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JP3032289B2 - 多機能性酵素及び誘導可能の２’，３’―ジデオキシリボフラノシド三リン酸塩 - Google Patents

多機能性酵素及び誘導可能の２’，３’―ジデオキシリボフラノシド三リン酸塩

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JP3032289B2
JP3032289B2 JP2511975A JP51197590A JP3032289B2 JP 3032289 B2 JP3032289 B2 JP 3032289B2 JP 2511975 A JP2511975 A JP 2511975A JP 51197590 A JP51197590 A JP 51197590A JP 3032289 B2 JP3032289 B2 JP 3032289B2
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ファジロイウ，ロクサナ
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ハヴリナ，ロクサナ―マリア
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の対象は、同一又は種々の微生物及び細胞物質
に由来する類似の活性スペクトルを有する複数の多機能
性酵素、その製造方法と用途、並びに多機能性酵素を使
用した方法を含む。
本発明は、少なくとも新規のヌクレオシド・デオキシ
リボシル転移酵素、特に乳酸桿菌Lactobacillus leichm
anniiからの酵素、その製造方法、ヌクレオシド・デオ
キシリボシル転移酵素Ｉ、II、III（V1、V2、V3）のそ
れぞれがキナーゼ、還元酵素、脱アミノ酵素、重合酵素
としての活性を示すという多機能性、並びに塩基を修飾
したヌクレオシド類、ヌクレオチド類、ポリヌチレオチ
ド類の酵素工学的製造方法に関する。
微生物Lactobacillus leichmanniiが２種のヌクレオ
シド・デオキシリボシル転移酵素V1（まだ酵素番号な
し）とV2（DRT II）（EC 2.4.2.6）とを有し、これが１
個のピリミジン（プリン）ヌクレオシドの２′−デオキ
シリボースを１個のピリミジン（プリン）塩基に転移す
る次の反応を触媒することが公知である。
dRib−Pur＋Pur′dRib−Pur′＋Pur （V1） ここでPur :プリン塩基 Pyr :ピリミジン塩基 dRib:2′−デオキシリボースである。
この公知の酵素V1とV2とをLactobacillus leichmanni
iから精製する過程で、意外にも第三のヌクレオシド・
デオキシリボシル転移酵素V3を発見した。これは次の反
応を触媒する。
dRib−Pur＋Pur′dRib−Pur′＋Pur 乳酸桿菌からのこの３種の多機能性酵素の精製は２段
の前処理とイオン交換クロマトグラフィーにより行った
（この３種のタンパク質はこの際それぞれ均質にお互い
によく分離された）。それぞれのタンパク質をアフィニ
ティークロマトグラフィーにより更に精製した。
こうしてV1、V2、V3を均質の状態まで精製した。
次にSDS−網目勾配電気泳動によりそのサブユニット
構造を調べた。V1とV2とはそれぞれ２個の19乃至20キロ
ダルトンのサブユニット、V3は１個の20キロダルトンの
ポリペプチド鎖から成ることが判った。
V1、V2、V3はアロステリック酵素で、凝集体を形成す
る。イオン強度又は溶剤濃度が高い場合或いは凍結乾燥
の際に、これらの酵素は大きな凝集体（２量体、３量体
など）となり、これは電気泳動により確認された。
この新規の酵素と公知の酵素は何れも、転移酵素活性
のみならずキナーゼ活性、還元酵素活性、脱アミノ酵素
活性、重合酵素活性を有する。
これらの活性は全て同じポリペプチド鎖にあり、公知
の生化学的（調製、分析）方法、例えばアフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動、等電点分離法では分離
できない。或いは非特異的タンパク質分解によれば分離
は可能かも知れない。
更にこれらの活性は全て共通の阻害剤及び活性化剤を
有するので、この点からもこれらの全ての機能に対する
活性中心が一つのポリタンパク質の構成部分で有ること
が再度立証される。
多機能性酵素の場合、必ずしも全ての活性が立証され
るわけではない。
転移酵素活性 V3は、１個の２′−デオキシ（２′,3′−ジデオキ
シ）リボヌクレオシドの２′−デオキシ（２′,3′−ジ
デオキシ）リボフラノシル残基を１個のプリン塩基に転
移する反応を触媒し、その際２′−デオキシ（２′,3′
−ジデオキシ）リボフラノシド類が生成する（実施例
２、３）。
この酵素の活性は次の二つの方法で測定される。
分光光度法による直接法 この方法は、合成した６−クロロ−２′−デオキシグ
アノシンが305nmの所で使用した受容体塩基６−クロロ
グアニンよりも大きな吸光を示すことに基づいている
（ε305nm＝760M-1×cm-1、ε＝モル吸光係数）。
反応開始時には、２′−デオキシアデノシン又は２′
−デオキシイノシンを1mM、６−クロログアニンを0.2mM
使用した。
活性の単位は、305nm/37℃/min/mに於ける0.01吸収単
位の吸収の増加により定義した。
R.Cardinaudの方法（Methods in Enzymology,Vol.LI） リン酸塩緩衝液0.3M pH6.0、２′−デオキシイノシン
1mM、受容体塩基1mM、キサンチン酸化酵素50μ（（NH
4）2SO4 3.2M中に10mg/ml（Boehringer Mannheim製）、
（NH4）2SO4 2Mで1:10に希釈）の開始時組成を用い、デ
オキシリボースの転移後２′−デオキシイノシンから生
成したヒポキサンチンを補酵素によりキサンチンに、更
に尿酸まで酸化する。尿酸は290nmで吸収最大値を示
す。
最初の方法はヌクレオシドを任意に変えることができ
る利点があり、第２の方法では各種の受容体塩基を試験
できる。
転移反応だけでなく、リン酸化、還元、脱アミノ、重
合の各反応を高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を
用いて分析的に追跡した。逆相マトリックスはオクタデ
シルシラン（ヌクレオシド300−5C18）から成り、溶離
液としてはKH2PO4 50mMを使用した。又メタノール濃度
を生成物の疎水性に応じて、2.5〜50％の間で変化し
た。
V3は特に１−,7−,8−又は３−置換プリンを受容体塩
基として認識し、V2は主として２−又は６−置換プリン
を認識する。
V3を用いて次の２′,3′−ジデオキシリボフラノシド
類の製造が可能である。
２′,3′−ジデオキシリボフラノシド類の検出を、上
述の吸光光度法とHPLC分析の両方により実施した。後者
の場合次の溶離プログラムを用いた。
0〜10分 緩衝液B 0〜100％ 10〜25分 緩衝液B 100％ 25〜28分 緩衝液B 100〜０％ 28〜30分 緩衝液B 0％ 緩衝液Ａ :KH2PO4 50mM MeOH 2.5％ 緩衝液Ｂ :KH2PO4 50mM MeOH 50％ カラム寸法:4×250mm 流 速:1ml/min この条件で化合物は次の保持時間を示した。
1,7−ジメチルグアニン−ddr 14.8分又は16.2分 １−ヒドロキシイソグアニン−ddr 5.4分 ８−メチルキサンチン−ddr 13.6分 １−メチルアデニン−ddr 6.7分 ２−ヒドロキシプリン−ddr 7.7分 反応速度は15〜20nmol/min/単位酵素で、濃度が1mMを
超えるとddA（ddr受容体）は阻害的に作用する。
２′,3′−ジデオキシリボフラノシド類は優れた化学
療法の可能性、特に抗ウイルス性物質としての可能性を
有する。
前述の全ての２′,3′−ジデオキシリボフラノシド類
は、これをキナーゼ活性により相当する三リン酸塩にま
でリン酸化できる。
キナーゼ活性 Lactobacillus leichmanniiからの酵素V1、V2、V3は
ヌクレオチド（リン酸塩供与体）の無機リン酸基をヌク
レオシド又はヌクレオチド（受容体）に転移する反応を
触媒する。
リン酸塩受容体は、これを段階的にデオキシヌクレオ
チド類又はジデオキシヌクレオチド類又はヌクレオチド
類或いはそれらの類似体の一リン酸塩、二リン酸塩から
三リン酸塩までリン酸化することができる（実施例４、
５）。
キナーゼの活性中心は熱に敏感であるから、酵素の精
製の際に熱変性過程は避けるべきで、合成は35℃で行わ
なければならない。
V1、V2、V3の基質特異性はリン酸化反応の受容体に関
しては次の通りである。
酵素 基質 V1 dC,dG,dA, 相当するヌクレオチド類及び類似体 V2 dG,dA,dC,dT,相当するヌクレオチド類及び類似体 V3 dT,dC,dG,dA,相当するヌクレオチド類及び類似体 各種のリン酸塩供与体（ヌクレオチド類）の効率は受
容体によって左右される。これを次の表に示す。
V1、V2、V3の幅広い基質スペクトルによって非常に種
々の受容体が可能である。
還元酵素活性 酵素V1、V2、V3はヌクレオチド類の還元を補酵素とエ
フェクターの存在下で触媒できる。
還元用の基質としては、ATP,CTP,GTP,UTP、およびそ
の二リン酸塩及び／又は一リン酸塩、並びにその類似体
が使用できる（実施例６）。
効率の良い反応速度を得るには、エフェクター及び補
酵素B12の存在が絶対に必要である。
エフェクターがなければ還元は殆ど起こらない。補酵
素B12は市販されており、例えばドイツのFluka AGで入
手できる。補酵素B12の濃度が50μＭを超えるか、或い
はその濃度が15〜20μＭで、10μＭの５′−デオキシア
デノシンが存在している場合には、多機能性酵素の全て
の活性を阻害する。
次のエフェクターが還元反応の場合に必要である。
基質 エフェクター ATP dGTP CTP dATP UTP dCTP GTP dTTP 一リン酸塩又は二リン酸塩の範囲での還元も可能であ
る。
脱アミノ酵素活性 酵素V1、V2、V3はヌクレオチド類、ヌクレオシド類、
プリン塩基、ピリミジン塩基のアミノ基の加水分解を触
媒する。
脱アミノを効率よく実施するには、始めの反応液を、
反応が始まるまで、かなりの間37℃でインキュベートす
る必要がある。例えば２′−デオキシシチジンから２′
−デオキシウリジンが、２′,3′−ジデオキシアデノシ
ンから２′,3′−ジデオキシイノシンが生成する（実施
例７、８）。
この所謂遅滞期（反応が起こらない最初の時間）は多
機能性酵素に特有な現象で、これは配座（コンホーメー
ション）の変更と関係がある。
ヌクレオシダーゼ活性 酵素V1、V2、V3は又ヌクレオシドのグリコシド結合を
加水分解することができる。この加水分解には脱アミノ
反応と全く同様な遅滞期がある。
重合酵素活性 乳酸桿菌からの多機能性酵素V1、V2、V3は、転移酵
素、還元酵素、脱アミノ酵素、キナーゼとしての活性を
有するばかりでなく、デオキシリボヌクレオチド類の反
応を触媒する能力があり、その際ホモポリマー又はヘテ
ロポリマーが生成する。これがドゥノボ（新規の）重合
である。ヌクレオチド類の結合は全てのリン酸化の段階
で行われ、デオキシヌクレオチドの三リン酸塩のみなら
ず、二リン酸塩、一リン酸塩も重合体に組み込まれる。
このドゥノボ重合も20乃至70時間の遅滞期を示す（実施
例９）。
この能力は既に、多機能性酵素のデオキシヌクレオシ
ド・キナーゼ活性を研究したJ.P.DurhamとD.H.Ivesによ
り認められたが、彼らは最終生成物を同定することはで
きなかった（１）。
デオキシリボヌクレオシド・キナーゼの多機能性は、
1977年既に速度論的研究から認められており（2,3,
4）、デオキシアデシンとデオキシグアノシンのリン酸
化がただ１個のポリペプチドの二つの異なる活性中心で
行われることが確認された（５）。
ポリタンパク質は、２個又はそれ以上の活性中心を有
するポリペプチド鎖（唯一つの遺伝子の生産物）と定義
できる（６）。
乳酸桿菌からの３種の多機能性酵素V1、V2、V3の内
で、最後の二つだけがドゥノボ重合酵素の活性を示す
が、３種ともある鋳型例えばポリ〔ｄ（Ａ−Ｔ）〕の複
製を触媒する（実施例10、11）。
乳酸桿菌からのこの３種の酵素は、それぞれ異なった
効率で、種々の天然及び合成のDNA、例えば二本鎖、一
本鎖、リング状、変成などのDNAの複製を触媒する。デ
オキシリボヌクレオチドの組込み率が２〜３％の効率
で、リボヌクレオチド類を重合する。
乳酸桿菌には、恐らくDNA複製に関与する第４の多機
能性酵素が存在していると思われるが、非常に不安定の
ため分離、精製することは今のところ不可能であった。
DNA重合酵素が６個の高度に保存された配列を有し、
これが数億年もの間変化していないことが知られている
（9,11,15,16）。そこで、他の生物からの相当する酵素
に就いて同じ活性を試験した。
Pfrongner（14）の改良法により、均質の状態まで精
製した、コウシ脾臓からのアデノシン脱アミノ酵素（Wo
rthington Biochemical Corporation,ロット番号59P41
2）が同じような性質を示した。この酵素を500回の過程
で等電沈殿、硫酸アンモニウム沈殿並びにBio−Rex−7
0、DEAE−Sephadex A−50、SE−Sephadex C−50を用い
たクロマトグラフィー（最後の２過程は繰り返した）に
より精製した。本公開をアデノシン脱アミノ酵素が均質
であることの証拠とする。
このコウシ脾臓からの多機能性酵素は、ADPとUDP（エ
フェクターとNADPHの存在下で）の還元、dAMPとdCMP
（相当するリン酸塩供与体と共に）のリン酸化、ヌクレ
オチド類のドゥノボ重合、ある鋳型の複製を触媒する
（実施例12）。
大腸菌DNA重合酵素Ｉ（Pharmacia 27−0626−02 E.co
li CM 5197）はその多機能性が公知の酵素である（その
重合酵素と３′,5′エキソヌクレアーゼとしての活性は
同じポリペプチド鎖に属し、タンパク質分解法によって
のみ分割できる）が、これまで予想もしなかった別の能
力を有する。
この酵素は２′−デオキシアデノシンを脱アミノして
２′デオキシイノシンとし（実施例13）、dGTPとNADPH
の存在下でADPをdADPまで還元する。ヌクレオチド二リ
ン酸塩・キナーゼとしても、この大腸菌からの多機能性
酵素は同様に活性である。この最後の活性に就いてはA.
Kornberg（17）も観察している。
Micrococcus luteus（Sigma Chemie GmbH D 2626）
（７）からのDNA重合酵素も同じような性質を示し、ア
デノシンを脱アミノ並びにリン酸化することができる
（実施例14,15）。CTPの還元は分光光度法（340nmに於
けるNADPHの吸収の減少）とHPLC分析とにより追跡し
た。
V2、V3に対するラビット多クローン性抗体は、微量滴
定板でのELISA試験で、大腸菌DNA重合酵素Ｉとの正の交
差反応を示した。
V3と重合酵素Ｉとの間の免疫学的親和性は非常に大き
い。構造的にもこの二つの酵素は非常によく似ている。
何れも１個の単量体から成り、ただ１個のポリペブチド
の構成成分として複数の活性中心或いは活性を有する。
V2に対する免疫グロブリンＧも、重合酵素Ｉとある程度
正の交差反応を示す。
これらの現象（前述の各種の活性）は他の生物に於い
ても実証され、これは普遍的のように思われる。例えば
コウシの腸には、既に４種のアデノシン脱アミノ酵素が
検出されており（20）、報告されたこれらの多機能性酵
素の構成成分も、コウシ脾臓からのアデノシン脱アミノ
酵素と同じように恐らくその他の活性を有するように思
われる。
ヒト細胞の２′,3′−ジデオキシアデノシン代謝の研
究の未発表の結果も発明者の前述の仮説を裏付けてい
る。欠損Ｔリンパ球のデオキシシチジン・キナーゼとデ
オキシアデノシン・キナーゼの場合、ddAの脱アミノの
割合は野性型に比べて僅か20％しか記録されていない。
これに対する説明としては、dCK-細胞、dAK-細胞はその
二つの多機能性酵素に於いて全ての活性（キナーゼ、還
元酵素、脱アミノ酵素、重合酵素）が欠損しており、そ
のため脱アミノ割合が低いと言うことができる。
DNA複製に関与する多機能性酵素の発見により次の事
実も説明されよう。即ち、ウイルスT 7 DNA重合酵素
は、とにかく活性になるには宿主細胞（大腸菌）からの
チオレドキシン分子を必要とする。このチオレドキシン
はこの場合にもヌクレオチド類の還元に対するレドック
ス補酵素として作用する。DNA重合酵素が何故チオレド
キシン分子を必要とするかは、A.Kornbergは説明できな
かった（17,18）。
ヒト細胞からのDNA重合酵素αのプライマーゼ活性は
既に検出されている。従ってこの酵素は現在『ポリメラ
ーゼ・プライマーゼ』と呼ばれている。この名称はこの
酵素の有する多くの活性の内の二つしか表現していない
（19）。
いくつかのこのような多機能性酵素の場合に、３′,
5′−エキソヌクレアーゼは公知である。
この酵素の精製はその過程で非特異性のタンパク質分
解や凝集体生成が生ずるため非常に困難であることも公
知である。この凝集体の生成は生体内でこの調節酵素の
アロステリーにより支持される（8,9,10,12,13,17）。
フッ化フェニルメチルスルホニルのような普通のプロ
テアーゼ阻害剤は非特定のタンパク質分解には作用しな
い。特殊の阻害剤、例えばアンチパイン、ロイペプチ
ン、アプロチニンなど（12）が多機能性酵素のプロテア
ーゼ活性だけでなく重合酵素活性をも阻害する。
逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）は他の重合
酵素とよく似ており、所謂RNA依存性DNAポリメラーゼ活
性を有する。これは現在インテグラーゼと呼ばれている
融合酵素で、プロテアーゼ、逆転写酵素、リボヌクレア
ーゼ、エンドヌクレアーゼの活性を示す（21,22）。こ
のDNAポリメラーゼの高度に保存された６個の機能部位
でさえ、逆転写酵素に於いて同定しなければならない
（22）。
この事実は、『これらの多機能性酵素の全てが一つの
元々は共通の遺伝子から発展したものである』ことを示
唆している（16）。
V1、V2、V3の多機能性の利用 多機能性酵素の種々の活性は、それぞれ塩基を修飾し
たヌクレオシド類、ヌクレオチド類、ポリ（オリゴ）ヌ
クレオチド類の生産の目的に利用される。乳酸桿菌酵素
の基質特異性は、大腸菌或いはコウシ脾臓からの相当す
る酵素に比べて全ての活性に於いて遥かに広範である。
その際ヌクレオチド類の還元は二リン酸塩の段階でのみ
行われ、ヌクレオシド二リン酸塩キナーゼ活性のみを示
す。このような広い基質範囲を示す多機能性酵素を有す
る生物は他には稀である。
多機能性から生ずる利点は、例えば高い効率で生体内
でこの種の酵素により行われるような一連の全反応を実
施できる点にある。
例えば、ヌクレオシドキナーゼ活性をドゥノボポリメ
ラーゼ活性又は鋳型の重合と組み合わせることができ
る。ドゥノボ重合は、35℃でのインキュベーションを延
長した場合にのみ、リン酸化の後で自発的に行われ、そ
の際ヘテロポリマーが生成する（実施例16、17）。
ホモポリマーの生産には、ただ１種のヌクレオチドを
ドゥノボ重合する（実施例９）。V2、V3はヌクレオチド
を全てのリン酸化の段階で結合することができる。
鋳型の重合に続くヌクレオシドのリン酸化の場合に
は、最初の反応が平衡に達した後で初めて、第２の反応
の基質を酵素に添加する（実施例18）。
デオキシリボース転移反応はリン酸化及び重合反応と
よく組み合わせることができる。
或いはヌクレオチド類の還元は（その後に）リン酸化
を続けることができる。
経済性の高いV1、V2、V3の重要な用途には次のような
ものがある。
− これまで生産されたことのない新しい２′,3′−ジ
デオキシリボフラノシド類の合成 − 従来高価な化学的並びに酵素的方法を併用してい
た、２′,3′−ジデオキシリボヌクレオシドの三リン酸
塩までの高い効率のリン酸化 − ホモ及びヘテロのポリヌクレオチド類の酵素による
合成 ドゥノボ重合によるホモポリマーの生産に於ける利点
は、合成反応開始用のプライマーを必要とせず、又基質
を100％消費するので、生産物の精製が著しく簡単にな
る点にある。
− Sanger（23）がジデオキシ法と称したDNA配列決定
法へのV3（又はV1、V2）の使用 乳酸桿菌酵素がddNDP又はddNMP（高価なddNTPの代わ
り）を組み込むことができるので、大きな経済的利点が
ある。
ヒトゲノム配列決定プログラムにより、この用途には
更に重要な意義が加えられる。
多種多様の反応に一つの生物学的触媒を繰り返し使用
することにより最終製品の生産コストを大幅に削減でき
る。
これまで合成できなかった修飾されたヌクレオシド
類、ヌクレオチド類、ポリヌクレオチド類の合成が次の
ような事実から可能になった。
ａ）Lactobacillus leichmanniiからの３種の多機能性
酵素の広範囲な基質スペクトル ｂ）他の原核細胞、真核細胞からの多機能性酵素の基質
特異性 ｃ）この理論を基にして目標を立て系統的に立証した、
新しい酵素の活性の予想外の特異性。
実施例１ 150のMRS−培地にLactobacillus leichmannii（DSM
20076）の対数的準備培養１を接種した。この微生物
を安定期に達するまで嫌気的に37℃で攪拌した（約６時
間）。クロスフロー濾過装置を用いて細胞懸濁液を濃縮
し、次に遠心分離した。収率は培地当たり12.5g細胞
湿潤重量であった。
MRS−培地 細菌学用ペプトン 10 g 肉エキス 5 g 酵母自己分解生成物 5 g K2HPO4 2 g クエン酸ナトリウム 2 g 酢酸ナトリウム酸三水和物 6 g MgSO4・7H2O 0.58g MnSO4・4H2O 0.28g トゥイーン界面活性剤80 1 g グルコース 20 g １になるまで水を加え、1Nの塩酸にてpHを6.2〜6.3
に調節した。
細胞20g（湿潤重量）を破砕用緩衝液30mlと80gのガラ
ス球（直径0.75mm）に加え、ガラス球破砕機で4000rpm
で破壊した。この破砕は５分以内に完了した。
破砕用緩衝液 リン酸塩緩衝液（Na） 20mM,pH6.5 NaCl 50mM EDTA 0.1mM メルカプトエタノール 1mM PMSF（フッ化フェニルメチルスルホニル）20μM 得られた最適のタンパク質濃度10mg/mlの粗抽出液に
４℃で硫酸プロタミン溶液１％（w/w）を加えて、硫酸
プロタミンの最終濃度が0.4〜0.45％になるまで、pH6.5
で１時間攪拌混合する。沈澱したタンパク質を11 000rp
mで15分遠心分離する。この沈澱の結果かなりの大きさ
のタンパク質の凝集体が生成し、それによりV2の活性が
30％向上する。
続いて飽和度０〜50％の間で最初の硫酸アンモニウム
沈澱を行い、次に飽和度50〜70％の間で第２の硫酸アン
モニウム沈澱を実施する。この最後の飽和度の範囲で転
移酵素が沈澱する。
ヌクレオシドデオキシリボシル転移酵素を、リン酸塩
緩衝液20mM、NaCl 100mM、EDTA 0.1mM、メルカプトエタ
ノール1mMで平衡化したDEDA−セファセルカラムに通し
てそれぞれの酵素に分離した。NaClの濃度勾配が160〜1
90mMの間でV1、260〜280mMの間でV2、通路の末端の100m
MでV3が溶離する（添付した溶離グラフ参照）。
転移酵素活性を示す分画を合体し、トリス−HCl 20m
M,pH7.0,KCl 20mM,DTT 4.0mM,MgCl 4.0mM,EDTA 0.1mMに
対して透析した。５′−AMP−アガロース（アフィニテ
ィーマトリックス）を１個のカラムに充填し、前述の緩
衝液で平衡化した。V3を含む試料（5ml）を１時間ペリ
スタポンプでこのカラムを循環させた（流速:10ml/
h）。遊離した酵素を、KClの濃度を100mMにした、カラ
ムの４倍量の同じ緩衝液で洗浄した。V3はトリス−HCl
緩衝液中のKClの濃度を300mMにした時に初めて溶離す
る。
この精製方法によりV3の特異的活性は20E/mgタンパク
質まで向上できた。こうして均質のタンパク質が得られ
る。
細胞の湿潤重量1g当たり細胞から次の量の酵素が分離
できた。
V1 50μｇ（１単位） V2 160μｇ（2.7単位） V3 550〜600μｇ（11〜12単位） V3の転移活性の例 実施例２ リン酸塩緩衝液（Na）20mM,NaCl 50mM,pH6.2 ２′,3′−ジデオキシアデノシン 0.2mM 1,7−ジメチルグアニン 0.1mM V3 10E/ml 反応開始時 温度:35〜37℃ 平衡に達するまでの反応時間:3〜５日 最終生成物:1,7−ジメチルグアニン−９−β−Ｄ−
２′,3′−ジデオキシリボフラノシド この場合ddrは恐らく位置N9のみならず位置N3にも転
移したと思われる。
同じようにして２′,3′−ジデオキシリボシル残基は １−ヒドロキシイソグアニン ８−メチルキサンチン ２−ヒドロキシプリン １−メチルアデニン ７−メチルグアニン ベンゾイミダゾール にも転移される。
実施例３ リン酸塩緩衝液（Na）20mM,NaCl 50mM,pH6.2 ２′−デオキシイノシン ２ mM ８−ブロモグアニン 0.5mM V3 5E/ml 反応開始時 温度:35〜37℃ 平衡に達するまでの反応時間:24〜30時間 最終生成物:8−ブロモグアノシン V1、V2、V3のキナーゼ活性の例 実施例４ 緩衝液：トリス−HCl 50mM,pH7.2 MgCl2 6.5mM ジチオトレイトール（DDT） 2.5mM アデノシン５′−三リン酸塩 ５ mM ２′−デオキシチミジン ３ mM V3 5E/mL 反応開始時 温度:35〜37℃ 最終生成物:dTMP,dTDP,dTTP（痕跡） 実施例５ ２′−デオキシシチジン５′−三リン酸塩 ５ mM ２′,3′−ジデオキシアデノシン３ mM 緩衝液：トリス−HCl 50mM,NaCl 50mM,pH7.2 MgCl2 6.5mM DTT 2.5mM V3 10E/ml 反応開始時 温度:35〜37℃ 平衡状態に達するのは５〜７日後である。
最終生成物:ddAMP,ddADP,ddATP 同様にして、 1,7−ジメチルグアニン−９−β−Ｄ−２′,3′−ジ
デオキシリボフラノシド １−ヒドロキシイソグアニン−９−β−Ｄ−２′,3′
−ジデオキシリボフラノシド ８−メチルキサンチン−９−β−Ｄ−２′３′−ジデ
オキシリボフラノシド ２−ヒドロキシプリン−９−β−Ｄ−２′,3′−ジデ
オキシリボフラノシド １−メチルアデニン−９−β−Ｄ−２′,3′−ジデオ
キシリボフラノシド ベンゾイミダゾール−９−β−Ｄ−２′,3′−ジデオ
キシリボフラノシド ７−メチルグアニン−９−β−Ｄ−２′,3′−ジデオ
キシリボフラノシド もリン酸化される。
V1、V2、V3の還元酵素活性の例 実施例６ 緩衝液：酢酸ナトリウム 60mM K2HPO4 3mM ATP（ADP又はAMP） 1mM 補酵素B12 ４μM DTT 30mM dGTP（エフェクター） 1mM 酵素（V1,V2,V3） 0.2〜0.5E/ml 反応開始 温度:35℃ 反応時間:2〜３日 最終生成物:dATP（dADP又はdAMP） V1、V2、V3の脱アミノ酵素活性の例 実施例７ リン酸塩緩衝液20mM,NaCl 50mM,pH6.5 ２′−デオキシシチジン 2mM V2 0.5E/ml 反応開始時 最終生成物:2′−デオキシウリジン 実施例８ リン酸塩緩衝液20mM,NaCl 50mM,pH6.5 ２′,3′−ジデオキシアデノシン 2mM V3 5E/ml 反応開始時 最終生成物:2′,3′−ジデオキシイノシン 本反応液は脱アミノの開始前にかなりの時間37℃でイ
ンキュベートする必要がある。脱アミノ反応時間は２〜
４日である。
実施例９ 緩衝液：トリス−HCl 60mM,pH7.2 DTT 2.5mM dATP ５ mM 酵素:V3（V2） 5E/ml（1E/ml）反応開始時 温度:35℃ 反応時間:3日 最終生成物：ポリ（dA） 実施例10 ポリ〔ｄ（Ａ−Ｔ）〕の複製 緩衝液：トリス−HCl 40mM,pH7.55 MgCl2 5mM DTT 1mM BSA 50μg/ml ポリ〔ｄ（A/T）〕 1.5A260U dATP 1mM dTTP 1mM dGTP 1mM dCTP 1mM 酵素:V1,V2,V3 ２−5E/ml 反応開始時 温度:35〜37℃ 反応時間:3〜５日 最終生成物：ポリ〔ｄ（Ａ−Ｔ）〕 実施例11 緩衝液：トリス−HCl 40mM,pH7.2 DTT 2.5mM dAMP １ mM MgCl2 6.5mM BSA 50μg/ml ポリ〔ｄ（Ａ−Ｔ）〕 1.5A260U dTTP １ mM dGTP １ mM dCTP １ mM 酵素:V3 5E/ml 反応開始時 温度:35℃ 反応時間:3〜５日 最終生成物：ポリ〔ｄ（Ａ−Ｔ）〕 他の生物からの類似の酵素の多機能性の例 実施例12 緩衝液：トリス−HCl 100mM,pH7.5 dAMP 1mM dCTP 2mM MgCl2 10mM DTT 1mM BSA 100μg/ml 酵素：コウシ脾臓からの アデノシン脱アミノ酵素 2E/ml 反応開始時 温度:35℃ 反応時間:24〜30時間 最終生成物:dADP,dATP 実施例13 緩衝液：リン酸塩 50mM,pH6.2 dA 2mM 酵素：大腸菌からのDNA−重合酵素Ｉ2E/ml 反応開始
時 温度:37℃ 反応時間:5日 最終生成物:dI,ヒポキサンチン 実施例14 緩衝液：リン酸塩 50mM,pH6.2 dA 2mM BSA 50μg/ml 酵素:Micrococcus luteusからの DNA−重合酵素 1E/ml 反応開始時 温度:35℃ 反応時間:20〜24時間 最終生成物:dI,ヒポキサンチン 実施例15 緩衝液：トリス−HCl 40 mM,pH7.5 dA ３ mM dCTP ５ mM MgCl2 ５ mM DTT 2.5mM BSA 50μg/ml 酵素:Micrococcus luteusからの DNA−重合酵素 1E/ml 反応開始時 温度:35℃ 反応時間:2日 最終生成物:dAMP,dADP,dATP 一連の反応の例 実施例16 緩衝液：トリス−HCl 40 mM,pH7.55 MgCl2 6.5mM DTT 2.5mM dATP ５ mM dC ３ mM 酵素:V3 5E/ml 反応開始時 温度:35℃ 反応時間:2日 最終生成物:dCMP,dCDP 自発的ドゥノボ重合はその３日後に行われる。
最終生成物：ポリ（dA−dC） 実施例17 緩衝液：トリス−HCl 40 mM,pH7.55 MgCl2 6.5mM DTT 2.5mM dATP ５ mM dG ３ mM 酵素:V2 1E/ml 反応開始時 温度:35℃ 反応時間:2日 ドゥノボ重合の後でポリ（dA−dG）が生成する。
実施例18 緩衝液：トリス−HCl 40 mM,pH7.2 dA ３ mM dCTP ５ mM MgCl2 6.5mM DTT 2.5mM BSA 50μＭ 酵素:V3 5E/ml 反応開始時 ３日後に更に次のように添加した ポリ〔ｄ（Ａ−Ｔ）〕 1.5A260U dGTP １ mM dTTP １ mM 温度:35℃ 反応時間:5〜６日 最終生成物:dAMP,dADP,dATP,ポリ〔ｄ（Ａ−Ｔ）〕 実施例19 緩衝液：トリス−HCl 50mM,pH7.5 AMP 1mM dGTP 2mM 補酵素 ４μＭ DTT 30mM BSA 50μg/ml 酵素:V3 5E/ml 反応開始時 AMPをdAMPまで還元した後で平衡に達してから MgCl2 5mMを追加した 生成物:dAMP,dADP,dATP
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｎ 9/14 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 19/00 - 19/64 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リボヌクレオチドを基質として、水性媒体
    中で、少なくとも以下の活性、すなわち、ヌクレオシド
    デオキシリボシル転移酵素活性、ヌクレオシドまたはヌ
    クレオチドキナーゼ活性、リボヌクレオチド還元酵素活
    性、アデノシン脱アミノ酵素活性並びにDNAポリメラー
    ゼ活性を有する酵素と接触させ、形成されたデオキシリ
    ボヌクレオチドをその反応混合物から分離することを特
    徴とするデオキシリボヌクレオチドの製造方法。
  2. 【請求項２】ラクトバチルス ライヒマンニイ（Lactob
    acillus leichmannii）から得られるヌクレオシドデオ
    キシリボシル転移酵素を用いることを特徴とする請求項
    １記載のデオキシリボヌクレオチドの製造方法。
  3. 【請求項３】前記反応が、補酵素B12の存在下で行われ
    ることを特徴とする請求項２記載のデオキシリボヌクレ
    オチドの製造方法。
  4. 【請求項４】前記反応が、エフェクターとしてのデオキ
    シリボヌクレオシド三リン酸塩の存在下で行われること
    を特徴とする請求項２記載のデオキシリボヌクレオチド
    の製造方法。
  5. 【請求項５】前記反応が、補酵素B12およびエフェクタ
    ーとしてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩の存在
    下で行われることを特徴とする請求項２記載のデオキシ
    リボヌクレオチドの製造方法。
  6. 【請求項６】ADPまたはUDPを基質として、エフェクター
    およびNADPHを含有する水性媒体中で、コウシ脾臓から
    得られるアデノシン脱アミン酵素と接触させ、形成され
    たデオキシリボヌクレオチドをその反応混合物から分離
    することを特徴とするデオキシリボヌクレオチドの製造
    方法。
  7. 【請求項７】リボヌクレオチドを基質として、水性媒体
    中で、ミクロコッカス ルートイス（Micrococcus lute
    us）から得られるDNAポリメラーゼと接触させ、形成さ
    れたデオキシリボヌクレオチドをその反応混合物から分
    離することを特徴とするデオキシリボヌクレオチドの製
    造方法。
  8. 【請求項８】CTPを基質として、水性媒体中で、エセリ
    シア コリ（Escherichia coli）から得られるDNAポリ
    メラーゼＩと接触させ、形成されたデオキシリボヌクレ
    オチドをその反応混合物から分離することを特徴とする
    デオキシリボヌクレオチドの製造方法。
  9. 【請求項９】ヌクレオシドまたはヌクレオチドを基質と
    して、水性媒体中ヌクレオチドの存在下で、少なくとも
    以下の活性、すなわち、ヌクレオシドデオキシリボシル
    転移酵素活性、ヌクレオシドまたはヌクレオチドキナー
    ゼ活性、リボヌクレオチド還元酵素活性、アデノシン脱
    アミノ酵素活性並びにDNAポリメラーゼ活性を有する酵
    素と接触させ、形成されたリン酸エステルをその反応混
    合物から分離することを特徴とするヌクレオシドのリン
    酸エステルの製造方法。
  10. 【請求項１０】ラクトバチルス ライヒマンニイ（Lact
    obacillus leichmannii）から得られるヌクレオシドデ
    オキシリボシル転移酵素を用いることを特徴とする請求
    項９記載のヌクレオシドのリン酸エステルの製造方法。
  11. 【請求項１１】ヌクレオシドとしてデオキシリボヌクレ
    オシドを用いることを特徴とする請求項10記載のヌクレ
    オシドのリン酸エステルの製造方法。
  12. 【請求項１２】ヌクレオシドとしてデオキシヌクレオシ
    ドを用いることを特徴とする請求項10記載のヌクレオシ
    ドのリン酸エステルの製造方法。
  13. 【請求項１３】dAMPまたはdCMPを基質として、水性媒体
    中ヌクレオチドの存在下で、コウシ脾臓から得られるア
    デノシン脱アミノ酵素と接触させ、形成されたリン酸エ
    ステルをその反応混合物から分離することを特徴とする
    ヌクレオシドのリン酸エステルの製造方法。
  14. 【請求項１４】アデノシンまたはｄ−アデノシンを基質
    として、水性媒体中ヌクレオチドの存在下で、ミクロコ
    ッカス ルートイス（Micrococcus luteus）から得られ
    るDNAポリメラーゼと接触させ、形成されたリン酸エス
    テルをその反応混合物から分離することを特徴とするヌ
    クレオシドのリン酸エステルの製造方法。
  15. 【請求項１５】反応が、水性媒体中で、少なくとも以下
    の活性、すなわち、ヌクレオシドデオキシリボシル転移
    酵素活性、ヌクレオシドまたはヌクレオチドキナーゼ活
    性、リボヌクレオチド還元酵素活性、アデノシン脱アミ
    ノ酵素活性並びにDNAポリメラーゼ活性を有する酵素に
    より行われ、形成された９−（２′−デオキシリボシ
    ル）−プリンdRib−Pur′をその反応混合物から分離す
    ることを特徴とする、以下の反応図式 dRib−Pur＋Pur′dRib−Pur′＋Pur による９−（２′−デオキシリボシル）−プリンの製造
    方法。
  16. 【請求項１６】コウシ脾臓から得られるアデノシン脱ア
    ミノ酵素を用いることを特徴とする請求項15記載の９−
    （２′−デオキシリボシル）−プリンの製造方法。
  17. 【請求項１７】少なくとも１つのヌクレオシド三リン酸
    塩を基質として、水性媒体中で、少なくとも以下の活
    性、すなわち、ヌクレオシドデオキシリボシル転移酵素
    活性、ヌクレオシドまたはヌクレオチドキナーゼ活性、
    リボヌクレオチド還元酵素活性、アデノシン脱アミノ酵
    素活性並びにDNAポリメラーゼ活性を有する酵素と接触
    させ、形成されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
    オチドをその反応混合物から分離することを特徴とする
    オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの製造方
    法。
  18. 【請求項１８】コウシ脾臓から得られるアデノシン脱ア
    ミノ酵素を用いることを特徴とする請求項17記載のオリ
    ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの製造方法。
  19. 【請求項１９】ラクトバチルス ライヒマンニイ（Lact
    obacillus leichmannii）から得られるヌクレオシドデ
    オキシリボシル転移酵素を用いることを特徴とする請求
    項17記載のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
    の製造方法。
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