JP3036545B2

JP3036545B2 - モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法

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Publication number: JP3036545B2
Application number: JP2249037A
Authority: JP
Inventors: 晃弘新崎; まゆみ林; 直生鈴木; 中島　　宏
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1990-09-19
Filing date: 1990-09-19
Publication date: 2000-04-24
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: JPH04131092A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は、モノクローナル抗体とこれを産生するハ
イブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定
法に関するものである。

さらに詳しくは、この発明は、ジアデノシンテトラホ
スフェート（Ap₄A）のモノクローナル抗体と、このモノ
クローナル抗体を特異的に産生するハイブリドーマ細胞
株、および医療分野、とくに心臓血管系の疾病等の診断
および治療に有用なこのモノクローナル抗体を用いる生
体液中のAp₄Aの免疫学的測定法に関するものである。

（従来の技術）生体中のジアデノシンテトラホスフェート（Ap₄A）
は、主として活性化された血小板から放出され血中に出
現し、血小板凝集阻害作用（M.J.Harrison他、FEBS Let
ters、54、57、1975）、肥満細胞からのヒスタミン放出
促進作用（B.S.Gomperts,Secretory Process Butterwor
ths,London.18−37,1984）、血管収縮作用（R.Busse
他、Am.J.Phyiol,254H828−H832、1988）等の生理作用
を有している。

従来より、生体液中のこのAp₄Aの定量法としては２つ
の方法が知られている。１つは、高速液体クロマトグラ
フィー（HPLC）を用い、Ap₄Aを含む検体を逆相カラムで
分離し、260nmにおける吸光度を測定することにより検
体中のAp₄A含有量を定量するというものである（前記R.
Busse他に記載）。

もう１つは、酵素法と呼ばれるものであり、Ap₄Aを酵
素（ホスホジエステラーゼ）によりアデノシンモノホス
フェートとアデノシントリホスフェート（ATP）に分割
し、それをATPが必須であり、かつその量に応じて活性
が変化するルシフェラーゼを用いて発光させることによ
りAp₄Aを定量するというものである。（B.K.Kim他、Blo
od 66,735−737,1985）。

（発明が解決しようとする課題）しかしながら、これら従来の測定法においては、たと
えばHPLCを用いる方法の場合、カラムが生体成分により
著しく劣化するのを避けるため予め検体を穴径0.45μｍ
以下のフィルターで処理するという繁雑な操作を必須と
する。さらにこの方法の場合、HPLCのハード面の問題と
して、安定したベースライン値を得ることが困難であ
り、またわずかな温度変化や溶媒変化等によりAp₄Aの溶
出時間が不均等になるなどの欠点を有してもいる。

またホスホジエステラーゼとルシフェラーゼを用いる
酵素法の場合も、最終的にはATPをルシフェラーゼで測
定するため、生体成分中に混在するATPを予めホスホモ
ノエステラーゼを用いて消去する必要があり、さらにこ
のホスホモノエステラーゼを、次のステップで生成され
るATPを消去させないために熱処理（90℃、５分間）に
よって失活させるという繁雑な操作を必要とするという
問題点を有している。

このように、従来のAp₄A測定法においては、検体中の
Ap₄AをHPLCを用い分離したり、あるいは酵素により分割
したりするため、操作が繁雑となり、しかも測定精度も
必ずしも良好なものではなかった。

一般に、生体中の特定の生理活性物質を定量する場
合、その物質の抗体、とくにモノクローナル抗体が同定
されるならば、たとえば標識を結合したその抗体を検体
に添加することにより、目標とする物質を直接的に定量
する免疫学的測定が可能となる。しかしながら、これま
でAp₄Aに対するモノクローナル抗体は存在しなかった。

この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたもの
であり、これまで存在しなかったAp₄Aのモノクローナル
抗体を提供することを目的としている。またこの発明
は、このモノクローナル抗体を特異的に産生するハイブ
リドーマ細胞株およびこのモノクローナル抗体を用いる
Ap₄Aの免疫学的測定法を提供することを目的としてもい
る。

（課題を解決するための手段）この発明は、上記の課題を解決するものとして、ジア
デノシンテトラホスフェート特異認識モノクローナル抗
体を提供する。

また、この発明は、ジアデノシンテトラホスフェート
抗原を免疫した哺乳動物より調製したリンパ球と、ミエ
ローマ細胞とのハイブリドーマから産生されてなること
を特徴とするジアデノシンホスフェート特異認識モノク
ローナル抗体と、このモノクローナル抗体産生能を有す
るハイブリドーマ細胞株およびこのモノクローナル抗体
を用いるジアデノシンホスフェートの免疫学的測定法を
提供する。

以下、この発明について詳しく説明する。

この発明のモノクローナル抗体は、上記の通り、Ap₄A
抗原を免疫した哺乳動物より調製したリンパ球と、ミエ
ローマ細胞とのハイブリドーマを選択、培養することに
より得ることができるが、生産効率の点からは、上記ハ
イブリドーマのうち、Ap₄Aに対するモノクローナル抗体
を特異的に産生する細胞を選別し、これをクローン化し
て細胞株とした上で、この細胞株の培養によりAp₄Aのモ
ノクローナル抗体を得るのが好ましい。

このような細胞株の作成とモノクローナル抗体の採取
法、およびそのモノクローナル抗体を用いるAp₄Aの免疫
学的測定法は以下の通り行うことができる。

（１） Ap₄Aのモノクローナル抗体を特異的に産生する
ハイブリドーマ細胞株の作成：まず、ハイブリドーマを作成するため、Ap₄A抗原に免
疫した哺乳動物のリンパ球と、これと融合させるミエロ
ーマ（骨髄腫細胞）を用意する。このうち、上記リンパ
球を採取するには、まず、Ap₄Aと担体タンパク質を共有
結合させた複合体（以下、Ap₄A−キャリアと記載する）
からなるAp₄A抗原を作成し、これを哺乳動物、好ましく
はマウスまたはラットに免疫する。

抗原の使用量、投与部位、アジュバントの使用等、免
疫の方法は従来の抗血清を得る方法に準ずればよい。例
えば、マウスを用いる場合、マウス１匹あたり１回につ
き0.001〜10mg、好ましくは0.01〜1mgのAp₄A−キャリア
を、初回はアジュバント（例えば、フロイントの完全ア
ジュバント）とよく混合して、皮下、腹腟内等に投与
し、２週間以上経過後、再びアジュバント（例えば、フ
ロイントの不完全アジュバント）をよく混合して、皮
下、腹腟内等に投与する。さらに、２週間以上経過後、
Ap₄A−キャリアのみを静脈内、皮下、腹腟内等に投与し
て、十分免疫する。このようにして免疫された動物を、
好ましくは最終免疫から２〜４日後に殺し、リンパ球を
採取する。リンパ球調製には、脾臓、リンパ節、末梢血
等が用いられる。このリンパ球を培養液に懸濁状態にほ
ぐしておく。

一方、ミエローマは、被免疫動物と同じ種由来のもの
を使用することが好ましい。さらに、そのミエローマは
薬剤低抗性の変異株であることが好ましく、未融合のミ
エローマがハイブリドーマ選択培地で生育しないものが
好ましい。最も一般には８−アザグアニン抵抗性の細胞
ラインが用いられる。これは、ヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Hypoxantin g
uanine phosphoribosyl transferase）が欠損してお
り、選択培地の一種ヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン（HAT）培地に生育できない。また、使用する
ミエローマ自身が抗体を分泌しないものが望ましい。以
上の点から、例えば、市販のマウスミエローマP3・X63
・Ag8・６・５・３（X63・６・５・３）;P3・X63・Ag8
・U1（P3U1）、ラットミエローマ 210・RCY3・Ag1・２
・３等を用いるのが好ましい。

このミエーローマを血清、好ましくは牛胎児血清を含
有するイーグル最少培地（MEM）、RPMI1640培地（RPMI1
640）等の培地中で培養する。

次に、MEM、RPMI1640等の培地に上記で得たリンパ球
およびミエローマを各々懸濁し、混合する。このときの
混合比は任意に選択できるが、好ましくはリンパ球：ミ
エローマが細胞数で1:1〜20:1、好ましくは5:1〜10:1の
比率を用いればよい。混合した細胞は、融合促進剤を用
いて融合を行う。融合方法としては、例えば、イムノロ
ジカルメソッズ２巻、285頁（Immunological Methods V
ol.II,1981,Academic Press）に従って行えばよい。融
合促進剤としては、種々の高分子物質やウィルス等を用
いることができるが、好ましくはポリエチレングリコー
ル（PEG）、センダイウイルスを用いればよい。PEGは、
平均分子量400〜20,000のものが使用できるが、好まし
くは1,000〜7,500のものを用いればよい。その使用濃度
は、40〜60vol％が好ましい。

融合させた細胞は、洗浄で融合促進剤を除去し、５〜
15vol.％の血清を含むMEMまたはRPMI1640培地に懸濁
し、96穴培養皿等に0.5〜５×10⁶/穴の割合で分注す
る。さらに、各穴に選択培地（例えば、HAT培地）を加
え、適宜選択培地を交換すれば、10〜14日後には未融合
のミエローマは死滅し、ハイブリドーマのみ生育する。
因に、リンパ球は長時間生体外（invitro）では育成で
きず、やはり10〜14日後には死滅する。

次に、Ap₄Aに対する抗体を産生するハイブリドーマを
検索、選別する。そのための方法としてはELISA法を用
いることができる。ただし、その場合に上記ハイブリド
ーマは、Ap₄A−キャリアを抗原とするため、Ap₄Aに対す
る抗体を産生するもののほか、担体タンパク質に対する
抗体を産生するものも存在するので、Ap₄Aに対する抗体
を産生するハイブリドーマのみを選択する必要がある。
そのためには、たとえば担体タンパク質以外のタンパク
質にAp₄Aを共有結合させた複合体（以下、Ap₄A−キャリ
ア２と記載する）を作成し、これをELISAプレートに吸
着させ、これにハイブリドーマ上清を加え、洗浄後、市
販の免疫動物免疫グロブリンに対する標識抗体（例え
ば、ホースラディシュパーオキシダーゼ（HRP）標識抗
体あるいは¹²⁵I標識抗体）を添加する。その結果、ハイ
ブリドーマ上清中にAp₄Aに対する抗体が存在する場合に
は、それが固相のAp₄A−キャリア２に結合し、さらに免
疫グロブリンに対する標識抗体がこれに結合して、標識
によるシグナルが得られる。一方、上清中にAp₄Aに対す
る抗体が存在しない場合には、固相のAp₄A−キャリア２
には何も結合せず、従ってシグナルも得られない。この
ように、標識によるシグナルの有無を手がかりとしてハ
イブリドーマの選択を行なうことができる。

次いで、このようにして得たAp₄Aに対するモノクロー
ナル抗体を特異的に産生するハイブリドーマを選択的に
培養することにより、ハイブリドーマ細胞株を創製する
ことができる。

なお、この方法に従って予めAp₄A−キャリアで免疫し
たマウスの脾臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞を融
合して創製したハイブリドーマ細胞株の１種を、ハイブ
リドーマUNH3H10と命名した。この株を、平成２年７月1
1日に通商産業省微生物工業研究所に寄託の手続を行
い、菌寄第11600号（FERM P−11600）として受け入れら
れた。このUNH3H10は、−120℃以下でほぼ永久的に凍結
保存が可能であって、たえず頒布可能な状態に置かれて
いる。

このハイブリドーマUNH3H10は、通常用いられる培地
で増殖可能である。例えば、牛胎児血清を５〜20％含有
するRPMI1640又はMEMを培地として用い、37℃、炭酸ガ
ス濃度5vol.％含有空気下でよく増殖する。また、ミエ
ローマの造腫瘍性をも有しているので、生体内（例え
ば、同系の動物、ヌードマウスなど）で増殖し、Ap₄Aに
対するモノクローナル抗体を産生することができる。

（２） Ap₄Aのモノクローナル抗体の多量採取：上記の通り作成したハイブリドーマ細胞株を培養する
ことにより、Ap₄Aに対するモノクローナル抗体を大量に
採取することができる。このモノクローナル抗体の採取
方法には、大きく分けて２通りの方法がある。１つは、
培地を用い、フラスコ等の培養容器で培養し、その上澄
液から抗体を採取する方法である。例えば、５〜10vol.
％の血清を含むMEMまたはRPMI1640培地に0.5〜５×10⁵
個のハイブリドーマ細胞株を植えると、２〜４日で10〜
20倍に成育し、その培養後の上澄液から抗体を採取する
方法である。もう１つの方法は、このようにして培養容
器で培養したハイブリドーマ細胞株を、同系の動物に接
種する方法である。すなわち、ハイブリドーマ細胞株10
⁵〜10⁷個を同系の動物の皮下または腹腔内等に投与し、
７〜20日後ハイブリドーマ細胞株が増殖し、腫瘍が大き
くなったときに、血清および腹水を採取する方法であ
る。腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に
2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン等の鉱物油を投
与すると、より多量の腹水が得られる。

このようにして得られた抗体は、必要に応じ精製して
使用することができる。たとえば硫安分画、イオン交換
クロマトグラフィー、プロテインＡを固定したアフィニ
ティークロマトグラフィー等、通常タンパク質に適用さ
れうる手段を用いて精製することができる。

このようにして、Ap₄Aに対するモノクローナル抗体を
容易に、かつ多量に得ることができる。

（３）モノクローナル抗体を用いるAp₄Aの免疫学的測
定：まず、Ap₄A−キャリアを固相に固定化する。固相とし
ては、プラスチック試験官、マイクロタイタープレー
ト、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、メンブレン等
を用いることができる。Ap₄A−キャリアを固定化するに
は、一般的な物理的吸着法を用いることができるが、官
能基をもつ固相に固定化する場合には共有結合法を用い
ることもできる。このとき、Ap₄A−キャリアの濃度は、
0.001mg/ml以上、好ましくは0.05〜0.2mg/mlとし、これ
を固相と接触させればよい。

次に、このようにAp₄A−キャリアを固定した固相に、
数種のAp₄A濃度既知の液体またはAp₄A濃度未知の検体を
加える。さらに、これに酵素、RI、蛍光物質等を標識し
たAp₄Aに対する抗体を加えるか、またはAp₄Aに対する抗
体を加えた後、酵素、RI、蛍光物質等を標識した二次抗
体を加える。なお、酵素としては、HRP、ウシ小腸アル
カリホスファターゼ等を用いることができる。また、RI
として¹²⁵I等を、蛍光物質としては、フルオレセインイ
ソチオシアネート、テトラメチルロ−ダミンイソチオシ
アネート等を用いることができる。

次いで、数種のAp₄A濃度既知の液体の標識抗体に対す
るシグナルを各々測定して検量線を作成し、Ap₄A濃度未
知の検体から得られるシグナルをこの検量線に当ては
め、その検体のAp₄A濃度を定量する。

以下、実施例を示し、この発明について具体的に説明
する。

実施例１（免疫原およびハイブリドーマ細胞株のスクリーニン
グ）担体タンパク質として、Keyhole Lympet Hemocyanin
（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）を用い、免疫
原およびハイブリドーマ細胞株のスクリーニングを行な
った。

Ap₄A10mgを0.1M NaIO₄0.2mlに溶解し、25℃の温度で2
0分間酸化した。これにエチレングリコールを加え、過
剰のNaIO₄を分解した。次いで28mgKLHまたはBSAを加
え、炭酸ナトリウム水溶液でpH9.0〜9.5に調整し、Ap₄A
−KLHまたはAp₄A−BSAを作成した。これらの260nmにお
ける吸光度およびタンパク質量からKLH1分子あたり結合
したAp₄Aは約1000分子、またBSA1分子あたり結合したAp
₄Aは約0.5分子と求められた。

実施例２（ハイブリドーマの作成）８週令のマウスBalb/c（オリエンタルバイオサービス
より入手）に、実施例１で作成したAp₄A−KLHを完全フ
ロイントアジュバント（半井化学より入手）と1:1に混
合乳化し、腹腔内に投与し、２週間後に50μｇのAp₄A−
KLHを静注して追加免疫し、３日後に脾臓を取り出し、M
EM培地（半井化学より入手）にほぐして懸濁洗浄した。
一方、マウスのミエローマX63・６・５・３（京都大学
より入手）を２日前から培養し、対数増殖期にある細胞
を遠心分離で集めた。脾細胞10⁸個をミエローマX63・６
・５・310⁷と混合し、遠心によりペレットしたのち、37
℃の水浴中で50％のPEG4000−RPMI1640（ギブコ社より
入手）1mlを徐々に１分間で加え、さらに、１分間緩や
かに攪拌後、9mlのRPMI1640培地を徐々に加えて、PEG40
00を希釈した。遠心分離によりPEG溶液を除去し、ペレ
ットに10％牛胎児血清を含むHAT培地20mlを加えて、２
皿の96穴培養皿（コーニング社製）の各穴に0.1mlずつ
分注した。4,8,11日目の計３回にわたり半分量の培養基
を捨て、新しいHAT培地を加えた。

その結果、10日後には384穴中24穴でハイブリドーマ
の成育が観察された。

実施例３（ハイブリドーマ細胞株の作成）実施例２で得たハイブリドーマのうちAp₄Aに対する抗
体を産生する株を、ELISA法を用い検索した。

まず、ELISAプレート（コーニング社製）に50mM炭酸
ナトリウム緩衝液、pH9.6に溶解したAp₄A−BSAを各穴に
つき50μｌずつ分注し、25℃の温度で２時間放置した。
この液を除去した後、各穴に1.0％BSA、0.15M塩化ナト
リウムを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）を
充満させ、25℃の温度で１時間放置した。さらにこの液
を除去し、0.2％トゥイーン20、0.2％BSA、0.15M塩化ナ
トリウムを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）
からなる洗浄液で各ウェルをよく洗浄し、Ap₄A−BSA固
定化プレートを作成した。

次いで、このプレートに実施例２で得たハイブリドー
マの上清50μｌを添加し、25℃の温度で２時間放置した
後、洗浄液で充分に洗浄し、HRP標識ヤギ抗マウスIgG
（フナコシより購入）１μg/mlを各穴に50μｌ加え25℃
の温度で２時間放置した。さらに、洗浄後、パーオキシ
ダーゼ測定試薬（バイオラッド社製）50μｌを加え、25
℃の温度で20分間反応させ、10％SDS50μｌの添加によ
りパーオキシンダーゼ活性を停止させ、415nmにおける
吸光度（A₄₁₅）を測定した。また対照にはハイブリドー
マ上清のかわりにHAT培地のみを反応させたものを用い
た。

その結果、対照として用いた上清無添加時のシグナル
に比べ、高いシグナルを示した上清が得られた。この上
清の穴の株を選択し、限界希釈法にてクローニングを行
い、モノクローンのハイブリドーマ細胞株UNH3H10を得
た。

実施例４（Ap₄Aに対するモノクローナル抗体の採取）実施例３で得たハイブリドーマ細胞株UNH3H10を培養
し、Ap₄Aに対するモノクローナル抗体の採取を行った。

まず、UNH3H10を10％牛胎児血清含有RPMI1640培地で
培養し、細胞濃度が２×10⁶細胞/mlに達した培養物300m
lを遠心分離し、その上清を50％飽和硫安分画により粗
抗体画分を分離し、透析した後、プロテインＡ−セファ
ロース（pH9.0）に吸着させ、クエン酸緩衝液（pH3.0）
で溶出してAp₄Aに対する抗体（以下、UNA3H10と記載す
る）を得た。

次に、このUNA3H10のAp₄Aに対する特異性を検討し
た。

まず、Ap₄A−BSAを固定したELISAプレートに、各穴10
^-7,10^-6,10^-5,10^-4mol/となるよう50μｌのAp₄Aまた
はアデノシン（Ａ）、アデノシンモノホスフェート（AM
P）、アデノシンジホスフェート（ADP）、アデノシント
リホスフェート（ATP）、アデノシンテトラホスフェー
ト（Ap₄）の各々をプレートの各穴に注入し、次いで、
各穴に4.0μg/ml濃度のUNA3H1050μｌを添加した。この
プレートを25℃の温度で２時間インキュベートした後、
0.2％トゥイーン20、0.2％BSA、0.15M塩化ナトリウム含
有20mMリン酸ナトリウム緩衝液で充分に洗浄し、HRP標
識ヤギ抗マウスIgG抗体を各穴に添加した。次いでこれ
を洗浄し、パーオキシダーゼ測定試薬（バイオラッド社
製）50μｌを加え、25℃の温度で20分間反応させた後、
10％SDS50μｌを添加して反応を停止させ、415nmにおけ
る吸光度を測定した。その結果は第１表および第１図に
示した通りである。

これら第１表および第１図からも明らかなように、モ
ノクローナル抗体UNA3H10は、A,AMP,およびADPを全く認
識せず、またATPおよびAp₄をわずかに認識はするがそれ
もAp₄Aに対する認識力の100分の１程度である。

これらのことから、UNA3H10は、Ap₄Aに対する特異的
なモノクローナル抗体であると考えられる。

実施例５（モノクローナル抗体を用いるAp₄Aの免疫学的測定）実施例４で得たモノクローナル抗体UNA3H10を用い、
検体中のAp₄A濃度を免疫学的に測定した。

まず、pH3.5の条件下で、UNA3H10とペプシンを重量比
200:1で混合し、37℃の温度で６時間消化し、UNA3H10F
（ab′）_２を得、さらにこれを還元してUNA3H10Fab′を
得た。

一方、HRPにＮ−スクシニミジル・マレイミドカルボ
キシレートを反応させ、マレイミド基を導入した。

このマレイミド基を導入したHRPとUNA3H10を混合し、
HRP標識UNA3H10Fab′を作成した。

次に、実施例１で作成したAp₄A−BSAを固定化したELI
SAプレートに、Ap₄A濃度既知（0,10^-7,3×10^-7,10^-6,3
×10^-6,10^-5mol/）の各標準液およびAp₄A濃度未知の
血清サンプルを各々50μｌ注入し、これらに１μg/ml濃
度のHRP標識UNA3H10Fab′50μｌを添加して、25℃の温
度で１時間反応させた後、よく洗浄し、HRP発色試薬50
μｌを加え、20分間反応させた後、10％SDS50μｌを添
加して反応を停止させA₄₁₅を測定した。

この測定結果を第２表に示した。また、Ap₄A濃度既知
の各標準液のA415から得られる検量線を第２図に示し
た。

この第２表および第２図から検体として用いた血清サ
ンプルに含まれるAp₄A濃度は5.6×10^-7mol/である。

比較例（従来法によるAp₄Aの測定）実施例５において検体として用いた血清サンプルのAp
₄A濃度を、HPLC法を用いて測定した。

すなわち、実施例４と同様のAp₄A濃度既知の各標準液
および血清サンプルを、逆相C₁₈カラム（Waters社製）
に、0.1％テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム含有リン酸
緩衝液（pH7.0）を溶媒として、各々500μｌ注入し、26
0nmにおける吸光度（A₂₆₀）を測定した。なお、Ap₄Aの
濃度はA₂₆₀のピーク面積で表わした。その結果は第３表
および第３図に示した通りであり、血清サンプル中のAp
₄A濃度は5.6×10^-7mol/となる。

このように、同一の血清サンプルに対し、従来法であ
るHPLC法により測定したAp₄A濃度と、実施例５に示した
この発明のモノクローナル抗体を用いる酵素免疫学的測
定によるAp₄A濃度は、全く同一値を示したことから、こ
の発明のAp₄A測定法は充分に信頼性の高い測定法である
と言える。

もちろんこの発明は以上の例によって限定されるもの
ではなく、その手続きの細部や適用範囲等については、
様々な態様が可能であることは言うまでもない。

（発明の効果）以上詳しく説明した通り、この発明によりモノクロー
ナル抗体を用いたAp₄Aの免疫学的測定が可能となり、生
体液中のAp₄Aを簡易かつ迅速に、しかも高精度に定量化
することができる。

しかも、このAp₄Aに対するモノクローナル抗体を特異
的に産生するハイブリドーマ細胞株の樹立により、診断
および測定に有用なAp₄Aのモノクローナル抗体を多量
に、かつ容易に得ることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクローナル抗体UNA3H10と、Ap₄Aおよび
その競合物質の結合の程度を、各検体の濃度と吸光度の
相関図として示したものである。第２図は、この発明の免疫学的測定法に使用するAp₄Aの
検量線の一例を示したAp₄A濃度と吸光度の相関図であ
る。第３図は、従来法であるHPLC法によるAp₄Aの検量線の一
例を示した相関図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者中島宏京都府宇治市宇治小桜23 ユニチカ株式会社中央研究所内 (56)参考文献特開昭61−93199（ＪＰ，Ａ) Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 254，（1988），ＰＨ828−832 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/08 C12N 5/00 - 5/28 G01N 33/53 G01N 33/577 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ジアデノシンテトラホスフェート抗原を免
疫した哺乳動物より調製したリンパ球と、ミエローマ細
胞との融合細胞であって、ジアデノシンテトラホスフェ
ート特異認識モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞株UNH3H10（FERM P−11600）。
【請求項２】請求項（１）記載のハイブリドーマ細胞株
UNH3H10（FERM P−11600）が産生するジアデノシンテト
ラホスフェート特異認識モノクローナル抗体。
【請求項３】請求項（２）記載のモノクローナル抗体を
用いるジアデノシンテトラホスフェートの免疫学的測定
法。