JP3037359B2 - コクシジウム症ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Eimeria種の免疫学的性質を有する蛋白質
及びその断片、これらをコ−ドするDNA配列、これらのD
NA配列を含有する組み換えベクタ−及び宿主生物、並び
に上記蛋白質もしくはは蛋白質断片又はこれらをコ−ド
するDNAを含有するワクチンに関する。

コクシジウム症は、原生動物門Apicomplexa亜門Eimer
ia属の細胞内寄生虫によって引き起こされる疾病であ
る。これらの寄生虫は、胃腸管及び消火器官の部分を形
成する細胞中で繁殖する。

集約的生産の増大のために、養鶏産業においてこれら
の寄生虫により引き起こされる損害が、この何十年間で
驚くほど増してきた。例えば、オランダの養鶏場が毎年
被って損失は、100万ギルダ−に達する。1986年の損失
は約1,300万ギルダ−であった。同年、米国では、コク
シジウム駆虫薬（coccidiostats）を使用したにもかか
わらず、３億米国ドルの損失を被った。

ニワトリのコクシジウム症の病原体は９種、即ちEime
ria acervulina、E.maima、E.tenella、E.necatrix、
E.brunetti、E.mitis、E.praecox、E.mivati及びE.haga
niに細分できる。しかしながら、最後の２種の存在を疑
っている人もいる。これらの種はすべて、ニワトリだけ
を宿主としており、高度の組織特異性を示す。しかしな
がら、上記の種の生活周期は類似している。種によって
ニワトリに及ぼすその病原作用は異なっており、ニワト
リの種類も一役を演じる。即ち、ブロイラ−はE.acervu
lina又はE.maximaのような寄生虫によって多大の損害を
被るであろう。これは、食物消化を主要な役割とする小
腸の大部分にこれらの寄生虫が寄生するためである。

生活周期の間に、寄生虫Eimeriaは多くの段階を経
る。感染段階（胞子形成接合子嚢）は口中に入り、ニワ
トリの胃に入り込むが、ここでは破砕作用の結果、嚢子
壁が破裂して開く。この接合子嚢が含有する４個のスポ
ロシストが放出され、十二指腸に運ばれて、ここで胆汁
及び消化酵素にさらされる。その結果、スポロシスト壁
に開口部が生じ、スポロシスト中に存在するスポロゾイ
トが放出される。これらのスポロゾイトは運動性であっ
て、侵入し、繁殖するために適当な宿主細胞、即ち上皮
細胞を捜す。種により、この最初の繁殖段階は20〜48時
間継続し、数十〜数百のメロゾイトが産生されるが、こ
れらは再び新しい宿主細胞に侵入し、繁殖する。２回乃
至時として５回のこれらの無性生殖周期の後、種に応じ
て、細胞内メロゾイトは有性形態、即ち雌雄の生殖母細
胞に成長する。雄性配偶子が雌に受精後、接合子が形成
されるが、これはそれ自身の周囲に嚢子壁をつくる。こ
の接合子嚢は宿主細胞を離れ、糞便とともに排出され
る。ニワトリ外部の温度及び湿度が相対的に高く、同時
に空気中に十分な酸素が存在する場合には、接合子嚢は
胞子形成して感染期に進むことができる。

このように、ニワトリからニワトリへと該寄生虫が移
動するのに中間宿主は必要ではない。したがって、有効
表面積の占有度が高いと、養鶏場における感染圧（infe
ction pressure）は急速に増加すると考えられる。

寄生虫は、種々の方法で撲滅することができる。

うまく管理することに加えて、しばしば餌や飲水に混
合されるコクシジウム駆虫薬を用いてコクシジウム症を
制御することができる。

しかしながら、種々の撲滅薬に対する耐性を発現する
該寄生虫の遺伝的能力が一部高いために、近年、これら
の薬剤は有効性が低下している。さらに、これらの薬剤
の多くが食肉中に残留し、これが消費に際して問題を生
じさせる可能性がある。

したがって、免疫学的予防ははるかに良好な撲滅方法
であると思われる。十分に重度の感染を経て生き延びた
ニワトリは、同型のEimeriaにその後接触しても抵抗で
きることは公知である。Eimeriaに対する抵抗性は、鳥
を数回低用量の接合子嚢で、又は弱性（非病原性の）株
の接合子嚢で感染させることによっても誘発可能であ
る。しかしながら、特に非常に多数のブロイラ−に制御
投与することは、この場合、実際には克服し難い問題で
ある。したがって、不活性化ワクチンは、それに代わる
実行可能な溶液であると思われる。

不活性化ワクチンは、該寄生虫起源の抗原から成る
が、できるならばアジュバントをも含む。

該寄生虫から単離された抗原を用いる代わりに、公知
の方法に従って実行可能な技術である組み換えDNA技術
を用いて製造される産物を使用するることもできる。

抗原又はその一部を合成的に再生産することができる
し、さらに、例えばアジュバントの存在下で担体蛋白質
に結合させた、免疫学的に認識可能な且つ刺激性の形態
で、ニワトリにこれを投与することができる。

さらに、該抗原をコ−ドする遺伝子が組み込まれてい
る細菌やウィルスのような生きている宿主生物を投与す
ることにより、ワクチン接種を実施することができる。
この生物は、その後、十分に長い期間抗原の合成を保証
するので、ニワトリの免疫系が十分に刺激される。

本発明は、コクシジウム症に対する家禽類の免疫に使
用することができる蛋白質（Etp 100と命名されてい
る）又はその断片を提供する。

上記蛋白質Etp 100は、E.tenellaの抽出物をモノクロ
−ナル抗体E.TEN.11P−２を含有するカラム基質に注
ぎ、抽出物の吸着画分を非吸着画分から分離し、その後
吸着画分を当業界で公知の方法によってカラム基質から
脱離することにより、上記抽出物から単離し得る。

この免疫クロマトグラフィ−法によって得られた蛋白
質物質を場合により、天然物質の精製のために当業界で
は公知の方法によりさらに精製し得る。

このようにしてE.tenellaから得られた蛋白質Etp 100
の特性化により、以下の性質が明らかになった： a.SDS−PAGEでの分子量約100KD; b.非還元条件下ではモノクロ−ナル抗体E.TEN.11P−２
と結合するが、還元条件下では結合しない； c.胞子形成された接合子嚢、スポロシスト、スポロゾイ
ト、第一及び第二世代シゾント、並びに第二世代メロゾ
イド中に出現。

100kD蛋白質は、種々の供給源から得られるE.tellena
のスポロゾイト並びにメロゾイトから適当に単離するこ
とができる。

さらに、Etp 100に相当する蛋白質は、E.maxima及び
E.acervulinaのような他のEimeria種から単離し得る。
これらの相当する蛋白質の確認は、上記E.tenellaの100
kD蛋白質の断片に対するマウス抗血清を生成し、第５図
に示した通り、E.maximaスポロゾイト及びE.acervulina
スポロゾイトを用いたウェスタン（Western）ブロット
アッセイにおいてこの抗血清の抗体を使用することによ
って確定した。

この方法で検出され得る蛋白質は、E.tenellaのEtp 1
00と同様の分子量を有することが判明した。同一抗血清
を用いて、E.maxima蛋白質とE.acervulina蛋白質を免疫
クロマトグラフィ−で分離することができる。

以下の実施例で略述する通り、E.tenella蛋白子又は
そのポリペプチド断片をコ−ドするDNA配列は、ゲノムD
NAから、並びにE.tenella mRNAに由来する相補DNA（cD
NA）から得られた。これらのDNA配列（及びその部分配
列）も、これらのDNA配列及び部分配列によりコ−ドさ
れるEimeria抗原性を有するポリペプチドとともに、本
発明の一部を形成する。

所定のアミノ酸に対しては、しばしばいくつかの異な
るコドン（３つのヌクレオチド塩基）がDNAではコ−ド
し得ることは公知である。即ち、例えばグルタミン酸に
対するコドンはGAT又はGAA等である。第６〜８図に従う
アミノ酸配列を有するポリペプチド（又はそのポリペプ
チド断片）の発現のためには、同様に、同様の代替コド
ン組成を有するDNAが用いられる。

さらに、コクシジウム症に対する家禽類の免疫に用い
得るこれらのポリペプチド断片も、本発明の一部であ
る。既知又は未知のアミノ酸配列内のこのような使用可
能なポリペプチド断片（エピト−プと呼ばれる）を検出
するために、種々の方法が知られている。既知のアミノ
酸配列に基づいて、例えばこれらのエピト−プは、特許
WO84/03564及びWO86/06487明細書に記載のスクリ−ニン
グ法を用いて実験的に決定することができる。

さらに、既述のアミノ酸配列を有するポリペプチドの
多くの領域は、理論的考察、並びに現在知られているエ
ピト−プと一致する構造に基づいて、エピト−プを明示
することができる。これらの領域の決定は、HoppとWood
s（PNAS USA78:3824〜3828;1981）による親水性判定基
準と、ChouとFasman（Advances in Enzymology 47:45〜
148;1987）による二次構造予測とを組み合わせたものを
基礎とした。

以下の領域は、抗体に対するエピト−プと思われるも
のを含む（第８図参照）：アミノ酸番号約270〜300及び
495〜525。

以後、アミノ酸配列ISPQKPGSPPCPTCEAPRGRSCAEQPPGLT
R及びPVDEVVGDWEDWGQCSEQCGGGKRTRNRGPS、並びにこれら
の配列を含むポリペプチドも、本発明の一部である。

必要となる可能性があるＴ細胞エピト−プは、Berzof
skyの両親媒性判定基準（Science 235:1059〜62;1987）
によって、理論的根拠に基づいて同様に得られる。

本発明に従ってコクシジウム症感染に対して免疫する
ためには、例えば、抗イディオタイプ抗体又はその抗原
結合断片を用いることもできる。このような抗体は抗体
のイディオタイプに対するものであるが、引き続いて本
発明のポリペプチドに対する抗体となる。上記の本発明
のポリペプチドの免疫原性等価物は、とりわけこの型の
抗イディオタイプ抗体を意味すると理解されたい。

本発明に従ってコクシジウム症に対して家禽類を免疫
するには、本発明のポリペプチド、断片、又は免疫原性
等価物をニワトリに投与するか、あるいは、組み換えDN
A又はRNA技術を用いた遺伝子操作により本発明のポリペ
プチドもしくはその免疫原性断片、又はその等価物をそ
の場で産生する能力を獲得している微生物を投与するこ
とが可能である。

前者の場合には「サブユニットワクチン」という用語
がしばしば用いられるし、また後者の場合には「ベクタ
−ワクチン」という用語が通常使われる−本出願人も、
本明細書でこの術語を用いることにする。

本発明のサブユニットワクチンは、一般に、精製形態
でのポリペプチドを、任意に医薬上許容される賦形剤の
存在下で、含有する。

このような応用に使用するポリペプチドは、Eimeria
からの単離、組み換えDNA技術、又はペプチド合成とい
ったような公知の方法によって製造し得る。

該ポリペプチドは、場合により、非関連蛋白質と共有
結合し得るが、この蛋白質は、例えば融合生成物を精製
する際に有益となり得るか、もしくは成熟蛋白質へのプ
ロセッシングに役立つものである。その具体例として
は、β−ガラクトシダ−ゼ、プロティンＡ、プロキモシ
ン、血液凝固因子Xa等が挙げられる。

所望により、該ポリペプチドを、例えばグリコシル
化、アミド化、カルボキシル化、アシル化又はリン酸化
によって、in vino又はin vitroで修飾することもでき
る。

それらの免疫原性を増強するためには、これらのポリ
ペプチドを適切に担体と結合するか又は担体と会合し、
及び／又はアジュバント特性を有する化合物と組み合わ
せることができる。

さらに、これらのポリペプチドをベ−スとするワクチ
ンは、慣用的にワクチンに用いられる安定剤、緩衝液等
のような他の化合物を含有し得る。

ベクタ−ワクチンでは、本発明のポリペプチド産物
は、それ自体が免疫されるべき固体に投与され、また生
物体内でそれ自体をしばらくの間保持し、又は増殖しさ
えする遺伝子操作された生物によって作製される。種々
の生物として、例えばEscherichia coli、Bacillus又
はSalmonellaのような細菌、もしくは牛痘ウィルス又は
鶏痘ウィルスのようなウィルスをこのための宿主として
用いることができる。このタイプの宿主生物を用いた場
合、ポリペプチドはそれ自体表面抗原として発現する。
このような情況においては、上記ポリペプチドと、Esch
erichia coliのOMP蛋白質または線毛蛋白質、あるいは
宿主生物によって認識されるシグナル配列及びアンカ−
配列の合成物との融合が考えられる。上記免疫原性ポリ
ペプチドは、所望によりより大きな全体の一部として、
動物体内に放出されて免疫することもできる。これらの
すべての場合において、１つ又はそれ以上の免疫原性産
物が、種々の病原体に対する、及び／又は所定の病原体
の種々の抗原に対する防御を生じさせることも可能であ
る。

実施例１ ハイブリド−マの製造 寄生虫及びその画分の製造 Longら（Fol.Vet.Lat.６:201〜217;1976）の方法に従
って、寄生虫E.tenellaを維持し、接合子嚢を単離し
た。WisherとRose（Parasitology 88:515〜519,1984）
の報告と同様に、さらにLarsenら（J.Parasitol.70:597
〜601;1984）の報告によるナイロンウ−ル精製法を用い
て、スポロゾイトを単離、精製した。第二世代メロゾイ
トを、StotishとWang（J.Parasitol.61:700〜703;197
5）の方法により感染後96時間目にニワトリ盲腸から単
離し、さらに連続70％Percoll勾配上で、遠心分離して
精製した。

免疫及び細胞融合 0.5mlのPBS（リン酸緩衝塩水）中10⁶個のE.tenellaス
ポロゾイトを腹腔内投与し、その後融合４日前に同用
量、同経路でブ−ストすることにより、Balb/Cマウスを
免疫した。第１回免疫後６週間目に、脾臓を、無菌的に
摘出し、その細胞を、ＫhlerとMilstein（Nature 25
6:495〜7;1975）の報告と同様に骨髄腫系P3×63Ag 8.6.
53.と融合し、標準プロトコ−ルに従って培養した。

ハイブリド−マの選択 蛍光抗体法（IFA）を用いてスポロゾイト抗原を認識
する、ハイブリド−マを選択した。スポロゾイトをPBS
中に懸濁し（１〜３×10⁶/ml）、3ml容量ずつを10ウェ
ルガラススライド（Celline）上に滴下し、室温で一晩
乾燥し、−70℃で乾燥保存した。

アセトン中でスライドを解凍、固定した後、25μの
ハイブリド−マ上澄を各ウェルに滴下し、37℃で30分間
インキュベ−トした。スライドをPBS中ですすぎ、PBSで
５分間、３回洗浄した。

標識されたウサギ抗マウスFITC（Nordiciフルオロ−
イソ−チオシアネ−ト）を1:100〜200に希釈して結合体
（conjugate）として使用し、計数用染料としての0.05
％ Evans Blue存在下、37℃で30分間インキュベ−トし
た。洗浄及びすすいだ後、スライドを0.1mol/トリス
−塩酸;pH 9.0:75％グリセロ−ルで固定し、Leitz Ort
holux蛍光顕微鏡を用いて検定した。この検定では陽性
を示したハイブリド−マを、さらに限界希釈によりクロ
−ン化し、再び検定して、液体窒素中に保存するか、あ
るいは腹水産生のためにプリスタンを注射しておいたBa
l b/Cマウスに直接注射した（2.5×10⁶ハイブリド−マ
細胞／マウス，腹腔内投与）。これらの陽性ハイブリド
−マから、有用な抗体を産生する２つのクロ−ンを選択
した。それぞれE.TEN.11P−２及びE.TEN.10Y−２として
示されるこれらのモノクロ−ナル抗体は、IFAから判定
されるようにE.tenellaスポロゾイト及び第二世代メロ
ゾイトを認識した。蛍光パタ−ンはともに類似してい
た。さらに、両モノクロ−ナル抗体は、ゾイトの前半に
存在する物質、おそらくは細胞質蛋白質と結合した。

サンプルの寄託 これらのE.TEN.11P−２及びE.TEN10Y−２抗体を産生
するハイブリド−マ細胞系のサンプルを、1989年２月２
日、英国、Porton Downのthe European Cellection of
Animal Cell Culturesに、それぞれ寄託番号第8902020
2号及び第89020201号として寄託した。

実施例２ モノクロナ−ル抗体E.TEN.11P−２及びE.TEN.10Y−２の
特徴 A.方法 MoAb E.TEN.11P−２及びE.TEN.10Y−２の標的抗原
を、Vurmeulenら（J.Exp.Med. 162:1460〜76;1985）の
報告と同様にSDS−PAGE/イムノブロッティング法を用い
て特性化した。手短かに言えば、２×10⁷個の新鮮に脱
嚢された（excysted）ナイロンウ−ルに精製されたスポ
ロゾイトを、DTT又はβ−メルカプトエタノ−ルのよう
な還元剤を加えないLaemmliサンプル緩衝液（Nature 22
7:680〜4;1970）中で溶解した。５分間煮沸し、18000g
で３分間遠心分離した後、上清を取り出し、20％グリセ
ロ−ル液とし、４％積層ゲルを含む７〜18％アクリルア
ミド勾配ゲル（又は12％均一ゲル）上に載せた。

電気泳動分離後、蛋白質を0.01mol/トリス;0.079mo
l/グリシン;pH8.3中で10V/cmで１時間、ニトロセルロ
−ス紙（0.45μm;Schleicher＆ Schll）上にブロッ
ティングした。

免疫検出のために、ニトロセルロ−ス紙片をPBSに溶
解した0.2％脱脂粉乳（NFMP）液中で30分間前処理し、P
BS;0.05％ Tween−20;0.1％NFMP中10倍希釈したハイブ
リド−マ上澄と共に、室温で90分間インキュベ−トし、
広範に洗浄して、アルカリ性ホスファタ−ゼで標識され
た抗マウスIgと共にインキュベ−トした。結合されたIg
結合体を、100mmol/トリス/HCl;pH 9.5;100mmol/ N
aCl;5mmol/ MgCl₂に溶解したニトロブル−テトラゾリ
ウム（0.33mg/ml）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルホスフェ−トＰ−トルイジン塩（0.17mg/m
l）を用いて視覚化した。

B.結果 モノクロナ−ル抗体E.TEN.11P−２及びE.TEN.10Y−２
は非還元性E.tenellaスポロゾイト−メロゾイト蛋白質
のWesternブロット上の95〜110kDのバンドと反応した
（第１図）。Bio−rad SDS−PAGE分子量マ−カ−は、参
照として用いた。ELISAにおいて特異抗血清を用いて、
E.TEN.11P−2/E.TEN.10Y−２をIgG1アイソタイプである
と特性化した。

実施例３ 寄生虫発育中にMoAb E.TEN.11P−２と反応する抗原の
発現 A.方法 比較しうる量の胞子形成された接合子嚢、精製スポロ
シスト及び精製スポロゾイトをもつレ−ンを含有するWe
sternブロットを作製した。実施例3Aに記載の手法によ
り、モノクロ−ナル抗体並びにニワトリ高度免疫血清を
用いてWesternブロットをプロ−ブした。

９羽のニワトリ（７週令）に２×10⁴個の生存するE.t
enella接合子嚢を４日以内に２回経口投与し、その後10
⁴個の用量で４回、４日間隔で投与することによりニワ
トリの高度免疫血清を生じさせた。最終投与後１週間目
に、全ニワトリを採血した。血清をプ−ルし、1:1280で
実施例１に記載の蛍光抗体法で、抗スポロゾイト力価を
アッセイした。

B.結果 MoAb E.TEN.11P−２及びE.TEN.10Y−２の標的蛋白質
である95〜110kD蛋白質は胞子形成された接合子嚢中に
すでに存在することが明示されたし、また、それらはス
ポロシスト及びスポロゾイト期にも発現された。95〜11
0kD蛋白質は、ニワトリの高度免疫血清によって優位に
認識された（第２図）。

実施例４ E.tenella蛋白質の免疫クロマトグラフィ−による精製 イムノアフィニティカラムの作製 E.TEN.11P−２から得られたIgGを、（NH₄）₂SO₄の50
％飽和を用いて、室温で、腹水液から沈澱させた。その
物質を、Minifuge T（Heraeus Christ）中で2500rpmで3
0分間回転させた。そのペレットを50％（NH₄）₂SO₄で２
回洗浄し、原容積の半分量の0.2mol/のNaHCO₃に再懸
濁し、メ−カ−の説明書に従ってSephadex G25（Pharm
acia PD10カラム）上で脱塩し、４℃で一晩、CNBr−活
性化Sepharose（Pharmacia）に結合させる。最終結合比
は、ゲル1ml当たり6.7mg IgGであった。E.TEN.10Y−２
に関しては、メ−カ−の説明書に従って、IgGを、プロ
ティンＡ−Sepharose（Pharmacia）を用いて腹水から濃
縮、精製した。中和及び脱塩後、上記と同様に結合を行
なった。E.TEN.10Y−２カラムの最終結合比は4.8mg/ml
ゲルとであった。

５〜7mlのIgG結合Sepharoseを適当なカラムに注入
し、ランニング緩衝液中で平衡化させた（25mmol/ト
リス／塩酸;pH8.0;0.5mol/ NaCl;0.1％NP40）。

Etp 100のイムノアフィニティ精製 −70℃でペレットとして凍結された320×10⁶個のE.te
nellaスポロシストを解凍し、25mmol/トリス／塩酸;p
H8.0;1mmol/ EDTA;1mmol/ PMSFの溶液3ml中に懸濁
した。

3gのガラスビ−ズ（直径〜0.3mm）存在下で、掻き回
して嚢子を破壊した。その溶液を0.1％Nonidet P40（NP
40）とし、０℃で１時間インキュベ−トした。非溶解物
質を４℃で2000rpmで15分間回転し、その後300rpmで１
時間回転して遠心分離した。上清を0.22μｍフィルタ−
に通した後、免疫カラムに掛けた。

5mlのE.tenellaスポロシスト抽出物を、0.15ml/分の
流速でE.TEN.11P−２及びE.TEN.10Y−２カラムに、周囲
温度で１晩、再循環システム中で結合させた。

±20循環後、非結合画分を集め、さらに分析するため
に保存した。カラムを、洗浄液４（0.1mol/酢酸塩;0.
5mol/ NaCl;0.1％NP40;pH4.0）及び洗浄液８（0.1mol
/ Tris/HCl;0.5mol/ NaCl;0.1％NP40;pH8.0）を交
互に用いて少なくとも３サイクル、流速0.5ml/分で洗浄
した。固定床容量の２倍のランニング緩衝液で洗浄した
後、0.1mol/炭酸塩／重炭酸塩;pH10.6;0.1％NP40を4m
l用いてアルカリ溶出を行なった。

画分を1mol/トリスpH8.0で中和し、カラムをランニ
ング緩衝液で再平衡化した。その後、0.1mol/グリシ
ン／塩酸;0.15mol/ NaCl;0.1％NP40;pH2.6を用いて溶
出を行った。酸性画分を1mol/トリス;pH8.0で中和し
た。

全画分を、非還元条件下のSDS−PAG上で、さらにプロ
−ブ抗体としてポリクロ−ナルウサギ抗スポロゾイト血
清を用いてWesternブロット上で分析した（第３図）。
画カラムから、酸性条件を用いて主画分を溶出した。E.
TEN.11P−２カラムから溶出した物質は、E.TEN.10Y−2
MoAbと陽性に反応した（示されていない）。

実施例５ E.tenellaのcDNAライブラリ−の作製及び免疫学的スク
リ−ニング A.RNAの単離 RNAを単離するために、十分に胞子形成した接合子嚢
を、10mmol/酢酸トリス（pH7.6）;75mmol/酢酸ナト
リウム;1％SDS;2mmol/ EDTA;0.2mg/mlプロテイナ−ゼ
Ｋ及び10mmol/バナジルリボヌクレオシド複合体を含
有する緩衝液2.8ml中に入れた。接合子嚢を、13gのガラ
スビ−ズ（φ0.5mm）存在下で60秒間（最大で）攪拌し
て破壊した。5mlのフェノ−ルを全抽出物に加え、その
混合物をさらに60秒間攪拌した。遠心分離後、水層をピ
ペットで取り出し、再び同容量のフェノ−ル，クロロホ
ルム，及びイソアミルアルコ−ル（25:24:1）の混合液
で抽出した。2.5容のエタノ−ルを加えた後、RNAを沈澱
させ、その結果生じた沈澱物を、トリス10mmol/;EDTA
0.1mmol/;pH7.6を含有する緩衝液800μに溶解し、
その後、その物質をさらに、等容量のフェノ−ル／クロ
ロホルム／イソアミルアルコ−ル（25:24:1）で２回、
クロロホルム／イソアミルアルコ−ル（24:1）で２回抽
出し、次いでエタノ−ルで沈澱させた。ポリA⁺−RNA
を、オリゴ（dT）−セルロ−スクロマトグラフィ−（Ma
niatisら，上記文献参照）によって単離した。約100μ
ｇのポリA⁺−RNAを、５×10⁸個の接合子嚢から単離し
た。

B.cDNA合成 酸素MMLV逆転写酵素によりポリA⁺−RNAをcDNAに変換
した。このために、25μｇのポリA⁺−RNAを90μの水
に溶解し、水酸化メチル水銀10mmol/を加え、その後
β−メルカプトエタノ−ル45mmol/を加えて、20℃で
５分間変性させ、その混合物を20℃で３分間インキュベ
−トした。４μｇのオリゴ（dT）₁₅、150UのRNAsi
n^(R)、20mmol/のトリス（pH7.6）、30mmol/のKCl、
4mmol/のジチオスレイト−ル（DTT）、2mmol/のMgC
l₂、1mmol/の各dNTP及び3000UのMMLV逆転写酵素を含
有する緩衝液190μ中で酵素反応を実施した。反応
は、37℃で１時間インキュベ−トした後に、0.5mol/
のEDTA10μを加えることにより停止させた。等容量の
フェノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコ−ル（2
5:24:1）で抽出後、RNA/DNAハイブリッドを、酢酸アン
モニウム2mol/と2.5容のエタノ−ルを加えて沈澱させ
た。

酵素DNA−ポリメラ−ゼＩとRNase Ｈとの組み合わせ
作用により、第二らせんの合成が起る。ペレットを、20
mmol/トリス（pH7.6）、5mmol/ MgCl₂、100mmol/
（NH₄）₂SO₄、0.6mmol/ β−NAD、16U RNase Ｈ、
200U DNA−ポリメラ−ゼＩおよび20U DNA−リガ−ゼ
（E.coli）を含む緩衝液960μ中に溶解した。インキ
ュベ−ション時間は、12℃で１時間、次いで22℃で１時
間であった。その後、等容量のフェノ−ル／クロロホル
ム／イソアミルアルコ−ル（25:24:1）を加えて反応を
停止させ、エタノ−ルで沈澱させた。

この目的に適合したベクタ−中でcDNAをクロ−ン化す
る前に、それを先ず修飾した。cDNA（５μｇ）を、30mm
ol/酢酸ナトリウム（pH5.6）、50mmol/ NaCl、1mmo
l/ ZnSO₄、及び21UのMung Beanヌクレア−ゼを含有す
る緩衝液100μに中溶解した。37℃で30分間インキュ
ベ−トした後、EDTA10mmol/及びトリス25mmol/を加
えて反応を停止させた。フェノ−ル／クロロホルム／イ
ソアミルアルコ−ル（25:24:1）で抽出した後、混合液
をSephadex G50カラムに掛けて脱塩した。

溶出物（125μ）に以下のものを加えた：トリスpH
7.6 50mmol/、EDTA 2.5mmol/、DTT 5mmol、Ｓ′−
アデノシル−メチオニン0.5μＭ、及び100UのEcoR I−
メチラ−ゼ。37℃で30分間インキュベ−トした後、65℃
で15分間加熱することにより反応を停止させ、その後、
トリス−HCl 100mmol/、MgCl₂ 100mmol/、及びNaCl
500mmol/（pH7.5）を含む溶液1/10容を加え、同時に
各dNTP 1mmol/及び12.5UのKlenow DNAポリメラ−ゼを
加えた。22℃で60分間インキュベ−トした後に、等容量
のフェノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコ−ル
（25:24:1）を加えて反応を停止させた。350μのH₂O
と50μの3mol/酢酸ナトリウム（pH5.6）を加えた
後、500μのイソプロパノ−ルを用いて水相中に存在
する核酸を沈澱させた。100μのH₂Oに溶解した後、ペ
レットをSephadex G50で脱塩し、溶出物をエタノ−ルで
沈澱させた。

ペレットを24μの水に溶解した後、２μｇのEcoR I
リンカ−、トリス−HCl（pH8.0）30mmol/、MgCl₂ 10m
mol/、ジチオスレイト−ル10mmol/、ATP 1mmol/
、ゼラチン0.1mg/ml及び10UのT4 DNA−リガ−ゼを加
えることにより、連結を50μ中で実施した。４℃で16
時間インキュベ−ションした後、加熱（70℃で15分）し
て反応を停止させ、その後、制限エンドヌクレア−ゼEc
oR Iを用いて、100mmol/トリス−HCl（pH7.6）、50mm
ol/ NaCl、10mmol/ MgCl₂、2.5mmol/ DTT及び500
U EcoR Iを含有する緩衝液210μ中で切断を実施し
た。37℃で90分間インキュベ−トした後、等容量のフェ
ノ−ル／クロロホルム／イソアミルアルコ−ル（25:24:
1）を用いて抽出することにより、反応を停止させた。
水相中に存在する核酸を、酢酸ナトリウム（pH5.6）300
mmol/を加えた後に2.5容積のエタノ−ルで沈澱させ、
Biogel A15mカラムを用いてcDNA及びリンカ−を分離し
た。cDNAをエタノ−ルで沈澱した後、その沈澱物をトリ
ス−HCl 10mmol/、EDTA 0.1mmol/（pH7.6）に溶解
した。次いでcDNA分子をファ−ジλgt11並びにファ−ジ
λgt10中に、Huynhら（DNA cloning techniques:A Prac
tical Approach,1984）に従ってクロ−ン化した。

C.MoAb E.TEN.11P−２によるλgt11cDNAライブラリ−の
スクリ−ニング λgt11cDNAクロ−ンで感染させたE.coli Y1090^-によ
り産生された蛋白質を、上記（Huynhら、上記文献参
照）と同様にニトロセルロ−スフィルタ−上に固定化し
た。cDNAライブラリ−をMoAb E.TEN.11P−２で免疫スク
リ−ニングし、その結果、２×10⁵個のファ−ジクロ−
ン中に約１個の陽性反応が起きた。モノクロ−ナル抗体
を、プロティンA Sepharose 上で精製し、１容のトリ
ス緩衝液（10mmol/トリス−HCl;150mmol/ NaCl;pH
8.0）＋0.05％Tween20及び10％ FCSで希釈した。

25℃で２時間、前記フィルタ−と一緒にインキュベ−
ションした。フィルタ−を50mlの上記トリス緩衝液＋0.
05％Tween20で10分間、４回洗浄した。ヤギ抗マウス抗
体及びアルカリ性ホスファタ−ゼの結合体（上記トリス
緩衝液＋0.05％Tween20及び10％FCSで1:7500に希釈）を
用いて二次抗体を37℃で30分間インキュベ−ションし、
その後、フィルタ−を一次抗体のインキュベ−ションに
関する上記記載と同様に洗浄した。

100mmol/トリス−HCl;100mmol/ NaCl;10mmol/
MgCl₂;pH9.6に0.33g/ニトロブル−テトラゾリウム及
び0.17g/ 5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
ホスフェ−トを含有させた溶液中で、室温で30分間イン
キュベ−トした後、結合されたアルカリ性ホスファタ−
ゼを検出した。

イムノアッセイで陽性を示す１つのクロ−ンは精製さ
れたブラ−クであって、このクロ−ンをクロ−ンEt100
として示した（第７図参照）。

実施例６ E.tenellaのゲノムライブラリ−の作製及び免疫学的ス
クリ−ニング A.方法 E.coli株 E.coli Y1088（supE supF strA metB trpR hsdR hsdM
−ton A21ΔlacU169（proC:Tn5）（pMC9））、Y1089
（ΔlacL169 proA⁺Δlon araD139 strA hfla150（chr:T
n10）（pMC9））及びY1090（ΔlacU160 proA⁺Δlon ara
D139 strA supF（trpC22:Tn10）（pMC9））は、America
n Type Culture Collectionから得られたものである。

DNAの単離 E.tenella染色体DNA、ニワトリDNA、及びE.coliDNAの
単離は、Clarkeら（Mol.Biochem.Parasitol.,22:79〜8
7;1987）の報告と同様に実施した。

ゲノムライブラリ−の構築 E.tenella DNAをEcoR I（Bethesda Research Laborat
ories）で一部消化し、これにEcoR Iで消化された、仔
ウシ腸ホスファタ−ゼ（Boehringer Mannheim）処理さ
れたλamp3をT4DNAリガ−ゼ（Boehringer Mannheim）を
用いて、４℃で16時間、連結した。１μｇのDNAに対す
る最終連結容量は10μであり、ベクタ−：挿入比は4:
1であった。λamp3は、kempら（P.N.A.S.USA 80:3787;1
983）に従って、λgt11から発生させた。ファ−ジをin
vitroで包装し（Maniatisら、Cold Spring Harbor Labo
ratory“Molecular Cloning:A Laboratory Manual";198
2）、E.coli Y1088株と一緒にインキュベ−トして、Ｘ
−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド）及びIPTG（イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（Bachem）の存在中
にプレ−ティングした。このライブラリ−を増幅し（Ma
niatisら、上記文献参照）、スクリ−ニング前に力価を
測定した。

ゲノムライブラリ−の免疫学的スクリ−ニング及び抗血
清の調製 Clarkeら（上記文献参照）の記載に従って実施した。

B.結果 組み換えバクテリオファ−ジEtHL6は、E.tenella DNA
の722 bp EcoR I制限断片を含有する。これも第７図を
参照されたい。

EtHL6によって生じるプラ−クは、最初は、免疫ニワ
トリ血清によるゲノムDNAライブラリ−のスクリ−ニン
グ後に抗体陽性として確認された。

実施例７ EtHL6融合蛋白質の特徴 A.方法 抗体のアフィニティ選択 EtHL6ストックからのバクテリオファ−ジ（１×10⁴）
を9cmの皿の中のE.coli Y1090株上にプレ−ティング
し、42℃で３時間インキュベ−トした。前記と同様に予
めIPTGで処理したフィルタ−の各サイドを、プレ−ト表
面と接触させて37℃で２時間放置した。フィルタ−を、
免疫ニワトリ血清（E.coliを予め吸着し、１％BSAを含
むPBS pH7.0中で1:20に希釈）と一緒に室温で１時間イ
ンキュベ−トした。洗浄後、結合した抗体を0.2mol/
グリシン（pH2.8）5mlで10分間溶出し、次いで2mol/
トリス（80μ）;10×PBS（500μ）;2mg/mlクロラム
フェニコ−ル（50μ）及び0.25gのBSAを含む溶液650
μで中和した。選択された抗体を用いて、それ以上希
釈せずに、スポロゾイト及びメロゾイト蛋白質のWester
nブロットを精査（probe）した。

融合蛋白質 E.coli Y1089株を実施例6B記載のファ−ジで溶原化
し、溶解物を1mlの対数増殖期培養物（Coppelら,Nature
306:751〜756;1983）から調製した。

ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE） 洗浄済みスポロゾイトペレット又は可溶化ファ−ジ溶
解物を、２％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム;6mol/
尿素;5％（v/v）２−メルカプトエタノ−ル;0.49mol/
トリス−HCl;pH6.7中に溶解して、５分間沸騰させる。
マイクロ遠心機中で５分間回転させた後、0.1％（w/v）
ブロモフェノ−ルブル−を含有する50％（v/v）グリセ
ロ−ルを上清に加える。ゲルは不連続で、3.6％（w/v）
アクリルアミドスペ−サ−ゲル,pH6.7と６〜14％（w/
v）アクリルアミド勾配分離ゲル,pH8.9（16×0.1cm）か
らなる。50〜70V（定電圧）で16時間、電気泳動を実施
し、蛋白質バンドを、35％（v/v）メタノ−ル,10％（v/
v）酢酸に溶解した0.2％（w/v）PAGEブル−83（BDH ch
emicals）で染色した。

ポリペプチドのイムノ−ブロッティング SDS−PAGE後、スラブゲルを25mmol/トリス;192mmol
/グリシン;pH8.3;20％（v/v）メタノ−ル（移動用緩
衝液）500ml中で30分間平衡化した。ゲル中のポリペプ
チドを電気泳動的に、Transblot移動セル（Bio−Rad L
aboratories）内のニトロセルロ−ス紙に移動させた（T
owbinら、PNAS 76:4359〜4354;1979）（Schleicher＆Sc
hull,BA85,0.45μｍ）。30Vの定電圧で、４℃で16〜22
時間、移動用緩衝液を用いて、電気泳動を実施した。移
動させた後、スポロゾイトサンプルを含むニトロセルロ
−ス紙を、３％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA;Sigma
A4503）を含むPBS pH7.0中でブロックした。移動させ
たマ−カ−蛋白質を含むニトロセルロ−ス断片をIndian
インキで染色した。

ブロットを、室温で１時間、免疫又は正常ニワトリ血
清（１％（w/v）BSA;PBS;pH7.0;0.05％（v/v）Tween20
中で1:200に希釈）と反応させた。ブロットを、PBS;pH
7.0;0.05％Tween20中で各５分ずつ、計５回洗浄し、そ
の後アフィニティ−精製したウサギ抗ニワトリIgG（Ｈ
＋Ｌ）−ペルオキシダ−ゼ結合体（Zymed Laboratories
Inc.1％（w/v）BSA;PBS;pH7.0;0.05％Tween20中で1:20
0に希釈）を用いて、室温で１時間インキュベ−トし
た。次いでブロットを上記と同様にさらに５回洗浄し
た。ペルオキシダ−ゼ結合体の結合を、0.5mg/mlジアミ
ノ−ベンジジン;50mmol/トリス−HCl pH7.4;200mmol/
NaCl及び0.03％（v/v）H₂O₂中で前記ニトロセルロ−
スと反応させることにより検出した。反応は、ブロット
をPBS pH7.0,0.05％Tween20中でブロットを洗浄するこ
とにより停止させた。

B.結果 EtHL6により産生されたβ−ガラクトシダ−ゼ融合蛋
白質のSDS−PAGE及びWesternブロット分析により、該蛋
白質と免疫血清との、並びにマウス抗β−ガラクトシダ
−ゼ血清との反応が確かめられた。Eimeria DNAにより
コ−ドされるポリペプチドの大きさは、35.5kD（２つの
読み値の平均。デ−タは示されていない）と推定され
る。

EtHL6抗原に対応する天然蛋白質を、EtHL6融合蛋白質
を含有するポリアクリルアミドゲルスライスの注射によ
りマウス又はウサギに生じた抗体、あるいは免疫ニワト
リ血清からアフィニティ精製された抗体を用いて同定し
た。これらの抗体は、E.tenellaのスポロゾイト及び第
二世代メロゾイトの両方から単離される蛋白質のWester
nブロット上の110.0＋1.0kD（平均±S.E.M.,n＝12）の
ポリペプチドダブレットと強く反応した（第４図，一重
矢印）。94.0±1.0kD（ｎ＝５）の第三世代スポロゾイ
トポリペプチドが第４図で明らかに認められる（二重矢
印）。同様のポリペプチドはメロゾイトで確認されてい
る。

EtHL6融合蛋白質に対するマウス抗血清はまた、E.max
ima及びE.acervulinaスポロゾイト蛋白質のWesternブロ
ット上の小グル−プのポリペプチドとも反応した（第５
図）。そのポリペプチドの分子量は、E.tenella蛋白質
のWesternブロット上で反応するものと同様であり、E.m
aximaに関しては108〜92kD、E.acervulinaに関しては10
2〜94kDの範囲であった。

実施例 ８ EtHL6関連DNA配列の特徴 A.方法 DNAの分析 ファ−ジストックを調製し、プレ−ト溶解物からDNA
を抽出した。標準技術を用いて、プラスミド及びコスミ
ドDNAを精製した（Maniatisら、上記文献参照）。50μg
/mlのRNase存在下で制限エンドヌクリア−ゼを用いて消
化した後、40mmol/トリス−HCl,20mmol/酢酸ナトリ
ウム,0.1mmol/ EDTA（pH8.3）（TAE緩衝液）中アガロ
−スゲル上でDNAを分画した。

DNAハイブリダイゼ−ション ゲノム，ファ−ジ，コスミド及びプラスミドDNAの制
限消化物を１％アガロ−スゲル上で分画し、Southern法
（J.Mol.Biol.98;503〜517;1975）を用いて,25mmol/
リン酸緩衝液pH6.5中Genescreen（New England Nuclea
r）に移動させた。メ−カ−の説明書（Amersham）に従
ってニックトランスレ−ションキットで³²P−標識化し
たDNAプロ−ブとのハイブリダイゼ−ションを、１×Den
hardt溶液、0.1％（w/v）SDS,及び４×クエン酸ナトリ
ウム塩水（SSC）中で37℃で16時間行った。Grunsteinと
Hogness（P.N.A.S.USA 72:3961〜3965;1975）の手法に
より、コロニ−ハイブリダイゼ−ションを実施した。

クロ−ンEtHL6からのDNA挿入物を、40mmol/トリス
−HCl;20mmol/酢酸ナトリウム;0.1mmol/EDTA;pH8.3
中の１％アガロ−スゲルからの電気溶出（Maniatisら、
上記文献参照）によって精製した。Dupontの増感板及び
FujiのRX X線フィルムを用いて、−70℃でオ−トラジオ
グラフィ−を実施した。

E.tenellaゲノムDNAのコスミドライブラリ−の構築及び
スクリ−ニング E.tenellaゲノムDNAをMbo Iで部分的に消化し、BamH
I消化コスミドPHC79と連結し、Maniatisら（上記文献参
照）に従って包装した。非増幅ライブラリ−から約500
クロ−ンを、ニックトランスレ−ション及び精製された
EtHL6挿入物を用いて精査することによりスクリ−ニン
グした。コスミドクロ−ン7.46（挿入物はEtg100として
示される−第７図参照）を多数の異なる制限エンドヌク
レア−ゼで消化し、その断片をアガロ−スゲル上で分離
し、ニトロセルロ−ス上にSouthernブロットし、再び精
査して、EtHL6に関連する配列を含有する制限断片を同
定した。

λgt10中のE.tenella cDNAライブラリ−のスクリ−ニン
グ λgt10中の胞子形成されたE.tenella接合子嚢mRNAのc
DNAクロ−ンを、上記のニックトランスレ−ション及び
精製されたEtHL6挿入物を用いて精査することによりス
クリ−ニングした。21個の陽性ファ−ジが見出された。
これらのうちの１個（cDNA10−挿入物はEtc100として示
される−第７図参照）をさらに研究するために選択し
た。

クロ−ンの配列決定 EtHL6及びEtHL6関連クロ−ンからの挿入物（コスミド
Etg100及びEtc100）を、配列決定前にM13mp,pUC13又はp
AT153由来のベクタ−にサブクロ−ン化した。配列決定
反応は、ジデオキシ法によって実施した（Bankier ＆ B
arrell,Techniques in the Life Sciences（（Biochemi
stry）85:Techniques in Nucl.Acids Bioch.1〜34;198
3）。

B.結果 EtHL6から得られたDNAの物理的マッピングにより、Ec
oR I挿入物のサイズは約700bpであって、それは単一のH
ind III部位を含むことが示された。ヌクレオチド配列
分析からは、挿入物の正確なサイズは722bpであること
が確定され、さらに挿入物の一方の末端付近にHind III
部位が存在することが確証された。読み枠は、λamp 3
ベクター内のEcoR Iクロ−ニング部位の既知の読み枠を
参照して確定したが、これにより、融合蛋白質の産生が
起こる。同定された唯一大きな読みとり枠（ORF）は、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子に関して挿入物の遠位部分
にHind III部位を置く配向（orientation）にあった。

EtHL6バクテリオファ−ジDNAの制限マッピングから、
これが実際に活性配向であることが確証された。

EtHL6断片は遺伝子全体を含有しないため、部分的に
消化されたE.tenellaゲノムDNAのコスミドライブラリ−
をスクリ−ニングし、組み換えコスミド7.46を単離し
た。このコスミドの種々の制限酵素消化物のSouthernブ
ロッティングにより、プロ−ブとハイブリダイズする約
3kbと1.3kbの２つのHind III断片が明らかになった。さ
らに1.7kb Hind III断片が確認されたが、これは1.3kb
Hind III断片に対して３′側にある。3kbHind III（H
3）,1.3kb Hind III（H3A）,1.35kb EcoR I（E5）及び
1.7kb Hind III（C4）断片をpUC13にサブクロ−ニング
し、それらのヌクレオチド配列を決定して、2359〜3080
の位置から伸びるEtHL6断片を伴う5,990bpの連続するゲ
ノム配列を得た。このヌクレオチド配列を第６図に示
す。

ゲノムの配列決定に加えて、λgt10ライブラリ−から
の１個のcDNAクロ−ン、即ちEtHL6挿入物に対するハイ
ブリダイゼ−ションにより確認されたcDNA10の配列を決
定した。その挿入物は3,402bpの長さであり、ゲノム配
列上の688位置で開始し、且つ4,993位置で終わり、ゲノ
ム配列内で確認された３つの介在非コ−ド領域（イント
ロン）を伴なっていた。このcDNAクロ−ンから得られた
配列デ−タは、第６図で示されるゲノム配列に合致す
る。Etc100の３′末端でＡ（17）のさらに別の配列が認
められるが、これはEtc100のポリＡ尾部を表わす。

EtHL6関連配列の整列（Aligning） 第７図はEtHL6、Etg100,Etc100及びEt100の一次配列
（alignments）を示す。

Etc100の末端の位置を、予測されるアミノ酸配列及び
ゲノムイントロンとともに第６図に示す。Etc100がその
全長をコ−ドしているとは思えない。５′末端には、ヌ
クレオチド９〜11に単一の終止コドン（TAG,第６図のゲ
ノム配列のヌクレオチド696〜698）があって、その直後
に、同一読み枠内で、予測されるコ−ド配列が続く。こ
のコ−ド配列は、ヌクレオチド78〜80にその最初の有力
な開始コドン（ATG,第６図のゲノム配列のヌクレオチド
765〜767）を有し、ヌクレオチド2213（第６図のゲノム
配列のヌクレオチド3804）まで途切れずに続くが、ここ
ではさらに、枠内終止コドン（TAA）が後に続く。この
後には、1,189bpの見掛けの非コ−ド配列が続き、３′
末端に連なる。

この読みとり枠（ORF）によって予測されるポリペプ
チドは長さが712個のアミノ酸からなり、その分子量は7
4.8kDであると算定される。予測されるアミノ酸配列
を、その配列組成とともに第８図に示す。この配列を、
HoppとWoods（上記文献参照）並びにChouとFassman（上
記文献参照）の計算法を用いて、可能な抗体を結合する
エピト−プに関して分析し、その結果、以下のエピト−
プ領域を得た:270〜300及び495〜525。

実施例 ９ Et100を発現する鶏痘ウイルス組換え体の構築 Ａ）プラスミドの構築 ３′末端の362ヌクレオチドを除く全てのEtc100を含
有する１μｇのプラスミドp1019を制限酵素BamH I及びH
ind IIIで切断した。

Etc100BamH I/Hind III断片は、５′非コ−ド配列の
上流のpuC13ポリリンカ−のBamH I〜EcoR I部分、並び
に３′非コ−ド領域内のHind III部位での予測される読
みとり枠（ORF）及び末端（第6c図の4309〜4314位置）
を含有する。制限消化物を、10単位のT4−DNAポリメラ
−ゼ及び10単位のE.coliDNAポリメラ−ゼ（大きな断
片）で末端修復し、次いで鶏痘ウイルス組換えプラスミ
ド内の平滑末端化された挿入部位にクロ−ニングした。
Etc100挿入物を保有するプラスミドを含む細菌コロニ−
を、³²Pで標識したEtc100を用いて精査することにより
確認し、挿入物の配向をミニプリ−プDNA（miniprepped
DNA）の制限消化によって確定した。鶏痘ウイルス内で
の発現に関して正しい配向の挿入物を含有するプラスミ
ドを確認した。Etc100で予測された読みとり枠（ORF）
内の領域（第6a図のヌクレオチド788〜802）に相補的で
あるオリゴヌクレオチドをプライマ−として用いて、プ
ラスミドDNAから誘導された鶏痘ウイルス組換えプラス
ミドとEtc100配列との結合部分を配列決定した。この配
列決定から、Etc100 BamH I/Hind III断片は該ベクタ−
の鶏痘ウイルス転写プロモ−タ−に隣接し、また正しく
配向していることが確証された。

Ｂ）鶏痘ウイルス中への組換え体 標準リン酸カルシウム法を用いて、鶏痘ウイルスFP9
株に感染したヒヨコ胚線維芽細胞（CEF）にプラスミド
をトランスフェクトした。組換えウイルスを単離し、プ
ラ−クを３回精製した。鶏痘ウイルスE10と呼ばれる１
種の組換えウイルスを、さらに研究するために使用し
た。E10の親ストックは、25cm²フラスコに単一プラ−ク
から得られたウイルスを接種し、その結果生じたウイル
スをアリコ−トとして−20℃で保存することによって得
た。準親ストック（sub−master stocks）は、20個の12
5cm²フラスコのバッチに親ストックの細胞当たり0.1プ
ラ−ク形成単位（p.f.u.）を接種することにより得た。
ストックは全て、標準技術を用いて、CEF上でプラ−キ
ングして力価測定した。

Ｃ）鶏痘ウイルスE10によるEt100の発現 25cm²又は125cm²フラスコ中のCEFの部分融合単層（su
b−confluent monolayers）を、１細胞当たり0.1p.f.u.
で鶏痘ウイルスE10に感染させた。感染細胞をリン酸緩
衝塩水pH7.0中て破砕することにより、感染後の種々の
時間に採取し、等量の２×Laemmli緩衝液を加えて溶解
した。溶解物（約10⁶個の感染細胞相当物）を５分間沸
騰させ、次いで10％ポリアクリルアミドゲル上に載せ、
100Vで一晩電気泳動を実施した。親鶏痘ウイルス（pare
ntal fowlpoxvirus）に感染した細胞からの同等の溶解
物を並列させて印加、移動させた。標準技術を用いてゲ
ルをニトロセルロース上にエレクトロブロッティング
し、ニトロセルロ−ス膜をEimeria tenellaに対する抗
血清を用いて精査した。E10からの溶解物において、約1
00kDのサイズのポリペプチドはウサギ抗スポロゾイト及
びニワトリ回復期抗血清によって認識された。このポリ
ペプチドは、親鶏痘ウイルスに感染した細胞から得られ
る溶解物中には存在しなかった。0.1p.f.u.の多重感染
を用いて、感染後２日目に100kDのポリペプチドを検出
したが、これは、ウイルスの細胞変性効果により該単層
が完全に破壊される７日目まで存続した。そのペプチド
は、還元及び非還元ゲルの両方で検出された。

Ｄ）鶏痘ウイルスE10を発現するEt100によるワクチン接
種 １） ３週令のニワトリ（Light Sussex）の各群に、50
0μの199組織培地中で作製した３×10⁷p.f.u.の親鶏
痘ウイルス（Ｉ群）又は組換え鶏痘ウイルスE10（II
群）を静脈内に接種した。三番目の群には199培地のみ
を接種した（III群）。ニワトリは全て５週令目に２回
目の同一注射を受け、そのブ−スタ−後10日目に採血さ
れた。鶏痘ウイルス、並びにEimeria tenellaの粉砕さ
れた胞子形成接合子嚢に対するELISA力価を測定した。
両ウイルス接種群のニワトリの90％以上が鶏痘ウイルス
に対する抗体を有しており、これを力価測定すると1/6
4,000（1in64,000）を上回ったが、一方対照群において
は、力価は無視してもよい値であった。Eimeria tenell
aに対する力価は、有意には上昇しなかったが、1/1000
希釈液では、光学密度の読み値がE10群でわずかに上昇
した（例えば以下を参照）。 抗血清の1/1000希釈液でのELISA読み値 群 抗−FPV（平均） 抗E.t（平均） Ｉ 0.844 0.126 II 0.855 0.161 III 0.016 0.070 各群10羽のニワトリから得られた抗血清をプ−ルし、
これを用いて、Eimeria tenellaのスポロゾイト又は第
二世代メロゾイトから電気泳動によって分離された蛋白
質のWesternブロットを精査した。

1/1000の血清希釈液では、組換えE10を接種されたニ
ワトリから得られたプ−ルされた抗血清はスポロゾイト
とメロゾイトの両方に関してEt100ポリペプチドを認識
したが、一方他の群から得られた血清は該ポリペプチド
を認識しなかった。

２） １週令のニワトリの各群に、50μの199組織培
地中で作製された親又は組換え鶏痘ウイルスE10を３×1
0⁶p.f.u.用いて、翼を乱切して、接種した。第三群のニ
ワトリには、199培地のみを接種した。４週令目の全ニ
ワトリには２回目の接種を施したが、この時にも50μ
の199培地中の３×10⁷p.f.u.の適切なウイルスを接種し
た。４週間目以降、１週間おきに全ニワトリを採血し、
その血清を用いて、Eimeria tenellaのスポロゾイト及
び第二世代メロゾイトから電気泳動により分離した蛋白
質のWesternブロットを精査した。

４週目には反応性は認められなかったが、１週間後ま
でには（２回目接種の１週間後）、E10接種のニワトリ
は特異的に、スポロゾイト及びメロゾイトからのEt100
を識別した。

【図面の簡単な説明】

第１図：モノクロ−ナル抗体でプロ−ブされたE.tenell
aのスポロゾイト及び第二世代メロゾイトのWesternブロ
ットを示す粒子構造の写真。 A.E.TEN.10Y−２（レ−ン１）,E.TEN.11P−２（レ−ン
２）でプロ−ブされたスポロゾイトブロット B.E.TEN.10Y−２（レ−ン１）,E.TEN.11P−２（レ−ン
２）でプロ−ブされたメロゾイトブロット 第２図：異なるスポロゴニ−段階におけるEtp100（矢
印）の発現。ニワトリの高度免疫血清でプロ−ブされ
た、異なる段階のSDS−PAGE分離物質のWesternブロッ
ト。 レ−ン1:胞子形成された接合子嚢 レ−ン2:スポロシスト レ−ン3:スポロゾイト 第3A図及び第3B図:E.TEN.11P−２又はE.TEN.10Y−２モ
ノクロ−ナル抗体の使用による、E.tenellaスポロシス
トからのEtp100（矢印）イムノアフイニティ精製を示す
粒子構造の写真。 A.グリシン/HCl（pH2.6）の銀染色SDS−PAGE −溶出画分及び出発物質 レ−ン1:E.TEN.10Y−２カラムから溶出 レ−ン2:E.TEN.11P−２カラムから溶出 レ−ン3:出発物質 B.出発物質及びpH 2.6のWesternブロット −ポリクロ−ナルウサギ抗スポロゾイト血清でプロ−ブ
された溶出画分 レ−ン1:出発物質 レ−ン2:E.TEN.11P−２カラムから溶出 レ−ン3:E.TEN.10Y−２カラムから溶出 第４図:EtHL6抗原に対応する天然蛋白質の確認を示す粒
子構造の写真。 ＜パネルＡ＞ 組換えバクテリオファ−ジEtHL6（レ−ン１及び５），
並びにλamp3（陰性対照；レ−ン２及び６），免疫ニワ
トリ血清（レ−ン３及び７），並びに正常ニワトリ血清
（レ−ン４及び８）によって形成されたプラ−クから得
られた蛋白質で選択された抗体を用いて、E.tenellaの
スポロゾイト（Spz）及びメロゾイト（Mz）蛋白質から
の還元蛋白質のWesternブロットを精査した。 ＜パネルＢ＞ EtHL6融合蛋白質に対する抗血清。マウス抗EtHL6融合蛋
白質（レ−ン１及び７），ウサギ抗EtHL6融合蛋白質
（レ−ン２及び８）,EtHL6融合蛋白質と同一のSDS−PAG
Eゲル上の領域内を移動するλamp3リゾゲンによって産
生される蛋白質に対する抗血清（陰性対照；レ−ン３及
び９），正常ウサギ血清（レ−ン４及び10），免疫ニワ
トリ血清（レ−ン５），正常ニワトリ血清（レ−ン６）
並びにE.tenellaのスポロゾイトに対するウサギ抗血清
（レ−ン11）を用いて、E.tenellaのスポロゾイト（Sp
z）及び／又はメロゾイト（Mz）蛋白質からの還元蛋白
質のWesternブロットを精査した。 一重矢印は、110及び102kDのポリペプチドダブレットの
位置を示す；三番目の94kDのポリペプチドの位置は、二
重矢印で示す（詳細は本文参照）。分子量マ−カ−は、
ミオシン,200kD;ホスフォリラ−ゼ,92kD;ウシ血清アル
ブミン,67kD;オボアルブミン,45kD;カルボニックアンヒ
ドラ−ゼ,28kD;及びミオグロビン,19kDであった。 第５図:EtHL6抗原に対応する、異なる種からの天然ポリ
ペプチドの検出を示す粒子構造の写真。 EtHL6融合蛋白質に対するマウス抗血清（レ−ン1,3及び
５），並びにEtHL6融合蛋白質と同一のSDS−PAGEゲル上
の領域内を移動するλamp3リゾゲンによって産生された
蛋白質に対するマウス抗血清（陰性対照，レ−ン2,4及
び６）を、E.tenella（レ−ン１及び２）,E.maxima（レ
−ン３及び４）並びにE.acervulina（レ−ン５及び６）
の各スポロゾイトからの還元蛋白質のWesternブロット
と反応させた。分子量マ−カ−の位置も示される。 第６図:E.tenellaゲノムDNA（Etg100）のヌクレオチド
配列が、ヌクレオチド１から5990まで伸びている。EtHL
6からのゲノム挿入物は、ヌクレオチド2359〜3080に対
応する。示される翻訳されたアミノ酸配列は、Etc100か
ら予測されるものである。３つのゲノムイントロンを破
線領域で示してある。またEtc100の５′末端及び３′末
端は黒矩形で示す。 第７図:EtHL6及びEtHL6関連ゲノム配列並びにcDNA配列
の配列図。５′及び３′末端を黒矩形で示す。３つのゲ
ノムイントロンを破線で示す。 第８図:Etp100の予測されるアミノ酸配列及びその含量
の統計的分析。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロレーヌ・エリザベス・クラーク イギリス国、オツクスフオード・オー・ エツクス・２・９・キユウ・テイー、カ ムノアー、ロブサート・プレイス、９ (72)発明者 フアイオナ・マーガレツト・トムレイ イギリス国、ケンブリツジシヤー・シ ー・ビー・２・１・エル・アール、ケン ブリツジ、ベイトマン・ストリート・56 (56)参考文献 特開 平３−7594（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−72827（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−67499（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−18724（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/455 C12N 1/21 C12N 15/00 C12P 21/02 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】図８に示すアミノ酸配列を有することを特
   徴とする、アイメリアテネラの免疫特性を有するポリペ
   プチド、あるいはアイメリア種の免疫特性を有する該ポ
   リペプチドのフラグメントであって、図８のアミノ酸配
   列406から712位の範囲内のみに属するものを除くフラグ
   メント。
2. 【請求項２】請求項１に記載のポリペプチド又はポリペ
   プチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】図６に示すヌクレオチド配列あるいはその
   部分配列を有する請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】図６に示すヌクレオチド配列を有する請求
   項２に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】請求項２から４に記載のポリヌクレオチド
   配列の発現を可能にする調節配列に基いて、位置を定め
   られた前記ポリヌクレオチド配列を有する組換えベクタ
   ー。
6. 【請求項６】請求項５に記載のベクターにより形質転換
   された宿主生物。
7. 【請求項７】アイメリア種の抗原特性を有するポリペプ
   チド若しくはタンパク質あるいはそれらのフラグメント
   の製造方法であって、請求項６に記載の宿主生物を培養
   することを含む方法。
8. 【請求項８】請求項１に記載のポリペプチド又はフラグ
   メントに対して免疫反応性を有する抗体あるいは抗血清
   であって、図８に示されるアミノ酸配列406から712位の
   範囲内に存在するエピトープに対して反応性を有するも
   のを除く抗体あるいは抗血清。
9. 【請求項９】本質的に、 （ａ）請求項８に記載の抗血清を含むカラム支持体に対
   して、アイメリア種の抽出物を免疫吸着し、 （ｂ）抽出物の吸着画分を非吸着画分から分離し、 （ｃ）カラム支持体から吸着画分を脱離させること、 から成る請求項１に記載のポリペプチド又はフラグメン
   トの単離方法。
10. 【請求項１０】カラム支持体が、寄託番号89020202でEC
    ACCに寄託されているEt11P−２モノクローナル抗体を含
    むことを特徴とする請求項９に記載の方法。