JP3060504B2 - ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Bordetella pertussis,Bordetella parape
rtussisまたはBordetella bronchisepticaに対するワク
チンに関する。

Bordetella pertussisは、ヒトにおける百日咳の病原
体であるが、本病気の発生は、その関連病原微生物Bord
etella parapertussisと関連づけられている。Bordette
la bronchisepticaは、主として動物の病原体である
が、百日咳様症状をもつ子供から巣離されたことがあ
る。B.pertussisの全細胞ワクチンでの免疫処置プログ
ラムは、本疾病を制御するのに比較的効果があったが、
ワクチン接種に関連する副作用原性のために、現在で
は、ある先進諸国においての使用度は低い。子供では、
１万人に１人の割合で副作用で苦しむことが認かめられ
た。臨床症状のなかには、絶えず金切声で叫び続けるこ
とや、発熱及び局所反応がある。

副作用原性と関連して、全細胞ワクチン中に存在する
成分を含まないが、依然として防御エピトープは含んで
いる新しいpertussisの非細胞性ワクチンが必要であ
る。防御性成分に対する探索は、多数の外膜関連抗原に
的を絞って進められた。これらの抗原には、pertussis
トキシン〔ptxリンパ球増加促進因子（LPE）〕、フィラ
メント状赤血球凝集素（FHA）、細胞毒性アデニル酸シ
クラーゼ（cytotoxic adenylate cyclase,Adcase）、皮
膚壊死トキシン（dermonecrctic toxin,DNT）、気管細
胞毒素（tracheal cytotoxin）、凝集原類（agglutinog
ens）（Agg2,Agg3）,69kDaの外膜タンパク質（omp），
（P.69），及びリポポリサッカライド（LPS）が含まれ
る。

pertussisトキシン（LPF）については多くの仕事がな
されてきており、それは、多くの人々によって、非細胞
pertussisワクチンすべてのうちで、最も重要な部分で
あると信じられている。（Bacterial Vaccines,1984,ch
apter 3,Manclarkら、Ed:Germainer）.LPF/FHAワクチン
についてのスエーデンにおける最近の臨床試験の結果に
より、このようなワクチンは、約69％の防御しか提供し
ないことが示された（Lancet１,995,1988）。これは、
全細胞ワクチンによって提供された防御について期待さ
れた結果よりも低く、その結果、LPF/FHAワクチンは、
スエーデンの厚生省（Swedish Health Authority）によ
って認可されないことになった。

EP−Ａ−0162639は、医薬として認め得るそのための
担体とともに、アデニル酸シクラーゼ（ACAP）に関連し
たタンパク質様物質を含むB.pertussisから由来した抗
原調製物を含むB.pertussisに対する防御のためのワク
チン製剤を明らかにするものである。分子量69kDaのACA
Pが明らかになっている。

P.69抗原と名付けられたこのACAPのいずれの領域が、
防御のために重要であるかを特徴づけるために、タンパ
ク質をコードしている遺伝子のクローニングを行い、配
列を決定した（Charlesら、PNAS,Vol86,3554−3558,198
9）。B.pertussisから抽出されたP.69は、プリカーサー
93kDa（P.93）がプロセッシングを受けた形のように思
われる。

本発明は、 （ａ） B.pertussis CN2992のP.69遺伝子のヌクレオチ
ド1885から1902によってコードされるアミノ酸配列、 （ｂ） B.pertussisの別の菌株、または、B.parapertu
ssis、またはB.bronchisepticaの菌株の相当するアミノ
酸配列；または （ｃ） 改変された配列が、該配列（ａ）または（ｂ）
の抗原性と実質的に同じ抗原性を持つように改変された
該配列（ａ）または（ｂ）を含むエピトープを提出する
ワクチンにおいて使用されるのに適したあるポリペプチ
ドを提供している。該ポリペプチドは、50こ未満のアミ
ノ酸残基の長さであるか、キャリヤ−タンパク質の配列
と、該エピトープの該配列を含む50こ未満のアミノ酸の
外来配列からなるアミノ酸配列をもつキメラ状のタンパ
ク質である。

本発明のポリペプチドは、明確化された抗原的に効果
をもつ配列をもつ。この配列は、Charlesら（1989）に
よって明らかにされた、B.pertussis CN2992のP.69遺伝
子配列と、アミノ酸に対する１文字コード（Eur,J.Bioc
hem.138,9−37,1984）を用いることに基いたPGPQPPであ
る。それゆえ、配列は、B.pertussis CN2992のP.69タン
パク質の547番目から552番目のアミノ酸残基から成立っ
ている。B.pertussisの他の菌株及び、B.parapertussis
及びB.bronchisepticaの菌株についての相当する配列
は、Charlesら（1989）によって示されたP.69抗原とP.7
0抗原またはP.68抗原を、それぞれ並べあわせることに
よって容易に決定することが出来る。

より好ましくは、エピトープは、 （a₁）B.pertussis CN2992のP.69遺伝子のヌクレオチド
1876から1944迄によってコードされるアミノ酸配列、 （b₁）B.pertussisの別株、または、B.parapertussisま
たはB.bronchisepticaの菌株の相当するアミノ酸配列：
または （c₁）改変された配列が該配列（a₁）または（b₁）の抗
原性と実質的に同じ抗原性をもつように改変された該配
列（a₁）または（b₁）のを含む。

配列（a₁）は、それゆえ： APQPGPQPPQPPQPQPEAPAPQPである。

本配列は、B.pertussis CN2992のP.69タンパク質の54
4番目から566番目の残基を示す。本配列とB.parapertus
sisのP.70抗原とB.bronchisepticaの抗原P.68に対する
相当する配列（b₁）は、以下のように並べあわせること
ができる。PGPQPPのエピトープは、下線がひいてある。

本配列は、改変を加えた配列が、未改変の配列と実質
的に同じ抗原性を示すように改変することができる。し
たがって、改変配列は相当する未改変配列と同じか、よ
り大きい程度の効果をKendrick試験において示すべきで
ある。改変配列は、未改変配列と実質的に同じアミノ酸
配列をもつが、１こ以上のアミノ酸の置換、挿入または
消去を含んでいる。

上記の如く、配列（ａ），（a₁），（ｂ）または
（b₁）は、エピトープの抗原性に影響することなく、１
こ以上の他のアミノ酸残基によって置換することができ
る。その結果、荷電密度，親水性／新油性、大きさと立
体配置によって物理化学的性質を保ち、したがって、免
疫学的構造を保持する１こ以上の別のアミノ酸によって
置換することができる。候補となる置換は、Ｇの代りに
Ａ及びＡの代りにG;Vの代りにA,LまたはG;Kの代りにR;S
の代りにＴ及びＴの代りにS;Dの代りにＥそしてＥの代
りにD;そして、Ｑの代りにＮ及びＮの代りにＱである。

本発明によれば、第１の型のポリペプチドは、上記の
如くエピトープを提出するところの、例えば40まで、ま
たは30まで、または20までの、50までのアミノ酸から構
成されている。それゆえ、エピトープの両端にさらにア
ミノ酸を加えることができる。1,2,3または４つの追加
残基を定義づけられたエピトープのＮ末端、またはＣ末
端または両端において、加えることができる。

さらに、追加の残基がエピトープのいずれかの末端か
両端に加えられる場合には、これらは、天然の残基であ
る方が望ましい。これらは、B.pertussisのP.69抗原の
配列、B.para−pertussisのP.70抗原またはB.bronchise
p−ticaのP.63抗原の配列から導き出すことができる。
それゆえ、エピトープのためのより飲ましい隣接配列
は、例えば、P.69,P.70またはP.68のタンパク質の全体
の配列において、場合によりエピトープ配列のいずれか
の側に存在する自然の隣接配列であってよい。またシス
ティン残基は、Ｎ−末端またはＣ−末端に加えられてよ
い。特にシスティン残基は、Ｃ−末端のみに加えられて
よい。これは、キャリヤーの結合を容易にし、そして／
または、ポリペプチドの免疫原性を増強するためであ
る。

ポリペプチドは、Ｃ−末端遊離カルボキシル基をもっ
ていてよい。代替として、Ｃ−末端アミドの形であって
よい。医薬的に容認できるポリペプチドの塩が使用され
ることができる。ポリペプチドは、抗原性的に活性であ
る抗原を創出すために、キャリヤーに結合することがで
きる。適切な生理学的に容認できるキャリヤーなどどれ
でも使用できる。ポリペプチドとキャリヤーの間の結合
体を形成することができる。キャリヤーは、例えば、ウ
シ血清アルブミン、チグロブリンオボアルブミン、キー
ホールリンペット（カサガイの１種、Fissurella属）の
ヘモシアニン（KLH）または肝炎Ｂのコア抗原であって
よい。

本発明による２番目の型のペプチドは、定義づけられ
たエピトープを提供するところのキメラ状タンパク質で
ある。キメラ状タンパク質は、典型的には、望まれるエ
ピトープの配列を含むところの50までのアミノ酸の外来
配列を、そのアミノ酸配列が含むように改変されたキャ
リヤータンパク質である。タンパク質のあるアミノ酸配
列によって置換されることができる。代替として、外来
アミノ酸はタンパク質に融合される。例えば、５こまで
のアミノ酸でもよい、10こまでのアミノ酸の介在リンガ
ーは、エピトープとキャリヤーの間に供給されることが
ある。外来アミノ酸配列は、本発明によれば、第１のポ
リペプチドについて記述されたように、長さにおいて変
動することがある。

エピトープは、それが免疫系に提出されるように、キ
メラ状のタンパク質の表面に露出させる。キメラ状のタ
ンパク質は、粒子の形または粒子が凝集した形をとるこ
とがある。このような凝集は、キメラタンパク質の複数
を含むか、そして／またはウイルスの粒子であることが
ある。エピトープを含む外来アミノ酸配列が、融合して
いることがあるタンパク質は、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsA
g,EP−Ａ−0175261）またはＢ型肝炎コアー抗原（HBcA
g,TP−Ａ−63196299）のような粒子形成タンパク質であ
ってもよい。外来配列は、ウイルス（GB−Ａ−212506
5）の表面上に露出したウイルスタンパク質の配列に挿
入されることがある。ウイルスタンパク質は、ウイルス
のキャプシドタンパク質であることがある。

配列は、それゆえ、ポリオウイルス（EP−Ａ−030280
1）のようなピコルナ科のウイルスの抗原部位の１つに
おいて供給されることがある。本エピトープは、１型ポ
リオウイルスの弱毒化株のキャプシドタンパク質上の、
例えば、1,2または３の抗原部位の１つにおいて、また
は２型、もしくは３型ポリオウイルスの抗原部位におい
て提供されることがある。例えば、ウシエンテロウイル
ス属のような、適切に改変された他のピコルナウイルス
が使用されることがある。

ピコルナウイルスの抗原部位のアミノ酸配列は、外来
アミノ酸配列によって完全に、もしくは部分的に置換え
ることがある。外来アミノ酸配列は、１型ポリオウイル
スの弱毒化株の抗原部位１の若干またはすべての代りに
提供されることがより好ましい。弱毒化株は典型的に
は、Sabin 1ワクチン株である。１型ポリオウイルスの
抗原部位の１はVPIキャプシドタンパク質の91番目から1
02番目のアミノ酸残基から成立っている。

本発明のポリペプチドは、合成ポリペプチドである。
それらは、特に50こまでのアミノ酸残基の長さをもつ最
初の型のポリペプチドは、合成によって調製することが
できる。固相または溶液法ペプチド合成を用いることが
できる。それゆえ、ポリペプチドは、単独アミノ酸そし
て／または、でき上ったペプチドまたは２こ以上のアミ
ノ酸を、発明のポリペプチド中でアミノ酸の存在する順
序にしたがって縮合することからなる工程によって構築
することができる。本ポリペプチドは、遊離のＣ−末端
カルボキシル基またはＣ末端アミド基をもつように合成
することができる。望ましければ、ポリペプチドは医薬
として容認できる塩に変換することができる。

固相合成においては、望むポリペプチドのアミノ酸配
列は、不溶の樹脂に結合しているＣ−末端アミノ酸から
順番に構築される。望むポリペプチドができ上ったとき
は、それは、樹脂から開裂される。溶液相合成法が使用
されるときは、ポリペプチドは、Ｃ−末端アミノ酸から
再び合成することができる。この酸のカルボキシル基
は、適切な保護基によって、全体を通じて保護されたま
まであり、合成の終りに除去される。

固相または溶液相のいずれの技術が使用されるにせ
よ、反応系に与えられる各アミノ酸は、保護されたα−
アミノ基と活性化されたカルボキシル基をもっている。
アミノ基は、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル
（Fmoc）またはｔ−ブトキシカルボニル（Boc）基によ
って保護することができる。カルボキシル基は、ペンタ
フルオロフェニルまたは１−オキソ−２−ハイドロキシ
−ジヒドロベンゾトリアジンエステルとして活性化でき
る。各縮合段階は、ダイサイクロヘキシルカルボジイミ
ドまたは１−ハイドロキシトリアゾールの存在において
行うことができる。

例えば、リジンの側鎖アミノ基、スレオニンの側鎖ハ
イドロキシル基またはシスティンのSH基（スルフヒドリ
ル基）のような側鎖の官能基も典型的に保護される。合
成における各段階の後、αアミノ保護基は除去される。

しかし、一般に側鎖の保護基は、必要であれば保持さ
れるが合成の終りにおいてのみ除去される。

ポリペプチドは、望まれるように、Ｃ−末端カルボキ
シルまたはアミド基をもった状態で調製される。固相ペ
プチド合成においては、これはＣ−末端が樹脂支持体に
どのように結合されているか、そして／または、最終ペ
プチドが樹脂からどのように開裂されるかによって決定
されることとなる。典型的には、樹脂は、スチレン、そ
して／またはジウイニルベンゼンポリマーである。Ｃ−
末端アミノ酸は、トリフルオロ酢酸中のHBrまたはHFの
ような強酸によって開裂することができ、Ｃ−末端カル
ボキシル基を与えることができるところのエステル結合
によって樹脂に結合することができる。アンモニア分解
によって、その代りに相当するアミドを与えることがで
きる。

固相合成によって、ポリペプチドアミドを得る代替法
は、ポリペプチドのＣ−末端アミノ基が、ペプチドアミ
ノベンツヒドリル結合を介して、樹脂に結合されるよう
処置をとることである。これは、ダイサイクロヘキシル
カルボジイミドでカップリングを行うことによって形成
することができる。そして、HFで典型的には低温で開裂
することができる。溶液相合成については、Ｃ−末端カ
ルボキシル基またはアミド基が存在するかどうかは、Ｃ
−末端アミノ酸のカルボキシル基がいかに保護されてお
り、そして合成の終了時に保護基がいかに取除かれるか
によることがある。Ｃ−末端カルボキシル基をもったポ
リペプチドは、Ｃ−末端アミド基をもったポリペプチド
に交換することができ、その逆も行うことができる。

本発明による両方の型のポリペプチドは、組換え体DN
A方法論によって、特に （ｉ）該ポリペプチドをコードするDNA配列を組み込
み、適当な宿主中に提供されたとき、該ポリペプチドを
発現することができる発現ベクターを調製し、そして、 （ii）該ポリペプチドの発現が起ることができるように
する該宿主において、該ベクターを供給することによっ
て調製することができる。

このようにして、望むポリペプチドをコードするDNA
配列が提供される。問題のDNA配列を組込み、適切な宿
主に提供されるとき、問題のポリペプチドを発現するこ
とができるところの発現ベクターが調製される。問題の
DNA配列は、ベクター中において翻訳開始部位と停止部
位の間に存在する。適切な転写及び翻訳調節要素、特に
そのDNA配列のためのプロモーターと転写停止部位も提
供される。問題のDNA配列は、ポリペプチドの発現がベ
クターと適合性の宿主中で起ることができるようにする
ような正しい枠組みにおいて提供される。

キメラ状のタンパク質の場合は、外来のアミノ酸配列
をコードするDNA断片は、問題のエピトープが、タンパ
ク質の表面上に露出したキメラ状タンパク質の部分とし
て発現されることができるようにする位置において挿入
される。そうすれば、キメラ状のタンパク質が発現され
る。ベクターを宿している細胞は、発現が起るよう培養
される。キメラ状タンパク質の型によって、タンパク質
は、粒子となって自ら集合することがある。

適切な宿主−ベクター系は、すべて使用することがで
きる。ベクターは、プラスミドであってよい。その場合
は、例えばE.coliやS.cerevisi−aeのようなバクテリア
や酵母を使用することができる。代替として、ベクター
はウイルスベクターであってもよい。これは、ポリペプ
チドの発現を起させるために、CHO細胞のような哺乳動
物の細胞系の細胞を形質転換するのに使用される。

本発明にしたがうエピトープは、１こ以上のヘルパー
Ｔ細胞（Th−細胞）のエピトープに結合させることがで
きる。Th−細胞エピトープは、抗体産生のための援助を
引出すことができる部位である。Th−細胞のエピトープ
は、宿主抗原提示細胞の表面において、クラスIIの主要
組織適合（MHC）分子と結合することができ、その後、
Ｂ−細胞は、Ｂ−細胞の分化と増殖を誘発するために、
Ｔ−細胞の受容体と３分子複合体の形で相互作用する。

Th−細胞エピトープは、本発明のポリペプチドの最初
の型と、種々の方法で結合することができる。グルタル
アルデヒド重合を使用することができる。そして、その
中では、発明のポリペプチドは、それらのアミノ基を介
して、Th−細胞エピトープを提供するポリペプチドと共
重合される。本発明のポリペプチド及びTh−細胞エピト
ープを提示するポリペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ハイドロキシ−サクシリミドエステル（MB
S）のようなヘテロ２官能性架橋結合剤を介して、一緒
に結合させることができる。

本発明のポリペプチドは、代替策として、ペプチド結
合を介してTh−細胞エピトープを提示するポリペプチド
に対して、そのＣ−末端またはＮ−末端において結合さ
せてよい。これは、本発明のポリペプチドとTh−細胞エ
ピトープを提出するポリペプチドとの共直線状合成また
は２つのポリペプチドが、一緒に融合している融合タン
パク質を発現するために、上記の如くの組換え体DNAの
技術を使用することによって達成される。いずれの方法
においても、適切なTh−細胞エピトープは、いずれも使
用することができる。

Th−細胞エピトープは提供するより好ましいポリペプ
チドは、Ｂ型肝炎コア抗原（HBcAg）である。本発明の
最初の型のポリペプチドは、HBcAgに化学的に結合させ
ることができる。そのアミノ末端に、本発明のポリペプ
チドが結合しているHBcAgを含むところの本発明の２番
目の型のポリペプチドにしたがって、融合タンパク質を
作るためには、組換え体DNA技術を使用することができ
る。問題のエピトープは、HBcAgのアミノ末端に直接融
合することができる。代替として、その配列は、介在リ
ンカーを介してHBcAgに融合させることができる。この
ようなリンカーは、１こ以上、例えば10こまでのアミノ
酸残基から構成することができる。

本発明のポリペプチドは、B.pertussis,B.parapertus
sisまたはB.bronchisepticaに対するワクチンとして有
用である。ポリペプチドの効果的な量が、ワクチン接種
が必要なときに、宿主に投与される。ポリペプチドは、
経口または非経口、例えば、皮下または筋肉注射で投与
されることができる。本ポリペプチドは、FHAとともに
与えてもよい。この方法で、百日咳に対する免疫は、ヒ
トにおいて誘導することができる。B.bronchisepticaに
対する免疫は、哺乳動物において誘導することができ
る。

典型的には、ポリペプチドは、投与あたり１乃至1000
μｇの量、より好ましくは、投与あたり10から100μｇ
の量において、経口または非経口投与される。単回投与
を行うことができ、または複数投与量を、ある期間にわ
たって投与することもできる。FHAが投与されるとき
は、それは、投与あたり20から75μｇの量において使用
することができる。FHAは、典型的な場合には、本発明
のポリペプチドと同じワクチン製剤として投与される。

本発明のワクチンは、発明のポリペプチド、随意に添
加してもよいFHA及び医薬的に容認し得るキャリヤーま
たは希釈剤から成っている。担体または希釈剤は、例え
ば、等張食塩水溶液のような抗原を患者に導入する媒体
として使用するのに適した液体媒体ならなんでもあって
もよい。また、ポリペプチドは、免疫応答を刺戟し、そ
の際、ワクチンの効果を増強するためのアジュバンドと
ともに提供されることができる。適切な生理学的に容認
できるアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリン
酸アルミニウムである。

ワクチン製剤は、抗原性ポリペプチドの0.01から5mg/
ml、望ましくは、0.03から2mg/ml、最も望ましくは、0.
3mg/ml範囲内における最終濃度を含むように提供される
のが便利である。製剤化後、ワクチンは無菌容器に入
れ、容器を封じ、低温、たとえば、４℃で貯蔵すること
もあれば、あるいは凍結乾燥することもある。

このような製剤の１つ以上の用量を免疫を誘導するた
めに宿主に投与することができる。各投与量は、0.1か
ら0.2ml、好ましくは、0.2から1ml、最も好ましくは、
約0.5mlのワクチンであることが推奨される。それゆ
え、ワクチン製剤の効果的な量の投与によって免疫を誘
導することができる。

以下の例は、本発明の具体的に説明する。それらに付
随している図においては： 第１図は、ベクターpWYG7の構築を示す。

第２図は、GAL7プロモーター領域のヌクレオチド配列
を示す。合成されたプロモーターは、Xho IからBam HI
断片に相当する、Bam HIの下流の領域は、RNAの開始部
位（↓）とイニシエイティングATG（下線が引いてあ
る）を含む天然のGAL7中に存在している。Bam HI部位を
与えるために変更された２つの塩基対に下線が引いてあ
る。

第３図は（その1,2及び３）は、pWXG7HBPの構築を示
す。

第４図（その１）は、GAL7の翻訳されないリーダー配
列とHBcAg遺伝子の５′領域を含む合成オリゴＡのヌク
レオチド配列を示す。

第４図（その２）は、想定されたBB05のエピトームを
コードしている合成オリゴＢのヌクレオチド配列を示
す。

第５図は、（１）pWYG7HBF（FMDペプチド−HBaAg融合
を発現する）、（２）pWYG7HBF、（３）プラスミドな
し、及び（４）pWYG7HBC（HBcAgを発現する）で形質転
換された誘導酵母細胞からの例２（６）における可溶性
タンパク質のウエスターンブロットの結果を示す。ブロ
ットは、ウサギ抗−HBcAg血清とヒツジ抗ラビットIgGと
ペルオキシダーゼ結合体を用いて展開した。ゲル中に、
30K,21.5K,及び14.3KDaのサイズマーカーの位置が示さ
れている。

第６図は、例２（７）中のHBP融合タンパク質の蔗糖
密度勾配遠心分離の後のドットブロット分析の結果を示
してある。分画１は最低部の分画であり、分画20が最高
部の分画である。抗−HBcAg血清と反応する物質はすべ
て、真中の分画にあり、HBPが完全に粒子として集合し
ていることを示している。

第７図は、HBP融合タンパク質によって提供されたペ
プチド683,684と685及びエピトープが、そこから由来し
ているところのP.69の領域を示す。BB05/コアーは、BB0
5と結合する。ペプチド683は、BB05,BB07,E4A8とE4D7と
結合する。ペプチド684;は結合しない。ペプチド685
は、PBE3と結合する。アミノ酸配列の番号づけは、成熟
した（すなわち、シグナル配列がプロセッシングを受け
た後の）P.69の残基を指している。

第８図は、B.pertussisのP.69タンパク質の残基505か
ら603をカバーしているペプチドのモノクローナル抗体
での分析を示している。

例1:ペプチドの調製 以下に示すペプチドは、Hunghten（Hunghten,PNAS,8
2,5131−5135,1985）によって記述されたMerrifield法
（Merrifield,JACS,85,2149−2154,1963）の変法を使用
して合成された。

ペプチド683: （本発明のペプチド） ペプチド684: ペプチド685: ペプチド683は、P.69遺伝子のヌクレオチド1876から1
962によってコードされているアミノ酸で構成されてい
て、カルボキシル末端に１つの追加の非天然システィン
残基をもっている。ペプチド684は、P.69遺伝子のヌク
レオチド1948から2031によってコードされているアミノ
酸で構成されている。そして、カルボキシル末端に１つ
の追加の非天然システィン残基をもっている。ペプチド
685は、P.69遺伝子の2014から2100のヌクレオチドによ
ってコードされたアミノ酸で構成されていて、カルボキ
シル末端に、１つの追加の非天然システィン残基をもっ
ている。

各ペプチドは、ｐ−メチル−ベンツヒドリルアミンジ
ビニルベンゼン樹脂上で合成された。各アミノ酸上のα
−アミノ保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル（Boc）で
あった。各カップリングのサイクルは、以下の通りであ
る： 1.ジクロロメタンで樹脂を10分間洗う。

2.5％ジイソプロピルエチルアミンを含むジクロロメタ
ンで２分間ずつ３回洗う。

3.ジクロロメタンで１分間ずつ２回洗う。

4.t−ブトキシカルボニルアミノ酸のジクロロメタン溶
液を、0.3Mジイソプロピルカルボジイミドで60分間カッ
プリングを行わせる。ＮとＱについては、カップリング
は、ジメチルホルムアミド中で、0.3Mジイソプロピルカ
ルボジイミドと、0.125Mトリハイドロキシベンゾトリア
ゾールによって行った。

5.3と同じ。

6.ジクロロメタン中50％トリフルオロ酢酸で脱保護基を
20分かけて行う。

7.ジクロロメタン洗滌１分間を６回。

8.2に戻る。

カップリングのサイクルが完了したときは、ペプチド
は、スカベンジャーとしてのアニソールの10％の存在下
で、１時間、弗化水素処理して、レジンから開裂させて
遊離とした。この方法では、ペプチドは、カルボキシル
末端がアミド基として得られた。それは、次にエーテル
で洗い、乾燥し、15％酢酸に溶かして凍結乾燥した。

例2:B.pertussisのエピトープとHBcAgの融合タンパク質
（HBP）の酵母における発現 1.総論 P.69の遺伝子のヌクレオチド1855から1944に相当する
アミノ酸配列を、HBcAgのアミノ−末端に遺伝的に融合
させた。その結果得られた融合タンパク質は、酵母にお
いて効率的に発現され、B.bronchisepticaの68kDaのタ
ンパク質に対して作られたモノクローナル抗体（Mab）B
B05と反応したが、B.pertussisのP.69と交差反応する。
融合タンパク質は、コア−粒子の中に集合し、FHAと一
緒にして使用したとき、kendrick試験におけるB.pertus
sisによる誘発に対して保護を与えた。

2.酵母発現ベクターpWYG7の構築 調節されているGAL7プロモーターを担っていた複数コ
ピーベクターpWYG7から、Saccha−romyces cerevisiae
において、融合タンパク質が発現された。Wellcomeにお
いて構築されたベクターpWYG7は、HBP、すなわち、HBcA
gのアミノ末端に融合した主要エピトープからなる融合
タンパク質の発見のために使用された。ベクターpWYG7
は、カナマイシン抵抗性マーカー（Kan^r）及び酵母ガラ
クトース調節性GAL7プロモーターを含むように改変され
た２μベクターpJDB219（Beggs,Nature275,104−109,19
78）から誘導されている。

pWYG7の構築は、第１図中に概要がまとめられてあ
る。まず、Kan^rマーカー（pUC4KからのHinc II断片;Vie
iraとMessing,Gene19,259,1982）をpJDB219の独特なSma
I部位につなげ、Kan^rtet^rベクターpJDB219Kを与えた。
第２に、合成GAL7プロモーター断片（Xho I−BamHI断
片、配列が第２図に示してある）が、pJDB219Kの独特な
Sal IとBam HI部位にクローニングされた。その結果得
られたベクター、pWYG7は、酵母２μプラスミドのFLP遺
伝子転写ターミネーター（SuttonとBroach,Mol.Cell.Bi
ol.５,2770−2780,1985）の上流に独特なBam HIとBcl I
I部位をもったGAL7プロモーターをもっている。pWYG7か
ら発現されるべき外来遺伝子は、Bam HIとBcl I部位の
間に挿入される。GAL7プロモーター断片のデザインは、
以下に論議されている。

完全なプロモーター活性を示すGAL7遺伝子のDNA上流
の最小の断片は、欠失地図作成（Tajimaら、Yeast 1,67
−77,1985）によって明確化された。この知識に基い
て、260bpのGAL7プロモーター断片が合成された（配列
については第２図参照）。260bpプロモーターは、４つ
の重なり合ったオリゴヌクレオチドとして、Pharmacia
Gene Assembler（プロトコルは、Pharmaciaから提供さ
れた）を使用して合成された。これらのオリゴヌクレオ
チドは、標準的技術を使用して、リン酸化され、アニー
リングを行ってからXho I−Bam HIで切断したpIC−20H
（Marshら、Gene32,481−485,1984）につなげた。陽性
のクローンを同定し、それらのDNAは、ユニバーサル及
びリバースシーケンシングプライマー（Hong,Biosci.Re
port 2,907,1982）を用いた２重鎖DNA配列決定法を使用
して決定された。GAL7挿入部分の配列が確認され、そし
て、次に、Xho I−Bam HI GAL7挿入部が切出され、上述
の如くPTDB219の中へクローニングされた。

pWYG7中のGAL7プロモーター断片のデザインは、GAL7
メッセンジャーRNAの開始部位の上流にBam HIクローニ
ング部位を作るために、天然のGAL7DNA配列が、僅かに
修正（2bp改変された）されたものである。発現される
べき合成DNAは次にGAL7上流の非翻訳配列とともにGAL7m
RNA開始部位が導入されるようにBam HI部位へ、合成DNA
で連結される。このようにして、プロモーターの下流の
最初の非酵母DNAは、外来遺伝子のイニシエイティングA
TGのコドンであり、生産された転写体は、翻訳の効率を
減少する可能性がある外来のリーダーよりも、むしろ酵
母のGAL7リーダーをもつ。

3.HBP融合タンパク質の酵母発現ベクターpWYG7HBPの構
築 HBPについてのBam HI−Bam HI発現ユニットは、中間
体ベクターpKGC−69K中に組立てられた。イニシエータ
ーATGコドンの上流にGAL7配列を含むこのベクターは、
最初に、イニシエーターATGにおいて、遺伝子操作したN
co I（CCATGG）部位でHBcAgベクター,pKGCを構築するこ
とによって造られた。予知されたB.pertussisエピトー
プをコードしているDNAは、次に合成Nco I−Nco Iオリ
ゴヌクレオチドリンカーとして挿入された。pKGCとpKGC
−69K、そして最終的発現ベクターpWYG7HBPの構築につ
いての全体的スキームは、第３図（その1,2及び３）に
おいて示されている。

（ｉ）pKGCの構築 HBcAgの３′末端配列（AVa I部位から停止コドンま
で）を含むSal I−EcoR Iリンカーが、pUC18のSal IとE
coR I部位（VieiraとMissing,1982）の間でつながれ、
プラスミドpKGFを与えた。HBcAg遺伝子の残りは、次
に、pKGFにおいて、３方向の連絡において組立てられ
た。pKGFの2.7KbのHind III−Ava I断片が単離され、
（ｉ）酵母のGAL7の上流配列とHBcAg遺伝子の５′未満
を含んでいる87bpの合成（リン酸化された）Hind III−
Mae III断片（オリゴA,第４図（その１））、そして、
（ii）遺伝子の中心部分の多くを含んでいるpEB208（Cl
arkら、Nature330,381−384,1987）からの500bp Mae II
I−Ava I断片へと連結された。その結果生じたプラスミ
ド、pKGCは、pWYG7からのHBcAgの発現のための中間体ベ
クターである。pKGCの合成された領域の配列は、ユニバ
ーサル及びリバースシーケンシングプライマーでの２重
鎖法を用いて確認された（Hong,1982）。

（ii）pKGC−69Kの構築 pKGC中のHBcAg遺伝子は、イニシエターATGにおいて、
特異なNco I（CCATGG）部位をもつように改変された。
それゆえ、Ｎ末端ペプチド融合は、この部位にNco I−N
co I DNA断片を挿入することによって作ることができ
た。P.69抗原のエピトープは、プロリンに富んだ繰返し
部分に存在することが予知されていたので、適当なオリ
ゴヌクレオチドの対が、このエピトープをコードするた
めに合成された。作られたオリゴヌクレオチドと相当す
るアミノ酸配列が、第４図（その２）に与えられてい
る;B.pertussis DNAは、酵母の最適コドンを与えるため
に改変された。pKGCは、Nco Iで消化され、アニーリン
グされた、リン酸化されていないオリゴヌクレオチド
は、リンカーティリング法（Latheら、BRL Focus ６,is
sue 4,1984）を用いて、中にクローニングされた。挿入
部をもった、その結果生じたプラスミドから、必要とさ
れた配置をもったものを、挿入体の２重鎖配列決定によ
って選択した。その結果生じたベクターpKGC−69Kは、p
WYG7への転移のためのBam HI−Bam HI断片の源として使
用することができた。

（iii）pWYG7HBPの構築 pKGC−69KからのBam HI−Bam HI断片が単離され、Bam
HIとBcl Iで消化され、コウシの小腸のアルカリ性ホス
ファターゼで処理されたところのpWYG7（dam^-DNA）へク
ローンされた。形質転換の後、Kan^rコロニーは、正しい
方向配置の挿入体につき試験を行い、これらのプラスミ
ドをpWYG7HBPと呼んだpWYG7HBPを含むE.coli MC1061
を、1989年７月28日に、受入れ番号NCIMB40176の下にNa
tio−nal Collection of Industrial and Marine Bacte
ria（NCIMB）に寄託した。

4.pWYG7HBPでの酵母の形質転換 ベクターpWYG7HBFを、Saccharomyces cerevisiae株S1
50−2B（a,leu 2,his 3,ura 3,trp 1,McCleodら,Cold S
pring Harbor Symp.Quant.Biol.49,779−787,1984）
に、Itoらのリチウム形質変換操作（J.Bact,153,163−1
68,1983）を使用して導入した。形質変換した酵母の細
胞を、YPDブロス（Shermanら,Method in Yeast Genetic
s,Cold Spring Harbor,New York,1983）中、30℃で一夜
インキュベート後、選択培地上で、プレーティングアウ
トを行った（YPD＋500μg/mlG418）。これによりG418−
抵抗性の発現ができるようになり、形質転換頻度を増加
する。G418^rとして出現したコロニーは、ロイシンを欠
いている最少必須培地上で、やはりpWYG7HBPによっては
付与されているLeu⁺表数型についてチェックするために
チェックを行った（YNB＋glucose＋histidine＋uracil
＋tryptohan,shermanら、1983）。正の形質転換体（G41
8^r＋Leu⁺）は、発現分析のために使用された。

5.HBPの発現のガラクトース誘導 形質転換体は、２％ラフイノースと500μg/mlのG418
を含むYP培養中で30℃で軌道式シエーカーで、中期−対
数増殖期（107細胞/ml）まで培養した。40％ガラクトー
スの部分量を最終濃度２％まで加え、さらに、48時間イ
ンキュベートした。細胞は、次に低速の遠心分離で収穫
し、１回蒸留水で洗い、氷冷した細胞破壊用バッファー
（20mMナトリウムホスフェートpH7.0,0.1％トリートン
ｘ−100,4mMフェニルメタンスルフォニルフロオライド,
4mM EGTA及びそれぞれ２μg/mlのペプスタチン，アンチ
パイン，リユーペプチンとキモトリプシン;250mlの培養
液からの細胞に対して5ml）中に再懸濁した。酸で洗っ
たガラス球（0.45mm）を加え、そして、細胞は、激しく
Vortex上で混和することによって破壊した、粗溶菌液を
15分間10,000gで遠心分離し、澄明にした。澄明にした
上清のタンパク質濃度を、Bio Radタンパク質アッセイ
を用いて定量した（Bio Rad,製造業者の使用説明にした
がって）。そして、材料は、小部分にわけて−20℃で保
存した。

6.発現について溶菌液の解析 誘発された酵母溶菌液中のタンパク質を、SDS−ポリ
アクリルアミドゲル中で分離することによって解析した
（Laemmli Nature277,680−685−1970）。各列毎に50μ
ｇの可溶性タンパク質をのせ、負の対照として、誘発し
たS150−2Bの抽出物をのせた。pWYG7HBP−形質転換細胞
抽出物において、24,000kDa（示していない）に移動す
る新しいタンパク質のバンドが、クーマシーブルー染色
によって検出された。このポリペプチドが、HBPである
ことは、HBcAgまたはBB05抗血清でウエスターンブロッ
ト分析を行うことによって確認した（第５図、HBcAg血
清での結果）。ELISA定量のデータにより、10−30％の
細胞タンパク質の発現の水準が示された。

7.酵母において発現されたHBPの融合タンパク質は会合
してコア−粒子を形成する 酵母中てま作られたHBPタンパク質がコア−粒子とし
て存在するかどうかを試験するため、誘発した細胞抽出
物を、15％−45％のw/v蔗糖密度勾配（リン酸バッファ
ーを加えた食塩水中）の上に重ね、ベックマンSW28ロー
ター中で遠心分離（28,000rpm,4時間）した。グレーデ
ィエントを分画し、各分画からのその小部分を、ニトロ
セルローズ格子上にスポットし、フィルターをウエスタ
ーンブロット操作にかけることによって、各画分を、HB
cAg−またはB.pertussisエピトープ反応性物質の存在に
ついて分析した（ドットプロットは第６図に示してあ
る）。

最大の反応性は、勾配の中央の分画に検出され、勾配
の頂点には、なんら検出されなかった。このことは、酵
母中で作られたHBPタンパク質のすべては、会合して、
蔗糖勾配中で沈澱するところのコアー粒子を形成してい
ることを示している。確認のため、ピークの勾配分画か
らの一部分が電子顕微鏡（ホスホタングステン酸染色）
検査のため送付された。多数のウイルスコアー粒子が明
らかに見られた（示されていない）。

例3:ドット−ブロット抗体ハイブリッド形成 例１（2mg/ml）において調製された３つのペプチドの
水溶液と例２において調製されたHBPの融合タンパク質
を、ドットプロット抗体ハイブリッド形成実験に使用し
た。手短かに記すと、10μのペプチドまたは融合タン
パク質を、ニトロセルローズ膜に適用し、乾燥させた。
モノクローナル抗体でのフィルターハイブリッド形成実
験は、正常の方法によって行われた（例えば、“Antibo
−dies,a laboratory manual"p.178,Ed.E.MarlowとD.La
ne編,1988,Cold Spring Harbor Laboratoryを参照）。

モノクローナル抗体は： B.bronchisepticaからの68kDaタンパク質に対して作
られたが、B.pertussisからのP.69と交差反応するBB05
及びBB07;そして、B.pertussisに対して作られた一連の
７種のモノクローナル抗体であった。

その結果は、表１と第７図に示されている。第７図
は、ペプチドがその周辺から作られたP.69の領域を示し
ている。３種の化学的に合成されたペプチドは、追加の
非天然カルボキシル末端システィン残基をもっている。
HBP融合タンパク質は、Ｎ−末端メチオニン残基をもっ
ている。その結果から、問題としているエピトープは、
以下の配列をもった領域にすることが確立された。

例4:Kendrickの試験 1.ペプチドのカップリング 例１のペプチドは、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ハイドロキシスルホサクシニミドエステル（MBS）を、
ヘテロ２官能性架橋−リンカー（Liu,F.ら,Biochemistr
y18,690,1979）として使用して、付加されたＣ−末端シ
スティン残基を通じて、キーホールリンペットヘモシア
ニン（KLH）に結合させた。手短かに述べると、透析し
たKLHを、室温でジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し
たMBSと反応させ、次にＧ−25カラムを通す。KLHのタン
パク質ピークをプールし、遊離ペプチドに加えた。pH
は、次に７と7.5の間に調節し、室温で３時間攪拌した
後結合したペプチドを−20℃で貯蔵した。KLH濃度は、2
0mg/mlを越えてはならず、MBS/KLHのモル比は40:1であ
り、そして、反応においては、DMFの最終濃度は30％以
下であるべきである。ペプチド683,684及び685は、5mg
ペプチドあたり、2.5mgのKLH（1:2重量／重量の比）を
使用して結合された。

2.フィラメント状赤血球凝集素（FHA） FHAは、この分野の技術においてよく知られている方
法によって調製できる（ArachとMunoz J.J.（1970）,In
fect.Immunolog 25 764−767;Ashworthら（1982）Infec
t.Immun.37 1278−1281参照）。ただし、以下の操作手
順においては、FHAは以下のプロトコルに従って調製さ
れた。

FHAの精製:B.pertussis Tomaha,またはBP357〔LPFを
分泌しないA.A.Weissら（1983）のTh5トランスポゾン変
異株〕は、650mlのCosterフラスコ中で、StainerとScho
teの培地中で（各150mlを入れる）、37℃、５日間培養
した（Satoら,InfectionとImmu−nity41,313−320,198
3）。遠心分離（30分,6000×ｇ）の前に、タンパク加水
分解阻害剤として、50μＭの1,10−フエナンスロリン１
加水物を培養物に加えた。無細胞上清は、30×150mmの
ハイドロキシアパタイト（BD₄）カラムに加え、順次pH8
の10mMホスフェートバッファー,pH7.1の100mMホスフェ
ートバッファーで、基線が安定するまで洗滌した（すべ
て室温、そして500ml/時間のポンプによる送液速度を用
いた）。

保持された物質は、100mMホスフェートバッファーに
加えた0.5M NaClで溶出し、アヒルの赤血球細胞を凝集
させるピーク分画をプールした。プールした分画を、４
℃で25−30倍容量の0.025Mビス−トリス／塩酸バッファ
ーに対して一夜透析した。沈澱したFHAは、遠心分離し
て集めた（20分,8000×ｇ）。次の段階は、FHA（LPFと
同様に）が、40mMβ−アラニンバッファー,pH3.5に溶解
することを見出したCowellら（IV巻の中、Bacterial Va
ccine,371−379,Seminars in Infections Dise−ase,We
insteinとFields編:Thieme Varlag,New York,Stuttgar
t,1982）によって示唆を受けたものであった。沈澱した
FHAは、可能な最小容量の３−アラニンバッファー（１
中3.57g ３−アラニンと0.35gの蟻酸）に溶解し、不
溶物を遠心分離によって除去し、そして透明な上清を、
同じバッファーで平衡に達したUltrogel ACA34のカラム
（25×50mm）に適用し、同じバッファーで溶出した。

赤血球凝集物質は、鋭いピークとなって現れ、続いて
肩が現れた。肩の物質は捨て、鋭いピークからの分画を
プールし、凍結保存し、0.025Mビス−トリスバッファー
に対して透析を行うことによって再沈澱させ、さらに小
容量の３−アラニンバッファーに溶解した。溶解度は、
約2.5mg FHA/mlである。酸性pHで凍結（−20℃または
−40℃）した物質は、そのELISA反応性とSDS−DAGEゲル
における外観から判断して、安定と思われた。それは15
0−100KDに優勢に、３つの強いバインドを形成した。

3.Kendrickの試験 これは、pertussisワクチンについてのW.H.O.の必要
事項にしたがって、体重14−16gのMFIまたはMICl（OLA
C,カテゴリー3,B.bronchisepticaをはじめとする大抵の
病原菌が含まれていない）を使用して遂行された。0.5m
lの容量における抗原は、同時に腹腔内に接種され、再
高濃度の希釈液と３回の連続４倍希釈液から成ってい
た。２週間後に、マウスは推奨された誘発株、18−323
（100−200LD₅₀）を用いて脳内で誘発を行った。各群に
おける生存者の数を、平行線プロビット解析のプログラ
ムを使用して、British Pertussis Reference Vaccine
66/84に対する相対的力価の計算に用いた。その結果は
表２に示されている。

この結果から、FHAと化学的に合成された３つのペプ
チドすべてか、またはHBPの融合タンパク質との併用
は、FHA単独よりももっと強力であることが明らかに示
されている。

例5:合成ペプチドを使用したエピトープ地図作成（Peps
can） １つのアミノ酸残基が重なっている６このアミノ酸か
らなるペプチドが、Geysenら（PNAS USA81,1984,3998−
4002）によって記述された固相のポリエチレンピン上で
合成された。B.pertussisのP.69抗原の505から603番目
のアミノ酸残基をカバーする94種の６このアミノ酸から
なるペプチドを合成した。ペプスキャンペプチド１は、
Thr（505）−Asp（501）であった。ペプスキャンペプチ
ド94は、Ala（598）−Leu（603）であった。

ペプチドのモノクローナル抗体に対する反応性は、ピ
ンを１−２時間、または一夜抗体中でインキュベートし
た後、洗滌し、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス交
体中でインキュベートすることによって定量した。（mA
b）BB05は、B.bronch−isepticaからのP.68抗原に対し
て作られた（IgGI）である（Montarezら、Infect.Immu
n,47,1985,644−751）。このmAbは、B.pertussisからの
P.69と交差する中和mAbである。

酵素活性は、ABTS基質溶液中〔100mlのバッファー
（0.1M Na₂HPO₄,0.08Mクエン酸,pH4,30μ過酸化水素
を含む）中の50mgのアジノ−ジ−３−エチル−ベンツチ
アゾジスルホネート（ABTS）〕でピンをインキュベート
し、10−60分後、溶液のA₄₂₀をTitertek Multiscan MC
1100を用いて測定することにより定量した。ピンは0.1M
Na₂HPO₄,0.1％ SDS,0.01Mβ−メルカプトエタノール中
65℃で超音波処理し、その後の抗体中のインキュベーシ
ョンの前に結合した抗体と染色複合体を除去した。結果
は第８図に示されている。

第８図からみることができるように、mAb BB05は、ペ
プスキャンペプチド43（配列PGPQPP）のみを認識した。
これは、ペプチド683の認識と一致しており、BB05エピ
トープを、P.69の（Pro−Gln−Pro）_５の繰返しの領域
中に、その位置を突きとめた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ベクターpWYG7の構築を示す。 第２図は、GAL7プロモーター領域のヌクレオチド配列を
示す。 第３図（その1,2及び３）はpWXG7HBPの構築を示す。 第４図（その１）は、GAL7の翻訳されないリーダー配列
とHBcAg遺伝子の５′領域を含む合成オリゴＡのヌクレ
オチド配列を示し、第４図（その２）は、合成オリゴＢ
のヌクレオチド配列を示す。 第５図は、ウエスターンブロット分析の結果を示す写真
である。 第６図は、ドットブロット分析の結果を示す写真であ
る。 第７図は、P.69領域を示す。 第８図は、モノクローナル抗体によるペプチドの分析結
果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ネイル フレイザー フェアーウェザー イギリス国ロンドン，イクシビジョン ロード，テクノロジー アンド メディ スン，インペリアル カレッジ オブ サイエンス、ティパートメント オブ バイオケミストリー気付 (72)発明者 マイケル アンソニー ロマノス イギリス国ハートフォードシャー，ステ ィーブネイジ，グンネルズ ウッド，ロ ード，グラスコ ウエルカム リサーチ アンド ディベロップメント気付 (56)参考文献 特開 昭63−196299（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−501799（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−505725（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｍａｙ，1989，Ｖｏｌ. 86，Ｎｏ．10，ｐ．3554−3558 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/235 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】50個までのアミノ酸残基の長さのポリペプ
   チドであって、Bordetella pertussisのP69抗原の断
   片、Bordetella bronchisepticaのP68抗原の断片または
   Bordetella parapertussisのP70抗原の断片であり、か
   つPro Gly Pro Gln Pro Proのアミノ酸配列を含むポリ
   ペプチド。
2. 【請求項２】以下のアミノ酸配列を含む請求項１記載の
   ポリペプチド。
3. 【請求項３】請求項１または２記載のポリペプチドと、
   該ポリペプチドに連結した生理学的に許容しうる担体を
   含むコンジュゲート。
4. 【請求項４】キャリアー蛋白質、とそれに融合した請求
   項１または２記載のポリペプチドを含む融合蛋白質。
5. 【請求項５】該キャリアー蛋白質はＢ型肝炎コアー抗原
   であり、該ポリペプチドはＢ型肝炎コアー抗原のアミノ
   末端に融合している請求項４記載の融合蛋白質。
6. 【請求項６】該ポリペプチドの配列が以下に示す配列で
   ある請求項５記載の融合蛋白質。
7. 【請求項７】宿主をBordetella pertussis、Bordetella
   bronchisepticaまたはBordetella parapertussisに対
   してワクチン化するためのワクチンであって、薬学的に
   許容しうる担体または希釈剤と、請求項１または２記載
   のポリペプチド、請求項３記載のコンジュゲート、ある
   いは請求項４から６のいずれかの融合蛋白質とを含むワ
   クチン。
8. 【請求項８】更にフィラメント状赤血球凝集組素を含む
   請求項７記載のワクチン。