JP3007161B2 - コレステロール吸収を減少するための方法および組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、食餌療法学の分野に関し、さらに詳細に
は、腸におけるコレステロールの取り込み量を減少する
ための、胆汁酸塩活性化リパーゼの使用に関する。

米国政府は、国立衛生研究所による研究認可番号HD−
23472により、本発明に一定の権利を有する。

高コレステロールに関与する心臓血管および他の疾患 高脂血症、特に、高コレステロール血症および高リポ
蛋白症は、アテローム性動脈硬化症を引き起こす最も危
険な因子の１つである。高リポ蛋白症はまた、膵炎の進
行に関与する。長い間に確立された理論によって、コレ
ステロール（通常、コレステロールを含む低密度リポタ
ンパク質（LDL）の形態である）の循環レベルが高い
程、コレステロールが動脈壁内へ侵入し、アテローム動
脈硬化症を生じ易いことが示唆されている（Brownおよ
びGoldstein、「高リポ蛋白質症およびその他の脂質代
謝疾患」Harrison's Principles of Internal Medicine
1650−1661（Braunwaldら、1987））。

心臓血管系の疾患は、女性および中年アメリカ人男性
の死亡原因の第１位である。1988年には、アメリカ在住
者の41,000人以上が、50歳までに心臓血管系の疾患によ
り死亡した。しかし、心臓血管系の疾患および脳卒中の
一因として知られるアテローム性動脈硬化症は、それよ
りかなり低い年齢で発症し始める。脂肪の条痕は小児の
動脈壁に多く認められ、そして環状動脈障害が高い割合
で、不慮の死または事故死の若年者に見い出されてい
る。血清コレステロールレベルが高い小児および思春期
の者は、正常なコレステロールレベルを有する小児およ
び思春期の者より、おそらく冠状心臓疾患の両親を有す
るであろう。小児期におけるより高い血清コレステロー
ルレベルは、思春期の者および青少年者の検死結果にお
ける、大静脈のアテローム性動脈硬化症に関連し、そし
て15歳から34歳の人の大動脈および冠状アテローム性動
脈硬化症の両方とも、検死時のコレステロールレベルに
相関している（Klagら、New Eng.J.Med.328（５）:313
−318（1993年２月４日））。

コレステロールは、特定の内分泌腺によるステロイド
ホルモン、および肝細胞由来の胆汁酸の合成の主要部分
によって使用され、そして細胞膜の必須な成分である。
これは、動物においてのみ見い出される。関連のステロ
ールは、植物で生じるが、植物ステロールは胃腸管から
は吸収されない。食餌中のコレステロールのほとんど
は、卵黄および動物性脂肪に含まれる。

腸で取り込まれるコレステロールは、食餌から直接、
そしてコレステロール含有胆汁酸塩および胆汁酸、なら
びに肝臓で合成され胆管を通じて腸に分泌される遊離の
コレステロールから誘導される。胆汁および食餌由来の
コレステロールエステルは、腸の上皮内面層細胞により
小腸の管腔から吸収され、そして細胞内に取り込まれて
カイロミクロン内に入るが、少量は、超低密度のリポタ
ンパク質（VLDL）に取り込まれる。これらの両方ともリ
ンパ液に分泌され、最終的には血流に合流する。カイロ
ミクロンおよびVLDLは、自らのトリアシルグリセロール
および自らのコレステロールのいくらかを内皮、筋肉、
および脂肪組織の細胞に送達する。次いで、コレステロ
ールに富むカイロミクロン残存物およびVLDLは、コレス
テロールを肝細胞およびその経路沿いの管壁の他の細胞
に戻される（Ganong,Review of Medical Physiology 24
9−250（Lange Medical Publications,1985））。腸細
胞および肝細胞由来のVLDLは、これらのトリアシルグリ
セロールの放出によって超低密度のリポタンパク質（LD
L）に変換され得る。LDLは、全血漿中コレステロールの
４分の３を含む。

高コレステロール血症において、血中コレステロール
レベルの増加は、LDL濃度の増加と主に関係する。しか
し、高コレステロール血症に固有の原因は複雑であり、
そして変化する。少なくとも１つの種類の高コレステロ
ール血症は、主として肝臓内の血液からコレステロール
を除去するLDLレセプター遺伝子の変異により引き起こ
される。一般に、高コレステロール血症は高食物中コレ
ステロールにかなり関連しており、これにより腸から循
環血液への高いコレステロールの取り込みがもたらされ
る。

高コレステロール血症を抑制すれば、アテローム性動
脈硬化症の発症を遅らせ、そしてアテローム性動脈硬化
症の進行が抑えられ、それゆえヒトおよび他の霊長類に
おける冠状心臓疾患の危険性が減少する。具体的には、
動物、特に霊長類において、高脂血症により誘導される
比較的複雑なプラークが後退し、さらに、高脂血症が除
かれると、アテローム性動脈硬化症の進行は終了する。
従って、アテローム発生を防止し、進行を中断し、そし
ておそらく危険因子を減少することによって現存の病巣
の後退を促進するように努めるべきである（Bierman,
「血管系の障害：アテローム性動脈硬化症および他の形
態のアテローム性動脈硬化症」Harrison's Principles
of Internal Medicine 1014−1024（Braunwaldら、198
7））。

高コレステロール血症を包含する高脂血症のいくつか
の形態は、予防的な処置の現行の技術を用いて、多少回
復する可能性がある。しかし、現行の技術で完全に成功
するものはなく、そして多くは所望しない副作用および
合併症が関与する。コレステロール減少薬を服用すれ
ば、血清中コレステロールを20％減少し得る。しかし、
薬物は高コレステロール血症に対して必ずしも確実では
なく、例えば、ロバスタチン（Lovastatin）、メバスタ
チン（mevastatin）、コレスチラミン（cholestyramin
e）（Questran）、クロフィブレート（Clofibrate）、
プロブコール（Probucol）、およびニコチン酸のような
高脂血症薬のいくつかは、肝臓合併症による死亡率の増
大を含む重篤な副作用、または例えば便秘（コレスチラ
ミン）、皮膚紅潮、筋肉の機能不全のような重篤度の低
い副作用を有し得、あるいは血中コレステロールではな
く、血中トリアシルグリセロールを下げる効果を有し得
る。食餌療法は、通常、高コレステロール血症の全ての
患者に奨励されるが、必ずしも効果的ではない。

従って、有効な方法および組成物が必要であって、そ
れらは血中脂質レベル（具体的には、コレステロールレ
ベル）を下げるのに（特にそれらは、それ自身顕著な副
作用を有さない）、そして高い血中脂質レベルに関連す
る疾患状態（特に、心臓疾患の高い危険性にある患者ま
たは既に心臓発作を起こしたことのある患者において）
を処置するのに有効である。

従って、本発明の目的は、それを必要とする患者にお
いて、血清中コレステロールを下げるのに使用する組成
物および方法を提供することである。

発明の要旨 ヒト胆汁酸塩活性化リパーゼ（BAL）のカルボキシ末
端領域の全部または一部から誘導される組成物について
記載する。それらを経口で摂取した場合に、天然のBAL
の腸表面への結合を競合し、従って腸細胞へのコレステ
ロールの輸送の仲介においてBALの生理学的役割を抑制
し、そしてその結果として、腸から血流へのコレステロ
ール吸収量を減少する。BALのカルボキシ末端領域の有
用な誘導体は、アミノ酸残基539から722を含む領域の全
部または一部から誘導され、そして、それぞれ11アミノ
酸残基の繰り返しプロリンリッチユニットを、少なくと
も３つ含有するムチン様構造を有する。好ましいプロリ
ンリッチユニットは、コンセンサス配列PVPPTGDSGAP
（配列番号６）を有する。

図面の簡単な説明 図１は、レクチン様レセプターに結合するＣテイルＯ
−グリコシル化炭水化物、コレステロールおよびコレス
テロールエステルのBALへの結合、BALによるコレステロ
ールエステルの加水分解を介する、腸皮内細胞へのBAL
の提唱される結合を示す。

図２は、内皮BAL脂肪分解活性の溶出を示し、マウス
の腸粘膜から、等浸透圧リン酸緩衝液、フコース（0.1
M）、ガラクトース（0.1M）、ヘパリン（10mg/ml）、ま
たはNaCl（0.3M）のいずれかを用いてμmol/g/hで測定
した。

図３は、BALを除去するためにエチレンビス（オキシ
エチレンニトリロ）四酢酸（EGTA）で処置または処置し
ていないいずれかのラットの腸における、放射活性コレ
ステロール（オレエート）エステルのnmol/g/hでのコレ
ステロールの取り込みを示す。

図４は、1mM EGTA、0.2mg/ml C−テイル、およびラッ
ト腸におけるコントロールに対するコレステロール取り
込み速度（nmol/g/h）のグラフを示す。

図５は、Ｃ−テイルを用いる、および用いないで、［
³H］−コレステロールオレエートを給餌したラットにお
ける血中［³H］−コレステロールレベル（nmol/mL）対
時間（hour）を示すグラフである。ヒト乳汁中BALより
単離されたＣ−テイルを給餌したラットへの血中［³H］
−コレステロールレベルをクロスで示す。Ｃ−テイルを
給餌していないラットの血中［³H］−コレステロールレ
ベルを四角で示す。血液サンプルを、［³H］−コレステ
ロールオレエートの給餌後、１時間間隔で５時間まで採
取した。

図６は、ヒト乳汁中BALから単離されたＣ−テイルを
用いる（斜線）、または用いないで（斜線なし）、
［³H］−コレステロールオレエートを給餌したラットの
血中［³H］−コレステロールレベル（nmol/mL）の平均
（６回の実験による）対時間（hour）のグラフである。
血液サンプルは、放射性標識したコレステロールオレエ
ートの最初のチューブの給餌後、１時間間隔で５時間ま
で採取した。データバー（bar）の先端の水平な線は、
標準誤差を示す（表XIVを参照のこと）。

図７は、腸を、１）取り込み実験の前に結合したBAL
を除去するための6mMタウロコーレートを含むEGTA溶液
（カラム１）、２）結合したBALが除去されないように
タウロコーレートを含まない緩衝液（カラム２）、３）
6mMタウロコーレートを含む緩衝液（カラム３）、30mM
タウロコーレートを含む緩衝液（カラム４）で洗浄した
ラットにおけるトリオレインの取り込みの速度（μmol/
g/h）のグラフである。データは、５回の実験の結果の
平均を示す（表XVを参照のこと）。４つの全ての動物の
グループとも、乳状された放射性標識トリオレインを受
容した。

図８は、腸を、１）取り込み実験の前に結合したBAL
を除去するたえのEGTA溶液（カラム１）（網掛け）、お
よび２）結合したBALが除去されないような緩衝溶液
（斜線）で洗浄したラットにおけるタウロコーレートの
取り込みの速度（μmol/g/h）のグラフである。データ
は、５回の実験の結果の平均を示す（表XVIを参照のこ
と）。左および右のカラムの対は、それぞれ1mMおよび6
mMの放射性標識したタウロコーレートによる取り込み速
度を示す。

発明の詳細な説明 胆汁酸塩活性化リパーゼ（BAL）のカルボキシ末端領
域の全てあるいは一部を含む組成物、あるいはそれらの
機能等価物が記載される。それらは、腸表面に結合する
際に腸内で天然BALと競合し、血流に取り込まれる遊離
コレステロールの形態でのコレステロールエステル（ea
ter）あるいは遊離コレステロールの取り込みを仲介さ
せるために内在性BALの機能を低下させる。

胆汁酸塩活性化リパーゼ 温血動物は、乳腺細胞あるいは膵臓、胃および小腸を
含むいくつかの消火器中の細胞によって分泌される、異
なる構造および活性を有する多くの形態のリパーゼを合
成する。生理学的基質に対して実質的にそれ自体が非活
性である胆汁酸塩活性化リパーゼ（BAL）は、胆汁酸塩
によって腸内で活性化される。BALは、膵臓によって、
および、ヒト、ゴリラ、ネコおよびイヌを含む少数の種
の乳腺によって合成され分泌される。ヒト乳汁中BALの
アミノ酸およびcDNA配列は、膵臓のカルボキシルエステ
ラーゼのものと同じであり、文献中でリソホスホリパー
ゼ、コレステロールエステラーゼ、ステロールエステル
ハイドロラーゼ、非特異的リパーゼ、リパーゼＡ、カル
ボキシルエステルリパーゼ、およびコレステロールエス
テルハイドロラーゼと称されているリパーゼと密接に関
連しているか、あるいは同一であり、主にカルボキシ領
域中の反復ユニット数に対して種によってある程度異な
る（WangおよびHartsuck、Biochim.Biophys.Acta1166:1
−19（1993））。膵臓BALは、膵臓リパーゼおよびホス
ホリパーゼなどの他のタイプの非胆汁酸塩活性化リパー
ゼとは明確に区別される。

腸腔内では、BALは腸表面、おそらく特異的レセプタ
ーを介して腸上皮内面層細胞の表面に付着する。BAL
は、EGTA、ガラクトースおよびフコースによって腔表面
から放出され得るが、以下に示すようにヘパリン、等張
緩衝液、あるいは塩化ナトリウムによっては放出され得
ない。胆汁酸塩が存在が要求される場合、BALはコレス
テロールエステルを加水分解して遊離コレステロールに
するために、あるいは食物中の遊離コレステロールと結
合するために必須である。この唯一の既知の膵臓脂肪分
解酵素はコレステロールの取り込みを仲介させ得るの
で、これらのプロセスは両方ともコレステロールの取り
込みを可能にするために必要である。BALはまた、アシ
ルグリセロール、リン脂質、およびビタミンエステルの
カルボキシルエステル結合を加水分解し、脂肪酸および
グリセロールを形成し、乳化された基質、ミセル状基質
あるいは可溶性基質に作用し得る。胆汁酸塩はBALのコ
ンフォメーション変化を引き起こし、それによってかさ
高い基質分子への活性部位接近を行い、また、酵素−基
質複合体の形成において付加的な脂質結合能を提供する
と考えられている。さらに、胆汁酸塩は、BAL触媒作用
の間に脂肪酸アクセプターとして作用すると考えられて
いる。

BALの作用の提案されたメカニズムを図１に示す。BAL
は、Ｃ−テイルＯ−グリコシル化炭水化物を介して、腸
上皮細胞の表面上でレクチン様レセプターと結合する。
酵素の触媒ユニットは、ヘパリン結合部位および活性部
位が露出した状態で、上皮細胞から離れたままである。
次いで、遊離コルステロールあるいはコレステロールエ
ステルは活性部位に結合し、そして、コレステロールエ
ステルの場合には、加水分解されて遊離コレステロール
になる。次いで、触媒ユニットは細胞表面でヘパリンに
結合し、コレステロールを細胞中に移す。

腸腔中のBALによるリポリス由来のコレステロール、
脂肪酸およびモノアシルグリセロールは、腸上皮内面層
細胞（粘膜細胞）によって取り込まれ、そこでこれらの
成分は再エステル化されて細胞内トリアシルグリセロー
ルになる。細胞中でコレステロールは、アポリポタンパ
ク質およびリン脂質を加えたこれらの再エステル化され
たトリアシルグリセロールと相互作用し、キロミクロン
および超低密度リポタンパク質を形成する。これらのキ
ロミクロンおよび超低密度リポタンパク質は、系循環の
ために血管系と最終的に接合する小リンパ管中に分泌さ
れる。

BAL分子のカルボキシ末端領域 完全で成熟したヒトBALは、722のアミノ酸残基（配列
番号１）を含んでいる。BALのカルボキシ末端領域は、
残基539から722を含む天然BAL分子中の領域を指す。BAL
のこのカルボキシ末端領域は、腸結合活性を保持するこ
の領域の誘導体と共に、本明細書中では「Ｃ−テイル」
と称される。ヒトBAL分子のＣ−テイルは、ムチン様構
造を形成する多くのＯ結合オリゴ糖ユニットを有してい
る。天然ヒトＣ−テイルアミノ酸配列は、それぞれ11の
アミノ酸残基からなる16の反復プロリンリッチ（rich）
ユニットを含み、その大半がPVPPTGDSGAP（配列番号
６）の共通配列を有している（Babaら、Biochemistry3
0:500−510（1991））。β−脱離反応を行うことによっ
て、天然Ｃ−テイルは、主にトレオニンで、また１つの
セリン残基において生じる場合は低い程度で、Ｏ−グリ
コシル化されることが決定された。隣接するアスパラギ
ン酸を有するセリン残基は、Ｏ−グリコシル化に好まし
くないと考えられる（Elhammerら、J.Biol.Chem.268:10
029−10038（1993））。Ｃ−テイルの臭化シアン消化に
よって調製されるペプチドは、天然BALの炭水化物の大
部分を含むことが見出された（Babaら（1991））。

以下に示されるように、本明細書において「Ｔ−BA
L」と称されるＣ−テイル結合部を欠く先端を切断され
た（truncated）型のBALは、酵素が超表面に結合しない
ので、腸細胞中にコレステロールを移すために効果的で
はない。同様に、Ｃ−テイルのみで腸表面に結合し、実
際にこの結合について天然BALと競合し得るが、触媒ユ
ニットは機能的でもなく、存在してもいないので、コレ
ステロールを移し得ない。

Ｃ−テイルタンパク質 アミノ酸残基539から722を含む領域の全てあるいは一
部に由来し、各々が11のアミノ酸残基を有する少なくと
も３つの反復プロリンリッチユニットを含むムチン様構
造を有するBALのカルボキシ末端領域の誘導体は、本明
細書においてＣ−テイルと称される。本明細書で用いら
れるように、プロリンリッチユニットは、BALの自然発
生形態で存在する11の反復アミノ酸グループのいずれ
か、あるいは他の２つ以上のプロリンリッチユニットと
組み合わせられると、腸上皮細胞に結合しおよび／また
は天然BALの結合を抑制するタンパク質になる、それら
のアミノ酸の誘導体を指す。好ましいプロリンリッチユ
ニットは、共通配列PVPPTGDSGA−Ｐ（配列番号６）を有
する。本明細書で用いられるように、「Ｃ−テイルタン
パク質」は、上記で定義したように３つ以上のプロリン
リッチユニットを含むいずれものタンパク質を指すこの
タンパク質は腸上皮細胞に結合しおよび／または天然BA
Lの結合を抑制する。これは、例えば、天然BALのムチン
様Ｃ−テイル領域の全てあるいは一部からなるBALを用
いることによって達成され得る。天然BALはＣ−テイル
タンパク質の形態である。

Ｃ−テイルタンパク質は、各々が11のアミノ酸残基か
らなる少なくとも３つの反復プロリンリッチユニットを
含むべきである。４つの反復ユニットのみを有するラッ
ト膵臓エステラーゼＣ−テイルも、ラット腸表面に結合
する。好ましいＣ−テイルタンパク質は少なくとも10
の、最も好ましくは少なくとも16のプロリンリッチユニ
ットを有する。より少数のプロリンリッチユニットを有
するＣ−テイルタンパク質は、より低い親和性を有する
腸表面に結合することが予測される。いずれものＣ−テ
イルタンパク質の結合親和性は、共通配列（配列番号
２）と非常に近似して一致するプロリンリッチユニット
によって高められ得る。Ｃ−テイルタンパク質は３つ以
上のプロリンリッチユニットを結合させることによって
構成され得る。ここで、プロリンユニットは、いずれか
のBALからのプロリンリッチユニットの天然アミノ酸配
列を有し、ヒトプロリンリッチユニットの共通アミノ酸
配列、あるいはこれらのアミノ酸配列の誘導体を有し、
その結果、Ｃ−テイルタンパク質は腸上皮細胞と結合し
および／または天然BALの結合を抑制する能力を保持す
る。

アミノ酸配列改変体 Ｃ−テイルタンパク質は、トレオニン残基およびセリ
ン残基の数に対して異なる程度でＯ−グリコシル化さ
れ、腸表面への結合を著しく妨げない。アミノ酸欠失、
置換あるいは付加を含み得る。結合を変化させないＣ−
テイルタンパク質への置換、欠失、あるいは付加は、ス
クリーニングアッセイによって容易に決定される。スク
リーニングアッセイにおいて、タンパク質は腸表面に結
合することが可能になり、次いで塩濃度を高くしながら
緩衝液で洗浄することによって除去される。Ｃ−テイル
の結合に影響を与えない欠失を含むBALの一例は、アミ
ノ酸残基56と62との間に存在すると仮定されている、ヘ
パリン結合部位を欠くBALである（Babaら（1991））。

Ｃ−テイルタンパク質のアミノ酸配列改変体は、３つ
のクラスの内の１つ以上の範囲に入る。すなわち、置換
改変体、挿入改変体、あるいは欠失改変体である。挿入
は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、なら
びに単一のあるいは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を
含む。融合は、成熟BALと、例えば、ヒトBALの場合は、
別の分泌ヒトタンパク質からの分泌リーダーである、BA
Lと相同型のポリペプチドを有するＣ−テイルタンパク
質とのハイブリッドを含む。融合は、BALと、宿主細胞
とは相同型であるがBALとは相同型ではないポリペプチ
ド、ならびに宿主細胞およびBALの両方に対して異種型
であるポリペプチドを有するＣ−テイルタンパク質との
ハイブリッドを含む。好ましい融合は、原核細胞、酵
母、細菌あるいは宿主細胞シグナル配列の原核生物のペ
プチドあるいはシグナルペプチドのいずれかを有するア
ミノ末端融合である。シグナル配列が、通常はその分泌
を誘導するタンパク質からいずれもの残基成熟配列を欠
いていることは必要ではないが、Ｃ−テイルタンパク質
融合の分泌を回避するためには好ましい。

挿入もまた、Ｃ−テイルタンパク質のプロリンリッチ
ユニット反復領域のコード化配列内に導入され得る。そ
のような挿入は、非関連アミノ酸の付加あるいは１つ以
上の付加的なプロリンリッチユニットの挿入を含み得
る。挿入されたアミノ酸のコンテクストにおいて、「非
関連」アミノ酸は、BALのプロリンリッチユニットの配
列に関連していないアミノ酸配列を指す。プロリンリッ
チユニットの場合、挿入されたユニットは、共通配列
（配列番号６）あるいは個々のヒトプロリンリッチユニ
ットの付加的な反復を有する非ヒトBALからの異種型ユ
ニットであり得る。しかし、非関連アミノ酸の挿入の場
合、挿入は、通常、アミノあるいはカルボキシル末端融
合より小さい挿入、あるいはプロリンリッチユニットよ
りも小さい、１から４残基のオーダーでの挿入から構成
される。

Ｃ−テイルタンパク質の挿入アミノ酸配列改変体（va
riant）とは、標的Ｃ−テイルタンパク質中の予め決定
したの部位に一つ以上のアミノ酸残基を導入したもので
ある。最も一般には、挿入改変体は、異種タンパク質ま
たはポリペプチドをＣ−テイルタンパク質のアミノ末端
またはカルボキシル末端と融合したのものである。好ま
しくは、これらの異種ポリペプチドは、ヒトBAL中に存
在するプロリンリッチな単位の異種形態である。免疫原
性のＣ−テイルタンパク質誘導体は、免疫原性を付与す
るために十分な大きさのポリペプチドを、インビトロで
の架橋または融合体をコードするDNAで形質転換した組
換え細胞の培養により、標的配列に融合することによっ
てなされる。そのような免疫原性ポリペプチドは、trpL
Eおよびβガラクトシダーゼなどの細菌性ポリペプチド
であり得る。

欠失は、Ｃ−テイルタンパク質配列から一つ以上のア
ミノ酸残基を除去することにより特徴付けられる。欠失
は、プロリンリッチな単位全体の欠失を包含することが
好ましい。プロリンリッチな単位内の個々のアミノ酸が
欠失される場合、Ｃ−テイルタンパク質分子内のどの部
位においても、約２〜６個の残基のみが欠失される。

これらの改変体は、通常、Ｃ−テイルタンパク質をコ
ードするDNA中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発に
より改変体をコードするDNAを作製し、その後組換え細
胞培養物中でDNAを発現させることによって調製され
る。しかし、約100〜150までの残基を有する改変体Ｃ−
テイルタンパク質フラグメントは、インビトロ合成によ
って簡便に調製することができる。改変体は、典型的に
は、天然に存在するアナログと同質の生物学的活性、す
なわち特異的な腸結合を示すが、以下により十分に詳述
するように、改変体はまた、Ｃ−テイルタンパク質の特
性を改変するように選択される。

アミノ酸配列改変体を導入するための部位は予め決定
されるが、変異そのものは予め決定する必要はない。例
えば、所与の位置における変異実行を至適化するため
に、標的コロン（colon）または領域においてランダム
変異誘発を行い得、発現したＣ−テイルタンパク質改変
体を、所望の特性の至適な組み合わせについてスクリー
ニングし得る。既知の配列を有するDNA中の予め決定し
た部位において置換変異を作製するための技術は周知で
あり、例えばM13プライマー変異誘発がある。

アミノ酸置換は、典型的には単一の残基である。挿入
は、通常、約１〜10個のアミノ酸残基程度、またはプロ
リンリッチな単位全体である；および欠失は、約１〜30
個の残基、またはプロリンリッチな単位全体にわたる；
欠失または挿入は、好ましくは近隣対においてなされ
る。すなわち、２残基の欠失あるいは２残基の挿入であ
る。最終構築物を得るために、置換、欠失、挿入、また
はその任意の組み合わせを組み合わせてもよい。明らか
に、改変体BALまたはＣ−テイルタンパク質をコードす
るDNAにおいてなされる変異は、その配列をリーディン
グフレームの外に追い出してはならず、および、好まし
くは、二次mRNA構造を生成し得るような相補的領域を形
成しない（EP75,444A）。

置換改変体とは、Ｃ−テイルタンパク質中の少なくと
も一つの残基が除去され、かつ異なる残基がその場所に
挿入されたものである。そのような置換は、一般に、Ｃ
−テイルタンパク質またはBALの特徴を最終的に改変す
ることが所望である場合に、以下の表Ｉに従ってなされ
る。

表Ｉ 元来の配列 置換の例 Ala Ser Arg Lys Asn Gln;His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn;Gln Ile Leu;Val Leu Ile;Val Lys Arg;Gln;Glu Met Leu;Ile Phe Met;Leu;Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp;Phe Val Ile;Leu 表Ｉの置換よりも保存性の低い置換を選択することに
よって、すなわち、（ａ）置換領域におけるポリペプチ
ド骨格構造（例えば、シート配置またはらせん配置）、
（ｂ）標的部位の分子の荷電または疎水性、または
（ｃ）側鎖のバルク（bulk）の維持に対する効果におい
て、より有意に異なる残基を選択することによって、機
能または免疫学的同一性における実質的な変化が作製さ
れる。BALまたはＣ−テイルタンパク質特性において、
最も大きな変化を生じることが一般に予測される置換
は、（ａ）親水性残基（例えば、セリル残基またはトレ
オニル残基）が、疎水性残基（例えば、ロイシル残基、
イソロイシル残基、フェニルアラニル残基、バリル残
基、またはマラニル残基）を置き換えた（あるいはこれ
らによって置き換えられた）置換；（ｂ）システインま
たはプロリンが他の任意の残基を置き換えた（あるいは
これによって置き換えられた）置換；（ｃ）正に荷電し
た側鎖を有する残基（例えば、リシル残基、アルギニル
残基、またはヒスチジル残基）が、負に荷電した残基
（例えば、グルタミル残基、アスパチル残基）を置き換
えた（あるいはこれによって置き換えられた）置換；ま
たは（ｄ）大きな（bulky）側鎖を有する残基（例え
ば、フェニルアラニン）が、側鎖を有さない残基（例え
ば、グリシン）を置き換えた（あるいはこれらによって
置き換えられた）置換である。

置換または欠失変異誘発を用いて、Ｎ−結合グリコシ
ル化部位またはＯ−部位グリコシル化部位を、（例えば
Asn−Ｘ−Thrグリコシル化部位中のアスパラギニル残基
の欠失または置換により）排除するか、またはBALまた
はＣ−テイルタンパク質の発現を向上させるか、または
タンパク質の半減期を変化させ得る。あるいは、非グリ
コシル化BALまたはＣ−テイルタンパク質を、組換え原
核細胞培養物中で生成させ得る。そのような非グリコシ
ル化形態は、腸結合活性を失っているか、または減少し
ていることが予測される。システインまたはその他の不
安定な残基の欠失もまた、例えば、酸化的安定性を向上
させるにおいて、またはBALの好ましいジスルフィド結
合配置を選択するにおいて、望ましくあり得る。潜在的
なタンパク質分解部位（例えば、Arg）の欠失または置
換は、例えば、塩基性残基の一つの欠失、またはグルタ
ミニル残基またはヒスチジル残基による置換によって、
達成される。

コレステロールの結合を競合的に阻害するために、不
活性化された触媒部位を有する完全長のBALを用いても
よい。触媒部位が不活性化されているので、BALはコレ
ステロールの取り込みを容易に行い得ない。触媒部位
を、組換えBALの活性部位においてアミノ酸を欠失また
は置換することにより、不活性化し得る。触媒部位はま
た、活性部位またはその近傍においてBALの化学的改
変、例えば、タンパク質分解またはその他の酵素反応に
より、非可逆酵素インヒビターの触媒部位への結合によ
り、またはBALの触媒単位の３次元的配置を破壊する手
段により（Ｃ−テイルの腸への結合はその配置に依存し
ないので）、不活性化される。破壊手段の例としては、
界面活性剤および熱が挙げられる。

コレステロールエステルを加水分解しない、またはヘ
パリンに結合しない有用なBAL誘導体は、BALと実質的に
相同であってもまたは相同でなくてもよいポリペプチド
を含む。これらのBAL誘導体は、BALフラグメントの組換
えまたは有機合成調製により、または完全なBAL中にア
ミノ酸配列改変体を導入することによって、上記に定義
したコレステロールエステル加水分解および／またはヘ
パリン結合活性を示さないようにすることにより、生成
される。

上記のようにコレステロールエステルを加水分解しな
い、またはヘパリンに結合しないBAL誘導体は、活性BAL
に対する抗体を惹起するための免疫原として有用であ
る。「BALタンパク質アンタゴニスト」と呼ばれるその
ようなBAL誘導体は、コレステロール取り込み仲介活性
またはBALを中和するために用いられ得る。このBALタン
パク質アンタゴニストは、腸内層に結合し、それにより
天然のBALの結合をブロックし得る。BALタンパク質アン
タゴニストは、種々のコレステロール異常、例えば、高
コレステロール血症、特に食事からのコレステロール摂
取により悪化した高コレステロール血症の治療に有用で
ある。

BAL、BAL誘導体、およびＣ−テイルタンパク質分子は
また、共有結合的に修飾し得る。そのような修飾は、回
収あるいは合成されたタンパク質の標的となるアミノ酸
残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有
機誘導剤（organic derivatizing agent）と反応させる
ことによってなされ得る。あるいは、選択された組換え
宿主細胞における翻訳後の修飾を用いてタンパク質を改
変してもよい。当業者には知られているように、得られ
る共有結合誘導体は、免疫原として、または生物学的活
性に重要な残基を同定するため、ならびに、半減期およ
び結合親和性などの分子の薬理学性質を変更するため
に、有用である。

ある種の翻訳後誘導は、発現されたポリペプチドに対
する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル
残基およびアスパラギニル残基は、しばしば、翻訳後
に、脱アミド化（deamidated）されて、対応のグルタミ
ル残基およびアスパラチル残基となる。あるいは、これ
らの残基は、温和な酸性条件下で脱アミド化される。こ
れら残基のいずれの形態を用いてもよい。

その他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリシン
のヒドロキシル化、セリル残基またはトリオニル残基の
ヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およ
びヒスチジン側鎖の０−アミノ基のメチル化（Creighto
n、Proteins:Structure and Molecular Properties、79
−86頁（W.H.Freeman ＆ Co.、San Francisco、198
3））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および場合により,
C末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。

Ｃテイルタンパク質の産生 Ｃテイルタンパク質の産生のためにいくつかの方法が
存在する。例えば、当業者は、天然または組換えBALを
取得し得、そしてプロテアーゼ（例えば、トリプシン、
キモトリプシン、ペプシンおよびその他）を用いるか、
またはMet−Ｘ結合を臭化シアンで切断するような化学
的方法を用いて、天然Ｃテイルを切断し得る。あるい
は、当業者は、真核生物宿主において、BALのＣテイル
領域または上記の任意のＣテイルタンパク質を含む配列
をコードする遺伝子またはcDNAを、それ自身でまたは他
の非BAL DNA配列との融合物のいずれかとして発現させ
得る。その非BAL DNA配列は、組換えＣテイルタンパク
質の発現または精製のいずれかを容易にし得る。組換え
BALまたはＣテイルタンパク質融合物は、精製Ｃテイル
を得るために切断および精製に供され得る。

BALは、例えば、ヒトおよび特定の種の乳汁または動
物の腸もしくは膵液のような天然の供給源から精製され
得る。しかしこれは、大規模では非実用的である。BAL
は、好ましくは、標準的な組換えDNA技術および真核生
物宿主細胞（例えば、酵母または培養哺乳動物もしくは
昆虫細胞）を用いる遺伝子操作により産生されるか（こ
の場合Ｃテイルが、適切にグリコシル化され得る）、ま
たはヒトではないトランスジェニック動物の乳汁で産生
される。

乳汁からのBALの単離方法が、WangおよびJohnson、An
al.Biochem.133:457（1983）により記載され、本明細書
中で参考として援用される。本明細書に記載のように、
産生されたBALまたはＣテイルタンパク質の状態を記載
するために使用される「本質的には含まない」または
「本質的には純粋な」は、例えば、BALが血液および／
または組織から抽出および精製により得られた場合、そ
のインビボでの生理的環境においてBALと通常結合する
タンパク質または他の物質を含まないことを意味する。
他の物質は、例えば、後天性不全症候群（AIDS）の原因
因子のような感染性生物を包含する。本発明の方法によ
り産生されたBALおよびＣテイルタンパク質は95％以上
の純度である。

組換えBALまたはＣテイルタンパク質を合成するため
に、当業者は、ヒト乳胆汁酸塩活性化リパーゼ（配列番
号２）をコードするcDNA配列（配列番号３）（Tangおよ
びWang、米国特許第5,200,183号;Babaら（1991）；また
はNilssonら、Eur.J.Biochem.192:543−550（1990）に
記載され、これらすべてが本明細書中で参考として援用
される）を利用し得る。この配列は、上記のような天然
BALのＣテイルをコードする配列の欠失、付加、または
置換のいずれかによって、上記のような任意のＣテイル
タンパク質の発現に容易に適合され得る。

DNA単離物は、３′および／または５′隣接領域を有
するかまたは有さない、化学合成DNA、cDNA、またはゲ
ノムDNAを意味することが理解される。BALをコードする
DNAは、ａ）特定の動物のBAL mRNAを含む肝臓、胸、膵
臓、または他の組織由来のcDNAライブラリーを得る工
程、ｂ）同種配列を含むcDNAライブラリーにおいてクロ
ーンを検出するために、ヒトBALまたはそのフラグメン
ト（通常、100bpより大きい）をコードする標識DNAを用
いてハイブリダイゼーション分析を行う工程、および
ｃ）制限酵素分析および核酸配列決定によりクローンを
分析し、全長クローンを同定する工程により、ヒト以外
の他の供給源から得られ得る。全長クローンがライブラ
リー中に存在しない場合、適切なフラグメントが、本明
細書中に開示された核酸配列を用いて種々のクローンか
ら回収され、そしてそれらクローンに共通の制限部位で
連結され、BALをコードする全長クローンをアセンブル
し得る。

「形質転換」は、DNAが染色体外エレメントとしてま
たは染色体組み込みにより複製可能であるように、生物
にDNAを導入することを意味する。特に示さない限り、
本明細書で使用される宿主細胞の形質転換の方法は、Gr
ahamおよびvan der Eb、Virology52:456−457（1973）
の方法である。しかし、核酸注入によるかまたはプロト
プラスト融合によるような、DNAの細胞への導入につい
ての他の方法もまた使用され得る。原核生物細胞または
堅固な細胞壁構造物を含む細胞が使用される場合、好適
なトランスフェクション方法は、Cohenら、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA69:2110（1972）に記載のような塩化カルシ
ウムを用いるカルシウム処理である。

所望のコード配列および制御配列を含有する適切なベ
クターの構築に、標準的な連結技術が使用される。単離
したプラスミドまたはDNAフラグメントは、切断され、
調整（tailored）され、そして必要なプラスミドを形成
するに所望の形態に再連結される。

Ｃテイルのグリコシル化は必須であるので、原核生物
細胞は、レセプターに結合するＣテイルの発現宿主とし
て有用ではない。しかし、一般に、原核生物は、発現に
有用なベクターの構築において、DNA配列のクローン化
のために使用される。例えば、E.coli W3110（Ｆ、原栄
養体性、ATCC番号27325）、Bacillus subtilusのような
桿菌、およびSalmonella typhimuriumまたはSerratia m
arcescansのような他の腸内細菌科、種々のシュードモ
ナス種が使用され得る。

一般に、宿主細胞に適合可能な種由来のプロモーター
および制御配列を含有するプラスミドベクターが、これ
らの宿主とともに使用される。ベクターは、通常、複製
部位ならびに１以上のマーカー配列を有する。マーカー
配列は、形質転換細胞の表現型選択を提供し得る。例え
ば、E.coliは、E.coli種由来のプラスミドであるpBR322
の誘導体を用いて代表的に形質転換される（Boliver
ら、Gene2:95（1977））。pBR322はアンピシリンおよび
テトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、そしてそれゆ
え、形質転換細胞の同定の簡単な手段を提供する。pBR3
22プラスミドまたは他の細菌プラスミドはまた、組換え
DNA構築において一般に使用されるプロモーターおよび
他の制御エレメトンを含有するか、または含有するよう
に改変されている。

原核生物宿主で使用するに適切なプロモーターは、β
ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Chang
ら、Nature275:615（1978）；およびGoeddelら、Nature
281:544（1979））、アルカリホスファターゼ、トリプ
トファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、nucleic
Acids Res.8:4057（1980）および欧州特許出願第36,776
号）およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロ
モーター（de Boerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21−
25（1983））を例示的に包含する。しかし、他の機能的
細菌プロモーターも適切である。これらのヌクレオチド
配列は一般的に知られており、従って、当業者は、任意
の必要な制限部位を供給するために、リンカーまたはア
ダプターを用いて、これらのヌクレオチド配列をBALま
たはＣテイルタンパク質をコードするDNAに作動可能に
連結し得る（Siebenlistら、Cell20:269（1980））。細
菌系で使用するためのプロモーターはまた、BALまたは
Ｃテイルタンパク質をコードするDNAに作動可能に連結
されたシャイン−ダルガルノ（S.D.）配列を含有する。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認する分析の
ために、連結混合物が、E.coli K12株294（ATCC31446）
を形質転換するために使用され、そして好結果の形質転
換体が、適切であればアンピシリンまたはテトラサイク
リン耐性により選択される。形質転換体からのプラスミ
ドが調製され、制限により分析され、そして／またはMe
ssingら、Nucleic Acids Res.9:309（1981）の方法によ
るか、もしくはMaxamら、Methods in Enzymology65:499
（1980）の方法により配列決定される。

宿主細胞は発現ベクターにより形質転換され得、そし
てプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または遺伝
子の増幅に適切なように改変された従来の栄養培地で培
養され得る。培養条件（例えば、温度およびpH）は、発
現について選択された宿主細胞で先に用いられた条件で
あり、そして当業者に明らかである。

「トランスフェクション」は宿主細胞による発現ベク
ターの取り込みを言い、これは、任意のコード配列が実
際に発現されるか否かに関わらない。多数のトランスフ
ェクション方法が当業者に公知である（例えば、CaPO₄
およびエレクトロポレーション）。首尾よいトランスフ
ェクションは、一般に、このベクターの作動の任意の徴
候が宿主細胞内で生じる場合に認識される。

以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻出
する方法および／または用語を記載する。

「プラスミド」は、小文字のｐを先頭に、そして／ま
たはそれに続く大文字および／もしくは数字によって表
される。本明細書中の出発プラスミドは、市販により入
手可能であるか、制限されずに公的に入手可能である
か、または公開された手順に従って入手可能なプラスミ
ドから構築される。さらに、記載のプラスミドと等価の
プラスミドが当該分野において公知であり、そして当業
者には明らかである。

DNAの「消化」は、DNAの特定の配列にのみ作用する制
限酵素によるDNAの触媒的切断を言う。本明細書中で使
用の種々の制限酵素は市販により入手可能であり、そし
てそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当
業者に公知のものが使用された。分析目的のためには、
代表的に、１μｇのプラスミドまたはDNAフラグメント
が、約20μｌの緩衝液中の約２ユニットの酵素とともに
使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメント
を単離する目的のためには、代表的に、５〜50μｇのDN
Aが、20〜250ユニットの酵素により大容量で消化され
る。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質の
量は、製造者により特定される。37℃で約１時間のイン
キュベーション時間が通常使用されるが、供給者の指示
に従って変化し得る。消化後、反応物は、ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動に直接適用され、所望のフラグ
メントが単離される。

制限消化物から得られる所定のDNAフラグメントの
「回収」または「単離」は、電気泳動によるポリアクリ
ルアミドまたはアガロースゲル上の消化物の分離、目的
のフラグメントの移動度と分子量の知られるマーカーDN
Aフラグメントの移動度との比較による目的のフラグメ
ントの同定、所望のフラグメントを含むゲル区画の切り
出し、およびDNAからのゲルの分離を言う。この手順
は、一般に知られている（Lawnら、Nucleic Acids Res.
9:6103−6114（1981）、およびGoeddelら、（198
0））。

「脱リン酸化」は、細菌アルカリホスファターゼ（BA
P）での処理による、末端５′リン酸の除去を言う。こ
の手順は、DNAフラグメントの２つの制限切断化末端の
「環状化」または閉環の形成を妨害する。「環状化」ま
たは閉環の形成は、制限部位での別のDNAフラグメント
挿入を妨害する。脱リン酸化のための手順および試薬は
従来どおりである（Maniatisら、Molecular Cloning,13
3−134（Cold Spring Harbor,1982））。BAPを用いる反
応は、50mM Tris中で68℃で行われ、酵素調製物中に存
在し得るいかなるエキソヌクレアーゼ活性をも抑制す
る。反応は、１時間行われる。反応後、DNAフラグメン
トは、ゲル精製される。

「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメント間のホス
ホジエステル結合の形成プロセスを言う（Maniatisら、
同書、146）。特に記載しない限り、連結は、公知の緩
衝液および条件を用いて、0.5μｇのほぼ等モル量の連
結されるDNAフラグメント当たり10ユニットのT4 DNAリ
ガーゼ（「ligase」）でなされ得る。

「充填化」または「平滑化」は、一本鎖のおよび制限
酵素消化した粘着末端の核酸を二本鎖に転換することに
よる手順を言う。これは粘着末端を切り出し、そして平
滑末端を形成する。このプロセスは、１つまたはわずか
の他の制限酵素のみにより創出される末端と粘着性であ
り得る制限切断末端を、任意の平滑切断制限エンドヌク
レアーゼに適合可能な末端あるいは他の充填された粘着
末端に転換するための用途の広い手段である。代表的に
は、平滑化は、２〜15μｇの標的DNAを10mM MgCl₂、1mM
ジチオトレイトール、50mM NaCl、10mM Tris（pH7.5）
緩衝液中で、約37℃、８ユニットのDNAポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントおよび４つのデオキシヌクレオ
シド三リン酸のそれぞれの250μＭの存在下でインキュ
ベートすることによりなされる。インキュベーション
は、一般に、フェノールおよびクロロホルム抽出ならび
にエタノール沈澱により30分後に終結される。

核酸分子を変異させ、操作し、そして組み換えるため
の多くの上記手順はまた、Sambrookら、Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor,1989）
による標準的な研究室マニュアル中に見出され得る。

多くの真核生物発現系エキソンが正しく切断されるの
で、ヒトBAL cDNAおよびヒトBALゲノムDNAの両方は、天
然形態または改変形態において組換えヒトBALタンパク
質の合成を指示するために用いられ得る。ヒトBAL遺伝
子は、酵素の発現を調節するその非翻訳領域配列に含ま
れることが予想される。これらの調節配列は、トランス
ジェニック動物の発現においてさえ直接用いられ得る。

組換えBALタンパク質は、多くの異なる方法により、
ヒトBAL cDNAまたは遺伝子から産生され得る。これら
は、例えば、E.coli、バチルス、酵母、真菌、昆虫細
胞、哺乳動物細胞、およびトランスジェニック動物のよ
うな宿主における、BALの発現を包含する、E.coliにお
けるＴ−BAL（Ｃ−テイルのないBALの短縮形態）の発現
は、Downsら、Biochemistry33:7980−7985（1994）に記
載されている。原核生物宿主は、mRNAから哺乳動物のイ
ントロンを削り取ることができないので、原核生物系に
おいて、適切な改変を加え、遺伝子よりもcDNAを発現さ
せることが好ましい。しかし、原核生物はBALをグリコ
シル化できないので、BALの発現のためには真核生物系
を用いることが好ましい。真核生物細胞を宿主として用
いる場合、ヒトBAL遺伝子またはcDNAのいずれかを酵素
の合成を指示するため使用し得る。粗面小胞体の内部に
対して新しく合成されたBALを指示するために、「リー
ダー」または「シグナル」配列が存在する場合、BALの
グリコシル化がまた存在し得る。これは、腸表面の相互
作用がＣ−テイルにおける多糖類切断するので、コレス
テロールの取り込みを減少させることが、Ｃ−テイルに
とって重要である。

すべての場合において、ヒトBAL cDNAまたは遺伝子
は、発現調節エレメント（例えば、転写開始シグナル、
翻訳開始シグナル、開始コドン、終止コドン、翻訳終止
シグナル、ポリアデニル化シグナルなど）を含む適切な
発現ベクターに挿入され得る。適切なベクターは、種々
の会社より市販されている。BAL cDNAまたは遺伝子を含
む組換えベクターを、宿主細胞にトランスフェクトした
後、これらは染色体外DNAとして残存し得るか、または
宿主ゲノムに組み込まれ得る。どちらの場合も、これら
は宿主細胞の組換えBALの合成を指示し得る。異種遺伝
子の発現についてのいくつかの例は、Methods in Enzym
ology,153巻、23章〜34章（編集者、WuおよびGrossman,
Academic Press,1987）に記載される。BAL合成宿主細胞
の大規模培養および酵素の精製は、BALまたはＣ−テイ
ルの産生の費用効率の良い商業手段を形成し得る。酵素
の大規模生産のための方法は、当業者に周知である。

グリコシル化されたBALのＣ−テイルについての有用
な発現系のいくつかの例を以下に示す： （１）宿主として酵母および真菌を用いる：酵母におけ
る組換えBALの発現の原理は、E.coli発現に類似する。
実施例は、Bitterら、Methods in Enzymology153:516−
544（1987）により提供される。E.coliのように、酵母
宿主細胞は、サイトソルにおいて、またはこの場合、好
ましくは、分泌タンパンク質としての、いずれかで、外
来遺伝子を発現し得る。E.coli発現とは異なり、酵母に
おける分泌発現は、グリコシル化され得る。分泌タンパ
ク質の酵母発現に利用可能な多くのベクター、プロモー
ター、およびリーダーが存在する。優れた実施例は、メ
チロトロピック酵母のPichia pastorisにおけるアルコ
ール酸化プロモーターによる制御に基づく系である。ベ
クターpHIL−S1およびpPIC9は、市販されており（Invit
rogen）、そして大容量の分泌性真核生物組換えタンパ
ク質を作製し得る（１〜4mg/Lのヒト血清アルブミン、B
arrら、Pharmaceutical Engineering12:48−51（199
2）;12mg/Lの破傷風菌毒性フラグメントＣ、Claraら、B
io/Technology9:455−460（1991）。

Saccharomycesにおける発現のために、例えば、プラ
スミドYRp7（Stinchcombら、Nature282:39（1979））;K
ingsmanら、Gene7:141（1979）;Techemperら、Gene10:1
57（1980））が、普通用いられる。このプラスミドは、
既にトリプトファン中で増殖する能力が欠損している酵
母の変異株（例えば、ATCC受託番号44076またはPEP4−
１（Jones,Genetics85:12（1977））についての選択マ
ーカーを提供するtrpl遺伝子を含む。次いで、酵母宿主
細胞ゲノムの特徴付けとしてのtrpl障害の存在は、トリ
プトファン非存在下での増殖により、選択の効果的な手
段を提供する。

酵母宿主を用いるための適切な促進配列は、３−ホス
ホグリセレートキナーゼ（３−phosphoglycerata kinas
e）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸
デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グロコ
ース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレー
トムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェ
ートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、お
よびグルコキナーゼ）（Hitzemanら、J.Adv.Enzyme Re
g.7:149（1968）；およびHolland,Biochemistry17:4900
（1978））のプロモーターを含む。

増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有す
る誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、
アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸
ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロ
チオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を
担う酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に使用
するための適切なベクターおよびプロモーターは、Hitz
emanら、欧州特許公開番号第73,657Aにさらに記載され
ている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターを
用いて有利に使用される。

異種遺伝子を発現するために首尾良く使用されている
真菌発現ベクターが少数存在する。既存の真菌発現ベク
ターは、トランスフェクションの後、宿主ゲノムへそれ
自身を組み込む（Cullenら、「Molecular Cloning Vect
ors for Aspergillus and Neurospora」in A Survey of
Molecular Cloning Vectors and their Uses（Butterw
orth Publishers,Stoneham,MA1986）。リーダーが発現
されるタンパク質コドンの前に存在する場合、分泌され
た組換えタンパク質は、グリコシル化され得る。首尾良
く発現したいくつかの例は、ウシキモシン（Cullenら、
Bio/Technology5:369−378（1987））および異なる真菌
由来の酸プロテアーゼ（Grayら、Gene48:41−53（198
7））を含む。

（２）宿主としての昆虫細胞：昆虫細胞における外来遺
伝子の合成のためのBaculovirus発現ベクターは、多く
の哺乳動物タンパク質およびウイルスタンパク質を発現
するために首尾良く使用されており、ならびにラット膵
臓BALについて記載されている（DiPersioら、Protein E
xpr.Purif.3:114−120（1992））。この系は、グリコシ
ル化され得、そして高レベルで組み換えタンパク質をま
た発現し得る。この系の使用はいくらか詳細に総説され
ている（LuckowおよびSummers、「Trends in the Devel
opment of Baculovirus Expression Vectors」Bio/Tech
nology,1987年９月11日）。baculovirus発現系由来の多
くのベクターは、市販されており（例えば、pBlueBacHi
s A,B,CおよびpEBVHis A,B,C）ならびに昆虫宿主細胞は
Invitrogenから入手可能である。

（３）宿主としての哺乳動物細胞：哺乳動物細胞におけ
る多くの異種遺伝子の発現は、商業目的のために首尾良
く成就されてきた。組換えヒト組織プラスミノゲンアク
チベーターの市販品が一例である。これらの発現ベクタ
ーのほとんどは、哺乳動物プロモーターまたはウイルス
プロモーターのいずれか、ポリアデニル化シグナル、お
よびE.coliにクローニングするための適切な調節エレメ
ント（抗生物質耐性遺伝子を含む）を含む。プロモータ
ーの下流にBALまたはＣ−テイルをコードするDNAを挿入
した後、ベクターは最初E.coliにクローン化され得、単
離され得、そして哺乳動物細胞にトランスフェクトされ
得る。ネオマイシンまたは類似の耐性選択マーカーのい
ずれかは哺乳動物細胞に同時トランスフェクトされ得
る。ネオマイシンまたは類似の耐性選択マーカーのいず
れかは、別のベクターまたは同一のベクターにおいて同
時トランスフェクトされ得る。高レベル発現のために、
遺伝子増幅系が有利である。BALまたはＣ−テイルタン
パク質を分泌する形質転換クローンは、酵素アッセイま
たはウェスタンブロットにより同定され得る。他の哺乳
動物タンパク質を用いたこのアプローチの成功例として
は、グリコシル化組換えタンパク質（Poormanら、Prote
ins1:139−145（1986））およびヒト免疫インターフェ
ロン（Scahillら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4654−46
58（1983））の合成をが挙げられる。

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御
するために好ましいプロモーターは、種々の供給源：例
えば、ポリオーマ（polymoma）、シミアンウイルス40
（SV40）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎
ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルス
のようなウイルスゲノムから、または異種哺乳動物プロ
モーター（例えばβアクチンプロモーター）から得られ
得る。SV40ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロ
モーターは、SV40ウィルす複製起点をまた含むSV40制限
フラグメントとして簡単に得られる（Fiersら、Nature2
73:113（1978））。ヒトサイトメガロウイルスの即時初
期プロモーターは、Hind III E制限フラグメントとして
簡単に得られる（Greenawayら、Gene18:355−360（198
2））。もちろん、宿主細胞または関連種由来のプロモ
ーターもまた本明細書において有用である。

高等真核生物による、BALまたはＣ−テイルタンパク
質をコードするDNAの転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増加される。エンハンサー
は、DNAのシス作用エレメントであり、通常約10〜300bp
であり、プロモーターに作用してその翻訳開始能力を増
加させる。エンハンサーは、比較的方向および位置が独
立しており、転写単位の５′（Laiminsら、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA78:993（1981））および３′（Luskyら、Mo
l.Cell.Bio.3:1108（1983））、イントロン内（Banerji
ら、Cell33:729（1983））、ならびにコード配列自身の
中（Osborneら、Mol.Cell Bio.4:1293（1984））に見出
されている。哺乳動物遺伝子（グロブリン、エラスター
ゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインス
リン）由来の多くのエンハンサー配列が公知である。し
かし、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサ
ーが用いられる。実施例は、複製起点の後側のSV40エン
ハンサー（ヌクレオチド100〜270）、サイトメガロウイ
ルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側の
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーを含む。

真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、
ヒト、または有核細胞）において用いられる発現ベクタ
ーはまた、mRNA発現に影響し得る転写の終結のために必
要な配列も含み得る。これらの領域は、BALまたはＣ−
テイルをコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデ
ニル化セグメントとして転写される。この３′非翻訳領
域はまた、転写終止部位を含む。

発現ベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも称さ
れる）を含み得る。哺乳動物細胞のために適切な選択マ
ーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、チ
ミジンキナーゼ、またはネオマイシンである。このよう
な選択マーカーが哺乳動物宿主細胞中にうまく移入され
ると、この形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧
下に置かれても生存し得る。選択レジメの２つの広く用
いられている異なるカテゴリーが存在する。第１のカテ
ゴリーは、細胞の代謝、および補充された培地に依存し
ないで増殖する能力を欠く変異細胞株の使用に基づいて
いる。２つの例は、CHO DHFR細胞およびマウスLTK細胞
である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチ
ンといった栄養素の添加なしに増殖する能力を欠いてい
る。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路のため
に必要な特定の遺伝子を欠いているので、これらの細胞
は失われたヌクレオチドが補充培地中に提供されない限
り生存し得ない。培地の補充に対する代替は、インタク
トなDHFR遺伝子またはTK遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠
いている細胞に導入し、こうしてそれらの増殖要求性を
変化させることである。DHFR遺伝子またはTK遺伝子で形
質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地中で生存
し得ない。

第２のカテゴリーは優性選択である。これは任意の細
胞タイプにおいて使用される選択スキームをいい、そし
て変異細胞株の使用を必要としない。代表的にはこれら
のスキームは、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を使用
する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬剤耐性をもたら
すタンパク質を発現し、そして選択から生き延びる。こ
のような優性選択の例は、ネオマイシン（Southernおよ
びBerg.Molec.Appl.Genet.1:327（1982））、ミコフェ
ノール酸（MulliganおよびBerg,Science209:1422（198
0））、またはハイグロマイシン（Sugdenら、Mol.Cell.
Biol.5:410−413（1985））といった薬物を使用する。
上に挙げた３つの例は、真核性制御下の細菌性遺伝子を
用いて、それぞれ、G418またはネオマイシン（ジェネテ
ィシン）、Xgpt（ミコフェノール酸）、またはハイグロ
マイシンといった適切な薬物に対する耐性をもたらす。

「増幅」は、細胞の染色体DNA内の単離された領域の
増加または複製をいう。増幅は、選択薬剤（例えば、DH
FRを不活化するメトトレキセート（MTX））を用いて達
成される。DHFR遺伝子の増幅または連続的コピーの作製
は、より多量のMTXに対抗して生成される、より多量のD
HFRを生じる。増幅圧が、培地にさらにより多量のMTXを
添加することにより、内因性DHFRの存在にもかかわらず
適用される。所望の遺伝子の増幅は、哺乳動物宿主細胞
を、所望のタンパク質をコードするDNAを有するプラス
ミドおよびDHFR遺伝子または同時組み込みを可能にする
増幅遺伝子で同時トランスフェクトすることにより達成
され得る。さらにより高いMTX濃度の存在下で増殖し得
る細胞のみを選択することにより、細胞がより多くのDH
FRを必要とすることを確実にする（この必要は、選択遺
伝子の複製により満たされる）。所望の異種タンパク質
をコードする遺伝子が選択遺伝子と同時組み込みされて
いる限り、この遺伝子の複製は所望のタンパク質をコー
ドする遺伝子の複製をもたらす。結果として、所望の異
種タンパク質をコードする、遺伝子の増加したコピー
（すなわち増幅された遺伝子）が、より多くの所望の異
種タンパク質を発現する。

高等真核生物においてBALまたはＣ−テイルタンパク
質をコードする開示のベクターを発現させるために好ま
しい適切な宿主細胞は、以下を包含する:SV40で形質転
換されたサル腎CVI株（COS−７、ATCC CRL1651）；ヒト
胚腎株（293、Grahamら、J.Gen.Virol.36:59（197
7））、ベビーハムスター腎細胞（BHK、ATCC CCL10）；
チャイニーズハムスター卵巣細胞−DHFR（CHO、Urlaub
およびChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216（198
0））マウスセルトリー細胞（TM4、Mather,Biol.Repro
d.23:243−251（1980））、サル腎細胞（CVI、ATCC CCL
70）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO−76、ATCC CRL
−1587）；ヒト子宮頸ガン細胞（HELA、ATCC CCL2）、
イヌ腎細胞（MDCK、ATCC CCL34）；バッファローラット
（buffalo rat）肝細胞（BRL 3A、ATCC CRL1442）；ヒ
ト肺細胞（W138、ATCC CCL75）；ヒト肝細胞（hep G2、
HB8065）；マウス乳腫瘍（MMT060562、ATCC CCL51）；
および、TRI細胞（Matherら、Annals N.Y.Acad.Sci.38
3:44−68（1982））。

（４）トランスジェニック動物におけるＣ−テイルタン
パク質またはBALの発現：ヒトBAL遺伝子を、組織特異的
発現のために、他の動物のゲノム中に移入するための技
術は、既に存在する（Jaenisch,Science240:1468−1474
（1988）;Westphal.FASEB J.3:117−120（1989））。ト
ランスジェニック技術を用いることにより、乳汁の組成
を変化させるためのいくつかの研究が、既に進行中であ
る（総説については、Bremelら、J.Dairy Sci.72:2826
−2833（1989）を参照のこと）。上に列挙した３つの総
説に要約された一般的なアプローチは、分泌性乳腺（乳
汁）タンパク質（例えば、カゼインまたは乳汁リゾチー
ム）のプロモーター、BALまたはＣ−テイルタンパク質
をコードするDNA、および適切な相補エレメントを含む
ベクターを構築することである。次いで、クローン化ベ
クターを新たに受精したウシまたはヒツジの卵子にマイ
クロインジェクションし、そしてこの卵子を胎児発生お
よび誕生のために「乳母」に移入する。トランスジェニ
ック子孫を、サザンブロットにより遺伝子移入につい
て、そして乳汁におけるBALまたはＣ−テイルタンパク
質の産生について分析する。ウシおよびヒツジは、それ
らの乳汁中にBALを産生しないことに留意することが重
要である。高収量株を産生するために、トランスジェニ
ック動物を交配させ得る。乳汁中に分泌されるＣ−テイ
ルタンパク質は、完全にグリコシル化される。ウシおよ
びヒツジは乳汁BALを作らないので、組換え産物は、宿
主乳汁タンパク質から容易に区別され得る。

Ｃ−テイル構造を模倣する、糖または糖アナログ含有
化合物をまた、化学反応により合成し得る。これらは、
腸表面に結合させ、そしてＣ−テイル自体と同じ様式で
内因性BALと競合させるために使用され得る。以下の実
施例は、ガラクトースおよびフコースが、ラット腸表面
から、内因性の結合したBALを溶出し得ることを実証
し、このことは、これらの糖を含有するＣ−テイルの合
成模倣物またはその構造的アナログが、腸表面への結合
に影響を及ぼすために使用され得ることを示す。Ｃ−テ
イルは反復配列および多数のグリコシル化部位を含むの
で、合成模倣物は、多数の糖含有部位を含み得る。糖の
化学結合が、Ｃ−テイルのオリゴ糖構造に基づいてモデ
リングされ得るが、またはこれらのオリゴ糖構造の構造
的アナログが、腸BALレセプターへの有効な結合のため
の必須の特性を含み得る。糖をポリマーに化学的に付着
させて反復単位を作製し得る。適切なポリマーの例は、
ポリペプチド、ポリエチレングリコール、デキストラ様
糖ポリマー、および糖への化学結合のために適切な官能
基を有するその他の合成ポリマーを包含する。

薬学的応用および組成物 以下の実施例に記載されるように、BALがそのＣテイ
ルのオリゴ糖を介して腸表面のレクチン様レセプターに
結合することが見いだされる。この結合は、腸によるコ
レステロールの取り込みへの介在における必須なステッ
プである。さらに、BALの単離されたＣテールが、腸表
面のレセプターへの結合に対してBALと競合し得ること
が見いだされた。さらに、Ｃテールが、腸に結合したBA
Lを減少させることによって、腸のコレステロール取り
込みを競合的に阻害し得ることが示された。コレステロ
ール取り込みのＣテールによる減少は特異的である。な
ぜなら、BALは、コレステロール取り込みを介在し得る
腸内の唯一の酵素であるからである。BALはまた、他の
脂肪酸エステルを加水分解するので、他の脂肪の取り込
みを容易にし得る。しかし、非コレステロール脂肪の腸
による取り込みのＣテールによる減少は、特異的ではな
い。なぜなら、腸内の他のリパーゼもまた非コレステロ
ール脂肪を消化し得るからである。従って、上記で定義
したように、Ｃテールタンパク質は、コレステロール取
り込みの特異的な減少および／または他の脂肪の取り込
みのより一般的な減少を必要とする固体に治療剤として
投与され、それによって、高リポタンパク症、高コレス
テロール血症、およびアテローム性動脈硬化症に関連す
る疾病を治療する。

好ましい実施態様において、Ｃテールタンパク質は、
血液中のコレステロールレベルの減少によって測定され
るように、食物からのコレステロールの取り込みを減少
させるのに有効な量で経口投与される。投与量は、製
剤、排出率、腸表面のレセプターの数などの個体の変
動、減少すべきコレステロールのレベル、および投与頻
度、ならびに医師によって通常最適化される他の要因に
よって異なる。

食物からの腸によるコレステロールの取り込みは、一
人当たり一日約200mgである。身体が合成するコレステ
ロールは、一人当たり一日約500mgである。膵臓は、一
人当たり一日約500mgのコレステロールを分泌し、これ
は腸を通して再吸収される。従って、腸表面におけるＣ
テール組成物は、一人当たり一日約700mgコレステロー
ルの取り込みからコレステロールの量を減少させるのに
有効でなければならない。減少が一日500mg未満のレベ
ルになると、身体は身体のコレステロールを減少させ
る。

腸内のコレステロール取り込みを減少させるのに有効
な量で患者に投与されるとＣテールタンパク質の薬学的
活性を向上させ、それによって血液中のコレステロール
レベルを減少させるように設計されるＣテールタンパク
質を含む薬学的組成物は、適切な薬学的な安定化化合
物、送達ビヒクル、担体、不活性希釈液、および／また
は当該技術において周知の方法による腸内（経口）投与
に適切な他の添加物と組み合わせて調製され得る。製剤
は、通常、胃または腸内に放出される。Ｃテールタンパ
ク質は、脂質、ペースト、懸濁液、ゲル、粉末、錠剤、
カプセル、食物添加物、または他の標準的な形態に調剤
される。薬学的に適合可能な結合剤および／またはアジ
ュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。その
例としては、微晶質セルロース、トラガカントゴム、ま
たはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトース
などの賦形剤；アルギン酸、Primogen^TM、またはコーン
スターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまた
はステロート（sterotes）などの潤滑剤；コロイド状二
酸化シリコンなどのアグリダント（aglidant）；ショ糖
またはサッカリンなどの甘味剤；および／またはペパー
ミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ着香料など
の矯臭剤が挙げられる。投与単位形態がカプセルである
場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体が含まれ
得る。他の投与単位形態はさらに、糖、シェラックのコ
ーティング、または他の腸剤を含み得る。Ｃテールタン
パク質は、エリキシル剤、懸濁剤、飲料、液体食物補足
剤もしくは代用剤、またはシロップなどの流体；または
カシェ剤もしくはキャンディーなどの個体の成分として
投与され得る。Ｃテールタンパク質は、他の血液脂質を
低下させる薬学組成物などの所望の作用を損なわない他
の活性材料、または所望の作用を補足する材料と混合さ
れ得る。

１つの好ましい実施態様において、Ｃテールタンパク
質は、タンパク質、ポリヒドロキシ酸または多糖類など
の合成または天然ポリマーから調製される微粒子、マイ
クロカプセルまたは微球体などの小腸に放出される担体
内にカプセル化される。適切なシステムは当業者に公知
である。いくつかの微球体製剤は、経口薬物送達用手段
として提案されている。これらの製剤は、一般に、カプ
セル化化合物を保護し、この化合物を血流に送達するの
に役立つ。腸溶製剤は、経口投与される薬物を保護し、
放出を遅延させるのに長年にわたって広範囲に使用され
てきた。化合物を血流に送達し、カプセル化された薬剤
を保護するように設計される他の製剤は、PCT/US90/064
30およびPCT/US90/06433に記載されているゼインなどの
疎水性タンパク質;Steinerの米国特許第4,976,968号に
記載されている「プロテイノイド（proteinoids）」；
またはUAB Research Foundation and Southern Researc
h Instituteによるヨーロッパ特許出願第0 333 523号に
記載されている合成ポリマーで形成される。EPA 0 333
523は、ワクチンの経口投与に用いられる抗原を含む直
径10ミクロン未満の微粒子について記載している。カプ
セル化されたＣテールタンパク質の血液およびリンパ系
への取り込みを防止するために、本明細書中で記載され
る用途には大きなサイズの方が好ましい。

微粒子は、その平滑な表面が腐食すると、カルボキシ
ル基が外面に露出されるポリ［ラクチド−コ−グリコリ
ド］、ポリ無水物、およびポリオルトエステルなどの迅
速な生体腐食性ポリマー；ゼイン、変性ゼイン、カゼイ
ン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミンまたはコラー
ゲンなどのタンパク質、およびセルロース、デキストラ
ン、ポリヒアルロン酸、アクリル酸エステルおよびメタ
クリル酸エステルとアルギン酸とのポリマーなどの多糖
類のような天然ポリマー；ポリホスホファジン（polyph
osphazines）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミ
ド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリル
アミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオ
キシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエ
ーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、
ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサ
ン、ポリウレタンおよびそのコポリマーなどの合成ポリ
マー；ならびにアルキルセルロース、ヒドロキシアルキ
ルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステ
ル、およびニトロセルロースなどの合成によって改変さ
れた天然ポリマーで形成され得る。代表的なポリマーに
は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシ
プロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロ
ース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、
酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリ
ウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチル
メタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポ
リ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタ
クリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポ
リ（ウラリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタク
リレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソ
プロピルアクリレート、ポリ（イソブチルアクリレー
ト）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポ
リ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）、ポリ（酢酸ビニル）、塩化ポリビニル、ポリスチ
レン、ポリビニルピロリドン、およびポリビニルフェニ
ルが挙げられる。特に代表的な生体腐食性ポリマーに
は、ポリアクチド、ポリグリコリドおよびそのコポリマ
ー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、
ポリ（バレリアン酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラ
クトン）、ポリ［ラクチド−コグリコリド］、ポリ無水
物、ポリオルトエステル、配合物、ならびにそのコポリ
マーが挙げられる。

これらのポリマーは、Sigma Chemical Co.,St.Louis,
Mo.,Polysciences,Warrenton,PA,Aldrich,Milwaukee,W
I,Fluka,Ronkonkoma,NY、およびBioRad,Richmond,CAな
どの供給源から得られるか、または標準的な技術を用い
てこれらの供給者から得られるモノマーから合成され得
る。

Ｃテールタンパク質を含む薬学組成物は、製造および
保存条件下で安定していなければならず、そして食品薬
品局によって使用が認可されている化合物のリストに挙
げられるビタミンＥおよびエトキシキンおよび静菌剤な
どの抗酸化剤を用いて細菌および真菌などの微生物によ
る汚染から保護され得る。

上記のように、Ｃテールタンパク質の不活性化および
排出速度、ならびに当業者に公知の他の要因は、患者に
投与される薬物の量に影響する。決定的な基準は、量が
血液中のコレステロールを減少させるのに有効かどうか
である。血液中のコレステロールレベルは、臨床実験室
で使用される標準的な技術によってアッセイされる。

Ｃテールタンパク質は、腸によるコレステロールの取
り込みを減少させ、それによって高コレステロール血
症、高トリグリセリド血症およびアテローム性動脈硬化
症、心臓血管疾患、および膵炎などの関連の疾病状態を
含む高脂血症の治療に使用され得る。Ｃテールタンパク
質はまた、これらの障害の発生を防止する予防的方策と
して正常な被験体においても使用され得る。ヒト血清コ
レステロールレベルは、200mg/dl未満に維持されるのが
好ましく、240mgの値は臨床的に高く、160mgの値は低い
と見なされる。

製剤は、一日一回の投与量または分割した投与量で投
与され、最も好ましくは、食前、食事中、または食後の
３回投与される。患者は、気づかないままＣテールタン
パク質が維持され、腸によるコレステロールの取り込み
が減少する。投与量レベル、頻度、および持続時間を選
択するにあたって考慮されるべき条件には、主として、
患者の疾患の深刻度、患者の血清コレステロールレベ
ル、胃の苦しみのような副作用、および患者の予防療法
の必要性、ならびに治療効率が挙げられる。特定の被験
体については、個々の患者の必要性および組成物投与を
管理または監視する人のプロフェッショナルな判断に従
って時間をかけて調整されなければならず、そして本明
細書で設定される濃度の範囲は、例示的なものにすぎ
ず、請求の範囲に記載される組成物の範囲または実施を
限定するものではないことが理解される。他の濃度範囲
および投与持続時間は、通常の実験によって決定され得
る。投与量の初期見積もりは、20μｇが1cmの腸から結
合されるレセプターをブロックするのに必要であるとい
う計算に基づくと、20mgのＣテールタンパク質は、BAL
結合部位をブロックするのに長さ10メートルの腸をカバ
ーするのに十分であるはずである。５倍の過度な量（10
0mg）は、腸細胞によるコルステロールの吸収を防止す
るのに十分すぎる。投与量のさらなる調整は、血液中の
コレステロールを減少させる際の患者のＣテールタンパ
ク質に対する投与量応答のモニタに基づく。

本発明は、以下の非限定の実施例を参照するとより理
解される。引用文献はすべて、本明細書中で参考として
明示的に援用される。

実施例1:プロリンリッチドメインおよびグリコシル化
は、胆汁酸塩活性化リパーゼの酵素活性に必須ではな
い。

BAL分子内の構造領域の機能的要件を試験するため
に、ヒトの、先端を切断した乳胆汁酸塩活性化リパーゼ
（Ｔ−BAL）cDNA（ムチン様カルボキシ末端領域（残基5
39〜722）なし）を、Escherichia coli中のT7系から発
現させ、精製し、そして切断組換え酵素の特性を研究し
た。方法は以下のとおりであった。

略語 本実施例において以下の略語を使用する:PANA、酢酸
ｐ−ニトロフェニル;PANB、酪酸ｐ−ニトロフェニル;SD
S、硫酸ドデシルナトリウム;T−BAL、切断型胆汁酸塩活
性化リパーゼ;PCR、ポリメラーゼ連鎖反応;TN（50mMのT
ris−HCl、pH8.0および100mMのNaCl）;EGTA、エチレン
グリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）N,N,
N′,N′−四酢酸;FPLC、高速タンパク質液体クロマトグ
ラフィー；およびBSA、ウシ血清アルブミン。

材料 本明細書中に参考として援用されるBabaら（1991）に
記載されているような方法で、ヒト乳からのBALの精製
を行った。ヒト泌乳胸部組織からのλgt10cDNAライブラ
リーを、Clontech（Palo Alto、CA）から購入した。グ
リセロールトリ［9,10−³H］オレエートを、Amersham
（Arlington Heights、Il）から入手した。オリゴヌク
レオチドプライマーＩ（配列番号４）およびプライマー
II（配列番号５）は、Dr.K.Jackson（Molecular Biolog
y Resource Facility、Oklahoma University Health Sc
ience Center）によって調製された。他の全ての化学物
質は、Sigma Chemical Co.（St.Louis、MO）から購入し
た。

分子生物学的方法 配列決定分析、制限酵素処理、連結およびサブクロー
ニングのための標準的な方法は、一般的に知られ、かつ
用いられている参照技術文献である、SambrookらのMole
cular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（198
9）、および、Ausubleら（編）のCurrent Protocols in
Molecular Biology,Green Publishing Associates and
Wiley−Interscience,New York,N.Y.（1989）に記載さ
れている。TangおよびWangの米国特許5,200,183号に記
載されているような方法で、ヒト乳腺cDNAからcDNAクロ
ーンG10−２およびG10−５を単離した。United States
Biochemical Corp.（Cleveland、OH）から入手したDNA
配列決定キットを用いて、以下のようにDNA配列決定分
析を行った。初めに、二本鎖DNA鋳型を、KraftらのBioT
echniques6:544−547（1988）に記載されているような
方法で変性した。次いで、2.5μｇのDNA、15ngのプライ
マーおよび２μｌの反応緩衝液を合わせて合計容積を10
μｌとし、これを、65℃に２分間加熱し、次いで、30分
間で25℃に冷却して、鋳型のアニーリングを行った。標
識混合物を、水で５倍に希釈し、シークエナーゼ型2.0
（Sequenase version2.0）を水で８倍に希釈した。１μ
のDTT（0.1M）、２μｌの希釈標識混合物、５μCiの
［α³²P］dATPおよび２μｌの希釈シークエナーゼを、
アニーリングを行った鋳型プライマーに加えた。混合
後、試験管を、室温で３分間インキュベートした。2.5
μｌの終止混合物を試験管に入れた。試験管は37℃で１
分間予熱しておいた。2.5μｌの標識反応混合物を、そ
れぞれの終止試験管に移し、混合し、そして次いで37℃
で３分間インキュベートした。４μｌの停止液を加えて
反応を停止させた。次いで、サンプルを６％のアクリル
アミドゲル上で泳動した。サンプルを適用する前に、20
00ボルトの定常電圧で30分間、ゲルの予備泳動を行っ
た。配列決定ゲル上に２μｌを搭載する直前に、サンプ
ルを75℃で２分間加熱した。2000の定常電圧で３時間〜
４時間、ゲルを泳動した。泳動後、ゲルを3MMペーパー
に移し、次いで、真空下、80℃で２時間乾燥させた。続
いて行われるDNA配列の読取りのために、Kodak X−Omat
^TMPRフィルムを、一晩、室温で露光した。本明細書中に
参考として援用される、InnisおよびGelfandのPCR Prot
ocols,A Guide to Methods and Application3−12（Inn
isら（編）、Academic Press,New York,N.Y.（1990））
に記載されているような方法でPCRを行った。Invitroge
n（San Diego、CA）から入手したTAクローニングキット
を用いて、以下のように、PCR生成DNAをPCR IIにサブク
ローンした。PCR IIベクターとの連結は、ベクター:PCR
生成物のモル比が1:1および13となるように設定した。
１μｌの10×連結緩衝液、50ngのベクター、PCR生成物
および４単位のT₄DNAリガーゼを合わせて、合計容積を1
0μｌとした。連結反応物を、12℃で、一晩インキュベ
ートした。次いで、0.5Mのβ−メルカプトエタノールを
２μｌ含有する50μｌのINVαＦ′コンピテント細胞
に、各連結反応物を１μｌ加えた。試験管を氷上で30分
間インキュベートした。次いで、試験管を42℃の水浴に
30秒間入れ、その後、氷上に２分間戻した。450μｌの
室温SOCを各試験管に加えた。次いで、試験管を37℃で
インキュベートし、225rpmで１時間振とうした。形質転
換した細胞を、50μg/mlのカナマイシンおよび1mgのＸ
−Galを含有するLBプレート上に広げた。次いで、形質
転換したクローンの選別を行うために、プレートを裏返
して、37℃で一晩インキュベートした。Promega（Madis
on、WI）提供のMagic Miniprep^TMシステムを用いてプラ
スミドの単離を行った。細胞をペレット化するために、
3mlの一晩培養した培養物を、4000rpmで５分間、遠心分
離にかけた。ペレットを200μｌの細胞再懸濁溶液中に
懸濁した。200μｌの細胞溶解液を加え、懸濁液が澄明
になるまで、試験管を反転させて混合した。200μｌの
中和溶液を加え、試験管を数回反転させて混合した。ミ
ニカラムを注射筒（syringe barrel）に取り付け、アセ
ンブリを真空マニホールドに挿入した。樹脂/DNA混合物
を、注射筒に移し、真空を付与することによって、カラ
ムに注入した。カラムを2mlのカラム洗浄溶液で洗浄し
た後、樹脂を乾燥させた。残っている洗浄液を除去する
ために、ミニカラムを、14000rpmで20秒間、遠心分離に
かけた。70℃の水50μｌをカラムに加え、１分経過後、
20秒間、カラムを遠心分離にかけることにより、DNAを
カラムから溶離した。

ベクターの構築 BALの全コード配列領域を取り囲むcDNA G10−６の構
築のために、オーバーラップクローンG10−２およびG10
−５のユニークなSma I制限部位を用いた。Ｔ−BAL cDN
Aを調製するために、切断型BALを発現させるためのプラ
イマーＩおよびIIの使用と共にPCRを用いた。続いて行
われるE.coli中のT7発現系を用いたＴ−BAL発現のため
に、Ｔ−BAL cDNAを、pET11aクローニングベクター（In
vitrogen、San Diego、CA）のNde I/BamH Iクローニン
グ部位に連結した。

pET11aベクターを用いたＴ−BALの発現 T7ポリメラーゼを用いてクローン化遺伝子の発現を指
示する一般的なアプローチおよび方法は、本明細書中に
参考として援用される、StudierらのMethods Enzymol,1
85:60−89（1990）に記載されている。Ｔ−BALのcDNAを
pET11a（Novagen、Madison、WI）のNde I/BamH Iクロー
ニング部位に連結した。Ｔ−BALの発現のために、この
ベクターを用いてE.coli BL21（DE3）を形質転換した。
このベクターを有する細胞を、アンピシリンを有するZB
媒地（Studierら（1990））中で一晩培養した。翌朝、6
00nmでの吸光度が0.6になるまで37℃で振とうした一晩
培養物80mlとともに、４リットルのLB−アンピシリンを
インキュベートした。次いで、イソプロピン−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシドを0.4mM濃度に加え、３時間振
とうした。遠心分離によって細胞を採集し、そして80mg
のリゾチームとともに、800mlのTN緩衝液（50mMのTris
−HCl、pH8.0、および100mMのNaCl）中に懸濁した。混
合物を、70℃で凍結し、次いで37℃の水浴内で解凍し、
これを３サイクル行った。溶液をTNで2,400mlに希釈
し、16,000xgで15分間、遠心分離にかけた。次いで、ペ
レット（封入体（inclusion body））を、TN中のTriton
^TMX−100（0.1％）を用いて２回洗浄し、遠心分離によ
ってペレットを回収し、さらなる処理のために、−20℃
で凍結状態に維持した。

Ｔ−BALの再生および精製 1mMのEGTA（エチレングリコール−ｂ（β−アミノエ
チルエーテル）N,N,N′,N′−四酢酸）、10mMのβ−メ
ルカプトエタノールおよび５％のグリセロール（v/v）
を含有する100mMのTris−HCl（pH12.5）中で、8Mの尿素
60mlとともに撹拌することにより、凍結した封入体をさ
らに可溶化した。この混合物を、105,000xgで30分間遠
心分離にかけ、その後、上清を透析チューブ（排除MW＝
10,000）に入れ、1Mの尿素、0.1mMのβ−メルカプトエ
タノールおよび５％のグリセロールを10mMのTris−HCl
（pH8.0）中に含有する１リットルの再生緩衝液に対し
て透析を行った。20時間透析を行った後、以下の「エス
テラーゼアッセイ」に記載されるように、基質としての
1mMのPANAおよび活性化因子としての2mMのタウロコール
を用いて、再生Ｔ−BALをエステラーゼ活性についてア
ッセイし、透析溶液中の活性酵素の量を決定した。次い
で、再生Ｔ−BALを、60mlの飽和硫酸アンモニウム（NH₄
OHを用いて、pH8.0に調節した）と混合した。これによ
り、Ｔ−BALの沈澱が生じた。18,000rpmで１時間、遠心
分離を行った後、沈澱からＴ−BALを採集した。採集さ
れた沈澱を、40mlの再生緩衝液を用いて可溶化し、40℃
で30分間撹拌した。次いで、Amicon Centriprep^TM−10
濃縮器（Beverly、MA）において、上清画分を3ml〜5ml
に濃縮した。さらなる超遠心分離を105,000xgで30分間
行った後、上清画分（1ml）を、高速タンパク質液体ク
ロマトグラフィー（FPLC）による分子ふるい分離に供し
た。２つのSuperose^TM12カラム（Pharmacia、Piscatawa
y、NJ）を、FPLC分離を行うために、縦列連結した。こ
れらのカラムを平衡化し、1Mの尿素、0.15MのNaCl、0.1
mMのβ−メルカプトエタノールおよび50mMのTris−HCl
（pH8.0）を含有する緩衝液を用いて溶出した。カラム
の溶出は、流速0.5ml/分で行った。1mlの画分中の溶出
物を採集し、そして、280nmでの吸光度を測定するこ
と、およびPANAを基質として用いてエステラーゼ活性を
アッセイすることによってモニターした。

Ｎ末端アミノ酸配列分析 自動エドマン分解を、Hewickら、J.Biol.Chem.256:79
90−7997（1981）に従って、モデル120Aオンラインフェ
ニルチオヒダントインアミノ酸アナライゾを装備したモ
デル470A気相タンパク質シーケンサ（Applied Biosyste
ms,Inc.,Foster City,CA）で行った。上記文献は本明細
書において参考のため援用されている。

エステラーゼアッセイ 短鎖エステルを用いたBALエステラーゼ活性の動力学
研究を、Wang、Biochem.J.279:297−302（1991）に記載
されているように、ｐ−ニトロフェニルアセテート（PA
NA）およびｐ−ニトロフェニルブチレート（PANB）を基
質として用いて行った。上記文献も本明細書において参
考のため援用されている。Michaelis−Mentenの動力学
的パラメータを導き出すために、実験は25℃で行い、最
終アッセイ混合液における基質濃度の範囲は、PANAにつ
いては0.4〜2mMおよびPANBについては0.1〜0.5mMであ
り、活性化剤として2mMのタウロコーレートを用いた。
ｐ−ニトロフェノールの生成速度は、ペルティエ温度制
御を装備したHewlett−Packard Diode Array Spectroph
otometer（Hewlett Packard,Palo Alto,CA）を用いて、
418nmでの吸光度変化の最初の部分（20秒）から決定し
た。再折り畳み効率、ならびにカラムクロマトグラフィ
溶離剤中のエステラーゼ活性および精製酵素の比活性を
モニタするために、基質として1mMのPANAおよび活性化
剤として2mMのタウロコーレートを用いて酵素アッセイ
を行った。酵素活性の１単位を、１分あたりの放出され
る生成物の１マイクロモルとして定義した。

Ｔ−BALの熱安定性 熱安定性を測定するために、リン酸ナトリウム（0.15
M、pH7.4）中の各0.1mg/mlのＴ−BALおよび天然BALを、
30℃、40℃、45℃および50℃で10分間、水浴中でインキ
ュベートした。インキュベーション後、溶液を氷水で冷
却した。次にこれらの処理試料を、基質としてPANAを用
いて残留活性についてアッセイした。

リパーゼアッセイ BALのリパーゼアッセイを、Nilsson−EhleおよびScho
tz、J.Lipid Res.17:536−541（1976）に記載された方
法を改変した方法に従って、基質としてグリセロールト
リ［9,10−³H］オレエートを用いて行った。10mlの50mM
NH₄OH−HCl緩衝液（pH8.5）中に28μmolのトリオレオ
イルグリセロール（比活性1.4μCi/μmol）および2.8μ
molのジオレオイルホスファチジルコリンを乳化させる
ことによって、２倍濃縮したストック基質溶液を調製し
た。混合液を、氷浴中で30秒間、５の設定（最大出力の
50％）で、Ｗ−380ソニケータ（Heat Systems−Ultraso
nics,Inc.,Farmingdale,NY）を用いて乳化した。冷却
後、混合液をさらに30秒間超音波処理した。最終容量10
0μｌのアッセイ混合液は、50mMのNH₄OH−HCl緩衝液（p
H8.5）、1.4mMのトリオレオイルグリセロール、0.14mM
のジオレオイルホスファチジルグリセロール、タウロコ
ーレートおよび10μｌの酵素溶液を含有した。37℃で撹
拌しながら１時間半にわたってインキュベートした後、
3.2mlのクロロホルム−ヘプタンメタノール（5:4:5.6、
vol/vol/vol）および1mlの0.2M NaOHを添加して反応を
終了させた。試料を遠心分離して、10mlのHydrocount^TM
（J.T.Baker,Inc.,Phillipsburg,NJ）と混合し、Beckma
nシンチレーションカウンタ（Fullerton,CA）で放射能
を測定した。

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動 LKB−Pharmacia Phastシステム（Piscataway,NJ）を
用い、Pharmacia（Piscataway,NJ）製の８〜25％ポリア
クリルアミドゲルスラブにより、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った。電気泳動の前に６分間、10
0℃で試料を10mMのβ−メルカプトエタノールおよび２
％のSDSにより処理した。

タンパク質アッセイ 酵素調製物のタンパク質含有量を、血清アルブミンを
標準として用いるLowryの手順（Lowryら、J.Biol.Chem.
193:265（1951））を改変した方法（WangおよびSmith,A
nal.Biochem.63:414:417（1975））によって測定した。
この文献は本明細書において参考として援用されてい
る。

Ｔ−BALのタウロコーレートとの相互作用の蛍光測定 Ｔ−BALのタウロコーレートとの相互作用の蛍光測定
を、aminco−Bowman Series 2 Fluorescence Spectrome
ter（Urbana,IL）により25℃で行った。Ｔ−BALのタウ
ロコーレートとの相互作用を研究するために、Ｔ−BAL
トリプトファニル蛍光を用いた。蛍光は、280nmの励起
波長を用いて340nmで記録した。励起および発光の帯域
幅を共に2nmに設定した。装置の感度を、検出器高圧の
1,000ボルトに設定した。

タウロコーレート（活性化剤）が存在しないとき、Ｔ
−BALの蛍光強度はＦ゜であった。タウロコーレートの
飽和濃度で、蛍光強度はＦ_∞であった。特定のタウロコ
ーレート濃度における蛍光（Ｆ）に基づいて、以下の等
式に示すように、Ｆを関連づけることによって、タウロ
コーレートに関連するＴ−BALのモル画分（ｘ）を決定
した。

Ｆ＝（１−ｘ）F₀＋xF_∞ 導き出されたモル画分（ｘ）は、次に、タウロコーレ
ートおよびＴ−BALの二元複合体（binary complex）解
離定数K_Aの計算に用いられる。反対に、K_AおよびＦ_∞を
可変パラメータとして扱うコンピュータ最小二乗曲線フ
ィッティング手順を用いて、Ｆの計算された値および実
験により測定された値との最良の一致を実験することが
できる。

データ分析 これらの実験で作成されたデータの動力学的分析を、
LOTUS 1−２−3 SPREAD SHEETプログラム（Worcester,M
A）およびIBM−ATコンピュータを用いて行った。最小二
乗非線形曲線フィッティングの実行を、Bevington、Dat
a Reduction and Error Analysis for the Physical Sc
iences、56−65および204−246、McGraw−Hill,New Yor
k（1969）に記載されているアプローチに従って行っ
た。この文献は本明細書において参考のため援用されて
いる。

（ａ）カルボキシル末端ドメイン、Ｏ−グリコシル化お
よびＮ−グリコシル化は、BALの酵素機能にとって必須
ではない。

天然のヒト乳汁BAL cDNAのアミノ酸配列（Babaら（19
91）;HuiおよびKissel、FEBS Lett.276:131−134（199
0）;Nilssonら、Eur.J.Biochem.192:543−550（199
0））は、722残基の成熟酵素をコードし、配列番号３に
示される。cDNA構造は膵臓BALの構造と同一である（Reu
eら、J.Lipid Res.32:267−27G（1991））。これは、乳
腺からの酵素および膵臓からの酵素は同じ遺伝子から発
現されるという概念を支持する。

予想通り、E.coli中で合成されたＴ−BALは不活性
で、水性緩衝液に不溶である。活性Ｔ−BALは再折り畳
みによって得られた。この手順は、封入体を尿素および
β−メルカプトエタノールにより高いpH（12.5）で可溶
化し、続いて低いpH（8.0）で低濃度の尿素に対して透
析することを包含した。酵素活性測定に基くと、活性酵
素の収率は培養LB培地４リットル当たり約10mgであっ
た。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分
子量60,000に対応する尿素可溶画分に主要なタンパク質
が生じた（90％以上）。この分子量は、Ｔ−BALの推定
分子量（59,270）に非常に近似した。このタンパク質画
分のＮ末端配列分析により、予想BAL N末端配列Ala−Ly
s−Leu−Gly−Ala−Val−Tyr−Thr（配列番号１のアミ
ノ酸１〜８位）が得られ、Ｔ−BALの合成の成功および
開始メチオニンの除去が示された。再折り畳みの最初の
工程後のＴ−BALの比活性は、約５〜10単位/mgであっ
た。これは天然BALの比活性の僅か10〜20％である。

E.coli中で発現された組換えＴ−BALはグリコシル化
されない。これによりさらに、BALの高度にグリコシル
化されたＣ末端領域は、触媒機能にとって必須ではない
ことが示される。

Ｔ−BALの精製は、硫酸アンモニウム沈澱により再折
り畳みされたＴ−BALを予め部分精製した後、FPLCによ
る分子ふるい分けによって行った。カラム画分に２つの
主要なピークが見い出された。排除容量（17ml）で溶出
される第１のピークは、主要タンパク質のピークを表
し、主に凝集形態の不活性Ｔ−BALを含む。第２のピー
クは（28mlで溶出）はBAL活性を含む。画分27〜29のSDS
−ポリアクリルアミドゲルパターンにより、このピーク
中に溶出したＴ−BALは均質であることが示される。４
つの異なるバッチから、精製酵素（画分28）に対して64
±２単位/mgの平均比活性が得られた。Ｔ−BALのこの比
活性は、以前に報告された（WangおよびJohnson（198
3））天然BALについて報告された比活性（52単位/mg）
より高いため、FPLCカラムクロマトグラフィにより、酵
素の活性形態が不活性形態から効果的に分離された。

（ｂ）動力学および特異性 十分な量の精製組換えＴ−BALが利用可能であること
により、Ｔ−BALおよび天然BALの特異性および動力学を
比較し、そして他の特性に留意した。

Ｔ−BALの熱安定性 Ｔ−BALの安定性を天然酵素と比較するために、これ
ら２つの酵素形態を30℃〜50℃の範囲の温度で処理し
た。Ｔ−BALおよび天然BALの熱不活化パターンは類似し
ており、共に、50℃で10分間の処理により約90％の活性
の損失を示した。これによりさらに、Ｔ−BALの折り畳
みは、天然酵素の触媒ドメインの折り畳みに類似するこ
とが示唆される。

Ｔ−BALのタウロコーレート結合動力学 Ｔ−BALおよび天然BALの解離定数K_Aは類似している。
タウロコーレートとの相互作用の際のトリプトファニル
蛍光の直接結合研究において、胆汁酸塩との結合の際に
天然BALは、タウロコーレートの飽和濃度でタンパク質
トリプトファニル蛍光が約20％減少した（WangおよびKl
oer（1983））。これは恐らく、リガンド結合の際のBAL
のコンホメーション変化から生じた。天然BALの解離定
数は0.37mMである（Wang、J.Biol.Chem.256:10198−102
02（1981））。トリプトファニル蛍光の同様の減少がＴ
−BALでも観察された。ここで、αおよびβはそれぞ
れ、動力学的パラメータK_sおよびK_catを改変することに
よって、タウロコーレートの活性化効果を表すために用
いられる２つのパラメータである（Segel、Enzyme Kine
tics227−231、John Wiley ＆ Sons,New York（197
5））。1:1の化学量論に基づいて、Ｔ−BALとタウロコ
ーレートとの相互作用に対して、解離定数K_A0.32±0.03
mM（ｎ＝４）が測定された。タウロコーレートの飽和濃
度で蛍光強度は約18％減少した。従って、Ｔ−BALは、
モノマー形態のタウロコーレートへのアフィニティが、
天然酵素と比較して僅かに高い。これらの結果により、
Ｔ−BALおよび天然BALのタウロコーレート結合部位の微
環境は、Ｔ−BALのプロリンリッチ配列ドメインの欠失
にもかかわらず非常に類似している。

PANAおよびPANBによるＴ−BALの動力学的特性 さらなる動力学的分析により、基質としてPANAおよび
PANB（ｐ−ニトロフェニルブチレート）を用いることに
より酵素特異性が変化することが示された。

天然BALと同様に、Ｔ−BALは、胆汁酸塩の非存在下で
エステラーゼ基質を用いてアッセイすると基礎的な活性
を含むことが分かった。従って、タウロコーレートはま
た、Ｔ−BALの必須ではない活性化剤であるとみなすこ
とができる。Lineweaver−Burkeプロットから、Ｔ−BAL
ならびに基質としてのPANAおよびPANBに対して動力学的
パラメータK_s、K_cat（基礎酵素に対して）およびαK_s、
ならびにβK_cat（タウロコーレート活性化酵素）が得ら
れた。天然酵素の比活性（52単位/mg）より僅かに高い
Ｔ−BALの比活性（64単位/mg）が得られたという事実
（WangおよびJohnson（1983））にもかかわらず、Ｔ−B
ALの導き出されたK_catおよびβk_catは、天然酵素のK_cat
およびβk_catより約２〜８倍低かった。しかし、Ｔ−BA
Lの導き出されたK_sおよびαK_sは、天然酵素のK_sおよび
αK_sより僅かに高いだけであった。従って、プロリンリ
ッチ配列の存在は、主に酵素の代謝回転速度の上昇には
役割を果たすが、基質結合アフィニティには僅かな効果
を有するのみである。さらに、酵素の優先的反応性の変
化がある。以前は、ｐ−ニトロフェノールの短鎖アシル
エステルの中で天然BALは、PANBの場合に、より高いk
_catおよびβk_catを有すると報告されていた。これに対
して、Ｔ−BALは、タウロコーレートの存在下でアッセ
イされると、PANBの場合よりPANAの場合に、より高いk
_catおよびβk_catを有する。これにもかかわらず、Ｔ−B
ALはまた、PANBの場合に、より高い基質特異性定数（Ｔ
−BALのk_cat/K_sおよびβk_cat/αK_s）を有する。これ
は、天然酵素で見い出されるものに類似している。基質
としてPANAを用いるBALが触媒する加水分解反応に及ぼ
すタウロコーレートの活性化効果により、BALのプロリ
ンリッチドメインは、酵素の胆汁酸塩結合部位を表さな
いことが示される。

Ｔ−BALのリパーゼ活性 長鎖トリアシルグリセロールの天然BALが触媒する加
水分解において、脂肪酸受容体（acceptor）として作用
する胆汁酸塩ミセルの必須要件が存在する（Wangら（19
88））。天然BALおよびＴ−BALにおけるグリセロールの
加水分解を比較した。この点に関して、Ｔ−BALは、長
鎖トリオレオイルグリセロールの加水分解における胆汁
酸塩について天然BALの要件と同様の要件を有すること
が分かった。血清アルブミンは、BAL触媒作用に対する
脂肪酸受容体ではないため、BALが触媒する反応におい
ても弱い脂肪酸受容体である。従って、リパーゼ混合液
中には、脂肪酸受容体として、BSAではなくタウロコー
レートのみが含まれた。

タウロコーレート濃度が60mMを超えるときの天然BAL
触媒作用の活性化には見かけの飽和が存在し、これは、
タウロコーレート濃度が高いときの天然BALの部分的不
活化に帰因する。これに対して、ミセルのタウロコーレ
ート（120mMのタウロコーレートまで試験した）による
Ｔ−BALの見かけの非飽和活性化が存在した。一方、60m
Mを超えるタウロコーレートによる活性化の見かけの飽
和は、タウロコーレート濃度が高いときの酵素の部分不
活化によると考えられる。これらの結果により、酵素活
性部位からの脂肪酸生成物の移動は、恐らく、レセプタ
ー媒介プロセスを介するのではなく、酵素−脂肪酸複合
体およびタウロコーレートミセルを含む二次反応動力学
を介するものであることが示される。

実施例2:BALのＣ−テイルの機能は、腸外皮を裏打ちす
る細胞にBALを結合させることである。

（ａ）ヒト乳汁中BALの腸粘膜への結合 ヒト乳汁中ABLが腸粘膜に結合することを決定するた
めに、以下によって実験を行った。すなわち、（ｉ）精
製天然ヒト乳汁BALを放射性標識（I¹²⁵）し、（ii）単
離されたマウス腸内で放射性標識されたBALをインキュ
ベートし、（iii）標識されたBALの腸内保持の程度を決
定し、そして（iv）コントロールとして等張性リン酸緩
衝液を用い、ガラクトース、フコース、ヘパリン、0.3M
NaClのマウス内在性BALの溶出を検査することによっ
て、BALの腸への結合のメカニズムを検査した。

方法 ヒト乳汁BALの精製を、本明細書において参考として
援用されるWangおよびJohnson、Anal.Biochem.133:457
−461（1983）によって記載されるように行った。短縮
された形態の組換えBAL（Ｔ−BAL）の調製を、実施例１
に記載したように行った。

ヒト乳汁BALおよび組換えＴ−BALのヨウ素化を、ヨー
ドビーズ（Pierce,Rockford,IL）を用いて行った。ヨウ
素¹²¹をAmersham（Arlington Heights,IL）から得た。
６μｌの¹²⁵Iを94μｌの酵素溶液（リン酸ナトリウム緩
衝液（pH6.5）中に2mg/ml）に添加することによって、
ヨウ素化を行った。一つの洗浄したビーズを溶液中に置
き、そして室温で15分間静置した。次いで、混合物をBi
o−spin^TM6カラム（Bio Rad,Hercules,CA）に通過さ
せ、４℃で４分間2275rpmで遠心分離し、そして溶出液
を収集した。溶出液を400μｌの0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液（pH6.5）で希釈した。溶出した分画を合わせ、
放射能について１μｌの溶出液を検査した。グリセロー
ルトリ［9,10−³H］オレエートを基質として用いて、実
施例１に記載したようにBALにリパーゼアッセイを行っ
た。２倍に濃縮したストック基質溶液を、10mlの50mM N
H₄OH−HCl緩衝液（pH8.5）中に、28μmolのトリオレオ
イルグリセロール（比活性1.4μCi/μmol）および2.8μ
molのジオレオイルホスファチジルコリンを乳化するこ
とによって調製した。混合物を、Ｗ−380ソニケーター
（Heat Systems−Ultrasonics,Inc.,Farmingdale,NY）
を用いて、設定を５（最大出力の50％）にして、氷浴中
で30秒間乳化した。冷却後、混合物をさらに30秒間超音
波処理した。最終容量が100μｌのアッセイ混合物は、5
0mM NH₄OH−HCl緩衝液（pH8.5）、1.4mMトリオレオイル
グリセロール、0.14mMジオレオイルホスファチジルグリ
セロール、30mMタウロコーレート、および10μｌの酵素
溶液を含んでいた。37℃で１時間の撹拌を伴ってインキ
ュベーションの後、3.2mlのクロロホルム−ヘプタンメ
タノール（5:4:5.6、vol/vol/vol）および1mlの0.2M Na
OHを加えて反応を終了した。試料を遠心分離し、そして
10mlのHydrocount^TM（J.T.Baker,Inc.,Phillipsburg,N
J）と混合し、そしてBeckmanシンチレーションカウンタ
ー（Fullerton,CA）中で放射能を測定した。

マウス小腸への¹²⁵I−標識されたBALおよびＴ−BALの結
合のためのプロトコル マウス（それぞれ約20グラム）の小腸から十二指腸お
よび空腸を取り出し、そして12cmのセグメントに切断し
た。３つの実験を行った。ここで、平行した実験におい
て、Ｃ−テイルを除くＴ−BALをコントロールとして使
用した。セグメントを、0.15M NaClで１回、そして0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で２回洗浄した。20
μｌの標識された試料をまず20μｌの8M尿素と混合し、
次いで720μｌの蒸留水および240μｌの20％アルブミン
で希釈し、最終容量を1mlとした。次いで、500μｌの溶
液を、両端を結紮した各腸セグメントに注入した。セグ
メントを室温にて２時間インキュベートした。インキュ
ベーションの後、腸を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
6.5）で３回洗浄し、そして放射能をカウントするため
に2cmの腸小片に切断した。

これらの実験の結果を表II、表IIIおよび表IV、なら
びに図２に示す。

これらの実験において、天然のBALが、表IIおよび表I
IIに示されるように、Ｔ−BALよりもほぼ12倍多い量で
腸粘膜によって保持された。天然のBALおよびＴ−BAL
は、Ｃ−テイルにおいてのみ異なるため、これらの結果
は、腸の表面、おそらく腸の表面のレセプターへの接着
が、グリコシル化されたＣ−テイルによって媒介される
ことを示す。

膵臓BALが成体動物の腸の表面に接着するか否かを決
定するために、セグメントを生理食塩水で完全に洗浄し
た後、マウス腸においてBAL酵素活性を測定した。結果
は、腸が高いBAL活性を有することを示した。

BALとマウス小腸レセプターとの間の相互作用の性質
を検査するために、洗浄した腸の1cmセグメントをフコ
ース、ガラクトース、ヘパリン、NaClおよび等張性リン
酸緩衝液と共にインキュベートすることにより、腸粘膜
から内因性に結合したBAL酵素活性を溶出する実験を行
った。結果を表IVに示す。

低活性のBALのみが、等張性リン酸緩衝液、および0.3
M NaClで溶出し、このことは、BALがイオン性相互作用
を通して腸に結合していないことを示した。さらに、ヘ
パリンは、等張性リン酸緩衝液、およびNaClによって溶
出したBAL活性より多くのBAL活性を溶出しなかった。こ
のことは、ヘパリンによって媒介されるBAL（ヘパリン
と結合することが知られている）の腸結合活性が、重要
でないことを示した。しかし、ガラクトースまたはフコ
ースのいずれかを用いて溶出が行われた場合、大量のBA
L活性が溶出した。これらの結果は、Ｃ−テイルのオリ
ゴ糖基を介して、腸管腔表面にBALが結合することを示
す。さらに、溶出は非常に特異的であるため、結果は、
BALのＣ−テイル中のオリゴ糖を特異的に結合するレセ
プター（CTレセプター）が存在することを示す。

マウス膵臓のBALは、ヒト酵素のＣ末端領域と同様
の、４つの反復モチーフを含むＣ末端領域を有する。ヒ
トBALがマウス腸に結合するため、上記結果により、オ
リゴ糖の構造における類似性が確認された。

実施例3:腸からのBAL溶出 （ａ）ラット内因性腸BALの、ガラクトース、フコー
ス、メチル−α−マンノシド、EGTA、ヘパリン、および
コントロールとしての等張リン酸緩衝液を用いた溶出 マウス由来の腸はサイズが小さすぎるので、ラットの
腸を、種々の化合物によるBALの溶出を実証するために
用いた。最初の実験は、マウスの腸に対してなされた観
察と同様に、ラット内因性BALもまたガラストースおよ
びフコースを用いて同様に溶出され得ることを実証する
ためのものであった。Ｃ型レクチンのリガンド結合には
カルシウムイオンが必要とされるので、腸表面のBAL結
合のためのカルシウムの必要性の試験に、EGTA溶出を含
めた。

表Ｖは、結合したラット腸BALが、ガラクトース（0.1
M）、フコース（0.1m）およびEGTA（1mM）により溶出さ
れたことを示す３つの実験の結果を示している。ヘパリ
ン（10mg/ml）による溶出は、等張リン酸緩衝液（pH7.
4）による溶出のレベルと同様に、溶出物中の活性が低
かったので、有効ではなかった。これらの実験では、洗
浄したラット腸の1cmのセグメントを、等張リン酸緩衝
液、pH7.4中に溶解された溶出化合物と共に、室温で30
分間インキュベートした。この溶出物中のBAL活性を、
実施例１で示したようにアッセイした。

ヘパリンが腸の結合したBALを溶出できないことは、B
ALがヘパリンを介してラット腸に結合されていないこと
を示した。これらの結果は、マウス腸からのBALの溶出
について得られた結果（表IV）と全体に一致している。
ガラクトースまたはフコースのいずれかによる結合した
BALの溶出の成功は、腸管腔表面へのBALの結合が、Ｃテ
イルにおけるオリゴサッカリド基を介することを示して
いる。EGTAにより溶出されたBALを見出したことは、BAL
テイルの腸への結合が、カルシウム補因子要求性を有し
ていることを示した。

（ｂ）BALの腸上皮細胞からの放出は、コレステロール
オリエートからの減少したコレステロール取り込みに関
連づけられた。

実験 以下に示すように、コレステロールの取り込みのため
には、BALの腸内層細胞への付着が必要されることを実
証するために、実験を行った。

コレステロール（オリエート）エステル乳濁溶液を、
以下のように調製した。２倍濃度のコレステロールオリ
エートストック溶液を、６μmol［³H］コレステロール
オリエート（1.6μCi/μmol）（Amersham、Arlington H
eights、IL）を、0.6μmolのジオレオイルホスファチジ
ルコリンと共に15mlの等張リン酸緩衝液、pH7.4中で乳
化することによって調製した。この混合物を、設定値５
（最大出力の50％）で30秒間、氷浴中でW380超音波破砕
機（Heat System−Ultrasonics,Inc.、Farmingdale、N
Y）を用いて乳化した。冷却の後、この混合物を、さら
なる30秒間さらに超音波破砕した。

４つの実験のそれぞれにおいて、ラット小腸の２つの
12cmのセグメントを切除し、等張リン酸緩衝液、pH7.4
を用いて１回洗浄した。それぞれの動物由来のセグメン
トを、コントロール（EGTAにより洗浄されない）群と、
実験（EGTAにより洗浄される）群とにランダムに割り当
てた。同じ動物由来の対のセグメントをコントロール群
および実験群において用いることは、腸内の結合したBA
Lの量の動物間差のすべてを低減した。管腔からの溶液
の注入または除去のために、腸のセグメントをそれぞれ
の末端で結紮し、そして一方の末端においてカテーテル
に固定した。

コントロールセグメントに、まず1mlの等張リン酸緩
衝液、pH7.5を注入した。腸表面に結合したBALを放出さ
せるために、実験セグメントは、1mMのEGTAを含有する
同じ等張緩衝液を受けた。腸のセグメントを、5mlの同
じ等張緩衝液を含有する、ポリスチレンの計量皿（14cm
²）の上に配置し、30分間穏やかに振盪した。次いで、
実験セグメントを、等張リン酸EGTA溶液で１回、および
等張緩衝液で２回洗浄した。コントロールの腸を、等張
緩衝液で３回洗浄した。

腸のセグメントによるコレステロールの取り込みを可
能にするために、次いで、0.2mMの［³H］−コレステロ
ールオリエート（Amersham、Arlington Heights、IL）
および6mMのタウロコーレート（Sigma Chemical Co.、S
t.Louis、MO）（BALのための補因子）を含有する1mlの
アリコートを、それぞれの腸の中に配置した。ポリスチ
レンの計量皿の中で穏やかに振盪しながら60分間インキ
ュベートした後、腸のセグメント中の内容物を取り出し
た。これらのセグメントを、等張緩衝液を用いて３回洗
浄した。

コントロール腸セグメントおよび実験腸セグメントに
よる放射性コレステロールの取り込みを測定するため
に、それぞれの腸セグメントの中央の10cmを取り出し、
約2.5cmの４つのセグメントにさらに切断した。それら
のセグメントのそれぞれを、組織の可溶化のために、1m
lの２％ドデシル硫酸ナトリウム＋8M尿素を含有するシ
ンチレーションバイアル内に入れた。可溶化プロセスの
後、10mlのHydrocount_TM（J.T.Baker,Inc.、Phillipsbu
rg、NJ）をそれぞれのバイアルに添加し、そして腸のセ
グメント中の³H−コレステロールからの放射能の量を、
Beckman Scintillation Counter（Fullerton、CA）を用
いて計数した。

これら４つの実験から得られた結果を、表VIおよび図
３に示す。

表VIに示すように、EGTA処理は、腸上皮細胞によるコ
レステロール取り込みを、コントロールの取り込みの約
16％に減少させた。生データ（ｐ＜0.005）およびコン
トロールの％として計算したデータ（ｐ＜0.0001）の統
計的有意性は、この差の非常に高い信頼レベルを示し
た。これらの結果は、BAL（腸表面に付着されている）
が、腸内層上皮細胞による腸管腔からのコレステロール
の取り込みを媒介することを示した。

（ｃ）コレステロールエステルからのコレステロール取
り込みにおけるBALの役割に加えて、BALはまた遊離コレ
ステロールの直接取り込みを媒介する。

食物のコレステロールの約85％は、遊離コレステロー
ルの形態であるので、遊離コレステロールの取り込みに
おけるBALの役割を確立することが重要である。

結合したBALがEGTAにより除去された腸と比較して
の、コントロール腸における放射性コレステロールの取
り込みを比較するために、インビトロ実験を行った。表
VIIは、３つの実験から得られた結果を示している。コ
ントロール実験の平均値は、16.38nmol/g腸／時の取り
込みであった。EGTA処理腸についての平均値は、4.40nm
ol/g腸／時であった。BALの除去は、遊離コレステロー
ルの取り込みの約70％の減少をもたらした。３匹のラッ
ト間での比較的大きな変動にもかかわらず、これら２つ
の群間の差は、非常に有意である（ｐ＜0.005）。

２倍濃度のコレステロールストック溶液を、６μmol
（比活性＝1.6μCi/−μmol）のコレステロールおよび
0.6μmolのジオレオイルホスファチジルコリンを15mlの
等張リン酸緩衝液、pH7.4中で乳化することによって調
製した。この混合物を、設定値５（最大出力の50％）で
30秒間、氷浴中でＷ−380超音波破砕機（Heat−System
−Ultrasonics,Inc.）を用いて乳化した。冷却の後、こ
の混合液を、さらなる30秒間さらに超音波破砕した。

ラット腸の２つのセグメント（11cm）をそれぞれ、等
張リン酸緩衝液（pH7.4）で１回洗浄し、これらのセグ
メントを両端で結紮した。次いで、1mMのEGTAを含む1ml
の等張リン酸緩衝液および1mMのEGTAを含まない1mlの等
張リン酸緩衝液を、それぞれの腸セグメント中に注入し
た。このセグメントを、5mlの等張リン酸緩衝液を含む
ポリスチレンの計量皿（14cm四方）の上に配置した。イ
ンキュベーションの後、腸中の溶液を、1mlの［³H］コ
レステロール（0.2mM）および6mMのタウロコーレートで
置換し、これらのセグメントを、上記のように、氷浴の
上のインキュベーショントレイ上に配置した。次いで、
これらの腸セグメントを、等張リン酸緩衝液で３回洗浄
し、そしてそれぞれの腸セグメントの8cm切片（約0.7
g）を、2cmの断片に切断し、そしてそれらの断片のそれ
ぞれを、組織の可溶化のために1mlの２％SDS−8M尿素中
に入れた。この混合物に、10mlのHydrocount^TMを、実施
例3aで記載したように放射能の計数のために添加した。

（ｄ）ヘパリンは、ラット腸による遊離コレステロール
の取り込みを阻害する。

ラット腸による［³H］コレステロールオリエートの取
り込みを、添加したヘパリン（10mg/ml）の存在下でイ
ンビトロで研究した。この手順は、本質的には、実施例
3bで記載した手順と同じである。表VIIIは、コントロー
ル（第１欄、タウロコーレートの存在かつヘパリンの非
存在）では、平均取り込みが20.65nmol/g/時であること
を示している。ヘパリンの存在下（第２欄）では、2.62
nmol/g/時である。この差は、有意である（ｐ＜.05）。
ヘパリン阻害からの値は、タウロコーレートの非存在下
でのバックグラウンド取り込みの値に近い。

実験手順は、実施例3bに記載した手順と同じである。
腸をEGTAを含まない等張リン酸緩衝液で洗浄したので、
結合したBALは腸表面から除去されなかった。取り込み
溶液中のヘパリン（ICN Chemicals、Costa Mesa、CA）
濃度は、10mg/mlであった。

（ｅ）EGTA処理された腸へのBALの添加はコレステロー
ル取り込みを回復させた材料および試薬 本明細書中に参考として援用されるWangおよびJohnso
n（1983）に記載されるように、天然のヒト乳汁胆汁酸
塩活性リパーゼ（Ｎ−BAL）を精製した。BALの組換え短
縮形態（Ｔ−BAL、カルボキシ末端を欠いている残基１
〜538）を、実施例１に記載したように、そしてDowns
ら、Biochemistry33:7979−7985（1994）によって報告
されたように調製した。

［１α−２α（ｎ）−³H］コレステロールオリエート
（³H−コレステロール）をAmersham（Arlington Height
s、IL）から購入した。他の化学試薬をSigma Chemical
Co.St.Louis、MOから購入した。

２倍濃縮コレステロールオリエートストック溶液を、
６μmolの³H−コレステロール（1.6μCi/μmol）および
0.6μmolのジオレオイル−ホスファチジルコリン４を15
mlの等張リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4中で乳化する
ことによって調製した。混合物を、Ｗ−380超音波破砕
機（Heat−system Ultrasonics、Inc.、Farmingdale、N
Y）を用いて氷浴中で30秒間、設定値５で（最大出力の5
0％）乳化した。冷却後、混合物をさらなる30秒間さら
に超音波破砕した。

方法 ５つの実験のそれぞれにおいて、ラット小腸の３つの
セグメント（各11cm）を等張緩衝液（pH7.4）で一回洗
浄し、そして溶液の注入のためにカテーテルを各腸セグ
メントの一方の末端に挿入して、セグメントを両端で連
結した。次いで、実施例１（ａ）に示したように、腸表
面に付着したBALを放出するために、1mM EGTAを含有す
る等張リン酸塩緩衝液を1ml、各腸セグメントに注入し
た。水分を維持するために5mlの等張リン酸緩衝液を含
有するポリスチレン計量皿（14cm²）にそのセグメント
を置き、氷浴の上で30分間、緩やかに振盪しながらイン
キュベートした。インキュベーション後、腸セグメント
をEGTA−含有等張緩衝液で一回、および0.2mMの塩化カ
ルシウムを含有する等張緩衝液で二回洗浄した。次い
で、等張リン酸緩衝液および0.2mM Ca⁺²の存在下で、0.
8mg/mlの平均酵素濃度で、セグメントの１つの1mlの精
製Ｎ−BALを注入し、そして第２のセグメントに1mlのＴ
−BALを注入した。BALを添加しなかった第３の腸セグメ
ントはコントロールであった。次いで、これらの腸セグ
メントをインキュベーショントレイに再度置き、30分間
緩やかに振盪しながらインキュベートした。インキュベ
ーション後、セグメント中の溶液を除去し、そして等張
乾燥液中の［³H］コレステロールオリエート（0.2mM）
および6mMタウロコーレート1mlで置換した。上記のよう
に、振盪しながらインキュベートした後、次いで、セグ
メントを、等張リン酸緩衝液で３回洗浄し、そして各腸
セグメントの8cmセグメント（約0.7g）を、2cm断片に切
断し、それぞれを組織の可溶化のために1mlの２％SDS−
8M尿素中に置いた。この混合物に、10mlのHydrocount^TM
を添加し、そして実施例１（ｂ）に記載のように放射能
を計量した。

結果を表IXに示す。

表IXに示すように、コレステロール取り込みを、BAL
を添加しないEGTA−洗浄腸セグメント（コントロー
ル）、短縮型BALで処理したEGTA−洗浄セグメント（＋
Ｔ−BAL）、および精製天然ヒトBALで処理したEGTA−洗
浄セグメント（＋Ｎ−BAL）において比較した。１時間
当たり、1gの腸当たりのnmolコレステロール取り込みで
測定されたコレステロール取り込みを、各群の左欄に示
す。５つの実験の平均取り込み値は、コントロール6.7
6、＋Ｔ−BAL7.32、および＋BAL14.41であった。コント
ロールセグメントにおける取り込みは、例えば、腸細胞
膜とのコレステロールミセルの融合、およびEGTA洗浄後
に残った残存腸BALによって生じる、腸のセグメントに
おける放射性コレステロールの非特異的トラッピングを
表した。

５匹のラット間での生物学的差違に起因する各群内で
の大きな偏差のために、＋Ｎ−BAL群の百分率としてデ
ータを計算し、そして各群の右欄に示した。百分率デー
タの平均は、コントロールにおける取り込みは、＋Ｎ−
BAL群（100％）の49.67％であり、＋Ｔ−BALにおいて
は、55.92％であったことを示す。＋Ｎ−BALの取り込み
と＋Ｔ−BALの取り込みとの間の差は、統計学的に有意
である（ｐ＜0.005）。

コントロールデータを、＋Ｔ−BALのデータおよび＋
Ｎ−BALのデータから引くと、平均の正味の取り込みは
以下のとおりである： ＋Ｔ−BAL:7.32−6.76＝0.56nmol/g/時 ＋Ｎ−BAL:14.41−6.76＝7.65nmol/g/時 ＋Ｎ−BALについての正味のコレステロール取り込み
は、＋Ｔ−BALについての正味のコレステロール取り込
みの約14倍である。これらの２つの群の百分率差もま
た、統計学的に高度に有意である（ｐ＜0.005）。

これらの結果は、（ａ）EGTA−またはEDTA−処理され
た腸によるコレステロール取り込みの減少は、BAL損失
によって媒介されるのであって、コレステロール取り込
み機構の損傷によるものではなく；そして（ｂ）コレス
テロール取り込みの回復は、Ｔ−BALにおいて欠如して
いたBALカルボキシ末端テイルの腸表面への結合に起因
することを示す。

実施例4:腸内容物へのＣテイルの添加は結合した内在性
BALを放出させる Ｃテイルが、結合内在性BALの転位という結果になる
腸表面CT−レセプターへの結合のための競争し得ること
を示すために実験が行われた。

（ａ）Ｃテイルの調製 BALから純粋なBALのＣテイルを調製するための手順を
考案した。Ｃテイルの精製は非常に効果的であるので、
開始BALは、完全に均質である必要がないことに留意す
べきである。これらのＣテイル単離実験において用いた
BALを、以前に記載のような（WangおよびJonson（198
3））Heparin−Sepharose^TMカラム（ベッド容量14×1.5
cm）クロマトグラフィーによって濃縮した。300mlのヒ
トスキムミルクを、まず、２時間20,000rpmで遠心分離
した。上清を濾過し、50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）
で予め平衡化したHeparin−Sepharose^TMカラムにかけ
た。ロードした後、カラムを200mlの平衡化緩衝液で洗
浄し、そしてBALを平衡化緩衝液中の0.3M NaClで溶出
し、そして5mlの画分で回収した。

画分を、基質としてｐ−ニトロフェニルアセテートを
用いて、BALのエステラーゼ活性についてアッセイし
た。BAL活性を含有する画分をプールし、蒸留水に対し
て透析し、そして凍結乾燥した。収量は、各バッチから
約100mg〜150mgの乾燥物質であった。Ｃテイル精製のた
めに、まず３バッチの部分精製BAL（約350mg）からのプ
ールを、8M尿素（10mg/ml）で２時間室温で処理し、そ
して一晩、50mMTris−HClに対して透析した。変性BAL
を、37℃で４時間、トリプシンおよびキモトリプシン
（基質：プロテアーゼ比、50:1、w/w）で消化した。同
量のトリプシンおよびキモトリプシンをこの混合物に２
回目に添加し、そして37℃で一晩、インキュベーション
を続けた。次いで、消化物を蒸留水に対して透析し、そ
して凍結乾燥した。乾燥粉末を5mlの70％ギ酸および50m
gの臭化シアン中に溶解し、ガラス管中に密閉し、一晩
室温でインキュベートした。溶液を、蒸留水で10倍希釈
し、そして凍結乾燥した。物質をさらに蒸留水で溶解
し、透析し、そして不溶性物質を遠心分離によって除去
した。次いで、可溶性画分を凍結乾燥した。次いで、２
つのタンデムに連結したSepharose^TMカラムを用いるFPL
C（fast protein liquid chromatography）を用いるゲ
ル浸透クロマトグラフィーのために、乾燥物質を0.15M
NaClを含有する50mMTris−HCl緩衝液3mlを用いて可溶化
した。1mlのサンプルをクロマトグラフィーの各回につ
いてカラムにかけた。溶出物画分の炭水化物分析は（Du
boisら、Anal.Chem.28:350−356（1956））、テイルが2
1〜25の画分（1ml/画分）で溶出されたことを示した。

ｂ） Ｃテイルの構造および組成 炭水化物含有FPLC画分由来の物質のＮ末端配列および
アミノ酸組成分析は、この物質が、528〜712の残基を含
有するヒトBAL領域に対応したことを示した。表Ｘに示
すように、精製Ｃテイルのアミノ酸組成および公知の配
列に基づく組成は非常に類似している。０−結合オリゴ
糖の放出のためのアルカリを用いるβ−脱離実験から、
そしてサンプルのさらなるアミノ酸組成分析において、
８〜10残基の間のスレオニンが、Ｃテイルの各分子内で
破壊され、一方、１残基までのセリンが同じ手順により
破壊されたことが決定された。従って、全部ではない
が、ほとんどのオリゴ糖が、Ｃテイルのスレオニン残基
に付着されていると結論した。

アルジトールアセテート誘導体の気液クロマトグラフ
ィー（Griggsら、Anal.Biochem.43:369−381（1971））
に基づくヒト乳汁BALのＣテイルの炭水化物組成のさら
なる分析からのデータは、表XIに示すように、Ｃテイル
中のフコース、ガラクトース、ガラクトサミンおよびグ
ルコサミンの存在を示した。ガラクトサミンは、炭水化
物をポリペプチド鎖に結合させるためにアンカーする糖
であるので、リジンとガラクトサミンの比から、Ｃテイ
ル１分子当たり約８〜10のオリゴ糖が存在すると推定し
た。

ヒト乳汁BALの単離されたＣテイルドメインが、ラッ
ト腸表面から結合したBALを置換し得るかどうかを決定
するために実験を行った。これらの実験において、異な
る量のＣテイルを、連結されたラット腸の内側に含有さ
れる溶液中に置いた。30分後に放出されたBAL活性を測
定した。

EGTAおよびBAL CテイルとのBAL腸のインキュベーショ
ンならびに溶出物中のBAL脂肪分解活性の測定は、実施
例3aおよび3bに記載のとおりであった。

データを表XIIに示す。この結果は、単離されたＣテ
イルが、ラット腸から結合した内在性BALを置するのに
有効であるということを示した。

実施例5:BALのＣ−テイルによるコレステロール取り込
みの競合阻害 先行する実施例は、Ｃ−テイルが、ラット腸表面か
ら、内因的に結合したBALを溶出し得ることを示してい
る。以下の研究は、単離されたＣ−テイルがラット腸に
おけるコレステロール取り込みを競合的に阻害し得るこ
とを示す。

ａ）BALのＣ−テイルによるコレステロール取り込みの
インビトロ阻害。

この研究では、３つの腸セグメントを等張のリン酸緩
衝液（pH7.4）を用いて洗浄した。腸セグメントの１つ
を、コントロールとして基質［³H］コレステロールオレ
エート（0.2mM）のみとインキュベートした。コントロ
ールの腸セグメントは、腸表面上の内因性BALがコレス
テロールの輸送に利用可能であるので、より高いコレス
テロール取り込み速度を有するはずである。第２の腸セ
グメントを、同じ［³H］コレステロールオレエートおよ
びEGTA（1mM）とインキュベートした。EGTAは、腸表面
から内因性BALを溶出することが知られている。第３の
腸セグメントを、同じ［³H］コレステロールオレエート
および単離したＣ−テイル（0.2mg/ml）とインキュベー
トした。

以下の表XIIIに示したデータは、４つの別々の実験に
由来する。平均したデータを図４に示す。これらの結果
は、Ｃ−テイルが存在するとき、コレステロール取り込
みは、コントロールの腸の取り込みの約10％にすぎない
ことを示す。これは、EGTAが存在するときのコレステロ
ールの取り込み（コントロールの約18％である）にひけ
を取らない。これらの結果は、Ｃ−テイルが、腸表面結
合について、内因性の結合型BALと効果的に競合し得る
ことを示す。この阻害は、Ｃ−テイルによる腸表面上の
内因性BALの置換に起因し、Ｃ−テイルを用いてヒト食
餌からのコレステロール取り込みを減少し得ることを示
す。

図１に示す、腸によるコレステロール取り込みにおけ
るBALの生理学的機能のスキームは、インビトロ実験か
ら得られたデータに基づいて構築された。このスキーム
では、BALは、最初、推定のレセプターによって腸表面
に結合する。次いで、コレステロールまたはコレステロ
ールエステルは、疎水性の食物ビヒクルから酵素の活性
部位に運搬される。コレステロールエステルは、BAL活
性部中で加水分解される。活性部位中の遊離のコレステ
ロール（加水分解産物またはビヒクルから直接運搬され
るもののいずれにしろ）は、腸細胞に運搬される。この
最後の段階は、配向因子として作用する可能性がある細
胞表面のヘパリンにより援助される。上記の結果は、腸
表面に結合していないBALはコレステロール取り込みを
介在するに有効でないことを示す。

このスキームは、生存動物に対して単離したＣ−テイ
ルの供給が腸表面上の推定のレセプターについて競合
し、それ故、コレステロール取り込みを競合的に阻害す
ることを予見する。以下の結果は、この予見を確認す
る。

実験条件 実験の18時間前に、食物（水はそうではない）を、一
対の成熟白ラット（平均体重259±27g）から取り上げ
た。実験ラットに、等張リン酸緩衝液（pH7.4）中に4mg
の単離したＣ−テイル（ヒト乳汁中BAL由来）１％（wt.
/vol）グルコースを含む1mlの溶液をチューブで供給し
た。コンオロール動物には、Ｃ−テイルを含まない同一
容量のグルコース−等張リン酸緩衝液を与えた。１時間
後、両方の動物に、10μCi［³H］−コレステロールオレ
エート＋非放射性コレステロールオレエート（最終濃度
0.2mM）、4mgの単離したＣ−テイル、0.2mMのトリオレ
インおよび0.02mMのジオレオイルホスファチジルコリン
を含む乳化混合物の1mlをチューブで与えた。乳化手順
は、上記実施例３のセクションｅ）で記載したように行
った。再び、コントロール動物に同じ混合物（しかしＣ
−テイルは含まない）を与えた。短期間実験では、血液
サンプルを５時間の間に１時間間隔で採取した。アリコ
ート（100μｌ）をこの血液から取り、そして2mlのヘパ
タンイソプロパノール（hepataneisopropanol）（3:7、
vol/vol）と混合した後、1.25mlの0.033N H₂SO₄を用い
て酸性化した。この混合物を30秒間ボルテックスして攪
拌し、そして４℃で10分間遠心分離した。次いで、上層
の半分（250μｌ）を放射能をカウントするために利用
した。

ヒト乳汁中BALからのＣ−テイル単離のための手順
は、上記の実施例４のセクションａ）に記載のように行
った。コレステロールオレエート乳化混合物中のコレス
テロールオレエートの測定された比活性に基づいて、血
液中の放射活性を、腸から血液区画に運搬されたコレス
テロール量に変換した。

結果。

ラットを18時間断食させ小腸内容物を減少させた。実
験ラットの各々に、4mgのＣ−テイルとともに放射性コ
レステロールオレエートをさらに投与する１時間前に、
4mgの単離したＣ−テイルをチューブで与えた。コント
ールラットは、Ｃ−テイルを与えなかった他は実験ラッ
トと同様に処置した。血液サンプルを、コレステロール
投与後１時間間隔で採取し、そして放射能を測定した。

図５は、一匹の実験ラットおよびコントロールラット
の代表的な実験からの結果を示す。結果は、合計６匹の
コントロールラットおよび６匹の実験ラットから得た。
表XIVは、すべての６つの実験からのデータを示し、そ
して図６は、コントロール群およびＣ−テイルを与えた
実験群の平均コレステロール取り込みを示す。Ｃ−テイ
ルの投与によるコレステロール取り込みの阻害は、放射
標識コレステロールの投与後１、２、３、４および５時
間後に得られた測定について、それぞれ、35％、48.8
％、55.7％、62.2％および55.5％であった。表XIVに示
されるように、２、３、４および５時間でのコントロー
ル群と実験群との間のデータは、統計学的に高度に有意
差がある（ｐ＜0.01）。

表XIV:C−テイルフラグメントの投与および非投与のラ
ット血液における経口的に与えられた放射標識コレステ
ロールの出現。

有意差 これらの結果から以下の結論が得られる： （１）生存ラットにおけるＣ−テイルによるコレステロ
ール取り込みの阻害は、腸に結合したBALがコレステロ
ール取り込みを仲介するという結論を支持する。

（２）コレステロール取り込みが単離されたＣ−テイル
により阻害されるという事実は、（ａ）Ｃ−テイル（BA
L上またはそれ自身断片として単離されたいずれか）が
腸表面上の同じレセプターに結合すること、（ｂ）Ｃ−
テイルおよびレセプターの結合は、このような有意な阻
害を達成するために、極めて特異的でなければならない
こと、および（ｃ）腸表面上のレセプターの数は限られ
ていることを示す。これは重要である。なぜならそれ
は、Ｃ−テイルの合理的なレベルがコレステロール取り
込みに有意な効果を有し得ることを示すからである。

（３）生存動物からのこれらのデータは、Ｃ−テイル
（異なる動物種のBAL由来のその等価物）、組換え的に
より産生されたＣ−テイルおよび化学的に合成されたＣ
−テイルおよびそのアナログが、コレステロール取り込
みを効果的に減少し得ることを確認したインビトロ結果
を確証する。これは、ヒトにおけるＣ−テイルの使用が
食餌コレステロールに起因する血清コレステロールレベ
ルを減少することにより心臓血管疾患を減少し得るとい
う結論を支持する。

（４）コレステロール取り込みをより効果的に減少する
ために多くの員式が最適化され得る。例えば、Ｃ−テイ
ルの投与量が最適化され得、Ｃ−テイル投与のパターン
が改変されてその効果を最大限にし得、そしてコレステ
ロール摂取に関連してＣ−テイルの投与時間を変化させ
得る。また、Ｃ−テイルの化学的改変および物理的改変
（付加および処方）もまたなされ、阻害を最大限にし得
る。

実施例6:BALは、単離されたラット腸組織によるトリ
グリセリドの取り込みを仲介するが、タウロコーレート
の取り込みは仲介しない。

上記の実施例は、タウロコーレートの取り込みが、腸
表面に結合したBALにより仲介されることを裏付けるも
のである。BALはまた、トリグリセリドを加水分解し、
そしてタウロコーレートにより活性化されることから、
以下の実施例では、腸に結合したBALもまた、トリグリ
セリドおよびタウロコーレートの取り込みを仲介するか
どうかという問題を扱う。

実験 ³H放射性標識トリオレイルグリセロールおよび¹⁴C−
タウロコーレートをコレステロールの代わりに使用した
ことを除いて、上記のコレステロール取り込み実験と同
様の様式で、トリオレインおよびタウロコーレートの取
り込み実験を行った。トリオレイン取り込み実験では、
6mMまたは30mMの非放射性標識タウロコーレートのいず
れも、放射性標識トリオレインを含有した。実験システ
ムは単離された腸であったため、タウロコーレートを供
給してBALを活性化した。［³H］−トリオレイルグリセ
ロール（Amersham,Arlington Heights,IL）を、先の記
載（Downsら（1994））と同様に調製した。7.5mlの等張
リン酸緩衝液（pH7.4）中で15μmolのジオレイルホスフ
ァチジルコリンを乳化することによって、２倍に濃度し
た基質溶液を調製した。Ｗ−380ソニケーター（Heat Sy
stems−Ultrasonics,Inc.）を、５のセッティング（50
％の最大出力）で30秒間、氷浴中で用いることによっ
て、混合物を乳化した。冷却後、混合物をさらに30秒
間、超音波処理した。先に記載のように、この乳化溶液
の1mlの容量を、取り込み測定のために単離したラット
の腸内に置いた。タウロコーレートの取り込みの研究の
ために、２μCiのタウロ（¹⁴CO）コーレートおよび30μ
molのタウロコーレート（Sigma）を5mlの等張リン酸緩
衝液に添加することによって、タウロコーレートのスト
ック溶液（6mM）を作製した。

結果 実施例２のセクションｂ）のコレステロール取り込み
実験について記載のように、単離したラット腸システム
を用いて、トリグリセリドおよびタウロコーレートから
の脂肪酸の取り込みを測定した。５つの実験それぞれか
ら、EGTA溶出によって、腸表面からBALを除去すると、
放射性トリオレインの吸収が高い統計的有意性で約75％
減少した（表XVおよび図７）ことを見出した。表XVは、
6mMのタウロコーレートの添加が、緩衝液洗浄腸におけ
るトリオレインの最大取り込み速度を維持するのに十分
であることを示す。なぜなら、30mMのタウロコーレート
は、本質的に同じ取り込み値を生じるからである（表XV
の最後の２つのカラムと図７中のカラム３および４とを
比較せよ）。タウロコーレートを添加しなかった場合
は、ベースラインのみが認められ、取り込みについて
は、プロセスがBALによって仲介され、そして胆汁塩の
活性化が取り込みに必要であることを示した。BALを除
去したEGTA洗浄の腸は、極めて低い取り込み量を示した
（表XVの第１のデータカラムおよび図７のカラム１）。
この取り込み量は、ベースラインに近い（表XVの0mMタ
ウロコーレートの第２のデータカラムおよび図７のカラ
ム２）。これらの結果は、BALがトリオレインの取り込
みを仲介することを示す。

一方、腸表面から結合型BALを除去してもタウロコー
レートの取り込みは有意に変化しなかった（表XVIおよ
び図８）。腸をEGTA溶液で洗浄して、取り込み実験前に
結合型BALを除去しても、放射性標識タウロコーレート
の取り込み量は僅かしか減少しなかった。EGTA溶出によ
る僅かな影響は、統計的に有為ではなかった。

有意性 これらの結果は、BALのＣ−テイル、組換えＣ−テイ
ル、および天然または化学合成Ｃ−テイルアナログの経
口投与は、医学上の恩恵または栄養上の恩恵を有するは
ずのヒトにおいてトリグリセリドの吸収を減少するのに
有用であるはずである。

胆汁塩活性化リパーゼ（BAL）のカルボキシ末端（Ｃ
テイル）領域の全部または一部、またはそれらの機能的
等価物（Ｃ−テイルペプチド）を含む組成物について記
載しているが、腸内では、腸表面に対する結合において
天然のBALと競合し、そして生物学的に活性な組成物と
結合する。BALのＣ−テイル分子は、送達しようとする
物質に結合され、それゆえ結合体の経口投与で物質を特
異的に腸に送達し得る。腸内で、これらの組成物は腸表
面に結合し、腸の内面層で治療化合物の送達および／ま
たは長期間の存在をもたらす。

結合 種々の生物活性薬剤のいずれも、Ｃ−テイルに結合し
得、生物活性分子の腸への送達を可能にする。例えば、
生物活性薬剤をＣテイルのカルボキシル基またはアミノ
基に共有結合することによって、Ｃテイルを修飾し得
る。Ｃテイルに共有結合する多くの異なる結合剤のいず
れかを用いることによって、Ｃテイルを修飾し得る。

１つの有用なプロトコルは、DMSO、アセトン、または
THFのような非プロトン性（aprotic）溶媒中でＣテイル
カルボニルジイミダゾール（CDI）上の水酸基の「活性
化」を包含する。CDIは、タンパク質のような生物活性
リガンドのフリーのアミノ基の結合によって置換され得
る。水酸基を有するイミダゾリルカルバメート複合体を
形成する。反応はＮ−求核置換であり、そしてＣテイル
に対してリガンドの安定なＮ−アルキルカルバメート結
合をもたらす。生成リガンド−Ｃテイル複合体は安定で
あり、そして長期間の間加水分解に抵抗性である。

別の結合方法は、Ｎ−ヒドロキシルスルホスクシンイ
ミド（スルホNHS）との結合において、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ED
AC）または「水溶性CDI」を用いて、Ｃテイルの露出し
たカルボキシル基を生物活性リガンドのフリーのアミノ
基に結合することを包含する。EDACおよびスルホNHS
は、Ｃテイルのカルボキシル酸基により活性化エステル
を形成する。この酸基はリガンドのアミノ末端と反応し
て、Ｃテイル結合を形成する。生成ペプチド結合は加水
分解に耐性である。反応にスルホNHSを用いるとEDAC結
合の効率が10倍増加し、そしてリガンド−Ｃテイル複合
体の生存能を確実にする非常に穏やかな条件を提供す
る。これらのプロトコルは、Ｃテイル上の水酸基または
カルボキシル基のいずれかの活性化および所望の生物活
性リガンドの結合を可能にする。

フリーの水酸基およびカルボキシル基を有するリガン
ドをＣテイルに結合するための有用な結合手順は、架橋
剤、ジビニルスルホンの使用を包含する。この方法は糖
または他の水酸基化合物をＣテイル上の水酸基に結合す
るのに有用である。活性化は、ジビニルスルホンとＣテ
イルの水酸基とのビニルスルホニルエチルエーテルへの
反応を包含する。ビニル基は、アルコール、フェノー
ル、およびアミンに結合する。活性化および結合は、pH
11で生じる。結合は、１から８のpHの範囲で安定であ
り、そして腸を介する輸送に適している。当業者に公知
のいずれの適切な結合方法も、生物活性なリガンドをＣ
テイルに結合するために使用し得る。

治療化合物は、リンカー分子を用いて、直接的または
間接的のいずれかでＣ−テイルタンパク質に共有結合さ
れ得る。Ｃ−テイルタンパク質と治療化合物との間にさ
らなるフレキシビリティまたはスペースが必要な場合
は、リンカー分子が典型的に使用される。Ｃ−テイルタ
ンパク質および治療化合物の両方に結合し得る適切な分
子が、いずれもリンカー分子として使用され得る。リン
カーの例には、ペプチドまたは直鎖の炭素鎖を有する分
子がある。Ｃ−テイル組成物は腸内で使用されるため、
Ｃ−テイルタンパク質および治療化合物を結合する結合
またはリンカーは、腸環境内で安定でなければならな
い。

生物活性剤 いずれの種類の生物活性剤も、標準的な技術を用いて
Ｃ−テイルに結合し得る。Ｃ−テイルと生物活性剤との
生成結合体を、本明細書ではＣ−テイル組成物またはＣ
−テイル−薬物結合体と呼ぶ。Ｃ−テイルフラグメント
は、生物学的に活性な任意の薬剤に結合され得る。用語
「生物学的に活性な材料」とは、タンパク質、炭水化
物、核酸、脂質、薬物などの有機化合物、またはそれら
の組み合わせをいい、ヒトを含む動物にインビボで投与
する場合、生物学的効果をもたらす。

例としては、抗原、酵素、ホルモン、レセプター、ペ
プチド、タンパク質、多糖類、核酸、ヌクレオシド、ヌ
クレオチド、リポソーム、ビタミン、ミネラル、無機化
合物およびウイルスがあるが、これらに限定されない。
Ｃ−テイルはまた、原核生物細胞および真核生物細胞
（例えば、細菌、酵母、および哺乳動物細胞（ヒト細胞
を含む）、およびそれらの成分（例えば、細胞壁、およ
び細胞成分の結合体）を送達するために使用され得る。

有用なタンパク質の例としては、インシュリン、成長
ホルモン（ソマトメチン（somatometin）、トランスフ
ォーミング成長因子、および他の成長因子を含む）のよ
うなホルモン、経口ワクチン用抗原、ラクターゼまたは
リパーゼのような酵素、およびパンクレアチンのような
消化剤が挙げられる。

有用な薬物の例としては、Marion Pharmaceuticals由
来のCarafate^TMのような潰瘍処置、Ｌ−DOPA、抗高血圧
剤または塩分排泄剤（例えば、Searle Pharmaceuticals
由来のMetolazone）、カルボニックアンヒドラーゼイン
ヒビター（例えば、Lederle pharmaceuticals由来のAce
tazolamide）、インスリン様の薬物（例えば、グリブリ
ド）、スルホニルウレアクラスの血中グルコース降下
薬、合成ホルモン（例えば、Brown Pharmaceuticals由
来のAndroid FおよびICN Pharmaceuticals由来のTestre
d（メチルテストステロン））、駆虫剤（例えば、メベ
ンドゾール（Vermox^TX、Jannsen Pharmaceutical）が挙
げられる。

Ｃ−テイル薬結合体は、潰瘍性大腸炎およびクローン
病のような炎症性腸疾患の処置に特に有用である。潰瘍
性大腸炎では、炎症は大腸に限定されるが、クローン病
では、炎症病巣は口腔から直腸までの消化管全体に見い
出され得る。スルファサラジン（sulfasalazin）は、上
記の疾患の処置に用いられる薬物の１つである。スルフ
ァサラジンは、大腸内の細菌によって分解されてスルフ
ァピリジン（抗生物質）および５−アミノサリチル酸
（抗炎症剤）となる。５−アミノサリチル酸は活性な薬
物であり、局所的に必要とされる。分解産物（５−アミ
ノサリチル酸）の直接投与はより有益であり得る。タン
パク質−薬物送達システムは、腸管内で延期された時間
薬物を保持することによって治療を改善し得る。クロー
ン病の場合、腸の上部ででの５−アミノサリチル酸の保
持がかなり重要である。なぜなら、細菌は大腸内でスル
ファサラジンを分解するからである。腸上部の炎症を処
置する唯一の方法は、５−アミノサリチル酸の局所投与
による。

抗原はペプチドに結合されて、ワクチンを提供し得
る。ワクチンを生産して、消化管内で異なる保持時間を
有し得る。この保持時間は、ペプチドをワクチンに結合
する共有結合の強さに依存している。他の要因のなかで
もこの異なる保持時間は、１つを超えるタイプ（IgG、I
gM、IgA、IgEなど）の抗体の産生を刺激し得る。

用語「抗原」は、抗体の形成を刺激するかまたは細胞
仲介応答を誘導する任意の化学構造を包含し、タンパク
質、多糖類、核タンパク質、リポタンパク質、合成ポリ
ペプチド、またはタンパク質に結合する小分子を含む
が、これらに限定されない。ペプチドに結合し得る具体
的な抗原としては、弱毒ウイルスまたは死菌ウイルス、
トキソイド、多糖類、細胞壁、ならびにウイルスおよび
細菌の表面またはコートタンパク質がある。これらはま
た、コンジュゲート、アジュバント、または他の抗原と
の組み合わせで用いられ得る。例えば、精製されたカプ
セル多糖類の形態のHemophilus influenzae（Hib）は、
単独で、またはジフテリアトキソイドとのコンジュゲー
トとして使用され得る。これらの抗原が誘導される生物
の例として、ポリオウイルス、ロタウイルス、Ａ型、Ｂ
型、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、狂犬病、HIV、麻疹、
おたふくかぜ、風疹、Bordetella pertussus、Streptoc
occus pneumoniae、Diphtheria、Tetanus、Cholera、Sa
lmonella、Neisseria、Shigella、およびEnterotoxigen
ic E.coliが挙げられる。

Ｃテイルはまた、水溶性または水の不溶性の薬物（例
えば、非ステロイド性抗炎症化合物、麻酔薬、化学療法
剤、免疫抑制剤、ステロイド、抗生物質、抗ウイルス
剤、抗真菌剤、ステロイド性抗炎症剤、および抗凝血
薬）を送達するのに使用され得る。

画像化剤もまた、Ｃ−テイルに結合され得る。これら
は、金属、放射性同位体、放射線不透過剤、蛍光色素、
および放射線透過剤を含む。放射性同位体および放射線
不透過剤は、ガリウム、テクネチウム、インディウム、
ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、およびリンを含
む。

Ｃ−テイルに結合する治療化合物（すなわち、生物学
的に活性な薬剤）は、腸内面層の送達される際に有用な
効果を有する任意の化合物であり得る。治療化合物は作
用して、個体によって摂取された化合物の取り込み量を
減少するかまたは増強するかのいずれかであり得るか、
あるいは有害な化合物を分解し得る。例えば、治療化合
物は、酵素、または非酵素的結合分子、またはリガンド
であり得る。個体によって摂取される所望しない化合物
を異化する酵素、またはそのような化合物に特異的な抗
体もしくはレセプターは、治療化合物として有用であ
る。Ｃ−テイル組成物は腸内で使用されるため、治療化
合物は腸環境内で安定かつ活性でなければならない。

好適な治療化合物は、異化酵素であり、特定の分子の
分解を触媒する。特に活性を有する酵素は通常腸内に存
在しない。このタイプの好適な治療化合物は、ラクター
ゼである。Ｃ−テイル／ラクターゼ組成物は、ラクター
ゼを欠く個体、またはラクターゼ活性の減少した個体の
腸内面層にラクターゼを送達するのに使用され得る。Ｃ
−テイル／ラクターゼは、腸内面層に結合し、そして長
期間ラクターゼ活性を維持し、摂取されたラクトースを
分解する。従って、ラクトース不耐症の症状を緩和す
る。

経口投与 好適な実施態様において、Ｃ−テイル−薬物結合体
を、特定の治療適用に有効な量で経口投与する。用量
は、処方、排泄の速度、腸表面上のレセプター数のよう
な個体側の変化、治療のタイプ、および投与回数、なら
びに通常医師によって適正化される他の要因に依存して
変化する。１つの実施態様において、BAL C−テイル組
成物を、食物由来の特定の化合物の取り込みを減少また
は増強するか、あるいは所望しない化合物の腸内濃度を
減少するのに有効な量で経口投与する。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：オクラホマ メディカル リサーチ フ
ァウンデーション （ii）発明の名称：コレステロールの腸吸収を減少させ
る方法 （iii）配列数:6 （iv）連絡住所： （Ａ）名称：パトレア エル パブスト （Ｂ）番地:2800ワン アトランティック センター1
201ウェスト ピーチツリー ストリート （Ｃ）市：アトランタ （Ｄ）州：ジョージア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:30309−3450 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピー ディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用 （Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース1.0
バージョン1.25 （vi）先願の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：米国08/479,160 （Ｂ）出願日:1995年６月７日 （Ｃ）分類： （vii）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：米国08/347,718 （Ｂ）出願日:1994年12月１日 （Ｃ）分類： （viii）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：パトレア エル パブスト （Ｂ）登録番号:31,284 （Ｃ）照会／記録番号:OMRF150CIPPCT （ix）電話回線情報： （Ａ）電話：（404）873−8794 （Ｂ）テレファックス：（404）873−8795 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:722残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （iii）ハイポティカル配列:NO （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:742残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （iii）ハイポティカル配列:NO （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:Modifiedd−Site （Ｂ）存在位置:186..187 （Ｄ）他の情報:/注意＝“位置187はＮ−グルコシド
結合部位を表す。” （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:Modifiedd−Site （Ｂ）存在位置:193..194 （Ｄ）他の情報:/注意＝“位置194のセリンは活性セ
リン部位を表す。” （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:misc.feature （Ｂ）存在位置:1..742 （Ｄ）他の情報:/機能＝“ヒト乳汁中胆汁塩活性化リ
パーゼのアミノ酸構造” （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:3018塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:misc.feature （Ｂ）存在位置:1..742 （Ｄ）他の情報:/機能＝“配列2904上のヌクレオチド
679はヒト乳汁中胆汁塩活性化リパーゼのアミノ酸をコ
ードする” （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:21塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （iii）ハイポティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:misc.feature （Ｂ）存在位置:1..21 （Ｄ）他の情報:/機能＝“プライマー” （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:25塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA （iii）ハイポティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:misc.feature （Ｂ）存在位置:1..25 （Ｄ）他の情報:/機能＝“プライマー” （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:11残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （iii）ハイポティカル配列:NO （ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号:misc.feature （Ｂ）存在位置:1..11 （Ｄ）他の情報:/機能＝“コンセンサス配列” （xi）配列：配列番号6:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ４８２，２６２ (32)優先日 平成７年６月７日(1995．6．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ワン，チ−サン アメリカ合衆国 オクラホマ 73162, オクラホマ シティ，ウッドブリッジ ロード 11808 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/46 A61K 31/70 C12P 21/02 A61K 45/00 A61K 47/48 C12N 15/00 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】コレステロールの腸吸収を減少させるため
   の組成物であって、ヒト胆汁酸塩リパーゼのカルボキシ
   ル領域の一部、または腸細胞上の特異的レセプターに結
   合するその誘導体を含むＣ−テイルタンパク質を含み、
   ヒトまたは動物に投与する場合には、コレステロールの
   取り込みを阻害するために効果的な量で、経口投与する
   ために適切な薬学的キャリアと組み合わせて投与され
   る、組成物。
2. 【請求項２】前記Ｃ−テイルタンパク質が、配列番号１
   のアミノ酸残基539から722の全部または一部を含有す
   る、請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】前記Ｃ−テイルタンパク質がさらに、不活
   性化されている触媒部位を含む胆汁酸塩活性化リパーゼ
   の領域を含有する、請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】前記Ｃ−テイルタンパク質がさらに、霊長
   類、ヒト、ネコ、イヌ、またはげっ歯類の胆汁酸塩活性
   化リパーゼの少なくとも３つの繰り返し領域を含有す
   る、請求項１に記載の組成物。
5. 【請求項５】前記Ｃ−テイルタンパク質が、コンセンサ
   スモチーフPVPPTGDSGAVを含有する、請求項１に記載の
   組成物。
6. 【請求項６】前記キャリアが、ポリマーまたは腸内のカ
   プセル化組成物であり、そして前記Ｃ−テイルタンパク
   質が該キャリア上または該キャリア内に取り込まれる、
   請求項５に記載の組成物。
7. 【請求項７】前記Ｃ−テイルタンパク質が、１またはそ
   れ以上の配列番号１のアミノ酸配列の置換、欠失、また
   は付加により形成される、請求項１に記載の組成物。
8. 【請求項８】前記組成物がさらに、別の血中コレステロ
   ールを減少させる効果的な化合物を包含する、請求項１
   に記載の組成物。
9. 【請求項９】前記化合物が、 （ｉ）ヒト腸表面の胆汁酸塩活性化リパーゼの結合を競
   合する、胆汁酸塩活性化リパーゼのカルボキシル末端領
   域の化学的に合成された模倣物、および （ii）ヒトBALのカルボキシ末端領域と配列相同性を有
   するカルボキシル末端領域の全部または一部 からなる組成物の群より選択されるが、ヒト腸表面にお
   いて胆汁酸塩活性化リパーゼの結合を競合する他の動物
   由来の胆汁酸塩活性化リパーゼより誘導される、請求項
   ８に記載の組成物。
10. 【請求項１０】前記Ｃ−テイルタンパク質が、経口投与
    するための食餌療法の処方である、請求項１に記載の組
    成物。
11. 【請求項１１】前記Ｃ−テイルタンパク質が、トランス
    ジェニックウシまたはヒツジの乳汁中にある、請求項１
    に記載の組成物。
12. 【請求項１２】以下を包含する治療的化合物を誘導する
    ための組成物であって： 経口投与するために適切な薬学的キャリアを用いて組み
    合わせる場合、Ｃ−テイルタンパク質の治療的に有効な
    量が、治療的組成物に結合するリパーゼ活性を有さない
    治療的化合物であり、ここで、 該Ｃ−テイルタンパク質が、Pro−Val−Pro−Pro−Thr
    −Gly−Asp−Ser−Gly−Ala−Proの基本構造、または少
    数を置換した基本構造を有する繰り返しを３回以上含有
    し、ヒト腸細胞に結合する、組成物。
13. 【請求項１３】前記治療的化合物が、タンパク質、炭水
    化物、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、リポソー
    ム、無機化合物、ビタミン、薬物、およびミネラルから
    なる群より選択される、請求項12に記載の組成物。
14. 【請求項１４】前記治療的化合物が、非ステロイド抗炎
    症性化合物、麻酔薬、化学療法剤、免疫抑制剤、ステロ
    イド、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ステロイド
    抗炎症剤、および抗凝血剤からなる群より選択される、
    請求項12に記載の組成物。
15. 【請求項１５】前記キャリアが、ポリマーまたは腸内の
    カプセル化組成物であり、そして前記Ｃ−テイルタンパ
    ク質が該キャリア上または該キャリア内に取り込まれ
    る、請求項12に記載の組成物。