JP3019344B2 - ９５ｋｂ程度の大きさのｄｎａ断片用ｐ１バクテリオフアージクローニング系 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は大きさが95KB程度のDNA断片の増幅を制御
するバクテリオファージP1クローニング系に関する。

発明の背景 組換えDNA技術は高等真核生物（植物と動物）の染色
体からのDNA断片をEscherichia coli（E.coli）のよう
な細菌の中で増殖することができるベクターを使用して
クローン化し、増幅することを可能にした。

DNAをその取込みを可能にした細菌中で直接導入する
場合、DNAの細菌への取込みの効率はDNAの大きさが20KB
以上に増加すると劇的に減少するのでDNAは比較的小さ
く（20KB以下）なければならない。このため、大きなDN
Aを細菌に導入するため別の供給経路が探索された。ウ
ィルス粒子中にバクテリオファージベクターDNAを包み
込む技術がこの必要に応ずるため開発された。それは包
み込んだDNAをほとんど単位効率を伴う感染により細胞
に供給される利点を持つ。Bruning等、Gene（1978年）7
5巻、85〜107ページとCollins等、Proc.Natl.Acad.Sci.
（1978年）75巻、4242〜4246ページはSternberg等、Gen
e（1975年）１巻、255〜280ページが開発したラムダバ
クテリオファージのインビトロパッケージ反応を利用し
てプラスミドとラムダバクテリオファージcos部位の融
合物であるコスミドベクター中でクローン化した大型挿
入断片を包み込んだ。cos部位はラムダバクテリオファ
ージ頭部へのDNAパッケージの開始に必要な認識要素を
提供する。

インビトロパッケージ反応におけるラムダバクテリオ
ファージの主要な欠点はラムダバクテリオファージ頭部
は49.5kbより大きいDNAを載せないということである。
従って、cosベクター自身が約2kbの大きさであることを
考慮に入れると、47kb以上のクローン化可能なDNAをベ
クターに挿入し、ラムダバクテリオファージ頭部に包み
込むことはできない（Murray,Lambda II 236（Cold Spr
ing Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York
1986年）、395〜432ページ）。

従って、50kbより大きい遺伝子のクローニングは達成
することができず、及び大きさが数メガ塩基のDNAの染
色体部分の「ウォーキング」又は「ジヤンピング」によ
る地図作成は困難であり、このことはラムダバクテリオ
ファージ系の制限となっている。研究者はより大きいDN
A断片をクローニングする有能な手段として二つの系、
すなわちラムダバクテリオファージより大きい頭部を持
つファージ系と酵母クローニングベクターを探索した。

Rao等、J.Mol.Biol.（1985年）185巻、565〜578ペー
ジはT4 DNA（約165キロ塩基）をインビトロでT4バクテ
リオファージ頭部を包み込むことができることを示し
た。この反応の効率は添加したT4 DNAマイクログラム当
り10⁴〜10⁵プラーク形成単位（PFU）であった。しかし
ながら、Black、Gene（1986年）46巻、97〜101ページは
種々なベクターDNAをT4頭部に包み込み、適当な細菌に
注入後前記DNAを回収する努力を重ねたが、添加DNAのマ
イクログラム当り10²〜10³PFUを上回る効率は得られな
かった。Blackの結果は哺乳動物細胞のそれのような複
雑なゲノムの150kb挿入断片の完全なライブラリー（す
なわち、150kb挿入断片の約20,000個相当）を生成させ
ることはT4パッケージ系の使用を以てしては極めて困難
であることを示唆する。第二の恐らくより困難な問題
は、大きなDNA断片をクローン化し増幅するためT4パッ
ケージ能力を利用できるクローニング用ベクターが存在
しないことである。実際、T4パッケージの開始に必要な
T4配列に関してはほとんど何も知られていないので、そ
のようなベクターを組み立てることは困難であろう。

Burke等、Science（1987年）236巻、806〜812ページ
は哺乳動物DNAの大セグメントをミニ染色体として酵母
中でクローン化することができた。挿入するDNAは酵母
複製要素、酵母分裂要素又はセントロメア、及び酵母テ
ロメアを含むベクター中にクローン化し、生成するキメ
ラDNAを直接DNA形質転換により酵母に導入する。100kb
より大きいDNAの挿入断片を持つミニ染色体を確認し
た。この系には二つの問題がある。第一にDNAの挿入断
片を持つ酵母クローンの生成は極めて非効率であり、記
述した実験においては約300クローンが挿入DNAのマイク
ログラム当り生成した。第二に一旦DNAの挿入断片を持
つクローンが得られると、挿入DNAを探り当てて回収す
ることは困難である。形質転換した酵母細胞において、
ミニ染色体は細胞の全DNAの1:1000以下に相当し、従っ
てDNAハイブリダイゼーション法によってのみ検出する
ことができる。その上、各々の形質転換した細胞内で挿
入断片は増幅することができず、それらは細菌中へのプ
ラスミド救援によってのみ一部分を回収することができ
る。

他の問題の系はGaitanaies等、Gene（1986年）46巻、
１〜11ページに記述されている。DNAを注入することが
でき、次いでそれを細胞内に注入することができるラム
ダベクターが記述されている。注入したDNAは宿主染色
体中に細胞当り１コピー、又は染色体外に細胞当り多数
コピー組み込まれて細胞内に維持される。このベクター
は30kb以下のDNAを載せることができるが、組み込まれ
たプロファージのDNA量はその挿入断片が組み込まれた
プロファージにおけるそれと重複する第二の感染ラムダ
キメラと相同組換えすることにより著しく増加すること
ができる。この方法で任意のプロファージにおける相接
するDNAのセグメントを100kb以上に増加し、その後ベク
ターの染色体外状態を誘導することにより増幅すること
ができる。しかしながら、これを達成するには少なくと
も数個の相接し重複するDNAのより小さいセグメントを
クローン化し、それらを組換えにより共に配列する困難
な方法を実行することが必要である。その上、大きなDN
A挿入断片は一旦組み立てられると回収することが困難
であり、何となればそれはラムダウイルス粒子中に包み
込むには大きすぎるからである。染色体外状態にあるDN
Aの直接単離もそれが大きいことから困難である可能性
がある。

発明の要約 この発明は次の配列、すなわちP1 loxP部位−アンピ
シリン耐性遺伝子−pBR322ori−pac−P1 loxP部位−ポ
リリンカークローニング部位−カナマイシン耐性遺伝子
−P1プラスミドレプリコンからなる95kb程度の大きさの
DNA断片のクローニング用ベクターに関し、前記配列はP
1プラスミドプリコンが第一のP1 loxP部位に付着して配
列が反時計方向に読まれるように環化している。このベ
クターの好ましい具体化は上に列挙したすべての要素並
びにポリリンカークローニング部位とカナマイシン耐性
遺伝子の間に挿入されたlacZプロモーターの制御下にあ
るP1溶菌レプリコンを持つ。

95kb程度の大きさのDNA断片のクローニング及び増幅
を制御する方法は（ａ）外因性DNAをP1溶菌レプリコン
を含むベクターのポリリンカークローニング部位に挿入
し、（ｂ）段階（ａ）の生成物をpac−開裂プロフィシ
ェント抽出物及び頭−尾プロフィシェント抽出物と接触
させ、（ｃ）Cre⁺、lacIqレプレッサーを持つグラム陰
性菌を段階（ｂ）の生成物に感染させ、段階（ｃ）の生
成物にIPTGを添加してレプレッサーを脱抑制し、及び
（ｅ）クローン化し増幅したDNAを回収する段階からな
る。

この発明は溶原NS2962とNS2961及び溶原から調製した
pac−開裂プロフィシェント及び頭−尾プロフィシェン
ト抽出物からなるインビトロP1パッケージ系に関する。
包み込んだDNAはその後E.coliのような種々のグラム陰
性細胞に感染させるために使用することができる。

BS591及びNS2974と称するCre⁺グラム陰性細菌株を特
別に工学処理してこの発明のベクターにより感染し形質
転換した。BS591はlacIqレプレッサー遺伝子を持たな
い。一方NS2974はlacIqレプレッサー遺伝子を持ち、従
って一旦形質転換するとIPTGを添加するまでlacZプロモ
ーターを抑制することができる。

図面の簡単な説明 第１図は一般的なP1バクテリオファージクローニング
と増幅系を示す。

第２図は本発明に関連するP1遺伝子と要素の地図を示
す。

第３図は、本発明のベクターの組立てを示す。

第4A図はガンマ³²P−dATPで両端を付票した600bpデル
タ−3pac断片を示す。

第4B図はpcp⁺パッケージ抽出物のpac開裂活性を示
す。

第5A図はCreリコンビナーゼが作用した場合のpNS358
のDNAの分裂を示す。

第5B図は形質転換したBS591菌においてCreが作用した
ベクターDNAを示す。

第6A図はpNS364の構造を示す。

第6B図はkan−Ｒ遺伝子、P1プラスミドレプリコン、
及びP1溶菌レプリコンを含むプラスミドpNS364の増幅を
示す。

第7A−7C図と第8A−8B図は包み込んだpNS358DNAとそ
れを含むE.coli挿入断片の回収と確認を示す。

寄託の声明 本発明に関する次の細菌とプラスミドはブダペスト條
約により、Maryland 20852−1776、Rockville,Parklawn
Drive 12301に依存するAmerican Type Culture Collec
tionに寄託した。

pNS20はATCC Accession No.67666と命名された。

pNS42はATCC Accession No.67667と命名された。

BS591はATCC Accession No.53760と命名された。

NS2961はATCC Accession No.67665と命名された。

NS2962はATCC Accession No.67664と命名された。

NS2974はATCC Accession No.53759と命名された。

発明の詳細な説明 本発明はバクテリオファージP1のインビトロパッケー
ジ系と95kb程度の大きさの外因性DNA挿入断片の導入と
増幅制御のための新規なクローニング用ベクターに関す
る。このクローニング系の組立てに使用される多くの要
素は最近詳細に総括されている（Yarmolinsky ＆ Stern
berg,The Bacteriophage,Bacteriophage P1,Chapter 9,
1988,Plenum Publishing Corporation,233 Spring St.,
New York,NY）。P1遺伝子とloxP−Cre組換え系、P1プラ
スミドレプリコン、P1溶菌レプリコン、及びpac部位を
第２図に示す。

ここに記述するクローニング系はラムダコスミドクロ
ーニング系で得ることができるDNA断片の大きさの少な
くとも２倍の大きさのそれの単離を可能にする。この大
きさの増加は次の有用性を持つ。すなわち （１）45−95kbの大きさの範囲の遺伝子は直接クローン
化でき、及び25−45kbの大きさの範囲の遺伝子はより容
易にクローン化できる。

（２）染色体「ウォーキング」及び「ジャンピング」技
術は少なくとも２倍に速度を上げることができ、共に連
結することを要する相接するセグメントの数が減るので
より正確になるであろう。

（３）P1ファージは広範囲の種類のグラム陰性細菌（第
１表）にそれらのDNAを注入することができるように見
えるので、インビトロP1パッケージ系は他の方法では溶
接からDNAをよく摂取しない細菌にDNAを効率的に供給す
る手段として有用であろう。

loxP−Cre組換え系 これは組換えが極めて効率的に起こる34bp部位又はDN
A配列（loxP）と、前記部位に接触し組換えを促進する
タンパク質酵素（Cre）とからなる部位特異的組換え系
である。Abremski等、Cell（1983年）32巻、1301〜1311
ページは超コイル、切れ目の入った環状、又は線状DNA
とloxP部位との間の組換えはCreの存在下で起こること
を示した。P1生活環においてCreは100kb離れたloxP部位
との間の組換えを促進することができる。Cre遺伝子は
ラムダベクター中にクローン化され、E.coli染色体中に
ラムダ−P1:Creプロファージとして存在する場合Creを
発現する。Sternberg等、J.Mol.Biol.（1986年）187
巻、197〜212ページはプロファージがそれから組み立て
られる機能的Cre遺伝子を含むpHR103変異株を記述して
いる。

P1プラスミドレプリコン P1プラスミドレプリコンと分配領域は溶原性細胞の集
団における単位コピー染色体外要素としてのP1プロファ
ージを維持するための責任がある。それはDNAの開始点
配列で細胞分裂周期当り１回の複製を開始する作用をす
るタンパク質をコード化する複製遺伝子（repP）を含
む。レプリコンには二つの遺伝子parAとparPも存在し、
それらはparS部位で細胞分裂の際、複製の生成物を娘細
胞に正確に分配する作用をする。

P1溶菌レプリコン P1増殖型及び溶菌レプリコンはプロファージ脱抑制後
30分以内に高いコピー数までDNAを複製することができ
る。このレプリコンは転写プロモーターP53と下流のrep
L遺伝子からなり、その生成物は開始点配列で複製を促
進する作用をする。レプリコンはP53に結合するファー
ジc1レプレッサーにより負の制御を受け、repL遺伝子の
転写を妨げる。

プロセッシブ頭部パッケージ、pac、及びpac認識タンパ
ク質（PRP） ウイルス生活環の間のパッケージ反応に使用するDNA
基質は頭部−尾部形式で配列するP1染色体の個々の単位
からなるコンカテマーである。パッケージは４段階の過
程である。すなわち（１）第１段階では特異的部位、pa
cが認識されてPRPタンパク質（一つ又は複数）により切
断され、（２）分裂の一方の側のDNAは空のファージ頭
部に頭部が完全に充満するまで包み込まれ、（３）第２
の分裂（頭部の切断）が起こって包み込まれたDNAがコ
ンカテマーの残りから分離され、及び（４）前の頭部の
切断で生成した自由末端から２回目のDNAパッケージが
始まり、従って用語、プロセッシブ頭部切断が生れる。
Sternberg等、J.Mol.Biol.（1987年）194巻、496〜479
ページは十分に機能的なpac部位を含む161bpの配列のク
ローニングを記述している。又、これらの研究はpacの
認識と開裂はファージの頭部と尾部の不存在下で起こる
ことができ、P1遺伝子９（第２図）の変異により機能が
失われることを示している。包み込まれたP1 DNAの末端
は包み込まれたラムダDNAのように相補的な一本鎖配列
を含まず、従ってP1DNAを細菌は注入した後、その環化
は鎖のアニーリングによっては起こらず、むしろ分子の
末端に存在する相同配列の間の組換えによって起こる。
このような状況であることから、P1パッケージを使用す
る任意のベクター、又は任意の頭部パッケージを使用す
るそれは線状の包み込まれたDNAを組換えにより環化す
る手段を工夫しなければならない。この発明において、
環化はベクターにP1 loxP部位を組み込み、Creリコンビ
ナーゼを使用してCre⁺、グラム陰性細菌に注入後DNAを
環化する。

P1は二つの大きさの頭部を生産し、大きい頭部は105
〜110kbのDNAを載せることができ、小さい頭部は40kb以
下のDNAを載せることができる。正常にはP1野性型感染
における大頭の小頭に対する比率は10:1であるが、しか
しながら、ここで使用する本発明の包み込んだリゼート
の調製に使用するP1のcm−２変異株は頭部大きさの比率
が1:1である。もっぱら大きいファージ頭部のみにDNAの
包み込みを確実にするため、DNAは小頭部に載せること
ができるより大きくなければならない。

P1宿主範囲 バクテリオファージP1は別な方法ではDNAを有効に摂
取することができない種々なグラム陰性細菌に吸着し、
及びそのDNAを注入することができる。P1ビリオンが吸
着しDNAを注入することができる細菌の表を第１表に示
す。

これらの株においてバクテリオファージを生産するP1
の能力も表に示されている。インビトロでP1ファージに
DNAを包み込む能力と共に、任意のこれらの細菌からDNA
を直接パッケージ用ベクター中にクローン化し、前記DN
AをP1ビリオン柱に包み込み、次いでこれをP1注入に熟
練したこれらの細菌に戻すことも可能である。このすべ
てはE.coliで挿入DNAを複製することなく実行され、前
記細菌中では挿入DNAがその元の宿主に入って場合それ
を制限酵素から保護するメチル化パターンの喪失が起こ
る。

細菌株と培地 E.coliのDH5デルタ−lacU169、W3350、NS439、N99、J
M101、JM109、594及びYMC株、及びその誘導株はプラス
ミドとファージP1の宿主の役割をすることができる。DH
5デルタ−lacU169はLitton BioneticsのDr.Michael Ber
manから入手したが、この株はDHIの変異株であるDH5の
誘導株であって、Hanahan,J.Mol.Biol.（1983年）166
巻、557〜580ページに記述されている。BS591はCre遺伝
子を含むpRH103から組み立てられるラムダ−imm434−P1
プロファージを伴うDH5デルタ−lacU169（以後DH5と呼
称する）である。pRH103変異株はSternberg等によりJ.M
ol.Biol（1986年）187巻,197〜212ページに記述されて
いる。BS591はlacIqレプレッサー遺伝子を含まない。JM
101とJM109はMA01915、Beverlyに存在するNew England
Biolabsから入手し、Yanish−Perron等によりGene（198
5年）33巻、102〜119ページに記述されている。NS2974
はJM109であり、機能的Cre遺伝子とlacIqレプレッサー
を含むラムダ−imm434−P1プロファージを持つ。、594
とW3350株はCambell等、Carnegie Institute of Wash.Y
earbook（1987年）57巻、386ページに記述されており、
YMCはDennert等、J.Mol.Biol.（1968年）33巻、322〜32
9ページに記述されており、N99はShimada等、J.Mol.Bio
l.（1972年）93巻、483〜503ページに記述されている。
NS 439はtrp E 5947変異を伴うYMC株である。NS 3067は
NS 439であり、機能的Cre遺伝子を持つラムダ−imm434
−P1プロファージを持つ。細菌増殖用培地（すなわちＬ
ブロス及びＬ−amp寒天）はMiller,Experiments in Mol
ecular Gemetics（Cold Spring Harbor Laboratory,Col
d Spring Harbor,NY,1972）に記述されている。

ファージ法 用語バクテリオファージとファージは互換的に使用さ
れる。ファージリゼートの調製、ファージ遺伝的交雑種
の作成、ファージ相補性試験の実施及びファージ溶原化
を起こさせるP1ファージ（P1バクテリオファージ、P1）
操作はSternberg等によりJ.Mol.Biol.（1986年）187
巻、197〜212ページ、及びSternberg等によりJ.Mol.Bio
l.（1987年）194巻、453〜468ページに記述されてい
る。

DNA調製と操作 20kbより小さいプラスミドDNAをE.coliから（１）Hol
mes ＆ QuigleyによりAnal.Biochem.（1981年）114巻、
143〜197ページに記述された迅速法（以後迅速プラスミ
ド調製と呼称する）、又は（２）Godson及びVapnek,BMA
（1973年）289巻、156〜522ページに記述された塩化セ
シウム密度勾配法により調製した。20kbより大きいプラ
スミドDNAはBirnboim等、Nucl.Acids Res.（1979年）７
巻、1513〜1523ページの方法により調製した。細胞DNA
はE.coliからSternberg等、J.Mol.Biol.（1987年）194
巻、469〜479ページにより記述されたように単離した。
DNAの大きさを200kb以上に維持するため、この単離過程
の間剪断力を避けるように注意した。パルスフィールド
アガロースゲル電気泳動をCarle等、Science（1986年）
232巻、65〜68ページにより記述されたように実行し
た。DNAの制限酵素消化とT4 DNAリガーゼによりDNA連結
反応は発売者が明示したように実施し、この場合発売者
はNew England Biolabsであった。DNAを操作するすべて
の他の方法はManiatis等、Molecular Cloning:A Labora
tory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory,Box 10
0,Cold Spring Harbor,NY 1982）により記述されてい
る。

サザン分析 DNAをアガロースゲルからニトロセルロース膜に移
し、Southern,J.Mol.Biol.（1975年）98巻、503〜507ペ
ージの方法により特別に付票したDNA断片又はプラスミ
ドでプローブし、前記方法は以後「サザン分析」と呼称
する。

制限分析 500ナノグラムのDNAを20マイクロリッターの酵素購入
先であるNew England Biolabs（Beverly,MA01915）が明
示した緩衝液中で、37℃で２時間１〜２単位の制限酵素
で消化した。反応を0.25％ブロムフェノルブルー0.25％
キシレンシアノール、及び40％（w/v）シュクロースの
溶液の３マイクロリッターを添加して停止し、次いで反
応物を70℃で５分間加熱した。この試料をTris−Borate
−EDTA緩衝液（0.089M Tris−Borate,0.089Mホウ酸,0.0
02M EDTA）に浸漬した１％アガロースゲル（15×15cm）
のみぞに添加した。電気泳動を20ミルアンペア（30ボル
ト）でキシレンシアノールのバンドがゲルの行程の３分
の２移動する通常約12時間室温で実行した。次いでゲル
を臭化エチジウムの0.5マイクログラム/mlの溶液中で30
分間染色し、ゲルの画を透過紫外光源（320nm）とポラ
ロイド型57フィルムを使用して撮影した。

DNAのアルカリホスファターゼ（AP）による処理 前章で記述したようにDNAを制限酵素で消化した後、
これを70℃で５分間加熱した。反応物を37℃に冷却し、
10mM Tris−HCl（pH8.0）溶液で100マイクロリッターに
し、次いでウシ腸アルカリホスファターゼの0.01単位と
共に37℃で１時間インキュベートした。反応物を等量の
フェノールで４回及び等量のクロロホルム−イソアミル
アルコール（24:1）で１回抽出し、次いでDNAを1M LiCl
₂中で２量のエタノールと共に−20℃で３時間沈澱させ
た。

断片のベクターへの連結と挿入 連結反応を6mM Tris−HCl（pH7.5）、5mM MgCl₂、5mM
ジチオスレイトール、1mM ATP、100マイクログラム/ml
ウシ血清アルブミンを含む20マイクロリッターの液量中
で実施した。適格な細菌中へ形湿転換により回収される
プラスミドへの断片の挿入を含む反応のため、100ngの
消化したベクターDNAと100〜400ngの挿入断片を使用し
た。インビトロファージパッケージにより回収されるプ
ラスミドベクターを含む反応のため、500ngのベクターD
NAと１〜５マイクログラムの挿入断片を使用した。400
単位のT4リガーゼを各反応物に添加し、この反応物を16
℃で20時間インキュベートした。反応を70℃で10分間加
熱して停止した。

形質転換体の選択 E.coli株を（１）Mandel及びHiga.J.Mol.Biol.（1970
年）53巻、159〜162ページの方法、又は高い効率が要求
される場合（２）Hanahan,J.Mol.Biol.（1983年）166
巻、557〜580ページの方法により形質転換した。0.1ml
の液量中の形質転換した細胞を1mlのＬ−ブロスで希釈
し、37℃で１時間インキュベートした。培養の100〜200
マイクロリッターをカナマイシン（25マイクロリッター
/ml）又はアンピシリン（150マイクログラム/ml）のい
ずれかを含むＬ寒天平板上に拡げ、平板を37℃で16時間
インキュベートした。次いでコロニーを計数した。Amp^R
形質転換体のカナマイシンを添加したＬ寒天平板上の発
育を試験し、逆も行った。

形質転換細胞の選択 E.coli株を（１）MandelとHiga〔J.Mol.Biol.53,159
〜162（1970）〕の方法、又は高い効率を要する場合に
は（２）Hanahan〔J.Mol.Biol.166,557〜580（1983）〕
の方法に従って形質転換した。0.1mlの容量の形質転換
細胞をＬ−ブイヨンで1mlに希釈し、37℃で１時間イン
キュベートした。100〜200ミクロリットルの培養液をカ
ナマイシン（25μ/ml）又はアンピシリン（150μg/m
l）を含有するＬ寒天平板上に広げて、その平板を37℃
で16時間インキュベートした。次いで、コロニーを採点
した。Amp−Ｒ形質転換細胞を、カナマイシンを含むＬ
−寒天平板上での増殖、及びアンピシリンを含むＬ−寒
天平板上での増殖に関して調べた。

プラスミドベクター,pNS358−lytの構築 ベクターの構築における種々の工程を記したフローシ
ートを第３図に示す。開始プラスミドはpBS69であっ
た。それは、同一方向に配向された２つのloxP組み換え
部位を含む4.9kbプラスミドであった。Cre蛋白質の存在
下では、これらの部位の間に組み換えが起きて、DNAの
２つの環を生じ、その各々は１つのloxP部位と、pBS69
におけるloxP部位間のDNAの２つの領域のうちの１つと
を含有する。以後、amp−Ｒドメインと呼ばれるこれら
の環状化領域の一方は、薬剤アンピシリンに対する耐性
と、プラスミドpBR322（以後、pBR322oriと呼ぶ）のDNA
複製系（レプリコン又は複製のオリジン（ori））とを
コードする遺伝子を含有する。他方のpBS69のloxP部位
間の環状化領域は、酵母菌leu2遺伝子を含有した。

（ａ）pBS69へのP1パッケージング部位pacの挿入 DNAパッケージングの開始に必要なP1配列は、DNAの16
1bpセグメント（pac部位）に局在した。DNAのこのセグ
メントは、Sternberg等〔J.Mol.Biol.194,469〜479（19
81）〕によって記載された二重欠失突然変異体（デルタ
−３−デルタ−20）に残存するP1配列を示した。デルタ
−３−デルタ20DNAを制限酵素Xho I及びSal Iで消化
し、161bp pac部位を含有する437bp断片を単離して、pB
S69DNAのamp−Ｒドメイン内の独特のXho I部位に結紮し
た。その結果生じたpBS69−pacプラスミドは、第３図に
示されているように、パッケージングが反時計回りに起
こるように配向されたpacを含有した。pacに加えて、43
7bp挿入体は、pBR322マップ座標の375及び651の間に位
置するテトラサイクリン遺伝子配列を含有した。さら
に、437pb DNA断片中に存在し、またpacとプラスミドDN
A内のpBR 322配列との間に位置するBamH I部位を欠失し
た。BamH I部位の除去により、pBS69−pacプラスミドが
単一pBS69 BamH I部位しか有していないことが確証され
た。

（ｂ）pNS 20を生成するためのTn903カナマイシン耐性
遺伝子のpBS69−pacへの挿入 Tn903カナマイシン耐性（kan−Ｒ）遺伝子を、1.3kbA
cc I断片として、PL−Biochemicals（ウイスコンシン州
ミルウォーキー）から購入したプラスミドpuc4Kから単
離した。pBS69−pac DNAを制限酵素Cla Iで消化した
が、これはそのDNAを酵母菌lau2遺伝子内で１回切断し
た。等量（100ng）のその消化プラスミドDNA及びkan−
Ｒ遺伝子断片を20μ中に混合し、16℃で一晩結紮させ
た。結紮混合物を用いてDH5株細菌を形質転換し、kan−
R,amp−Ｒ形質転換細胞を選択した。これらの形質転換
細胞から作製される迅速プラスミド調製物の分析によ
り、それらは全てpBS69−pacのCla−Ｉ部位でkan−Ｒ遺
伝子を含有することが示された。その後の全手技のため
に選択され、以後pNS20と呼ばれるプラスミドは、kan転
写の方向が反時計回りであるように配向されたkan−Ｒ
断片を含有した（第３図）。このkan−Ｒ遺伝子を含むl
oxP部位と側面を接する領域は、以後、kan−Ｒドメイン
と呼ぶ。

（ｃ）pNS150を生成するためのP1プラスミドレプリコン
のpNS20への挿入 P1マップの座標59及び66（第２図）の間に位置するDN
Aの7kb Kpn I断片を、P1ファージからのDNAをKpn Iで消
化した後、単離した。それをpNS20の特独のKpn I部位に
結紮し、プラスミド中のその存在を、迅速プラスミド調
製物の制限酵素消化物を分析することによって確証し
た。その後の手技のために選択された特定の構築物はpN
S150と呼ばれ、プラスミド中で反時計回りに配向された
マップ座標59から66までのP1 DNAを含有した。7kb P1挿
入体はプラスミド複製系だけでなく、その分配系をも含
有した（Yarmolinsky and Sternberg,in“The Becterio
phajes",Chapter9,1988）。

（ｄ）pNS358を生成するためのポリリンカークローニン
グ部位のpNS150 DNAへの挿入 相補的配列を有する２つの31塩基オリゴデオキシヌク
レオチドを、ホスホラミダイト法によって合成した。10
0μ（10mMトリス塩酸緩衝液,pH8.0,1mM EDTA）の容量
中の10μｇの各オリゴヌクレオチドを、70℃で10分間、
相互にアニーリングした。

その結果生じた２本鎖断片を以下に示す： DNAのこの断片は、左から右へ、次の制限エンドヌク
レアーゼ部位： を含有する。これらの部位は何れも、pNS150のDNA中に
は存在しなかった。本断片はまた、BamH I消化によって
生成される末端と相補的な１本鎖GATC末端を含有する。
本断片のGATC末端に対するヌクレオチド３′が異なるた
めに、この断片のBamH Iを有するDNAへの結紮は、挿入
体の一方の側においてはBamH Iを再生したが、他方にお
いては再生しなかった。本断片をBamH I−開裂pNS150 D
NAに結紮し、挿入体の存在を、５つの制限酵素BamH I、
Xba I、Not I、Sal I及びSnaB Iの各々によって１回だ
け開裂されるプラスミドの能力によって確証した。その
後の手技のために選択された特定の構築物はpNS358と呼
ばれ、プラスミド上で反時計回りに配向されたBamH Iか
らSnaB Iまでのポリリンカーを有した（第３図）。

（ｅ）pNS358−lytを生成するためのP1溶菌レプリコン
のpNS358への挿入 P1溶原性レプリコンを、正常P53プロモータがlacZプ
ロモータに置換された1.9kbのAsu II断片（P1マップ座
標53〜55）としてクローン化した。したがって、P1溶菌
レプリコンは、lacZプロモーターの制御下に置かれた。
lacZプロモータは、次に、laclqリプレッサーによって
制御される。IPTG（イソプロピル−ベータ−Ｄ−ガラク
トシド）の存在下では、lacIqリプレッサーは抑制解除
され、レプリコンが機能的になる。lacZプロモータ−調
節P1溶菌レプリコンをプラスミドpNS42からPyu II−Hpa
I断片として単離し、SnaB I消化pNS358 DNAに結紮し
て、pNS358−lytプラスミドを生成した。レプリコン（P
1マツプ座標53〜55）は、プラスミド内で反時計回りに
配向した。

P1パッケージング抽出物を生成する際に用いるファージ
及び溶原菌の構築及び特性 P1パッケージング抽出物の調製のための溶原性細菌
（溶原菌）を構築するために用いるファージは、４倍体
突然変異株P1rm^-cm−2c1.100 9.16又はP1rm^-cm−2c1.10
0 10.1であった。個々の突然変異株の特性、及び最終フ
ァージにおけるその組み込みの理由を以下で考察する。

（ａ）c1.100。Rosner〔Virology,48,679〜689（197
2）〕によって最初に記載されたこの突然変異は、ファ
ージc1リプレッサーを温度感受性にする。したがって、
このP1プロファージを含有する溶原菌は一般に33℃以下
の温度で増殖するが、しかし溶菌周期に入るよう導入さ
れて、より高い温度でファージを産生する。例えば、培
養液の温度が33℃から40℃に上昇した場合には培養液は
その温度に保たれて、細菌溶解が切換えてから50分以内
に起り始め、約100ファージ／細胞が放出される。

（ｂ）rm^-。Glover等〔Genet.Res.,4,480〜482（196
3）〕によって最初に記載されたこの突然変異は、ウイ
ルスの制限及び装飾系を不活性にする。それは、P1溶原
菌から作成される抽出物が、パッケージされる前に付加
されたDNAを破壊し得る制限エンドヌクレアーゼ活性を
含有しないようにここで用いられるファージに組み込ん
だ。

（ｃ）cm−２。この突然変異はIidaとArber〔Mol.Gen.G
enet.,153,259〜269（1977）〕によって記載されてい
て、そのクロラムフェニコール耐性（cm−Ｒ）遺伝子を
伴うTn9トランスポゾンがPlマップ座標24で挿入され、
マップ座標24と33の間のP1 DNAの10kb部分を欠失した大
量染色体転位である。本突然変異は、溶原菌の導入後
に、細菌を別の方法でできるよりも遅い時間に採集可能
であるようにファージを部分的に溶菌欠陥性にする。こ
の突然変異体の別の特性は、それが野生型P1よりも多く
の小頭型ファージ変異体を産生することである。

（ｄ）am9.16及びam10.1。P1アンバー（am）突然変異株
10.1は、P1遺伝子10中にナンセンス突然変異を含有し
（第２図参照）、全“後期”ファージ蛋白質合成に欠陥
がある。それは、正常量のpac−開裂活性を産生する。P
1アンバー突然変異株9.16は、P1遺伝子９中にナンセン
ス突然変異を含み、pac−開裂活性の産生に欠陥があ
る。それは、正常では、ファージの頭部及び尾部を含め
たファージ形態形成蛋白質を産生する。これらの突然変
異株の何れか１つから調製される抽出物がin vitroでDN
Aをパッケージングできるとは期待しないが、しかし両
抽出物はともに、パッケージに必要な成分を全て有する
べきである。

２工程法で、４倍体ファージ変異株を構築した。先
ず、ファージP1cm−２と、P1 c1.100 9.16又はP1 c1.10
0 10.1とを交叉させて、３つの突然変異、P1cm−2 c1.1
00 9.16又はP1cm−2 c1.100 10.1を含有する組み換えフ
ァージを選択した。この交叉によって産生されたファー
ジを用いて、YMC株の細菌芝上にプラークを生成し、個
々のプラークを次に３つの特性：（１）cm−Ｒである溶
原菌を産生する能力；（２）温度感受性；及び（３）細
菌のN99株上ではなくYMC株上にプラークを作る能力；に
関してスクリーニングした。YMC株はアンバーサプレッ
サーを含有したが、他方N99株は含有しなかった。アン
バー変異組み換え株が正しいアンバー変異を含有するこ
とを確証するために、コントロール9.16及び10.1ファー
ジを用いた相補性試験を実施した。同一遺伝子内のアン
バー変異株はファージ産生に関しては互いに相補的でな
いが、遺伝子９及び10のように異なる遺伝子におけるも
のは、相補的である。相補性試験によって、３倍体変異
株におけるアンバー変異はそれらの変異株を生成するた
めに用いるファージに基づいて予期されることが確証さ
れた。３倍体変異株を次にP1rm^-と交叉して、４倍体変
異株が３倍体変異株の全特性に加えて、任意のE.coli株
中にプロファージとして存在する場合は、ラムダファー
ジの増殖を制限することができない特性を有することが
確証された。

４倍体P1変異株を用いてN99株を溶原化し、9.16及び1
0.1変異株に対してそれぞれNS2961及びNS2962と呼ばれ
るその溶原菌を用いて、in vitroパッキング反応のため
のP1抽出物を調製した。さらに、これらのP1変異株はま
た、それらの取込みに熟達した任意の細菌株を溶原化す
るのに用い得る。

P1パッケージ抽出物の調製 （ａ）10.1又はpac−開裂プロフィシェント（pcp⁺）抽
出物の調製 １リットルのＬ−ブイヨンにNS2962株、細菌のコロニ
ーを植え込み、その培養を32℃で0.8のOD650に増殖させ
た。つぎに培地の温度を90℃の水浴中でそれを渦巻き状
に掻き混ぜて42℃に急速に上げ、激しく曝気しながら42
℃で15分間増殖を継続した。つぎに培地に温度を、38℃
の水浴中に入れて低下させ、激しく曝気しながらさらに
165分間増殖を継続した。次いで、細菌懸濁液を氷スラ
リー中で４℃に急冷し、Sorvall GSAローター内で４℃
で10分間、6000×ｇで遠心分離して小球状にした。細胞
小球を、20mMトリス−塩酸、pH8.0、1mM EDTA、50mM Na
Cl、及び1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMS
F）から成る2mlの緩衝液中に再懸濁した。再懸濁細胞
を、40秒間隔で５回、５にセッテッングしたBranson音
波処理装置の中等度出力で氷上で音波処理した。各音波
処理バーストの間は、試料を60秒間氷上に置いた。つぎ
に音波処理抽出物を34,000×ｇで30分間遠心分離し、そ
の後上清を10μアリコートに分けて、−80℃で凍結保
存した。これらの抽出物は、通常、数回の凍結−及び−
解氷に対して安定であった。

Pcp⁺パッケージング抽出物のpac−開裂活性 pac開裂を測定するために、600bpデルタ−3pac断片を
用いたが、これはその右末端にpac部位を含有していた
（第4A図;Sternberg and Coulby,J.Mol.Biol.194,469〜
479（1987））。その断片を両末端で、ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いることによってガンマ³²P−dATPで標
識し、つぎにpcp⁺抽出物の種々のアリコートを用いてイ
ンキュベートした。反応は、10mMトリス−塩酸、pH8.
0、50mM NaCl、10mM MaCl₂、1mM DTT、1mM ATP、１μ
の標識化pac断片（12μg/ml）を伴う10μｇの音波処理
仔ウシ胸腺DNA、及び抽出物を含まないか又は0.01〜１
μのpcp⁺抽出物（3.4mg蛋白質/ml）から成る溶液15μ
中で実施した。反応混合液を30℃で15分間インキュベ
ートし、そして0.2％の濃度までSDSを加えてその混合液
を70℃で５分間加熱することによって反応を停止した。
その反応の生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析した。試料を垂直に５％ゲルのスロットに入
れ、150ボルトで４時間電気泳動処理した。つぎにゲル
を乾燥してKodak XRPフィルムに一晩露出した。第4B図
に示されている結果は、１μの抽出物（レーン２）は
約20％の断片を切断し、付加抽出物（レーン１）なしで
はそのレーンでは観察されない２つの新規断片を生成す
ることを明示している。その抽出物の10倍希釈（レーン
３）は辺縁部のみ切断断片の量を低減したが、しかし、
さらにその抽出物を10倍に希釈すると（レーン４）、切
断効能が約５％に低減した。

（ｂ）9.16又は頭−尾プロフィシェント（htp⁺）抽出物
の調製 上記（ａ）に記載のように１リットルのＬブイヨンに
NS2961株細菌のコロニーを植えつけ、培養を増殖、導入
した。温度を42℃に切り換えてその温度で15分間培養を
インキュベート後、温度を38℃に戻し、その後45分間イ
ンキュベートした。培養を半分に分けて、細胞を（ａ）
に上記のように小球化した。培養の半分からの細菌細胞
を、20mMトリス−塩酸、pH8.0、50mM NaCl、1mM EDTA、
5mM MaCl₂、1mM PMSF、及び5mMベータ−メルカプトエタ
ノールを含有する1mlの緩衝液中に再懸濁し、（ａ）に
上記のように音波処理した。100μのアリコールを直
接−80℃に凍結した。培養の他の半分からの細胞は、50
mMトリス−塩酸緩衝液、pH7.4、及び10％ショ糖の溶液1
ml中に再懸濁し、つぎに２回、凍結及び解氷した。凍結
は液体窒素中で実施し、凍結細胞は室温で解氷した。次
いで、卵白リゾチームの８μmoles溶液（10mg/ml）を解
氷細胞に加え、４℃で15分後、音波処理htp⁺抽出物のた
めに用いる200μの緩衝液を加えた。全ての成分を４
℃で５分間、徐々に混合した後、抽出物の100μアリ
コートを−80℃に凍結した。

細胞を採集する前に、NS2961株の場合よりも長期間、
細菌NS2962株を導入したことに留意すべきである。これ
は、NS2962株における10.1アンバー変異が、両細胞株に
認められるcm−２変異の場合よりもさらに劇的に細胞溶
解を阻害するためであった。したがって、導入されたNS
2962溶原菌は導入後４時間は溶解しなかったが、一方導
入されたNS2961溶原菌は導入後約80〜100分で溶解を開
始した。実際上、遠心分離工程中に細胞を溶解しないよ
う、遠心分離によって小球化される前に導入されたNS29
61細胞を急冷するよう注意すべきである。

ベクターDNAが形質転換型BS591細菌中のCreの影響を受
けるということの立証 本明細書で構築されるベクターが、Creリコンビナー
ゼを含有する細胞中に導入される場合に予期されるよう
にプロセッシングされるということを立証するために、
pNS20及びpNS358をE.coli DH5株及びBS591株中に導入し
た。DH5は機能的cre遺伝子を含有しなかったが、一方BS
591は機能cre遺伝子を含有した。Amp−Ｒ及びkan−Ｒに
形質転換した結果を表２に示すが、これは、Creが細胞
中のこれらの両プラスミドの２つのドメインを効率よく
解離し、そして各ドメインは、回収さるべきものである
場合にはレプリコンを含有しなければならない、という
ことを示している（第5A図参照）。

BS591株を、amp−Ｒドメイン中にのみレプリコンを保
有するpNS20で形質転換した場合、amp−Ｒ形質転換の効
率はkan−Ｒ形質転換の効率よりも約1000倍高かった。D
H5株の形質転換の結果は、これがloxP部位間のCre仲介
組み換えによる２つのドメインの分離によるものであ
る、という結論を支持する。この場合、pNS20によるamp
−Ｒ形質転換とkan−Ｒ形質転換の効率は同じであっ
た。kan−Ｒドメインが、プラスミドpNS358の場合と同
様にレプリコンを保有する場合には、kan−Ｒ及びamp−
Ｒ遺伝子はともに、BS591株の形質転換細胞の間に等し
く表現される。さらに、BS591のkan−Ｒ形質転換細胞の
約20〜30％がアンピシリン感受性であり、同様のamp−
Ｒ形質転換細胞応がカナマイシン感受性であった。予期
される通り、pNS358DNAによるDH5（Cre^-）の形質転換細
胞はすべて、amp−Ｒ且つkan−Ｒであった。これらの実
験における形質転換の１単位は、使用したDNA1μｇ当た
り10⁶個の形質転換細胞を表わすことを意味した。

BS591中のpNS358のDNAの解離に関する物理的証拠（第
5B図）は、BS591及びDH5の形質転換細胞に由来するDNA
の迅速プラスミド試料の制限分析から得られた。全DNA
を制限酵素Xho Iで消化し、その結果生じた断片数をア
ガロースゲル電気泳動法及びサザーンハイブリダイゼー
ションによって測定した。DH5のamp−Ｒ、kan−Ｒ形質
転換細胞（レーン１）に由来するプラスミドDNAは、オ
リジナルpNS358プラスミドと区別できなかった。それは
ともに、予期される３つのXho I断片を含有した。これ
に対してBS591のamp−Ｒ、kan−Ｓ形質転換細胞からの
プラスミドDNAは、単一Xho I部位のみを伴うDNAを含有
したが（レーン２）、一方BS591のkan−Ｒ、amp−Ｓ形
質転換細胞からのプラスミドDNAは２つのXho I断片を含
有した（レーン３）。BS591のamp−Ｒ、kan−Ｒ形質転
換細胞からのプラスミドDNA（レーン４）は、３種類のD
NA、即ちpNS358と同様のDNA、単一Xho I部位を有するam
p−ＲドメインプラスミドDNA、２つのXho I部位を有す
るkan−ＲドメインプラスミドDNAを全て含有した。予測
の通り、pNS358のまさにkan−Ｒドメインを有するプラ
スミドDNAは、pNS358 DNA又はamp−ＲプラスミドDNAの
場合よりも非常に少量で（即ち、DNAバンドは非常に薄
い）回収された。kan−Ｒドメイン中のP1プラスミドレ
プリコンは、amp−Ｒドメイン中のpBR322レプリコンよ
りも非常に少量のコピー数にDNAを複製した。

Pcp⁺及びhtp⁺抽出物によるDNAパッケージングの立証 結紮ベクター（pNS358）DNAのパッケージング ５μｇのBamH I消化pNS358 DNA（100μg/ml）を一晩
結紮して、50kb〜150kbの大きさのコンカテマーを生成
した。30ngのこのDNAを、インキュベーション時間が15
分ではなく60分であったことを除いては、前章に記載さ
れた通りに、0.2μのpcp⁺抽出物でインキュベートし
た。インキュベーション終了時に、6mMトリス−塩酸,pH
7.4、15mM ATP、16mM MgCl₂、60mMスペルミジン、60mM
プトレシン、及び30mMベータ−メルカプトエタノールを
含む２μの緩衝液を、８μの凍結−解氷htp⁺抽出物
とともに反応に加えた。その結果生じた混合液をさらに
60分間、30℃でインキュベートした。この時間の終了時
に、TMG（10mMトリス−塩酸,pH7.5、10mM MgSO₄、0.1
％ゼラチン）でその反応液を150μに希釈し、DNase I
を10μg/mlの濃度まで加えて未パッケージング化DNAを
全て破壊した。５μの上記パッケージング反応液をBS
591の10⁸個の細菌細胞に加え、その結果生じた混合液を
30℃で10分間インキュベートして、ファージ吸着を起こ
させた。その結果生じた感染細胞をＬブイヨンで2mlに
希釈して、37℃で１時間増殖させ、遠心分離によって小
球化し、次いでＬ−amp寒天平板上に広げた。一晩イン
キュベート後、平板は2208のコロニーを含有した。これ
は、２×10⁶パッケージング化DNA分子／付加ベクターDN
A（μｇ）のパッケージング効率に相当した。パッケー
ジ化ベクターを査定するために用いた細菌株がDH5（Cre
^-）であった場合には、検出されるamp−Ｒコロニーの数
は約40倍低減したが、これは、loxP部位間のCre仲介組
み換えが、注入された線状DNAを環状化するためには必
要であることを示している。２つの抽出物のいずれかが
パッケージング反応から除外された場合には、amp−Ｒ
コロニーは検出されなかったが、これは両抽出物がパッ
ケージングには必要であることを示している。凍結−解
氷htp⁺の代わりに音波処理htp⁺抽出物を用いた場合、パ
ッケージング効率は変わらなかった。しかしながら、音
波処理抽出物が凍結−解氷抽出物よりも安定度が低いこ
とが立証されたので、その後の実験は全て、凍結−解氷
抽出物を用いた。最後に、amp−Ｒコロニーの分析から5
0％（25/50）がkan−Ｒでもあったことが示されたが、
これは、頻繁に、pNS358の両抗生物質耐性ドメインがパ
ッケージングされたことを示している。

ベクターによる細菌の感染 一晩培養した100μの細菌（２〜３×10⁹細胞/ml）
をファージ溶解物のアリコート、又はin vitroパッケー
ジング反応液で、30℃で10分間インキュベートした。フ
ァージを査定する場合は、3.0mlの溶解Ｌ最上寒天（0.7
％寒天）を55℃で感染細胞に加え、その混合液をＬ−寒
天平板上に広げた。最上寒天を室温で５分間固化させた
後、平板を37℃で16時間インキュベートし、プラークを
採点した。抗生物質耐性細胞を査定する場合は、感染細
胞を抗生物質含有Ｌ−寒天平板の上に広げ、これらの平
板を37℃で16時間インキュベートした。

In vitroパッケージング及びCre⁺細胞の形質転換後pNS
358 DNAにクローン化された外生DNA断片の回収 E.coli DNAのクローン化挿入体を有するプラスミドを
２つの方法で回収した：（１）プラスミドDNAを、Birnb
oim等〔Nucl.Acids Res.7,1513〜1523（1979）〕のアル
カリ性溶解プロトコールにより、そして塩化セシウム臭
化エチジウム平衡遠心分離〔これはManiatis等（Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbo
r Laboratory,Box 100,Cold Spring Harbor,NY,1982）
が記載した〕によつて、一晩増殖させて２〜３×10⁹細
胞/mlになった細胞１から単離した。DNAを勾配液から
除去した後、それを塩化セシウム−飽和イソプロパノー
ルで４回抽出し、10mMトリス−塩酸、pH8.0、1mM EDTA
の溶液１に対して４℃で５時間透析し、フェノールで
２回抽出して、つぎに1M LiCl₂に溶解した２容積のエタ
ノールで沈澱させた。（２）クローン化挿入体DNAを有
するプラスミドを、細胞をP1ファージで感染させること
によってファージ粒子の形で形質転換細胞から回収し
た。感染中のP1 DNAは、Cre仲介組み換え工程によって
細胞中の残留プラスミドと組み換えを生じ、両DNA上にl
oxP部位を生じた。この出来事により、クローン化挿入
体−プラスミドに隣接したP1 pac部位が突きとめられ、
それによってそれをファージ粒子中にパッケージングす
ることができた。一晩培養した100μの形質転換細胞
（約２×10⁸細胞）を６×10⁸P1ファージとともに30℃で
10分間インキュベートし、次いでＬ−ブイヨンで5mlに
希釈した。感染細胞を、細胞溶解が観察されるまで（約
90分間）、37℃で激しく振盪した。pNS358のkan−Ｒド
メインとともにクローン化断片を含有するファージの数
を、BS591を溶解物のアリコートで感染させることによ
って査定し、つぎに産生されたkan−Ｒ細胞の数を測定
した。溶解物中のプラーク形成中のファージを、前記の
ように測定した。通常、これらの溶解物中のkan−Ｒフ
ァージ対プラーク形成ファージの比は約0.1〜１％であ
った。

kan−Ｒ遺伝子、P1プラスミドレプリコン、及びP1溶解
レプリコン,pNS364を含有するプラスミドの増幅 このプラスミドの構造を第6A図に示す。われわれは、
本明細書においてはこれを、lacZ遺伝子プロモータによ
って調節されるクローン化P1溶解レプリコンが細胞中の
プラスミドコピーの数を容易に増幅するために使用し得
ることを示すために用いた。JM109株（lacIq）をpNS364
DNAで形質転換して、その形質転換細胞をＬ−ブイヨン
中で増殖させた。これらの条件下では、プラスミドは１
コピー／細胞染色体でプラスミドレプリコンによって保
持されると予測された。IPTGをその培地に加えた場合
は、lacIqリプレッサーが不活化され、したがって、lac
Zプロモーター及びP1溶解レプリコンを活性化する。JM1
09（pNS364）の培養60mlをＬ−ブイヨン中で37℃で５×
10⁷細胞/mlの密度に増殖させ、つぎに各々5mlの８つの
アリコートに分けた。１つのアリコートをＬ−ブイヨン
中で37℃でさらに３時間増殖させ、一方他の７つのアリ
コートは各々、10μmoles〜1mMの濃度範囲のIPTGを用い
て３時間、Ｌ−ブイヨン中で増殖させた。全ての細胞DN
Aを各培養から単離し、制限酵素BamH I（これはpNS364
を２つの断片に切断した）で消化して、サザーンハイブ
リダイゼーションによって分析した。その結果（第6B
図）は、培地中のIPTG濃度が増大するとプラスミドのコ
ピー数も増大することを示した。1mM IPTGでは、プラス
ミドのコピー数は、IPTGを欠いた培地中のプラスミドの
コピー数よりも30〜40多かった（レーン１と８を比
較）。

実施例 １ E.coli DNAの断片をpNS358に挿入し、キメラベクターDN
Aをパッケージングし、細菌をパック化キメラベクター
で形質転換し、形質転換細菌を選択して、挿入DNA断片
を回収する ２μｇのpNS358 DNAをBamH I又はNot I制限酵素で消
化した。これらの酵素は各々、ベクターDNAをポリリン
カークローニング部位で１回切断した。つぎに開裂DNA
をアルカリ性ホスファターゼで処理して、その後の結紮
反応における開裂末端の再結紮を防止した。挿入DNAの
供給源はE.coli W 3350株であって、単離DNAはそのサイ
ズが200kbより大きかった。ベクターにおける任意のDNA
の挿入に先立って、それを、San 3a Iで平均サイズ20〜
50kbに消化するか、あるいは制限酵素Not Iで完全に消
化した。ほぼ等量（200ng）９のベクターDNAとE.coli D
NAs（Sau3a I−消化E.coli DNAを有するBamH I−消化ベ
クター又はNot−消化ベクター、及びNot I−消化E.coli
DNA）を20μの溶液中で混合し、一晩結紮した。その
結紮混合液１μを『抽出物pcp⁺及びhtp⁺のパッケージ
ングによるDNAのパッケージングの立証』という表題の
章に記載されているようにパッケージし、これを用い
て、『細菌のベクターによる感染』の章に記載されてい
るように感染によって、E.coli BS591株を形質転換し
た。その結果生じた細菌を、表３に示すようにkan−Ｒ
コロニーとして検出した。

アルカリ性ホスファターゼで処理されていないBamH I
−又はNot I−消化ベクターDNAをパッキングする効率
は、約２×10⁶パッケージング化DNA分子／付加ベクター
DNA（μｇ）であった。ベクターDNAをアルカリ性ホスフ
ァターゼで処理すると、パッキング後のDNAの回収率は
約100〜200倍低減したが、しかしSan 3a I−又はNot I
−消化E.coli DNAを結紮反応液に加えて部分的にその喪
失を回復してもよい。これらの結果を解釈すると、ホス
ファターゼ処理ベクターDNAは大型コンカテマーと結紮
できず、したがって効率よくパッケージング化され得な
いということであった。E.coli DNA挿入体をベクターDN
Aに加えると、パッケージング化され得る大きさに達す
ることができた。特定のパッケージング反応によって、
50〜90％のkan−Ｒコロニーがamp−Ｓであったが、これ
は、それらがpNS358のamp−Ｒドメインを欠いていたこ
とを示している。

パッケージング化pNS358 DNA及びそれを含有するE.coli
挿入体の回収及び特性 （ａ）Sau 3a Iクローン pNS358に挿入されたSau 3a I−消化E.coli DNAをパッ
ケージングすることによって生成された10個の別々のコ
ロニーから増殖された各培養中のプラスミドDNAを、Bir
nbim等（Nucl.Acids Res.7,1513〜1523（1979））のア
ルカリ性手法によって単離し、制限酵素消化によって分
析した。プラスミドのうちの２つのDNAはpNS358DNAのka
n−Ｒドメインと同一であったが、しかし残りは、多数
の新規制限断片を含めて、ベクター中に存在するよりも
実質的に多くのDNAを含有した。ベクター（レーン
３）、及びベクター−San 3a Iキメラのうちの５つ（レ
ーン４〜８）の、制限酵素Bql II、Xho I、Pvu II及びE
co Vによる消化物を第7A図に示す。レーン４〜８で観察
される新規DNA断片は、E.coli Sau 3a I断片の挿入によ
るものであると思われる。第7A図のレーン１及び２は、
DNAサイズマーカーを含有した。単離された最大のプラ
スミドは、38〜40kbであった。パルス野ゲル分析から、
それは22kbと17kbの２つのNot I断片を含有することが
示された（第7B図，レーン３）。レーン１はパッケージ
ング化ベクターDNAを含有し、レーン２はNot Iで消化さ
れた２分の1Sau 3a I−キメラを含有した。これらの結
果は、Sau 3a I挿入体が小頭型（P1S）粒子に全てがパ
ッケージングされたわけではない場合は、その容量は40
kb以下であることを示唆している。

（ｂ）Not Iクローン Smith等（Science 236,1448〜1453（1987））が記載
したE.coli DNAの最新のNot I制限マップには、E.coli
DNAのNot I消化によって５つのDNA断片が生じることが
示されている。これらの断片は、本発明のin vitro P1
パッキング系によってパッキングされ得る。これらの断
片は、大きさが20kb、40kb、43kb（このサイズの断片が
２つ）、及び95kbである。Not I断片をpNS358 DNAに挿
入し、Sau 3a I挿入体に関して記載したと同様にBS591
細菌内でそれらをクローニングした後、５つのクローン
からのプラスミドDNAを調べた。クローン化プラスミド
のうち２つのもののDNAは、pNS358のkan−Ｒドメインの
みを含有した。他の３つのクローン化プラスミドからの
DNAをNot Iで消化した場合、それらがベクターのkan−
Ｒドメインに加えて、30kb以上の大きさのNot I断片を
保有することが示された。これらのDNA中のNot I挿入体
の大きさは、パルスゲル電気泳動によってより正確に測
定した。プラスミドの１つ（第7B図，レーン11）は、ゲ
ル中で40kbマーカーを伴って転位するNot I挿入体を含
有したが、一方他の２つ（第8B図，レーン９及び10）
は、わずかに大きい42.5kbマーカーを転位する挿入体を
含有した。３つのクローンはすべて、ベクターのkan−
Ｒドメインに対応する12kb Not I断片を含有した。43kb
挿入体を含有するクローンの１つのDNAは（レーン1
0）、6kb Not I断片を含有したが、この起源はE.coli断
片の場合のようには明らかでなかった。レーン10に示さ
れているプラスミドDNAの、Not IによってではなくBgl
II及びXho Iによる消化は、全体の大きさが60kbを上回
る断片族を産生したが、これはその大きさがNot I消化
物に基づく概算値であることを確証している（第7C図，
レーン２）。それらの大きさに基でいて、Not I挿入体
を有する３つのプラスミドは、大きなP1（P1B）頭部に
パッケージングされていなければならなかった。

E.coliトリプトファン生合成オペロンの遺伝子は、E.
coli DNAの95kb Not I断片上に存在するが、その大きさ
の断片がin vitroでP1頭にパッケージングされ得ること
を示すために使用した。Not I−消化E.coli DNAを用い
てパッケージング反応に起因するファージは、ラムダ−
Pl:creプロファージを含有するE.coliのNS3067株（tr
p^-）を感染するために用いた。その結果生じたkan−Ｒ
細胞を単離し、それらがトリプトファンを欠いた最小寒
天培地上で増殖し得るか否かを調べる試験をした。試験
した50のうち２つが増殖した。そのプラスミドDNAを陽
性クローンの１つから単離し、臭化エチジウム染色（第
8A図，レーン３〜４）によって、又はパルス野ゲルのサ
ザーン分析（第8A図，レーン５〜６）によって、E.coli
trp遺伝子プローブに対してハイブリッド化される95kb
E.coli Not I断片を含有することを示した。レーン３
及び５はNot Iによって消化されたプラスミドDNAを含有
し、レーン４及び６はNot Iによって消化されたE.coli
DNAを含有した。パルス野ゲルをkan−Ｒ遺伝子DNAでプ
ローブした場合、12kb DNA断片はtrpプラスミドDNAを含
有するレーン（レーン７）には現われたが、しかしE.co
li DNAを含有するレーン（レーン８）には現われなかっ
た。その断片は、pNS358 DNAのkan−Ｒドメインに対応
した。種々の制限酵素（Bal II−Xho I,レーン１及び2,
Hind III,レーン３及び4,Sma I,レーン５及び６）でtrp
プラスミド及びE.coli DNAを消化し、その後プローブと
してtrpプラスミドDNAを用いてサザーン分析した結果、
プラスミドDNAは、真正E.coli DNA断片と大きさが同じ
である多数の断片を含有することが示された。レーン
１、３及び５はE.coli DNAを含有し、レーン２、４及び
６はtrpプラスミドDNAを含有した。断片がE.coliレーン
中に存在し、プラスミドレーンには存在しなかった場
合、もしくはこの逆の場合は、それらがベクター由来の
ものであったか又はそれらがベクターとE.coli DNAとの
間の接合を表わしていたことを示す。総じて、これらの
結果は、P1パッケージング系が107kbの大きさのDNA（95
kb Not I挿入体＋12kbプラスミドkan−Ｒドメイン）を
収容し得るということ、そしてベクターが染色体外プラ
スミドとしてそのDNAを忠実に複製したということを示
した。

実施例 ２ クローン化DNA断片を増幅するためのpNS358−lytベクタ
ーの使用 ２μｇのpNS358−lyt DNAをBamH I又はNot Iで消化
し、それを用いて、実施例１に記載されているように、
それぞれE.coli DNAのSau 3a I及びNot I断片をクロー
ン化する。実施例１におけると同様に、Sau 3a I又はNo
t I断片挿入体でベクターDNAをインin vitroパッケージ
ングした後、そのパッケージング化キメラDNAをNS2974
株に注入し、kan−Ｒ形質転換細胞を選択する。個々のk
an−Ｒ形質転換細胞のDNAを実施例１と、『in vitroパ
ッケージング及びCre⁺細胞の形質転換後のpNS358 DNA中
にクローン化された外生DNA断片の回収（pp.27〜28）』
の章とに記載されている通りに単離し、制限酵素消化及
びサザーンハイブリダイゼーション分析によってE.coli
DNA挿入体を含有することを明示した。ベクター挿入体
DNAがベクター中で溶菌レプリコンによって増幅され得
るか否かを調べるために、キメラプラスミドを含むNS29
74株細菌の培養を半分に分けて、1mM IPTGを含む場合と
含まない場合とで３時間増殖させた。増殖時間終了時
に、全ての細胞DNAを２つの培養の各々から単離し、『k
an−Ｒ遺伝子、P1プラスミドレプリコン及びP1溶菌レプ
リコン,pNS364を含有するプラスミドの増幅』という表
題の章でプラスミドpNS364に関して記載したように、サ
ザーンハイブリダイゼーションによってプラスミドコピ
ー数を測定した。IPTGを含有して増殖させた培養からの
DNAは、IPTGを含まずに増殖させた培養から単離されたD
NAの場合よりも20〜30倍多いベクター挿入体プラスミド
DNAを含有する。この結果は、CsCl−臭化エチジウム平
衡密度勾配を用いて２つの培養から超らせん環状DNAを
単離することによって確証される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サウアー，ブライアン・リー アメリカ合衆国デラウエア州 19805. ウイルミントン．レツドスタートコート 2514 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 Ｂｉｏｓｉｓ Ｐｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｅｄｌｉｎｅ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の配列： P1 loxP部位−アンピシリン耐性遺伝子−pBR322 ori−p
   ac−P1 loxP部位−ポリリンカークローニング部位−カ
   ナマイシン耐性遺伝子−P1プラスミドレプリコン を包含するDNA断片をクローニングするためのベクター
   であって、上記配列が、P1プラスミドレプリコンが最初
   のP1 loxP部位と結合してその配列が反時計回り方向に
   読まれるように環状化されたベクター。
2. 【請求項２】上記ベクターがポリリンカークローニング
   部位とカナマイシン耐性遺伝子との間に挿入されたlacZ
   プロモータの制御下でP1溶菌レプリコンを有する請求項
   １記載のベクター。
3. 【請求項３】P1rm^-cm−2c1.100 9.16及びP1rm^-cm^-2c1.1
   00 10.1より成る群から選択される４倍体ファージ突然
   変異体で溶原化された細菌株。
4. 【請求項４】NS2961及びNS2962と呼ばれる請求項３記載
   の細菌株。
5. 【請求項５】lacIqリプレッサーを有するNS2974と呼ば
   れるCre⁺グラム陰性細菌株。
6. 【請求項６】lacZプロモーターの制御下にマルチコピー
   レプリコンを含有するベクター中の95kbの大きさのDNA
   断片の増幅をクローニングし、制御する方法であって： （ａ）DNA断片を２つのP1 loxP部位とpacとを有するベ
   クターDNAに連結し： （ｂ）工程（ａ）の生成物をpac−開裂プロフィシェン
   ト抽出物及びP1頭−尾プロフィシェント抽出物と反応さ
   せ； （ｃ）lacIqリプレッサーを有するCre⁺細菌株を工程
   （ｂ）の生成物で感染させ； （ｄ）培地にIPTGを加え；そして （ｅ）クローン化及び増幅化されたDNAを回収する； 工程から成る方法。
7. 【請求項７】95kbの大きさのDNA断片の増幅をクローニ
   ングし、制御する方法であって： （ａ）外生DNA断片を請求項２のベクターのポリリンカ
   ークローニング部位に挿入し； （ｂ）工程（ａ）の生成物をpac−開裂プロフィシェン
   ト抽出物及びP1頭−尾プロフィシェント抽出物と接触さ
   せ； （ｃ）lacIqリプレッサーを有するCre⁺グラム陰性細菌
   株を工程（ｂ）の生成物で感染させ； （ｄ）工程（ｃ）の生成物にIPTGを加えることによって
   lacIqリプレッサーを抑制解除し； （ｅ）クローン化及び増幅化ベクターDNAを回収する； 工程から成る方法。
8. 【請求項８】そこに挿入された外生DNA断片を有する請
   求項１又は２記載のベクターのDNAのin vitro P1バクテ
   リオファージパッケージングのための工程であって、断
   片含有ベクターのDNAをpac−開裂プロフィシェント抽出
   物及びP1頭−尾プロフィシェント抽出物と接触させるこ
   とを包含し、この場合上記断片の大きさが95kb又はそれ
   以下である工程。
9. 【請求項９】95kbの大きさのDNA断片のクローニング方
   法であって： （ａ）外生DNA断片を請求項１のベクターのポリリンカ
   ークローニング部位に挿入し； （ｂ）工程（ａ）の生成物をpac−開裂プロフィシェン
   ト抽出物及びP1頭−尾プロフィシェント抽出物と接触さ
   せ； （ｃ）Cre⁺グラム陰性細菌株を工程（ｂ）の生成物で感
   染させ；そして （ｄ）クローン化ベクターDNAを回収する； 工程から成る方法。