JP3029435B2 - 脂質分解性酵素をコードする遺伝子の分子クローニング及び発現 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は組換えDNA技術による脂肪の酵素的分解に用
いる酵素、特に洗剤添加物として使用するのに適する特
性を有する脂質分解性酵素の調製に関する。

（背 景） クリーニングに関する１つの問題は脂肪性のシミの除
去にある。現在、脂肪を含む汚れは高温と高アルカリの
組合せによりエマルジョン化され除去されている。しか
し、最近は特に脂肪性シミの除去には適さない比較的低
温、すなわち約40℃以下での洗浄が主流となっている。
それゆえより低い洗浄温度で効果的であり、高アルカリ
洗剤溶液中で安定であり、かつ固体及び液体洗剤組成物
中の保存条件下で安定な洗剤添加物に対する需要があ
る。トリグリセリドを加水分解する一群の酵素はリパー
ゼ（E.C.3.1.1.3.）である。リパーゼは真核細胞の他多
種の原核生物中にあって広く分布している。その酵素の
起源に応じて基質特異性の他に種々の条件下での安定性
を含む特性も様々である。リパーゼはこれまでに洗剤組
成物中で使用されてきたが、ここで用いられているもの
は洗濯条件下で低い洗浄効果しか示さず、さらに洗剤に
適した安定性を満していない。

現代の洗濯条件下でリパーゼ活性を示し得る脂質分解
性酵素、すなわち高洗剤濃度、高pH及び低洗浄温度の条
件で有効なものはシュードモナス・シュードアルカリゲ
ンス（Pseudomonas pseudoalcaligenes），シュードモ
ナス・スタゼリ（Pseudomonas stutzeri）及びアシネト
バクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoati
cus）種に属する特定の株（ヨーロッパ特許出願EP−Ａ
−0218272参照）から生産される。しかしこれらの微生
物種は潜在的に植物及び動物に対して病因性を有し、か
つこれらの微生物を用いたリパーゼ生産プロセスに有効
な発酵条件に関してはほとんどデータがない。

それゆえ洗剤添加物に対して望ましい特性を有する脂
質分解酵素を生産する上で有効でかつ安全な方法の開発
が望まれる。さらに、その酵素を発酵混合物の細胞外液
から直接回収し得るようその宿主生物から分泌されるこ
とが望ましい。

（関連文献） シュードモナス（Pseudomonas）種によって生産され
るリパーゼに関してはその培養条件がそれらの酵素の最
終的存在位置に強く影響することが知られている（スギ
ウラ（Sugiura），“リパーゼ"B.ボーグストロム（Borg
strom）及びH.L.ブロックマン（Brockman）編（1984）5
05〜523、エルスバイア版、アムステルダム）。しばし
ば形成するタンパク質の折りたたみ方の誤りや、タンパ
ク質の分解、タンパク質の不適正な存在位置を含む、微
生物において異質遺伝子を効果的に発現する上での問題
につき当る。ハリス（Harris）“遺伝子工学”、第４巻
（1983）アカデミックプレス版、ニューヨーク参照。大
腸菌における分泌クローニングベクターの使用は一般に
細胞周辺腔への異質遺伝子産物の輸送を可能にし、また
その生産物は時たま培養培地中に見られる。ラン（Lun
n）等、“微生物学及び免疫学における最新のトピック
ス”125（1986）59−74参照。宿主細胞として大腸菌を
用いた場合のゴツ（Gotz）等（ヌクレイックアシッズリ
サーチ（Nucleic Acids Res,）13（1985）5895−5906、
クギミヤ（Kugimiya）等（バイオケム・バイオフィズ・
リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Biophys.Res.
Comm.）141（1986）185−190）及びオデラ（Odera）等
（ジャーナル・オブ・ファーメンタル・テクノロジー
（J.Fermental.Technol.）64（1986）363−371）により
報告されているクローン化した微生物リパーゼは培養培
地中にほとんど分泌されない。

ウォルファース（Wohlfarth）及びウィンクラー（Win
kler）（ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオ
ロジー（J.Gen.Microbiol.）134（1988）433−440）は
シュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）
PAO2302株由来の新しく単離されたリパーゼ欠損変異株
の生理学的特性及び相当する遺伝子の染色体地図及びク
ローニングに関して報告している。

バチルス種、特にバチルス・サチルス株は外来及び内
在遺伝子の発現及びコードされているタンパク質産物の
分泌に関して宿主株として用いられる種々の成功をおさ
めている。レヴューについては例えばサーバス（Sarva
s）、“微生物学及び免疫学における最近のトピック
ス”125（1986）103−125、H.C.ウ（Wu）及びP.C.タイ
（Tai）編、スプリンガー・バーラグ版及びヒメノ（Him
eno）等、F.E.M.S.マイクロバイオロジカル・レターズ
（Microbiol.Letters）35（1986）17−21参照。

米国特許第3,950,277号及び英国特許明細書番号約1,4
42,418号は各々活性化因子及びカルシウムイオン及び、
又はマグネシウムイオンと合せてリパーゼ酵素を公開し
ており、それらを汚れた生地を浸し各々ポリエステル又
はポリエステル／綿混紡の生地からトリグリセリドのシ
ミ及び汚れを除去するのに使用している。公開された有
用な微生物リパーゼにはシュードモナス（Pseudomona
s），アスペルギラス（Aspergillus），ニューモコッカ
ス（Pneumococcus），スタフィロコッカス（Staphyloco
ccus），マイコバクテリウム・スベルクロシス（Mycoba
cterium tuberculosis），マイコトルラリポリティカ
（Mycotorula lipolytica）及びスクレロチニア（Scler
otinia）由来のものが含まれる。

英国特許明細者番号第1,372,034号はシュードモナス
スツゼリ（Pseudomonas stutzeri）ATCC19154株により
生産される細菌性リパーゼを含む洗剤組成物を公開して
いる。さらにこの特許はこの好ましい脂質分解性酵素が
pH6〜10の至適pH値を有し、かつこのpH範囲、好ましく
はpH7〜９で活性を示ことを公開している。（ここでシ
ュードモナス・スツゼリ（Pseudomonas stutzeri）株と
推定されている株はシュードモナスアルギノサ（Pseudo
monas aeruginosa）として再分類されている。） 英国特許出願（EP−Ａ）0130064は従来のリパーゼよ
りも高い脂質分解洗浄効率を有するフサリウム・オキシ
スポラム（Fusarium oxysporumから単離されたリパーゼ
を含む酵素性洗剤添加物を公開している。また例えば英
国特許明細書番号第1,293,613号及びカナダ特許第835,3
43号も脂質分解性洗剤添加物を公開している。

ヨーロッパ特許出願EP−Ａ−0205208及びEP−Ａ−020
6396は洗剤へのシュードモナス（Pseudomonas）及びク
ロモベクター（Chromobacter）由来のリパーゼの使用を
公開している。洗剤添加物としてのリパーゼに関する包
括的レヴューに関してはアンドリー（Andree）等のジャ
ーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（J.Ap
pl.Bicohem.）２（1980）218−229参照せよ。

本発明の概要 洗剤組成物への使用に適した脂質分解性酵素を生産す
る形質転換微生物細胞を含む新しい組成物及びそれらの
調製法が提供されている。アルカリ性pHで活性を有し、
洗濯条件下で安定な脂質分解性酵素をコードするDNA配
列を含む発現カセットで宿主微生物細胞をトランスホー
ムする。脂質分解性酵素の調製法には微生物システムに
おけるクローニング及び発現及びDNAホモロジーに基づ
くスクリーニングが含まれる。

２つのDNA配列も提供されており、これらの配列は各
々シュードモナスシュードアルカリゲンス（Pseudomona
s Peudoalcaligenes）株及びシュードモナスアルギノサ
（Pseudomonas aeruginosa）株に由来する脂質分解性酵
素をコードする遺伝子を含んでいる。

特定のシュードモナス（Pseudomonas）種由来のリパ
ーゼ遺伝子はリパーゼ生産に関して特に興味深い。

図の簡単な説明 第１図；脂質分解性酵素遺伝子クローニングの戦略。
記号については第２図の脚注参照。

第２図;pAT1の制限地図。プラスミドpAT1における多
くの制限酵素認識部位が確認されている。

使用されている記号： −Ori E.coli;大腸菌の複製オリジン −Ap^r;アンピシリン耐性をコードするpUN121の遺伝子 −Tc^r;テトラサイクリン耐性をコードするpUN121の遺
伝子 −cI;cIリプレッサーをコードするバクテリオファー
ジラムダの遺伝子 シュードモナススツゼリ（Pseudomonas stutzeri）Th
ai IV17−１（CBS461.85）の染色体DNAのSan3A部分分解
物を、pUN121にライゲーションした位置はBcl I/San3A
で示されている。脂質分解活性をコードする遺伝子の位
置は点線で示してある。

第３図;pAT3の制限地図。記号は第２図で使用したも
のと同様。

第４図;pET1の制限地図。記号は第２図で使用したも
のと同様。

第５図;pET3の制限地図。記号は第２図で使用したも
のと同様。

第６図;pAM1の制限地図。記号は第２図で使用したも
のと同様。

第７図;pM6−５の制限地図。記号は第２図で使用した
ものと同様。

第８図;pP5−４の制限地図。記号は第２図で使用した
ものと同様。アシネトバクター・カルコアセチカス（Ac
inetobacter calcoaceticus）GR Ｖ−39（CBS460.85）
の染色体DNAのEcoR I^＊部分消化物をpUN121にライゲー
ションした位置はEcoR I/EcoR I^＊で示してある。

第９図;SDS10−15％グラジェントファストゲル（ファ
ルマシア社） 第9A図；コマージブリリアントブルー染色後 第9B図；β−ナフチルアセテート／ファストブルBB染
色後 レーン1;95℃、10分間SDSとともに加熱した、pUN121を
宿す大腸菌JM101hsd S rec A株由来の分解物。

レーン2;95℃、10分間SDSとともに加熱した、PET3を宿
す大腸菌JM101hsd S rec A株由来の分解物。

レーン3;95℃、10分間SDSとともに加熱した、P.スツゼ
リ（stutzeri）Thai IV17−１株由来の培養物上清。

レーン4;95℃、５分間SDSとともに加熱したこと以外は
レーン２と同様のサンプル。

レーン5;95℃、５分間SDSとともに加熱したこと以外は
レーン３と同様のサンプル。

レーン6;室温10分間SDSとともにインキュベートしたこ
と以外はレーン２と同様のサンプル。

レーン7;室温10分間SDSとともにインキュベートしたこ
と以外はレーン３と同様のサンプル。

レーン8;ファルマシア社の低分子量タンパク質マーカ
ー。

第10図；コマージブリリアントブルー染色後のSDS13
％ポリアクリルアミドゲル。

レーン1;精製Ｍ−リパーゼ。

レーン2;低分子量タンパク質マーカー（ファルマシア
社）。

第11図;pTMPv18Aの制限地図。

使用した記号： −Ori E.coli;pBR322ベクター由来の大腸菌の複製オ
リジン −f 1 ori;繊維状バクテリオファージf1由来の複製オ
リジン −P_T7;インビトロ転写物を調製するためのバクテリオ
ファージT7のプロモーター −Ap^r;アンピシリン耐性をコードする遺伝子 −Lip;M−１リパーゼをコードする遺伝子 第12図；第12図はＭ−１リパーゼ遺伝子のヌクレオチ
ド配列（すなわち最初の942ヌクレオチド）及びそれに
由来するＭ−１リパーゼのアミノ配列を示している。終
止コドンTGAはアステリスクで示されている。Ａボック
スはリパーゼタンパク質の活性中心を表わしている。矢
印は推定されるシグナルペプチダーゼ切断部位を示して
いる。成熟リパーゼタンパク質のアミノ末端配列は下線
が引かれている。

第13図;pSW103の制限地図。

使用されている記号； −Ori E.coli;pBR322ベクター由来の大腸菌の複製オ
リジン −Plac;大腸菌lacオペロンのプロモーター −Ap^r;アンピシリン耐性をコードする遺伝子 −Lip;PAO1リパーゼをコードする遺伝子 第14図;PAOリパーゼ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
（すなわち内部のSal I部位から）及びそれに由来するP
AOリパーゼのアミノ酸配列。終止コドンTAGはアステリ
スクで示してある。Ａボックスはリパーゼタンパク質の
活性中心を表わしている。

第15図；プラスミドpBHAM1及びpBHCM1の構築。

使用している記号： −Bacillus ori;バチルスの複製オリジン −Km^r;カナマイシン耐性をコードするpUB110の遺伝子 −Cm;クロラムフェニルコール耐性をコードするTn9ト
ランスポゾン遺伝子 −P_HpaII;プラスミドpUB110のHpa IIプロモーター他
の記号は第11図と同様である。

第16図；第16図はプラスミドpBHAM1N1の構築を示して
いる。記号は第15図で使用しているものと同様である。

第17図；第17図はプラスミドpTZN1M1の構築を説明し
ている。使用している記号は； −lac Zα；β−ガラクトシダーゼのα−ドメインを
コードするLac遺伝子のＮ末端部分 −P_Lac;大腸菌lacオペロンのプロモーター 他の記号は第11図と同様である。

第18図；第18図はプラスミドpMCTM1の構築を示してい
る。使用している記号は； −Cm^r;クロラムフェニコール耐性をコードする遺伝子 −P_tac;大腸菌のハイブリッドtrp−lacプロモーター 他の記号は第11図及び第15図と同様である。

第19図；トランスホームした大腸菌細胞から生産され
るＭ−１リパーゼタンパク質のイムノブロット検出。

レーンＡ−Ｄは次の構築物を宿す大腸菌細胞の細胞周
辺腔画分を含む： レーンA;pTZ18RN レーンB;pTZN1M1 レーンC;pMCM1 レーンD;シュードモナス・シュードアルカリゲンス
（Pseudomonas pseudoalcaligens）Ｍ−１株由来の精製
Ｍ−１リバーゼ。マーカータンパク質（アマーシャム社
レインボー）の分子量は右側にkDaで示してある。

第20図；プラスミドpBHM1N1の構築。記号は第15図の
ものと同様である。

第21図；インビトロで合成した³⁵Sラベル化タンパク
質のオートラジオグラフ。

レーンＡ−D;M−１リパーゼに対するモノクローナル
抗体によるインビボで翻訳されたタンパク質の免疫沈殿
化。

レーンＥ−H;次のプラスミドのインビトロにおける転
写／翻訳産物： レーンＡ及びE;pTZ18RN レーンＢ及びF;pTMPv18A レーンＣ及びG;pMCTM1 レーンＤ及びH;pMCTbliM1 第22A図及び第22B図；バクテリアDNA中のリパーゼを
コードする配列の検出。プラスミドDNA5ナノグラム及び
染色体DNA5マイクログラムを示されている制限酵素で消
化し、0.8％アガロースゲルで分画後ニトロセルロース
フィルターにブロッティングし各々pET3及びpTMPv18Aの
ニックトランスレーションした挿入物とハイブリダイズ
させた。

第22A図；第22A図はpET3EcoR I挿入物によるハイブリ
ダイゼーション後のオートラジオグラフ。

第22B図；第22B図はpTMPv18A Xho I−EcoR V挿入物
によるハイブリダイゼーション後のオートラジオダラフ
を示している。

レーンA;プラスミドpTMPv18AのHind III/SSt I消化物 レーンB;プラスミドpET3のEcoR I消化物 BRL DNAゲルマーカーMW;0.5、1.0、1.6、2.0、3.0、
4.0、5.0、6.0、７、８、９、10、11、12kb。

レーンC;P.シュードアルカリゲンス（Pseudoalcalige
nes）Ｍ−１（CBS473.85）のSal I消化物 レーンD;P.シュードアルカリゲンス（Pseudoalcalige
nes）IN II−５（CBS468.85）のSal I消化物 レーンE;P.アルカリゲンス（alcaligenes）DSM50342
のSal I消化物 レーンF;P.アルギノサ（aeruginosa）PAC 1R（CBS13
6.89）のSal I消化物 レーンG;P.アルギノサ（aeruginosa）PAO2302（６−
１）のSal I消化物 レーンH;P.スツゼリ（stutzeri）Thai IV17−１（CBS
461.85）のSal I消化物 レーンI;P.スツゼリ（stutzeri）PG−Ｉ−３（CBS13
7.89）のSal I消化物 レーンJ;P.スツゼリ（stutzeri）PG−Ｉ−４（CBS13
8.89）のSal I消化物 レーンK;P.スツゼリ（stutzeri）PG−II−11.1（CBS1
39.89）のSal I消化物 レーンL;P.スツゼリ（stutzeri）PG−II−11.2（CBS1
40.89）のSal I消化物 レーンM;P.フラジ（fragi）Serm.DB1051（＝ファーム
BP1051）のSal I消化物 レーンN;P.グラジオリ（gladioli）（CBS176.86）のS
al I消化物 レーンO;A.カルコアセチカス（calcoaceticus）Gr−
Ｖ−39（CBS460.85）のSal I消化物 レーンP;S.オーレウス（aureus）（ATCC27661）のSal
I消化物 特定の態様の説明 本発明に従がい新しいDNA構築物及び脂質分解性酵素
を生産する微生物を含む新しい組成物が提供されてい
る。本発明で興味が持たれるリパーゼは約８から10.5の
至適pH値を有し、60℃以下の温度、好ましくは30〜40℃
でかつ約７〜11のpH値、好ましくは約９〜10.5のpH値の
洗浄条件下約10g/までの濃度で洗浄組成物を含む水溶
液中で効果的なリパーゼ活性を示す。望ましい特性を有
するリパーゼをコードするDNA配列を含むプラスミド構
築物が真核細胞又は原核細胞のいずれかの宿主細胞をト
ランスホームするのに用いられる。その後このトランス
ホームした宿主細胞を増殖させこの遺伝子が発現され
る。

リパーゼ遺伝子を単離するのに用いる技術は当分野で
はよく知られており、これらには合成、ゲノムDNAから
の単離、cDNAからの調製又はその組換えなどが含まれ
る。この遺伝子を取扱う種々の技術はよく知られてお
り、これらには制限切断、消化、切断、ライゲーショ
ン、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、リンカ
ー及びアダプターの使用等が含まれる。マニアチス（Ma
niatis）等、“モレキュラークローニング”コールドス
プリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハ
ーバー、ニューヨーク、1982年参照。

一般に、この方法は、望ましい特性を有するリパーゼ
を発現する生物からのゲノムライブラリーの作成を含ん
でいる。これらのリパーゼの例にはシュードモナス（Ps
eudomonas）及びアシネトバクター（Acinetobacter）か
ら得られるもの、特にシュードモナスアルカリゲンス
（Pseudomonas alcaligenes），シュードモナス・シュ
ードアルカリゲンス（Pseudomonas pseudoalcaligene
s），シュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aerugin
osa），シュードモナス・スツゼリ（Pseudomonas stutz
eri）及びアシネトバクター・アルコアセチカス（Acine
tobacter calcoaceticus）種に属する株から得られるも
のがある。これらのリパーゼ及び株については、ここで
参考として引用するEP−Ａ−0218272に十分記述されて
いる。供与微生物のゲノムを単離し、ついでSau3Aのよ
うな適当な制限酵素でこれを切断する。得られた断片を
予め適合する制限酵素で切断したベクター分子に結合す
る。適当なベクターの例には制限エンドヌクレアーゼBc
l Iで切断し得るプラスミドpUN121がある。さらにその
アミノ酸配列はリパーゼ遺伝子に関してmRNAから調製さ
れるcDNA又はゲノムライブラリー又は供与細胞由来のDN
Aをスクリーニングするのに用いるプローブを設画する
のに使用し得る。

さらに、ハイブリダイゼーションプローブとしてその
リパーゼDNA又はその断片を用いることにより、他の微
生物中に存在する構造的に関連する遺伝子のクローニン
グも容易に行ない得る。本発明は特にEP−Ａ−0218272
に述べられている生物に由来するリパーゼ遺伝子のヌク
レオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用
いた、脂質分解活性を示す生物からの遺伝子の単離に関
する。別に、これらのオリゴヌクレオチドは目的とする
リパーゼのアミノ酸配列からも誘導し得る。これらのプ
ローブはその全配列よりもかなり短かくすることができ
るが少なくとも10個、好ましくは少なくとも14個のヌク
レオチド長であるべきである。またその遺伝子の全長ま
でで、好ましくは多くとも500個、より好ましくは多く
とも300個のヌクレオチド長のより長いオリゴヌクレオ
チドも有用である。RNA及びDNAプローブの両方とも使用
し得る。

使用に際し、一般的にこのプローブは検出様式に応じ
てラベル化され（例えば³²P、³⁵S、³H、ビオチン又はア
ビジンによる）、ついで遺伝子を探索する生物に由来す
る一本鎖DNA及びRNAと共にインキュベートする。一本鎖
及び二本鎖（ハイブリダイズしたもの）DNA（DNA/RNA）
を分離後（一般的にはニトロセルロースペーパーを使用
する）ラベルによりハイブリダイゼーションを検出す
る。オリゴヌクレオチドの使用に適したハイブリダイゼ
ーション技術は当分野ではよく知られている。

通常プローブは簡単に同定し得る検出可能ラベルと共
に使用されるが、非ラベル化オリゴヌクレオチドもラベ
ル化プローブの前駆体として、並びに二本鎖DNA（又はD
NA/RNA）の直接的検出を提供する方法で使用するのに有
用である。従って、“オリゴヌクレオチドプローブ”と
いう語句はラベル化型及び非ラベル化型の両方を意味す
る。

本発明の好ましい態様の１つの場合シュードモナス・
シュードアルカリゲンス（Pseudomonas pseudoalcalige
nes）のリパーゼ由来の配列をCBS473.85（Ｍ−１）株か
らクローン化する。驚くべきことに、かつて配列決定さ
れたシュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aerugino
sa）PAO（ATCC15692）のクローン化したリパーゼはＭ−
１のリパーゼ遺伝子配列と高い配列ホモロジーを示し
た。さらに驚くべきことにこの高い配列ホモロジーはＭ
−１株のリパーゼ遺伝子配列及び多くのシュードモナス
スツゼリ（Pseudomonas stutzeri）単離物〔PG−Ｉ−３
（CBS137.89）、PG−Ｉ−４（CBS138.89）,PG−II−11.
1（CBS139.89）、PG−II−11.2（CBS140.89）〕及びシ
ュードモナスアルカリゲンス（Pseudomonas alcaligene
s）DSM50342の染色体DNAの間にも見受けられた。この明
細書中で用いられている“高度のハイブリダイゼーショ
ン”とは少なくとも67％のホモロジーを有する少なくと
も300bpの連続するDNAと定義される。

P.アルギノサ（aeruginosa）及びP.スツゼリ（stutze
ri）のリパーゼ酵素を生産し、SLMテストで洗浄性能の
テストを行った。驚くべきことにＭ−１リパーゼ遺伝子
と高度のホモロジーを示す全ての酵素は、現代の洗浄プ
ロセスを真似た条件下で優れた安定性、有効性及び性能
を示すことが分った。オウスベル（Ausubel）等の方法
に従がい（カレントプロトコールス・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular B
iology）,1987−1988）、サウザンハイブリダイゼーシ
ョン技術でこのレベルのホモロジーを検出し得る。この
発見されたホモロジーはEP−Ａ−0205208及びEP−Ａ−0
206390に述べられているP.グラジオリ（gladioli）又は
EP−Ａ−0305216に述べられているフミコラ・ランギノ
サ（Humicola languinosa）のリパーゼには観察されな
かった。

このDNA挿入断片を含むクローンは大腸菌（クン（Kuh
n）等、ジーン（Gene）44（1986）253−263）及びB.サ
チラス（subtilis）（グリクザン（Gryczan）及びドゥ
ブナウ（Dubnau），ジーン（Gene）20（1982）459−46
9）に対して開発された直接又はポジティブ選択操作を
用い同定し得る。大腸菌に対するポジティブ選択ベクタ
ーの例としてはpUN121（ニルソン（Nilsson）等ヌクレ
イックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Res.）11（19
83）8019−8030）がある。

さらに、脂質分解性酵素を発現するクローンは例えば
ローダミンＢとともにトリブチリン又はオリーブ油を含
む寒天培地などの（クーカー（Kouker）及びジャガー
（Jaegar），アプライドエンバイロメンタルマイクロバ
イオロジー（Appl.Env.Microbiol.）53（1987）211）適
当なインジケータプレート検定法を用いて同定し得る。
さらに複製コロニーはエステラーゼ活性を検出するため
に述べられた操作（ヒルガード（Hilgerd）及びスピジ
ゼン（Spizizen），ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（J.Bacteriol.）114（1978）1184）に基づく軟寒天
技術改良法を用いてスクリーニングし得る。別に、脂質
分解性酵素を発現するクローンはウォルファース（Wohl
farth）及びウィンクラー（Winkler）（ジャーナル・オ
ブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（J.Gen.Microbio
l.）134（1988）433−440）により述べられているよう
な適当なリパーゼ欠損受容株における遺伝子的相補によ
り同定し得る。

一度完全な遺伝子がcDNAにしろ染色体DNAにしろ同定
されればそれを発現させるための種々の方法で取り扱う
ことができる。微生物宿主には例えば大腸菌、クルイベ
ロミセス（Kluyveromyces），アスペルギラス（Aspergi
llus），バチルス（Bacillus）及びシュードモナス（Ps
eudomonas）種のような細菌、イースト及び菌類を用い
ることができる。それゆえ、その遺伝子はそのリパーゼ
の野生型転写及び翻訳調節領域を認識する宿主中で発現
されることから、野生型５′及び３′調節領域を有する
全遺伝子が適当な発現ベクター中に導入されなければな
らない。原核性細胞由来の複製システムを有する種々の
発現ベクターが存在する。例えばポーウェルス（Pouwel
s）等、“クローニングベクター、ラボラトリーマニュ
アル”、エルスビア版1985参照。これらの複製システム
はトランスホーマントの選択を可能にするマーカーを提
供し、かつ遺伝子を挿入し得る簡便な制限部位を提供す
るよう開発されてきている。

天然の野生型転写及び翻訳調節領域を認識しない宿主
中でその遺伝子を発現する場合、別の操作が必要とな
る。簡便には、種々の３′転写調節領域が知られている
ことから、これを終止コドンの下流に挿入することがで
きる。構造遺伝子の上流の５′側非コード領域はエンド
ヌクレアーゼ制限処理、Bal31切除等で除去し得る。別
に構造遺伝子の５′末端近傍に便利な制限部位がある場
合には、その構造遺伝子を制限処理し、かつ構造遺伝子
の欠失したヌクレオチドを補うアダプターがその構造遺
伝子をプロモーター領域に結合するのに用いられる。

５′−３′の転写方向に調節の誘導を可能にする調節
配列も含む転写調節領域及び翻訳開始領域、好ましくは
指定された宿主細胞により認識される分泌用リーダー配
列を含む脂質分解性酵素をコードする読み枠及び翻訳及
び転写終止領域を有する発現カセットを提供する種々の
戦略が用いられる。さらにこの発現カセットは少なくと
も１個のマーカー遺伝子を含む。この開始及び終止領域
は宿主細胞中で機能するもので、これらは同種（その宿
主に由来するもの）又は異種でその宿主に由来するも
の、もしくは異種で別の起源又は合成DNA配列に由来す
るもののいずれかである。このようにこの発現カセット
は全体的に又は部分的に天然のものに由来することもあ
るし、全体的に又は部分的に宿主細胞と同種の起源に由
来することもあり、もしくはその宿主細胞と異種の起源
に由来することもある。本発明の種々のDNA構築物（DNA
配列、ベクター、プラスミド、発現カセット）は単離さ
れ、及び、又は精製又は合成されるもので、従って“天
然に存在するもの”ではない。

適当な調節配列の選択には発現に影響する次の因子が
考慮される。転写調節についてはメッセンジャーRNAの
量及び安定性が遺伝子産物の発現を左右する重要な因子
である。mRNAの量は特定の遺伝子のコピー数、プロモー
ターの相対的効率及びエンハンサー又はリプレッサー等
のプロモーターを調節する因子により決定する。mRNAの
安定性はリボヌクレアーゼに対するmRNAの感受性に支配
される。一般にエクソヌクレアーゼ切断はmRNAの末端の
構造様式パリンドローム構造、修飾ヌクレオチドあるい
は特異的ヌクレオチド配列の存在により阻害される。エ
ンドヌクレアーゼ切断はmRNA内の特異的認識部位で起こ
ると考えられており、安定なmRNAはこれらの部位を欠い
ているのであろう。また高いレベルで翻訳を行うmRNAは
mRNA上のリボゾームの存在によっても分解から保護され
ているといういくつかの証拠もある。

翻訳については、mRNAが存在するならばその発現は開
始速度（mRNAへのリボゾームの結合）、伸長速度（mRNA
上のリボゾームの移動）、翻訳後の修正速度及び遺伝子
産物の安定性により調節され得る。伸長速度はおそらく
使用するコドンに影響される。すなわち少ないtRNAに対
するコドンの使用は翻訳速度を減少させる。開始はコー
ド配列の始めの直前の領域で起こると考えられている。
原核生物においてほとんどの場合、この領域にはAGGAの
コンセンサスヌクレオチド配列が含まれており、これは
シャイン・ダルガルノ配列と呼ばれている。この配列は
リボゾーム結合部位となる特徴を有する一方、この配列
の上流及び下流の配列は翻訳開始に影響しうることは明
白である。

また、別の証拠は、おそらく開始部位をリボゾームが
認識する構造様式の形成によってリボゾーム結合に影響
を与えうるコード領域内のヌクレオチド配列の存在も指
摘している。開始コドンATGに対するAGGA配列の位置は
発現に影響を与え得る。従って特定の発現速度を決定す
るのはこれら全ての因子の相互作用による。しかし、発
現される遺伝子はこれら全ての因子の組合せを展開して
特定の発現速度を生み出してきた。高いレベルの遺伝子
産物を生ずる発現システムの設計は、発現に影響すると
決定された特定の領域だけでなく、それらの領域（配
列）が互いにどのように影響し合うかを考慮しなければ
ならない。

代表的な転写調節領域又はプロモーターには例えば工
業的生産に用いられる株中で過剰発現される遺伝子由来
の配列が含まれる。さらに転写調節領域には、例えば生
育培地中の栄養物又は発現産物の有無又は温度等により
調節される構造遺伝子の発現を可能にする調節配列も含
まれる。例えば原核細胞において構造遺伝子の発現はバ
クテリオファージラムダO_Lオペレーター及び温度感受性
リプレッサーとともにバクテリオファージラムダP_Lプロ
モーターを含む調節配列を用いると温度によって調節で
きる。このプロモーターの調節はリプレッサーとオペレ
ーター間の相互作用を通して行なわれる。バチルス（Ba
cillus）のアミラーゼとプロテアーゼの遺伝子の調節配
列を用いた脂質分解性酵素を発現し得る発現カセットは
特に興味深い。目的の構造遺伝子はリボゾーム結合部位
の下流に結合され、そうすることにより転写調節領域及
び翻訳開始領域の調節制御下に置かれることになる。

また分泌リーダーシグナル及びプロセシングシグナル
をコードする配列を構造遺伝子の５′側に付けることに
より融合遺伝子が調製される。もし選択した宿主細胞中
で機能的であるなら、リパーゼ遺伝子それ自体のシグナ
ル配列も用いられる。代表的異種分泌リーダー配列には
ペニシリナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及びイース
トのα因子の分泌リーダー配列が含まれる。目的とする
構造遺伝子と分泌リーダー配列を適正な読み枠で融合す
ることにより成熟した脂質分解性酵素が培養培地中に分
泌される。

発現カセットは適当な宿主微生物中エピソーム的維持
を可能にする複製システム内に含まれていてもよいし、
また複製システムなしに提供され、宿主ゲノムに組込ま
れる場合もある。宿主微生物への種々のDNA構築物のト
ランスホーメーションの方法は本発明にとってあまり重
要ではない。DNAは、リン酸カルシウム沈殿化DNA、接
合、エレクトロポレーション、細胞のウィルスとの接触
によるトランスフェクション、細胞へのDNAのマイクロ
インジェクション等を用いたトランスホーメーション等
の従来技術に従がい宿主細胞中に導入される。この宿主
細胞は細胞自体でももよいしプロトプラストでもよい。

宿主生物としては脂質分解性酵素の生産と抽出に適し
たものであればどの微生物でもよい。また、この宿主生
物は生産した酵素を分泌でき、それにより無細胞発酵液
からその酵素を回収し得ることが望ましい。また宿主微
生物は非病原性生物であることが望ましい。上記の条件
を満足する宿主生物の例には大腸菌、シュードモナスプ
チダ（Pseudomonas putida）及びバチルス（Bacillus）
株、特にB.サチラス（subtilis）及びB.リチェニホルミ
ス（licheniformis），ストレプトミセス（Streptomyce
s）株及び各々アスペルギラス（Aspergillus）及びクル
イベロミセス（Kluyveromyces）等の菌類及びイースト
株が含まれる。

宿主株は研究用の株でもよいし、又工業用の微生物株
も含みうる。工業用の菌株はファージ感染又はトランス
ホーメーションなど遺伝的変化に耐性を持つ特徴があ
る。この株は安定であり、また胞子を形成し得るものと
形成し得ないものがある。それらは独立栄養性であり、
またα−アミラーゼや種々のプロテアーゼのような内在
性タンパク質産物を高収率で提供しうるよう変えられ
る。工業生産プロセスにおいて得られる内在性タンパク
質産物の収量は少なくとも5g/（0.5％w/v）にまで高
め得る。また工業用株はDNaseを分泌し、これが培地中
のDNAを分解することにより遺伝的変化に対する耐性を
与えている。

一度構造遺伝子を適当な宿主の中に導入すれば、その
宿主細胞を増殖しその構造遺伝子を発現させ得る。脂質
分解活性の生産レベルはその遺伝子が由来する本来の株
と同様かもしくはそれより高い。その宿主細胞を適当な
培地中で高密度に増殖させて富栄養培地を作る。プロモ
ーターが誘導可能な場合、例えば温度変化、貧栄養又は
過剰の代謝産物又は栄養物などの誘導条件が用いられ
る。

分泌が行なわれる場合、発現産物は従来法により生育
培地から単離される。生産された脂質分解性酵素の放出
は希薄な界面活性剤溶液で促進し得る。分泌が行なわれ
ない場合、宿主細胞を収穫し、従来の条件の従って分解
する。それから望ましい産物を単離しクロマトグラフィ
ー、電気泳動法、溶剤抽出、相分離等の既知技術に従っ
て精製する。

本組成物は巾広い方法で使用し得る。トランスホーム
した宿主微生物は洗剤組成物で有用となる特性を有する
リパーゼ生産を増加するのに使用し得る。また、クロー
ン化したリパーゼ遺伝子は、エステラーゼではなくリパ
ーゼとしての脂質分解性遺伝子の同定を含むリパーゼ遺
伝子のスクリーニングに使用し得る。

またそれらは、必要とされる修正した特性を有するリ
パーゼを生ずるランダム又は部位指定突然変異誘発に関
する従来技術を用いて酵素工学で使用される。

脂質分解性酵素組成物は一般に洗浄組成物で用いられ
る洗剤及び別に添加される成分を含む洗濯組成物に使用
し得る。これらの成分には、少なくとも１種の界面活性
剤、複合リン酸、アルカリ金属ケイ酸塩及び重炭酸塩な
どの柔軟剤、アルカリ金属硫酸塩などのファイラー、プ
ロテアーゼ及びアミラーゼなどの酵素、漂白剤、及び香
料、ケイ光漂白剤などのその他の化合物が含まれ得る。

本発明に従がう酵素的洗浄組成物において、そのリパ
ーゼ活性は１〜20,000TLU/g（組成物）の範囲であるこ
とが好ましく、一方タンパク質分解酵素活性は50〜10,0
00デルフトユニット（Delft Units）/g（洗浄組成物）
の範囲であることが好ましい。1TLU（真リパーゼ単位）
はpH8.0、25℃でオリーブ油／アラビアゴムエマルジョ
ンから放出される、１μmole NaOH/minと等価の滴定値
をもつ脂肪酸と定義される。テルフトユニットはジャー
ナル・オブ・アメリカン・オイル・ケミカル・ソサイア
ティ（J.Amer.Oil Chem.Soc.）60（1983）1672に定義さ
れている。

本発明の洗剤は通常の方法、例えば各成分を一緒に混
合すること、又は予備混合物を調製し、つづいて他の成
分と混合することにより調合される。ある調合経路で
は、１つ以上のリパーゼ調製物を１つ以上の他の化合物
と混合して所定の酵素活性濃縮物を作り、それからこの
濃縮物を他の望ましい成分と混合する。

本発明の脂質分解性酵素は酵素性洗剤添加物の形で使
われることが望ましい。またこの添加物には例えば現在
の洗剤で使用し得るプロテアーゼ及び／又はアミラーゼ
など他の１つ以上の酵素及び例えば非イオン性、塩、安
定化剤及び／又はコーティング剤など一般にこの分野で
用いられている他の１つ以上の成分が含まれる。酵素性
洗剤添加物にはリパーゼに加えてプロテアーゼ及び場合
によってはα−アミラーゼを含み得る。このタンパク質
分解性酵素はこの調合物中の脂質分解性酵素とうまく適
合する。一般に酵素性洗剤添加物を当分野で知られてい
る１個以上の洗剤及び他の成分と混合し洗剤を調合す
る。一般に酵素性洗剤添加物は10²〜10⁷TLU/g（添加
物）の範囲で用いられる一方、場合により存在するタン
パク質分解活性は５×10⁴〜10⁶デルフトユニット/gの範
囲である。

本発明の酵素性洗剤添加物は例えば一般に当分野で知
られている方法によって調製される顆粒又は粒（pril
l）の形をしている。例えば英国特許第1,324,116号及び
第1,362,365号及び米国特許第3,519,570号、第4,106,99
1号及び第4,242,219号参照。

酵素性洗剤添加物は例えばプロピレングリコールなど
の酵素安定化剤と共に液体状とすることもできる。また
それらは可溶性又は不溶性サポートに固定するか、又は
１種以上の安定化剤の存在下水性又は無水溶液中の有機
性又は無機性スラリー、エマルジョン又はカプセルの形
状とすることができる。このような添加剤は液体洗剤中
で用いることが望ましい。

以下に述べる例は説明のためのものであり発明を制限
するものではない。

実 験 一般的なクローニング技術はマニアチス（Maniatis）
等（“モレキュラークローニング、ラボラトリーマニュ
アル”コールドスプリングハーバーラポラトリー、198
2、CSH、ニューヨーク）により報告されているものを用
いた。全てのDNA修正酵素は市販されているものを用い
た。それらは業者の説明書に従って用いた。DNA精製及
び分離用の物質及び装置は業者の説明書に従って使用し
た。

例 １ トリアシルクリセロール・アシルヒドロラーゼの分子ク
ローニング A.DNA及び選択ベクターの起源 EP−Ａ−0218272は洗剤への使用に適したリパーゼを
生産する数種のバクテリア株を公開している。その中の
アシネトバクターカルコアセチカス（Acinetobacter ca
lcoaceticus）GrV−39（CBS460.85）、シュードモナス
スツゼリ（Pseudomonas stutzeri）Thai IV 17−１（CB
S461.85）、シュードモナス・シュードアルカリゲンス
（Pseudomonas Psudoalcaligenes）Ｍ−１（CBS473.8
5）が脂質分解性遺伝子の起源として選択した。

アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝
子及びバクテリオファージラムダのcIレセプター遺伝子
を有するプラスミドベクターpUN121（ニルソン（Nilsso
n）等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nacleic A
cids Res.）11（1983）8019）はM.ウールン博士（王立
技術研究所、生化学科、スウェーデン・ストックホルム
Ｓ−10044、テクニクリンゲン（Teknikringen）10）か
ら入手した。テトラサイクリン遺伝子の転写はcIリプレ
ッサーにより妨がれる。外来DNAの単一の制限部位（Bcl
I、Sma I、Hind III及びEcoR I）への挿入はテトラサ
イクリン遺伝子を活性化する。このことは８μg/mlテト
ラサイクリン及び50μg/mlアンピシリンを含むルリア
（Lurla）培地寒天プレート上で組換えトランスホーマ
ントの直接的（ポジティブ）選択を可能にする。

B.遺伝子ライブラリーの調製（第１図参照） プラスミド及び染色体DNAはアンドレオリ（Andreol
i）（モレキュラーアンドゼネラルジェネティクス（Mo
l.Gen.Genet.）199（1985）372−380）により報告され
ている方法で単離した。Thai IV 17−１及びＭ−１から
単離した各染色体DNAをSan3Aで部分消化した。それから
そのDNAをT4DNAリパーゼを用いマニアチス（Maniatis）
等（上述）により報告されている方法に従がいBcl Iで
消化したpUN121DNAにライゲートし大腸菌JM101hsd S re
c A株（ダガート（Dagert）及びアーリッヒ（Ehrlic
h），ジーン（Gene）６（1979）23−28）のコンピテン
ト細胞にトランスホームした。大腸菌JM101hsd S rec A
はファバゲン・コレクション（受理番号PC2495）（オラ
ンダウレット（Utrecht）から入手した。ルリア培地寒
天プレート中８μg/mlのテトラサイクリンに耐性のトラ
ンスホーマントを選択した。

C.トランスホーマントのスクリーニング 上記のようにして得られた遺伝子ライブラリーのレプ
リカプレートを作り、以下の２つの操作を用い脂質分解
活性でスクリーニングした。第１の操作では複製コロリ
ーをトリブチリン含有のペプトン寒天培地上の脂質分解
活性でスクリーニングした。脂質分解活性は濁った脂質
エマルジョンの分解によるコロニー周辺の透明領域（ハ
ロー）として検出した。第２の操作においては複製コロ
ニーを軟寒天重層技術を用いてエステラーゼ活性でスク
リーニングした。この方法はヒルガード（Hilgerd）及
びスピジゼン（Spizizen）の方法（ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（J.Bactoriol.）114（1987）1184）
に基づいている。基本的には0.4％低融点アガロース、
0.5Mリン酸カリウム（pH7.5）、アセトンに溶解した0.5
mg/β−ナフチルアセテート及び0.5mg/ファースト
ブルーBB（例２参照）の混合物をトランスホーマントに
注ぐと、数分以内にエステラーゼ又はリパーゼ活性を有
するコロニーは紫色に変色する。

Thai IV 17−1/pUN121遺伝子バンクから得た1200個の
テトラサイクリン耐性トランスホーマントのうち３個が
トリブチリン寒天プレート上にハローを作った。Ｍ−1/
pUN121遺伝子バンク由来の、テストした12000個の組換
えトランスホーマントのうちわずか１個のクローンが弱
い脂質分解活性を示した。

このトリブチリンポジティブクローンを2TY培地）16g
/バクトトリプトン、10g/バクトイーストエクスト
ラクト、5g/ NaCl、pH7.0）中一晩増殖させ、ついで
プラスミド含量（下の1D参照）及び脂質分解活性の指標
となる種々のβ−ナフチル基質の転換能（例2A参照）の
両方について検定を行った。

D.プラスミドの単離 D.1 Thai IV 17−１リパーゼ遺伝子の包含化 Thai IV 17−1/pUN121トランスホーマントから単離し
たプラスミドはpAT1及びpAT3と命名した。それらの構造
を各々第２図及び第３図に示す。pAT2と命名した第３の
クローンはpAT1構築物と同じプラスミドを宿していた。
脂質分解活性をコードする遺伝子はpAT1の2.7kb EcoR I
断片内（第２図、点線）及びpAT3の3.2kb EcoR I断片内
（第３図、点線）に位置する。これら２つのEcoR I断片
をDNA配列決定用及び高収率脂質分解活性獲得用に適当
なベクターにサブクローンした。

pUN121ベクターへのpAT1由来の2.7kb EcoR I断片のク
ローニングにより組換えプラスミドpE1を作った（第４
図）。プラスミドpET1を宿す大腸菌JM101hsd S rec A株
はCBS157.87として、1987、２月５日CBSに登録された。

pUN121ベクターへのpAT3由来の3.2kb EcoR I断片のク
ローニングにより組換えプラスミドpET3を作った（第５
図）。プラスミドpET3を宿す大腸菌JM101hsd S rec A株
はCBS155.87として、1987、２月５日CBSに登録した。

D.2 Ｍ−１リパーゼ遺伝子の包含化 pAM1と命名されたＭ−1/pUN121トランスホーマントか
ら単離した組換えプラスミドを単離し、特性を明らかに
した（第６図）。しかし、pAM1の脂質分解活性の生化学
的特性はこのプラスミドが目的とするリパーゼをコード
していないことを示した（例２及び例３参照）。それゆ
え以後説明する他の戦略を開発しなければならなかっ
た。

大腸菌JM101hsd S rec A中のプラスミドpAM1は第154.
87号として1987年、２月５日CBSに登録した。

D.3 IN II−５リパーゼ遺伝子の包含化 プラスミドベクターpUN121を使用しSau3Aで部分消化
したシュードモナス・シュードアルカリゲンス（Pseudo
monas pseudoalcaligenes）1N II−5DNA断片を大腸菌K1
2DH1株（ATCC33849）にクローン化した。ライゲーショ
ン及びハナハン（Hanahan）（ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）166（1983）55
7−580）により報告されている方法で調製したDH1コン
ピテント細胞へのトランスホーメーション後、50μg/ml
アンピシリン及び８μg/mlテトラサイクリンに耐性の約
1500個のトランスホーマントが得られた。トリブチリン
及びβ−ナフチルアセテートを加水分解し得るトランス
ホーマントは1Cで述べた方法で選択した。１個のポジテ
ィブコロニーからプラスミドDNAを単離し、数種の制限
酵素認識部位の決定による特性化を行った。pM6−５と
命名されたこのプラスミドの物理マップを第７図に示
す。

β−ナフチルエステルに対する大腸菌DH1（pM6−５）
の活性を測定した（第１表）。プラスミドpM6−５を宿
す大腸菌DH1株を、第153.87号として1987年２月５日CBS
に登録した。

D.4 Gr V−39リパーゼ遺伝子の包含化 EcoR I^＊で部分消化した（ガードナー（Gardenr）
等、DNA1（1982）109−114に従う条件下）アシネトバク
ターカルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticu
s）Gr V−39DNAをEcoR Iで線状化したpUN121DNAと混合
し、T4ポリヌクレオチドリガーゼを用いて再環状化した
後、このDNA混合物をこの例で先に述べたトランスホー
メーション操作を用い大腸菌DH1（ATCC33849）に導入し
た。得られた全1800個のテトラサイクリン耐性トランス
ホーマントを1Cで述べた脂質分解活性でスクリーニング
した。

このGr V−39゜/pUN121遺伝子ライブラリーのうちの
３個のコロニーは脂質分解性酵素を生産した。pP5−４
と命名した３個のクローンのうちの１個に由来するプラ
スミドDNAを単離し、制限エンドヌクレアーゼで特徴づ
けた。このプラスミドpP5−４の物理マップを第８図に
示した。それから大腸菌DH1（pP5−４）由来の酵素粗調
製物によるβ−ナフチルエステルの加水分解を測定した
（第１表）。大腸菌DH1中のプラスミドpP5−４は第151.
87号として1987年２月５日CBSに登録した。

例 ２ クローン化した脂質分解性酵素調製物の特性 A.脂質分解活性の測定 トリブチリンポジティブ大腸菌コロニーを500mlコニ
カルフラスコ中のアンピシリン及びテトラサイクリンを
含む100mlの2TY培地に接種した。この大腸菌培養物を25
0rpmのシェーカー中30℃で40時間振盪した。40時間後、
575nmの光学密度を測定し、ついでその培地をGSAロータ
ーを用いたソーバル（Sorvall）RC5B遠心機により6000r
pm、10分の遠心を行った。酵素検定までその上清を４℃
で保存した。

細胞を4mlの溶菌バッファ（25％スクロース、50mMト
リス−HCl pH7.5）中に懸濁した。リゾチームを添加
し、21℃、30分のインキュベーション後DNase（20μg/m
l）を加え、さらに37℃、30分間インキュベーションを
続けた。トリトンＸ−100（0.1％v/v）を添加し、その
細胞サスペンジョンをラブソニック（Labsonic）1510超
音波装置を用い氷上で超音波処理した（１分間隔を置い
て１ワット30秒間の処理５回）。それから細胞破片をヘ
チクミクロラピッド/K（Hettich Mikro Rapid/K）遠心
機を用い12000rpm、15分間の遠心で除去した。得られた
上清脂質分解活性を検定した。この検定は脂質分解性酵
素によるβ−ナフチルエステルの加水分解に基づいてい
る。放出されたβ−ナフチルはジアゾニム塩ファースト
ブルーBBと反応し540nmに吸収をもつアゾ色素を生ず
る。この方法は基本的にマクケラー（McKollar）の方法
（ジャーナル・オブ・ディリーリサーチ（J.Dairs Re
s.）53（1986）117−127）であり、以下のように行っ
た。

反応管中の最終容積は2.0mlであった:1.8ml55mM TES
（Ｎ−トリス（ヒドロキシ−メチル）メチル−２−アミ
ノエタンスルホン酸、シグマ社）；ジメチルスルホキシ
ド（DMSO、メルク社）又はメチル・セルソルブアセテー
ト（メルク社）に溶解した0.02ml100mMβ−ナフチルエ
チテル、0.1ml120mM NaTC（Na−トーロクロレート、シ
グマ）、及び0.1mlの酵素調製物。

酵素を欠くコントロール及び酵素及び基質をかくβ−
ナフチル（シグマ社）標準物質も使用した。

反応混合物を入れたコーニングの遠心管（15ml）を37
℃又は指定された温度で30分間インキュベートした。0.
02ml100mMFB溶液（DMSOに溶かしたファストブルーBB塩
（シグマ））を加え、さらに10分間インキュベーション
する。0.2mlの0.72NTCA（トリクロロ酢酸、リーデルデ
ハン（Riedel De Haen））を加えて反応を停止し、発色
複合体を2.5ml1−ブタノール（メルク）と激しく混ぜる
ことにより抽出した。その層はヘリウスクリストミンフ
ュージ（Heraeus Christ Minifuge）RFを用い5000rpm、
５分間の遠心で分離した。上層の吸光度をLKBウルトラ
スペクII分光光度計を用い540nmで測定した。コントロ
ールを差引いた後、その測定値を標準物質としてカンデ
ィダ・シリンドラセア（Candida cylindracea）のリパ
ーゼ（L1754、シグマ）を用いたTLU値（真リパーゼ単
位）に変換した。1T2Uは１μmole NaOH/minと等価の脂
肪酸滴定値と定義される（EP−Ａ−0218272参照）。そ
の結果を以下の第１表に示す。

アシル鎖長をC₄〜C₁₈と種々に変化させたβ−ナフチ
ルエステルの加水分解のデータを比較すると以下のこと
が示される。１゜、pAT3及びpET3プラスミドを宿すクロ
ーンは真のリパーゼを生産する。及び２゜、pAT1、pET
1、pAM1、pP5−４及びpM6−５プラスミドを宿すクロー
ンは実質的にエステラーゼ活性を有する酵素を生産す
る。組換えプラスミドを有する大腸菌によって合成され
る全んどの脂質分解酵素は細胞分解物中に存在した。

B.クローン化した脂質分解性調製物のより詳細な特性 クローン化した脂質分解性酵素調製物は業者の指示に
従がいファストゲル勾配10〜15％を使用したファストゲ
ルシステム（ファルマシア）によるSDSゲル電気泳動を
行ない、その特性を調べた。

大腸菌のクローンpET3及びpUN121ベクターを含むDH1
株由来の無細胞抽出物を供与株Thai IV 17−１由来の部
分精製酵素（スチュア（Stuor）等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）168（1986）1070
−1079）と比較した。

（サンプル調製）酵素調製物の適当な希釈液４部に10
％SDS、10％β−メルカプトエタノールの0.5Mトリス・H
Cl（pH6.8）溶液１部を混合する。この溶液を３等分し
た。その１つはゲル電気泳動するまでなにも処理を行な
わず室温で保存した。第２及び第３のものは各々５分及
び10分間95℃に加熱し、氷水中で冷却した後ゲル電気泳
動するまで室温で保存した。

（電気泳動）処理したサンプルは２度65ボルト／時間
のファストゲルシステムによる電気泳動を行った。１つ
のゲルはファルマシア開発技術ファイル番号200に従が
いコマージブリリアントブルーによるタンパク質染色を
行った。第２のゲルは50mMトリス・HCl（pH7.5）、0.1
％トリトンＸ−100で洗浄しSDSを除き酵素活性を再活性
化した。洗浄ゲル中の脂質分解活性の存在は例1Cで述べ
たβ−ナフチルアセテート／ファストブルーBB塩法に基
づく軟寒天重層技術で可視化した。30℃で30分間インキ
ュベーションした後、透明な背景に紫色のバンドが出現
してきた。第9B図に示したように、大腸菌pET3クローン
由来のリパーゼ及び天然のP.スツゼリ（Stutzeri）Thai
IV 17−１のリパーゼ（MW40kDa）はSDSゲル電気泳動で
同じ移動度を示した。同様の熱変化性が大腸菌K12の別
の外膜タンパク質（Omp A遺伝子産物）についても報告
されている（フリュードル（Freudl）等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）
261（1986）11355〜11361）。

例 ３ 広域宿主ベクターにおけるシュードモナスシュードア
ルカリゲンス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）遺伝
子ライブラリーの構築 P.シュードアルカリゲンス（pseudoalcaligenes）Ｍ
−１株のリパーゼ遺伝子クローニングに対する別の戦略
として、二要素性広域宿主クローニングシステムを使用
した。これは種々のシュードモナス（Pseudomonas）の
変異株に対する相補性により遺伝子バンクの直接スクリ
ーニングを可能にする。２つの広域宿主ベクターpLAFR1
（フリードマン（Friedman）等、ジーン（Gene）18（19
82）289−296）及びpKT248（バグダサリアン（Bagdasar
ian）等、ジーン（Gene）16（1981）237−247）を用い
た。プラスミドpLAFR1はテトラサイクリン耐性を供与す
るRK2由来の広域宿主コスミドであり、これは転移可能
であるが自立転移することはできない。プラスミドpKT2
48はストレプトマイシン耐性及びクロラムフェニコール
耐性を供与する転移可能なR300B由来の広域宿主プラス
ミドである。大腸菌からシュードモナス（Pseudomona
s）へのこれらのベクターの転移はRK2転移機能を有する
（ジッタ（Ditta）等、プロシィーディング・イン・ナ
ショナルアカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA77（1980）7347−7351）pRK2013の助けを
借り、フリードマン（Friedman）等（ジーン（Gene）18
（1982）289−296）の三親交配操作に従って行った。P.
アルギノサ（aeruginosa）PAO2302株のリパーゼマイナ
ム変異株（ウォルファース（Wohlfarth）及びU.K.ウィ
ンクラー（Winkler）、（ルア大学、ボカム、FRG）から
入手した）を受容シュードモナス（Pseudomonas）とし
て使用した（ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバ
イオロジー（J.Gen.Microbiol.）134（1988）433−44
0）。

インビトロからのラムダファージパッキング抽出物の
調製及びpLAFR1 DNAのパッキングは基本的にイシュホロ
ヴィッツ（Ish−Horowicz）及びバーク（Burke）（ヌク
レイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Res.）９
（1981）2989−2998）の方法で行った。簡単に言うと、
全P.シュードアルカリゲンス（pseudoalcaligenes）Ｍ
−1 DNAをEcoR I又はSal Iで部分切断し、EcoR I制限切
断pLAFR1 DNA又はSal I制限切断pKT248DNAにライゲーシ
ョンした。ベクターに対する挿入物の比を1:5にしてベ
クターとベクターのライゲーションの可能性を減らし
た。インビトロでライゲーションしたＭ−1/pLAFR1 DNA
をラムダファージの頭部にパッキングし、大腸菌DH1へ
注入した（マニアチス（Maniatis）等、上述1982）。

P.シュードアルカリゲンス（pseudoalcaligenes）Ｍ
−1 1μｇ当たり約2,500個のテトラサイクリン耐性のト
ランスダクタントが得られた。P.シュードアルカリゲン
ス（pseudoalcaligenes）が5000kbのゲノムサイズを有
し、かつ少くともテトラサイクリン耐性トランスダクタ
ントの50％が20kbの挿入物を有すると仮定すると、特定
のDNA配列を99％の確立で発見することを保証するには2
300個の異なるクローンが必要である（クラーク（Clar
k）及びカーボン（Carbon）、セル（Cell）９（1976）9
1）。この遺伝子ライブラリーは8500個以上の異なる組
換えコロニーを含んでいるのでおそらくそれは全P.シュ
ードアルカリゲンス（pseudoalcaligenes）のゲノムを
含んでいるであろう。

ライゲーションしたＭ−1/pKT248DNAを例１で述べた
ようにコンピテント大腸菌にトランスホームした。大腸
菌JM101hsd S rec Aのトランスホーマントをストレプト
マイシン耐性（Sm^R）で選択し、かつクロラムフェニコ
ール感受性（Cm^S）で逆選択した。5000個のSm^RCm^Sクロ
ーンが得られた。大腸菌宿主中に得られた２つのＭ−１
遺伝子ライブラリーのレプリカをプレートにとり、例１
で述べたように脂質分解活性についてスクリーニングし
た。13000個の組換えトランスホーマントのいずれもリ
パーゼ活性を示さなかった。

それゆえ大腸菌からP.アルギノサ（aeruginosa）PAO
2302（６−１）へのそのクローンの転移を以下のように
行った。組換えプラスミドは、供与株を受容株（PAO023
02/6−１）及びヘルパー株（pRK2013プラスミドを宿す
大腸菌MC1061又はDH1）の下地にレプリカをとることに
よりシュードモナス受容体に転移させた。供与株、受容
株及びヘルパー株を、ハートインフュージョン寒天プレ
ート上で一晩増殖させた後、0.2％クエン酸塩、メチオ
ニン（10μg/ml）及びストレプトマイシン又はテトラサ
イクリンを含む最小寒天培地にレプリカをとることによ
るエクスコンジュカントを選択した。

クエン酸塩は大腸菌によって代謝されない。組換えプ
ラスミドを有するリパーゼ欠損変異体のlip発現型の保
は、クーカー（Kouker）及びジャガー（Jaeger）が報告
しているように（アプライド・アンド・エンバイロメン
タル・マイクロバイオロジー（Appl.Env.Microbiol.）5
3（1987）211−213）そのP.アルギノサ（aeruginosa）
のエクスコンジュカントのレプリカをトリオレオイルグ
リセロール及び蛍光色素ローダミンＢを含む栄養寒天培
地をとることによりテストした。

13000個のスクリーニングを行ったエクスコンジュガ
ントのうちの４個は、37℃、40時間のインキュベーショ
ン後、細菌コロニーの周辺に360nmの光で可視光を発す
るオレンジの蛍光性ハローを発現することで確認される
リパーゼ活性を示した。これらのポジティブクローンの
うちの１つ、pALM5を選んでさらに特性を調べた。

最後に、pALM5を宿すPAO2302/6−１エクスコンジュガ
ントにより生産されるリパーゼがP.シュードアルカリゲ
ンス（pseudoalcaligenes）Ｍ−１株由来のリパーゼが
示す望ましい特性を有することを確認するため、酵素サ
ンプルを調製し生化学分析（例２参照）及びSLMテスト
（後の例10に述べられる）を行った。これらのテストで
得られた結果は、pALM5クローンにより生産された酵素
の脂質分解活性は、親株のＭ−１に由来する酵素と同じ
特性を有していた。

例 ４ シュードモナスシュードアルカリゲンス（Pseudomonas
pseudoalcaligenes）Ｍ−１リパーゼ遺伝子の分子クロ
ーニング A.タンパク質の精製及び配列決定 シュードモナスシュードアルカリゲンス（Pseudomona
s pseudoalcaligenes）Ｍ−１株の凍結乾燥上清の醗酵
及び調製は、EP−Ａ−0218272に述べられている。脂質
分解性酵素は基本的にウィンゲルダー（Wingerder）等
（アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノ
ロジー（Appl.Microbiol.Biotechnol.）27（1987）139
−145）の方法に従がい、この上清から精製した。精製
後のこのタンパク質調製物はSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動とつづくコマージブリリアントブルー染色に
よる検定で80％以上の純度を有していた（第10図参
照）。

Ｎ−末端配列分析は、マツダイラ（Matudaira）（ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミトリー（J.Bio
l.Chem.）262（1987）10035−10038）の方法に従がいSD
Sゲル電気泳動及びイムモビロントランスファーメンブ
レン（ミリポア社）へのエレクトロブロッティング後に
行った。この分析は以下の配列を示した（簡便な１文字
アミノ酸コードを使用している）。

GLFGSTGYTKTKYPIVLTHGMLGF 1 10 20 B.M−１リパーゼ遺伝子のクローニング ２つの32マーの合成オリゴヌクレオチド ５′ACC GGC TAC ACC AAG ACC AAG TAC CCC ATC GT−
３′及び ５′ACC GGC TAC ACC AAG ACC AAG TAC CCG ATC GT−
３′ は、P.シュードモナス（Pseudomonas）のコドン選択性
及び遺伝子コードの縮重を考慮し、先に述べた成熟リパ
ーゼタンパク質のＮ末端配列のアミノ酸６番−15番（TG
YTKTKYPI）から誘導した。ハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用するため、このオリゴヌクレオチドはT4
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端ラベルした。

染色体DNAをアンドレオリ（Andreoli）の方法（モレ
キュラー・アンド・ゼネラル・ジェネティクス（Mol.Ge
n.Genet.）199（1985）372−380）に従がいシュードモ
ナスシュードアルカリゲンス（Pseudomonas pseudoalca
ligenes）Ｍ−１株（CBS473.85）から単離し、いくつか
の制限エンドヌクレアーゼで消化した後、0.8％アガロ
ースゲルで分離した。プローブとして放射性ラベルした
32マーのオリゴヌクレオチドを用いたこれらのゲルのサ
ウザンブロット分析は、以下に示す独特のハイブリダイ
ズするDNAバンドを示した:1.8kb Bcl I,2.0kb Pvu II及
び1.7kb Sal I。それゆえＭ−１染色体DNAをこれら三種
の制限エンドヌクレアーゼで別々に消化し、0.8％アガ
ロースゲル電気泳動で分画したのち、上述のハイブリダ
イズした画分を、シレイチャー（Schleicher）及びシュ
ル（Schull）社から市販されているバイオトラップBT10
00装置での電気溶出により回収した。

1.8kbのBcl I消化画分をBamH I切断後脱リン酸化した
ベクターpTZ18R/19R（ファルマシアから市販されてい
る、ウォーデン、オランダ）にライゲーションした。2.
0kbのPvu II消化画分はSma I切断後脱リン酸化したベク
ターpTZ18R/19Rにライゲーションした。1.7kbのSal I切
断画分は、Sal I切断後脱リン酸化したベクターpZT18R/
19Rにライゲーションした。これら三つのライゲーショ
ン物質を大腸菌JM101hsd S rec Aのコンピテント細胞
（アンドレオリ（Andreoli）により報告されている、上
述）にトランスホームレ、アンピシリン、Ｘ−gel（５
−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）及びIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド）を含むルリア培地寒天プレートにプ
レーティングした。

新鮮な寒天プレート上に約4000個の白色コロニーをピ
ックアップし、放射性ラベルした32マーのオリゴヌクレ
オチドへのコロニーハイブリダイゼーションによりスク
リーニングした。この方法により12個のポジティブコロ
ニーが得られた。これらのポジティブコロニーのそれぞ
れからアルカリ分解法によりプラスミドミニプレップを
調製し、業者の説明書に従って適当な制限エンドヌクレ
アーゼで消化した。６個のプラスミドは期待されるハイ
ブリダイズ挿入物を含んでいた。pTMPv18Aと命名された
2.0kb Pvu II断片のみを含むプラスミドの１つをさらに
詳細に分析するために選んだ。プラスミドpTMPv18Aを宿
す大腸菌JM101hsd S rec Aのサンプルを、CBS142.89と
して、1989,3月８日CBSに登録した。

上記のようにして得た大腸菌のpTZ18R/19R組換えトラ
ンスホーマントのレプリカをとり、例２で述べたように
脂質分解活性でスクリーニングにた。試験した５×10⁴
個の大腸菌トランスホーマントのうちのいずれも脂質分
解活性を示さなかった。この失敗のいくつかの理由とし
ては以下のものが考えられる。ａ）Ｍ−１リパーゼ遺伝
子の遺伝子発現開始シグナルが大腸菌の転写／翻訳シス
テムに認識されない（例えばジーンズ（Jeenes）等、モ
レキュラー・アンド・ゼネラル・ジェネティクス（Mol.
Gen.Genet.）203（1986）421−429参照）。ｂ）このＭ
−１リパーゼ遺伝子に関しては調節配列又は調節タンパ
ク質を変える必要性がある。ｃ）大腸菌中ではＭ−１リ
パーゼの適正な折りたたみ又は分泌がうまく行なわれな
い。

C.M−１リパーゼ遺伝子の特性及び配列決定 プラスミドpTMPv18Aを6bpの認識配列をもついくつか
の制限酵素で消化した。これらの実験から生じた断片の
分析でpTMPv18Aの2.0kb Pvu II挿入物の予備的制限エン
ドヌクレアーゼ切断地図を作ることができた。この地図
を第11図に示す。

使用したpTZ18/19RベクターはDNAクローニング、ジデ
オキシDNAシーケンシング、インビトロ突然変異誘発及
びインビトロ転写を可能にする多目的性“オールワンシ
ステム”を提供した（ミード（Mead）等、プロテインエ
ンジニアリング（Protein Engineering）１（1986）67
−74）。二本鎖プラスミドはファルマシアから入手でき
るヘルパーファージM13K07を用いた重感染により一本鎖
DNAに転換した。pTMPv18AのXho I及びEcoR V部位間の0.
94kb DNA断片のDNA配列を第12図に示す。全ての可能な
読み枠で翻訳されたとき、このDNA配列は直接的アミノ
酸配列決定で決定されたように、リパーゼタンパク質の
NH₂末端アミノ酸残基（残基１−24）を含む大きな読み
枠を持つことを明らかにした（本例のＡ参照）。位置−
24のメチオニンは、バクテリアのシグナルペプチドに典
型的な一連のアミノ酸に先行することからタンパク質前
駆体の開始コドンである（フォンヘイン（Von Heyn
e）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.）192（1986）287−290）。24個のアミノ
酸からなるこのシグナルペプチドは、分泌プロセルの際
にAEA（−３〜−１）シグナルペプチダーゼ認識シグナ
ルの後ろで切り離される。このシグナル配列のシステイ
ン残基の回りの領域は脂質タンパク質コンセンサスシグ
ナルペプチド（フォンヘイン（Von Heyne）、同上）に
非常に逃ていることが注目される。

このDNA配列から予想されるアミノ酸配列は、成熟Ｍ
−１リパーゼはTGA終止コドンで終わる289個のアミノ酸
から成ることを示している（第12図参照）。この成熟タ
ンパク質の予想分子量は30,323であり、これはSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によりＭ−１リパーゼにつ
いて測定された分子量（MW31500）と非常によく一致し
ている（第10図参照）。

例 ５ シュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）
PAOリパーゼ遺伝子の分子クローニング シュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aeruginos
a）のリパーゼは分子量約29000の脂質加水分解酵素（EC
3.1.1.3）であり、これは後期対数増殖期に培地中に分
泌される（スチュア（Stuer）等、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（J.Bacteriol）168（1986）1070−10
74）。

A.クローニング及び特性 シュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aeruginos
a）PAO1株（ATCC15692）のリパーゼ遺伝子をクローニン
グするため、シュードモナス（Pseudomonaceae）の種々
の突然変異株に対する相補性により直接遺伝子バンクを
スクリーニングし得る広域宿主クローニングシステムを
使用した。広域宿主ベクターとしてpKT248（バクダサリ
アン（Bagdasarian）等、ジーン（Gene）16（1981）237
−247）を用いた。これはストレプトマイシン及びクロ
ラムフェニコール耐性を有する転移性R300B由来の広域
宿主プラスミドである。

シュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aeruginos
a）PAO1DNAを制限エンドヌクレアーゼSal Iで部分分解
し、pKT248ベクターの単一のSal I部位にライゲーショ
ンした。挿入物：ベクターの比を5:1としベクター−ベ
クターライゲーションの可能性を減少させた。ライゲー
ションしたPAO/pKT248 DNAは、例1Bで述べたように大
腸菌SK1108コンピテント細胞にトランスホームした（ド
ノバン（Donovan）及びクシュナー（Kushner），ジーン
（Gene）25（1983）39−48）。大腸菌SK1108のトランス
ホーマントをストレプトマイシン耐性（Sm^R）で選択
し、かつクロラムフェニコール感受性（Cm^S）で逆選択
した。

6000個のSm^RCm^Sクローンが得られ、それらを例２で述
べたように脂質分解活性でスクリーニングした。おそら
く大腸菌中ではシュードモナス（Pseudomonas）のプロ
モーターがよく認識されないため、これらのクローンの
いずれもその活性を示さなかった（ジーンズ（Jeenes）
等、上述）。

それゆえ、そのクローンの、大腸菌からシュードモナ
スアルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）PAO2302リパ
ーゼ欠損変異株６−１（ウォルファース（Wohlfarth）
及びウインクラー（Winkler）、ジャーナル・オブ・ゼ
ネラル・マイクロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）13
4（1988）433−440）への転移を以下のように行った。6
000個のクローンを各々50個づつから成る120のグループ
に分けた。各グループからプラスミド調製物を作り、PA
O2302（６−１）lip−変異体のコンピテント細胞へのト
ランスホームに用いた。シュードモナス（Pseudomona
s）のコンピテント細胞の調製はオルセン（Olsen）等
（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l.）150（1982）60−69）に従った。選択はストレプト
マイシン（50μg/ml）を補ったカルシウムトリオレイン
（CT）寒天プレート（ウォルファース（Wohlfarth）及
びウインクラー（Winkler）、上述）で行った。スクリ
ーニングした5000個のPAOトランスホーマントのうちの1
0個がコロニー先端の白色結晶によって確認されるリパ
ーゼ活性を示した。さらに特性を明らかにするため、こ
れらのポジティブPAOトランスホーマントのうちの個、p
SW1を選んだ。

これに含まれるプラスミドを、制限分析及びアガロー
スゲル電気泳動により特性を調べてみると、1.3kb、0.9
7kb及び0.76kbのSal Iサブフラグメントからなる3.1kb
のSal I挿入物を含むことが分った。DNA配列決定及びリ
パーゼ遺伝子の発現を行うため、これらの挿入物を適当
なベクターにサブクローン化した。

pSW103と命名したpUC19由来のサブクローンのプラス
ミドDNA（1.3kb及び0.97kb挿入物を含む）を単離し、制
限エンドヌクレアーゼで分析した。このプラスミドpSW1
03の物理地図を第13図に示す。プラスミドpSW103を宿す
大腸菌JM101hsd S rec Aのサンプルを、第141.89号とし
て、1989年、３月８日OBSに登録した。

B.シュードモナスアルギノサ（Pseudomonas aeruginos
a）PAO1リパーゼ遺伝子の配列決定と特性 PAO1リパーゼ遺伝子を含むpSW103の2.3kb Sal I挿入
物を２つの操作で配列決定した：バクテリオファージM1
3誘導体mp18及びmp19（ヤニシューペラン（Yanisch−Pe
rron）等、ジーン（Gene）33（1985）103−119）を用い
たデニンガー（Deininger）の“強制”クローニング配
列決定法あるいは“ショットガン”クローニング配列決
定法（アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bio
chem.）129（1983）216−223）及びミズサワ（Mizusaw
a）等のジデオキシチェーンターミネーション技術（ヌ
クレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acid Res.）14
（1986）1319−1324）。

“強制”クローニング配列決定操作では、pSW103の2.
3kb挿入物のSal I/Pst I及びSal I/EcoR I断片を精製
し、適当なM13mp18ベクターにライゲーションした。得
られたDNA配列の断片を継ぎ合せることにより全DNA配列
を確定した。全んどのDNA配列は両鎖について測定し
た。全ての可能な読み枠で翻訳されたとき、このDNA配
列は、pSW103の0.97kb Sal I断片のみが（第14図参照）
成熟PAO1リパーゼをコードしていることが明らかにし
た。

pSW103サブクローンの1.3kb Sal I断片は、全ての可
能な読み枠で翻訳してみた時も、直接的アミノ酸配列決
定で測定されたようなPAO1リパーゼタンパク質の24個の
Ｎ末端アミノ酸残基をコードしていなかった。

0.97kbのSal I断片のDNA配列から予想されるアミノ酸
配列は、１個の興味あるドメインを示している（第14図
Ａで示してある）。

ドメインＡは真核性リパーゼ（ウィオン（Wion）等、
サイエンス（Science）235（1987）1638−1641）、ボド
マー（Bodmer）等、バイオケム・バイオフィズ・アクタ
（Biochem.Biophys.Acta）909（1987）237−244）及び
原核性リパーゼ（クギミヤ（Kugimiya）等、バイオケム
・バイオフィズ・リサーチ・コミュニケーション（Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.）141（1986）185−190）の両
方の活性中心であるとすでに決定されているアミノ酸配
列Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｈ−Ｇをコードしている。

例 ６ A.バクテリアにおけるクローン化したＭ−１リパーゼの
発現 異種宿主におけるＭ−１リパーゼの発現レベルを向上
させるため、Ｍ−１リパーゼ遺伝子を含むpTMPv18Aの2.
0kbKpn I−Hind III断片をKpn I及びHind IIIで消化し
たpBHA/C1ベクターにライゲーションした。pBHA1ベクタ
ーのヌクレオチド配列はEP−Ａ−0275598に述べられて
いる。以下の抗生物質耐性遺伝子の発現が異なること以
外はpBHC1ベクターとpBHA1ベクターは同じである：クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は
pBHC1ベクターを宿す大腸菌WK6株中で発現し、またβ−
ラクタマーゼ遺伝子はpBHA1ベクターを宿す大腸菌WK6株
中で発現する。大腸菌WK6株についてはR.ゼル（Zell）
及びH.J.フリッツ（Fritz）によって報告されている（E
MBOJ.６（1987）1809）。

WK6株のトランスホーメーション及び得られたアンピ
シリン（pBHA1の場合）及びクロラムフェニコール（pBH
C1の場合）耐性コロニーの分析の結果各々プラスミドpB
HAM−１及びpBHCH−１が検出された（第15図参照）。

次のステップはＭ−１前駆体タンパク質のATG開始コ
ドンへのHde I制限エンドヌクレアーゼ部位の導入であ
る。スタンセンス（Stanssens）等（“タンパク質工学
及び部位指定突然変異誘発”、24回ハーダー（Harder）
会議、1985、A.R.ファースト（Feersht）及びG.ウィン
ター（Winter）編）の方法に従がいpBHA/CM−１プラス
ミドの部位指定突然変異誘発を行った。

突然変異誘発後、制限酵素分析及びミヅサワ（Mizusa
wa）等のジデオキシ法を用いた配列分析により（例５参
照）関連する突然変異を有する潜在的変異体のチェック
を行った。これらの分析後、pBHAM1N1と命名した適正な
プラスミドを発見した（第16図参照）。大腸菌中でのＭ
−１リパーゼの発現を調節するため、Ｍ−１リパーゼ構
造遺伝子を含むpBHAM1N1の1.7kb Hde I−Hind III断片
を単離し、２つの発現ベクターにライゲーションした。

−pTZ18RN:β−ガラクトシダーゼのATG開始コドンに
単一のNde I部位を含むpTZ18R誘導体（ミード（Mead）
等、タンパク質工学（Protein Engineering）１（198
6）67−74）。

−pMCTN:tacプロモーター及びリボゾーム結合部位の
後に単一のNde I部位を含むpMC誘導体（スタンセンス
（Stanssens）等、上述）。

２つのライゲーション調製物を大腸菌JM101hsd S rec
Aのコンピテント細胞にトランスホーメーションした
後、このトランスホーマントを0.5mM IPTG（イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を含むトリブチリリン
寒天プレートを用い脂質分解活性でスクリーニングし
た。これらのトリブチリンプレートの30℃48時間のイン
キュベーションとそれにつづく数日間の冷蔵庫保存の
後、いくつかのコロニーが脂質分解活性を示す淡いハロ
ーを形成した。これらのトリブチリンポジティブクロー
ンのプラスミドの特性を制限酵素分析で調べた。求めて
いた２つのプラスミドが発見された： −pTZN1M1:lacコントロール配列の後にＭ−１リパー
ゼ遺伝子を有する（第17図参照）、 −pMCTM1:tacコントロール配列の後にＭ−１リパーゼ
遺伝子を有する（第18図参照）。

プラスミドpTZN1M−１及びpMCTM−１をそれぞれ宿す
大腸菌トランスホーマントによって生産される脂質分解
活性を同定するため、これらのクローンを30℃で一番、
100mlの2TY培地（16g/バクトトリプトン、10g/バク
トイーストエキストラクト、5g/ NaCl、pH7.0）中で
増殖させ、ついで0.5mM IPTGを用い、30℃で３時間の誘
導を行った。ネガティブコントロールとしてはpTZ18RN
を宿す大腸菌JM101hsd S rec A株を用いた。細胞を遠心
により培養上清を分離した後、テツアキ（Tetuaki）等
（アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロ
ジー（Appl.Env.Microbiol.）50（1985）298−303）の
方法に従がいペリプラズマ及び膜／細胞質成分に分画し
た。各画分は、レムリ（Laemmli）の方法に従がい（ネ
イチャー（Nature）227（1970）680−685）13％の分離
ゲル及び５％のスタッキングゲルから成るSDSポリアク
リルアミドゲルで分析した。電気泳動はブロモフェノー
ブル（BPB）マーカー色素がゲルの底に到達するまで60m
Aで運転した。サンプル調製及びタンパク質ブロッティ
ング操作はEP−Ａ−0253455に述べられているように行
った。ウェスタンブロット分析には、P.シュードアルカ
リゲンス（pseudoalcaligenes）Ｍ−１株由来の精製リ
パーゼに対する多価ウサギ抗血清を用いた。第19図に示
した結果から、各々pTZN1M1及びpMCTM1を宿す大腸菌は
Ｍ−１リパーゼ特異的31.5kDaポリペプチドを合成し、
かつ細胞周辺腔に分泌し得ると結論される（第19図、レ
ーンＢ及びＣ参照）。この31.5kDaポリペプチドの脂質
分解活性は例1Cで述べたβ−ナフチルアセテート／ファ
ーストブルーBB塩法に基づく軟寒天重層技術により確認
した。

EP Ａ 0275598及びEP−Ａ−0253455は目的遺伝子を
含むベビクルをバチルス（Bacillus）に効率的に転移
し、望ましいポリペプチド産物を効率的に分泌するバチ
ルス（Bacillus）株を得るための方法を公開している。
この方法はThai IV 17−１及びＭ−１リパーゼ遺伝子の
両方に用いた。

Ｍ−１リパーゼ遺伝子の場合、pBHAM1N1プラスミド
（上述）をNde Iで消化し、再結合した。このライゲー
ション混合物をバチルスリチェニルホルミス（Bacillus
licheniformis）T9のプロトプラストにトランスホーム
した。多くのネオマイシン耐性トリブチリンポジティブ
コロニーを分析し、適正なプラスミドを得た。このプラ
スミドはpUB110のHpa IIプロモーター（ジプリアン（Zy
prian）及びマツバラ（Matubara）、DNA５（1986）219
−225参照）の後ろにＭ−１の前駆体タンパク質を含ん
でおりpBHM1N1と命名された（第20図参照）。プラスミ
ドpBHM1N1を宿すT9トランスホーマントを例２で述べた
方法に従がい工業用培地中での醗酵の後β−ナフチルエ
ステルの加水分解能についてテストした。その結果は、
このT9クローンによって生産される酵素の脂質分解活性
が親株のシュードモナスシュードアルカリゲンス（Pseu
domonas pseudoalcaligenes）Ｍ−１株のリパーゼと同
様の特性であることを示した。

シュードモナス（Pseudomonas）宿主における発現に
ついては、シュードモナス（Pseudomonas）特異的バク
テリオファージPt3のp78遺伝子の構成プロモーターを用
いた（R.G.M.ルイテン（Luiten）“繊維状バクテリオフ
ァージ"Pf3:分子遺伝学的研究”、PhDセシス（Thesi
s）、1987、ニメゲンカソリック大学、オランダ）。こ
のPf3プロモーターをコードする合成DNA断片： を合成した。

この断片をEcoR I及びKpn Iで切断したベクターpTZ18
Rにライゲーションし、プラスミドpTZPf31Aを作った。

シュードモナス（Pseudomonas）中でクローン化した
Ｍ−１リパーゼ遺伝子を発現させるため、pTMPv18A、pM
CTM1、及びpTZPf3M1中に存在するＭ−１発現カセットを
広域宿主ベクターpKT231（バグタサリオン（Bagdasario
n）等、ジーン（Gene）16（1981）237−247）、pLAFR3
（スタスカウィス（Staskawisz）等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）169（1987）5789
−5794）及びpJRD215（ダビソン（Davison）等、ジーン
（Gene）51（1987）275−280）に挿入した。Ｍ−１発現
カセットを宿す広域宿主プラスミドをフリードマン（Fr
iedman）等、（ジーン（Gene）18（1982）289−296）の
三親交配操作に従がい、次のシュードモナス（Pseudomo
nas）株に転移させた。

−P.アルギノサ（aeruginosa）PAO2302株のリパーゼ
欠損変異株６−１（ウォルファース（Wohlfarth）及び
ウィンクラー（Winkler））。

−リパーゼ欠損P.プチダ（putida）KT2442株（ゼヤー
（Zeyer）等、アプライド・エンバイロメンタルマイク
ロバイオロジー（Appl.Env.Microbiol.）50（1985）140
9−1413）。

−P.シュードアルカリゲンス（pseudoalcaligenes）
Ｍ−１株（CBS473.85）。

−P.シュードアルカリゲンス（pseudoalcaligenes）I
N II−５株（CBS468.85）。

大腸菌からシュードモナス（Pseudomonas）への広域
宿主プラスミドの転移の別の操作法としてジーンパルサ
ー（バイオラドラボラトリー社）の使用マニュアルに従
がう電場によるトランスホーメーション（“エレクトロ
ポレーション”）を使用した。

得られたシュードモナス（Pseudomonas）のトランス
ホーマントのリパーゼ生産テストをオデラ（Odera）等
（ジャーナル・オブ・ファーメンタル・テクノロジー
（J.Ferment.Technol.）64（1986）363−371）により報
告されているオリーブ油培地中の発酵後行った。

以下の第２表では種々の株の脂質分解活性生産性を示
した。

シュードモナス（Pseudomonas）のトランスホーマン
トによって生産されるリパーゼをSDS・ゲル電気泳動で
分析してみると、本来のP.シュードアルカリゲンス（ps
eudoalecaligenes）Ｍ−１株によって生産されるリパー
ゼと同じ移動度を示した。

P.シュードアルカリゲンス（pseudoalecaligenes）中
にＭ−１発現カセットを多数導入することにより供与株
によって生産されるリパーゼレベルと比較すると２〜４
倍の向上が見られる。さらにＭ−１リパーゼ遺伝子の本
来の遺伝子発現開始シグナル又はプロモーターは、PAO1
株及びKT2442株とは対照的にシュードモナスシュードア
ルカリゲンス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）にお
いて活性をもつと結論することができる。

B.クローン化したＭ−１リパーゼ遺伝子のインビトロで
の発現 Ｍ−１リパーゼを含むクローンのインビトロでの発現
は真核性DNA依存翻訳キット（アマーシャムインターナ
ショナル社）を用いて行った。このシステムはもし関連
するコントロールシグナルが存在するなら、そのバクテ
リアプラスミド上の遺伝子のインビトロの発現を可能に
する。以下の４つのバクテリアプラスミドについて分析
した。

B.1.M−リパーゼ及びβ−ラクタマーゼ遺伝子産物をコ
ードし、かつアンピシリン（Ap）耐性を付与するプラス
ミドpTMPv18A（第11図参照）。さらにpTMPv18Aは自分自
身の調節シグナル、プロモーター、シャイン・ダルガル
ノ配列及びリーダー配列を有している。

B.2.M−１リパーゼ遺伝子及びクロラムフェニルコール
耐性遺伝子（Cm）を有するプラスミドpMCTM1（第18図参
照）。この構築物の場合リパーゼプロモーターは強力な
tacプロモーターに交換している。

B.3.プラスミドpMCTbliM1もＭ−１リパーゼ遺伝子及び
クロラムフェニコール耐性遺伝子を有している。この構
築物の場合、リパーゼシクナル配列はα−アミラーゼシ
グナル配列に交換されている（EP−Ａ−0224294参
照）。プロモーターは構築物pMCTM1と同じである。

B.4.プラスミドpTZ18RNはネガティブコントロールとし
て使用した（第17図参照）。

上述したプラスミドのDNA（0.5μｇ）をインビトロで
転写した。この反応は0.5μの10xTB/10xNTPミックス
（20xTB及び20xNTPの等量混合物;20xTBは800mMトリス・
HCl、pH7.5、120mM MgCl₂及び40mMスペルミジン;20xNTP
ミックスには10mM ATP、10mM CTP、10mM GTP及び10mM U
TP）、0.5μの0.1MDTT、0.5μのRNasin（40u/μ
、プロメガ社）及び0.5μのT7RNAポリメラーゼ（15
u/μ、プロメガ社）又は１μの大腸菌RNAポリメラ
ーゼ（1u/μ、ベーリンガー社）を加えることにより
行った。この反応混合物を39.5℃で１時間インキュベー
ションした。

RNA転写物のインビトロでの翻訳は業者の説明書に従
って行った。Ｍ−１リパーゼはヴァンモリク（Van Mour
ik）（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）260（1985）11300−11306）の方法
に従がいＭ−１リパーゼに対するモノクローナル抗体を
用いて免疫沈殿化した。

ネガティブコントロールとしてはpTZ18RNを使用した
（第21図、レーンＡ及びＥ）。pTMPv18Aの免疫沈殿化
（レーンＢ）はプロセシングを受けていない34kDaM−１
リパーゼを示した。pMCTM−１の免疫沈殿化（レーン
Ｃ）ではプロセシングを受けていない34kDaのＭ−１リ
パーゼ及び31.5kDaの成熟Ｍ−１リパーゼが示された。
一方pMCTbliM1の免疫沈殿化（レーンＤ）は31.5kDの成
熟Ｍ−１リパーゼを示した。このインビトロでの翻訳実
験からＭ−１リパーゼ遺伝子は大腸菌のＳ−30抽出物中
で発現し得ると結論できる。pTMPv18Aのインビトロ転写
／翻訳実験から得られたデータはＭ−１リパーゼがプロ
セシングを受けてない理由からトリブチリンプレート上
で脂質分解活性を示さない事を裏付けた（例4B参照）。

例 ７ プローブとして特性の明らかなリパーゼ遺伝子を用いた
酵素分子のスクリーニング さらに本発明の一般的応用性を説明するために、別の
微生物に由来する同等の特性を有するリパーゼ遺伝子の
探索に本出願で公開されているプローブを使用した。こ
こでは同様又は同等の洗浄応用性を有するリパーゼをコ
ードするリパーゼ遺伝子を選択し得ることを示した。

例８において我々は本ハイブリダイゼーション技術に
よって他の微生物に由来する同種リパーゼ遺伝子をクロ
ーン化し得ることも示した。

これを行うため、以下の株、シュードモナスシュード
アルカリゲンス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）Ｍ
−１（CBS473.85）,P.シュードモナスシュードアルカリ
ゲンスIN II−５（CBS468.85）,P.アルカリゲンス（DSM
50342）,P.アルギノサ（aeruginosa）（PAC1R（CBS136.
85）P.アルギノサ（aeruginosa）PAO（ATCC15692）（ウ
ォルファース（Wohlfarth）及びウィンクラー（Winkle
r）,1988、ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイ
オロジー（J.Gen.Microbiol.）134,433−440）,P.スツ
ゼリ（stutzeri）Thai IV17−１（CBS461.85）;P.スツ
ゼリ（stutzeri）PG−Ｉ−３（CBS137.89）,P.スツゼリ
（stutzeri）PG−Ｉ−４（CBS138.89）,P.スツゼリ（st
utzeri）PG−II−11.1（CBS139.89）,P.スツゼリ（stut
zeri）PG−II−11.2（CBS140.89）,P.フラジ（fragi）D
B1051,P.グラジオリ（gladiori）（CBS176.86），アシ
ネトバクターカルコアセチカス（Acinetobacter calcoa
ceticus）Gr−Ｖ−39（CBS460.85）及びスタフィロコッ
カスオーレウス（Staphyrococcua aureus）（ATCC2766
1）の染色体DNAを単離し、その５μｇを消化してからサ
ウザンブロッティング技術で分析した（マニアテス（Ma
niatis）等、上述）。そのDNAをニトロセルロースフィ
ルター（シュレイチャー・アンド・シュエル（Schleich
er ＆ Schuell）社、BA85:0.45mM）に移した。このフィ
ルターを6xSSC、5xデンハート液、0.5％SDS及び100μg/
ml変性ウシ胸腺DNA中でプリハィブリダイズした。

２時間のプレインキュベーション後、各々32Pラベル
化したpTMPv18A又はpET3の挿入物を加え、ハイブリダイ
ゼーションを55℃、16時間で行った。

挿入DNAをXho I及びEcoR VによるpTMPv18A及びEcoR I
によるpET3の消化によりそれぞれ単離し、その断片を0.
8％アガロースゲル電気泳動で分画した後ガラスミルク
操作（ジーンクリーン）によりそれらを回収した。pTMP
v18Aの挿入物である1kb Xho I/EcoR V断片及びpETT3の
挿入物である3.2kb EcoR I断片をα32PATPを用いたニッ
クトランスレーションによりインビトロで高い放射性を
もつように（２〜５×10⁸cpm/μｇ）ラベル化した（フ
ェインバーグ（Feinberg）及びボゲルスタイン（Vogels
tein），アナリティカルバイオケミストリー（Anal Bio
chem.）132（1983）６−13）。プローブ断片は平均300
〜800塩基長を有することが示された。

それからフィルターを6xSSC、0.1％SDS中55℃で30分
の条件で２回洗浄した。フィルターを室温で乾燥後−70
℃で増感スクリーン（クロネックス、ライティングプラ
スGH220020）を用いてコダックＸ−omatARフィルム又は
クロネックス4NIF100X線フィルム（デュポン）に１〜３
日間露光することによりオートラジオグラフを得た。

ハイブリッドの安定性に関する種々の因子の影響を分
析して誘導された以下の式 Tm＝81＋16.6（log10Ci）＋0.4（％Ｇ＋Ｃ）−600/n−15％ ミスマッチ （“分子生物学における最新プロトコール”、1987−19
88、オースベル（Ausubel）等編） （式中 ｎ＝プローブの最小鎖長 Ci＝イオン強度（Ｍ） Ｇ＋Ｃ＝塩基組成） を我々の実験で検出された相同性を測定するのに用い
た。プローブ長を300塩基と仮定すると、300塩基以上の
断片内の少なくとも67％の相同性を示す遺伝子を検出し
得た。相同性の割合を測定する上でシュードモナス（Ps
eudomonas）のGC含量は65％と仮定した（ノーモア（Nor
more）,1973,ラスキン（Laskin）及びレチェバリア（Le
chevalier）（編）“微生物学ハンドブック"II巻、CRC
プレス、ボカレイトン、Fla） 第22A図はpET3のEcoR Iをハイブリダイズした場合の
染色体DNAのSal I消化物のハイブリダイゼーションパタ
ーンを示している。

全んどのシュードモナス（Pseudomonas）株はpET3ク
ローンと相同的遺伝子を含んでいることが分る。P.フラ
ジ（flagi）DB1051（レーンＭ）,A.カルコアセチカス
（calcoaceticus）Gr−Ｖ−39（レーンＯ）及びS.オー
レウス（aureus）（レーンＰ）の場合、相同的遺伝子は
検出されなかった。P.アルカリゲンス（alcaligenes）
（レーンＥ）,P.シュードアルカリゲンス（Pseudomalig
enes）（レーンＣ及びレーンＤ）,P.アルギノサ（aerug
inosa）（レーンＦ及びレーンＧ）には中程度のハイブ
リダイゼーションシグナルが観察されたが、一方、P.グ
ラジオリ（gladioli）（レーンＮ）には弱ハイブリダイ
ゼーションシグナルが観察された。非常に強いハイブリ
ダイゼーションシグナルがP.スツゼリ（stutzeri）（レ
ーンＨ〜Ｌ）で見られるがこれはpET3が本来P.スツゼリ
（stutzeri）Thai IV 17−１株に由来するので驚くべき
ことではない。

第22B図はpTMPv18AのEcoR V/Xho I挿入物を用いたと
きのハイブリダイゼーションパターンを示している。

強いハイブリダイゼーションシグナルがP.シュードア
ルカリゲンス（psudoalcaligenes）（レーンＣ及び
Ｄ）,P.アルカリゲンス（alcaligenes）（レーンＥ）及
びP.スツゼリ（stutzeri）株（レーンＨ〜Ｌ）由来の染
色体DNAから得られることが分る。P.アルギノサ（aerug
inosa）の染色体DNAにはより弱いハイブリダイゼーショ
ンが見られ（レーンＦ及びＧ）,P.フラジ（fragi）（レ
ーンＭ）,P.グラジオリ（gladioli）（レーンＮ）,A.カ
ルコアセチカス（calcoaceticus）Gr−Ｖ−39（レーン
Ｏ）及びS.オーレウス（aureus）（レーンＰ）の染色体
DNAにはハイブリダイゼーションは全くみられなかっ
た。

例 ８ 他の微生物由来の相同的リパーゼ遺伝子のクローニング ここに公開した本発明の応用性を示すため、P.アルカ
リゲンス（alcaligenes）（DSM50342）由来の相同遺伝
子をクローニングするためのプラスミドpTMPv18Aの使用
を説明する（第22B図レーンＥ参照）。

第22B図レーンＥにおいて、P.アルカリゲンス（alcal
igenes）は、プローブとハイブリダイズする明確な5.0k
b Sal I断片及び薄い0.5kb Sal I断片を示すことが分
る。このことはP.アルカリゲンス（alcaligenes）がプ
ラスミドpTMPv18AのXho I/EcoR V挿入物に対し、300以
上の塩基対断片内に少なくとも67％の相同性を有する遺
伝子を含むことを示している。

P.アルカリゲンス（alcaligenes）の5.0kb Sal I断片
がリパーゼをコードする遺伝子を含んでいるかどうかを
確めるため、Sal I断片をクローン化した。Sal I遺伝子
ライブラリーはベクターpUC19を用いて構築し、大腸菌J
M109にトランスホームした（ヤニシュ−ペラン（Yanish
−Perron）等、ジーン（Gene）33（1985）103−119）。

遺伝子ライブラリのレプリカフィルターを例７で述べ
た条件を用い、pTMPv18Aのα32Pラベル挿入物とハイブ
リダイズさせた。5.0kbのSal I断片を含む３個のポジテ
ィブクローンをそのライブラリーから単離した;pCH1、p
CH2及びpCH3。pCH1の5.0kb Sal I断片を、クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子中に存在するSal I部位を利用して
ベクターpKT248（バグダサリアン（Bagdasarian）等、
ジーン（Gene）16（1981）237−247）に再クローン化し
た。大腸菌JM109のストレプトマイシン耐性クロラムフ
ェニコール感受性トランスホーマントを選択した。期待
される5.0kbのSal I挿入物を含むこれらのトランスホー
マントのうちの１つ、pCH101をシュードモナスアルギノ
サ（Pseudomonas aeruginosa）2302（６−１）lip−株
にトランスホームした（例５参照）。

コロニーをNB−カルシウムトリオレイン寒天上で増殖
させた。増殖後このプレートを10℃で保存した。数日
後、トランスホームしたコロニーの回りにカルシウムの
沈殿が現れ、また抗生物質を含まない同じ寒天プレート
上で増殖したトランスホームしていないP.アルギノサ
（aeruginosa）2302（６−１）lip^-株の回りには現れな
い。我々はクローン化した5.0kb Sal I断片がP.アルギ
ノサ（aeruginosa）2302（６−１）lip^-株のlip^-発現型
を相補し、従って適当な宿主内で生産され得る細胞外リ
パーゼをコードしていると結論する。

DNAハイブリダイゼーション実験に基づき、これらの
リパーゼはＭ−１リパーゼとの相同性を示し、かつ結果
的にプローブとして用いられるpTMPv18A挿入物とハイブ
リダイズする他のリパーゼに対しても相同性を示すと結
論し得る。P.アルカリゲンス（alcaligenes）のリパー
ゼのクローニングの説明はＭ−１リパーゼに対する相同
性を示すリパーゼをクローン化する一般的な応用方法を
表わしている。

例 ９ シュードモナスシュードアルカリゲンス（Pseudomonas
pseudoalcaligenes）Ｍ−１由来のリパーゼと他のリパ
ーゼのヌクレオチド配列の比較 シュードモナスシュードアルカリゲンス（Pseudomona
s pseudoalcaligenes）のＭ−１リパーゼのヌクレオチ
ド配列（第12図）をシュードモナスフラジ（Pseudomona
s fragi）（IFO−3458）のリパーゼ（クギミヤ（Kugimi
ya）等、バイオケム・バイオフィズ・リサーチ・コミュ
ニケーション（Biochem.Biophys.Res.Comm.）141（198
6）185−190）、スタフィロコッカスハイカス（Staphyl
ococcus hyicus）のリパーゼ（ゴツ（Gotz）等、ヌクレ
イックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Res.）13（19
85）1891−1903）及びシュードモナスアルギノサ（Pseu
domonas aeruginosa）PAO1のリパーゼ（第14図）のもの
と比較した。Ｍ−１リパーゼ及びP.アルギノサ（aerugi
nosa）PAO1リパーゼの間には81％の高い相同性がみら
れ、またＭ−１リパーゼとP.フラジ（fragi）（IFO−34
58）の間には62％の相同性がみられた。しかし、このP.
フラジ（fragi）のリパーゼの配列は他の二つのシュー
ドモナス（Pseudomonas）のリパーゼのものよりかなり
短かい。Ｍ−１リパーゼとスタフィロコッカスハイカス
（Staphylococcus hyicus）のリパーゼの間には相同性
がみられなかった。

これらの結果は、pTMv18Aをプローブとして使用した
ときシュードモナスフラジ（Pseudomonas fragi）及び
スタフィロコッカスオーリウス（Staphylococcus aureu
s）由来の染色体DNAにハイブリダイズしないという例７
で得られたデータを支持している。

P.シュードアルカリゲンスＭ−１リパーゼのヌクレオ
チド配列から誘導されるアミノ酸配列も他のリパーゼと
比較した。Ｍ−１リパーゼのP.アルギノサ（aeruginos
a）PAO1リパーゼ間の全体にわたる相同性は78％であ
り、Ｍ−１リパーゼとP.フラジ（fragi）リパーゼ間の
相同性は48％であることが分った。Ｍ−１リパーゼとス
タフィロコッカスハイカス（Staphylococcushyicus）リ
パーゼのアミノ酸配列の間にも相同性はみられなかっ
た。しかし成熟Ｍ−１リパーゼの重要な87番セリンの領
域においては、この４種のリパーゼ間には高い相同性が
みられた。クギミヤ（Kugimiya）等は、この領域Ｇ−Ｈ
−Ｓ−Ｈ−Ｇの配列がリパーゼ酵素の活性中心であると
提唱した。

例10 SLMテストにおける相同的リパーゼの洗剤適合性 この例は現代の洗濯用洗剤中のこれらの酵素の適合性
をテストするSLMテスト修正法に従がい、洗浄プロセス
における、Ｍ−１遺伝子と高いDNA配列相同性を示す、
P.アルギノサ（aeruginosa）、P.スツゼリ（stutzeri）
及びP.アルカリゲンス（alcaligenes）株によって生産
されるリパーゼ酵素の性能を説明している。

使用している洗剤は粉洗剤（ALL^Rベース、EP−Ａ−02
18272に報告されている）及び液体洗剤（液体TIDE^Rこれ
もEP−Ａ−0218272に報告されているがプロテアーゼの
不活性化は行っていない）である。これらのリパーゼ酵
素の調製は以下の操作に従がいバクテリアを培養するこ
とにより行った：バクテリアを100mlのブレインハート
インフュージョン（BHI）培地中、30℃、24時間、ロー
タリーシェーカーを用いて培養することにより接種培地
を調製した。その後、以下に述べる組成の培地１を含
むラボファーメンター（２）に接種した。 培 地 組 成 成 分 濃度（g/kg） ブレインハートインフュージョン 18.50 （BHI）（ディフコ） イーストエキストラクト（ディフコ） 16.00 塩化カルシウム・2H₂O 0.80 硫酸マグネシウム・7H₂O 3.20 硫酸マンガン・H₂O 0.030 大豆油 5.0 リン酸二カリウム 6.4 発酵は30℃で行った。接種から16時間後、1g/hの速度
で大豆油を注入し始め、さらに発酵を続けた。通気速度
は60/h及び撹拌速度は700rpmで行った。発酵は計64時
間行った。

発酵後、そのバクテリアを遠心で除去した。その上清
を室温で撹拌しながら2.5倍容のアセトンと迅速に混合
した。それからこの混合物を10分間撹拌してから放置
し、これを吸引ロ過した。ロ過固形分を70％アセトンで
洗浄後、100％アセトンで洗浄し、これを減圧下で乾燥
した。

このようにして得たリパーゼ酵素調製物をSLMテスト
法でテストした。SLMテストの操作はEP−Ａ−0218272に
述べられている。この操作は以下のように修正して行っ
た。

アセトンに溶かした10mgのオリーブ油（25％）を含む
溶液をポリエステルスワッチ（３×3cm）上にスポッテ
ィングし、室温で空気乾燥した。10mlのSHW（標準硬水:
0.75mM CaCl₂、0.25mM MgCl₂）又はSHWに溶かした洗剤
からなる洗浄液をスリ栓付三角フラスコ（25ml）に入
れ、40℃の振盪水槽中に保持した。テストした洗剤は粉
末洗剤（ALL^Rベース）及び液体洗剤（TIDE液）である。
ALLベース洗浄液の濃度は4g/（pH9.5）で行ない、液
体TIDEの濃度は1.5g/（pH7.5）で行った。洗浄プロセ
スは酵素調製物を三角フラスコに加え、直ちに汚れた標
本を入れて40℃で40分以上振盪した。最終的リパーゼ濃
度は2TLU/mlであった。

洗浄後、その標本をSHWですすいだ後55℃で１時間乾
燥した。そのように乾燥した標本を再び新しい洗剤及び
酵素液を用いた40分間の二次洗浄サイクルで洗浄した。
二次洗浄サイクル後、標本を0.01NのHClで処理し、すす
いだ後に室温で一晩乾燥した。乾燥標本を、5mlの溶媒
（ｎ−ヘキサン／イソプロピルアルコール／ギ酸;975:2
5:2.5（v/v）、1ml/min）を入れたガラス管中で回転さ
せることにより抽出を行った。生成した残渣のトリグリ
セリド、ジクリセリド及び遊離脂肪酸をHPLCで測定し
た。

HPLC装置及び条件 カラム:CPマイクロスフィアーSi（クロムパック）、100
×4.6mm 注入システム：ウィスプ（ミリポア）10μ ポンプ ：モデル2150（LKB） 検出器 ：屈折率モニター（ジョビンジボン） インテグレーター:SP4270（スペクトラフィジス） 溶出液 :m−ヘキサン／イソプロピルアルコール／
ギ酸975:25:2.5（v/v）,1ml/min 温度 ：室温 トリオレインの保持時間は1.2分、1,3ジグリセリドは
2.5分、1,2−ジグリセリドは3.6分及びオレイン酸は1.6
分であった。ピーク面積又はピーク高さをトリグリセリ
ド及び脂肪酸の回収の指標として測定した。非洗浄標本
から抽出したトリグリセリド回収量を100％とした。ト
リオレイン及びオレイン酸の屈折率の比はピーク高さか
ら1.0であることが分った。

これらのSLMテストの結果を以下の表に示す。これら
の表にはトリグリセリド回収率及び全脂質回収率を示し
た。全脂質回収物とはトリグリセリド、1,2及び1,3ジグ
リセリド、及び遊離脂肪酸をたし合せたものである。全
脂質回収率とトリグリセリド回収率の差は、リパーゼの
活性及び性能の尺度となる。全脂質回収率とコントロー
ル（リパーゼ酵素なし）の差は布からの油汚れの除去を
示しており、これらの酵素がSLMテストに模倣された現
実的洗浄条件で安定かつ有効であることを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07 1:19 1:38） 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４６０．８５ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４６１．８５ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４６８．８５ (72)発明者 コックス マリア マチルド ジョゼフ ィーナ オランダ国 エヌエル‐1012カーテー アムステルダム ローキン 38‐３ (72)発明者 ファラン ファロック オランダ国 エヌエル‐2394ハーセー ハーゼルスワウデ レインデイク ファ ン ベートーヴェンラーン 20 (72)発明者 ヴオールファルト スザンヌ ドイツ連邦共和国 デー4600 ドルトム ント アイッヒリンクホッフェン ペル ゼベッケルシュトラーセ 45 (56)参考文献 特開 昭63−32489（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−500423（ＪＰ，Ａ) ・Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，134, （1988），Ｐ433−440 ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, 141，［１］（1986），Ｐ185−190 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/20 ＷＰＩ／Ｌ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】転写の５′−３′方向に、宿主細胞中で機
   能する転写調節領域及び翻訳開始領域、下記アミノ酸配
   列を有する脂質分解性酵素をコードするDNA配列及び宿
   主細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含み、該DN
   A配列の発現が該転写及び翻訳調節領域の制御下にある
   発現カセットを含む微生物の形質転換宿主細胞。
2. 【請求項２】発現カセットがさらにマーカー遺伝子を含
   む請求の範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。
3. 【請求項３】DNA配列が脂質分解性酵素をコードする遺
   伝子に適当な読み枠で結合するリーダー配列を含む請求
   の範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。
4. 【請求項４】該宿主細胞が原核細胞である請求の範囲
   （１）記載の形質転換宿主細胞。
5. 【請求項５】該原核細胞がバチルス、大腸菌又はシュー
   ドモナス細胞である請求の範囲（４）記載の形質転換宿
   主細胞。
6. 【請求項６】該DNA配列が微生物細胞に由来する請求の
   範囲（１）記載の形質転換宿主細胞。
7. 【請求項７】該DNA配列がシュードモナス種に由来する
   請求の範囲（６）記載の形質転換宿主細胞。
8. 【請求項８】該DNA配列がP.シュードアルカリゲンスに
   由来する請求の範囲（７）に由来するの形質転換宿主細
   胞。
9. 【請求項９】前記DNA配列がP.シュードアルカリゲンス
   Ｍ−１（CBS473.85）に由来する請求の範囲（８）記載
   の形質転換宿主細胞。
10. 【請求項１０】TLU測定条件下pH一定での測定で８〜10.
    5の至適pH範囲を有し、かつ温度約60℃以下でかつpH7〜
    11の洗浄条件下、10g/までの濃度で洗剤を含む水溶液
    中でリパーゼ活性を示す脂質分解性酵素を調製する方法
    で、 （イ）栄養培地中、転写の５′−３′の方向に宿主細胞
    中で機能する転写調節領域及び翻訳開始領域、下記アミ
    ノ酸配列を有する脂質分解性酵素をコードするDNA配列
    及び宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終止領域を含
    み、該DNA配列が該転写及び翻訳調節領域制御下にある
    発現カセットを含む宿主細胞を増殖する、 （ロ）該脂質分解性酵素を単離する 以上のステップを含む方法。
11. 【請求項１１】脂質分解性酵素を生産する方法で、 （イ）栄養培地中、請求の範囲（１）乃至（９）記載の
    形質転換微生物宿主細胞を培養し、リッチブイヨンを作
    る、 （ロ）該培地から該脂質分解性酵素を単離する、 以上のステップを含む方法。
12. 【請求項１２】転写の方向に、微生物宿主細胞中で機能
    する転写調節領域、TLU測定条件下pH一定で８〜10.5の
    至適pH範囲を有し、かつ温度約60℃以下でかつpH7〜11
    の洗浄条件下で10g/までの濃度の洗剤を含む水溶液中
    でリパーゼ活性を示す下記アミノ酸配列を有する脂質分
    解性酵素をコードするDNA配列、及び宿主細胞中で機能
    する転写終止調節領域を含むDNA構築物。
13. 【請求項１３】請求の範囲（12）記載のDNA構築物で、
    さらに選択マーカー遺伝子及び分泌リーダー配列のうち
    の１つを含むDNA構築物。