JP2995860B2

JP2995860B2 - 新規ペプチド

Info

Publication number: JP2995860B2
Application number: JP2324763A
Authority: JP
Inventors: 昭谷内; 浩三今井; 正幸辻崎; 久美子濱田; 伸介滝; 淳爾羽室; 俊朗嶌村
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1990-11-27
Filing date: 1990-11-27
Publication date: 1999-12-27
Anticipated expiration: 2014-12-27
Also published as: JPH04193895A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はヒト細胞間粘着分子Ｉ（以下、ICAM−１と称
する）に結合することにより、ヒトICAM−１とヒトリン
パ球機能関連抗原−１（以下LFA−１と称する）との結
合を阻害する活性を有する新規ペプチドに関する。本ペ
プチドは、臓器移植時の拒絶反応の予防、アレルギー性
疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療薬として利
用しうる有用な免疫抑制剤である。

〔従来の技術〕

臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移
植手術の成否は術後の移植片拒絶反応をいかにして抑制
できるかに換言されてきている。また、拒絶反応は、生
体が移植片を異物として認識し、それを排除するために
一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。そこ
で、従来より拒絶防止薬として、ステロイド剤、アザチ
オプリン、メトトレキセート、６−メルカプトプリンな
どのいわゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与が行
われてきた。しかし、安全域が狭いこと、あるいは効果
が弱いことなどの理由で、移植した臓器の生着率は向上
しなかった。ところが、近年開発されたサイクロスポリ
ンＡの登場により、生着率は格段の向上をみるようにな
った。しかしながら、サイクロスポリンＡには重篤な腎
毒性があることが明らかとなり、その使用の制限を与儀
なくされてきている。したがって、より安全で、かつ効
果的な免疫抑制剤の開発が望まれてきている。

ところで、移植片の拒絶のために惹起される免疫反応
は、細胞傷害性Ｔリンパ球が移植片を異物として認識
し、攻撃する反応がその主因の一つであると考えられて
いる。これらの反応は、まず宿主のＴリンパ球が移植片
を特異的に認識し、両者が接着することにより開始す
る。従って、これらの細胞同士の接着を阻害することが
できれば、拒絶反応を抑制することができるものと推定
される。細胞同士が接着するためには、それぞれの細胞
表面上に発現している接着分子と呼ばれている糖タンパ
ク質同士が結合することによる仲介が必須である。最近
の研究により、接着分子として種々の分子が発見されて
きており、そのうち１組としてICAM−１とLFA−１が知
られている（Cell,51巻,813頁,1987年）。拒絶反応の場
合には、細胞傷害性Ｔ細胞上のLFA−１分子と移植片の
細胞上のICAM−１分子とが接着することが必要であると
考えられている（European Journal of Immunology,8
巻,637頁,1988年）。

一方、自己の抗原に対して免疫反応が生じることによ
り自己の破壊が起こる自己免疫疾患や、外来抗原に対し
て過剰な免疫反応が生じることにより自己に対しても傷
害を引き起こすアレルギー性疾患は、その多くが難治性
の慢性炎症性疾患である。その治療薬としては、ステロ
イド性の抗炎症薬が現在最も有効であるが、強力な非特
異的免疫抑制作用を持ち合わしているために生じる重篤
な副作用がしばしば現れ、その使用を制限せざるを得な
い。また、非ステロイド性の抗炎症薬は、炎症反応を仲
介する化学的仲介因子の産生阻害剤、あるいはその拮抗
物質がほとんど占めており、慢性の炎症には効果のない
ものが多く、これらの疾患の優れた治療薬の開発が望ま
れている。これらの疾患がいかにして慢性化するかは現
在まで不明であるが、炎症部位への好中球・マクロファ
ージの集束、それに引き続いて生じるリンパ球の集束
が、慢性化の一助となっている可能性が高い。血液中を
循環しているそれらの細胞が局所へと集束するために
は、まず、炎症部位に近い血管の内皮にこれらの細胞が
接着し、血管の内皮細胞の接合部をすり抜け、更に基底
膜を破って、炎症部位へと遊走すると考えられている。

したがって、この一連の反応の第一歩である炎症性細
胞の血管内皮細胞への接着を阻止すれば、炎症の抑制、
更には炎症の慢性化を抑制することができるものと考え
られる。炎症性細胞の血管内皮細胞への接着の場合に
も、炎症性細胞の表面上に発現しているLFA−１分子
と、血管内皮細胞の表面上に発現しているICAM−１分子
の結合が必須であると考えられるようになってきている
（Clinical Research,36巻648A頁,1988年）。

すなわち、ICAM−１とLFA−１との結合を阻害するこ
とができれば細胞同士の接着が阻害され、拒絶反応を阻
止したり、炎症を抑制することができるものと想定され
る。しかし、現在までこの結合を選択的に阻害する物質
は、抗ICAM−１抗体あるいは抗LFA−１抗体以外には知
られていない。また、唯一知られているこれらの抗体
も、ウサギやマウスなどの異種動物を免疫することによ
り得られた異種タンパク質であり、そのままの形でヒト
に投与すると、抗体に対する免疫反応が生じてアナフィ
ラキシーショックや血清病などの重篤な副作用が起こっ
たり、抗体の効果が減弱してしまうことが想定され、残
念ながら直ちに臨床に応用することは不可能である。

また、ICAM−１あるいはLFA−１の結合部位を明らか
にしてその情報を基にペプチドをデザインすれば、結合
阻害物質となりうる可能性もあるが、現在までのとこ
ろ、ICAM−１分子、LFA−１分子とも互いの結合部位が
固定されておらず、そのアプローチも不可能である。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明の目的はヒトICAM−１に結合して、ヒ
トICAM−１とLFA−１との結合を選択的に阻害する物質
を提供することである。この物質は、臓器移植時の拒絶
反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎
症性疾患の治療薬に有効な免疫抑制剤として期待でき
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ね
た結果、以下の新しい概念及び方法により、目的とする
ICAM−１とLFA−１との結合を選択的に阻害するペプチ
ドを見いだし、本発明を完成した。

即ち、本発明はICAM−１とLFA−１との結合を阻害す
るペプチドである。尚、ペプチド鎖を構成しているアミ
ノ酸残基数により、ペプチドとポリペプチドを区別して
表現される場合もあるが、本発明においてはアミノ酸残
基数にこだわらず、全てペプチドという表現を用いるこ
とにする。従って厳密には、ポリペプチドに分類される
ものも本発明においては全てペプチドとして表記する。
以下、本発明を詳細に説明する。

さて、ICAM−１分子を認識する抗体のうち、特にLFA
−１とICAM−１との結合阻害活性を有しているものの中
には、ICAM−１分子上のLFA−１分子との結合部位その
ものを認識しているものが含まれているものと考えられ
る。更に、ICAM−１分子上のLFA−１分子との結合部位
を認識している抗体の中には、LFA−１分子がICAM−１
分子と結合するがごとく、LFA−１分子上のICAM−１分
子結合部位と同じ様な立体構造をもって、ICAM−１分子
に結合するものも含まれる可能性がある。従って、LFA
−１とICAM−１との結合阻害活性を有している抗ICAM−
１抗体を産生するハイブリドーマを多数集め、それらの
ハイブリドーマの産生する抗体の可変領域（以下Ｖ領域
と略する）のアミノ酸配列を決定すれば、LFA−１のICA
M−１分子の結合部位のアミノ酸配列と同一あるいは類
似のアミノ酸配列が得られる可能性がある。そしてLFA
−１分子のアミノ酸配列と、抗体のＶ領域のアミノ酸配
列との間に類似の配列が得られた場合には、その部分に
当たるペプチドを合成すればそのペプチドはLFA−１とI
CAM−１の結合を阻害できるものと推定できる。このよ
うな概念に基づき、本研究者らはまずICAM−１に特異的
でかつICAM−１とLFA−１の結合を阻害する活性を有す
るマウスモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ
クローンを作製した。マウス抗ヒトICAM−１モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは、以下の
ようにして得られる。まず、γ−インターフェロンで刺
激してICAM−１分子を高発現させたヒト大腸癌細胞株BM
314をマウスに免疫する。尚、この場合、ICAM−１分子
を元来発現している細胞、種々の刺激によりICAM−１分
子の発現を誘導した細胞など、細胞表面にICAM−１分子
を発現しているヒト由来の細胞であればどんな細胞を免
疫原として用いてもかまわない。次に、その免疫された
マウスの脾臓細胞あるいはリンパ節細胞中に存在する抗
体産生細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作製す
る。骨髄腫細胞は、融合可能な限りいかなる動物種由来
のものでもよいが、通常同一種の細胞を用いた方が良い
結果が得られる。本発明で得たハイブリドーマは、生理
食塩水に懸濁したγ−インターフェロン刺激ヒト大腸癌
細胞株BM314で免疫したBALB/cマウスの脾臓細胞とBALB/
cマウスの骨髄種細胞であるX63−Ag8−6.5.3とをポリエ
チレングリコール存在下で融合して得られたハイブリド
ーマである。骨髄種細胞としては、X63−Ag8−6.5.3の
ほかに、P3−X63−Ag8−U1,P3−X63−Ag8,P3−NSI/1−A
g4−1,MPC11−4.5.6.TG.1.7.SP2/V−Ag14（以上マウス
細胞）、210.RCY.Ag1.2.3（ラット細胞）、SK0−007,GH
15006TG−A12（以上ヒト細胞）等の８アザグアニン耐性
の細胞株を用いてもよい。マウスの脾臓中の抗体産生細
胞と骨髄種細胞とが融合したハイブリドーマの選択は、
細胞融合後ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン
を含む培地（HAT培地）中で培養することにより行え
る。得られたハイブリドーマはすべて目的とする抗体を
産生しているわけではないので、得られたハイブリドー
マクローンの中からICAM−１に対する抗体を産生してい
るハイブリドーマを選択し、その中から更にICAM−１と
LFA−１との結合阻害活性を有している抗体を産生して
いるハイブリドーマを選択しなければならない。その選
択は例えば以下の様な方法を用いて行うことができる。

すなわち、ヒト臍帯静脈内皮細胞をγ−インターフェ
ロン存在下で37℃で一晩培養して、プラスチックプレー
ト表面に張り付ける。この場合、張り付ける細胞は表面
にICAM−１分子を発現しているヒト由来細胞である限り
どんな細胞を用いてもかまわない。この際、検体である
ハイブリドーマ培養上清をあらかじめ各穴に加えてお
く。２′７′−ビス（カルボキシエチル）カルボキシフ
ルオレセンテトラアセトキシメチルエステルにて標識し
たHL−60細胞を各穴に加えて、臍帯静脈内皮細胞に結合
したHL−60細胞数を蛍光強度として求め、検体の培養上
清によるHL−60細胞の臍帯静脈内皮細胞への接着阻害能
を測定し、目的とするICAM−１分子とLFA−１分子の接
着を阻害する活性を有するICAM−１に対する抗体を産生
するハイブリドーマを得る。なお、スクリーニングのた
めに臍帯静脈内皮細胞へ接着させる細胞は、HL−60以外
にも表面にLFA−１分子を発現しているヒト由来細胞で
ある限りいかなる細胞を用いてもかまわない。また、細
胞の標識は、蛍光色素以外にも、アイソトープ、酵素な
どを用いて行ってもよい。

こうして得られたハイブリドーマクローンより全RNA
を抽出し、モノクローナル抗体のＶ領域をコードする遺
伝子（cDNA）を取得する。本発明のためには、期待する
構造を有するＶ領域を見いだすため、多数のハイブリド
ーマよりＶ領域cDNAを取得し、構造を決定する必要があ
る。

そこで、本発明者はより迅速な方法を鋭意工夫し、以
下の方法により遺伝子を取得した。すなわち、まず既に
知られているマウスIgGの重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ
鎖）の、それぞれのＶ領域をコードする遺伝子の５′端
に共通性の高い20〜30個の塩基配列（プライマーDNA）
を考案する。この塩基配列を有するDNAオリゴマー
（５′側プライマーDNA）、及び抗体の定常領域mRNAに
相補的な配列を有するDNAオリゴマー（３′側プライマ
ーDNA）をDNA合成機を用いて合成する。得られたいくつ
かのハイブリドーマより、常法に従って全RNAを抽出
し、逆転写酵素と適当な３′側プライマーDNAを用いて
一本鎖cDNAを作製し、５′側プライマーDNA及び３′側
プライマーDNAを用い、Taqポリメララーゼによるポリメ
ラーゼチェーンリアクション法（PCR法）（Science,230
巻,1350頁,1985年）にて抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域を
コードするDNA断片のみを選択的に増幅し取得する。そ
の後、得られたそれぞれのDNA断片を、T4DNAポリメラー
ゼにより両端を平滑化し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
により５′端をリン酸化する。このDAN断片を、あらか
じめクローニングサイドのSma Iサイトにて切断し、ア
ルカリフォスファターゼにて脱リン酸しておいたプラス
ミドベクターと、T4DNAリガーゼを用いて連結してクロ
ーニングする。クローニングされたcDNAの配列は、ダイ
デオキシ法（Science,214巻,1205頁,1981年）により決
定した。この決定されたＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域の塩基配
列からアミノ酸配列を推定する。クローニング法は、こ
こに記した方法以外にも通常用いられているいかなる方
法を用いてもかまわない。

次に、得られた抗ヒトICAM−１抗体のＨ鎖及びＬ鎖の
Ｖ領域の塩基配列より推定したアミノ酸配列と、LFA−
１分子のそれとホモロジーの検索を行った。抗ヒトICAM
−１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製、そ
のＶ領域のアミノ酸配列の決定、そしてヒトLFA−１分
子とのホモロジー検索、という一連の行程を多数のハイ
ブリドーマについて繰り返し行った結果、本発明の目的
に沿う、ICAM−１とLFA−１との結合を阻害する活性を
有する６種類のペプチドを見い出した。ペプチドのアミ
ノ酸配列を具体的に示すと以下の通りである。

即ち、下記のアミノ酸配列［Ｉ］〜［VI］で示される
構造を有するものである。

アミノ酸配列［Ｉ］：アミノ酸配列［II］：アミノ酸配列［III］：アミノ酸配列［IV］：アミノ酸配列［Ｖ］：アミノ酸配列［VI］：もちろん本発明のICAM−１とLFA−１との結合を阻害
するペプチドは上記［Ｉ］〜［VI］に示した構造を有す
るペプチドにとどまらず、例えば上記［Ｉ］〜［VI］で
示されるアミノ酸配列中の１個若しくは複数個のアミノ
酸が他のアミノ酸に置換された構造を有するもの、ま
た、上記［Ｉ］〜［VI］で示されるアミノ酸配列のＮ末
端、及び／又はＣ末端に１個若しくは複数個にアミノ酸
が付加された構造を有するものもICAM−１とLFA−１と
の結合を阻害する活性を有する限り本発明のペプチドに
含まれる。

更に、上記［Ｉ］〜［VI］で示されるペプチドがアミ
ド化、アセチル化又はポリエリエチレングリコール付加
された構造のものもICAM−１とLFA−１との結合を阻害
する活性を有する限り、本発明のペプチドに含まれる。

さて、上記［Ｉ］〜［VI］で示される配列のうち、式［Ｉ］:Tyr−Ser−Thr−Ser−Asn−Leu−Ala−Ser
−Gly−Val−Pro−Ala−Argで表される配列は特にICAM
−１とLFA−１との結合を強く阻害する。この配列
［Ｉ］を含め上記［II］〜［VI］で示される配列は特定
のハイブリドーマHA−58（FERM P−11857）由来の抗体
のＶ領域中に存在し、LFA−１分子と非常にホモロジー
が高い部分である。

この配列は、抗体のＶ領域中で、いわゆる相補性決定
領域（CDR）と呼ばれ、抗原との結合に直接関与するこ
とが知られている部分に当る。さて、上記［Ｉ］〜［V
I］で示される配列を有するペプチドは、化学的に合成
してもよいし、遺伝子工学の手法を用いて調製してもか
まわない。化学的に合成する場合には、通常用いられる
固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種
類のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル
基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応
性アミノ基を有する原料をジシクロヘキシルカルボジイ
ミド法を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護基を有
する場合、その保護基を除去させることにより製造し得
る（Internation Journal of Peptide Protein Reserc
h,30巻,705頁,1987年）。また、遺伝子工学の手法を用
いる場合には、例えば、５′,3′両端に適当な制限酵素
サイト、更にその内部に５′側から開始コドン（AT
G）、それに引き続き本ポリペプチドに対応する塩基配
列を含むように化学的に合成したDNA、あるいはPCR等を
用いて調製したcDNAを、プロモーター領域、SD領域とタ
ーミネータ領域を含む適当な発現ベクタープラスミド
に、組み込み、大腸菌を形質転換し、大腸菌内に目的と
するペプチドを産生させればよい。発現させる宿主は大
腸菌に限らず、酵母、昆虫、動物細胞など可能な限りい
かなるものを用いてもよい。本発明のペプチドは、通常
の方法に従い精製される。具体的には、イオン交換クロ
マトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーやアフィ
ニティークロマトグラフィーなどを用いればよい。

さて、本発明のペプチドは、ICAM−１に結合してICAM
−１とLFA−１との結合を選択的に阻害する活性を有し
ており、臓器移植時の拒絶反応の予防などに対して有効
なものである。また、本発明に係る免疫抑制剤は上記ペ
プチドを0.1重量％〜100重量％、好ましくは0.5重量％
〜70重量％の割合で含有すればよい。したがって、本発
明のペプチドをそのまま投与してもよいし、また通常製
剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与してもよ
い。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、
かつ本発明のポリペプチドと反応しない物質が得られ
る。注射剤の場合には、本発明のポリペプチドを水に溶
解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水、ぶど
う糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤、保存剤、安
定化剤あるいは賦形剤を含有させてもよい。また、これ
らの製剤は治療上価値のある他の成分を含有していても
よい。

本発明に係る免疫抑制剤の投与方法としては、径口、
注射、直腸内などいずれの方法を用いてもかまわない
が、注射による投与が好ましい。投与量は、投与方法、
患者の症状、年齢などにより異なるが、通常１回0.001
〜1000mg、好ましくは0.01〜10mgを１日当り１〜３回投
与すればよい。

尚、本発明に係るペプチドは安全性が確認されてい
る。

以下本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。

（実施例１、ICAM−１分子とLFA−１分子との結合を阻
害する活性を有するペプチドの作成）あらかじめ250U/mlの濃度のインターフェロン−γ存
在下で37℃で３日間培養したヒト大腸癌細胞株BM314
を、生理食塩水に懸濁し、６〜８週令の雌のBALB/cマウ
スに、１匹あたり１×10⁷個腹腔内投与することにより
免疫した。その10日後、同様の操作により追加免疫し、
更にその５日後、マウスの眼窩静脈より採血して、BM31
4細胞に対する抗体価を、FACScan（ベクトンディッキン
ソン社製）を用いた蛍光染色法により測定した。すなわ
ち、まず、１本あたり１×10⁶個のBM314細胞をチューブ
に入れ、遠心して上清を捨て、細胞をペレットとする。
次に0.5％牛血清アルブミン（BSA）、0.1％NaN₃及び0.1
5M NaClを含む10mMリン酸塩緩衝液（pH7.5）（以下BSA
−PBS）にて種々の濃度に希釈したサンプル血清を10μ
ずつ加え、４℃で30分間反応させた。この細胞をBSA
−PBSにて３回遠心洗浄した後、細胞ペレットにBSA−PB
Sにて1000倍に希釈したフルオレセンイソチオシアネー
ト（FITC）標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（Tago
社製）を10μずつ加えて、４℃で30分間反応させた。
更にBSA−PBSにて３回遠心洗浄した後、FACScanにて細
胞に結合した抗体量を蛍光強度として測定した。このよ
うにして抗体価を測定し、抗体価の高かったマウスを更
に同様の操作にて最終免疫した。その３日後、脾臓を摘
出して脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞（X63−Ag8−6.5.
3）とを、50％ポリエチレングリコール＃4000（ナカラ
イテスク社製）存在下にて細胞数で10:1の割合で混合
し、細胞融合させた。融合細胞を、10％牛胎児血清（ギ
ブコ社製）を含むRPMI1640培地（ギブコ社製）にて５×
10⁶個/mlとなるように懸濁し、１穴あたり５×10⁵個の
マウス胸腺細胞を含有する96穴平底プレート（コーニン
グ社製）に100μずつ分注した。１日、２日、３日、
６日後に培地の半量をヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジンを含む培地（HAT培地）と交換し、以後３
日ごとに同様の操作を繰り返した。融合より約２週間
後、融合した細胞（ハイブリドーマ）の増殖してきた穴
の培養上清について、後述の方法にてICAM−１とLFA−
１との結合阻害活性を測定し、阻害活性を有していた穴
に含まれるハイブリドーマを、限界希釈法にてクローン
化した。更にそれぞれのハイブリドーマクローンの培養
上清中の阻害活性を測定して、抗ICAM−１抗体産生ハイ
ブリドーマを得た。

５×10⁶個のハイブリドーマHA−58（FERM P−11857）
をPBSにて洗浄後、グアニジンチオシアネート、Ｎ−ラ
ウルリサルコシン、EDTAを含むRNA抽出用緩衝液（ファ
ルマシア社製）を加えて懸濁した後、あらかじめ等容量
のセシウムクロライド溶液（ρ＝1.51g/ml,ファルマシ
ア社製）を入れたチューブ重層し、125,000xgにて16時
間遠心した。上清を吸い取ったのち、1mMEDTAを含む10m
Mトリス塩酸塩緩衝液（pH7.5）（TE）を加えて懸濁し、
新しいチューブに入れ、65℃で５分間インキュベートし
た。更に、2M酢酸カリウム（pH5.0）（ファルマシア社
製）を1/10容量とエタノール（ナカライテスク社製）を
３倍容量加えて、−20℃に一晩放置した。5,000xgにて2
0分間遠心して、上清を捨てた後、80％エタノールにて
遠心洗浄し、沈澱を乾燥させた。沈澱をTEにて溶解して
RNA画分とした。

次に、RNA溶液にデオキシNTP混合液、cDNA合成用緩衝
液（アマシャム社製）、RNaseインヒビター（宝酒造社
製）、及びリバーストランスクリプターゼ（宝酒造社
製）を加えて42℃にて１時間反応させcDNAを合成した。
更に、PCR用緩衝液（シータス社製）、デオキシNTP混合
液、マウス免疫グロブリンＨ鎖Ｖ領域cDNA増幅用プライ
マー（５′、３′側それぞれ最終濃度１μＭ）あるい
は、マウス免疫グロブリンＬ鎖Ｖ領域cDNA増幅用プライ
マー（同濃度）、及びTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）
を加えDNAサーマルサイクラー（シータス社製）にてPCR
を行った。反応は変性30秒（94℃）、アニール30秒（55
℃）、プライマーイクステンション１分（72℃）にて30
サイクル行い、各サイクル毎にプライマーイクステンシ
ョンの時間を15秒ずつ延長させた。反応後、1mMEDTAを
含む40mMトリス酢酸緩衝液（pH8.0）にてアガロースゲ
ル電気泳動を行い、該当するcDNAフラグメントを切り出
し、ジーンクリーンキット（バイオ101社製）を用いて
抽出・精製した。精製したフラグメントをT4 DNAポリメ
ラーゼ（宝酒造社製）を用いて両端を平滑化した後、T4
ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を用いて５′
端をリン酸化し、あらかじめSma I（宝酒造社製）にて
切断後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）にて脱
リン酸した。pUC18ベクター（宝酒造社製）と、T4 DNA
リガーゼ（宝酒造社製）によりライゲーションした。大
腸菌JM109株（宝酒造社製）に形質転換後、クローンを
χブロスに接種し37℃にて一晩培養して、アルカリSDS
法によりプラスミドを抽出精製した。

精製したプラスミドをシークエンス用プライマーM4あ
るいはRV（宝酒造社製）を用い、７−DEAZAシークエン
スキット（宝酒造社製）にて以下の通り塩基配列を決定
した。

＜Ｌ鎖＞＜Ｈ鎖＞得られた塩基配列より、アミノ酸配列を推定し、以下
に示す配列［Ｖ］［VI］を得た。

＜Ｌ鎖：アミノ酸配列［Ｖ］＞＜Ｈ鎖：アミノ酸配列［VI］＞本アミノ酸配列を有するペプチドの調製は、まず、PC
Rにより増幅し精製したそれぞれのcDNAフラグメントの
両端に、Nco Iリンカー（ファルマシア社製）をT4 DNA
リガーゼ（宝酒造社製）を用いてライゲーションしたNc
o Iにより切断したものと、Nco Iにより切断したpKK233
−２ベクター（ファルマシア社製）とを更にT4 DNAリガ
ーゼを用いてライゲーションした。次に、大腸菌JM105
株（ファルマシア社製）に形質転換後、クローンをＬブ
ロスに接種して一晩培養し、菌を超音波破砕後、C8結合
シリカカラム（資生堂社製）を用いた逆相液体クロマト
グラフィーにより精製した。尚、Ｎ末端付近のアミノ酸
配列を調べた結果、上記アミノ酸配列Ｖ、及びVIを有す
るペプチドを得たことを確認した。

上記アミノ酸配列Ｖ、及びVIとLFA−１のアミノ酸配
列とのホモロジー検索の結果、を得た。これらのペプチドの作成は以下の様にして行っ
た。ペプチド［Ｉ］の作成は、まずFmoc−Arg（Mtr）樹
脂（国産化学社製）をMerrifieldの固相用反応装置（国
産化学社）にとり、ジメチルホルムアミド（DMF）（国
産化学社製）に懸濁して振盪し、樹脂を膨潤させた。樹
脂をDMF中で振盪し、更に50％ピペリジン−DMF溶液中で
振盪後、DMF、イソプロパノールで洗浄してFmoc基を除
去した。再びDMFに懸濁して振盪し樹脂を膨潤させ、Fmo
c−Ala−OH（国産化学社製）のDMF溶液を加えて振盪し
た。更に、1Mジシクロヘキシルカルボジイミド塩化メチ
レン溶液を添加し振盪後、DMF、イソプロパノールで洗
浄して縮合した。このようなFmoc基の除去、Fmoc−アミ
ノ酸縮合を繰り返して、Tyr−Ser−Thr−Ser−Asn−Leu
−Ala−Ser−Gly−Val−Pro−Ala−Arg樹脂を得た。樹
脂からの脱離は、塩化メチレンで洗浄後、塩化メチレン
・アニソール・チオフェノール（15:3:1）混合液に懸濁
し、トリフルオロ酢酸・塩化メチレン（8.6:1）を加え
振盪した。樹脂にろ過し、得られたろ液を減圧濃縮して
残渣にエーテルを加え、更にろ過して得られた粉末を、
C8結合シリカカラム（資生堂社製）による逆相液体クロ
マトグラフィーにより精製し、アミノ酸配列［Ｉ］を有
するペプチドを得た。

同様の方法により、以下のペプチドII、III、IVを合
成した。

（実施例２、ペプチドＩによるICAM−１とLFA−１を介
した細胞接着阻害効果） ICAM−１分子を発現しているヒト臍帯静脈内皮細胞を
最終濃度で10U/mlのIL−１（ゲンザイム社製）を含む培
地にて５×10⁴個/mlの濃度に調製し、96穴平底プレート
に１穴あたり100μ（５×10³個）ずつ、及び10μＭの
濃度に調製したペプチドＩ、ペプチドＶあるいはコント
ロールペプチドを100μずつ分注して、37℃で一晩培
養した。これとは別に10％FCSを含むRPMI1640培地にて
２×10⁷個/mlの濃度に調製したHL−60細胞懸濁液に、最
終濃度が10μＭとなるように２′７′−ビス（カルボキ
シエチル）カルボキシフルオロセンテトラアセトキシ
メトキシエステル（同仁化学社製）を加え、37℃で１時
間反応させ、３回培地にて洗浄した後、培地にて２×10
⁶個/mlの濃度に調製し、細胞を標識した。一晩培養した
HL−60細胞を培地にて２回洗浄した後、標識したHL−60
細胞を１穴あたり100μ（２×10⁵個）ずつ分注して、
37℃で30分間インキュベートした。培地にて４回洗浄し
た後、細胞ペレットを１％NP−40にて可溶化し、励起波
長490nm、蛍光波長530nmにて蛍光リーダー（インターメ
ッド社製）を用いて標識細胞の接着量を測定した。その
結果表Ｉに表す様に、本発明のペプチド添加時において
のみ、有意にICAM−１とLFA−１分子を介した細胞接着
が阻害された。

＜発明の効果＞本発明のペプチドは、臓器移植時の拒絶反応の予防，
アレルギー性疾患や自己免疫疾患などの炎症性疾患の治
療薬として有効な、従来の免疫抑制剤とは異なった選択
的作用のある、副作用の少ない免疫抑制剤として利用で
きる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者羽室淳爾神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１味の素株式会社中央研究所内 (72)発明者嶌村俊朗神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１味の素株式会社中央研究所内審査官高堀栄二 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 7/08 C07K 16/28 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト細胞間粘着分子−１とヒトリンパ球機
能関連抗原−１との結合を阻害する活性を有し、下記の
アミノ酸配列［Ｉ］で表されるペプチド。アミノ酸配列［Ｉ］
【請求項２】ヒト細胞間粘着分子−１とヒトリンパ球機
能関連抗原−１との結合を阻害する活性を有し、下記の
アミノ酸配列［Ｖ］で表されるペプチド。アミノ酸配列［Ｖ］
【請求項３】アミノ酸配列［Ｉ］または［Ｖ］で表され
るアミノ酸配列において、該アミノ酸配列中の１個また
は複数個のアミノ酸がアセチル化、アミド化またはポリ
エチレングリコール付加されたものである請求項（１）
または（２）記載のペプチド。