JP2759365B2 - 免疫学的測定方法およびその試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学的凝集反応を利用した測定方法およ
び測定用試薬に関する。特には、低分子化合物の免疫学
的測定方法および測定用試薬に関する。

［従来の技術］ 近年、医療分野において、治療経過の観察や疾病診断
のために、血液や尿などの生体液体試料中に存在する微
量成分を迅速、簡便かつ高精度で測定することが、重要
な課題となっている。このような測定には、抗原抗体反
応による凝集を利用する方法が広く用いられている。例
えば、抗原または抗体などの免疫学的活性物質で微粒子
状不溶性担体を感作し、この感作担体と検査対象物質含
有液体試料とを接触させ、感作担体と検査対象物質との
抗原抗体反応によって起きる凝集を目視的または光学的
に確認して、検査対象物質の存在（定性）および／また
は濃度（定量）を分析することができる。

ここで、臨床検査の対象とする検査対象物質として
は、具体的には、タンパク質やポリペプチドなどの高分
子化合物から、薬物、ペプチド、糖類または核酸などの
低分子化合物に至るまでの広範な化合物が存在する。

しかしながら、特に低分子化合物を免疫反応に由来す
る凝集法で分析する場合には、その低分子化合物に特有
の困難な問題がある。

即ち、低分子化合物の場合には、それが含んでいる抗
原決定基の数が少ないので、高分子化合物についての分
析方法をそのまま利用することができない。例えば、抗
体で感作した不溶性担体に、多数の抗原決定基を含む高
分子化合物を接触させると凝集反応が起きるのに対し
て、抗原決定基を１個しか含まない低分子化合物を接触
させても凝集反応は当然起こらない。また、その低分子
化合物が２個または３個程度の抗原決定基を有していて
も、分子それ自体が小さいので、立体障害のために凝集
が起こらないかあるいは極めて困難になる。

特開昭60−20149号公報には、二種類の担体を用いる
技術が記載されている。即ち、検査対象物質であるハプ
テン（低分子化合物）で感作した担体と、そのハプテン
に対する抗体で感作した担体と、被検液体試料とを接触
させ、二種類の担体の凝集反応を、試料中の検査対象物
質が阻害する程度を測定することによって検査対象物質
の存在または濃度を分析する技術が記載されている。し
かしながら、この特許公報に記載の技術にも、感度が低
いという問題があった。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明者は、従来技術における前記の問題点を、従来
技術の観点とは全く異なる手段によって解決することが
できることを見いだした。即ち、凝集反応を直接的に起
こすことが不可能または困難な検査対象化合物（ａ）
（特に低分子化合物）に対する抗体（ｂ）と、その検査
対象化合物（ａ）それ自体との抗原抗体反応複合体
［（ａ）＋（ｂ）］を作製し、続いてその複合体
［（ａ）＋（ｂ）］に対する第２の抗体（ｃ）を作製
し、そしてその第２の抗体（ｃ）を利用することによっ
て前記の問題を解決することができることを見い出し
た。本発明は、この知見に基づくものである。

［課題を解決するための手段］ 従って、本発明は、 （ｉ）検査対象化合物（ａ）と、 この検査対象化合物（ａ）に対する第１次抗体（ｂ）
と の抗原抗体反応複合体に対する第２次抗体（ｃ）を担持
した不溶性担体（Ｘ）、 （ii）前記の第１次抗体（ｂ）、またはその第１次抗体
（ｂ）を担持した不溶性若しくは可溶性の担体（Ｙ）お
よび （iii）被検試料（ｄ） を接触させ、次いで、試料（ｄ）中の検査対象化合物
（ａ）と、不溶性担体（Ｘ）と、第１次抗体（ｂ）また
は担体（Ｙ）とによる凝集反応を測定することを特徴と
する、免疫学的測定方法に関する。

更に、本発明は、 （ｉ）検査対象化合物（ａ）と、 この検査対象化合物（ａ）に対する第１次抗体（ｂ）
と の抗原抗体反応複合体に対する第２次抗体（ｃ）を担持
した不溶性担体（Ｘ）、および （ii）前記の第１次抗体（ｂ）、またはその第１次抗体
（ｂ）を担持した不溶性若しくは可溶性の担体（Ｙ） を含むことを特徴とする、免疫学的測定用試薬にも関す
る。

以下、本発明の構成を詳細に説明する。

本発明において検査対象化合物（ａ）とは、抗原決定
基の数が少ないか、あるいは複数部位での抗原抗体反応
を妨げる立体障害が起きるために、その抗体で感作した
担体を用いては直接凝集反応を起こすことが不可能また
は困難な化合物である。例えば、分子量が数百程度の薬
毒物の場合には、その基本骨格を色々な方向から認識す
る抗体が数種類は存在することが予想される。しかしな
がら、実際の抗原抗体反応の場においては立体障害のた
めに直接的に凝集反応を起こすことは一般にできない。
また、ペプチド抗原では、分子量2,000〜3,000当たりに
１個の抗原決定基が存在するものと一般に考えられてい
る。しかしながら、分子量が約5,000以下のペプチドに
おいては、複数部位での抗原抗体反応を妨げる立体障害
が起きる可能性が高い。従って、本発明の検査対象化合
物（ａ）は、薬毒物の場合には、分子量が数百程度の化
合物であり、ペプチドやタンパク質の場合には、分子量
が約5,000以下の化合物である。

これらの低分子化合物の具体例としては、薬毒物（例
えば、バルビツール系催眠剤）ペプチド（例えば、キニ
ン類、カルシトニン）、低分子タンパク質（例えば、酵
素的分解産物）、糖類（例えば、グルコース、腫瘍関連
糖鎖抗原）、ステロイドハプテン（例えば、卵胞ホルモ
ン、黄体ホルモン、男性ホルモン、副腎皮質ホルモン、
ビタミンＤ類、コレステロール、胆汁酸、強心性ステロ
イド、サポニン）、生理活性アミン類（例えば、カテコ
ールアミン）を挙げることができる。

前記の検査対象化合物（ａ）に対する第１次抗体
（ｂ）は、公知の方法で調製することができる。検査対
象化合物（ａ）それ自体が免疫原性を有する場合には、
その物質で動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ヒツジ、ウマ、ブタ）を免疫し、免疫動物の抗血清
からポリクローナル抗体を調製するか、あるいは好まし
くはその脾臓細胞を用いる細胞融合により、モノクロー
ナル抗体を調製することができる。

また、検査対象化合物（ａ）それ自体が免疫原性を有
しない場合には、免疫原性を有する高分子キャリア化合
物と結合させて免疫原性を付与してから、動物に投与
し、前記と同様にして第１次抗体（ａ）を調製する。

免疫原性を有する高分子キャリア化合物は、例えばタ
ンパク質（特にウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、
ウシ免疫グロブリン、KLH）である。

検査対象化合物（ａ）と高分子キャリア化合物との結
合には、例えば、グルタルアルデヒド法、カルボジイミ
ド法を用いることができる。

こうして得られた第１次抗体（ｂ）は、不溶性若しく
は可溶性の担体（Ｙ）に担持させるか、または担体に担
持させず単独で、検査対象化合物（ａ）の測定に使用す
ることができる。第１次抗体（ｂ）は多量体（主として
IgM）である場合には、担体に担持させず単独で使用
し、第１次抗体（ｂ）が単量体（主としてIgG）である
場合には、第２次抗体の反応の場を多価に提供するため
に第１次抗体（ｂ）を不溶性若しくは可溶性の担体
（Ｙ）に担持させて使用するのが好ましい。

不溶性担体（Ｙ）としては、例えば、ラテックス粒
子、または赤血球を用いることができる。担体（Ｙ）の
感作は、主として疎水結合による物理吸着法を用いて、
あるいは、カルボキシル基やアミノ基などによって修飾
した担体（Ｙ）と抗体（ｂ）とを架橋剤（例えば、グル
タルアルデヒド、カルボジイミド）で化学的に結合する
方法を用いて実施することができる。

可溶性担体（Ｙ）としては、例えば、デキストランを
用いることができる。この場合の感作は、過ヨウ素酸に
よる化学結合法を用いて実施することができる。

検査対象化合物（ａ）と第１次抗体（ｂ）との抗原抗
体反応複合体［（ａ）＋（ｂ）］の調製は、以下のとお
りに行うことができる。

即ち、第１次抗体（ｂ）がポリクローナル抗体である
場合には、アフィニティークロマトグラフィーの手法を
用いて検出対象化合物（ａ）に特異的に反応する第１次
抗体（ｂ）を得た後、検査対象化合物（ａ）の過剰量存
在下に第１次抗体（ｂ）と反応させ、反応に関与しない
検査対象化合物（ａ）をゲル過法によって除去し、抗
原抗体反応複合体［（ａ）＋（ｂ）］を得ることができ
る。

更に、第１次抗体（ｂ）がモノクローナル抗体である
場合には、抗体を精製した後、前記のポリクローナル抗
体に関連して説明したのと同様の方法で、検査対象化合
物（ａ）の過剰量存在したに第１次抗体（ｂ）と反応さ
せ、ゲル過法によって処理して、抗原抗体反応複合体
［（ａ）＋（ｂ）］を得ることができる。

更に、抗原抗体反応複合体［（ａ）＋（ｂ）］に対す
る第２次抗体（ｃ）は、複合体［（ａ）＋（ｂ）］で動
物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、
ウマ、ブタ）を免疫し、免疫動物の抗血清からポリクロ
ーナル抗体を調製するか、あるいは好ましくはその脾臓
細胞を用いる細胞融合により、モノクローナル抗体を調
製することができる。

即ち、ポリクローナル抗体を得る場合には、始めに抗
原抗体反応複合体［（ａ）＋（ｂ）］を固定化して得た
アフェニティーカラムに、抗血清を流して吸着画分を調
製し、続いて、検査対象化合物（ａ）の固定化カラムお
よび第１次抗体（ｂ）の固定化カラムに前記の吸着画分
を流して非吸着画分を採集し、第２次抗体（ｃ）とする
ことができる。

モノクローナル抗体の場合には、ELISA法により、検
査対象化合物（ａ）および第１次抗体（ｂ）とは反応せ
ず、抗原抗体反応複合体［（ａ）＋（ｂ）］とは反応す
る抗体を選ぶことにより、第２次抗体（ｃ）とすること
ができる。

こうして得られた第２次抗体（ｃ）で不溶性担体
（Ｘ）を感作する。担体（Ｘ）の感作は、主として疎水
結合による物理吸着法を用いて、あるいは、カルボキシ
ル基やアミノ基などによって修飾した担体（Ｘ）と抗体
（ｃ）とを架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、カル
ボジイミド）で化学的に結合する方法を用いて実施する
ことができる。担体（Ｘ）としては、前記の不溶性担体
（Ｙ）と同様のものを用いることができる。こうして本
発明で用いる第２次抗体感作不溶性担体（Ｘ）を得るこ
とができる。

本発明で用いる被検試料（ｄ）は、検査対象化合物
（ａ）を含むおそれのある試料、例えば、水性液体、特
に生体試料（例えば、全血液、血清、尿）である。

第２次抗体（ｃ）感作不溶性担体（Ｘ）と、第１次抗
体（ｂ）またはその第１次抗体（ｂ）担持担体（Ｙ）と
を含む液体に、被検試料（ｄ）を加えると、その被検試
料（ｄ）中に検査対象化合物（ａ）が存在している場合
には凝集反応が起きる。即ち、第１図に示すように、不
溶性担体１に担持された第２次抗体２が、検査対象物質
３と第１次抗体４との複合体５を介して相互に結合し、
この結果凝集が起きる。ここで、仮に、第１次抗体４で
不溶性担体１を感作し、その担体１と検査対象物質３と
を接触させても、検査対象物質３の抗原決定基の数が少
ないか、あるいは立体障害のために、相互の結合がまっ
たくあるいはほとんど起こらず、凝集が観察されない。

凝集反応は、被検試料中に含まれる検査対象物質の量
に依存するので、凝集の程度を、従来公知の方法で、目
視的（肉眼）または光学的（光学測定機器の使用）に測
定することによって検査対象物質の定量を、バッチ式に
あるいは連続式に行うことができる。

本発明の試薬は、第２次抗体（ｃ）を担持した不溶性
担体（Ｘ）からなる第１成分と、第１次担体（ｂ）また
はその第１次抗体（ｂ）を担持した不溶性若しくは可溶
性の担体（Ｙ）からなる第２成分とからなる。第１成分
と第２成分は、懸濁液または溶液であり、好ましくは抗
菌剤（例えば、アジ化ナトリウム）の存在下に、低温下
（好ましくは１〜10℃）で保存することができる。

被検試料（ｄ）中の検査対象化合物（ａ）の測定は、
被検試料（ｄ）と第１成分と第２成分とを同時に混和
し、任意の時間（例えば、１分間以上）反応させた後、
目視的（肉眼）または光学的（光学測定機器の使用）に
より測定することができる。また、被検試料（ｄ）と第
２成分とを最初に混和して任意の時間（例えば、１分間
以上）反応させた後、更に第１成分を加えて任意の時間
（例えば、１分間以上）反応させ、目視的（肉眼）また
は光学的（光学測定機器の使用）により測定することが
できる。

［実施例］ 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

例１ （１）ジゴキシン−BSAコンジュゲート（複合体）の調
製 カルボジイミド法（B.B.A.:BiochimicaetBiophysicaA
CTA 842,90−99）に準じ、ジゴキシン（分子量780）を
キャリアタンパク質である牛血清アルブミン（BSA）に
共有結合させた。即ち、ジゴキシン6mg、BSA3mgおよび
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド30mgを、0.9％塩化ナトリウム溶液1ml中に溶
解し、20℃で16時間保温し、0.9％塩化ナトリウム溶液
（４℃）で透析した。得られた透析液（1.0mg/ml、25m
l）をジゴキシンに対するモノクローナル抗体作製用の
免疫抗原として使用し、更に、抗ジゴキシンモノクロー
ナル抗体産生性ハイブリドーマを選別するためのELISA
用抗原として使用した。カップリング効率は約30％であ
った。

（２）免疫化脾細胞の調製 ジゴキシン−BSAコンジュゲート免疫原溶液（1.0mg/m
l）を等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化する
まで混合し、その混合液200μｌをマウス腹腔内に投与
することにより免疫を行った（第１回免疫）。30日経過
後、そのマウスに前記と同様の混合液200μｌをマウス
腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から21日
経過後、ジゴキシン−BSAコンジュゲート免疫原溶液
（1.0mg/ml）を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液
200μｌを、前記マウスの静脈内に投与した（最終免
疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓を無菌的にマウス
から取り出し、次の細胞融合工程に使用した。

（３）細胞融合工程 無菌的に摘出した前記の脾臓を、15％ウシ胎児血清を
含むDME培地5lを入れたシャーレに入れた。次に脾臓を1
5％ウシ胎児血清を含むDME培地約5mlで還流して脾臓細
胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイロンメッ
シュに通した。この脾臓細胞を50ml遠心チューブに集
め、500×ｇで10分間遠心した。こうして得られたペレ
ットにヘモライジング溶液（155mMNH₄Cl、10mMKHCO₃、1
mMNa₂EDTA pH7.0）4mlを加え、懸濁させた。０℃で５分
間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。15％ウシ胎
児血清10mlを含むDME培地を加えてから遠心分離した。
このようにして得た細胞ペレットをDME培地で遠心法に
よって洗浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。

一方、予め培養しておいたマウスエミローマ細胞（骨
髄腫細胞）SP 2/O−Ag14（理化学研究所ジーンバンク細
胞銀行）約２×10⁷個に前記脾臓細胞１×10⁸個を加え、
DME培地中で良く混合し、遠心分離を行った（500×ｇ、
10分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐ
し、40％ポリエチレングリコール4000溶液（38℃に保
温）0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やか
に回転することによってポリエチレングリコール溶液を
細胞ペレットを混合させた。次に38℃に保温しておいた
DME培地を30秒毎に1ml加えて、チューブを穏やかに回転
させた。この操作を10回繰り返した後、15％ウシ胎児血
清20mlを含むDME培地を加えて、遠心分離（500×ｇ、10
分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを15
％ウシ胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプテリ
ン４×10^-7Ｍ、チミジン1.6×10^-5Ｍ、ヒポキサンチン
１×10^-4Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によ
って２回洗浄後、40mlの前記HAT培地に懸濁した。この
細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに20
0mlずつ分注し、37℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培
養器で培養を開始した。培養注、２〜３日間隔で各ウェ
ルの培地を約100μｌ除き、新たに前記のHAT培地100μ
ｌを加えることにより、HAT培地注で増殖するハイブリ
ドーマを選択した。８日目から15％ウシ胎児血清を含む
HAT培地（DME培地にチミジン1.6×10^-5Ｍ、ヒポキサン
チン１×10^-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、
ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、10日目に後
述するELISA法によりジゴキシン抗体産生ハイブリドー
マをスクリーニングした。

（４）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はELISA
法により測定した。96ウェルELISA用プレート（Immulon
II、日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記
のジゴキシン−BSAコンジュゲート免疫原溶液（50μg/m
l、生理食塩水で希釈）50μｌずつを分注し、25℃で２
時間放置した（プレートＡ）。

同様に、別のプレートにBSA（50μg/ml）を50μｌず
つ分注する（プレートＢ）。次に、0.05％Tween20−生
理食塩水で３回洗浄した後、各ウェルに培養上清50μｌ
を加え、25℃で１時間反応させた。

次に、Tween20−生理食塩水で200倍に稀釈したペルオ
キシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50
μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20
−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、0.5mMアミノア
ンチピリン、10mMフェノールおよび0.005％過酸化水素
水を含む溶液250μｌを各ウェルに加え、25℃で30分間
反応させ、各ウェルの490nmにおける吸光度を測定した
（プレートＡで反応し、プレートＢで反応しないウェル
の検索）。その結果、192ウェル中４ウェルに、抗ジゴ
キシン抗体産生が認められた。そのウェル中のハイブリ
ドーマを24ウェルプレートに移し、15％ウシ胎児血清を
含むHT培地で、４〜５日間培養した。その後、再度ELIS
A法によって、キャリアタンパク質（BSA）に反応しない
抗ジゴキシン抗体の産生の有無を確認してから限界希釈
法によりクローニングした。限界希釈法は、HT培地でハ
イブリドーマが５個/mlとなるように希釈した細胞浮遊
液を、予め正常BALB/C系マウスの腹腔細胞がウェルあた
り２×10⁴個分中してある96ウェルプレートの各ウェル
に100μｌずつ分注した。10日後、ELISA法によって、抗
ジゴキシン特異抗体を産生するハイブリドーマのクロー
ンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマ
につき、20〜40個の抗体産生クローンの中から、増殖性
が良好で、抗体分泌能が高く、しかも、安定なクローン
を選び、前記と同様の方法で再クローン化を行い、抗ジ
ゴキシン特異的抗体産生ハイブリドーマDIG−１を樹立
した。

（５）モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマDIG−１を15％ウシ胎児血清を
含むDME培地中で37℃、５％二酸化炭素雰囲気中におい
て72〜96時間培養した。培養物を遠心分離（10000×
ｇ、10分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを50％最
終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で30
分間攪拌した後、60分間放置し、遠心分離（10000×
ｇ、10分）後、得られた沈殿物を少量の10mMリン酸緩衝
液（pH8.0）に溶解し、1000倍量の10mMリン酸緩衝液に
対して透析した。これを、10mMリン酸緩衝液で既に平衡
化したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モノクロ
ーナル抗体の溶出は10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2MN
aClを含む10mMリン酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法
によって行った。溶出されたモノクローナル抗体を限界
過法で濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して
透析した。ウシ血清1gGを除くために、透析物をヤギ抗
ウシ血清IgG−セファロース4Bのカラムに通した。次
に、透過液を0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化した
プロテインＡ−セファロール4Bのカラムに充填した。カ
ラムをpH3.5の緩衝液で溶出して、精製したジゴキシン
特異抗体DIG−１の溶液を得た。

（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカ
ン）0.5mlを10〜12週令のBALB/c系マウスの腹腔内に投
与し、14〜20日経過した後のマウス腹腔内に、イン・ビ
トロで増殖させたハイブリドーマDIG−１をマウス一匹
当たり２×10⁶細胞となるように接種した。

各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約10〜15ml
の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜10mg/mlであ
った。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記のイ
ン・ビトロ精製法と同様の方法（但し、ヤギ抗ウシ血清
IgG−セファロース4Bのカラムを通す操作を除く）行な
った。

（６）モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスおよ
び特異性の同定 抗ジゴキシン特異モノクローナル抗体のDIG−１の免
疫グロブリンクラスおよび特異性の同定を、オクテロニ
ー免疫拡散法およびエンザイムイムノアッセイ法により
行った結果、モノクローナル抗体DIG−１の免疫グロブ
リンクラスはIgG1であることがわかった。

（７）ジゴキシン−DIG−１（抗ジゴキシンモノクロー
ナル抗体）複合体の調製、免疫化した脾臓細胞の調製、
細胞融合およびハイブリドーマの樹立 精製抗体DIG−１の1mg（1mg/ml,0.9％NaCl）とジゴキ
シン1mg（1mg/ml,0.9NaCl）とを混合し、20℃で１時間
保温した。この混合液をセファデックスＧ−25ゲル過
カラムにかけ、遊離のジゴキシンを除去し、ジゴキシン
−DIG−１複合体を得た。このジゴキシン−DIG−１複合
体（1.0mg/ml,0.9％NaCl）を当量のフロイド氏完全アジ
ュバントと乳化するまで混合し、その混合液200μｌを
マウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１
回免疫）。30日経過後、そのマウスに前記と同様の混合
液200μｌをマウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。
この第２回免疫から21日経過後、ジゴキシン−DIG−１
免疫原溶液（1.0mg/ml）の等量の生理食塩水で希釈し、
その希釈液200μｌを、前記マウスの静脈内に投与した
（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓を無菌的
にマウスから取り出し、抗ジゴキシン特異性抗体DIG−
１の方法と同様の方法で細胞融合を行った。細胞融合処
理から12日目にELISA法により、ジゴキシン−DIG−１複
合体に対して特異的に反応する抗体を産生するハイブリ
ドーマのスクリーニングを行った。

即ち、96ウェルELISA用プレート（ImmulonII、日本ダ
イナテック株式会社）の各ウェルに前記のジゴキシン−
BSAコンジュゲート溶液50μg/mlを50μｌずつ分注し、2
5℃で２時間放置した（プレートＣ）。同様に、別々の
プレートに、DIG−１およびジゴキシン−DIG−１複合体
をそれぞれ50μg/mlの濃度で50μｌずつ分注した。（プ
レートＤ、プレートＥ）。次に、0.05％Tween20−生理
食塩水で３回洗浄した後、各ウェルに培養上清50μｌを
加え、25℃で１時間反応させた。

次に、Tween20−生理食塩水で200倍に希釈したペルオ
キシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50
μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20
−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、0.5mMアミノア
ンチピリン、10mMフェノールおよび0.005％過酸化水素
水を含む溶液250μｌを各ウェルに加え、25℃で30分間
反応させ、各ウェルの490nmにおける吸光度を測定し
た。

その結果、プレートＥで反応し、プレートＣおよびプ
レートＤで反応しないウェルは、288ウェル中で２ウェ
ルに認められた。そのウェル中のハイブリドーマを24ウ
ェルプレートに移し、15％ウシ胎児血清を含むHT培地
で、７日間培養した。その後、再度ELISA法によって、
ジゴキシン−BSAコンジュゲートおよびDIG−１には反応
せず、ジゴキシン−DIG−１複合体に反応する抗体の産
生の有無を確認してから限界希釈法により、クローニン
グを行った。限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが
５個/mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常B
ALB/C系マウスの腹腔細胞がウェルあたり２×10⁴個分注
してある96ウェルプレートの各ウェルに100μｌずつ分
注した。12日後、ELISA法によって、抗ジゴキシン−DIG
−１複合体特異抗体を産生するハイブリドーマのクロー
ンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマ
につき、20〜40個の抗体産生クローンの中から、増殖性
が良好で、抗体分泌能が高く、しかも、安定なクローン
を選び、前記と同様の方法で再クローン化を行い、抗ジ
ゴキシン−DIG−１複合体特異的抗体を産生するハイブ
リドーマDIG−２を樹立した。

（８）モノクローナル抗体の製造と免疫グロブリンクラ
スの同定 モノクローナル抗体DIG−２の製造とサブクラスの同
定は、前記と同様の操作を行った結果、モノクローナル
抗体DIG−２の免疫グロブリンサブクラスはIgG1であっ
た。

前記のELISA法により調べたモノクローナル抗体DIG−
２の特異性を第２図に示す。第２図において、（ａ）は
ジゴキシン−BSAコンジュゲートのプレート、（ｂ）は
モノクローナル抗体DIG−１のプレート、そして
［（ａ）＋（ｂ）］はジゴキシン−DIG−１複合体のプ
レートを示す。

（９）抗体と不溶性担体との結合 ラテックス溶液（２％、DowChemical社：粒径0.482μ
ｍ）2mlと、DIG−２抗体2.0mg/mlを含有する水溶液2ml
とを混合し、約１時間攪拌した。遠心後（20000g、10
分）、沈殿物を0.1％BSA溶液に懸濁し、約１時間攪拌し
た。再び遠心（20000g、10分）した後、沈殿を水に懸濁
し、約２時間攪拌した。こうして、DIG−２抗体−ラテ
ックス複合体含有液を得た。

（10）スライド凝集反応による定量 前項（９）で調製したDIG−２抗体−ラテックス複合
体含有液30μｌと種々の濃度のジゴキシンを含有する水
溶液30μｌと、一定量のDIG−１を含む水溶液30μｌと
をスライドガラス状で混合、揺動して３分後に凝集像を
目視的に判定した。結果を以下の第１表に示す。

（11）分光学的方法による測定 前項（９）で調製したDIG−２抗体−ラテックス複合
体を用い、自動分析器（LPIA:三菱化成）によって凝集
反応速度のシゴキシン濃度依存性を調べた。反応器内
に、一定量のDIG−１と0.125〜32ng/mlの種々の濃度の
ジゴキシン溶液を分注し、そこにDIG−２抗体−ラテッ
クス含有液を添加した。

対照実験として、DIG−１を除いて同様の操作を行っ
た。得られた結果を第３図に示す。第３図において、○
はDIG−１が存在する本発明方法による実験の結果を、
そして、△はDIG−１を除いた対照実験の結果を、更
に、●はDIG−１抗体を前記（９）の方法と同様の方法
でラテックスに感作して得たDIG−１抗体−ラテックス
を、DIG−２抗体−ラテックスの非存在下で種々の濃度
のジゴキシン溶液と反応させた結果を各々示す。第３図
から明らかなように、ジゴキシン濃度は凝集反応速度
（Ｖ値：単位時間当たりの透過度変化）と良好な相関性
を示している。

例２ （１）カルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲート
（複合体）の調製 グルタルアルデヒド法（Clin. Chem;31:430,1985）に
準じ、ヒトカルシトニン（分子量3500）をキャリアタン
パク質である卵白アルブミンに共有結合させた。即ち、
ヒトカルシトニン（以下、単にカルシトニンと称する）
3mgおよび卵白アルブミン10mgを、0.9％塩化ナトリウム
溶液2.0ml注に溶液し、この溶液に１％（v/v）グルタル
アルデヒド0.2mlを添加し、室温で２時間反応させた
後、0.9％塩化ナトリウム溶液（４℃）で透析した。得
られた透析液を0.9％塩化ナトリウム溶液で1.0mg/mlの
濃度に希釈し、この希釈液をカルシトニンに対するモノ
クローナル抗体作製用の免疫抗原として使用し、更に、
抗カルシトニンモノクローナル抗体産生性ハイブリドー
マを選別するためのELISA用抗原として使用した。カッ
プリング効率は約40％であった。

（２）免疫化脾細胞の調製 カルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲート免疫原
溶液（1.0mg/ml）を等量のフロインド氏完全アジュバン
トと乳化するまで混合し、その混合液200μｌをマウス
腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免
疫）。30日経過後、そのマウスに前記と同様の混合液20
0μｌをマウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２
回免疫から21日経過後、カルシトニン−卵白アルブミン
コンジュゲート免疫原溶液（1.0mg/ml）を等量の生理食
塩水で希釈し、その希釈溶液200μｌを、前記マウスの
静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過
後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、次の細胞融合
工程に使用した。

（３）細胞融合工程 無菌的に摘出した前記の脾臓を、15％ウシ胎児血清を
含むDME培地5mlを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓
を15％ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで還流して脾
臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイロン
メッシュに通した。この脾臓細胞を50ml遠心チューブに
集め、500×ｇで10分間遠心した。こうして得たペレッ
トにヘモライジング溶液（155mMNH₄Cl、10mMKHCO₃、1mM
Na₂EDTA pH7.0）4mlを加え、懸濁させた。０℃で５分間
放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。15％ウシ胎児
血清10mlを含むDME培地を加えてから遠心分離した。こ
うして得た細胞ペレットをDME培地で遠心法によって洗
浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。

一方、予め培養しておいたマウスエミローマ細胞（骨
髄腫細胞）SP 2/O−Ag−14（理化学研究所ジーンバンク
細胞銀行）約２×10⁷個に前記脾臓細胞１×10⁸個を加
え、DME培地注で良く混合し、遠心分離を行った（500×
ｇ、10分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解き
ほぐし、40％ポリエチレングリコール4000溶液（38℃に
保温）0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏や
かに回転することによってポリエチレングリコール溶液
と細胞ペレットを混合させた。次に、38℃に保温してお
いたDME培地を30秒毎に1ml加えて、チューブを穏やかに
回転させた。この操作を10回繰り返した後、15％ウシ胎
児血清20mlを含むDME培地を加えて、遠心分離（500×
ｇ、10分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレッ
トを15％ウシ胎児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノ
プテリン４×10^-7Ｍ、チミジン1.6×10^-5Ｍ、ヒポキサ
ンチン１×10^-4Ｍになるように添加したもの）で、遠心
法によって２回洗浄後、40mlの前記HAT培地に懸濁し
た。この細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートの各ウ
ェルに200mlずつ分注し、37℃、５％炭酸ガスを含む炭
酸ガス培養器で培養を開始した。培養注、２〜３日間隔
で各ウェルの培地を約100μｌ除き、新たに前記のHAT培
地100μｌを加えることにより、HAT培地注で増殖するハ
イブリドーマを選択した。７日目から15％ウシ胎児血清
を含むHAT培地（DME培地にチミジン1.6×10^-5Ｍ、ヒポ
キサンチン１×10^-4Ｍになるように添加したもの）に交
換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、11日
目に、後述するELISA法によりジゴキシン抗体産生ハイ
ブリドーマをスクリーニングした。

（４）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はELISA
法により測定した。96ウェルELISA用プレート（Immulon
II、日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記
のカルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲート免疫原
溶液（50μg/ml、生理食塩水で希釈）50μｌずつを分注
し、25℃で２時間放置した（プレートＦ）。

同様に、別のプレートに卵白アルブミン（50μg/ml）
を50μｌずつ分注する（プレートＧ）。次に、0.05％Tw
een20−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウェルに培養
上清50μｌを加え、25℃で１時間反応させた。

次に、Tween20−生理食塩水で200倍に希釈したペルオ
キシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50
μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20
−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、0.5mMアミノア
ンチピリン、10mMフェノールおよび0.005％過酸化水素
水を含む溶液250μｌを各ウェルに加え、25℃で30分間
反応させ、各ウェルの490nmにおける吸光度を測定した
（プレートＦで反応し、プレートＧで反応しないウェル
の検索）。その結果、192ウェル中３ウェルに、抗カル
シトニン抗体産生が認められた。そのウェル中のハイブ
リドーマを24ウェルプレートに移し、15％ウシ胎児血清
を含むHT培地で、４〜５日間培養した。その後、再度EL
ISA法によって、キャリアタンパク質（卵白アルブミ
ン）に反応しない抗カルシトニン抗体の産生の有無を確
認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希
釈法は、HT培地でハイブリドーマが５個/mlとなるよう
に希釈した細胞浮遊液を、予め正常BALB/C系マウスの腹
腔細胞がウェルあたり２×10⁴個分注してある96ウェル
プレートの各ウェルに100μｌずつ分注した。８日後、E
LISA法によって、抗ジゴキシン特異抗体を産生するハイ
ブリドーマのクローンをスクリーニングにした。その結
果、各ハイブリドーマにつき、30〜50個の抗体産生クロ
ーンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、し
かも、安定なクローンを選び、前記と同様の方法で再ク
ローン化を行い、抗ジゴキシン特異的抗体産生ハイブリ
ドーマCAL−１を樹立した。

（５）モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマCAL−１を15％ウシ胎児血清を
含むDME培地注で37℃、５％二酸化炭素雰囲気中におい
て72〜96時間培養した。培養物を遠心分離（10000×
ｇ、10分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを50％最
終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で30
分間攪拌した後、60分間放置し、遠心分離（10000×
ｇ、10分）後、得られた沈殿物を少量の10mMリン酸緩衝
液（pH8.0）に溶解し、1000倍量の10mMリン酸緩衝液に
対して透析した。これを、10mMリン酸緩衝液で既に平衡
化したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モノクロ
ーナル抗体の溶出は10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2MN
aClを含む10mMリン酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法
によって行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外
過法で濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して
透析した。ウシ血清1gGを除くために、透析物をヤギ抗
ウシ血清IgG−セファロース4Bのカラムに通した。次
に、透過液を0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化した
プロテインＡ−セファロース4Bのカラムに充填した。カ
ラムをpH3.5の緩衝液で溶出して、精製したカルシトニ
ン特異抗体CAL−１の溶液を得た。

（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカ
ン）0.5mlを10〜12週令のBALB/c系マウスの腹腔内に投
与し、14〜20日経過した後のマウス腹腔内にイン・ビト
ロで増殖させたハイブリドーマCAL−１をマウス一匹当
たり２×10⁶細胞となるように接種した。

各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約10〜15ml
の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜10mg/mlであ
った。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記のイ
ン・ビトロ精製法と同様の方法（但し、ヤギ抗ウシ血清
IgG−セファロース4Bのカラムを通す操作を除く）行な
った。

（６）モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスおよ
び特異性の同定 抗ジゴキシン特異モノクローナル抗体CAL−１の免疫
グロブリンクラスおよび特異性の同定を、オクテロニー
免疫拡散法およびエンザイムイムノアッセイ法により行
った結果、モノクローナル抗体CAL−１の免疫グロブリ
ンクラスはIgG2aであることがわかった。

（７）カルシトニン−CAL−１（抗カルシトニンモノク
ローナル抗体）複合体の調製、免疫化した脾臓細胞の調
製、細胞融合およびハイブリドーマの樹立 精製抗体CAL−１の1mg（1mg/ml,0.9％NaCl）とカルシ
トニン1mg（1mg/ml,0.9％NaCl）とを混合し、20℃で１
時間保温した。この混合液をセファデックスＧ−50ゲル
過カラムにかけ、遊離のカルシトニンを除去し、カル
シトニン−CAL−１複合体を得た。このカルシトニン−C
AL−１複合体（1.0mg/ml,0.9％NaCl）を等量のフロイン
ド氏完全アジュバントと乳化するまで混合し、その混合
液200μｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を
行った（第１回免疫）。30日経過後、そのマウスに前記
と同様の混合液200μｌをマウス腹腔内に投与した（第
２回免疫）。第２回免疫から21日経過後、カルシトニン
−CAL−１複合体免疫原溶液（1.0mg/ml）を等量の生理
食塩水で希釈し、その希釈液200μｌを、前記マウスの
静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過
後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、抗カルシトニ
ン特異性抗体CAL−１の方法と同様の方法で細胞融合を
行った。細胞融合処理から14日目にELISA法により、カ
ルシトニン−CAL−１複合体に対して特異的に反応する
抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行っ
た。

即ち、96ウェルELISA用プレート（ImmulonII、日本ダ
イナテック株式会社）の各ウェルに前記のカルシトニン
−卵白アルブミンコンジュゲート溶液50μg/mlを50μｌ
ずつ分注し、25℃で２時間放置した（プレートＨ）。同
様に、別々のプレートに、CAL−１およびカルシトニン
−CAL−１複合体をそれぞれ50μg/mlの濃度で50μｌず
つ分注した。（プレートＩ、プレートＪ）。次に、0.05
％Tween20−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウェルに
培養上清50μｌを加え、25℃で１時間反応させた。

次に、Tween20−生理食塩水で200倍に希釈したペルオ
キシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）50
μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20
−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、0.5mMアミノア
ンチピリン、10mMフェノールおよび0.005％過酸化水素
水を含む溶液250μｌ各ウェルに加え、25℃で30分間反
応させ、各ウェルの490nmにおける吸光度を測定した。

その結果、プレートＪで反応し、プレートＨおよびプ
レートＩで反応しないウェルは、384ウェル中で２ウェ
ルに求められた。そのウェル中のハイブリドーマを24ウ
ェルプレートに移し、15％ウシ胎児血清を含むHT培地
で、11日間培養した。その後、再度ELISA法によって、
カルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲートおよびCA
L−１には反応せず、カルシトニン−CAL−１複合体に反
応する抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によ
り、クローニングを行った。限界希釈法は、HT培地でハ
イブリドーマが５個/mlとなるように希釈した細胞浮遊
液を、予め正常BALB/C系マウスの腹腔細胞がウェルあた
り２×10⁴個分注してある96ウェルプレートの各ウェル
に100μｌずつ分注した。12日後、ELISA法によって、抗
カルシトニン−CAL−１複合体特異抗体を産生するハイ
ブリドーマのクローンをスクリーニングにした。その結
果、各ハイブリドーマにつき、10〜20個の抗体産生クロ
ーンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、し
かも、安定なクローンを選び、前記と同様の方法で再ク
ローン化を行い、抗カルシトニン−CAL−１複合体特異
的抗体を産生するハイブリドーマCAL−２を樹立した。

（８）モノクローナル抗体の製造と免疫グロブリンクラ
スの同定 モノクローナル抗体CAL−２の製造とサブクラスの同
定は、前記と同様の操作を行った結果、モノクローナル
抗体CAL−２の免疫グロブリンサブクラスはIgG1であっ
た。

前記のELISA法により調べたモノクローナル抗体CAL−
２の特異性を第４図に示す。第４図において、（ａ）は
カルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲートのプレー
ト、（ｂ）はモノクローナル抗体CAL−１のプレート、
そして［（ａ）＋（ｂ）］はカルシトニン−CAL−１複
合体のプレートを示す。

（９）抗体と不溶性担体との結合 ラテックス溶液（２％、DowChemical社：粒径0.482μ
ｍ）2mlと、CAL−２抗体2.0mg/mlを含有する水溶液2ml
とを混合し、約１時間攪拌した。遠心後（20000g、10
分）、沈殿物を0.1％BSA溶液に懸濁し、約１時間攪拌し
た。再び遠心（2000g、10分）した後、沈殿を水に懸濁
し、約２時間攪拌した。こうして、CAL−２抗体−ラテ
ックス複合体含有液を得た。

また、ラテックス溶液（２％、DowChemical社：粒径
0.091μｍ）2mlと、CAL−１抗体4.0mg/mlを含有する水
溶液2.0mlとを混合し、約１時間攪拌した。遠心後（200
00g、10分）、沈殿物を0.1％BSA溶液に懸濁し、約１時
間攪拌した。再び遠心（20000g、10分）した後、沈殿を
水に懸濁し、約２時間攪拌した。こうして、CAL−１抗
体−ラテックス複合体含有液を得た。

（10）スライド凝集反応による定量 前項（９）で調製したCAL−２抗体−ラテックス複合
体含有液30μｌと種々の濃度のカルシトニンを含有する
水溶液30μｌと、一定量のCAL−１抗体ラテックスを含
む水溶液30μｌとをスライドガラス状で混合、揺動して
３分後に凝集像を目視的に判定した。結果を以下の第２
表に示す。

（11）分光学的方法による測定 前項（９）で調製したCAL−２抗体−ラテックス複合
体を用い、自動分析器（LPIA:三菱化成）によって凝集
反応速度のカルシトニン濃度依存性を調べた。反応器内
に、一定量のCAL−１抗体ラテックスと0.125〜32ng/ml
の種々の濃度のカルシトニン溶液を分注し、そこにCAL
−２抗体−ラテックス含有液を添加した。

対照実験として、CAL−１抗体ラテックスを除いて同
様の操作を行った。得られた結果を第５図に示す。第５
図において、○はCAL−１が存在する本発明方法による
実験の結果を、そして、△はCAL−１抗体ラテックスを
除いた対照実験の結果を、更に、●はCAL−２抗体−ラ
テックスの非存在下でCAL−１抗体ラテックスと種々の
濃度のカルシトニン溶液と反応させた結果を各々示す。
第５図から明らかなように、カルシトニン濃度は凝集反
応速度（Ｖ値：単位時間当たりの透過度変化）と良好な
相関性を示している。

［発明の効果］ 本発明によれば、従来、抗原抗体反応により凝集を利
用することが不可能あるいは困難であった検査対照物
質、特に低分子化合物についても、凝集反応を行わせる
ことができる。従って、従来、高分子化合物について開
発されてきた凝集反応を利用する臨床検査技術を、低分
子化合物に対しても、そのまま利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の原理を模式的に示す説明図であり、 第２図は、本発明の第２次抗体のDIG−２の特異性を示
すグラフであり、 第３図は、本発明方法において、ジゴキシン濃度と凝集
反応速度とが良好な相関性を有していることを示すグラ
フであり、 第４図は、本発明の第２次抗体のCAL−２の特異性を示
すグラフであり、そして 第５図は、本発明方法において、カルシトニン濃度と凝
集反応速度とが良好な相関性を有していることを示すグ
ラフである。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ｉ）検査対象化合物と、 この検査対象化合物に対する第１次抗体と の抗原抗体反応複合体に対する第２次抗体を担持した不
   溶性担体、 （ii）前記の第１次抗体、またはその第１次抗体を担持
   した不溶性若しくは可溶性の担体、および （iii）被検試料 を接触させ、次いで、被検試料中の検査対象化合物と、
   第２次抗体担持担体と、第１次抗体または第１次抗体担
   持担体とによる凝集反応を測定することを特徴とする、
   免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】検査対象化合物と、 この検査対象化合物に対する第１次抗体と の抗原抗体反応複合体に対する第２次抗体を担持した不
   溶性担体、および （ii）前記の第１次抗体、またはその第１次抗体を担持
   した不溶性若しくは可溶性の担体 を含むことを特徴とする、免疫学的測定用試薬。