JP3049961B2 - 細菌検査装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体または液体中の微生
物や体細胞の数を計測する細菌検査装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ここでは、細菌を微生物、体細胞なども
含めて、これらの総称として取り扱うが、これら細菌数
を計測することは、食品，醸造，臨床，上下水および半
導体などの各分野における品質管理や環境管理などを行
なう上で極めて重要である。例えば、微生物の菌数また
は微生物活性の計測には、従来、コロニー計数方法が一
般に用いられている。コロニー計数方法は、寒天培地に
試料液の一定量を散布または混合して培養し、生じたコ
ロニーを計数する方法であるが、培養時間に数十時間を
必要とし、操作も煩雑である。

【０００３】その他、ＡＴＰをルシフェリン−ルシフェ
ラーゼ基質−酵素混合液で発光させ、その発光量から菌
数を推定するＡＴＰ測定法、細菌を蛍光色素で染色して
観察する方法などがあるが、いずれも操作が煩雑で迅速
性に欠け、精度も悪い。このような従来の方法の欠点を
克服して、迅速で精度の高い方法が近年開発されつつあ
る。例えば、特開平２−５１０６３号公報、雑誌Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ
ｌ．２６，１９８８，ｐｐ１４７−１４８に記載されて
いるように、二次元的に散布された細菌に対して、抗原
−抗体反応を利用して発光酵素を標識し、基質を添加し
たときの発光基点を画像として撮像し計数する方法であ
る。図６はその方法を行なう装置の測定部の要部構成を
示す模式図であり、メンブレンフィルター（以後、単に
膜ということもある）１で濾過した付着細菌２（発光基
点）の発光画像を、カメラレンズ３によって高感度撮像
手段４の入力面５に結像させ、画像信号をケーブル６に
より取り出すものである。この方法は、イメージインテ
ンシファイアーなどの高感度撮像手段を用いることによ
り、測定の迅速性と正確性において優れた特徴を有す
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
文献に示されている方法には、次のような問題がある。
この方法は、撮像手段としてフォトンレベルの感度を有
しながら、前段の光学系で光量の損失があり、その結
果、例えば細菌に含まれるＡＴＰを発光させるような発
光強度の低い反応系には、使用することができない。

【０００５】また、図６に示したように、発光面を上部
から撮像するので、試薬を撮像手段と同期させる自動注
入機構など、本来、細菌付着面の上部に配置されるべき
であるのに、撮像の障害となることから設置し難くなっ
ている。したがって、あらかじめ、発光反応を開始させ
てから、膜を設置し、撮像を行なわざるを得ない。これ
では、発光寿命が短く反応開始後数秒で光量ピーク点と
なるような、例えば殆どのＡＴＰ発光反応には、適用す
ることが困難である。これはこの種の測定の自動化が難
しいことを意味するものである。

【０００６】本発明は上述の問題点を解決し、低発光
量、低濃度でも高感度かつ迅速に測定することができ、
発光反応開始直後から計測可能な発光基点計数による細
菌検査装置を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに、本発明の細菌検査装置は、あらかじめ一定量の試
料をメンブレンフィルターで濾過し捕捉した細菌を、そ
の捕捉位置で所定の試薬を用いて発光反応させ、このメ
ンブレンフィルターを高感度撮像手段の結像面に接続し
た光ファイバープレートの入力面に、細菌付着面で直接
密着させて、発光画像を撮像するように構成したもので
ある。

【０００８】

【作用】以上のように構成することにより、本発明の細
菌検査装置は、光ファイバープレートの開口数で決まる
最大受光効率で、細菌捕捉位置から受光することがで
き、また、メンブレンフィルターを高感度撮像手段の結
像面、即ち入力光ファイバープレートに、細菌付着面で
密着させて設置したために、メンブレンフィルターの裏
面から、発光反応試薬を添加、浸透した後、細菌付着面
で発光反応を開始させ、発光反応開始直後からその発光
画像を撮像することが可能となる。さらに、高感度撮像
手段の入力光ファイバープレートとして、入力像の大き
さを所定の倍率に拡大可能なテーパー型光ファイバープ
レートを用いることにより、膜面の有効視野領域を拡げ
ることができる。

【０００９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき説明する。図
１は本発明の細菌検査装置の測定部の構成を示す模式断
面図である。図１において、図示してない濾過装置によ
り細菌が捕捉されたメンブレンフィルター７は、マルチ
チャンネルプレートを内蔵したイメージインテンシファ
イアーの高感度撮像手段８の一部である入力光ファイバ
ープレート８ａの上に置き、このとき、メーンブレンフ
ィルター７の細菌が付着している面が入力光ファイバー
プレート８ａに接するようにしてある。そして、マルチ
チャンネルプレートを内蔵したイメージインテンシファ
イアーの高感度撮像手段８の内部で増倍された画像を、
出力光ファイバープレート８ｂに蛍光画像として映し出
し、その下方に設置してあるカメラレンズ９と、撮像素
子、例えばＣＣＤカメラ１０によって撮像し、画像信号
として出力することができる。さらに、測定部の蓋１１
には、発光反応基質試薬の注入ノズル１２を設けてあ
り、前処理した後のメンブレンフィルター７の細菌付着
面の裏側から、試薬を注入することができ、表面に浸透
・拡散した時点から発光反応が開始される。高感度撮像
手段８の電圧リード線１３には、光電面８ｃが接地電位
となるように、高電圧をかける。接地電位とするのは、
光電面８ｃに高電圧を印加すると、ウエットな膜７や試
薬に漏電したり、光電面８ｃにノイズを発生させる危険
があるからである。

【００１０】ここで、本発明の細菌検査装置における光
学的な優位性を、前述のカメラレンズによる撮像方式
（図６）との比較で説明する。はじめに、従来法におけ
る菌体位置（基点）からの光が、レンズでマルチチャン
ネルプレート内蔵イメージインテンシファイアーの入力
光ファイバープレート上に結像した様子を模式的に図２
に示すが、図２（ａ）は、膜上の点光源ａ，ｂから追跡
した像面への光線を示す光線追跡図であり、図２（ｂ）
は、光ファイバープレートの開口数（Ｎ．Ａ＝０．１）
で制限された受光角θの光線を、それぞれの基点に逆に
辿った光線追跡図である。図２（ａ）および（ｂ）から
わかるように、通常、像の明るさを左右するのは、レン
ズの大きさと焦点距離、即ちｆ数であるが、光ファイバ
ープレートを入力とする場合は、ファイバーの開口数
（Ｎ．Ａ）で明るさが決定される。しかも、通常膜の大
きさは、光ファイバープレートより大きいので、縮小投
影（倍率＜１）となり、発光基点からの受光立体角度ω
は、ファイバーの受光角度θより小さくなる。即ち、受
光角度θを十分に使っていない。

【００１１】具体的な計算例を挙げてθとωの大きさを
比較してみる。膜の大きさ（線分ｂｃ）を直径３５ｍ
ｍ、光ファイバープレートの有効視野領域（線分ｂ₁ ｃ
₁ ）を直径１５ｍｍ、レンズから膜面までの距離ｆ₁ を
１００ｍｍとすると、レンズの焦点距離（像側焦点距
離）ｆは、４２．９ｍｍである。ここで、レンズの倍率
をｍ、像面における光軸からの変位量をｘとすると、物
点での受光立体角度ωは次式で表わされる。

【００１２】 ω＝ｔａｎ^-1｛（１＋１／ｍ）ｘ／ｆ＋１／ｍ（ｔａｎθ／２）｝ −ｔａｎ^-1｛（１＋１／ｍ）ｘ／ｆ−１／ｍ（ｔａｎθ／２）｝ （１） また、θは Ｎ．Ａ＝ｎ・ｓｉｎ（θ／２）＝０．１ （２） ｎ＝１．００（空気の屈折率） から計算し、１１．５°とする。倍率ｍ（線分ｂｃ／線
分ｂ₁ ｃ₁ ）は２．３３３として、ωの値を計算した結
果、膜の中心部（光軸）で４．９４度、周辺部で４．６
５度であった。

【００１３】これに対して、図３に本発明の装置におけ
る基点の受光角度を説明するための模式図を示す。図３
（ａ）は通常の光ファイバープレートを用いた場合、図
３（ｂ）はテーパー型光ファイバープレートを用いた場
合を表わす。図３に示すように、本発明の装置には、レ
ンズによる結像過程がなく、発光基点１４が光ファイバ
ープレート１５の入力面１５ａに密着しているために、
発光基点１４からの受光立体角は、光ファイバーの受光
角１６に等しく、レンズ自体の光吸収による損失（約１
０％）もない。光ファイバープレート１５を入射径／出
射径比率が４０：１５のテーパー型光ファイバープレー
ト１５に置き換えたときの光透過率８０％、およびメン
ブレンフィルター７と光ファイバープレート１５との間
の液膜層１７の屈折率（約１．３）を考慮するとして
も、レンズによる結像方式に比べて、集光効率は２．８
倍向上することになる。

【００１４】図４（ａ）〜（ｃ）は、ルシフェリン−ル
シフェラーゼによるＡＴＰ発光法を、本発明の装置に適
用して生菌計数を行なったときの過程を示す模式図であ
る。図４（ａ）〜（ｃ）におけるＥ（□印）は酵素、即
ちここではルシフェラーゼ、Ｓ（○印）は基質、ここで
はルシフェリンを表わしている。細菌Ｃが捕捉された膜
表面７ａ上には、あらかじめルシフェリン−ルシフェラ
ーゼ混合液を浸潤させておくので、入力光ファイバー面
１５ａと膜表面７ａとの間には、酵素−基質を含む液膜
層１７ａが存在する。一方、ＡＴＰ１８（・印）は、細
胞内部に細胞膜１９によって閉じ込められているため
に、発光反応は起こらない［図４（ａ）］。

【００１５】ここで膜裏面７ｂから、矢印で示したＡＴ
Ｐ抽出液（通常は界面活性剤など細胞膜を溶解する試
薬）２０を注入すると、膜表面７ａに拡散し、付着して
いた細菌の細胞膜１９が溶解して、内部のＡＴＰ１８は
外部に放出される［図４（ｂ）］。放出されたＡＴＰ１
８は、液膜層１７ａに存在していた発光酵素ルシフェラ
ーゼＥにより、基質ルシフェリンＳと反応して発光（太
い矢印２１）する［図４（ｃ）］。

【００１６】この反応の発光強度の応答特性を図５に示
す。応答曲線は、反応開始数秒で光量ピークに達し、そ
の後急速に光量が減衰する。以上のように、本発明の装
置を用いることにより、膜裏面から試薬の注入が可能と
なり、発光反応初期からの計測が容易に実施される。本
発明は、２次元に分布した発光基点を計数する測定装置
の特に測定部に関するものであり、測定中に出力される
画像信号の後段の処理については、従来と同様であり、
画像信号を所定のフレーム数を積算し、適当な画像処理
を施した後、２値化して計数することができる。

【００１７】なお、本発明の実施例では、高感度撮像手
段としてマルチチャンネルプレートを内蔵したイメージ
インテンシファイアーを用いたが、通常のイメージイン
テンシファイアーを用いてもよい。また、ＳＩＴカメラ
や冷却型ＣＣＤカメラの光電面や撮像素子に光ファイバ
ープレートを直接カップリングして用いることもでき
る。

【００１８】さらに、本発明の装置を用いた発光反応と
して、ルシフェリン−ルシフェラーゼによるＡＴＰ発光
を例に説明したが、細菌内部のＤＮＡを膜上に固定し、
このＤＮＡに発光酵素で標識した抗体またはプローブを
反応させ、最後に発光酵素の基質を添加して発光させる
という方法にも適用することができる。

【００１９】

【発明の効果】本発明の細菌検査装置は、実施例で述べ
た如く、測定部をレンズによる結像方式に代えて、光フ
ァイバープレートを用い、その入力面にメンブレンフィ
ルターの細菌付着面を密着させて設置し、試薬を膜裏面
から注入することができるように構成したために、発光
基点からの光の集光効率を向上させるとともに、発光反
応の開始直後からの計測が可能となり、また測定の完全
自動化を図ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細菌検査装置の測定部の構成を示す模
式断面図

【図２】従来のレンズによる結像方式を示し（ａ）は点
光源から像面への光線追跡図、（ｂ）は像面から逆に辿
った光線追跡図

【図３】本発明の装置における基点の受光角度を示し、
（ａ）は通常の光ファイバープレートを用いた場合、
（ｂ）はテーパー型光ファイバープレートを用いた場合
のいずれも模式図

【図４】本発明の装置のＡＴＰ発光法による生菌計数の
過程を示し、（ａ）は発光反応前の状態、（ｂ）は試薬
を注入した状態、（ｃ）は発光状態のいずれも模式図

【図５】本発明の装置によるＡＴＰ発光反応の発光強度
の応答特性線図

【図６】従来装置の測定部の要部構成を示す模式図

【符号の説明】

１ メンブレンフィルター ２ 付着細菌 ３ カメラレンズ ４ 高感度撮像手段 ５ 入力面 ６ ケーブル ７ メンブレンフィルター ７ａ 膜表面 ７ｂ 膜裏面 ８ 高感度撮像手段 ８ａ 入力光ファイバープレート ８ｂ 出力光ファイバープレート ８ｃ 光電面 ９ カメラレンズ １０ ＣＣＤカメラ １１ 蓋 １２ 注入ノズル １３ 電圧リード線 １４ 発光基点 １５ 光ファイバープレート １５ａ 入力面 １６ 受光角 １７ 液膜層 １７ａ 液膜層 １８ ＡＴＰ １９ 細胞膜 ２０ ＡＴＰ抽出液 ２１ 発光

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】あらかじめ一定量の試料をメンブレンフィ
   ルターで濾過し捕捉した細菌を所定の試薬を用いて発光
   反応させ、その発光画像を高感度撮像手段により撮像し
   て細菌数を測定する細菌検査装置であって、メンブレン
   フィルターの細菌付着面と、結像面に光ファイバープレ
   ートを備えた高感度撮像手段の入力面とが密着してなる
   ことを特徴とする細菌検査装置。
2. 【請求項２】請求項１記載の装置において、高感度撮像
   手段は光ファイバープレートの出力面が撮像素子に接し
   ていることを特徴とする細菌検査装置。
3. 【請求項３】請求項１または２記載の装置において、細
   菌付着面の裏面から試薬を添加、浸透させて発光反応を
   開始させることを特徴とする細菌検査装置。
4. 【請求項４】請求項１ないし３記載の装置において、光
   ファイバープレートは、入力像の大きさを所定の倍率に
   拡大可能なテーパー型光ファイバープレートであること
   を特徴とする細菌検査装置。