物の直線の傾きのプロットに対し未知の生体分子のため
の傾きを比較する。図15の相対移動度はα−ラクトアル
ブミンの移動、すなわち、各標準タンパク質の移動時間
によって分けられたα−ラクトアルブミンの移動時間に
関して特定のタンパク質の移動速度である。
実施例４は制限消化フラグメントの混合物におけるDN
Aフラグメントの分離を示す。φX174RF Hae III消化フ
ラグメントは0.24の電荷パーセントにてTEMEDを用いて
作られたポリアクリルアミドを用いる本発明の方法によ
って分離された。11φX174RF Hae III消化フラグメント
の大きさは72から1353塩基対までの範囲である。図12は
３種のコポリマー濃度１、２および３％について得られ
た電気泳動図を示す。図12のデーターはポリマー／コポ
リマーの濃度パーセントの増加はこの技術の分離能力に
影響を与える本発明の方法の性質を示している。図12に
見られるように、コポリマー濃度が増加すると、φX174
RF Hae III 271および281塩基対のフラグメントに対応
するピークの分解が改善する:2％で分離が始まり３％で
ピークは良く分解される。この例は溶液中のポリマーの
濃度パーセントをどの位にすると分解に影響するかを示
す。
Aフラグメントの分離を示す。φX174RF Hae III消化フ
ラグメントは0.24の電荷パーセントにてTEMEDを用いて
作られたポリアクリルアミドを用いる本発明の方法によ
って分離された。11φX174RF Hae III消化フラグメント
の大きさは72から1353塩基対までの範囲である。図12は
３種のコポリマー濃度１、２および３％について得られ
た電気泳動図を示す。図12のデーターはポリマー／コポ
リマーの濃度パーセントの増加はこの技術の分離能力に
影響を与える本発明の方法の性質を示している。図12に
見られるように、コポリマー濃度が増加すると、φX174
RF Hae III 271および281塩基対のフラグメントに対応
するピークの分解が改善する:2％で分離が始まり３％で
ピークは良く分解される。この例は溶液中のポリマーの
濃度パーセントをどの位にすると分解に影響するかを示
す。
V.分離条件の最適化 キャピラリー電気泳動における電気浸透流と分子篩分
けの調整のための本方法に有用なポリマーの特性は次の
ものを含む： 1.少なくとも１のポリマーまたはコポリマー種を含有す
る非架橋親水性ポリマーまたはコポリマー溶液の重量に
対し0.05ないし30重量％（w/w）含有する電解質溶液； 2.ポリマーまたはコポリマー種は20と5,000キロダルト
ンの間の分子量を有する；そして 3.ポリマーまたはコポリマー種は全ポリマーサブユニッ
トに対し荷電したモノマーサブユニットのモルパーセン
トによって測定されるとき0.01ないし1.0％の間の電荷
パーセントを有し、荷電したモノマーサブユニットは選
択された電気泳動pHで壁電荷と逆の電荷を有する。
けの調整のための本方法に有用なポリマーの特性は次の
ものを含む： 1.少なくとも１のポリマーまたはコポリマー種を含有す
る非架橋親水性ポリマーまたはコポリマー溶液の重量に
対し0.05ないし30重量％（w/w）含有する電解質溶液； 2.ポリマーまたはコポリマー種は20と5,000キロダルト
ンの間の分子量を有する；そして 3.ポリマーまたはコポリマー種は全ポリマーサブユニッ
トに対し荷電したモノマーサブユニットのモルパーセン
トによって測定されるとき0.01ないし1.0％の間の電荷
パーセントを有し、荷電したモノマーサブユニットは選
択された電気泳動pHで壁電荷と逆の電荷を有する。
任意の選択されたポリマー、コポリマー、またはそれ
らの混合物に対して、電荷パーセント値は、電気浸透流
が優先して２×10-5以下まで減少する値を見出すため、
実施例２に記載したように電荷パーセント値の範囲を本
質的に選択することによって最適にすることができる。
選択されたポリマーまたはコポリマー溶液の後続の試験
は標的の生体分子試料の分離である。溶液中のポリマー
／コポリマー％（w/w）は生体分子の選択された混合物
（例えば、上記タンパク質またはDNA混合物）の成分を
分離するように調整する必要がある。溶液は標的生体分
子の大きさに基づき成分を分離しなければならない。
らの混合物に対して、電荷パーセント値は、電気浸透流
が優先して２×10-5以下まで減少する値を見出すため、
実施例２に記載したように電荷パーセント値の範囲を本
質的に選択することによって最適にすることができる。
選択されたポリマーまたはコポリマー溶液の後続の試験
は標的の生体分子試料の分離である。溶液中のポリマー
／コポリマー％（w/w）は生体分子の選択された混合物
（例えば、上記タンパク質またはDNA混合物）の成分を
分離するように調整する必要がある。溶液は標的生体分
子の大きさに基づき成分を分離しなければならない。
特定の電荷％を有し、または選択された％（w/w）で
の溶液中でポリマーまたはコポリマーを使用することに
加えて、フラグメントの移動速度を次の方法によって選
択的に調整することができる： 1.電界力の変更。移動時間およびある程度まで分解能は
約100ないし400V/cmにて分離を行うことによって調整さ
れる。
の溶液中でポリマーまたはコポリマーを使用することに
加えて、フラグメントの移動速度を次の方法によって選
択的に調整することができる： 1.電界力の変更。移動時間およびある程度まで分解能は
約100ないし400V/cmにて分離を行うことによって調整さ
れる。
2.溶液pHの変更。生体分子、特にタンパク質は、異なる
pH値で異なる正味の電荷を呈することができる。約pH4
ないし10の間にポリマー溶液のpHを調整することによ
て、相対移動速度を変えることができる。
pH値で異なる正味の電荷を呈することができる。約pH4
ないし10の間にポリマー溶液のpHを調整することによ
て、相対移動速度を変えることができる。
3.温度の変更。移動時間および分解能は約10ないし60℃
の温度で分離を行うことによって変えることができる。
低い温度は一般に分解能を改善する。
の温度で分離を行うことによって変えることができる。
低い温度は一般に分解能を改善する。
4.緩衝液型の濃度またはイオン力の変更。ポリマー／コ
ポリマー溶液に使用される所定の緩衝液種のいずれかに
対して、最大分解能に対する最適の濃度範囲が存在す
る。バンドの広がりは低すぎる濃度（低いイオン力）で
生ずるかまたはバンドの広がりは高すぎるイオン力で生
ずることができる。特に両性イオン緩衝液は分解能を改
善しバックグラウンドUV吸光度変化を減らす。
ポリマー溶液に使用される所定の緩衝液種のいずれかに
対して、最大分解能に対する最適の濃度範囲が存在す
る。バンドの広がりは低すぎる濃度（低いイオン力）で
生ずるかまたはバンドの広がりは高すぎるイオン力で生
ずることができる。特に両性イオン緩衝液は分解能を改
善しバックグラウンドUV吸光度変化を減らす。
5.緩衝液への界面活性剤の添加。中性、陽性、または陰
性に荷電したヘッド基をもつハイドロまたはフルオロカ
ーボンの界面活性剤の混入は選択的にタンパク質の移動
度を変える。特に、緩衝液中に、ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）が存在すると、タンパク質分子量に比例した
移動度となる。
性に荷電したヘッド基をもつハイドロまたはフルオロカ
ーボンの界面活性剤の混入は選択的にタンパク質の移動
度を変える。特に、緩衝液中に、ドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）が存在すると、タンパク質分子量に比例した
移動度となる。
6.緩衝液への変成剤の添加。一本鎖または二本鎖DNAの
変更された移動度および分解能の改善は電解質緩衝液に
尿素またはホルムアミドのような変成剤を添加して行う
ことができる。
変更された移動度および分解能の改善は電解質緩衝液に
尿素またはホルムアミドのような変成剤を添加して行う
ことができる。
上記をまとめると、本発明は、生体分子分離を高める
ように選択的に変えることができる種々のパラメーター
を与える。生体分子移動速度はポリマーの性質およびそ
の濃度、溶液のpH、分離温度および電界の強さ、および
緩衝液配合を変えることによって選択的に変更すること
ができる。核酸に対して、移動速度はフラグメントを非
イオン性内位添加剤、例えば臭化エチジウムまたはアク
リジンオレンジと錯体を形成させて選択的に変更するこ
とができ、分解能は尿素およびホルムアミドのような変
成剤を添加して改善することができる。
ように選択的に変えることができる種々のパラメーター
を与える。生体分子移動速度はポリマーの性質およびそ
の濃度、溶液のpH、分離温度および電界の強さ、および
緩衝液配合を変えることによって選択的に変更すること
ができる。核酸に対して、移動速度はフラグメントを非
イオン性内位添加剤、例えば臭化エチジウムまたはアク
リジンオレンジと錯体を形成させて選択的に変更するこ
とができ、分解能は尿素およびホルムアミドのような変
成剤を添加して改善することができる。
VI.パルス電界分離 上述の電気泳動法を定電圧電界で行った。本発明の他
の面によれば、生体分子、特に、核酸フラグメントの分
別は、所定の大きさのフラグメントの範囲内で選択的に
分離を高めるために有効な周波数にて、パルス電圧電界
の下に電気泳動分離を行うことによって高められる。
の面によれば、生体分子、特に、核酸フラグメントの分
別は、所定の大きさのフラグメントの範囲内で選択的に
分離を高めるために有効な周波数にて、パルス電圧電界
の下に電気泳動分離を行うことによって高められる。
理論では、パルス電界における核酸フラグメントの移
動速度の挙動は２つの大きさに関連した効果によって支
配されているのかも知れない。第一の効果はフラグメン
トの回転モードと電界の周波数を含む共鳴効果である。
以下の表１は100、1,000、および10,000塩基対の二本鎖
DNAフラグメントについて計算した回転および延伸の共
鳴周波数を示す。Hzで表した回転共鳴周波数は二本鎖分
子の扁長・長円モデルを基礎として計算した（マシュー
ら；カンターら）。
動速度の挙動は２つの大きさに関連した効果によって支
配されているのかも知れない。第一の効果はフラグメン
トの回転モードと電界の周波数を含む共鳴効果である。
以下の表１は100、1,000、および10,000塩基対の二本鎖
DNAフラグメントについて計算した回転および延伸の共
鳴周波数を示す。Hzで表した回転共鳴周波数は二本鎖分
子の扁長・長円モデルを基礎として計算した（マシュー
ら；カンターら）。
強力な回転共鳴効果は、電界との共鳴でのフラグメン
トの移動速度が時間不変の電界での移動速度に関連して
優先的に遅くなることを予言している。これは電界と回
転共鳴する分子が、平均して、電界が最大になるとき電
界方向に移動するために最も少なく有利に配向すること
が期待されるためである。より遅い回転時間のため、よ
り大きい分子は、各電圧−パルスサイクルで電界配向位
置からあまり揺動しないことが期待される；より小さい
分子は、より速い応答時間をもち、電界方向に一層迅速
に再配向する。従って、もしも回転共鳴効果が支配的で
あるならば、非共鳴種の移動速度に比例して電気泳動中
に共鳴種の移動を遅くすることが可能でなければならな
い。
トの移動速度が時間不変の電界での移動速度に関連して
優先的に遅くなることを予言している。これは電界と回
転共鳴する分子が、平均して、電界が最大になるとき電
界方向に移動するために最も少なく有利に配向すること
が期待されるためである。より遅い回転時間のため、よ
り大きい分子は、各電圧−パルスサイクルで電界配向位
置からあまり揺動しないことが期待される；より小さい
分子は、より速い応答時間をもち、電界方向に一層迅速
に再配向する。従って、もしも回転共鳴効果が支配的で
あるならば、非共鳴種の移動速度に比例して電気泳動中
に共鳴種の移動を遅くすることが可能でなければならな
い。
パルス電界で期待することができる第二の大きさによ
る効果は各電圧パルスと共に流体中のフラグメントの加
速と減速による慣性効果である。この効果は図９に示さ
れており、この図はパルス幅と最大電圧Vmaxを有する印
加方形波電圧に関して、比較的小さい核酸フラグメント
（点線）と比較的大きい核酸フラグメント（一点鎖線）
に対する仮定的な速度曲線を示す。フラグメントが達し
なければならない最大速度は電位Vmaxの定電圧電界にお
けるフラグメントの終端または定常状態の速度、すなわ
ち100％の一定電界移動速度である。
る効果は各電圧パルスと共に流体中のフラグメントの加
速と減速による慣性効果である。この効果は図９に示さ
れており、この図はパルス幅と最大電圧Vmaxを有する印
加方形波電圧に関して、比較的小さい核酸フラグメント
（点線）と比較的大きい核酸フラグメント（一点鎖線）
に対する仮定的な速度曲線を示す。フラグメントが達し
なければならない最大速度は電位Vmaxの定電圧電界にお
けるフラグメントの終端または定常状態の速度、すなわ
ち100％の一定電界移動速度である。
図から見られるように、より小さいフラグメントは電
圧パルスの印加後は大きいフラグメントよりも速く終端
速度に達することが期待されるが、電圧パルスが終わる
ときに同じ速度で実質的にゼロ電圧に減速することが期
待される。電圧パルスの間に各フラグメントによって移
動される全距離はまさに速度曲線の積分であるから、よ
り大きいフラグメントの移動速度はパルス−電圧電界で
優先的に減少することが期待される。また、速度曲線で
の任意の遅延の効果が短いパルスで目立つようになるの
で、パルス周波数が高くパルス持続時間が短い程、フラ
グメントの大きさが小さく、その移動速度において優先
的に遅らせることができることは高く評価できる。
圧パルスの印加後は大きいフラグメントよりも速く終端
速度に達することが期待されるが、電圧パルスが終わる
ときに同じ速度で実質的にゼロ電圧に減速することが期
待される。電圧パルスの間に各フラグメントによって移
動される全距離はまさに速度曲線の積分であるから、よ
り大きいフラグメントの移動速度はパルス−電圧電界で
優先的に減少することが期待される。また、速度曲線で
の任意の遅延の効果が短いパルスで目立つようになるの
で、パルス周波数が高くパルス持続時間が短い程、フラ
グメントの大きさが小さく、その移動速度において優先
的に遅らせることができることは高く評価できる。
いくつかの生体分子の混合物、特に核酸フラグメント
において、異なる大きさの範囲で種を分別しようとする
場合、上記の変数は−−溶液のpH、およびポリマーの種
類および濃度、電界周波数および変性剤を含めて−−電
気泳動の走行中にフラグメントの分解能を高めるように
選択的に変えることができる。例えば、電気泳動分離は
大きさがより大きいフラグメントを分離するために、最
初に一定の電界または低い周波数で行い、次に大きさが
より小さいフラグメントの分離を進めるためにより大き
い周波数にスイッチを切り替える。別の例として、キャ
ピラリーチューブに引き出される連続的な溶液勾配を生
み出すために標準二室混合装置を用い、ポリマー溶液の
pHまたはポリマー濃度を電気泳動走行中に継続して変え
ることができる。
において、異なる大きさの範囲で種を分別しようとする
場合、上記の変数は−−溶液のpH、およびポリマーの種
類および濃度、電界周波数および変性剤を含めて−−電
気泳動の走行中にフラグメントの分解能を高めるように
選択的に変えることができる。例えば、電気泳動分離は
大きさがより大きいフラグメントを分離するために、最
初に一定の電界または低い周波数で行い、次に大きさが
より小さいフラグメントの分離を進めるためにより大き
い周波数にスイッチを切り替える。別の例として、キャ
ピラリーチューブに引き出される連続的な溶液勾配を生
み出すために標準二室混合装置を用い、ポリマー溶液の
pHまたはポリマー濃度を電気泳動走行中に継続して変え
ることができる。
VII.応用 本発明の分離法は生体分子の大きさによる分別を必要
とする上述の種々の応用の何れかに有用性を見出す。こ
れらの応用は、DNAの制限分析を含めて、タンパク室
類、ポリペプチド類、ペプチド類および一本鎖および二
本鎖核酸の電気泳動分離法を含む。
とする上述の種々の応用の何れかに有用性を見出す。こ
れらの応用は、DNAの制限分析を含めて、タンパク室
類、ポリペプチド類、ペプチド類および一本鎖および二
本鎖核酸の電気泳動分離法を含む。
本発明の方法はDNA配列反応が蛍光タグ（ドロッスマ
ン）で標識を付けた核酸を含むDNA配列分析に応用する
ことができ、これらの反応の生成物は本発明の方法によ
って大きさにより分離される。核酸分子は非変性または
変性のいずれかの条件下に大きさにより分離することが
できる。代表的な変性条件は分離前の核酸におよび／ま
たは電解質溶液に尿素またはホルムアミドを添加するこ
とを含む。
ン）で標識を付けた核酸を含むDNA配列分析に応用する
ことができ、これらの反応の生成物は本発明の方法によ
って大きさにより分離される。核酸分子は非変性または
変性のいずれかの条件下に大きさにより分離することが
できる。代表的な変性条件は分離前の核酸におよび／ま
たは電解質溶液に尿素またはホルムアミドを添加するこ
とを含む。
さらに、本発明の方法はDNAの一本鎖配座多形性分析
に用いることができる（マキノ）。ポリメラーゼ鎖反応
方法（ムリス；ムリスら;Perkin−Elmer Cetus Corp.）
もまた一本鎖配座多形性分析に応用することができる。
この分析は一本鎖DNA分子が配列特異的であり鎖内相互
作用によって安定化される配座を発現する原理に基づい
ている：一般的にこのような分析は非変性条件下、すな
わち、一本鎖分子の配座特性を保持する条件下に行われ
る。一本鎖分子間の単一塩基の変化でさえも分子間の相
対移動差を十分に検出するために配座を変えることがで
きる。一本鎖DNA分子の大きさによる分離が行われる条
件は一本鎖分子の移動度に影響を与えるように変えるこ
とができる。例えば、次のパラメーターを変えることが
できる：ポリマー％、ポリマーの型、グリセロール（一
般的に約５％ないし20％、w/vの濃度で存在する）、お
よび温度。
に用いることができる（マキノ）。ポリメラーゼ鎖反応
方法（ムリス；ムリスら;Perkin−Elmer Cetus Corp.）
もまた一本鎖配座多形性分析に応用することができる。
この分析は一本鎖DNA分子が配列特異的であり鎖内相互
作用によって安定化される配座を発現する原理に基づい
ている：一般的にこのような分析は非変性条件下、すな
わち、一本鎖分子の配座特性を保持する条件下に行われ
る。一本鎖分子間の単一塩基の変化でさえも分子間の相
対移動差を十分に検出するために配座を変えることがで
きる。一本鎖DNA分子の大きさによる分離が行われる条
件は一本鎖分子の移動度に影響を与えるように変えるこ
とができる。例えば、次のパラメーターを変えることが
できる：ポリマー％、ポリマーの型、グリセロール（一
般的に約５％ないし20％、w/vの濃度で存在する）、お
よび温度。
本発明の分離方法はまたポリメラーゼ鎖反応増幅生成
物の分析に対しても有用である。例えば、増幅反応は試
料鋳型および選択されたプライマーを用いて行うことが
できる。生成物は、予想された大きさをもつ標的増幅生
成物が、反応混合物中に存在する場合に決定するように
大きさにより分離される。増幅反応生成物の濃度もまた
決定することができる。
物の分析に対しても有用である。例えば、増幅反応は試
料鋳型および選択されたプライマーを用いて行うことが
できる。生成物は、予想された大きさをもつ標的増幅生
成物が、反応混合物中に存在する場合に決定するように
大きさにより分離される。増幅反応生成物の濃度もまた
決定することができる。
本発明の分離方法はまた核酸−タンパク質複合体の分
析にも用いることができる。例えば、本方法は移動−シ
フトアッセイフォーマットに使用でき、選択されたヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチドを結合するための
試料タンパク質の能力を、試料タンパク質の存在および
不在においてポリヌクレオチドの移動度を比較して評価
する。試料タンパク質へのポリヌクレオチドの結合は、
得られたポリヌクレオチド−タンパク質複合体の移動度
がポリクヌレオチド単独の場合とは異なるときに確認さ
れる。本方法はまた試料タンパク質とポリヌクレオチド
との間の結合の理論量を、ポリヌクレオチドに対する試
料タンパク質の比を変えることによって決定するために
使用することができる。簡単には、ポリヌクレオチドは
蛍光タグのような特徴的なあレポーター標識を含み、ポ
リヌクレオチド含有ピークを容易に同定し定量すること
ができる。
析にも用いることができる。例えば、本方法は移動−シ
フトアッセイフォーマットに使用でき、選択されたヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチドを結合するための
試料タンパク質の能力を、試料タンパク質の存在および
不在においてポリヌクレオチドの移動度を比較して評価
する。試料タンパク質へのポリヌクレオチドの結合は、
得られたポリヌクレオチド−タンパク質複合体の移動度
がポリクヌレオチド単独の場合とは異なるときに確認さ
れる。本方法はまた試料タンパク質とポリヌクレオチド
との間の結合の理論量を、ポリヌクレオチドに対する試
料タンパク質の比を変えることによって決定するために
使用することができる。簡単には、ポリヌクレオチドは
蛍光タグのような特徴的なあレポーター標識を含み、ポ
リヌクレオチド含有ピークを容易に同定し定量すること
ができる。
制限消化生成物の分析の応用は次のものを含む：遺伝
子スクリーニング用の制限フラグメント長の多形現象の
分析、ベクトル構造の確認、核酸プローブに対する大き
さおよび／またはハイブリッド形成に基づく特定の核酸
フラグメントの同定、および化学的または酵素的配列に
対する一本鎖フラグメントの分別。
子スクリーニング用の制限フラグメント長の多形現象の
分析、ベクトル構造の確認、核酸プローブに対する大き
さおよび／またはハイブリッド形成に基づく特定の核酸
フラグメントの同定、および化学的または酵素的配列に
対する一本鎖フラグメントの分別。
次の応用は制限フラグメント分析のため本方法をどの
ように利用できるかを説明している。制限分析の例で
は、ゲノムフラグメントの混合物から、関係のある標的
配列を含む制限フラグメントを同定することが望まし
い。選ばれた一種またはそれ以上の制限酵素を使用して
ゲノム混合物を消化した後、フラグメント混合物を標的
配列とハイブリッド形成することができるリポーター標
識プローブとハイブリッド形成下に混合する。このプロ
ーブは好ましくは相補的標的配列および、蛍光プローブ
検出器によって容易に検出できる蛍光プローブのよう
な、共有結合したプローブを含む。このプローブは、例
えば、一本鎖種を含む標準変性／復元条件によってフラ
グメントとハイブリッド形成し、または三本鎖形成を生
じさせるRecAによって二本鎖の形でフラグメントに結合
することができる。
ように利用できるかを説明している。制限分析の例で
は、ゲノムフラグメントの混合物から、関係のある標的
配列を含む制限フラグメントを同定することが望まし
い。選ばれた一種またはそれ以上の制限酵素を使用して
ゲノム混合物を消化した後、フラグメント混合物を標的
配列とハイブリッド形成することができるリポーター標
識プローブとハイブリッド形成下に混合する。このプロ
ーブは好ましくは相補的標的配列および、蛍光プローブ
検出器によって容易に検出できる蛍光プローブのよう
な、共有結合したプローブを含む。このプローブは、例
えば、一本鎖種を含む標準変性／復元条件によってフラ
グメントとハイブリッド形成し、または三本鎖形成を生
じさせるRecAによって二本鎖の形でフラグメントに結合
することができる。
プローブをフラグメントに結合した後、試料は本方法
にしたがって分離する。検出器は好ましくは二重波長モ
ードで操作し、UV吸収と蛍光放出検出を同時に行う。
にしたがって分離する。検出器は好ましくは二重波長モ
ードで操作し、UV吸収と蛍光放出検出を同時に行う。
本発明の方法によって、タンパク質、ポリペプチド、
およびペプチドは変性状態、自然状態、または化学的に
改変した状態のいずれかにおいて、ポリマーおよび／ま
たはコポリマー電解質溶液を含有するチューブ中で電気
泳動によってそれらの大きさまたは分子量に従って分離
される。この溶液をキャピラリー電気泳動によって分離
するために用いるとき、SDS（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）変性タンパク質の高速および高分解分子量（MW）分
離が得られる（図６および７参照）。標準タンパク質の
分子量と相対移動時間を関連づけることによって、未知
のタンパク質の分子量を算定することができる。
およびペプチドは変性状態、自然状態、または化学的に
改変した状態のいずれかにおいて、ポリマーおよび／ま
たはコポリマー電解質溶液を含有するチューブ中で電気
泳動によってそれらの大きさまたは分子量に従って分離
される。この溶液をキャピラリー電気泳動によって分離
するために用いるとき、SDS（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）変性タンパク質の高速および高分解分子量（MW）分
離が得られる（図６および７参照）。標準タンパク質の
分子量と相対移動時間を関連づけることによって、未知
のタンパク質の分子量を算定することができる。
タンパク質と核酸の分離に加えて、本発明の方法はま
た核酸／タンパク質複合体、例えばリボヌクレオタンパ
ク質粒子、それらの同種のDNAsに結合したDNA結合タン
パク質、およびそれらの同種のRNA結合部位に結合したR
NA結合タンパク質（例えばHIV−１のTATおよびREVタン
パク質）の大きさによる分離に応用することができる。
た核酸／タンパク質複合体、例えばリボヌクレオタンパ
ク質粒子、それらの同種のDNAsに結合したDNA結合タン
パク質、およびそれらの同種のRNA結合部位に結合したR
NA結合タンパク質（例えばHIV−１のTATおよびREVタン
パク質）の大きさによる分離に応用することができる。
高質量感度および再現できる移動時間は約0.01ないし
1.0％の範囲の電荷パーセントを有するポリマーまたは
コポリマーを用いて得られ、そこではポリマーまたはコ
ポリマーの電荷はキャピラリーチューブの内側表面の電
荷と逆である。この組合せは約２×10-5cm/秒・Ｖ以下
に電気浸透流を実質的に減らし、電気泳動中のタンパク
質の吸着を避けるために役立つ。全ての応用に２×10-5
cm2/秒・Ｖ以下に電気浸透流を減らすことは必要ではな
い：電気浸透流の本質的な減少は約８×10-5cm2/秒・Ｖ
で起こる。分離のために使用されるポリマー溶液は従来
のキャピラリー電気泳動装置に見られる穏和な圧力を用
いてキャピラリーチューブに導入される。
1.0％の範囲の電荷パーセントを有するポリマーまたは
コポリマーを用いて得られ、そこではポリマーまたはコ
ポリマーの電荷はキャピラリーチューブの内側表面の電
荷と逆である。この組合せは約２×10-5cm/秒・Ｖ以下
に電気浸透流を実質的に減らし、電気泳動中のタンパク
質の吸着を避けるために役立つ。全ての応用に２×10-5
cm2/秒・Ｖ以下に電気浸透流を減らすことは必要ではな
い：電気浸透流の本質的な減少は約８×10-5cm2/秒・Ｖ
で起こる。分離のために使用されるポリマー溶液は従来
のキャピラリー電気泳動装置に見られる穏和な圧力を用
いてキャピラリーチューブに導入される。
生体分子を含有する試料を分離した後、キャピラリー
は次の試料を分析する前に新しいポリマー溶液でフラッ
シする。この工程は逐次試料を処理する際に汚染、また
は前の試料からの「ゴーストピーク」の可能性を排除す
る。新しいポリマー溶液で装置をフラッシする能力はポ
リマー溶液の粘度を制限することにより可能となる。
は次の試料を分析する前に新しいポリマー溶液でフラッ
シする。この工程は逐次試料を処理する際に汚染、また
は前の試料からの「ゴーストピーク」の可能性を排除す
る。新しいポリマー溶液で装置をフラッシする能力はポ
リマー溶液の粘度を制限することにより可能となる。
分離溶液に使用されるポリマーまたはコポリマーは分
子量が20と5,000キロダルトンの範囲内である。このポ
リマーの分子量は一般に、選択された生体分子の電気泳
動による移動を遅延させるであろう絡み合い領域に対す
る域値を越えており、生体分子の分子量に比例している
（グロッスマン、米国特許第5,126,021号、1992年６月3
0日発行）。溶液中のポリマーまたはコポリマーの分子
量は、従来のキャピラリー電気泳動機器に見られる圧力
を用いて狭いキャピラリー（直径200μＭ以下）に導入
することができない高粘度の溶液において生ずる値より
も小さい。
子量が20と5,000キロダルトンの範囲内である。このポ
リマーの分子量は一般に、選択された生体分子の電気泳
動による移動を遅延させるであろう絡み合い領域に対す
る域値を越えており、生体分子の分子量に比例している
（グロッスマン、米国特許第5,126,021号、1992年６月3
0日発行）。溶液中のポリマーまたはコポリマーの分子
量は、従来のキャピラリー電気泳動機器に見られる圧力
を用いて狭いキャピラリー（直径200μＭ以下）に導入
することができない高粘度の溶液において生ずる値より
も小さい。
ポリマーまたはコポリマー電解質溶液は有機または無
機イオンも含むことができ、pHコントロールおよび光学
安定性のために使用され、次のものを含む：有機酸（例
えばクエン酸、酢酸、蟻酸）または双極性イオン（例え
ばTES（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］−２−アミノ
エタンスルホン酸）（シグマ）、BICINE（N,N−ビス
［２−ヒドロキシエチル］グリシン）（シグマ）、ACES
（２−［２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ］エ
タンスルホン酸）（シグマ））、グリシルグリシン（シ
グマ）；無機酸（例えばリン酸）；および有機塩基（例
えば“トリス”（シグマ））。
機イオンも含むことができ、pHコントロールおよび光学
安定性のために使用され、次のものを含む：有機酸（例
えばクエン酸、酢酸、蟻酸）または双極性イオン（例え
ばTES（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］−２−アミノ
エタンスルホン酸）（シグマ）、BICINE（N,N−ビス
［２−ヒドロキシエチル］グリシン）（シグマ）、ACES
（２−［２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ］エ
タンスルホン酸）（シグマ））、グリシルグリシン（シ
グマ）；無機酸（例えばリン酸）；および有機塩基（例
えば“トリス”（シグマ））。
変性分離を行うとき、アニオン界面活性剤もまたポリ
マーまたはコポリマー電解質溶液に添加することができ
る。アニオン界面活性剤は一般にハイドロカーボンまた
はフルオロカーボン硫酸塩（例えばドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS））、スルホン酸塩（例えばデカンスルホン
酸ナトリウム）、またはカルボン酸（例えばラウリン
酸）である。例えば、水で希釈したSDS変性タンパク質
試料は、キャピラリーに動電学的に注入することができ
る。通常30cmの分離長と200V/cmの電解の強さを用いる
とき、15分以下で分離は通常完了する。
マーまたはコポリマー電解質溶液に添加することができ
る。アニオン界面活性剤は一般にハイドロカーボンまた
はフルオロカーボン硫酸塩（例えばドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS））、スルホン酸塩（例えばデカンスルホン
酸ナトリウム）、またはカルボン酸（例えばラウリン
酸）である。例えば、水で希釈したSDS変性タンパク質
試料は、キャピラリーに動電学的に注入することができ
る。通常30cmの分離長と200V/cmの電解の強さを用いる
とき、15分以下で分離は通常完了する。
240nm以下の波長でオンカラムUV検出を行うとき、双
極性イオン緩衝液、例えばACES、またはTES（シグマ）
は、ポリアクリルアミドおよびSDSをpH6ないし８で含有
する分離溶液中で、バックグラウンドUV吸光度に安定化
効果を与える。この安定化は過度なベースラインの傾斜
なしで200nmにて繰り返せる敏感なUV検出を可能にす
る。
極性イオン緩衝液、例えばACES、またはTES（シグマ）
は、ポリアクリルアミドおよびSDSをpH6ないし８で含有
する分離溶液中で、バックグラウンドUV吸光度に安定化
効果を与える。この安定化は過度なベースラインの傾斜
なしで200nmにて繰り返せる敏感なUV検出を可能にす
る。
分子量によるタンパク質または核酸のキャピラリー電
気泳動分離のための上記のようなポリマーまたはコポリ
マー溶液の使用は、（１）さらに短い分析時間、（２）
全体として自動化した分離と検出、（３）定量分析、
（４）極少量のタンパク質または核酸（ピコグラム）の
非破壊分析、および（５）ユーザーに便利なマトリック
ス（すなわち、ポリマー溶液は予備試験されており、固
体ゲルは準備しない）を提供することによって従来のPA
GEスラブゲル分離を越える利点がある。
気泳動分離のための上記のようなポリマーまたはコポリ
マー溶液の使用は、（１）さらに短い分析時間、（２）
全体として自動化した分離と検出、（３）定量分析、
（４）極少量のタンパク質または核酸（ピコグラム）の
非破壊分析、および（５）ユーザーに便利なマトリック
ス（すなわち、ポリマー溶液は予備試験されており、固
体ゲルは準備しない）を提供することによって従来のPA
GEスラブゲル分離を越える利点がある。
固体ゲルマトリックスでは、ゴーストピークは除くこ
とが難しい。固体ゲルではまた、マトリックス中の不可
逆的に結合した物質が次の分離において生体分子と相互
に作用する傾向があり、従って分解能が下がる。本発明
の方法の１の利点は、分離マトリックス、すなわち、ポ
リマー／コポリマー溶液を、各実験間で置換できること
である。さらに本発明の利点は動電学的注入がキャピラ
リーに試料マスを導入するときに効果がないとき、真空
または正の加圧によって行われる流体力学的注入を用い
て試料マスをキャピラリー中に移動させることができる
ことである。
とが難しい。固体ゲルではまた、マトリックス中の不可
逆的に結合した物質が次の分離において生体分子と相互
に作用する傾向があり、従って分解能が下がる。本発明
の方法の１の利点は、分離マトリックス、すなわち、ポ
リマー／コポリマー溶液を、各実験間で置換できること
である。さらに本発明の利点は動電学的注入がキャピラ
リーに試料マスを導入するときに効果がないとき、真空
または正の加圧によって行われる流体力学的注入を用い
て試料マスをキャピラリー中に移動させることができる
ことである。
本発明の方法に用いられる低い電荷を含むポリマーお
よびコポリマーはキャピラリーチューブの内側の荷電し
た表面壁のコーティングとして、また生体分子のための
分子篩分けマトリックスとして働く。
よびコポリマーはキャピラリーチューブの内側の荷電し
た表面壁のコーティングとして、また生体分子のための
分子篩分けマトリックスとして働く。
以下に示す実施例は本発明を限定するものではない。
実施例１ 荷電したポリマーまたはコポリマーの合成 A.アクリルアミドとTEMEDのコポリマー 変動分量のTEMED（N,N,N′,N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン、アルドリッチ・ケミカル社）を、アクリル
アミド（アルドリッチ・ケミカル社）の重合を開始する
過硫酸アンモニウム（アルドリッチ・ケミカル社）に添
加すると、変量する分子量（図４の粘度データー参照）
と電荷パーセント（図４のEOFデーター参照）をもつポ
リアクリルアミドを結果として生成した。次の例はアク
リルアミドに対するTEMEDのモルパーセントが0.24％で
あるポリアクリルアミドの合成を示す。TEMEDのモルパ
ーセントは、この実施例において重合混合物に添加する
溶液中のTEMEDの濃度を増加または減少させて増加また
は減少させることができる。
ンジアミン、アルドリッチ・ケミカル社）を、アクリル
アミド（アルドリッチ・ケミカル社）の重合を開始する
過硫酸アンモニウム（アルドリッチ・ケミカル社）に添
加すると、変量する分子量（図４の粘度データー参照）
と電荷パーセント（図４のEOFデーター参照）をもつポ
リアクリルアミドを結果として生成した。次の例はアク
リルアミドに対するTEMEDのモルパーセントが0.24％で
あるポリアクリルアミドの合成を示す。TEMEDのモルパ
ーセントは、この実施例において重合混合物に添加する
溶液中のTEMEDの濃度を増加または減少させて増加また
は減少させることができる。
２リットルのフラスコに含まれる脱イオン水500mlに1
00gのアクリルアミドを添加する。この溶液は一定であ
るが静かにヘリウムを吹き込みながら50℃で15分間撹拌
する。400mlのメタノール（バーディック・アンド・ジ
ャクソン、HPLC等級）を添加して反応フラスコに水冷コ
ンデンサを取り付けてさらに15分間撹拌を続ける。10％
（v/v）TEMED水溶液10mlを添加し、２分間撹拌する。10
％（w/v）の過硫酸アンモニウム10mlを添加し、２時間
撹拌しながら重合を進行させる。
00gのアクリルアミドを添加する。この溶液は一定であ
るが静かにヘリウムを吹き込みながら50℃で15分間撹拌
する。400mlのメタノール（バーディック・アンド・ジ
ャクソン、HPLC等級）を添加して反応フラスコに水冷コ
ンデンサを取り付けてさらに15分間撹拌を続ける。10％
（v/v）TEMED水溶液10mlを添加し、２分間撹拌する。10
％（w/v）の過硫酸アンモニウム10mlを添加し、２時間
撹拌しながら重合を進行させる。
透明な粘性の液体反応混合物を３リットルのポリプロ
ピレンビーカーに注入する。一定に手動で撹拌しなが
ら、徐々に500mlのメタノールを添加する。得られた固
体の白色の塊のポリアクリルアミドの沈澱をビーカーの
底に沈澱させる。上澄み液を排出するようにデカントす
る。500mlのメタノールをビーカーに加え、ガラス棒で
塊を手動で圧搾し、メタノールを塊のまわりに渦を巻か
せて残りの物質を上澄み液中に洗い出して濁らせる。固
体の塊を沈澱させて上澄み液を排出するようにデカント
する。このメタノール洗浄法を３回以上、上澄み液が比
較的透明になるまで繰り返す。
ピレンビーカーに注入する。一定に手動で撹拌しなが
ら、徐々に500mlのメタノールを添加する。得られた固
体の白色の塊のポリアクリルアミドの沈澱をビーカーの
底に沈澱させる。上澄み液を排出するようにデカントす
る。500mlのメタノールをビーカーに加え、ガラス棒で
塊を手動で圧搾し、メタノールを塊のまわりに渦を巻か
せて残りの物質を上澄み液中に洗い出して濁らせる。固
体の塊を沈澱させて上澄み液を排出するようにデカント
する。このメタノール洗浄法を３回以上、上澄み液が比
較的透明になるまで繰り返す。
固体の塊を大きさが約1cm×2cmまたはそれよりも小さ
い小片に砕きまたは切断して、これらの小片をポリプロ
ピレントレイに置く。分離した小片を入れたトレイを真
空オーブンに置き（VWR1430または同等）24時間50〜60
℃で約30″Hg真空度（冷却蒸気トラップに連結したTriv
ac D2A真空ポンプまたは同等のものによって供給され
る）にて乾燥させる。乾燥したポリアクリルアミドの小
片をマイクロミル（Bel−Art、VWRサイアンティフィ
ク）で顆粒粉末に砕きポリマー溶液を作るために使用す
るまで小さいガラス瓶に乾燥させて貯蔵する。
い小片に砕きまたは切断して、これらの小片をポリプロ
ピレントレイに置く。分離した小片を入れたトレイを真
空オーブンに置き（VWR1430または同等）24時間50〜60
℃で約30″Hg真空度（冷却蒸気トラップに連結したTriv
ac D2A真空ポンプまたは同等のものによって供給され
る）にて乾燥させる。乾燥したポリアクリルアミドの小
片をマイクロミル（Bel−Art、VWRサイアンティフィ
ク）で顆粒粉末に砕きポリマー溶液を作るために使用す
るまで小さいガラス瓶に乾燥させて貯蔵する。
B.アクリルアミドとDADMACのコポリマー 変量分量のDADMAC（ジアリルジメチルアンモニウムク
ロリド、アルドリッチ・ケミカル社）をアクリルアミド
の重合を開始する過硫酸アンモニウムに添加すると、結
果として分子量（図５の粘度データーを参照）および電
荷パーセント（図５のEOFデーターを参照）を変化させ
てポリアクリルアミドを生成することになる。次の実施
例はアクリルアミドに対し0.05モルパーセントのDADMAC
を用いるポリアクリルアミドの作り方を示す。DADMACの
モルパーセントはこの実施例に使用される溶液中のDADM
ACの濃度を増加または減少させて増加または減少させる
ことができる。
ロリド、アルドリッチ・ケミカル社）をアクリルアミド
の重合を開始する過硫酸アンモニウムに添加すると、結
果として分子量（図５の粘度データーを参照）および電
荷パーセント（図５のEOFデーターを参照）を変化させ
てポリアクリルアミドを生成することになる。次の実施
例はアクリルアミドに対し0.05モルパーセントのDADMAC
を用いるポリアクリルアミドの作り方を示す。DADMACの
モルパーセントはこの実施例に使用される溶液中のDADM
ACの濃度を増加または減少させて増加または減少させる
ことができる。
ポリアクリルアミドの合成と回収は、TEMEDの代わり
に10mlの1.14（w/v）DADMAC水溶液で置き換えたこと以
外は、上記例Ａに明記したように行われる。
に10mlの1.14（w/v）DADMAC水溶液で置き換えたこと以
外は、上記例Ａに明記したように行われる。
C.ポリアクリルアミド中のアミド基をアミンへ転換 小さいパーセンテージのポリアクリルアミド中のアミ
ド基を対応する荷電したアミン基へ転換することは既知
のホフマン分解（Jen）を用いて行われた。40部の5.25
％次亜塩素酸ナトリウムと2.3部の水酸化ナトリウムの
溶液を20分かけて355部の20％ポリアクリルアミド水溶
液に添加する。ポリアクリルアミドはTEMEDを添加しな
いでＡに上述したように調製する。30ないし37℃の温度
と共に反応を30分間保持する。反応溶液をHClでpH6.9に
中和する。ポリアクリルアミドをＡに上述したように沈
澱させて回収する。ポリアクリルアミドの電荷パーセン
トは全反応時間を増加または減少させることにより、増
加または減少させる。
ド基を対応する荷電したアミン基へ転換することは既知
のホフマン分解（Jen）を用いて行われた。40部の5.25
％次亜塩素酸ナトリウムと2.3部の水酸化ナトリウムの
溶液を20分かけて355部の20％ポリアクリルアミド水溶
液に添加する。ポリアクリルアミドはTEMEDを添加しな
いでＡに上述したように調製する。30ないし37℃の温度
と共に反応を30分間保持する。反応溶液をHClでpH6.9に
中和する。ポリアクリルアミドをＡに上述したように沈
澱させて回収する。ポリアクリルアミドの電荷パーセン
トは全反応時間を増加または減少させることにより、増
加または減少させる。
D.アクリルアミドとDADMACのコポリマーをデキストラン
にグラフト アクリルアミドコポリマーをマックコーミック（McCo
rmic）に似た方法を用いてデキストランの主鎖にグラフ
トする。1.25gのデキストラン、8.165gのアクリルアミ
ド、および0.66gのDADMACの水溶液を25℃で30分間ヘリ
ウム下に撹拌する。0.0274gのセリウムアンモニウム硝
酸塩を含有する10mlの0.05N硝酸を添加して重合を開始
する。３時間後グラフトコポリマーをＡに上述したよう
に沈澱させて回収する。電荷パーセントはこの実施例
（すなわち0.05％）から、反応混合物に添加したDADMAC
の分量を増加または減少させることにより増加または減
少させる。
にグラフト アクリルアミドコポリマーをマックコーミック（McCo
rmic）に似た方法を用いてデキストランの主鎖にグラフ
トする。1.25gのデキストラン、8.165gのアクリルアミ
ド、および0.66gのDADMACの水溶液を25℃で30分間ヘリ
ウム下に撹拌する。0.0274gのセリウムアンモニウム硝
酸塩を含有する10mlの0.05N硝酸を添加して重合を開始
する。３時間後グラフトコポリマーをＡに上述したよう
に沈澱させて回収する。電荷パーセントはこの実施例
（すなわち0.05％）から、反応混合物に添加したDADMAC
の分量を増加または減少させることにより増加または減
少させる。
E.ポリマーまたはコポリマー溶液 ポリマーまたはコポリマーを所望の緩衝液溶液（w/
v）に添加する。次いでこの溶液を約２時間静かに回転
させて混合し、その後0.45ミクロンフィルターに通して
溶液を濾過する。溶液を15分間29インチのHgにて30℃で
脱気するため真空オーブンに入れる。次に溶液をキャピ
ラリー電気泳動器具の検出器側と緩衝液側の貯蔵器に導
く。
v）に添加する。次いでこの溶液を約２時間静かに回転
させて混合し、その後0.45ミクロンフィルターに通して
溶液を濾過する。溶液を15分間29インチのHgにて30℃で
脱気するため真空オーブンに入れる。次に溶液をキャピ
ラリー電気泳動器具の検出器側と緩衝液側の貯蔵器に導
く。
実施例２ 比粘度と電気浸透流の荷電ポリマーまたはコポリマーの
効果 ABIモデル270キャピラリー電気泳動システムを用いて
キャピラリー電気泳動を行った。このシステムは30KVま
での電圧をセットできる組み込み高電圧DC電源を含む。
システムに使用したキャピラリーチューブはポリミクロ
・テクノロジーズ（フェニックス、AZ）から入手した長
さ50cm、内径55μｍ、外径350μｍの溶融シリカキャピ
ラリーチューブである。
効果 ABIモデル270キャピラリー電気泳動システムを用いて
キャピラリー電気泳動を行った。このシステムは30KVま
での電圧をセットできる組み込み高電圧DC電源を含む。
システムに使用したキャピラリーチューブはポリミクロ
・テクノロジーズ（フェニックス、AZ）から入手した長
さ50cm、内径55μｍ、外径350μｍの溶融シリカキャピ
ラリーチューブである。
電気浸透流の流速（Veo）を示すために用いたマーカ
ーは中性化合物、酸化メシチルであり、これは200mmでU
V吸収を示す。電気泳動システムは30℃の温度で実験を
通して約10kV（約＋200v/cm）の電圧設定で行った。UV
検出はキャピラリーチューブ検出用に設計された組込み
783UV検出器を用いた。検出器出力信号はスペクトロフ
ィジクスSp4400積分器／プロッターで積分しプロットし
た。
ーは中性化合物、酸化メシチルであり、これは200mmでU
V吸収を示す。電気泳動システムは30℃の温度で実験を
通して約10kV（約＋200v/cm）の電圧設定で行った。UV
検出はキャピラリーチューブ検出用に設計された組込み
783UV検出器を用いた。検出器出力信号はスペクトロフ
ィジクスSp4400積分器／プロッターで積分しプロットし
た。
新しいキャピラリー表面はキャピラリーを連続して５
〜10キャピラリー容量の1.0N NaOH、３〜５容量の0.1N
NaOH、および最後に３〜５容量のポリマー溶液を用いて
フラッシして日常的に調製させた。溶液をキャピラリー
からアノード端部に組込み制御真空システムを用いて真
空して吸い出した。
〜10キャピラリー容量の1.0N NaOH、３〜５容量の0.1N
NaOH、および最後に３〜５容量のポリマー溶液を用いて
フラッシして日常的に調製させた。溶液をキャピラリー
からアノード端部に組込み制御真空システムを用いて真
空して吸い出した。
一般に、選ばれたポリマー／コポリマー電界質溶液を
用いて平衡にした後、２〜5nlの中性マーカー（酸化メ
シチル）を検出器端部を真空にしてキャピラリーに注入
した；マーカーは電気浸透流を測定するために使用す
る。電場を印加し（＋200v/cm）検出器に移動する（30c
m）マーカーに対し時間（ｔ、秒）を記録する。
用いて平衡にした後、２〜5nlの中性マーカー（酸化メ
シチル）を検出器端部を真空にしてキャピラリーに注入
した；マーカーは電気浸透流を測定するために使用す
る。電場を印加し（＋200v/cm）検出器に移動する（30c
m）マーカーに対し時間（ｔ、秒）を記録する。
電気浸透流の移動度（EOF）を次式のように計算す
る： 生体分子は一般に動電学的に注入される。例えば、参
照マーカーを動電学的に−5kVで２秒間注入した後、生
体分子の試料を、1mlにつき約0.01mgで、動電学的に−5
kVで10秒間注入する。次に特定の分離によって、一般に
は約−10kVないし約−20kVの適当な電圧を印加して実験
を終了する。
る： 生体分子は一般に動電学的に注入される。例えば、参
照マーカーを動電学的に−5kVで２秒間注入した後、生
体分子の試料を、1mlにつき約0.01mgで、動電学的に−5
kVで10秒間注入する。次に特定の分離によって、一般に
は約−10kVないし約−20kVの適当な電圧を印加して実験
を終了する。
A.アクリルアミドとTEMEDのコポリマー アクリルアミドとテトラメチルエチレンジアミン（TE
MED）の混合物は、実施例１に述べたように、図４の下
部に示されるTEMED対アクリルアミドモノマー（［A
Am］）パーセントで生成させた。コポリマー溶液は50mM
のACES、pH7.0および0,2％のSDSから成る緩衝液中で生
成させた。この緩衝液または他の適当な電解質溶液を使
用してコポリマー電解質溶液を生成させることができ
る。ポリアクリルアミドの濃度は２％（w/w）であっ
た。コポリマー電解質溶液の粘度は、上記のように、キ
ャピラリー粘度計を用いて測定した。コポリマー電解質
溶液を上記のようにキャピラリーチューブを通して真空
で引っ張った。２ないし５ナノリットルの中性マーカー
（酸化メシチル）をカソード末端に加えた真空によって
キャピラリーに注入した。200V/cmの電圧を印加した。
電気浸透流（EOF）はcm2/秒・Ｖで計算したマーカーの
移動度として決定した。
MED）の混合物は、実施例１に述べたように、図４の下
部に示されるTEMED対アクリルアミドモノマー（［A
Am］）パーセントで生成させた。コポリマー溶液は50mM
のACES、pH7.0および0,2％のSDSから成る緩衝液中で生
成させた。この緩衝液または他の適当な電解質溶液を使
用してコポリマー電解質溶液を生成させることができ
る。ポリアクリルアミドの濃度は２％（w/w）であっ
た。コポリマー電解質溶液の粘度は、上記のように、キ
ャピラリー粘度計を用いて測定した。コポリマー電解質
溶液を上記のようにキャピラリーチューブを通して真空
で引っ張った。２ないし５ナノリットルの中性マーカー
（酸化メシチル）をカソード末端に加えた真空によって
キャピラリーに注入した。200V/cmの電圧を印加した。
電気浸透流（EOF）はcm2/秒・Ｖで計算したマーカーの
移動度として決定した。
その結果を図４に示す。図４から分かるように、約0.
05％ないし0.5％の範囲内のTEMED/［AAm］値で、EOF移
動度は２×10-5cm2/秒・Ｖ以下に減少する:2×10-5cm2/
秒・ＶのEOF移動度の値は電気浸透流が極めて低レベル
であることを反映している。
05％ないし0.5％の範囲内のTEMED/［AAm］値で、EOF移
動度は２×10-5cm2/秒・Ｖ以下に減少する:2×10-5cm2/
秒・ＶのEOF移動度の値は電気浸透流が極めて低レベル
であることを反映している。
B.アクリルアミドとDADMACのコポリマー アクリルアミドとジアリルジメチルアンモニウムクロ
リド（DADMAC）の混合物は、実施例１に述べたように、
図５の下部に示されるDADMAC対アクリルアミドモノマー
（［AAm］）パーセントで反応させた。コポリマー溶液
は50mMのACES、pH7.0および0.2％SDSから成る緩衝液中
で生成させた。この緩衝液または他の適当な電解質溶液
を使用してコポリマー電解質溶液を生成させることがで
きる。アクリルアミドコポリマーの濃度は２％であっ
た。コポリマー電解質溶液の粘度は、上記のように、キ
ャピラリー粘度計を用いて測定した。コポリマー電解質
溶液を上記のようにキャピラリーチューブによって真空
で引っ張った。２ないし５ナノリットルの中性マーカー
（酸化メシチル）をカソード末端に加えた真空によって
キャピラリーに注入した。＋200V/cmの電圧を印加し
た。電気浸透流（EOF）はcm2/秒・Ｖで計算した中性マ
ーカーの移動度として決定した。
リド（DADMAC）の混合物は、実施例１に述べたように、
図５の下部に示されるDADMAC対アクリルアミドモノマー
（［AAm］）パーセントで反応させた。コポリマー溶液
は50mMのACES、pH7.0および0.2％SDSから成る緩衝液中
で生成させた。この緩衝液または他の適当な電解質溶液
を使用してコポリマー電解質溶液を生成させることがで
きる。アクリルアミドコポリマーの濃度は２％であっ
た。コポリマー電解質溶液の粘度は、上記のように、キ
ャピラリー粘度計を用いて測定した。コポリマー電解質
溶液を上記のようにキャピラリーチューブによって真空
で引っ張った。２ないし５ナノリットルの中性マーカー
（酸化メシチル）をカソード末端に加えた真空によって
キャピラリーに注入した。＋200V/cmの電圧を印加し
た。電気浸透流（EOF）はcm2/秒・Ｖで計算した中性マ
ーカーの移動度として決定した。
その結果を図５に示す。図５から分かるように、約0.
05％ないし0.26％の範囲内のDADMAC/［AAm］値で、EOF
移動度は２×10-5cm2/秒・Ｖ以下に減少する：約２×10
-5cm2/秒・ＶのEOF移動度の値は電気浸透流が極めて低
レベルであることを反映している。
05％ないし0.26％の範囲内のDADMAC/［AAm］値で、EOF
移動度は２×10-5cm2/秒・Ｖ以下に減少する：約２×10
-5cm2/秒・ＶのEOF移動度の値は電気浸透流が極めて低
レベルであることを反映している。
実施例３ 試料ポリペプチドの分離 A.タンパク質分離 次のタンパク質の混合物をシグマ（セントルイスMO）
から購入した：α−ラクトアルブミン（14kd）、ダイズ
トリプシン阻害剤（20kd）、卵アルブミン（45kd）、ウ
シアルブミン（66kd）、およびβ−ガラクトシダーゼ
（116kd）。混合物中のタンパク質は標準法（アウスベ
ルら）によってSDS変性させた。簡単には、１％SDS/1％
メルカプトエタノール中1.0mg/mlにてタンパク質を沸騰
水で15分間加熱した。分析する前にタンパク質を水で0.
02mg/mlまで希釈した。
から購入した：α−ラクトアルブミン（14kd）、ダイズ
トリプシン阻害剤（20kd）、卵アルブミン（45kd）、ウ
シアルブミン（66kd）、およびβ−ガラクトシダーゼ
（116kd）。混合物中のタンパク質は標準法（アウスベ
ルら）によってSDS変性させた。簡単には、１％SDS/1％
メルカプトエタノール中1.0mg/mlにてタンパク質を沸騰
水で15分間加熱した。分析する前にタンパク質を水で0.
02mg/mlまで希釈した。
アクリルアミドとジアリルジメチルアンモニウムクロ
リド（DADMAC）の混合物を図６と図７に示したDADMAC対
アクリルアミドモノマー（［AAm］）パーセントで実施
例１に述べたように調製した。コポリマー溶液は2.0％
のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有した50mM ACE
S、pH7.0から成る緩衝液（シグマ）に生成させた。溶液
中の線状コポリマーポリアクリルアミド/DADMACの濃度
は２％（w/v）であった。コポリマー電解質溶液は上述
のようにキャピラリーチューブによって真空で引っ張
り、キャピラリーのカソード末端を試料混合物中に入れ
た。約１ないし２ナノグラムのタンパク質を−100V/cm
の電解強度によって10秒間キャピラリーに注入した。緩
衝液貯蔵器中のキャピラリー末端を用いて、−200V/cm
の電界強度を印加した。分離は30℃で行い、タンパク質
は200nmで検出した。キャピラリーチューブは55μｍの
内径と28cmの有効分離長を有していた。
リド（DADMAC）の混合物を図６と図７に示したDADMAC対
アクリルアミドモノマー（［AAm］）パーセントで実施
例１に述べたように調製した。コポリマー溶液は2.0％
のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有した50mM ACE
S、pH7.0から成る緩衝液（シグマ）に生成させた。溶液
中の線状コポリマーポリアクリルアミド/DADMACの濃度
は２％（w/v）であった。コポリマー電解質溶液は上述
のようにキャピラリーチューブによって真空で引っ張
り、キャピラリーのカソード末端を試料混合物中に入れ
た。約１ないし２ナノグラムのタンパク質を−100V/cm
の電解強度によって10秒間キャピラリーに注入した。緩
衝液貯蔵器中のキャピラリー末端を用いて、−200V/cm
の電界強度を印加した。分離は30℃で行い、タンパク質
は200nmで検出した。キャピラリーチューブは55μｍの
内径と28cmの有効分離長を有していた。
DADMAC/［AAm］で行われたタンパク質混合物の成分分
離のためのCEの結果を示す電気泳動図は、図６と図７に
示される。
離のためのCEの結果を示す電気泳動図は、図６と図７に
示される。
B.寸法較正 上記のタンパク質混合物は、３％（w/v）の溶液中、
線状コポリマーポリアクリルアミド/TEMEDの濃度で0.24
％のTEMED/［AAm］を使用して、本質的に上記のように
分離した。対数（MW）を、混合物中の各タンパク質に対
しα−ラクトアルブミンに関してタンパク質標準物の移
動度（α−ラクトアルブミンの移動時間を問題のタンパ
ク質ピークの移動時間によって割った）に対してプロッ
トし、得られた較正曲線を図10に示す。
線状コポリマーポリアクリルアミド/TEMEDの濃度で0.24
％のTEMED/［AAm］を使用して、本質的に上記のように
分離した。対数（MW）を、混合物中の各タンパク質に対
しα−ラクトアルブミンに関してタンパク質標準物の移
動度（α−ラクトアルブミンの移動時間を問題のタンパ
ク質ピークの移動時間によって割った）に対してプロッ
トし、得られた較正曲線を図10に示す。
C.再現性 本発明の方法の再現性は、上記の条件下に試料を繰り
返し注入して示され、キャピラリーは各試料の実験の間
に20″Hgで10分間コポリマー溶液を用いてフラッシし
た。全試料のタンパク質はシグマから入手した。溶液中
に線状コポリマーポリアクリルアミド/TEMEDの濃度は３
％w/vであった。TEMED/［AAm］濃度は0.24％であった。
50回の逐次試料実験を行い、分離結果は実験１、30およ
び50について図11に示す。
返し注入して示され、キャピラリーは各試料の実験の間
に20″Hgで10分間コポリマー溶液を用いてフラッシし
た。全試料のタンパク質はシグマから入手した。溶液中
に線状コポリマーポリアクリルアミド/TEMEDの濃度は３
％w/vであった。TEMED/［AAm］濃度は0.24％であった。
50回の逐次試料実験を行い、分離結果は実験１、30およ
び50について図11に示す。
D.ファーガソン回帰分析 上記タンパク質混合物中の各タンパク質の相対移動度
を多数のコポリマー濃度パーセントでα−ラクトアルブ
ミンの移動度に関して決定した。この分析に使用したコ
ポリマーは図15に示した溶液中の線状コポリマーポリア
クリルアミド/TEMEDの濃度範囲でTEMED/［AAm］が0.24
％であった。EC条件は上記と同じであった。
を多数のコポリマー濃度パーセントでα−ラクトアルブ
ミンの移動度に関して決定した。この分析に使用したコ
ポリマーは図15に示した溶液中の線状コポリマーポリア
クリルアミド/TEMEDの濃度範囲でTEMED/［AAm］が0.24
％であった。EC条件は上記と同じであった。
実施例４ 試料核酸の分離 Hea IIIで消化したφX174RFをベテスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ（（BRL）ガイサースバーグMD）から購
入した。φX174RFのHae III制限消化は72ないし1353塩
基対の範囲の大きさの11の二本鎖DNAフラグメントを生
成する。試料をマイクロリットルにつき0.06マイクログ
ラムに希釈した。アクリルアミドとTEMEDは実施例１に
記載したように0.24モルパーセントのTEMEDにて調製し
た。コポリマー溶液は125mM TES（シグマ）、pH7.0から
成る緩衝液で生成させた。核酸分離のために使用した線
状コポリマーポリアクリルアミド/TEMEDの濃度は図12に
示される（１、２および３％）。コポリマー電解質溶液
は上記のようにキャピラリーチューブによって真空で引
っ張り、キャピラリーのカソード末端を試料混合物中に
入れた。約１〜２ナノグラムのDNA制限消化混合物を10
秒間、−100V/cmの電界強度によってキャピラリーに注
入した。緩衝液貯蔵器中のキャピラリー末端を用いて、
−200V/cmの電界強度を印加した。分離は30℃で行い、D
NAフラグメントは260nmの吸光度によって検出した。キ
ャピラリーチューブは55μｍの内径と28cmの有効分離長
を有していた。
ラボラトリーズ（（BRL）ガイサースバーグMD）から購
入した。φX174RFのHae III制限消化は72ないし1353塩
基対の範囲の大きさの11の二本鎖DNAフラグメントを生
成する。試料をマイクロリットルにつき0.06マイクログ
ラムに希釈した。アクリルアミドとTEMEDは実施例１に
記載したように0.24モルパーセントのTEMEDにて調製し
た。コポリマー溶液は125mM TES（シグマ）、pH7.0から
成る緩衝液で生成させた。核酸分離のために使用した線
状コポリマーポリアクリルアミド/TEMEDの濃度は図12に
示される（１、２および３％）。コポリマー電解質溶液
は上記のようにキャピラリーチューブによって真空で引
っ張り、キャピラリーのカソード末端を試料混合物中に
入れた。約１〜２ナノグラムのDNA制限消化混合物を10
秒間、−100V/cmの電界強度によってキャピラリーに注
入した。緩衝液貯蔵器中のキャピラリー末端を用いて、
−200V/cmの電界強度を印加した。分離は30℃で行い、D
NAフラグメントは260nmの吸光度によって検出した。キ
ャピラリーチューブは55μｍの内径と28cmの有効分離長
を有していた。
TEMED/［AAm］で行われたDNAフラグメント混合物の成
分の分離のためのCEの結果を示す電気泳動図は、図12に
示される。
分の分離のためのCEの結果を示す電気泳動図は、図12に
示される。
本発明は特定の方法および具体的に関して記載されて
いるが、本発明から逸脱することなく、種々の改良およ
び変更を行うことができることは認められるであろう。
いるが、本発明から逸脱することなく、種々の改良およ
び変更を行うことができることは認められるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０８Ｌ 33/24 Ｃ０８Ｌ 33/24 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｂ０１Ｄ 57/02 // Ｂ０１Ｄ 57/02 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３０１Ａ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ウェルナー，ウイリアム イー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94070 サン カルロス，アパートメン ト１，メレンディ ドライブ 2760 (72)発明者 ウイクトロウイツ，ジョン イー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95119 サン ジョーズ，サン アンセ ルモ ウェイ 6416 (72)発明者 ウェンツ，エイチ−マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94061 レッドウッド シティ，カント リイ クラブ ロード 3733 (72)発明者 オークス，フランク エル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94521 コンコード，カウリ コート 3981 (56)参考文献 特開 平３−239959（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/447 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (33)
- 【請求項１】その内壁表面に荷電した化学基を有するキ
ャピラリーチューブまたは導管であって、該チューブま
たは導管は、（ａ）20と5,000キロダルトンとの間の分
子量、および（ｂ）全ポリマーサブユニットに対し荷電
したモノマーサブユニットのモルパーセントによって測
定されるときに0.01〜1.0％の間の電荷パーセントを有
する少なくとも一つのポリマーまたはコポリマー種を含
有する非架橋親水性ポリマーまたはコポリマー溶液0.05
〜30重量％（w/w）を含有する電解質溶液を含有し、こ
こで、該荷電したモノマーサブユニットは壁電荷と逆の
電荷を有する、キャピラリーチューブまたは導管。 - 【請求項２】請求項１に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、ポリアクリルアミド、ポリオキシド、ポリエー
テル、ビニルポリマー、セルロースポリマー、アクリル
ポリマー、天然ゴム、または多糖類を含有し、そして該
ポリマーまたはコポリマーが特定の電荷パーセントを含
有する、キャピラリーチューブまたは導管。 - 【請求項３】請求項２に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリルアミ
ド）、ポリ（Ｎ−メチルアクリルアミド）、またはポリ
（N,N−ジメチルアクリルアミド）を含有する、キャピ
ラリーチューブまたは導管。 - 【請求項４】請求項２に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、ポリエチレンオキシド、またはポリプロピレン
オキシドを含有する、キャピラリーチューブまたは導
管。 - 【請求項５】請求項２に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、ポリビニルメチルエーテルを含有する、キャピ
ラリーチューブまたは導管。 - 【請求項６】請求項２に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコー
ル、またはポリビニル酢酸を含有する、キャピラリーチ
ューブまたは導管。 - 【請求項７】請求項２に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、キサンタン、デキストラン、寒天、グアー（gu
ar）、または澱粉を含有する、キャピラリーチューブま
たは導管。 - 【請求項８】請求項２に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシ
プロピルメチルセルロースを含有する、キャピラリーチ
ューブまたは導管。 - 【請求項９】請求項２に記載のキャピラリーチューブま
たは導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポリ
マーは、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、または
ポリエチレングリコールモノメタクリレートを含有す
る、キャピラリーチューブまたは導管。 - 【請求項１０】請求項１に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、前記ポリマーまたはコポ
リマー溶液は、ホモポリマーを含む、キャピラリーチュ
ーブまたは導管。 - 【請求項１１】請求項１に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、前記ポリマーおよびコポ
リマーは、第１級アミン類、第２級アミン類、第４級ア
ミン類、カルボン酸類、スルホン酸類、リン酸類、硫酸
類、およびホスホン酸類から選ばれる少なくとも１つの
荷電した基を含む、キャピラリーチューブまたは導管。 - 【請求項１２】請求項11に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、前記ポリマーおよびコポ
リマー分子は、ジアリルジメチルアンモニウム塩、テト
ラメチルエチレンジアミド、〔３−（メタクリロアミ
ノ）プロピル〕−トリメチルアンモニウム塩、2.2′−
アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）塩、および
２−メチルアクリルオキシエチル（トリメチルアンモニ
ウム）塩に由来する正に荷電した基を含む、キャピラリ
ーチューブまたは導管。 - 【請求項１３】請求項１に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、前記ポリマーは、アクリ
ルアミドと塩化ジアリルジメチルアンモニウム（DADMA
C）とのコポリマーであり、かつ約200〜600キロダルト
ンの間の分子量を有し、そして該ポリマー分子は、アク
リルアミドサブユニット一つあたり0.02〜0.4％のN,N−
ジメチルピロリジンを含む、キャピラリーチューブまた
は導管。 - 【請求項１４】請求項１に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、前記ポリマーは、アクリ
ルアミドとテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）と
のコポリマーであり、かつ約100〜500キロダルトンの間
の分子量を有し、そして該ポリマー分子は、アクリルア
ミドサブユニット一つあたり0.05〜0.5％のテトラメチ
ルエチレンジアミンを含む、キャピラリーチューブまた
は導管。 - 【請求項１５】請求項１に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、前記ポリマーは、N,N−
ジメチルアクリルアミドとテトラメチルエチレンジアミ
ン（TEMED）とのコポリマーであり、かつ約200〜800キ
ロダルトンの間の分子量を有し、そして該ポリマー分子
は、N,N−ジメチルアクリルアミドサブユニット一つあ
たり0.03〜0.6％のテトラメチルエチレンジアミンを含
む、キャピラリーチューブまたは導管。 - 【請求項１６】請求項１に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、前記ポリマーは、アクリ
ルアミドおよび〔３−（メタクリロイルアミノ）プロピ
ル〕トリメチルアンモニウムクロリドとのコポリマーで
あり、かつ約200〜600キロダルトンの間の分子量を有
し、そして該ポリマー分子は、アクリルアミドサブユニ
ット一つあたり0.01〜0.2％のＮ−〔（プロピル）トリ
メチルアンモニウムクロリド〕メタクリルアミドを含
む、キャピラリーチューブまたは導管。 - 【請求項１７】請求項１に記載のキャピラリーチューブ
または導管であって、ここで、壁電荷と逆の電荷を含有
するポリマー分子の濃度が、非共有結合的に該壁表面を
被覆し、かつ２×10-5cm2/秒・Ｖ、未満の電流浸透流を
生じるために十分である、キャピラリーチューブまたは
導管。 - 【請求項１８】請求項１〜17のいずれか１項に記載のキ
ャピラリーチューブまたは導管であって、ここで、前記
溶液はドデシル硫酸ナトリウムを含む、キャピラリーチ
ューブまたは導管。 - 【請求項１９】請求項１〜17のいずれか１項に記載のキ
ャピラリーチューブまたは導管であって、ここで、前記
溶液は尿素またはホルムアミドを含む、キャピラリーチ
ューブまたは導管。 - 【請求項２０】請求項１〜19のいずれか１項に記載のキ
ャピラリーチューブまたは導管であって、200μｍ以下
の内径を有する、キャピラリーチューブまたは導管。 - 【請求項２１】請求項１〜20のいずれか１項に記載のキ
ャピラリーチューブまたは導管を電気泳動のために調製
する方法であって、該方法は、内壁表面に荷電した化学
基を有するキャピラリーチューブまたは導管に（ａ）20
と5,000キロダルトンとの間の分子量、および（ｂ）全
ポリマーサブユニットに対し荷電したモノマーサブユニ
ットのモルパーセントによって測定されるときに0.01〜
1.0％の間の電荷パーセントを有する少なくとも一つの
ポリマーまたはコポリマー種を含有する非架橋親水性ポ
リマーまたはコポリマー溶液0.05〜30重量％（w/w）を
含有する電解質溶液を充填する工程であって、ここで該
荷電したモノマーサブユニットは、選択されたpHで壁電
荷と逆の電荷を有する工程、を包含する、方法。 - 【請求項２２】試料中の生体分子を検出する方法であっ
て、該方法は、以下の工程： ｉ）請求項１〜20のいずれか１項に記載のキャピラリー
チューブまたは導管を２つの端部とともに調製する工程
であって、前記荷電したモノマーサブユニットは、選択
した電気泳動pHにおいて、前記壁電荷と逆の電荷を有す
る、工程； ii）該キャピラリーチューブまたは導管の該端部を電解
質溶液を含有するアノードとカソードの貯蔵器に浸す、
工程； iii）分離される該生体分子を含有する試料を該キャピ
ラリーチューブまたは導管の一端に導入する、工程； iv）該試料中の該生体分子を分画するために有効な極性
を用いて該貯蔵器を横切って電界を印加する、工程；お
よび ｖ）該キャピラリーチューブまたは導管において分離さ
れた生体分子の存在を検出する、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２３】前記生体分子がタンパク質、ポリペプチ
ド、またはペプチドである、請求項22に記載の方法。 - 【請求項２４】前記貯蔵器中の溶液がドデシル硫酸ナト
リウムを含む、請求項22または23に記載の方法。 - 【請求項２５】前記生体分子が核酸フラグメントであ
る、請求項22に記載の方法。 - 【請求項２６】前記貯蔵器中の溶液が尿素またはホルム
アミドを含む、請求項22〜25のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２７】前記フラグメントが２本鎖核酸であり、
示差移動度が該フラグメントに内位添加剤を添加して調
整される、請求項25に記載の方法。 - 【請求項２８】DNA試料の制限消化分析を行う際に使用
するため、さらに１またはそれ以上の選択された制限エ
ンドヌクレアーゼで該試料を消化する工程を包含する、
請求項25に記載の方法。 - 【請求項２９】前記核酸フラグメントが、DNA配列決定
反応の生成物であり、そして該DNA配列決定反応が、蛍
光標識で標識を付けた核酸を含む、請求項25に記載の方
法。 - 【請求項３０】前記生体分子が、１本鎖DNAであり、そ
して該生体分子の相対移動度が、該生体分子間の配座多
形性に依存する、請求項25に記載の方法。 - 【請求項３１】前記生体分子がポリメラーゼ鎖反応の増
幅生成物であるDNA分子である、請求項25に記載の方
法。 - 【請求項３２】前記生体分子が、核酸−タンパク質複合
体である、請求項25に記載の方法。 - 【請求項３３】前記生体分子が、線状、分枝状、天然、
または化学的改変オリゴ糖類である、請求項25に記載の
方法。
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|---|---|---|---|
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| PCT/US1993/004078 WO1993022665A1 (en) | 1992-05-01 | 1993-04-30 | Capillary electrophoresis molecular weight separation of biomolecules using a polymer-containing solution |
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