[go: up one dir, main page]

JP3061659B2 - ２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基および該基の使用法 - Google Patents

２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基および該基の使用法

Info

Publication number
JP3061659B2
JP3061659B2 JP3193151A JP19315191A JP3061659B2 JP 3061659 B2 JP3061659 B2 JP 3061659B2 JP 3193151 A JP3193151 A JP 3193151A JP 19315191 A JP19315191 A JP 19315191A JP 3061659 B2 JP3061659 B2 JP 3061659B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mmol
group
pyridine
ethylthio
monomethoxytrityloxy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP3193151A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0532614A (ja
Inventor
良治 石戸
和大 釜池
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yamasa Corp
Original Assignee
Yamasa Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yamasa Corp filed Critical Yamasa Corp
Priority to JP3193151A priority Critical patent/JP3061659B2/ja
Publication of JPH0532614A publication Critical patent/JPH0532614A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3061659B2 publication Critical patent/JP3061659B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、３’−および／または
５’−末端にりん酸残基を有するオリゴヌクレオチド
（以下、オリゴマーと称することもある）を合成する際
に使用する３’−および／または５’−りん酸残基の保
護基に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】長鎖オリゴヌクレオチドの合法法の一つ
として、ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いる短鎖オリ
ゴヌクレオチドの結合反応による方法がある。この際、
基質となるオリゴマーは３’−末端水酸基を有するオリ
ゴマー（アクセプター）および５’−末端りん酸残基を
有するオリゴマー（ドナー）の２つのオリゴマーであ
る。従来、５’−りん酸残基を有するオリゴマーは、
５’−水酸基を有するオリゴマーの５’−末端をポリヌ
クレオチドキナーゼとＡＴＰとを用いてりん酸化する方
法により調製されていた。しかし、この酵素的りん酸化
はライゲーションごとに行なわなければならず、このた
め目的とするオリゴマーの収率が低下するという問題を
有していた。また、リガーゼによる結合反応は、ドナー
となるオリゴマーが３’−末端に水酸基を有するため、
環化反応や重合反応などの副反応が生じやすい。この副
反応を防止する方法としては、酵素を用いて３’−末端
水酸基をりん酸残基で保護する方法が報告されている
（「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」
（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．），１８５〜１９７，ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
Ｄ．Ｃ．（１９８４））ものの、上述と同様に得られ
るオリゴマーの収率が低いという問題を有していた。上
記問題を解決する方法としては、３’−および／または
５’−末端にりん酸残基を有するオリゴマーを化学的に
合成する方法が挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記化学的合成法にお
ける５’−りん酸残基の保護基としては、３’−りん
酸残基の保護基である２−シアノエチル基の除去条件で
安定であること、脱保護時に容易に除去できること、
オリゴヌクレオチドの合成時の縮合反応の簡易な定量
が行なえること、および高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）による精製が容易に行なえること、の各条
件を満足するものが好ましく、これらの各条件を満足す
るものは３’−りん酸残基の保護基の条件をも満たすも
のであるが、現在までにこのような各条件を充足する性
質を有する保護基は報告されていない。
【０００４】よって、本発明は、３’−および／または
５’−末端にりん酸残基を有するオリゴマーを合成する
際に使用するりん酸残基の保護基であって、上記の〜
条件を充足する保護基を提供することを目的とするも
のである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、
【０００６】
【０００７】２−｛２−（モノメトキシトリチルオキ
シ）エチルチオ｝エチル基が上記の〜の各条件を満
足するものであることを知見し、本発明を完成させた。
【０００８】すなわち、本発明は、下記式
【化２】ＭＭＴｒＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2−ヌクレ
オチド （式中、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチル基を示す）で
表されるヌクレオチドの３’−および／または５’−末
端のりん酸残基に２−｛２−（モノメトキシトリチルオ
キシ）エチルチオ｝エチル基を有するヌクレオチド化合
物に関するものである。また、本発明は、３’−および
／または５’−末端に上記ヌクレオチド化合物を有する
オリゴヌクレオチド化合物に関するものである。さら
に、本発明は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
と２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチ
オ｝エタノールとを縮合剤の存在下に反応させ、ヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチドの３’−および／また
は５’−末端のりん酸残基に２−｛２−（モノメトキシ
トリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基を導入する方法
に関するものである。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチ
オ｝エチル基（以下、本発明の保護基と称することもあ
る）は上記式（１）で表わされるものである。トリチル
基中のモノメトキシ基の置換位置は特に制限されず、オ
ルト、メタ、パラのいずれの位置であってもよい。
【００１０】本発明の保護基は、２，２’−チオジエタ
ノールとハロゲン化モノメトキシトリチル（たとえば、
モノメトキシトリチルクロライド、モノメトキシトリチ
ルブロマイドなど）とを反応溶媒（塩化メチレン、クロ
ロホルム、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、
ピリジンなどの単独または混合溶媒）中、０〜１００℃
で反応させることにより２−｛２−（モノメトキシトリ
チルオキシ）エチルチオ｝エタノールの形で調製するこ
とができる。
【００１１】反応液中にトリエチルアミン、ピリジン、
ピコリン、ジエチルアミノピリジン等の酸受容体を共存
させておくことにより反応を効率よく進行させることが
できる。反応後、２−｛２−（モノメトキシトリチルオ
キシ）エチルチオ｝エタノールはシリカゲル等を使用し
た吸着クロマトグラフィー法により単離精製することが
できる。
【００１２】本発明の保護基は３’−および／または
５’−末端にりん酸残基を有するＤＮＡ型またはＲＮＡ
型オリゴヌクレオチドの合成に使用することができる。
まず、ヌクレオチドの３’−および／または５’−末端
に本発明の保護基を導入し、以下、通常の方法（たとえ
ば、りん酸トリエステル法、ホスファイト法など）に従
って目的とするオリゴヌクレオチドを合成すればよい。
【００１３】ヌクレオチドへの本発明の保護基の導入
は、たとえば、ヌクレオチド１モルに対して２−｛２−
（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エタノー
ル１〜２倍モル使用し、反応溶媒（ピリジン、ピコリ
ン、塩化メチレン、などの単独または混合溶媒）中、通
常の縮合剤（たとえば、２，４，６−トリイソプロピル
ベンゼンスルホニルクロライド−１−メチルイミダゾー
ル系、８−キノリンスルホニルクロライド−１−メチル
イミダゾール系、２，４，６−トリメチルベンゼンスル
ホニル−３−ニトロトリアゾリド、２，４，６−トリイ
ソプロピルベンゼンスルホニル−３−ニトロトリアゾリ
ドなど）の存在下、０〜５０℃で反応させることにより
実施することができる。
【００１４】反応後、本発明の保護基を３’−および／
または５’−末端に有するヌクレオチドは、必要により
シリカゲル等を使用した吸着クロマトグラフィー、再結
晶法等のヌクレオチドの通常の単離精製法により単離精
製することができる。
【００１５】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説
明する。
【実施例】
【００１６】実施例１２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチ
オ｝エタノールの合成および、ヌクレオチドへの２−
｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エ
チル基の導入 ２，２’−チオジエタノール（４．５１ml，７５ｍｍｏ
ｌ）とモノメトキシトリチルクロリド（４．６３２２
ｇ，１５ｍｍｏｌ）とを塩化メチレン（６０ml）に溶か
し、トリエチルアミン（２．１７ml，１５ｍｍｏｌ）を
滴下しながら攪拌し、さらに室温で１時間攪拌した。塩
化メチレンで抽出し、水で洗浄して有機層を減圧下濃縮
した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（ｎ−ヘキサンークロロホルム系）により精製して、２
−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝
エタノールを収率７０％（４．１７１ｇ，１０．５７１
８ｍｍｏｌ）で得た。 1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 −ＴＭＳ）δ；２．１０〜
２．３３（１Ｈ，ｍ，−ＯＨ），２．６５（４Ｈ，ｔ，
−ＣＨ2 ×２），３．３０（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ2 −），
３．６３（２Ｈ，ｔ，−ＣＨ2 −），３．８３（３Ｈ，
ｓ，ＯＣＨ3 ），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ａ
ｒ−Ｈ），７．００〜７．６０（１２Ｈ，ｍ，Ａｒ−
Ｈ） さらに下記構造式１で表わされるウリジン誘導体（１）
（０．５２８３ｇ，０．５ｍｍｏｌ）と２−｛２−（モ
ノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エタノール
（０．３７４０ｇ，０．７５ｍｍｏｌ）をピリジンで共
沸脱水した後、ピリジン（２．５ml）に溶かし２，４，
６−トリイソプロピルベンゼスルホニルクロライド（Ｔ
ＰＳＣｌ）（０．４５４３ｇ，１．５ｍｍｏｌ）、１−
メチルイミダゾール（１−Ｍｅｉｍ）（０．２３９ml、
３．０ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。その
後、塩化メチレンで抽出して水で洗浄した。有機層を減
圧下濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーにより精製して、３’−りん酸基に２−｛２−（モ
ノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基を導
入した下記構造式２で表わされるウリジン誘導体（２）
を収率３１％（０．２００ｇ，０．１５６ｍｍｏｌ）で
得た。
【００１７】
【化３】
【００１８】（式中、ＭＭＴｒは前記と同意義、Ａｎは
アニソイル基、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基、ＴＨ
Ｐはテトラヒドロピラニル基、Ｅｔはエチル基、ＰｈＣ
ｌはｏ−クロロフェニル基を示す）
【００１９】ウリジン誘導体（２）の 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3 −ＴＭＳ）δ：１．３３−１．６７（６Ｈ，
ｍ，ＣＣＨ2 ×３），２．５３−２．８０（４Ｈ，ｍ，
ＣＨ2 ×２），３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ
2 ），３．４７−３．６３（２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ2 ），
３．７７（１２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ3 ×４），３．８０−
３．８７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，５”），４．０７−
４．３３（２Ｈ，ｍ，ＰＯＣＨ2 ）４．３７−４．５０
（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’），４．６７−４．９３（２Ｈ，
ｍ，ＯＣＨ，Ｈ−２’），５．１３−５．３６（１Ｈ，
ｍ，Ｈ−３’），５．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ56＝７．５Ｈ
ｚ，Ｈ−５），６．２０，６．３５（１Ｈ，ｄ×２，Ｊ
1'2'＝６Ｈｚ，Ｊ1'2'＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１’）６．８
０−７．６０（３３Ｈ，ｍ，Ｐｈ−Ｈ），７．７５（１
Ｈ，ｄ，Ｈ−６），７．９５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，
Ｐｈ−Ｈ）
【００２０】２−（２−（モノメトキシトリチルオキ
シ）エチルチオ）エチル基の除去 ウリジン誘導体（２）（０．１ｇ，０．０７８ｍｍｏ
ｌ）に０．５Ｍ Ｎ1 ，Ｎ 1 ，Ｎ3 ，Ｎ3 −テトラメチ
ルグアニジウム−（Ｅ）−２−ピリジンアルドオキシマ
ート（ＴＭＧ−ＰＡＯ）（０．５ml）を加え室温で３時
間放置した。塩化メチレン（１００ml）で抽出し０．２
Ｍテトラエチルアンモニウムブロミド（ＴＥＡＢ）（５
０ml×２）で洗浄した。有機層を減圧下濃縮し、残留物
に０．２ＭＴＥＡＢ−ピリジン（２：１ｖ／ｖ）（１０
０ml）を加え抽出し、ジエチルエーテル（５０ml×２）
で洗浄した。有機層を減圧下濃縮し、残留物に０．２Ｍ
１−クロロコハク酸イミド（ＮＣＳ）／０．４Ｍ Ｔ
ＥＡＢ：１，４−ジオキサン（１：１ｖ／ｖ）溶液（５
ml）を加えて溶かし、室温で２時間放置した。その後、
０．２Ｍ ＴＥＡＢ（５ml）を加えジエチルエーテル
（５ml×２）で洗浄した。水層を減圧下濃縮し、残留物
に濃アンモニア水（５ml）−ピリジン（０．５ml）を加
え室温で２０時間放置した。減圧下濃縮し、残留物にpH
２の塩酸溶液（５ml）を加えさらに２２時間放置した。
希アンモニア水で中和した後、水１０mlを加えジエチル
エーテル（５ml×２）で洗浄した。水層を減圧下濃縮
し、ペーパークロマトグラフィー（東洋漉紙Ｎｏ．５
１；ＩＰＡ：ｃｏｎｃ．ＮＨ4 ＯＨ：Ｈ 2 Ｏ＝７：１：
２ｖ／ｖ／ｖ）により完全に脱保護されていることを確
認した。
【００２１】実施例２シチジン３’，５’−ジホスフェイト誘導体の合成 下記構造式３で表わされるシチジン誘導体（３）（１．
２６８ｇ，１．８３４９ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸脱
水した後、塩化メチレン（１０ml）に溶かし、２−クロ
ロフェニルホスホロジクロリド（０．４５３０ml，２．
７５２５ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１０ml）に攪拌し
つつ２時間かけて滴下し、さらに３０分攪拌した。水
（１ml）で反応を停止した後、減圧下濃縮した。残留物
を水−ピリジン（２：１）溶液（１００ml）で抽出しエ
ーテル（５０ml×３）で洗浄し、水層を減圧下濃縮し下
記構造式４で表わされるシチジン誘導体（４）を収率６
７％（１．２０２ｇ，１．２２３１ｍｍｏｌ）で得た。
２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチ
オ｝エタノール（１．４３５６ｇ，３．６３８７ｍｍｏ
ｌ）とシチジン誘導体（４）（１．１９２ｇ，１．２１
２９ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸脱水した後、ピリジン
（６ml）に溶かし８−キノリンスルホニルクロライド
（ＱＳＣｌ）（０．８２４ｇ，３．６３８７ｍｍｏ
ｌ）、１−Ｍｅｉｍ（０．５８ml，７．２７７４ｍｍｏ
ｌ）を加え１時間攪拌した。析出した８−キノリンスル
ホン酸（ＱＳ）の分子内塩を濾別した後、濾液に冷水
（２ml）を加えて反応を停止させ、水（１５ml）および
ピリジン（６ml）を加えジエチルエーテル（３０ml×
３）で抽出し、有機層を水−ピリジン（２：１）溶液
（１５ml×２）で洗浄した。有機層を減圧下濃縮しシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して下記構
造式５で表わされるシチジン誘導体（５）を収率３８％
（０．５８８ｇ，０．４６５２ｍｍｏｌ）で得た。
【００２２】シチジン誘導体（５）（０．５７８ｇ，
０．４５５８ｍｍｏｌ）にトリエチルアミン−ピリジン
（１：３ｖ／ｖ）（５ml）を加え２時間攪拌した。減圧
下濃縮して下記構造式６で表わされるシチジン誘導体
（６）を定量的に得た。この際５’−りん酸に導入した
２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチ
オ｝エチル基が損なわれていないことはＭＭＴｒ基の酸
による発色で確認した。すなわち、６０％過塩素酸−エ
タノール（３：２（ｖ／ｖ））溶液にて発色させ、４７
０ｎｍでの吸光度を測定し、ε470 ＝５６０００（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１１，４３６５（１
９８３））よりＭＭＴｒ基の量を算定する方法によっ
た。
【００２３】
【化４】
【化５】
【００２４】（式中、Ａｎ，ＴＨＰ，ＰｈＣｌ，Ｅｔ，
ＭＭＴｒは前記と同意義）
【００２５】 シチジン誘導体（５）の元素分析値 Ｃ61Ｈ62Ｎ4 Ｏ9 Ｐ2 ＳＣｌ2 として Ｃ Ｈ Ｎ 計算値（％） ５７．６０ ４．９２ ４．４０ 実測値（％） ５７．６２ ４．９１ ４．４３
【００２６】実施例３１１量体の合成 図１〜３の反応スキームで１１量体を合成した。
【００２７】２量体の合成 シチジン誘導体（６）（０．８４９３ｇ，０．６４５２
ｍｍｏｌ）と下記構造式７で表わされるウリジン誘導体
（７）（０．３７９６ｇ，０．５３７７ｍｍｏｌ）を共
沸脱水した後、ピリジン（３ml）に溶かし、ＱＳ（０．
４４０７ｇ，１．９３５６ｍｍｏｌ）、１−Ｍｅｉｍ
（０．３０８６ml，３．８７１２ｍｍｏｌ）を加え２時
間攪拌した。析出したＱＳの分子内塩を吸引濾過により
除去し、濾液に水（１ml）を加えて反応を停止し、水−
ピリジン（４：１ｖ／ｖ）溶液（２５ml）を加えジエチ
ルエーテル（３０ml×３）で抽出した。有機層を減圧下
濃縮してグラス状の図１の化学式８で表わされる２量体
（８）を収率８６％（０．８８３ｇ，０．４６１５ｍｍ
ｏｌ）で得た。
【００２８】下記構造式９で表わされるシチジン誘導体
（９）（２．８７５ｇ，２．７６ｍｍｏｌ）と下記構造
式１０で表わされるグアノシン誘導体（１０）（１．６
９０ｇ，２．３ｍｍｏｌ）を共沸脱水した後、ピリジン
（１１．５ml）に溶かし、ＱＳ（１．８８５０ｇ，８．
２８ｍｍｏｌ）、１−Ｍｅｉｍ（１．３２０１ml，１
６．５６ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。析出したＱ
Ｓの分子内塩を吸引濾過により除去し、濾液に水（１m
l）を加えて反応を停止し、水−ピリジン（４：１ｖ／
ｖ）溶液（５０ml）を加えジエチルエーテル（４０ml×
３）で抽出した。有機層を減圧下濃縮してグラス状の図
１の化学式１１で表わされる２量体（１１）を収率９５
％（３．６５２ｇ，２．１９１４ｍｍｏｌ）で得た。
【００２９】
【化６】
【化７】
【００３０】（式中、Ａｎ，ＴＨＰ，ＰｈＣｌ，ＤＭＴ
ｒ，Ｅｔは前記と同意義、ＣＥはシアノエチル基、ｉＢ
ｕはイソブチリル基を示す）
【００３１】４量体の５’−末端りん酸トリエステル−
３’−末端りん酸トリエステル誘導体（１４）の合成 ２量体（８）（０．４９１ｇ，０．２５９２ｍｍｏｌ）
は、トリエチルアミン−ピリジン（１：３ｖ／ｖ）（４
ml）に溶かし室温で２時間攪拌した後反応溶液を減圧下
濃縮しりん酸部の保護基である２−シアノエチル基を除
去し図１の化学式１２で表わされる２量体（１２）を収
率９１％（０．４２６ｇ，０．２３５６ｍｍｏｌ）で得
た。一方２量体（１１）（１．８７６５ｇ，１．１２６
０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍ）に溶かし氷冷下
４％ジクロロ酢酸／塩化メチレン溶液（１０ｍ）を加え
て１５分間反応させＤＭＴｒ基を除去した。その後５％
炭酸水素ナトリウム溶液を加えて中和し、クロロホルム
（５０ml）で抽出、さらに水（２０ml×２）で洗浄した
後有機層を減圧下濃縮した。残留物をシリカゲルカラム
クロマトグラフィーにより精製し図１の化学式１３で表
わされる２量体（１３）を定量的に得た。このようにし
て合成した２量体（１２）（０．４２６ｇ，０．２３５
６ｍｍｏｌ）および２量体（１３）（０．２６７８ｇ，
０．１９６３ｍｍｏｌ）をピリジンで共沸脱水した後、
ピリジン（３ml）に溶かしＱＳ（０．１６０９ｇ，０．
７０６８ｍｍｏｌ）、１−Ｍｅｉｍ（０．１１２７ml，
１．４１３６ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌し
た。析出したＱＳの分子内塩を吸引濾過により除去し、
濾液に水（０．５ml）を加えて反応を停止し、水−ピリ
ジン（４：１ｖ／ｖ）溶液（２５ml）を加えジエチルエ
ーテル（３０ml×３）で抽出した。有機層を減圧下濃縮
しシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して
グラス状の図１の化学式１４で表わされる４量体（１
４）を収率４４％（０．０８５９１ｍｍｏｌ）で得た。
【００３２】４量体の５’−末端りん酸トリエステル−
３’−末端りん酸ジエステル誘導体（１５）の合成 ４量体（１４）（０．０８５９１ｍｍｏｌ）をトリエチ
ルアミン−ピリジン（１：３ｖ／ｖ）（１ml）を加えて
２時間攪拌し減圧下濃縮した。残留物をＣ−１８逆相カ
ラムクロマトグラフィーにより精製して図１の化学式１
５で表わされる４量体（１５）を収率６０％（０．１６
９ｇ，０．０５１７７ｍｍｏｌ）で得た。同様にして図
２に示す順序で５’−末端にりん酸残基を有しない図２
の化学式１６で表わされる６量体の３’−末端りん酸ジ
エステル誘導体（１６）を合成した。
【００３３】担持体の合成 ６量体（１６）（０．２１０７ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）
と下記構造式１７で表わされるアデノシン誘導体を担持
した担体（１７）（０．４９６５ｇ，０．３０ｍｍｏ
ｌ）を共にピリジンで共沸脱水した後、ピリジン（５m
l）に溶かしＴＰＳＣｌ（０．０７５７ｇ，０．２５ｍ
ｍｏｌ）、１−Ｍｅｉｍ（０．０３９８ml，０．５０ｍ
ｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。その後無水酢酸
（１．５ml）を加えてさらに室温で６時間攪拌し、反応
溶液を塩化メチレンで薄めてから攪拌しているエタノー
ル（５００ml）中に注いで沈殿としてヌクレオシド誘導
体を担持したアセチルセルロースを得た。さらにトルエ
ンで共沸してピリジンを除き塩化メチレン（１０ml）に
溶かし４％ジクロロ酢酸塩化メチレン溶液（１０ml）を
加えて氷冷下１０分間攪拌した。その後ピリジン（２m
l）を加え中和して反応を停止し攪拌しているエタノー
ル（５００ml）中に注ぐことにより沈澱として図３の１
８で表わされる７量体を担持した担体（１８）を収率４
８％（０．４６４ｇ，０．０２４２２ｍｍｏｌ）で得
た。（担持量０．０５２１９ｍｍｏｌ／ｇ）さらに４量
体（１５）（０．１１８６ｇ，０．０３６３３ｍｍｏ
ｌ）と担体（１８）（０．２３２ｇ，０．０１２１１ｍ
ｍｏｌ）を共にピリジンで共沸脱水した後、ピリジン
（２ml）に溶かしＴＰＳＣｌ（０．０６０６ｇ，０．１
８１７ｍｍｏｌ）、１−Ｍｅｉｍ（０．０３１８ml，
０．３６３３ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間攪拌した。
その後、反応溶液を塩化メチレンで薄めてから攪拌して
いるエタノール（５００ml）中に注いで担持体を沈澱さ
せ、図３の１９で表わされる１１量体を担持した担体
（１９）を収率６１％（０．２２１０ｇ，０．００７３
７６ｍｍｏｌ）で得た。（担持量０．０３３３８ｍｍｏ
ｌ／ｇ）
【００３４】
【化８】
【００３５】１１量体の脱保護および構造確認 担体（１９）（２９．９２mg，１．０μｍｏｌ）を０．
５Ｍ ＴＭＧ−ＰＡＯ／ピリジン−水（９：１ｖ／ｖ）
溶液（０．５ml）に溶かし、室温で２４時間放置した。
反応溶液にエタノール（３０ml）を加えセルロース残渣
を沈澱させた後、−２０℃で３０分放置してから遠心分
離（３０００回転／分、ｒ．ｔ．，１５分間）し、上清
を減圧下濃縮した。残留物に濃アンモニア水（２８％）
（１５ml）を加え、密栓をし、５５℃６時間放置した
後、減圧下濃縮した。あらかじめ、アセトニトリル−水
（９：１ｖ／ｖ）（１０ml）を注入して３時間以上放置
した後、５０ｍＭ ＴＥＡＢ水溶液（２０ml）を流出さ
せておいたＳＥＰ−ＰＡＫ（Ｃ−１８）（Ｗａｔｅｒｓ
社）に５０ｍＭＴＥＡＢ水溶液（２０ml）に溶かした１
１量体を注入した。１５％アセトニトリル−５０ｍＭ
ＴＥＡＢ水溶液（３０ml）でＴＭＧ、ＰＡＯ等を溶出し
た後、３５％アセトニトリル−５０ｍＭ ＴＥＡＢ水溶
液（２０ml）で１１量体を溶出し溶出液を減圧下濃縮し
た。
【００３６】１１量体を水（０．２００ml）に溶かし、
ＨＰＬＣ（μＢＯＭＤＡＳＰＨＥＲＥ ５μ Ｃ−１８
−１００Å ３．９mm×１５cm，１０％−５０％アセト
ニトリル−０．１ＭＴＥＡＡ水溶液系）により１１量体
（０．０７７６ml）を精製した（図４参照）。主ピーク
の中央部分を分取し、減圧下濃縮した。さらに水（１m
l）を加えトリエチルアミン臭がしなくなるまで減圧留
去した後、残留物を０．５ＭＴＥＡＢ−１，４−ジオキ
サン（１：１）（１００μｌ）に溶かしＮ−クロロコハ
ク酸イミド（０．００２７ｇ）を加え室温で２時間放置
した。さらに濃アンモニア水（１ml）を加え２０時間放
置した。酢酸エチル（５ml×２）で洗浄した後、水層を
減圧下濃縮し、残留物をpH２．０塩酸（５ml）に溶かし
室温で２日間放置した。希アンモニア水で中和し、酢酸
エチル（２０ml）で洗浄した後、水層を減圧下濃縮し
た。残留物を水（０．０７５ml）に溶かしＨＰＬＣ（μ
ＢＯＭＤＡＳＰＨＥＲＥ ５μ Ｃ−１８−１００Å
３．９mm×１５cm，５％−１９％アセトニトリル−０．
１ＭＴＥＡＡ水溶液系）で精製し（図５参照）、主ピー
クの中央部分を分取して減圧下濃縮し保護基が完全に除
去された図３の２０で表わされる１１量体（２０）を
０．８８４Ａ260 ユニット得た。
【００３７】１１量体の酵素分解 １１量体（２０）（０．２Ａ260 ユニット）をＴｒｉｓ
緩衝液（０．１ml）に溶かしヘビ毒のホスホジエステラ
ーゼを３μｌ加え３７℃で１時間放置した。ＨＰＬＣ
（ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ １８−５ ４．６mm×
１５０mm，１％アセトニトリル−０．１ＭＴＥＡＡ水溶
液）の溶出パターンには４種類全てのヌクレオチドのピ
ークが認められ（図６参照）、その積分強度比はｐＣ：
ｐＵ：ｐＧ：ｐＡ＝（６：２：１：２）［理論比（６：
２：１：２）］でありシチジンのピークは認められなか
った。ヘビ毒のホスホジエステラーゼはオリゴヌクレオ
チドの３’−位の酸素とりん酸との結合を選択的に開裂
する活性を有しており分解物のＨＰＬＣ（図６）では
５’−りん酸基を有するヌクレオチドのみが見られるこ
とから本発明の保護基の有用性が示された。
【００３８】
【発明の効果】上述の実施例１より、本発明の保護基は
導入および除去とも極めて容易に行なえるとともに、２
−シアノエチル基の除去条件下でも安定であることが明
らかとなった。また、本発明の保護基中にはモノメトキ
シトリチル基を有するため通常の方法により発色させる
ことができ、この発色の程度で定量を行なうこともでき
る。
【００３９】さらに、図４に示されているように、本発
明の保護基を有するオリゴマーは他の反応未反応物との
分離がよく、ＨＰＬＣにより目的とするオリゴマーを単
離精製することができる。このように本発明の保護基は
３’−および／または５’−末端にりん酸残基を有する
オリゴマーを調製する際のりん酸残基の保護基として有
用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例３で合成した１１量体の合成スキ
ームを示したものである。
【図２】図２は実施例３で合成した１１量体の合成スキ
ームを示したものである。
【図３】図３は実施例３で合成した１１量体の合成スキ
ームを示したものである。
【図４】図４は２’位にＴＨＰ基、５’位に本発明の保
護基を有する１１量体のＨＰＬＣにおける溶出パターン
を示したものである。
【図５】図５は、保護基を有しない１１量体のＨＰＬＣ
における溶出パターンを示したものである。
【図６】図６は、無保護の１１量体をヘビ毒のホスホジ
エステラーゼで酵素分解して得られる分解物のＨＰＬＣ
における溶出パターンを示したものである。
【符号の説明】
図中の略号は以下のとおりである。 Ｐ ｏ−クロロフェニルホスホニル基 ＣＥ ２−シアノエトキシ基 ＮＥｔ3 トリエチルアミン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 19/10 C07H 19/207 C07H 21/00 - 21/04 C07C 323/12 C07F 9/6558 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記式 【化１】ＭＭＴｒＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2−ヌクレ
    オチド （式中、ＭＭＴｒはモノメトキシトリチル基を示す）で
    表されるヌクレオチドの３’−および／または５’−末
    端のりん酸残基に２−｛２−（モノメトキシトリチルオ
    キシ）エチルチオ｝エチル基を有するヌクレオチド化合
    物。
  2. 【請求項２】 ３’−および／または５’−末端に請求
    項１のヌクレオチド化合物を有するオリゴヌクレオチド
    化合物。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
    と２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチ
    オ｝エタノールとを縮合剤の存在下に反応させ、ヌクレ
    オチドまたはオリゴヌクレオチドの３’−および／また
    は５’−末端のりん酸残基に２−｛２−（モノメトキシ
    トリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基を導入する方
    法。
JP3193151A 1991-08-01 1991-08-01 ２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基および該基の使用法 Expired - Fee Related JP3061659B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3193151A JP3061659B2 (ja) 1991-08-01 1991-08-01 ２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基および該基の使用法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3193151A JP3061659B2 (ja) 1991-08-01 1991-08-01 ２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基および該基の使用法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0532614A JPH0532614A (ja) 1993-02-09
JP3061659B2 true JP3061659B2 (ja) 2000-07-10

Family

ID=16303136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3193151A Expired - Fee Related JP3061659B2 (ja) 1991-08-01 1991-08-01 ２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基および該基の使用法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP3061659B2 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2114355A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 Hidehiko Furukawa Modified oligodeoxyribonucleotides, their preparation and their therapeutic use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．４（１９９０）ｐ．５２４−５３０

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0532614A (ja) 1993-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5552538A (en) Oligonucleotides with cleavable sites
US5367066A (en) Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5695979A (en) Inhibition of reverse transcriptase by phosphorodithioates
JP2511005B2 (ja) インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法並びにそれに用いる試薬
US6028182A (en) Methylphosphonic acid esters, processes for their preparation, and their use
US5703218A (en) Oligonucleotides containing hydroxyl-protecting groups orthogonally removable by reduction
US20030096981A1 (en) Modified oligonucleotides, their preparation and their use
JPH0714954B2 (ja) ヌクレオチド架橋試薬として使用するためのクマリン誘導体
JPS638120B2 (ja)
CA2089668A1 (en) Oligo (alpha-arabinofuranosyl nucleotides) and alpha-arabinofuranosyl precursors thereof
Reese et al. Solution phase synthesis of ISIS 2922 (Vitravene) by the modified H-phosphonate approach
JPH07103150B2 (ja) ２’―０―アルキルヌクレオチド並びにこのようなヌクレオチドを含むポリマー
JP2835630B2 (ja) 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成
US5955600A (en) Method for the synthesis of nucleotide or oligonucleotide phosphoramidites
EP0002322A2 (en) Improved Triester process for the synthesis of oligonucleotides
CA2083485A1 (en) Oligodeoxyribonucleotide
HUT77509A (hu) Nukleinsavakhoz szekvencia-specifikusan kötődő oligomerek és alkalmazásuk antiszensz technikában
JP3061659B2 (ja) ２−｛２−（モノメトキシトリチルオキシ）エチルチオ｝エチル基および該基の使用法
US4419509A (en) Process for de-cyanoethylating blocked nucleotides
US4426517A (en) Process for de-cyanoethylating blocked nucleotides
JP5435872B2 (ja) オリゴヌクレオチドの合成
JPH0371437B2 (ja)
US6124484A (en) Recovery of triarylmethyl halide protecting groups cleaved during oligonucleotide synthesis
US5332845A (en) Phosphorylating reagents
US7049432B2 (en) Oligonucleotides having alkylphosphonate linkages and methods for their preparation

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees