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JP2843048B2 - 新規な組換リンホトキシン誘導体 - Google Patents

新規な組換リンホトキシン誘導体

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JP2843048B2
JP2843048B2 JP1076918A JP7691889A JP2843048B2 JP 2843048 B2 JP2843048 B2 JP 2843048B2 JP 1076918 A JP1076918 A JP 1076918A JP 7691889 A JP7691889 A JP 7691889A JP 2843048 B2 JP2843048 B2 JP 2843048B2
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lymphotoxin
amino acid
plasmid
dna
cells
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誠 浅田
毅志 長洲
嘉一 長谷川
靖 四方
学 桑田
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Eezai Kk
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な組換リンホトキシン誘導体とその生産
に係る遺伝子組換技術並びに該誘導体を含有する医薬組
成物に関する。従って、本発明は医療用医薬品の分野に
おいて利用することができる。
〔従来の技術〕
生体中には生体防禦機構に係わる種々の液性因子が存
在しており、これらは主として白血球、リンパ球、マク
ロファージなどが刺激に反応して産生する微量生理活性
物質であって、例えばインターフェロン（IFN−α，
β，γ）、インターロイキン（IL1,2,3,4）、リンホト
キシン（LT）、癌壊死因子（TNF）、コロニー刺激因子
（Ｇ−,GM−CSF）を挙げることができる。これらのうち
リンホトキシン、TNFは新生細胞系統に対し直接的な抗
細胞活性を示すポリペプチドとして確認されており、リ
ンホトキシンはリンパ球から、またTNFはマクロファー
ジから、それぞれマイトージエンによる刺激により産生
される。
さて、リンホトキシンおよびTNFの遺伝子をクローニ
ングし、該遺伝子を組込んだベクターにより形質転換さ
れた大腸菌を培養することによって、リンホトキシンお
よびTNFを生産することはすでに報告されている（ネイ
チャー，312,721−724,1984（Nature,312,721−724,198
4）。そして大腸菌で生産されたリンホトキシンおよびT
NFはin vivoの実験でも移植癌に対する壊死効果を有す
ることが証明されており、例えばマウスに移植したMeth
A Sarcomaによる癌はリンホトキシンあるいはTNFの静
脈内投与または局所投与により顕著に治癒されることが
認められている（J.Immunology,M.A.PALLADINO et al,1
38 4023（1987））。
しかしこれらリンホトキシンおよびTNFは全ての癌細
胞を特異的に傷害するわけではなく、まったく作用を受
けない癌細胞も多数存在することが明らかとなってきた
（Sugarman et al Science,230,943（1985）,Watanabe
et al,J.Cancer Res.（Gann）76 1115（1985））。例え
ばヒト膀胱癌Ｔ−24,ヒト悪性黒色腫Ｇ−361,結腸腺癌L
S174−T,ヒト咽頭癌HEp2,ヒト線維内腫HT1080などはin
vitroでの実験では傷害作用を受けにくい。
ところでリンホトキシンおよびTNFは抗腫瘍作用以外
にも広範な作用を示すことが明らかとなり、リポプロテ
インリパーゼ阻害作用,ILI誘発作用、プロスタグランジ
ン誘導作用、血液凝固促進作用等がこれまでに報告され
ている。リンホトキシンあるいはTNFを臨床で使用する
場合、これらの作用が副作用として露見してくることが
予想され、事実TNFの臨床第一相試験では発熱、悪寒、
戦慄、血圧低下、GOT/GPT上昇、全身倦怠感、ALP上昇が
認められている（癌と化学療法，13,3491,1986）。
さて、リンホトキシンは分子量、荷電、耐熱性の違い
からα（分子量70000〜90000），β（分子量25000〜500
00），γ（分子量10000〜20000），コンプレックス（分
子量200000＜）の４つのクラスに分けられており（ポー
ル エフ．トーレンス，バイオロジカル リスポンス
モディファイヤース 293,1985（Paul F.Torrence,Biolo
gical Response Modifiers,293,1985）、さらにα，β
クラスは電荷によってサブクラスに分類することができ
る。すなわち、リンホトキシンは種々のヘテロな物質の
総称として用いられている。
Aggarwalらはリンホトキシンのアミノ酸構造を報告し
（ジェー．ビー．シー，260 2334（1985）（J.B.C.260,
2334（1985））、またGaryらによってリンホトキシン遺
伝子構造も報告されるとともに、リンホトキシンのヘテ
ロの原因の一部分は、同リンホトキシンのアミノ酸残基
数および会合形成の違いによって説明できると考えられ
ている。
他方、Grangerらはこのリンホトキシンと免疫交差を
示さないリンホトキシンが存在することを報告しており
（ジェー．インムュノロジー137,1878,1986（J.Immunol
ogy 137,1878,1986）、これはすでに構造解明されたリ
ンホトキシンとは抗細胞活性に関するスペクトラムが異
なるとしている。また、抗腫瘍細胞活性を有する因子と
して報告されているヒト腫瘍壊死因子（TNF）はアミノ
酸構造においてヒト リンホトキシンと28％の類似性を
示し、腫瘍細胞表面上のレセプターが共通であることが
報告されているにもかかわらず、抗腫瘍細胞活性スペク
トラムは多少異なると考えられている。
以上の知見を背景にして本発明者は当該リンホトキシ
ンより種々のポリペプチドを作り、抗腫瘍作用を示すre
gionのアミノ酸配列を見出すことおよび抗腫瘍作用の増
強を課題として検討した。
〔課題を解決するための手段〕
種々の検討の結果、137個のアミノ酸残基からなるア
ミノ酸配列に抗腫瘍作用があることを見出し、該配列の
NH2側に任意のアミノ酸配列を連続するか、または該配
列中の特定のアミノ酸を変換することによってさらに強
い抗腫瘍作用のある、あるいはリンホトキシン抵抗性癌
細胞に対しても傷害作用のある新規ポリペプチドが得ら
れることを知り、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は抗腫瘍作用の増強および抗腫瘍作
用スペクトラムの拡大を目的として、137個のアミノ酸
残基から構成されるアミノ酸配列であって、該配列中の
特定のアミノ酸に数種のバリエーションがあるものを含
有する新規なリンホトキシン誘導体を開示している。し
かるに該誘導体は遺伝子組換技術の利用によって効果的
に達成されるので、本発明は上記アミノ酸配列を含有す
る組換リンホトキシン誘導体の提供を要旨とするもので
ある。
以下に本発明を構成および方法の項に分けて詳細に説
明する。
構成 本発明組換リンホトキシン誘導体はその分子中に下記
一次構造式で示されるアミノ酸配列（以下本発明に係る
アミノ酸配列と呼ぶ）を含有し、これらは優れた抗腫瘍
作用が示される。
（式中、A1はPro又はValを表す） 上記本発明に係るアミノ酸配列のNH2側およびCOOH側
に連結する他のアミノ酸配列の選択は自由であり、特に
制限はない。NH2側に連結するアミノ酸として、例えば
次の〜を挙げることができる。
本発明の最終目的物質は遺伝子組換技術によって生産
することができる。従って本発明組換リンホトキシン誘
導体をコードするcDNA、該cDNAを外来遺伝子として含
み、かつ選択した宿主内で制禦および発現が可能となる
ように連続して得られた発現プラスミドはいずれも本発
明の最終目的物質の生産のために必要な中間物質であ
り、同一の課題を解決する意味において発明としては共
に一体となることができる。発現プラスミドの具体例と
して、pEH6084,pEH7084,pEH8084,pBRD8050,pEH5050によ
って識別表示されるプラスミドを挙げることができ、こ
れらはいずれも後記実施例において示される。また発現
プラスミドによって形質転換された宿主もcDNAおよび発
現プラスミドと同様に発明としては共に一体となること
ができ、宿主としては大腸菌や動物細胞、とりわけBHK
細胞が使用される。形質転換した大腸菌の例として、JM
83−pEH6084,JM83−pEH7084,JM83−pEH8084,RR1−pBRD8
050によって識別表示される大腸菌を挙げることがで
き、これらはいずれもそれぞれ後記実施例において示さ
れ、かつそれぞれの表示をもって微工研に寄託されてい
る。各受託番号は上記順序に対応してFERM P−10041,同
Ｐ−10040,同Ｐ−10042,同Ｐ−10253である。
最終目的物質である本発明組換リンホトキシン誘導体
は天然リンホトキシンが変異したものであるにもかかわ
らず、後記実験例によって示されるごとく天然リンホト
キシンの活性、すなわち抗腫瘍活性を天然リンホトキシ
ンと同程度およびそれ以上に有している。従って天然リ
ンホトキシンが医薬組成物の必須の有効成分となって、
その活性を利用する医療目的に提供されるのと同様に、
本発明組換リンホトキシン誘導体もその活性を利用する
治療目的のための医薬組成物の必須の有効成分となるこ
とができる。後記実験例によって示されるごとく、本発
明組換リンホトキシン誘導体の例えばヒト肺癌由来細胞
（PC−10）に対する活性は天然リンホトキシンのそれに
比べて50〜80倍大きい。
この場合に該医薬組成物は主として注射剤であり、静
脈内投与される。注射剤として製造されるためには、微
量生理活性物質を注射剤とするときの常法に従っておこ
なえばよい。従って例えば本発明組換リンホトキシン誘
導体を単独あるいは適当な賦形剤、溶解剤と共に水溶液
とし、無菌濾過して充填し、凍結乾燥し、他方溶解用水
溶液を添付して用時溶解型注射剤とすればよい。
方法 本発明物質の製造方法および測定方法について説明す
る。
まず、本発明物質を製造するために必要なリンホカイ
ンのcDNAライブラリーは適当な細胞からmRNAを取り出
し、発現系においてリンホトキシン活性を示すものをス
クリーニング、逆転写し、適当なプラスミドとして大腸
菌を形質転換して得られる（ネイチャー，312,721−72
4,1984（Nature,312,721−724,1984））。例えば後記実
施例に示されるごとくDaudi細胞からmRNAを分画し、ア
フリカツメガエルの卵母細胞に注入し、その培養上清に
ついてリンホトキシン活性を測定して、目的のmRNAをス
クリーニングし、得られたmRNAを常法により逆転写し、
得られたDNAから常法によりプラスミドを調製し、大腸
菌X1776株を形質転換すればよい。
なお、Daudi細胞は人のBurkitt lymphomaであり、ATC
C CCL 213として一般に入手することができる（キャ
ンサー リサ．28,1300−1310,1968（Cance Res.28,130
0−1310,1968））。
次にcDNAライブラリーからリンホトキシンをコードす
るcDNAを含むプラスミドをコロニーハイブリダイゼーシ
ョンによって選別する。コロニーハイブリダイゼーショ
ンはWallaceの方法（Nucleic Acids Res.,９,879,198
1）に準じて行い、プローブとしてリンホトキシンのＣ
端の８個のアミノ酸配列に対応する下記DNAを合成し、
精製して使用する。
陽性コロニーについてプラスミドを調製し、塩基配列
を決定し、リンホトキシンのcDNAを含むプラスミドを選
別すればよい。
次にリンホトキシンのcDNAを含むプラスミドから本発
明組換リンホトキシン誘導体をコードするDNAを得るに
は公知の遺伝子組換操作を適宜組み合わせて行えばよ
い。本発明ではもっぱら特定位置のアミノ酸配列を除去
および特定位置のアミノ酸の置換が行われる関係で特に
Zoller and Smithの部位特異的変異誘発（site−di−re
cted mutagenesis）を利用することができる。すなわ
ち、リンホトキシンのcDNAをM13の如きファージベクタ
ーに組み込み、その結果得られる二本鎖M13 DNAで形質
転換した大腸菌の培養液から一本鎖DNAを用意し、これ
に所定の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてア
ニーニングし、変異を誘発すればよい。部位特異的変異
誘発を行った後は、得られた反応液で大腸菌を形質転換
し、これを培養して得られるプラークについて放射標識
した合成オリゴヌクレオチドをハイブリッドしてスクリ
ーニングすれば、目的物質をコードする所定のcDNAを外
来遺伝子として含む二本鎖M13 ファージDNAを得ること
ができる。必要により該ファージDNAから所定のcDNAを
切り出し、これを宿主に応じて使用される適当な発現ベ
クターに連結することは常法に従って適宜行えばよい。
なお、発現ベクターとしては市販の発現ベクター、例
えばpKK 233−2,pUC 12,pUC 18（ファルマシア）,PUG 1
30,PUG 131,（M13tg130,131のポリリンカー部位をpUC 1
2,13に置き換えたプラスミド）を使用すればよいが、以
下に示すように所要のプロモーターおよびターミネータ
ーを選定して連結し、特別の発現ベクターを用意して、
これを使用してもよい。すなわち、一般に哺乳動物由来
の遺伝子を大腸菌、酵母、動物細胞の中で発現させるた
めには蛋白合成開始シグナルであるATG（Met）の上流に
プロモーターを配し、蛋白合成終止コドン（TAA,TGA,TA
G）の下流にターミネーターを連結させなければならな
い。プロモーターとしては大腸菌ではlac,trp,tac,trc,
sac,PL等が、酵母ではα−factor,TPI,suc,GAL,PGI等
が、そして動物細胞ではメタロチオネイン、SV 40 earl
y、LTR等が通常使用される。特に大腸菌で効率よく遺伝
子を発現させるためにはプロモーター、シャインダルガ
ーノ配列（SD配列）およびATGを正確に連結し、しかもS
D配列からATGに至るまでの塩基数を至適に選定する必要
がある。こうした点を配慮して、後記実施例では大腸菌
発現ベクターとしてtrcプロモーター、SD配列およびATG
をこの順序に連結し、しかもSD配列から塩基数で11個だ
け下流にATGが来るように調整し、さらにATGの直前にBg
l II siteが挿入されるように構築したものを用意し、
これを使用している。
以上の製造プロセスの中間段階で利用される個々の遺
伝子組換操作はほとんど公知であるので、文献あるいは
簡単な記述によって以下に説明する。
制限酵素によるプラスミドの切断および切断して得ら
れるDNA断片のアガロースゲル電気泳動またはポリアク
リルアミドゲル電気泳動による分離と回収と結合につい
ては、マニアティス，ティー，エタール，モレキュラー
クローニング，ア ラボラトリー マニュアル，コール
ド スプリング ハーバーラボラトリー1982（Maniati
s,T,et al,.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Laboratory 1982）の記述が参照さ
れる。
例えば天然リンホカインをコードするcDNAを含むプラ
スミドおよびM13ファージベクターを各々切断し、断片
を結合してcDNAの組込まれた二本鎖M13 DNAを得る場合
に応用される。
プラスミドの大腸菌への形質転換は、DNAクローニン
グ第１巻第６章ディー．エム．クロバー編，アイアール
エル プレス1985（DNA cloning Vol.1,Chap.6,ed.D.M.
Glover IRL press 1985）に従えばよい。
例えば天然リンホカインをコードするcDNAの組込まれ
た二本鎖M13 DNAあるいは変異リンホカインをコードす
るcDNAの組込まれた発現プラスミドを大腸菌への形質転
換に供するときに応用される。
変異誘発用およびスクリーニング用のオリゴヌクレオ
チドのphosphoamidite法による合成および５′末端の標
識はそれぞれ、エス．エル．ビューケージ，エタノー
ル.,:テトラヘドロンレット.,22 1859,（1981）（S.L.B
eaucage,etal.,Tetrahedron Lett.,22 1859（1981））
およびエー．マキサム アンド ダブリュ．ギルバー
ド，メソッズ イン エンチモロジー,65巻499−560頁
アカデミックプレス1980（A.Maxam and W.Gilbert,Me
thods in Enzymology,Vol.65 p499−560 Academic Pres
s 1980）によればよい。
DNA塩基配列の決定は、エフ．サンガー エタール.,
ピー．エヌ．エー，エス．74 5463,1977（F.Sanger et
al.,P.N.A.S 74 5463,1977）に従いdideoxy法により行
えばよい。
例えば変異誘発し、スクリーニングした一本鎖M13 DN
Aについて塩基配列を決定し、目的とする変異が誘発さ
れているか否かを確認する場合に応用される。
二本鎖および一本鎖のM13 ファージDNAは以下のよう
に調製される。
すなわち、形質転換した大腸菌を、ジェー．メッシン
グ，メソッズ イン エンチモロジー101,20−78 1983
（J.Messing,Method in Enzymology 101,20−78 1983）
に記載の方法により培養し、さらに振盪培養し、遠心分
離する。沈澱部の大腸菌からは、マニアティス，ティ
ー，エタール.,モレキュラークローニング，ア ラボラ
トリーマニュアル．コールドスプリング ハーバーラボ
ラトリー1982（Maniatis.T,et al.,Molecular Cloning,
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory
1982）に記載の方法により二本鎖M13 DNAを得る。また
上澄液からは、その1.3mlに260μの2.5M NaCl−20％P
EG 6000混合溶液を加え、混合物をエッペンドルフミク
ロチューブで遠心分離し、得られるペレットを120μ
の10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.9,0.1mM EDTA）に懸濁
し、フェノール抽出し、エタノールで沈澱させ、70％エ
タノールで洗浄し、乾燥後30μの10mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.9,0.1mA EDTA）に再び懸濁して一本鎖M13 DNA
を得る。
部位特異的変異誘発反応は、ゾラー アンド スミ
ス，メソッズ インエンチモロジー 100 468−500,19
83（Zoller and Smith,Methods in Enzymology,100 468
−500,1983）に従って行われる。
すなわち非放射性リン酸で末端標識した変異誘発用合
成オリゴヌクレオチド（プライマー）20p molに一本鎖M
13 DNA １μｇ、アニーリング用緩衝液（50mMトリス塩
酸,pH8.0,0.25mM MgCl2）２μ、Ｂ緩衝液（0.2Mトリ
ス塩酸、pH7.5,0.1M MgCl2,0.1M ジチオスレイトー
ル）８μ,dATP,dGTP,dCTP,dTTP各2.5mMずつの混合物
４μ,5mM rATP 2μ、蒸溜水１μ,T4DNA リガー
ゼ５単位、DNAポリメラーゼI Klenowフラグメント５単
位を加え、最終全液量を20μとして14℃３時間反応さ
せる。
次に反応混合液を用いて変異誘発を受けたDNAで大腸
菌を形質転換するためには、クレーマー エタール.,セ
ル38 879−887,1984（Kramer et al.,Cell 38 879−88
7,1984）に従って行い、さらにグルンスタイン アンド
ホグネス，ピー．エヌ．エー．エス．ユーエスエー 72
3961,1975（Grunstein and Hogness,P.N.A.S.USA 72 3
961,1975）に従って形質転換した大腸菌を大腸菌JM 103
とまぜて寒天培地上に拡げ、37℃で一夜培養し、形成す
るプラークをニトロセルロースフィルター上に写しと
る。
ニトロセルロースフィルター上に写しとったプラーク
についてのスクリーニングは以下のように行う。
ニトロセルロースフィルターを６倍のSSC（１倍のSSC
は150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウム）,10倍のDenhar
d's（１倍のDenhardt'sは0.02％ポリビニルピロリドン,
0.02％フィコール,0.02％ウシ血清アルブミン）,50μｇ
超音波処理サケ精子DNAの中に加えて65℃３時間処理
し、予備ハイブリッドを形成させる。次いでフィルター
を放射標識した変異誘発用合成オリゴヌクレオチドと同
一緩衝液条件下で混合し65℃で一夜放置してハイブリッ
ドを形成させる。フィルターを６倍のSSCで洗浄し、水
分をきった後、増感スクリーンを重ね、Ｘ線フィルムに
露出して目的のプラークを選出する。
変異リンホカインをコードするcDNAを二本鎖M13 DNA
から切り出し、これを発現ベクターに連結して得られる
発現プラスミドは宿主に応じてそれぞれ形質転換に使用
すればよいが、例えばBHK細胞の形質転換のためには、
ロイター エタール.,ピー．エヌ．エー．エス．ユーエ
スエー，79 422,1982（Loyter et al.,P.N.A.S.USA,79
422,1982）に従ってLoyterらの方法により行えばよい。
すなわち、得られた発現プラスミドを例えばpSV2−dhfr
と供にBHK570細胞株（ts,tk-）に形質転換する。なおpS
V2−dhfrについては、サブラマニ，エタール：モル．セ
ル．バイオロ．１ 854−864,（1981）（Sabramani,et
al:Mol.Cell.Biol.１ 854−864,（1981））が参照され
る。
クローニングは限界希釈法（limiting dilution法）
を利用して以下のごとく行うことができる。
形質転換の数日後より200nM Amethopterin含有ダルベ
コ変法イーグル培地（ダルベコ変法イーグル培地，ブド
ウ糖3.5％，炭酸水素ナトリウム7.5％，牛胎児血清（FC
S）５％，トラネキサム酸3mM,グルタミン2mM,（＋）−A
methopterin 200nM）で２〜３日毎に１〜２週培地交換
しながら限界希釈して産生株を得る。次に産生株をロー
ラーボルトに用意した200nM Amethopterin含有ダブルベ
コ変法イーグル培地300mlに接種し、37℃で培養し、培
養開始より３〜４日後より毎日３〜４週間同量の培地で
培地交換し、培養上清を集めればよい。
後記実施例では大腸菌JW83を使用し、振盪培養した後
に菌体を破砕し、上清画文を集めた。
精製はゲル濾過、色素吸着クロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、分画しリ
ンホトキシン活性によって所要の画分を得ればよい。
リンホトキシン活性、すなわちリンホトキシンの抗腫
瘍作用活性は次の如く行う。
インジケーター細胞として例えばマウス線維芽細胞株
L Cellの亜株であってリンホトキシンに対する感受性の
高いLP3細胞を使用し、これに試料および最終濃度１μg
/mlのアクチノマイシンＤを加え、CO2気流下で37℃12−
18時間培養する。ここで培地は10％非働化中胎児血清を
含むRPMI 1640を使用する。培養終了後死細胞を洗浄除
去し、付着残存している生細胞を0.5％クリスタルバイ
オレット（メタノール：水＝1:4）液で固定染色してい
る。染色された細胞より色素を抽出し、その吸光値を測
定して生細胞の数を判定する。タイターはLP3細胞の50
％lysisを与えるときの試料希釈度によって表示する。
なお、この値は試料を加えたときのLP3細胞の増殖相に
よって変化するので、常にリンホトキシン標準力価試料
を対照に用いて、補正をする必要がある。
無血清培地（DM−153培地）で継代している対数増殖
期のLP3細胞を用いて上記のアッセイを行うとき24時間
後に50％ lysisを起こすLTの活性濃度を1U/mlと定義す
る。
ヒト悪性腫瘍細胞株に対するLTの細胞傷害、増殖抑制
試験は以下の如く行う。
各種ヒト癌細胞株を0.5〜１×103wellの密度で90well
ミクロタイタープレートに添加し、１晩培養後、LT試料
を含む培地を添加する。その後約一週間湿潤,CO2存在下
で培養する。生存細胞は前記の方法と同様Crystal vio
letの抽出により判定する。
別法として、0.1μg/mlのアクチノマイシンＤを共存
させてAssayすることも可能である。その場合、細胞株
を２〜５×104/wellの密度で添加し、LT試料およびアク
チノマイシンＤを添加し、12〜15時間で生細胞数を判定
する。
エンザイム イムノアッセイ（EIA）による比活性の
推定は以下のように行う。LTを免疫して得られたウサギ
抗ヒトLT抗体、もしくは免疫マウスの脾細胞より細胞融
合法により得られたハイブリドーマの産生するモノクロ
ーナル、抗ヒトLT抗体を用い、サンドイッチ法により試
料中のLTの量を推定する。すなわち、プラスチック製We
llに抗ヒトLT抗体（モノクローナルあるいはポリクロー
ナル）を吸着させた後、LTを添加し結合させる。更に一
次抗体とは確認部位の異なるモノクローナル抗体もしく
はポリクローナル抗体を添加する。この二次抗体は予め
ビチオンを結合させておいたものを用いる。これによ
り、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したア
ジピンを添加すればアジピンと二次抗体のビチオンの特
異的反応により、LTと結合した二次抗体の量に比例して
ペルオキシダーゼがwellに固定される。ここに、例えば
オルトフェニレンジアミン及び過酸化水素の如き、基質
を添加すれば、ペルオキシダーゼにより定量的に発色が
みられ、その吸光度より試料中のLT濃度を推定できる。
すなわち、未知量のLTを含む試料と、予め精製しアミノ
酸分析により決定した含有濃度既知のLTのEIA値を比較
すればよい。また、前者の抗腫瘍活性をＬ−P3細胞をイ
ンジケーターとして前記の如く調べれば、その比活性が
求まる。
〔実 施 例〕
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
実施例 １ mRNAの調整 Daudi細胞２×108個を4Mグアニジウムチオシアネー
ト,0.5％Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム,25mMク
エン酸ナトリウムpH7.0、0.1Mメルカプトエタノール,0.
1％アンチホルム（シグマ）溶液10mlに懸濁させ、ポリ
トロンによりホモジナイズした。このホモジネートを0.
1M EDTAを含む5.7Mセシウムクロライド水溶液上に重層
し、超遠心分離機（SRP28Aローター，日立）を用い2600
0rpmで20℃下28hr遠心分離した。沈澱したRNAを10mMト
リス塩酸pH7.4 10mlに溶解した後2.5倍量のエタノール
を加え、−70℃下１時間放置した。次に、遠心により沈
澱させたRNAを10mMトリス塩酸pH7.4 14mlに溶解し、4M
塩化カリウム2mlをさらに加えた。このRNA溶液をオリゴ
（Ｔ）セルロースカラム（φ２×15cm）に付し、0.5M塩
化カリウム、10mMトリス塩酸pH7.4で十分に洗浄後、10m
Mトリス塩酸pH7.4水溶液でmRNAを溶出させた。
mRNAの精製 Daudi細胞由来mRNA 500μｇを50mMTrisHCl pH7.4,0.2
MNaCl,1mM EDTAを含む10％から28％sucrose濃度勾配を
形成させた溶液15mlに重層し、超遠心分離機（SRP28Aロ
ーター，日立）を用い26000rpmで20℃下16hr遠心した。
次に500μずつ分画し各分画にエタノールを加えmRNA
を沈澱させた。各分画mRNAは滅菌水で溶解し、mRNA濃度
１μg/uに調整した。
mRNAのスクリーニング アフリカツメガエルの雌（生後１年以上のもの）に血
清性性腺刺激ホルモン（ピーメックス：三共）を200U注
射した。一晩経過後、卵母細胞を取り出し、modified b
arth saline medium（MBS）中に保存した。次に先のmRN
Aの各分画50〜100ng/eggを卵に注入し、1mM phenyl met
hyl sulfonyl fluoride（PMSF）を含むMBS中で25℃,36h
r培養した。上清を除去した後、卵母細胞をホモジネー
トし、1mM PMSF含有MBSで抽出し、mRNAの各画分ごとの
試料とした。各試料についてリンホトキシン活性を測定
し、リンホトキシン活性を示すmRNAの画分をスクリーニ
ングした。
cDNAライブラリーの作成 アフリカツメガエルの卵母細胞によるmRNA発現系にお
いてリンホトキシン活性を示したmRNA画分の５μｇを5m
M TrisHCl pH8.37μに溶解し、65℃５分間incubateし
た後、pcDVI DNA（ファルマシア）14μｇを加え、次の
条件で反応を行った。50mM TrisHCl pH8.3mM MgCl2,30m
MKCl,0.3mM DTT,2mM dNTP,reversetranscriptease 5U,
反応液量20μ。
37℃で60分間反応を行った後、0.25M EDTA 2μを加
え反応を止めた。フェノールクロロホルム処理を行った
後、4M NH4OAc 20μ,EtOH 80μを加え、−70℃で放
置し、次に遠心して上清を除いた後、同様の操作を繰り
返した。75％EtOH水で沈澱を洗浄し乾燥した後、10mM s
odium cacodylate,2.5mM HEPES pH7.6,0.1mM dCTP,poly
（Ａ）0.2μg/uの反応液に調整し、terminal deoxynu
cleotidyl transferase（TdT）10Uを加え、最終的に20
μとした。37℃で10分間反応を行った後、0.25M EDTA
1μを加え反応を止め、以下常法に従い後処理を行っ
た。
得られたDNAの沈澱を8mM MgCl2,6mMメルカプトエタノ
ール,Hind III 10Uを含有する10mM Tris HCl pH7.4溶液
11μに溶解し、37℃で2hr反応させた。0.25M EDTA 1
μを加え、反応を止めた後、常法に従い後処理を行
い、10mM Tris HCl pH7.4,1mM EDTA溶液10μおよびEt
OH3μの混合溶液に溶解させた。
次に、DNA含有溶液11μにpL−1 DNA（ファルマシ
ア）77ngを加え10mM TrisHCl pH7.4,1mM EDTA,0.1M NaC
l溶液120μとした。65℃で５分間、42℃で30分間放置
した後、氷冷下、次の成分を加え液量を1.2mlとした。2
0mM Tris HCl pH7.5,4mH MgCl2,10mM（NH4）2SO4,0.1MK
Cl,0.1mM β−NAD,50μg/ml Bovine Serum Albumin,E.c
oli ligase 1μｇ 12℃で一晩反応を行った後、4mM dNTP 10μ,20mM
β−NAD 10μ,E.coli ligase 1μg,E.coli DNA polym
erase I 17.5U,RNase H 120Uを加え、12℃で1hr、25℃
でさらに1hr反応を行った後、この溶液を用いE.colix17
76株を形質転換させた。
すなわち、E.colix1776株をx1776 medium（Maniatis
et al,Molecular cloning）中、37℃で吸光度（550nm）
が0.2となるまで培養した後、集菌し以下Maniatis等の
方法でcompitent cellを調整した。このcompitent cell
に先のDNAを加えた後、E.colix1776株をtransformしてc
DNAライブラリーを作成した。
cDNAのスクリーニング 前項で得られたcDNAライブラリーの中から、リンホト
キシンをコードするcDNAを含むプラスミドを選別するた
め、リンホトキシンのＣ端８アミノ酸に対応するDNAを
合成しこれをプローブとしてコロニーハイブリダイゼー
ションを行った。
合成プローブの構造はGTC TTC TTT GGA GCC TTC GCT
CTGであり、自動固相合成機（アプライドバイオシステ
ムズ社）により合成した後、HPLCにより精製した。ハイ
ブリダイゼーションはWallace等の方法（Nucleic Acids
Res,９ 879,1981）に準じて行った。cDNAライブラリー
の約10万個のうち60個が陽性コロニーであり、その中の
３コロニーのプラスミドを調整し、塩基配列を決定した
ところ、１個がリンホトキシンcDNAを含むプラスミドで
あった。得られたリンホトキシンcDNAのアミの酸コーデ
ィング領域の塩基配列を図１に示す。
発現ベクターの構築 前項で得たリンホトキシンcDNAを含むプラスミドをBa
mH1で消化し、リンホトキシンcDNAを含む約1.1kbpのフ
ラグメントをpUG131（pUC13（ファルマシア）のpoly li
nker部分をM13tg131（アマシャム）のpoly linker部分
と入れ換えたプラスミド）ノBamHI siteへ挿入した後
（プラスミド番号pMLT2000）、Hinc IIおよびBal Iで消
化して約1.1kbpのDNAフラグメントを得た。次に、pkk23
3−２（ファルマシア）をNco I消化した後にKlenow酵素
処理したベクターへ先の1.1Kbpフラグメントを挿入した
（プラスミド番号pMLT2100）。pKK233−２はtrcプロモ
ーター（tacプロモーターを改良したもの）を有し、IPT
Gにより誘導発現が可能である。次にpMLT2100をEcoR1お
よびHind IIIで消化し、リンホトキシンcDNAを含む約1.
5kbpフラグメントをM13mp10二本鎖DNA（ファルマシア）
へ挿入した。次に、E.coli JM103にtransfectionした
後、一本鎖DNAを常法に従って調整し、以下に示す合成
オリゴヌクレオチドを用いてin vitro mutagenesisを行
った。
部位特異的な変異発反応は基本的にZoller等の方法
（Method in Enzymology 100 468,1983）に従って行っ
た。すなわち、非放射性リン酸で末端標識した前記合成
オリゴヌクレオチド20pmolに１μｇの鋳型DNA（一本鎖D
NA）,2μの５×annealing buffer（50mM TrisHCl,pH
8.0,25mM MgCl2）、８μのB buffer（0.2M TrisHCl p
H7.5、0.1M MgCl2,0.1M DTT）、４μの2.5mM dNTP、
２μの5mM ATP、１μの蒸留水、5UのT4 DNA ligas
e,5UのDNA polymerase I Klenowフラグメントを加え全
量を20μとした。14℃で3hr反応を行った後、E.coli
JM103をtransformした（Kramer等、Cell 38 879,198
4）。
形質転換した細菌をE.coli JM103とまぜ寒天培地上に
広げ37℃で一晩培養し、形成されたプラークをニトロセ
ルロース上に写しとった（Grunstein et al PNAS 72 3
961,1975）。次に32Pでラベルした合成オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイゼーション試験を行い変異を誘発さ
れたファージプラークを選別した。以上のようにして選
びだしたファージプラークより二本鎖DNAを調整し、Eco
R1およびHind IIIで消化して得たDNAフラグメントをpKK
233−２のEcoR1およびHind III消化で調整したプラスミ
ドへ挿入した（プラスミド番号pMLT3020）。
pMLT3020は、trcプロモーターのShine−Dargaro配列
より11ヌクレオチド下流のATGより蛋白合成が開始する
とともに、Bg1 II消化によりプロモーターの下流に任意
の遺伝子を挿入可能であり、BamH I消化すれば開始コド
ンであるATGの下流に遺伝子が挿入可能となる発現ベク
ターである。pMLT3020は本発明ポリペプチドのNH2末端
より７アミノ酸残基を欠失したポリペプチドをコードし
ており、NH2末端周辺のDNA配列を示すと次の如くにな
る。
なお、pMLT3020の構築工程図を図２に示す。
pMLT3020をBamH1およびHind IIIで消化し約500bpのDN
Aフラグメントをアガロースゲル電気泳動で回収した。
また、下記に示すオリゴヌクレオチドを合成し、ポリヌ
クレオチド キナーゼ（NEB）、ATPにより５′末端をリ
ン酸化した後、先の500bp DNAフラグメントと共にpUG13
0をEcoRlおよびHind III消化して得たベクターと酵素的
に連結させた（プラスミド番号pUG5001）。
反応停止後、常法に従いE.coli JM83を形質転換し、
Ｘ−Gal入り寒天プレート上で白色コロニーを選別し
た。次に、プラスミドpUG5001をBal IIおよびHind III
で消化した後、約500bp DNAフラグメントをアガロース
電気泳動より回収し、pMLT3020をBgl IIおよびHind III
で消化して得た約4.6kbp DNAと合わせ酵素的に連結させ
た（プラスミド番号pMLT5001A）。
構築工程図を図３に示す。
プラスミドpUC12をBamHlおよびPst Iで消化し約2.8kb
p DNAフラグメントを得、５′末端をリン酸化した下記
合成DNAを酵素的に連結してプラスミドpUC7692を得た。
プラスミドpUC7692をAcc IおよびAva IIで消化後、７
％ポリアクリルアミド電気泳動で約100bp DNAフラグメ
ントを回収し、プラスミドpMLT5001AをEcoR1およびAcc
I消化、Ava IIおよびHind III消化して得た各々約450b
p、約300bp DNAフラグメントとプラスミドpUG130をEcoR
lおよびHind III消化して得た約2.8kbpフラグメントと
酵素的に連結した（プラスミドpEH5123）。
構築工程図を図４に示す。
プラスミドpEH5123を制限酵素Acc III及びXho Iで切
断した後、Bacterial Alkalin Phosphataseにより５′
末端脱リン酸基の除去を行った。次に、0.8％アガロー
スゲル電気泳動により約3.5kbpフラグメントを回収し、
５′末端のリン酸化した下記合成DNAと酵素的に連結さ
せた（プラスミド番号pEH6084）。
構築工程図を図７に示す。
このpEH6084プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
１に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、１−
62位及び118−123位のアミノ酸を欠失し、NH2末端にMet
−Lysが付加したリンホトキシン誘導体をコードするこ
とが確認された。
実施例 ２ プラスミドpEH6084を制限酵素EcoR1及びBgl IIで切断
して得た約300bpフラグメントと、Sac II及びHind III
で切断して得た約500bpフラグメントと、５′末端のリ
ン酸化された下記合成DNAとをプラスミドpUG130のEcoR1
及びHind IIIサイトへ酵素的に挿入した（プラスミド番
号pEH7084）。
構築工程図を図８に示す。
このpEH7084プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
１に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、１−
62位及び118−123位のアミノ酸を欠失し、NH2末端に−S
er−Thr−Leu−Lysが付加したリンホトキシン誘導体を
コードすることが確認された。
実施例 ３ pMLT3020をBamH IおよびHind IIIで消化して得た約50
0bpのDNAフラグメントを５′末端をリン酸化した下記合
成オリゴヌクレオチド並びにpUG130をEcoR1およびHind
III消化して得たベクターと酵素的に連結させた（プラ
スミド番号pUG5004）。
構築工程図を図５に示す。
プラスミドpUG5004をSac IIおよびHind IIIで消化し
て得た約540bpのDNAフラグメント、５′末端をリン酸化
した下記合成オリゴヌクレオチド、プラスミドpUG130を
EcoR1およびHind IIIで消化して得た約2.8kbpのDNAフラ
グメントを酵素的に連結させた（プラスミド番号pUG501
1）。
次に、プラスミドpUG5011をBgl IIおよびHind IIIで
消化して得た約570bpのDNAフラグメントとプラスミドpL
MLT3020をBgl IIおよびHind IIIで消化して得た約4.6kb
pのDNAフラグメントを酵素的に連結させた（プラスミド
番号pMLT5011）。
構築工程図を図６に示す。
プラスミドpEH7084を制限酵素Acc I及びHind IIIで切
断した後、１％アガロースゲル電気泳動により約450bp
のDNAフラグメントを分取した。同様にプラスミドpMLT5
011を制限酵素EcoR1及びAcc Iで切断して得た約450bp D
NAフラグメントと前記フラグメントをプラスミドpUG130
のEcoR1及びHind IIIサイトへ酵素的に挿入した（プラ
スミド番号pEH8084）。
構築工程図を図９に示す。
このpEH8084プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
１に記載のリンホトキシンのアミン酸配列のうち、１−
62位及び118−123位のアミノ酸が欠失したリンホトキシ
ン誘導体をコードすることが確認された。
実施例 ４ プラスミドpEH6084をEcoR1及びPst Iで切断して得た
約580bp DNA断片、pTT5001をPst I及びPvu Iで切断して
得た約1700bp DNA断片、pBR322d−ropをEcoR1及びPvu I
で切断して得た約3100bp DNA断片の三者を酵素的に連結
した（プラスミド番号pBRD6084）。
次に、pBRD6084をEcoR1,Acc I及びPvu Iで切断して得
た約1100bp DNA断片とpEH8037をEcoR1及びAcc Iで切断
して得た約450bp DNA断片、pBR322 d−ropをEcoR1及びP
vu Iで切断して得た約3100bp DNA断片の三者を酵素的に
連結した（プラスミド番号pBRD8050）。
構築工程図を図10に示す。
このpBRD8005プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
１に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、１−
62位及び118−123位のアミノ酸が欠失し、71位のプロリ
ンがバリンに変換されたリンホトキシン誘導体をコード
することが確認された。
実施例 ５ プラスミドpEH7084を制限酵素Acc I及びHind IIIで切
断し、約300bpのDNA断片を得た。またプラスミドpEH503
7をEcoR1及びAcc Iで切断して約450bp DNA断片を得、先
のDNA断片と共に酵素的にプラスミドpUG130のEcoR1,Hin
d III部位へ挿入した（プラスミド番号pEH5050）。
構築工程図を図11に示す。
このpEH5050プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
１に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、１−
62位及び118−123位のアミノ酸が欠失し、71位のプロリ
ンがバリンに変換され、更にNH2末端にMet−Lysが付加
したリンホトキシン誘導体をコードすることが確認され
た。
実施例 ６ プラスミドpEH6084で形質転換した大腸菌W3110をアン
ピシリン100mg/を含むLB培地20に接種し、37℃下20
時間の撹拌培養を行った。次に遠心分離により菌体を集
めPBSで洗浄後、100mlのPBSに懸濁した。この菌体液を
超音波発生装置で破砕した後、遠心分離（トミー精工:R
B20BH,15,000回転、30分間）により菌体抽出液125mlを
得た。この粗抽出液のリンホトキシン活性は4.4×108U/
mlであった。次に、予め0.2Mリン酸緩衝液で十分に平衡
化したゲル濾過担体であるSephacryl S−200（ファルマ
シア）φ113×900mmに付した。
リンホトキシン活性を示す画分を集めた後、一部を抗
リンホトキシンマウスモノクローナル抗体カラム30mlに
付した。同抗体カラムは組換リンホトキシンをマウスに
免疫して作成したモノクローナル抗体をSepharose 4B
（ファルマシア）に結合して作成した。同カラムを0.2M
リン酸緩衝液で十分に平衡換し、先の部分精製したリン
ホトキシン誘導体を吸着させた後に同緩衝液で洗浄し、
3M KSCMを含む0.2Mリン酸緩衝液で溶出させた。次にSep
hadex G−25（ファルマシア）で脱塩を行い、SDS−ポリ
アクリルアミド電気泳動で純度検定を行ったところ、分
子量約16,000の単一バンドであった。また、NH2末端配
列を調べたところ、その構造はMet Lys Pro Ala Ala Hi
s Leu IIe Gly Aspであった。
実施例 ７ プラスミドpEH7084で形質転換した大腸菌JM83をアン
ピシリン100mg/を含むLB培地200mlに接種し、37℃下1
8時間の振とう培養を行った。次に遠心分離により菌体
を集めPBS（Dalbecco）で洗浄後、2mlのPBSに懸濁し
た。この菌体液を超音波発生装置で破砕した後、遠心分
離により菌体抽出液を得た。この粗抽出液を無菌濾過
（0.22μｍ）した後、濾液を抗リンホトキシンマウスモ
ノクローナル抗体カラム2mlに付した。同カラムは50mM
Tris HCl pH8.0緩衝液で十分に平衡化し、先のリンホト
キシン誘導体を吸着させた後に同緩衝液で洗浄を行っ
た。次に3M KSCNを含む50mM Tris HCl pH8.0緩衝液で溶
出させた。溶出液は直ちにPBS（Dulbecco）緩衝液に透
析した。
実施例 ８ プラスミドpEH8084で形質転換した大腸菌JM83をアン
ピシリン100mg/を含むLB培地200mlに接種し、37℃下1
8時間の振とう培養を行った。次に遠心分離により菌体
を集めPBS（Dulbecco）で洗浄後、2mlのPBSに懸濁し
た。この菌体液を超音波発生装置で破砕した後、遠心分
離により菌体抽出液を得た。この粗抽出液のリンホトキ
シン活性は6.6×107/mlであった。次に、同抽出液を無
菌濾過（0.22μｍ）した後、抗リンホトキシンマウスモ
ノクローナル抗体カラム2mlに付した。前記と同様の方
法で溶出させ、PBSに透析して2.9×107U/mlの活性を含
む2ml溶液を得た。SDS−ポリアクリルアミド電気泳動で
は分子量約16,000の単一バンドを与え、NH2末端配列はP
ro Ala Ala His Leu IIe Gly Aspであった。
〔発明の効果〕
実験例をもって本発明の効果を説明する。
実験例 １ ＜試 料＞ プラスミドpEH6084を発現し、精製し、最終目的物質
Ａを得て、これを検体試料とした。別に対照試料として
天然リンホトキシンを用意した。
＜方 法＞ インジケータ細胞としてヒト肺癌細胞（PC−10）、ヒ
ト結腸腺癌細胞（WiDr）及びヒト繊維肉腫細胞（HT108
0）を使用した。各細胞株を２〜５×104/Wellの密度で9
6Wellミクロタイタープレートに添加し、各試料を含む
培地及びアクチノマイシンＤ（PC−10の場合には0.1μg
/ml、WiDr及びHT1080の場合には0.5μg/ml）を添加し
た。湿潤CO2存在下で12〜15時間培養し、生存細胞をCry
stal violetで固定染色し、染色された細胞より色素を
抽出し、その吸光値を測定した。試料添加前の生存値を
100％として、試料添加による生存率を求めた。
＜結 果＞ 結果を図12−図14に示す。図12〜図14はそれぞれイン
ジケーター細胞としてPC−10,WiDr,HT1080を使用した場
合の結果であり、図中、△印線は天然リンホトキシン、
○印線は目的物質Ａをそれぞれ試料としたときのリンホ
トキシン活性と生存率の関係を示すグラフである。
図12〜図14より、本発明で示される137個のアミノ酸
配列にリンホトキシンの抗腫瘍活性があることが知られ
る。
実験例 ２ ＜試 料＞ プラスミドpHE6084,pH7084,pEH8084をそれぞれ発現
し、精製し、最終目的物質B,C,Dを得て、これを検体試
料とした。別に対照試料として天然リンホトキシンを用
意した。
＜方 法＞ インジケータ細胞としてヒト肺癌細胞（PC−10）、ヒ
ト結腸腺癌細胞（WiDr）及びヒト繊維肉腫細胞（HT108
0）を使用した。各細胞株を２〜５×104/Wellの密度で9
6Wellミクロタイタープレートに添加し、各試料を含む
培地及びアクチノマイシンＤ（PC−10の場合には0.1μg
/ml、WiDr及びHT1080の場合には0.5μg/ml）を添加し
た。湿潤CO2存在下で20時間培養し、生存細胞をCrystal
violetで固定染色し、染色された細胞より色素を抽出
し、その吸光値を測定した。試料添加前の生存値を100
％として、試料添加による生存率を求めた。
＜結 果＞ 結果を図15に示す。図15の（ａ），（ｂ），（ｃ）は
それぞれインジケーター細胞としてPC−10,WiDr,HT1080
を使用した場合の結果であり、図中、●印線、△印線、
□印線、▽印線はそれぞれ天然リンホトキシン、目的物
質B,C,Dを試料としたときのリンホトキシン活性と生存
率の関係を示すグラフである。
図15（ａ），（ｂ），（ｃ）より、本発明で示される
137個のアミノ酸配列にリンホトキシンの抗腫瘍活性が
あることが知られる。
実験例 ３ 実験例２の試料B,C,Dについてエンザイムイムノアッ
セイ法により、マウスＬ−P3細胞に対する活性を求め、
天然リンホトキシンの活性（0.5〜１×108U/mg蛋白）を
標準にして、各試料の生物活性を算出した。
index 天然リンホトキシン 1.0 Ｂ 7.3 Ｃ 5.6 Ｄ 6.2 上記結果より、本発明リンホトキシン誘導体の活性は
天然リンホトキシンよりも５〜８倍大きいことが知られ
る。
【図面の簡単な説明】
図１はリンホトキシンcDNAのアミノ酸コーディング領域
の塩基配列の図である。 図２はpMLT3020の構築工程図である。 図３はpUG5001およびpMLT5001Aの各構築工程図である。 図４はpEH5123の構築工程図である。 図５はpPU5004の構築工程図である。 図６はpMLT5011の構築工程図である。 図７はpEH6084の構築工程図である。 図８はpEH7084の構築工程図である。 図９はpEH8084の構築工程図である。 図10はpBRD8050の構築工程図である。 図11はpEH5050の構築工程図である。 図12、13、14はそれぞれ実験例１の結果を示すグラフ、
図15は実験例２の結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 四方 靖 茨城県つくば市春日４―19―13 エーザ イ紫山寮311号 (72)発明者 桑田 学 茨城県牛久市牛久町3010―118 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/12 - 15/28 C12N 1/21 C07K 14/51 - 14/57 A61K 37/02 C12P 21/00 - 21/02 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ，Ｂ ＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分子中に下記一次構造式で示されるアミノ
    酸配列を含有する新規な組換リンホトキシン誘導体。 （式中、A1はPro又はValを表す）
  2. 【請求項２】アミノ酸配列のNH2末端に１〜４個のアミ
    ノ酸が連結しているか、又はアミノ酸が連結していない
    請求項１記載の組換リンホトキシン誘導体。
  3. 【請求項３】アミノ酸配列のNH2末端に連結するアミノ
    酸がMet−Lysである請求項２記載の組換リンホトキシン
    誘導体。
  4. 【請求項４】アミノ酸配列のNH2末端に連結するアミノ
    酸がSer−Thr−Leu−Lysである請求項２記載の組換リン
    ホトキシン誘導体。
  5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換
    リンホトキシン誘導体をコードするcDNA。
  6. 【請求項６】請求項５記載のcDNAを外来遺伝子として含
    み、かつ、選択した宿主内で制御および発現が可能とな
    るように連結して得られた発現プラスミド。
  7. 【請求項７】発現プラスミドが下記によって識別表示さ
    れる請求項６記載の発現プラスミド。 pEH6084,pEH7084,pEH8084,pBRD8050,pEH5050
  8. 【請求項８】請求項６又は７記載の発現プラスミドによ
    り形質転換される宿主。
  9. 【請求項９】請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換
    リンホトキシン誘導体を有効成分として含有する抗腫瘍
    剤。
  10. 【請求項１０】請求項８記載の宿主を培養し、培養液か
    ら回収することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に
    記載の組換リンホトキシン誘導体の製造方法。
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MA23841A1 (fr) * 1995-04-07 1996-12-31 Alberto Vazquez Figueroa Rial Installation pour dessaler l'eau de mer par osmose inverse par pression propre et methode pour dessaler l'eau de mer par osmose inverse par pression propre

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