JP3010215B1

JP3010215B1 - リパ―ゼ阻害剤

Info

Publication number: JP3010215B1
Application number: JP37626398A
Authority: JP
Inventors: 恵則根岸; 憲樹松尾; 桂介宮寺; 雅江谷島
Original assignee: 通商産業省基礎産業局長
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1998-12-24
Publication date: 2000-02-21
Anticipated expiration: 2018-12-24
Also published as: JP2000191527A

Abstract

【要約】【課題】リパーゼ阻害剤及びこれに基づく医薬、食品
添加物の提供。【解決手段】スクレロチオリンを有効成分とするリパ
ーゼ阻害剤、抗肥満薬、にきび治療剤及び食品変敗抑制
剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はリパーゼ阻害剤、抗
肥満薬及びにきび治療剤、食品変敗抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】リパーゼはグリセリドを加水分解し、脂
肪酸を遊離する酵素であり、哺乳動物体液、臓器、植
物、微生物中等に広く分布している。このうち、膵リパ
ーゼは、膵液に含まれるリパーゼで十二指腸中に分泌さ
れ、腸管内でグリセリドを分解して脂質の吸収に寄与し
ている。そこで、当該膵リパーゼ活性を阻害すれば腸管
からの脂質の吸収が抑制されることから、膵リパーゼ阻
害剤は副作用の少ない抗肥満薬として有用であることが
知られている（International Journal of Obesity(199
5)19, 221-226、臨床検査vol. 42, No.4, 440-443）。

【０００３】また、にきびの主な原因は、皮脂分泌の増
加、角化亢進及び皮膚常在菌プロピオバクテリウムア
クネス（ニキビ桿菌）の増殖にあるとされている。この
うち、ニキビ桿菌の産生するリパーゼは皮脂中の中性脂
肪を分解することによって生成される遊離脂肪酸が刺激
性物質として働くため、これを阻害する成分はにきび治
療に有用であることが知られている（特開平２−１２１
９０８号等）。

【０００４】また、食品中に含まれる脂肪は、その食品
原料、例えば植物に含まれているリパーゼや、食品中に
混入した微生物由来のリパーゼにより加水分解を受け、
グリセロールと遊離脂肪酸に分解される。この遊離脂肪
酸は、変敗や悪臭の原因となり、食品の品質保持の観点
から遊離脂肪酸の発生を抑制することが重要な課題とな
っており、リパーゼ阻害剤の食品変敗抑制剤としての開
発が種々なされている（特許第２５９８８７３号、特開
平９−４０６８９号）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
従来のリパーゼ阻害活性に基づく抗肥満薬、にきび治療
剤や食品変敗抑制剤は未だ十分に満足できるものではな
く、さらに新たな薬剤が求められている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、種
々の微生物の培養物の中からリパーゼ阻害作用を有する
物質を探索してきたところ、ペニシリウム・スクレロチ
オルムに属する微生物が産生するスクレロチオリンが、
膵リパーゼ、にきび桿菌由来のリパーゼ、微生物由来の
リパーゼ、及び植物由来のリパーゼに対して阻害作用を
有し、抗肥満薬、にきび治療剤及び食品変敗抑制剤とし
て有用であることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００７】すなわち、本発明は、スクレロチオリンを
有効成分とするリパーゼ阻害剤、抗肥満薬、にきび治療
剤及び食品変敗抑制剤を提供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明に用いられるスクレロチオ
リンは、次式（１）

【０００９】

【化１】

【００１０】で表される公知化合物であり、バイオケミ
カル・ジャーナル（Biochem. J.），34, 1419(1940)、
ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブルティ
ン（Chem. Pharm. Bull.），11, 366(1963)など多くの
報告があり、さらに「生理活性天然物化学」255 頁（東
京大学出版会）にその抗グラム陽性菌作用が、アルツナ
イミテル−フォルシュンク（Arzneimittel-Forsh.）12,
1143(1962)に抗腫瘍作用についての報告がなされてい
る。また、最近ではアグリカルチャー・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.），52,
307(1988)に真菌類の厚膜胞子様細胞誘導活性が、ジャ
ーナル・オブ・アンティバイオティクス（J.Antibio
t.），48, 913(1995)にエンドセリンアンタゴニスト活
性が、特開平２−２５５６１５号公報にホスホリパーゼ
Ａ₂阻害活性が報告されている。しかしながら、スクレ
ロチオリンのリパーゼ阻害作用については一切報告され
ていない。

【００１１】スクレロチオリンは、例えばペニシリウム
属に属するスクレロチオリン生産菌を培養し、該培養物
から採取することにより製造される。本発明者らの検討
によれば、本方法によるスクレロチオリンの製造におい
ては、炭素源としてエタノールを含む培地を用いれば、
他の炭素源を用いた場合に比べて、生産性が飛躍的に向
上することを見出した。従って、本方法においては炭素
源としてエタノールを含む培地を用いるのが好ましい。

【００１２】スクレロチオリン生産菌としては、ペニシ
リウム・スクレロチオルム（Penicillium sclerotioru
m）ＥＦ−１６４６株が好ましい。このＥＦ−１６４６
株は、長野県長野市篠ノ井塩崎で採集した土壌試料から
分離されたものであり、以下に示すような菌学的性質を
有する。

【００１３】＜種々の培地上での特徴＞ポテトデキスト
ロース寒天平板培地、ツァペックイーストエキス寒天平
板培地等の種々の培地においてテレオモルフは形成され
ず、ほうき形の分生子柄と分生子からなるアナモルフが
豊富に形成され、その分生子形成様式はフィアロ型であ
った。

【００１４】次にマルトエキス寒天平板培地、ツァペッ
クイーストエキス寒天平板培地２５℃で７〜９日間培養
したときの生育状態の特徴を表１に示す。

【００１５】

【表１】

【００１６】これらの培地上で観察されたアナモルフ
は、気中又は栄養菌糸から直立するほうき形の分生子柄
と、分生子鎖からなっていた。分生子柄は無色、滑面
で、分枝せず、直径３〜４μｍ、長さが２８〜１２０μ
ｍであり、直径４〜５μｍのベジクルに５〜１０本のフ
ィアライドを着生した単輪生体である。フィアライドは
アンプル形で７〜１１μｍ×２〜３μｍの大きさであっ
た。形成される分生子は、淡緑色、滑面、球形、直径２
〜３μｍである。

【００１７】＜生理学的特徴＞ＥＦ−１６４６株は１０
℃〜３４℃の範囲で生育可能であり、最適生育温度は２
４〜２５℃である。

【００１８】本菌株は、前記の特徴から、不完全菌類の
ペニシリウム属（Penicillium Link）のアスペルギロイ
デス亜属（Subgenus Aspergilloides Dierckx ）、アス
ペルギロイデス節（Section Aspergilloides Pitt）に
属すると思われた。同亜属に含まれる菌種の中では集落
裏面がオレンジ色となる特徴からペニシリウム・スクレ
ロチオルム・ファン・ベイマ（Penicillium sclerotior
um van Beyma）と同定した。従って本菌株をペニシウム
・スクレロチオルム・ＥＦ−１６４６（Penicillium sc
lerotiorum EF-1646）と命名した。このペニシリウム・
スクレロチオルム・ＥＦ−１６４６株は、通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１７１１
７として平成１０年１２月２２日に寄託した。

【００１９】スクレロチオリン生産菌の培養にあたって
は、ペニシリウム属菌が生育する培地を用い、常法に従
って行えばよいが、前記の如くエタノールを含有する培
地を用いるのが生産性の点で好ましい。特に、ＥＦ−１
６４６株は、エタノールを炭素源として含む培地で良好
に生育し、他の炭素源を用いた場合に比べてスクレロチ
オリンを極めて高率で生産するので、エタノールを炭素
源として含む培地で培養するのが好ましい。培地中のエ
タノール濃度は、特に制限されないが、０．０１〜５
（ｖ／ｖ）％が好ましい。特に好ましい培地としてはエ
タノール３％（ｖ／ｖ）、脱脂大豆粉１．２％、ペプト
ン０．３２％、硝酸ナトリウム０．０８％、硫酸ナトリ
ウム７水和物０．１％からなる培地（pH５．６）が挙げ
られる。

【００２０】かくして得られるスクレロチオリンは、膵
リパーゼ、ニキビ桿菌リパーゼ、植物由来リパーゼ及び
微生物由来リパーゼに対して優れた阻害作用を有する。
そして、スクレロチオリンの毒性は非常に低く、例えば
１００mg／kg体重を１０週齢（体重３５〜４０ｇ）のＩ
ＣＲ系雄マウスに０．５％メチルセルロース懸濁液とし
て腹腔内投与しても毒性を示さず、安全性が高い。従っ
て、スクレロチオリンは、リパーゼ阻害作用に基づき、
抗肥満薬、にきび治療剤、食品変敗抑制剤として有用で
ある。

【００２１】本発明の抗肥満薬はヒトを含む哺乳動物へ
経口的にあるいは非経口的に使用される。製剤の形態と
しては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その
代表的なものとしては錠剤、丸剤、顆粒、散剤、カプセ
ル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の経口投与剤や、注
射剤（皮下、静脈内、筋肉内注射等）等の非経口投与剤
が挙げられる。

【００２２】本発明のにきび治療剤は経口的にあるいは
非経口的に使用される。製剤の形態としては、各種の形
態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとし
ては錠剤、丸剤、顆粒、散剤、カプセル剤、懸濁剤、乳
剤、シロップ剤等の経口投与剤や、注射剤（皮下、静脈
内、筋肉内注射等）等の非経口投与剤及び軟膏剤などの
固形製剤の形での外用投与剤が挙げられる。また、にき
び治療剤の場合には、ローション類、乳液剤、クリーム
類、ゲル状物、スティック状物等のにきび治療用化粧料
とすることもできる。

【００２３】本発明の食品変敗抑制剤は食品添加物とし
ての使用及びそれを配合した食品に適用される。食品添
加物の形態としては粉末あるいは適切な溶媒で希釈した
溶液もしくは懸濁液として使用することができる。さら
に、混合、乾燥等の通常の操作により、他の添加物と配
合して粉末状あるいはペースト状として使用することも
できる。

【００２４】スクレロチオリンの抗肥満薬又はにきび治
療剤としての投与量は、その用法、患者の体重、年齢、
性別その他の条件、疾病の程度等により適宜選択される
が、通常は、１日あたり０．５〜２０００mg、好ましく
は１〜１０００mgを投与する。有効な１回投与量は、患
者の体重１kg当たりスクレロチオリンとして０．０１〜
５０mgの範囲、好ましくは０．０５〜２０mgの範囲で選
択される。スクレロチオリンの外用薬又はにきび用化粧
料への配合量は組成物の総量を基準として好ましくは
０．００１〜１０重量％（以下ｗｔ％と略記する）、よ
り好ましくは０．０５〜５ｗｔ％の範囲である。また、
食品変敗抑制剤として食品に配合する場合は、食品に対
してスクレロチオリンとして０．０００１〜１ｗｔ％が
適当であり、さらに０．００１〜０．１ｗｔ％がより好
ましい。

【００２５】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明は
これらによって何ら限定されるものではない。

【００２６】製造例１脱脂大豆粉１．２％、ペプトン０．３２％、硝酸ナトリ
ウム０．０８％、硫酸ナトリウム７水和物０．１％から
なる培地（pH５．６）１００mlずつをそれぞれ５００ml
のエルレンマイヤーフラスコ３本に仕込み、１２１℃で
１５分滅菌した。その後、ろ過滅菌したエタノールを３
％（ｖ／ｖ）ずつ加え液体培地とした。それぞれのフラ
スコにペニシリウム・スクレロチオルム（Penicillium
sclerotiorum）ＥＦ−１６４６株を１白金耳ずつ接種
し、２５℃、４日間、ロータリーシェイカーにて攪拌培
養した。次に同様の培地１５ｌを３０ｌ容ジャーファー
メンターに仕込み、１２１℃、１５分滅菌した後、上で
得た培養物の全量を接種し、２５℃、６日間培養した。
得られた培養液を酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を
５％炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄したのち、酢酸エチ
ル層を脱水、ろ過、濃縮・乾固し、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（シリカゲル１ｌ）にかけ、ベンゼ
ン：酢酸エチル＝５：１で溶出した。溶出液を１ｌずつ
分取し、リパーゼ阻害活性を示す画分を集めて溶媒を減
圧下に留去し、残渣をメタノールから結晶化して２ｇの
粗結晶を得た。これをさらにメタノールで再結晶してス
クレロチオリンの黄色針状結晶１．２ｇを得た。

【００２７】融点：２０５〜２０８℃ 比旋光度：〔α〕_D＝＋４６３°（c 0.2, EtOH） IR(KBr)：1740, 1720, 1636, 1528cm^-1 UV λ_maxnm（ε）：220(13000), 270(13100), 370(302
00)¹ H-NMR(CDCl₃,δ)：7.94(1H,s), 7.06(1H,d,J=16Hz),
6.65(1H,s),6.08(1H,d,J=16Hz), 5.71(1H,d,J=10Hz),
2.49(1H,m), 2.17(3H,s),1.85(3H,s), 1.57(3H,s), 1.2
5-1.50(2H,m), 1.00(3H,d,J=6Hz),0.87(3H,t,J=7Hz)¹³ C-NMR(CDCl₃,δ)：191.7, 186.0, 170.1, 158.1, 15
2.7, 148.8,142.9, 138.7, 132.0, 115.7, 114.6, 106.
4, 84.6, 35.1, 30.0, 22.5,20.2, 20.1, 12.4, 12.0 Rf＝0.40（シリカゲルプレート、ヘキサン：酢酸エチ
ル＝３：１）溶解性：可溶；メタノール、エタノール、アセトン、ジ
クロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン不溶；水 FAB-MS,M/Z（％）：391(M⁺＋1, 100), 393(M⁺＋3, 37) EI-MS,M/Z（％）：390(M⁺, 100), 392(M⁺＋2, 34)

【００２８】製造例２（炭素源の違いによる生産性）脱脂大豆粉１．２％、ペプトン０．３２％、硝酸ナトリ
ウム０．０８％、硫酸ナトリウム７水和物０．１％から
なる培地（pH５．６）１００mlを５００mlのエルレンマ
イヤーフラスコに仕込み、１２１℃で１５分滅菌した。
その後、ろ過滅菌したエタノールを３％（ｖ／ｖ）加え
液体培地とした。同様にエタノール３％（ｖ／ｖ）をグ
ルコース３％（ｗ／ｖ）及びグリセリン３％（ｗ／ｖ）
に置き換わった培地を調製し、１２１℃で１５分滅菌し
た。以下それぞれの培地をエタノール培地、グルコース
培地、グリセリン培地と呼ぶ。エタノール培地が調製さ
れたフラスコにペニシリウム・スクレロチオルム（Peni
cillium sclerotiorum）ＥＦ−１６４６株を１白金耳ず
つ接種し、２５℃、４日間、ロータリーシェイカーにて
攪拌培養した。次に、エタノール培地、グルコース培
地、グリセリン培地が調製されたフラスコにそれぞれ２
％（ｖ／ｖ）の量を接種し、２５℃、７日間、ロータリ
ーシェイカーにて攪拌培養した。培養液を酢酸エチルで
２回抽出し、脱水、ろ過、乾固した後、一定量のメタノ
ールに溶解し、後記実施例１と同様の方法で膵リパーゼ
阻害活性を調べ、スクレロチオリンの生産性を算出し
た。その結果を図１に示す。この結果、本発明の有効成
分であるスクレロチオリンはＥＦ−１６４６株を用いる
培養において、炭素源としてエタノールが有効であるこ
とが確認された。

【００２９】実施例１（膵リパーゼ阻害活性作用）スクレロチオリンのブタ膵臓リパーゼに対する阻害活性
試験を行った。０．１mMの４−メチルウンベリフェリル
オレート溶液１００μｌに各種濃度のスクレロチオリン
のメタノール溶液を１０μｌ、０．１ＭのMcllvaine 緩
衝液（pH７．４）を４０μｌ、５μｇ／mlのブタ膵臓リ
パーゼ（シグマ社製）溶液を５０μｌ加え、３７℃で２
０分間酵素反応させた。ブタ膵臓リパーゼ溶液は０．０
０４％の牛血清アルブミンを含む同緩衝液に溶解したも
のである。反応後、０．１Ｎ塩酸１mlを反応液に加えて
酵素反応を止め、次に０．２Ｍクエン酸ナトリウム溶液
２mlを加えた後、生成した４−メチルウンベリフェロン
の蛍光を励起波長３２０nm、蛍光波長４５０nmで定量し
た。なお、サンプルとしてメタノールを１０μｌ加えた
ものを対照とした。各濃度における阻害率（％）を、
〔（対照の蛍光強度−各検体の蛍光強度）／対照の蛍光
強度〕×１００より算出した。その結果を下記表２にス
クレロチオリンのＩＣ₅₀値で示した。膵リパーゼ阻害活
性がすでに報告されているヘスペリジン、アピゲニン、
ケルセチンを陽性対照とした。

【００３０】

【表２】

【００３１】実施例２（プロピオニバクテリウム・アク
ネ菌（Propionibacterium acnes）由来リパーゼ阻害作
用）スクレロチオリンのプロピオニバクテリウム・アクネ菌
由来リパーゼに対する阻害活性試験を行った。にきびの
原因菌とされるプロピオニバクテリウム・アクネ（Prop
ionibacterium acnes）はＪＣＭ６４２５を用いて、市
販ＧＡＭ培地（ニッスイ社製）にて３７℃、２４時間培
養した培養液から５０％飽和硫酸アンモニウムを添加し
て４℃で一晩塩析した。遠心分離により沈殿を回収し、
Mcllvaine 緩衝液（pH６．８）に溶解して酵素液とし
た。リパーゼ阻害活性は実施例１に準じ、酵素を調製し
た酵素液を用い、反応に使用したMcllvaine 緩衝液のpH
は６．８で試験した。その結果を下記表３にスクレロチ
オリンのＩＣ₅₀値で示した。

【００３２】

【表３】

【００３３】実施例３（植物由来及び微生物由来リパー
ゼに対する阻害作用）スクレロチオリンの植物由来及び微生物由来リパーゼに
対する阻害活性試験を行った。植物由来のリパーゼとし
てコムギ（Wheat Germ）由来のリパーゼ（シグマ社
製）、微生物由来のリパーゼとしてシュードモナス・エ
スピー（Pseudomonas sp.）由来のリパーゼ（シグマ社
製）及びカンジダ・ルゴーサ（Candida rugosa）由来の
リパーゼ（シグマ社製）を使用した。小麦由来のリパー
ゼは０．００４％の牛血清アルブミンを含むMcllvaine
緩衝液（pH７．４）に溶解して使用した。反応に用いた
緩衝溶液もMcllvaine 緩衝液（pH７．４）を使用した。
シュードモナス・エスピー由来のリパーゼは０．００４
％の牛血清アルブミンを含むMcllvaine 緩衝液（pH７．
０）に溶解して使用した。反応に用いた緩衝溶液もMcll
vaine 緩衝液（pH７．０）を使用した。カンジダ・ルゴ
ーサ（Candida rugosa）由来のリパーゼは０．００４％
の牛血清アルブミンを含むMcllvaine 緩衝液（pH７．
２）に溶解して使用した。反応に用いた緩衝溶液もMcll
vaine 緩衝液（pH７．２）を使用した。その他の反応条
件は実施例１に準じた。その結果を下記表４にスクレロ
チオリンのＩＣ₅₀値で示した。

【００３４】

【表４】

【００３５】実施例４カプセル剤の製造表５の配合により、各成分を良く混和し１号カプセルに
充填し、本発明のリパーゼ阻害剤のカプセル剤を３００
個製造した。

【００３６】

【表５】スクレロチオリン５ｇ乳糖４０ｇバレイショ澱粉５０ｇヒドロキシプロピルメチルセルロース３．５ｇステアリン酸マグネシウム１．５ｇ合計１００ｇ

【００３７】実施例５軟膏剤の製造表６の配合により、各成分を良く混和し、本発明のリパ
ーゼ阻害剤の軟膏剤を製造した。

【００３８】

【表６】スクレロチオリン５ｇグリセリン１２ｇステアリルアルコール２５ｇ白色ワセリン２５ｇｐ−オキシ安息香酸メチル０．０２５ｇｐ−オキシ安息香酸プロピル０．０２５ｇ滅菌精製水全量１００ｇ

【００３９】実施例６スキンクリームの製造表７の配合のＡ及びＢ成分を、それぞれ８０℃に加熱溶
解したものを混合した後、３０℃まで攪拌しつつ冷却し
てスキンクリームを製造した。

【００４０】

【表７】Ａスクレロチオリン５ｇステアリン酸７ｇセタノール３ｇミツロウ２ｇオリーブ油１５ｇポリオキシエチレンソルビタンモノオレート２ｇＢプロピレングリコール５ｇメチルパラベン０．１ｇ精製水全量１００ｇ

【００４１】実施例７ビスケットの製造表８の配合で常法によりドウを作成し、成型、焙焼して
ビスケットを製造した。

【００４２】

【表８】スクレロチオリン０．１ｇ小麦粉１２０ｇ砂糖３５ｇショートニング１５ｇ全卵粉１．５ｇ食塩１ｇ炭酸水素ナトリウム０．６ｇ炭酸アンモニウム０．７５ｇ水２０ｇ

【００４３】

【発明の効果】スクレロチオリンは、安全性が高く、か
つ高い膵リパーゼ阻害活性を有することから、腸管での
脂質分解を抑えることにより脂質の吸収を抑え、肥満の
抑制や予防、減量等に寄与し得る。また、にきびの原因
菌であるプロピオニバクテリウム・アクネ（Propioniba
cterium acnes）菌の生産するリパーゼに対しても阻害
活性を示すことから、にきびの予防、治療に有用であ
る。さらに食品素材由来や微生物由来のリパーゼによる
食品中の油脂の分解を抑制でき、その結果、遊離脂肪酸
に起因する食品の変敗や悪臭の発生を防ぐことができ
る。従って長期保存可能な食品を提供することができ
る。また、その膵リパーゼ阻害作用から食品のカロリー
を減少させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】スクレロチオリン生産菌の培養における、炭素
源の違いによるスクレロチオリン生産性の違いを示すグ
ラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ // Ｃ０７Ｄ 311/76 Ｃ０７Ｄ 311/76 Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｐ 17/06 (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:80） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/35 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】スクレロチオリンを有効成分とするリパ
ーゼ阻害剤。
【請求項２】スクレロチオリンを有効成分とする抗肥
満薬。
【請求項３】スクレロチオリンを有効成分とするにき
び治療剤。
【請求項４】スクレロチオリンを有効成分とする食品
変敗抑制剤。