JP3002735B2 - 大豆のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の種子、特に大豆
に含まれるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
遺伝子に関するものである。該遺伝子は、タンパク質の
生産増大に関するものであるので、この遺伝子を発現さ
せればタンパク質含量の高い大豆その他の植物を生産す
ることができ、一方遺伝子の発現を抑制すれば大豆その
他の植物での脂肪の生産増大が図られ、本発明を利用す
れば、所望する性質を有する大豆その他各種の植物の育
種が極めて効率的に行われる。

【０００２】

【従来の技術】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（以下、ＰＥＰＣと略す）は植物の各種の組織に見
いだされる酵素であり、ホスホエノールピルビン酸と炭
酸イオンからオキザロ酢酸とオルトリン酸を生成する反
応を触媒する。

【０００３】Ｓｕｇｉｍｏｔｏら（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．５３，８８５，１９８９）によれば大豆
種子に含まれるＰＥＰＣとタンパク質含量、脂肪含量と
の間にはそれぞれ正、および負の相関性があることが報
告されている。すなわちＰＥＰＣの発現量を制御すれ
ば、これらの生産量をコントロールできることを示して
いる。従来の研究においてはＣ４植物であるトウモロコ
シのＰＥＰＣ遺伝子が単離されているが（Ｉｚｕｉら、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４，１６１５，１９
８６）、Ｃ３植物の種子からの遺伝子の単離は報告され
ていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】人口の増大に伴ない、
食糧の増産は世界的な急務であるが、作付面積の拡大は
森林等自然破壊につながり好ましくない。このような条
件下で食糧増産を図るためには、個々の植物自体を増大
ないし肥大化する方法のほか、植物における特定成分濃
度を特に高める方法が考えられる。

【０００５】本発明は、後者の考え方にたち、しかもこ
れを遺伝子工学の手法を利用して解決しようとするもの
であって、特にタンパク質と脂肪の増産という観点か
ら、それに関与する遺伝子をクローニングすることを目
的とし、もって所望する植物を育種することを究極の目
的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために行われたものであって、本発明者らは植物
種子・葉・培養細胞におけるタンパク質含量の増大ある
いは脂肪生産の増大を図る手段として、大豆からＰＥＰ
Ｃ遺伝子のクローニングを計画し、大豆登熟期種子より
２種のｃＤＮＡをクローニングするのに成功し、更に各
方面から研究の結果、大豆ＰＥＰＣ遺伝子の構造を決定
するのに成功し、遂に本発明の完成に至ったものであ
る。以下、本発明について詳細に説明する。

【０００７】本発明を実施するには、先ず、大豆種子か
らＰＥＰＣを分離精製する必要があるが、それには酵素
の精製に用いられる常法が適宜利用され、例えば、大豆
種子を破砕した後、緩衝液に懸濁し、その上清の硫安画
分について、カラムクロマトグラフィー等既知の方法に
したがって精製する。

【０００８】このようにして、大豆種子からＰＥＰＣを
均一にまで精製した後、それを用いてウサギに対する抗
体を作製した。次に、大豆の登熟期の種子からポリ
（Ａ）ＲＮＡを調製して、それを鋳型としてｃＤＮＡを
合成した。このｃＤＮＡをラムダファージベクターλｇ
ｔ１１に組み込みｃＤＮＡライブラリーを得た。このラ
イブラリーをさらに大腸菌Ｙ１０８８株を用いて増幅さ
せてからスクリーニングを行った。スクリーニングは先
に作製したウサギ抗体を用いて行ったところ、この抗体
に特異的に結合するタンパク質を生産するλファージが
６つ得られた。これらがＰＥＰＣ遺伝子を有するもので
あることを確認するために、これらのλファージが生産
するタンパク質に結合する抗体を精製して、それを用い
てウエスタン分析を行った。その結果、いずれの抗体も
ＳＤＳ電気泳動で分離した大豆種子タンパク質の中から
ＰＥＰＣのみを特異的に選択したことからＰＥＰＣ遺伝
子を含むことを確認した。そこでこれらのλファージか
らλＤＮＡを調製して、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して
からｃＤＮＡ部分を回収して、プラスミドベクターｐＫ
Ｓ＋にサブクローニングした。これらの制限酵素地図を
作製したところ、４つは１ｋｂｐ以下のインサートｃＤ
ＮＡしか含まなかったが、２つは３ｋｂｐのインサート
ＤＮＡを含んでいた。これら２つのクローンをＳＰＣ１
およびＳＰＣ１６と名付けた。この両者は制限酵素の位
置が異なっており、異なる遺伝子に由来するＰＥＰＣ遺
伝子であることが判明した。これらの塩基配列を決定し
て２種のＰＥＰＣ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を得るの
に成功した（配列表、配列番号１及び配列番号２）。

【０００９】この２種のＰＥＰＣ遺伝子の配列は既にト
ウモロコシ、マツバギク、ラン藻、大腸菌から単離され
ているＰＥＰＣ遺伝子と相同性がみとめられるが同一で
はなかった。

【００１０】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説
明する。

【００１１】

【実施例１】

【００１２】（１）大豆ＰＥＰＣの精製 大豆種子（５００ｇ）を粉砕して、２リットルの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８、２５ｍＭ塩化マグネシウ
ムを含む）を加えてよく混合し、その上清を遠心分離に
よって回収した。この上清から３０％から５０％の硫安
画分を得た。この硫安沈澱を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．５、３０％硫安を含む）に溶解したのち、同じ緩
衝液を用いてブチルトヨパールカラム（５×５０ｃｍ）
に供して、ＰＥＰＣ活性を溶出した。この画分を透析し
た後、ＤＥＡＥトヨパールカラム（５×５０ｃｍ）に供
した。このカラムよりＰＥＰＣ活性を塩化ナトリウムの
濃度勾配により溶出した。この画分を硫安沈澱させたの
ちセファロースＣＬ６Ｂカラム（２×９０ｃｍ）を用い
てゲル濾過を行った。この画分をハイドロキシアパタイ
トカラム（１×２０ｃｍ）に供し、５ｍＭから１００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にて溶出した。この様
にして均一に精製されたＰＥＰＣを得た。

【００１３】（２）大豆ＰＥＰＣに対する抗体の作製 以上の方法で得た大豆ＰＥＰＣの１ｍｇを２．５ｍｌの
アジュバントとよく混合したのち、ウサギの表皮に注射
した。６０日間の後に再度、同じウサギに同様にして大
豆ＰＥＰＣを注射して抗体価を高めた。この後、６０日
間たってからこのウサギから血液を採取し、等量の５０
ｍＭクエン酸ナトリウムを加えて、その上清を抗体とし
て用いた。

【００１４】（３）大豆登熟期種子からのポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡの調製 登熟期の大豆種子をすぐさま液体窒素に投入して、凍結
して、使用までは−１３５℃で保存した。この大豆種子
（５０ｇ）を液体窒素の存在下で乳鉢を用いて、粉末状
になるまで破砕した。これに２００ｍｌの抽出緩衝液
（２０ｍＭのバナジルコンプレックス、２％ＳＤＳ、ト
リス塩酸、ｐＨ８．０）を加えて、すぐさま５００×ｇ
で遠心してその上清を回収した。この上清に等量のフェ
ノール・トリス（ｐＨ８．０）を加えて、約１０分間攪
拌してから２０００×ｇで遠心して、その上清を回収し
た。この上清に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．２）および２倍量のエタノールを加えて、−２０
℃で３０分間おいた。これを２０００×ｇで遠心して核
酸の沈澱を得た。これを５ｍｌのトリス緩衝液に溶解
後、等量のフェノール・トリスを加えて、１０分間攪拌
した。この上清を遠心で回収して、このフェノール抽出
をさらに５回繰り返した。得られた上清をエタノールで
沈澱させ、このＲＮＡを蒸留水に溶解し、ＲＮＡ濃度が
１ｍｇ／ｍｌ、塩化リチウム濃度が２Ｍとなるようにし
たのち、氷上で８時間静置した。これを２０００×ｇで
遠心してから、沈澱を回収した。このＲＮＡ沈澱を蒸留
水に溶解した。ポリ（Ａ）ＲＮＡの調製は、オリゴｄＴ
スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて、このカラ
ムの使用説明書に従って行った。１００μｇのポリ
（Ａ）ＲＮＡを得ることができた。

【００１５】（４）ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記の方法で得たポリ（Ａ）ＲＮＡを５μｇ用い、ｃＤ
ＮＡ合成キット（ファルマシア社製）を用い、このキッ
トの説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。このキットに
よるｃＤＮＡ合成では合成されたｃＤＮＡの両末端にＥ
ｃｏＲＩアダプターをライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて、その説明書に従って、連結反応を行わせ
た。このようにして得られたλＤＮＡをパッケージング
キット（ストラタジーン社製）を用いて、そのキットの
説明書に従ってファージ粒子を再構成させ、ｃＤＮＡラ
イブラリーとした。このライブラリーには約１００万の
組換体が含まれていた。このライブラリーをスクリーニ
ングする前に、このライブラリーに含まれる全てのファ
ージを大腸菌Ｙ１０８８株に感染させ、これを４２℃で
寒天培地上で培養して、６時間後に出現したファージプ
ラークからファージをＳＭ溶液を用いて回収した。この
回収液にクロロフォルムを少量くわえて４℃で保存し
た。以下のスクリーニングではこのファージ液をｃＤＮ
Ａライブラリーとして用いた。

【００１６】（５）ｃＤＮＡのスクリーニング 以上のようにして得られたｃＤＮＡライブラリーに含ま
れるファージ液の一部を大腸菌（Ｙ１０９０株）と混合
して３７℃で１５分間培養することによって、ファージ
を大腸菌に感染させた。これを５０℃で溶解した１０ｍ
ｌの軟寒天と混合してから、ＬＢ寒天培地（直径１５ｃ
ｍのシャーレ）に重層させ、軟寒天を固化させた。この
際、一枚のシャーレあたり１０万個のプラークが生じる
ように大腸菌とファージ液の量を調節した。このように
して調製した１０枚のシャーレを３時間、４２℃で培養
後、１０ｍＭのＩＰＴＧ溶液をしみこませてから乾燥し
ておいたニトロセルロースフィルターを寒天培地上にか
ぶせ、さらに３時間、３７℃で培養を行った。その後、
これらのフィルターを注意深く寒天培地から剥し、１％
のＢＳＡ溶液に１６時間浸した。ＰＥＰＣのウサギ抗体
（０．１ｍｌ）を１００ｍｌのＢＳＡ溶液に加えて混合
したのち、この溶液に先のフィルターを浸して、緩く揺
すりながら室温で１時間抗体と反応させた。発色反応は
アルカリフォスファターゼをもちいる２次抗体法のキッ
ト（プロメガ社、ピコブルー）をその説明書に従って行
った。フィルター上に現れた６個の紫色のスポットの位
置をそのフィルターが由来した寒天培地と照らし合わせ
て、対応する位置のファージを１ｍｌのＳＭ溶液に回収
した。これら６種のファージ液には目的以外のファージ
が多数混在しているので、今度はシャーレ１枚当り約１
００のファージのプラークが生じるように寒天培地にま
いて、同様にしてそれぞれのファージ液から紫色のスポ
ットを与えるファージのプラークを回収した（２次スク
リーニング）。さらに同様にして３次スクリーニングを
行い、最終的に６種のファージ液を得た。

【００１７】（６）塩基配列の決定 このようにして得られた６種のファージからＧｒｏｓｓ
ｂｅｒｇｅｒの方法（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
５，６７３７，１９８７）に従って、λＤＮＡをそれぞ
れ調製した。このλＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化
してから、すでにＥｃｏＲＩで消化しＣＩＰ処理を施し
たプラスミドベクターｐＫＳ＋（ストラタジーン社）と
ライゲーションキット（宝酒造社製）の説明書に従っ
て、連結した。これを用いて大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
株）を形質転換した。得られたコロニーからプラスミド
を調製して、各種の制限酵素で消化して、それぞれの制
限酵素地図を作製した。これらを比較して、２種の全長
と考えられるｃＤＮＡを見いだした。これらをＳＰＣ１
およびＳＰＣ１６と名付けた。これらは類似した制限酵
素地図を示すが、いくつかの点で異なっており、異なる
ＰＥＰＣ遺伝子から由来していることが判明した。そこ
でこれらの塩基配列を決定するため、ＳＰＣ１に関して
はインサートｃＤＮＡを別のプラスミドベクターｐＵＣ
１１８にサブクローニングした。これらをプロメガ社の
イレース・ア・ベース・キットを用い、その説明書に従
って、デリーションクローンを作製した。これらのクロ
ーンから一本鎖ＤＮＡを調製して、ジデオキシ法により
塩基配列を決定した。その結果、２つのＰＥＰＣクロー
ンはいずれも翻訳開始部位を含む全長のｃＤＮＡインサ
ートを有することが明らかとなった。

【００１８】すなわち、本発明は、下記の表１〜１６に
示される配列表の配列番号１、２に示す大豆のＰＥＰＣ
をコードする遺伝子に関するものである。

【００１９】

【表１】

【００２０】

【表２】

【００２１】

【表３】

【００２２】

【表４】

【００２３】

【表５】

【００２４】

【表６】

【００２５】

【表７】

【００２６】

【表８】

【００２７】

【表９】

【００２８】

【表１０】

【００２９】

【表１１】

【００３０】

【表１２】

【００３１】

【表１３】

【００３２】

【表１４】

【００３３】

【表１５】

【００３４】

【表１６】

【００３５】

【発明の効果】ＰＥＰＣ活性が高い植物細胞では脂肪の
合成に較べてタンパク質の生産量が増加するという観点
から、ＰＥＰＣを利用してタンパク質の生産の増大、あ
るいは逆にＰＥＰＣの発現を抑えることにより脂肪の生
産増大に用いることができる。本発明により大豆種子で
のタンパク質生産増大に係わるＰＥＰＣの遺伝子が単離
されたことにより、遺伝子組換え技術を用いて植物種
子、葉・培養細胞などにおいてタンパク質含量を増大さ
せた植物の作製や、逆に脂肪含量を増大させた植物の作
製が期待できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エフ ウイッティア 茨城県土浦市桜ケ丘31−14 (56)参考文献 特開 平３−172187（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１又は配列番号２に記
   載の塩基配列で示されるホスホエノールピルビン酸カル
   ボキシラーゼの遺伝子のｃＤＮＡ。