JP2636844B2 - 酵母の外質隙中に局在するポリペプチドの回収法 - Google Patents
酵母の外質隙中に局在するポリペプチドの回収法Info
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- C12N1/063—Lysis of microorganisms of yeast
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、酵母により製造されそして少なくとも部分
的にそれの細胞周辺腔（または外質隙）（periplasmic
space）中に局在しているポリペプチド類を水性媒体
中に放出させるための方法に関するものである。より特
に、本発明はその目的のために遺伝的に操作された酵母
により製造されるリゾチームを水性媒体中に放出させる
ための方法に関するものである。
的にそれの細胞周辺腔（または外質隙）（periplasmic
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中に放出させるための方法に関するものである。より特
に、本発明はその目的のために遺伝的に操作された酵母
により製造されるリゾチームを水性媒体中に放出させる
ための方法に関するものである。
酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces
cerevisiae）は、商業的に興味のあるポリペプチド類を
発酵により製造する際に意図される遺伝的操（manipula
tions）作用の宿主としてますます使用が増えてきてい
る。この酵母の使用量増大は、例えば酵母が特に食餌性
有機体であるという事実のように他の工業用微生物類よ
り優れている点などの種々の利点により説明できる。酵
母の他の利点は、それの培養に絶対的な殺菌条件が必要
でなくそのため大規模な発酵用に特に適していることで
ある。嫌気性条件下でそれが生存できるために、代謝産
物類の連続的製造用に非可動性形にすることもできる。
cerevisiae）は、商業的に興味のあるポリペプチド類を
発酵により製造する際に意図される遺伝的操（manipula
tions）作用の宿主としてますます使用が増えてきてい
る。この酵母の使用量増大は、例えば酵母が特に食餌性
有機体であるという事実のように他の工業用微生物類よ
り優れている点などの種々の利点により説明できる。酵
母の他の利点は、それの培養に絶対的な殺菌条件が必要
でなくそのため大規模な発酵用に特に適していることで
ある。嫌気性条件下でそれが生存できるために、代謝産
物類の連続的製造用に非可動性形にすることもできる。
酵母をポリペプチド類、例えば酵素類、を製造するた
めに使用する時には、それらを原形質膜を通って分泌さ
せそして発酵媒体中に排出させる点が明らかに重要であ
り、次にそれらを例えば吸着または親和力クロマトグラ
フィの如き公知の技術を使用することにより該媒体から
回収できる。酵母の原形質膜を通って分泌される蛋白質
類は外質隙に閉じこめられて保有されるかまたは少なく
とも細胞壁と結合して保有される傾向があることは知ら
れている。これはサッカロミセス属の、そして特にS.セ
レヴィシエ種の、酵母中でしばしば観察される（R.シェ
ックマン（SCHEKMAN）およびP.ノヴィック（NOVICK）
著、酵母サッカロミセスの分子生物学、代謝および属表
示（the Molecular Biology of Yeast Saccharomy
ces, Metabolism and Gene Expression）、J.N.ス
トラサーン（Strathern）他編集、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク、1982、361−393頁）。し
かしながら、酵母にある種の機能的利益をもたらすこの
特性は商業的に興味のある蛋白質類の発酵による製造の
実施時には実際的な観点からすると大きな欠点となる。
実際、当該蛋白質は細胞に結合して保有されているため
細胞内蛋白質の場合のように細胞物質全体から分離しな
ければならないので、そのような場合には生じた利点が
興味ある蛋白質を回収するための分泌により失われてし
まう。酵母が分泌した蛋白質類を酵母壁に結合させて保
有するというこの酵母の傾向は、これらの蛋白質類のほ
とんどが大量にグルコシル化されているという事実のた
めであるとされていた。このことは、大きい割合で本質
的にマンノースからなる多糖類を含有している転化酵素
および酸性燐酸酵素の場合にそうである。これらの蛋白
質類のグルコシル化された部分の一機能は、蛋白質類を
本質的にマンノースだけからなる壁の多糖類マトリック
スに結合させて保有することである（J.O.ランペン（LA
MPEN）著、アントニイ・ヴァン・リイウベンヘーク（An
tonie van Leeuvenhoek）、34、１−18、1968）。こ
の説明によると、Matα−型酵母類またはある種の酵母
菌株により製造されたキラー蛋白質のα−因子の媒体中
への排出はそれらがグルコシル化されていなかったとい
う事実から解釈できる。
めに使用する時には、それらを原形質膜を通って分泌さ
せそして発酵媒体中に排出させる点が明らかに重要であ
り、次にそれらを例えば吸着または親和力クロマトグラ
フィの如き公知の技術を使用することにより該媒体から
回収できる。酵母の原形質膜を通って分泌される蛋白質
類は外質隙に閉じこめられて保有されるかまたは少なく
とも細胞壁と結合して保有される傾向があることは知ら
れている。これはサッカロミセス属の、そして特にS.セ
レヴィシエ種の、酵母中でしばしば観察される（R.シェ
ックマン（SCHEKMAN）およびP.ノヴィック（NOVICK）
著、酵母サッカロミセスの分子生物学、代謝および属表
示（the Molecular Biology of Yeast Saccharomy
ces, Metabolism and Gene Expression）、J.N.ス
トラサーン（Strathern）他編集、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク、1982、361−393頁）。し
かしながら、酵母にある種の機能的利益をもたらすこの
特性は商業的に興味のある蛋白質類の発酵による製造の
実施時には実際的な観点からすると大きな欠点となる。
実際、当該蛋白質は細胞に結合して保有されているため
細胞内蛋白質の場合のように細胞物質全体から分離しな
ければならないので、そのような場合には生じた利点が
興味ある蛋白質を回収するための分泌により失われてし
まう。酵母が分泌した蛋白質類を酵母壁に結合させて保
有するというこの酵母の傾向は、これらの蛋白質類のほ
とんどが大量にグルコシル化されているという事実のた
めであるとされていた。このことは、大きい割合で本質
的にマンノースからなる多糖類を含有している転化酵素
および酸性燐酸酵素の場合にそうである。これらの蛋白
質類のグルコシル化された部分の一機能は、蛋白質類を
本質的にマンノースだけからなる壁の多糖類マトリック
スに結合させて保有することである（J.O.ランペン（LA
MPEN）著、アントニイ・ヴァン・リイウベンヘーク（An
tonie van Leeuvenhoek）、34、１−18、1968）。こ
の説明によると、Matα−型酵母類またはある種の酵母
菌株により製造されたキラー蛋白質のα−因子の媒体中
への排出はそれらがグルコシル化されていなかったとい
う事実から解釈できる。
しかしながら、グルコシル化されていない異型の蛋白
質類が酵母中に現われる時には製造される蛋白質の一部
分だけしか媒体中に排出されないということがしばしば
起き、それが原形質膜を通る分泌を可能にするシグナル
配列を備えている時でさえ起きる。人間のα１ インタ
ーフェロンの場合にそうであり（A.シン（SINGH）他
著、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）、12、8927−8938、1984）、それの分泌は酵母
α因子の先駆体の先導配列用にコード付けされているDN
Aと対応する属の融合により保証されているのだが、そ
れらの半分しか媒体中で観られない。このことは、自身
のシグナル配列の結果として分泌される鶏のリゾチーム
の場合でもそうである（ベルギー特許番号901,223）。
そのような場合には蛋白質の可溶性部分だけを回収でき
るが、これが収率の損失をもたらすことは明白である。
また、細胞に結合して保有されている部分を回収するこ
ともできるが、これには余分の操作が必要である。いず
れの解決法も高い製造費用がかかり、そのことは酵母を
製造用の有機体として使用する際の上記の利点をある程
度減じることとなろう。
質類が酵母中に現われる時には製造される蛋白質の一部
分だけしか媒体中に排出されないということがしばしば
起き、それが原形質膜を通る分泌を可能にするシグナル
配列を備えている時でさえ起きる。人間のα１ インタ
ーフェロンの場合にそうであり（A.シン（SINGH）他
著、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids
Res.）、12、8927−8938、1984）、それの分泌は酵母
α因子の先駆体の先導配列用にコード付けされているDN
Aと対応する属の融合により保証されているのだが、そ
れらの半分しか媒体中で観られない。このことは、自身
のシグナル配列の結果として分泌される鶏のリゾチーム
の場合でもそうである（ベルギー特許番号901,223）。
そのような場合には蛋白質の可溶性部分だけを回収でき
るが、これが収率の損失をもたらすことは明白である。
また、細胞に結合して保有されている部分を回収するこ
ともできるが、これには余分の操作が必要である。いず
れの解決法も高い製造費用がかかり、そのことは酵母を
製造用の有機体として使用する際の上記の利点をある程
度減じることとなろう。
本発明の主な目的は、酵母により製造されそして排出
されているが外質隙内に部分的にもしくは全部が局在し
ているようなポリペプチド類を簡単な方法でしかも高収
率で回収するための方法を提供することである。より特
に、本発明の目的は意図的に遺伝的操作がなされている
酵母により製造されそして少なくとも媒体中に分泌され
ている異型の蛋白質類を高収率で回収することである。
さらに特に、本発明の目的は酵母S.セレヴィシエから遺
伝的操作の結果としてその中で製造されそして分泌され
たリゾチームを回収することである。
されているが外質隙内に部分的にもしくは全部が局在し
ているようなポリペプチド類を簡単な方法でしかも高収
率で回収するための方法を提供することである。より特
に、本発明の目的は意図的に遺伝的操作がなされている
酵母により製造されそして少なくとも媒体中に分泌され
ている異型の蛋白質類を高収率で回収することである。
さらに特に、本発明の目的は酵母S.セレヴィシエから遺
伝的操作の結果としてその中で製造されそして分泌され
たリゾチームを回収することである。
本発明に従うと、これらの酵母を水性媒体中で（ｉ）
中性の可溶性鉱物質塩（mineral salt）および（ii）８
〜15の間にあるHLB（親水性−親脂性平衡）を有するポ
リエトキシル化されたアルキルフェノール型の可溶性の
非イオン性表面活性剤からなる系により処理することか
らなる方法によりこれらの目的が達成される。
中性の可溶性鉱物質塩（mineral salt）および（ii）８
〜15の間にあるHLB（親水性−親脂性平衡）を有するポ
リエトキシル化されたアルキルフェノール型の可溶性の
非イオン性表面活性剤からなる系により処理することか
らなる方法によりこれらの目的が達成される。
酵母の培養媒体中に充分な濃度の塩化ナトリウムまた
は他の塩類、例えばKC1もしくはNaNO3、が存在している
とそれらの中での可溶性蛋白質類が遊離しやすくなると
いうことは公知である。すなわち、通気媒体中でのパン
酵母の６時間にわたる培養後の媒体中の蛋白質量は0.6M
のNaC1の存在下では塩の不存在下の場合よりも３倍ほど
高いということが示されている（T.A.フランクリン（FR
ANKLIN）他著、バイオテクノロジイ・アンド・バイオエ
ンジニアリング・シンポジウム（Biotechnology and
Bioengineering Symp.）No.14、467、1984）。この結
果は浸透圧衝撃による蛋白質類の遊離では説明できず、
その理由はS.セレヴィシエの外質隙蛋白質類はこの処理
により遊離されないということが認められているからで
ある（W.N.アーノルド（ARNOLD）著、酵母細胞外包の物
理的な面；酵母細胞外包における生化学、生物理学およ
び超微細構造（Physical Aspects of the Yeast C
ell Envelope; in Yeast Cell Envelope: Bioche
mistry, Biophysics and Ultrastructure）、１巻、
W.N.アーノルド（ARNOLD）編集、CRC・プレス・インコ
ーポレーテッド、ボカ・ラトン、フロリダ、1981、25−
47頁）。この塩の作用機構は詳細には知られていない
が、酵母細胞壁と媒体中に可溶性の蛋白質との間でイオ
ン結合が生じ、塩の効果はれらの結合を破壊しそして蛋
白質を遊離させることであろうと推測できる。この現象
は下記の実験でも証明できる。
は他の塩類、例えばKC1もしくはNaNO3、が存在している
とそれらの中での可溶性蛋白質類が遊離しやすくなると
いうことは公知である。すなわち、通気媒体中でのパン
酵母の６時間にわたる培養後の媒体中の蛋白質量は0.6M
のNaC1の存在下では塩の不存在下の場合よりも３倍ほど
高いということが示されている（T.A.フランクリン（FR
ANKLIN）他著、バイオテクノロジイ・アンド・バイオエ
ンジニアリング・シンポジウム（Biotechnology and
Bioengineering Symp.）No.14、467、1984）。この結
果は浸透圧衝撃による蛋白質類の遊離では説明できず、
その理由はS.セレヴィシエの外質隙蛋白質類はこの処理
により遊離されないということが認められているからで
ある（W.N.アーノルド（ARNOLD）著、酵母細胞外包の物
理的な面；酵母細胞外包における生化学、生物理学およ
び超微細構造（Physical Aspects of the Yeast C
ell Envelope; in Yeast Cell Envelope: Bioche
mistry, Biophysics and Ultrastructure）、１巻、
W.N.アーノルド（ARNOLD）編集、CRC・プレス・インコ
ーポレーテッド、ボカ・ラトン、フロリダ、1981、25−
47頁）。この塩の作用機構は詳細には知られていない
が、酵母細胞壁と媒体中に可溶性の蛋白質との間でイオ
ン結合が生じ、塩の効果はれらの結合を破壊しそして蛋
白質を遊離させることであろうと推測できる。この現象
は下記の実験でも証明できる。
最少量の媒体（３％のグルコース、0.67％の酵母窒素
基質、0.002％のヒスチジンおよびロイシン）中で成長
しそして静止相の最初のところで捕集された酵母（S.セ
レヴィシエ、GRF18菌株）を、鶏のリゾチーム（ベリン
ガー・インゲルヘイム（Boehringer Ingelheim）が670
単位/mlの懸濁液の濃度となるまで加えられてあるpHが
6.5の0.1Mの燐酸塩緩衝液中に再懸濁させた。37℃にお
ける２時間の培養後に、細胞を遠心分離し、そして上澄
み液中に存在しているリゾチームをD.シュガー（SHUGA
R）の方法（バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アク
タ（Biochem.Biophys.Acta）、８、302−309、1952）に
より測定する。その結果、リゾチーム濃度は440単位/m
l、すなわち最初の値の66％、でしかないことが示され
た。０℃においても同じ結果が観察された。初期培養の
上澄み液中で同一濃度および同一温度において培養され
たリゾチームは活性損失を示さなかったため、この結果
が培養中の酵素の部分的不活性化によるものではあり得
ない。
基質、0.002％のヒスチジンおよびロイシン）中で成長
しそして静止相の最初のところで捕集された酵母（S.セ
レヴィシエ、GRF18菌株）を、鶏のリゾチーム（ベリン
ガー・インゲルヘイム（Boehringer Ingelheim）が670
単位/mlの懸濁液の濃度となるまで加えられてあるpHが
6.5の0.1Mの燐酸塩緩衝液中に再懸濁させた。37℃にお
ける２時間の培養後に、細胞を遠心分離し、そして上澄
み液中に存在しているリゾチームをD.シュガー（SHUGA
R）の方法（バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アク
タ（Biochem.Biophys.Acta）、８、302−309、1952）に
より測定する。その結果、リゾチーム濃度は440単位/m
l、すなわち最初の値の66％、でしかないことが示され
た。０℃においても同じ結果が観察された。初期培養の
上澄み液中で同一濃度および同一温度において培養され
たリゾチームは活性損失を示さなかったため、この結果
が培養中の酵素の部分的不活性化によるものではあり得
ない。
他の実験では、リゾチームの存在下での４℃における
１時間の培養後にNaC1を酵母懸濁液に0.5Mの濃度となる
まで加え、それを30℃においてさらに２時間培養した。
懸濁液を次に遠心し、そして上澄み液中に存在している
リゾチームを上記の如くして測定した。初期のリゾチー
ムの98％が上澄み液中に溶解されていると測定された
が、それに対してNaC1が省略されていること以外は同一
である実験では38％であった。
１時間の培養後にNaC1を酵母懸濁液に0.5Mの濃度となる
まで加え、それを30℃においてさらに２時間培養した。
懸濁液を次に遠心し、そして上澄み液中に存在している
リゾチームを上記の如くして測定した。初期のリゾチー
ムの98％が上澄み液中に溶解されていると測定された
が、それに対してNaC1が省略されていること以外は同一
である実験では38％であった。
これらの実験は、他のリゾチームは酵母の細胞壁に可
逆的に結合しており、媒体のイオン強度を増大させるこ
とによりそこからそれを定量的に遊離できるということ
を示している。この状態は、細胞についているリゾチー
ムがその中のクローン化された遺伝子の発現から生じる
時には生じない。1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ
活性を有する酵素をコードする外来（または異型）の遺
伝子、例えば鶏のリゾチームをコードする遺伝子、をク
ローン化し、そして酵母で発現できるということは公知
である（ベルギー特許901,223）。このようにして酵母
中で製造されたリゾチームは下記の作用を示す；それは
一部分培養媒体中に存在しており、そこからそれはpH6.
5の0.1M燐酸塩緩衝液中の急速流動カルボキシメチルセ
ファロース（ファーマシア）上での吸着により分離さ
れ、その後同一緩衝液で洗浄され、次に0.5MのNaC1が補
充されている同一緩衝液中で溶離される。このようにし
て得られた溶離液を次に限界濾過により濃縮し、セファ
デックスＧ−25（ファーマシア）上を通過させて脱塩
し、限外濾過により再濃縮し、そして凍結乾燥により乾
燥する。ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動法では１個だけの蛋
白質帯が示され、それは卵白から抽出された市販の鶏の
リゾチームのものと同じ電気泳動可動性を有していた。
実際のところ、上記の方法により培養媒体から抽出され
た蛋白質のＮ−末端部の最初の10個のアミノ酸類の配列
は成熟鶏のリゾチームのものと同一であることが示され
ていた。この結果は、クローン化された遺伝子の発現に
より酵母中で製造されたプレリゾチームのシグナルペプ
チドが酵母により正確に認識されそして処理されて、酵
母によってリゾチームが活性形で分泌されたことを明白
に示している。しかしながら下記の実施例により証明さ
れているように、酵母により製造されるリゾチームの一
部は上記の実験で示唆されているように細胞を0.5MのNa
C1の存在下で培養（またはインキュベート）した時でさ
え媒体中に遊離されない。このリゾチーム部分は、細胞
を粉砕しそして細胞残屑を遠心した後に検出でき、特に
粉砕を0.5MのNaC1の存在下で実施した時に検出できる。
従って、たとえNaC1の効果が示されているように思える
ため該リゾチームが部分的に一方だけの細胞成分上に吸
着可能な場合でも、該リゾチームは可溶性部分（分子内
または外質性）に相当すると結論づけることができる。
逆的に結合しており、媒体のイオン強度を増大させるこ
とによりそこからそれを定量的に遊離できるということ
を示している。この状態は、細胞についているリゾチー
ムがその中のクローン化された遺伝子の発現から生じる
時には生じない。1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ
活性を有する酵素をコードする外来（または異型）の遺
伝子、例えば鶏のリゾチームをコードする遺伝子、をク
ローン化し、そして酵母で発現できるということは公知
である（ベルギー特許901,223）。このようにして酵母
中で製造されたリゾチームは下記の作用を示す；それは
一部分培養媒体中に存在しており、そこからそれはpH6.
5の0.1M燐酸塩緩衝液中の急速流動カルボキシメチルセ
ファロース（ファーマシア）上での吸着により分離さ
れ、その後同一緩衝液で洗浄され、次に0.5MのNaC1が補
充されている同一緩衝液中で溶離される。このようにし
て得られた溶離液を次に限界濾過により濃縮し、セファ
デックスＧ−25（ファーマシア）上を通過させて脱塩
し、限外濾過により再濃縮し、そして凍結乾燥により乾
燥する。ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動法では１個だけの蛋
白質帯が示され、それは卵白から抽出された市販の鶏の
リゾチームのものと同じ電気泳動可動性を有していた。
実際のところ、上記の方法により培養媒体から抽出され
た蛋白質のＮ−末端部の最初の10個のアミノ酸類の配列
は成熟鶏のリゾチームのものと同一であることが示され
ていた。この結果は、クローン化された遺伝子の発現に
より酵母中で製造されたプレリゾチームのシグナルペプ
チドが酵母により正確に認識されそして処理されて、酵
母によってリゾチームが活性形で分泌されたことを明白
に示している。しかしながら下記の実施例により証明さ
れているように、酵母により製造されるリゾチームの一
部は上記の実験で示唆されているように細胞を0.5MのNa
C1の存在下で培養（またはインキュベート）した時でさ
え媒体中に遊離されない。このリゾチーム部分は、細胞
を粉砕しそして細胞残屑を遠心した後に検出でき、特に
粉砕を0.5MのNaC1の存在下で実施した時に検出できる。
従って、たとえNaC1の効果が示されているように思える
ため該リゾチームが部分的に一方だけの細胞成分上に吸
着可能な場合でも、該リゾチームは可溶性部分（分子内
または外質性）に相当すると結論づけることができる。
しかしながら、酵母により製造されるリゾチームの無
視できない部分が膜構造（原形質膜および／または細胞
内構造）と、多分プレリゾチームの形で、結合しうる可
能性がある。例えば酵母中で発現する子牛のキモシンは
細胞が崩壊して遠心可能な細胞残屑になった後にそして
充分な洗浄後でさえかなりの部分が結合されて保有され
ている（J.メラー（MELLOR）他、Gene、24、１−14、19
83）。ある場合には、膜構造に結合している蛋白質をエ
トキシル化されたアルキルフェノール型の穏やかな表面
活性剤を用いる処理により溶解させることができる（A.
ヘレニウス（HELENIUS）およびK.シモンズ（SIMONS）、
バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.
Biophys.Acta）、415、29−79、1975）。この処理はあ
るときには細胞に結合している蛋白質を放出させること
ができる。従って、サツカロミコプシス・リポリチカ
（Saccharomycopsis lipolytica）の懸濁液をエトキシ
ル化されたノニルフェノール（エマルゲン 950、カオ
・アトラス・カンパニイ）で処理することにより、それ
に結合していたリパーゼを細胞を崩壊させずに溶解させ
ることができた（Y.オタ（OTA）他、アグリカルチュラ
ル・バイオロジカル・ケミストリイ（Agric.Biol.Che
m.）、46、2885−2889、1982）。しかしながら、同じ工
程をリゾチームを製造するために遺伝的に操作されたS.
セレヴィシエに適用するときにはこれの放出は観察され
なかった。リゾチームを製造する酵母細胞を例えば0.05
％の濃度のトリトン Ｘ−100（ローム・アンド・ハア
ース）の如きポリエトキシル化されたオクチルフェノー
ルの存在下で粉砕した時でさえ、上澄み液中で測定され
たリゾチーム活性は表面活性剤の不存在下で観察された
ものと実質的に異ならなかった。
視できない部分が膜構造（原形質膜および／または細胞
内構造）と、多分プレリゾチームの形で、結合しうる可
能性がある。例えば酵母中で発現する子牛のキモシンは
細胞が崩壊して遠心可能な細胞残屑になった後にそして
充分な洗浄後でさえかなりの部分が結合されて保有され
ている（J.メラー（MELLOR）他、Gene、24、１−14、19
83）。ある場合には、膜構造に結合している蛋白質をエ
トキシル化されたアルキルフェノール型の穏やかな表面
活性剤を用いる処理により溶解させることができる（A.
ヘレニウス（HELENIUS）およびK.シモンズ（SIMONS）、
バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.
Biophys.Acta）、415、29−79、1975）。この処理はあ
るときには細胞に結合している蛋白質を放出させること
ができる。従って、サツカロミコプシス・リポリチカ
（Saccharomycopsis lipolytica）の懸濁液をエトキシ
ル化されたノニルフェノール（エマルゲン 950、カオ
・アトラス・カンパニイ）で処理することにより、それ
に結合していたリパーゼを細胞を崩壊させずに溶解させ
ることができた（Y.オタ（OTA）他、アグリカルチュラ
ル・バイオロジカル・ケミストリイ（Agric.Biol.Che
m.）、46、2885−2889、1982）。しかしながら、同じ工
程をリゾチームを製造するために遺伝的に操作されたS.
セレヴィシエに適用するときにはこれの放出は観察され
なかった。リゾチームを製造する酵母細胞を例えば0.05
％の濃度のトリトン Ｘ−100（ローム・アンド・ハア
ース）の如きポリエトキシル化されたオクチルフェノー
ルの存在下で粉砕した時でさえ、上澄み液中で測定され
たリゾチーム活性は表面活性剤の不存在下で観察された
ものと実質的に異ならなかった。
これらの種々の結果は、意図的に遺伝的操作がなされ
た酵母により製造されるリゾチームの主部分を回収する
ためには先行技術により示唆されている如き表面活性剤
を用いたとしても細胞を可溶性塩で処理することだけで
は不充分であることを示しており、公知の技術にたよる
ときには細胞構造を破壊することが依然として必要であ
り、それには実際にこの操作に伴なう全ての欠点が存在
している。従って、細胞を本発明の方法によりすなわち
水溶性の中性塩および疎水性部分が置換された芳香族核
である非イオン性表面活性剤を同時に用いて処理するこ
とにより、該細胞に結合されているリゾチームの主部分
がそれらの構造を破壊する必要なしに回収されるという
ことは驚くべきことである。このことは、酵母細胞に結
合して保有されているリゾチームの主部分は細胞内性で
はなくそれらの外質隙中に放出されていることを示して
いる。
た酵母により製造されるリゾチームの主部分を回収する
ためには先行技術により示唆されている如き表面活性剤
を用いたとしても細胞を可溶性塩で処理することだけで
は不充分であることを示しており、公知の技術にたよる
ときには細胞構造を破壊することが依然として必要であ
り、それには実際にこの操作に伴なう全ての欠点が存在
している。従って、細胞を本発明の方法によりすなわち
水溶性の中性塩および疎水性部分が置換された芳香族核
である非イオン性表面活性剤を同時に用いて処理するこ
とにより、該細胞に結合されているリゾチームの主部分
がそれらの構造を破壊する必要なしに回収されるという
ことは驚くべきことである。このことは、酵母細胞に結
合して保有されているリゾチームの主部分は細胞内性で
はなくそれらの外質隙中に放出されていることを示して
いる。
本発明に従い使用される塩は水溶性の中性鉱物質塩で
ある。例えばNaC1、KC1、NaNO3、KNO3,Na2SO4他が挙げ
られる。経済的および生物学的の両方の理由から、NaC1
が好適に使用される。塩の使用濃度は厳密なものではな
いが、希望する結果を最も良く得るためには少なくとも
0.1Mの濃度が使用されるであろう。ほとんどの場合、0.
5M以上の濃度を使用しても特別な利点はない。
ある。例えばNaC1、KC1、NaNO3、KNO3,Na2SO4他が挙げ
られる。経済的および生物学的の両方の理由から、NaC1
が好適に使用される。塩の使用濃度は厳密なものではな
いが、希望する結果を最も良く得るためには少なくとも
0.1Mの濃度が使用されるであろう。ほとんどの場合、0.
5M以上の濃度を使用しても特別な利点はない。
本発明に従い使用される表面活性剤は非イオン性のも
のから選択される。アニオン性またはカチオン性表面活
性剤とは対照的に、非イオン性のものは一般的に蛋白質
中でそれらの生物学的活性の減少もしくは損失をもたら
すような構造的改変を誘発しないという本質的な利点を
有する。外質隙の蛋白質の回収用に水溶性の中性鉱酸塩
類と共に相乗効果を示す非イオン性表面活性剤は、水中
に可溶性でありそして８〜15の間になるHLBを有するポ
リエトキシル化されたアルキルフェノール型のものであ
るということが、本出願人により見出された。そのよう
な試薬類の代表例として、ポリエトキシル化されたオク
チル−、ノニル−およびトリブチル−フェノール類、特
に商標トリトン Ｘ−100、ノニデット Ｐ−40、ルテ
ンソル AP ８、シンペロニック NP 10、セムルソル
OP ９、サポゲナット Ｔ−080などとして市販され
ているもの、が挙げられる。
のから選択される。アニオン性またはカチオン性表面活
性剤とは対照的に、非イオン性のものは一般的に蛋白質
中でそれらの生物学的活性の減少もしくは損失をもたら
すような構造的改変を誘発しないという本質的な利点を
有する。外質隙の蛋白質の回収用に水溶性の中性鉱酸塩
類と共に相乗効果を示す非イオン性表面活性剤は、水中
に可溶性でありそして８〜15の間になるHLBを有するポ
リエトキシル化されたアルキルフェノール型のものであ
るということが、本出願人により見出された。そのよう
な試薬類の代表例として、ポリエトキシル化されたオク
チル−、ノニル−およびトリブチル−フェノール類、特
に商標トリトン Ｘ−100、ノニデット Ｐ−40、ルテ
ンソル AP ８、シンペロニック NP 10、セムルソル
OP ９、サポゲナット Ｔ−080などとして市販され
ているもの、が挙げられる。
そのような表面活性剤の選択時には、それらの活性は
置換された芳香族核によってだけでなくエトキシル化さ
れた鎖の長さによっても影響を受けるということを考慮
するべきである。一般的原則として、それらのHLBが８
〜15の間にあるようなエトキシル化された鎖を有する表
面活性剤類が選択されるであろう。HLBが８より低い時
には、一般的に水中での表面活性剤の溶解度が不充分で
ある。一方、HLBが15より高い時には、本発明で特許が
請求されている相乗効果が弱すぎて実用的でない。表面
活性剤の使用濃度はあまり厳密なものではない。ほとん
どの場合、0.02〜１％の間の濃度が有利に使用される。
置換された芳香族核によってだけでなくエトキシル化さ
れた鎖の長さによっても影響を受けるということを考慮
するべきである。一般的原則として、それらのHLBが８
〜15の間にあるようなエトキシル化された鎖を有する表
面活性剤類が選択されるであろう。HLBが８より低い時
には、一般的に水中での表面活性剤の溶解度が不充分で
ある。一方、HLBが15より高い時には、本発明で特許が
請求されている相乗効果が弱すぎて実用的でない。表面
活性剤の使用濃度はあまり厳密なものではない。ほとん
どの場合、0.02〜１％の間の濃度が有利に使用される。
本発明に従うと、回収しようとするポリペプチドと結
合している酵母細胞を可溶性の中性塩および非イオン性
表面活性剤の両方を含んでいる水性媒体中に懸濁させ
る。操作温度は厳密なものではない。しかしながら、回
収しようとするポリペプチド類の変性を最少にするため
には室温以上での操作は避けるべきであろう。一方、細
胞および媒体の間の充分な接触時間をもつ必要がある。
一般原則として、室温付近の温度においては期待する結
果を得るためには30〜120分間、より特に45〜90分間、
の間の接触時間で充分である。次に細胞を遠心または他
の適当な技術により分離する。好適にはそれらを同じ媒
体中または他の水性媒体中に、実際には純水中に、再懸
濁させることによりそれらを洗浄する。その後それらを
再び分離し、次に圧縮または乾燥することができ、すな
わち例えば動物飼料中の蛋白質源としてのそれらの価格
安定性を確実にするための有用な操作にかけることがで
きる。
合している酵母細胞を可溶性の中性塩および非イオン性
表面活性剤の両方を含んでいる水性媒体中に懸濁させ
る。操作温度は厳密なものではない。しかしながら、回
収しようとするポリペプチド類の変性を最少にするため
には室温以上での操作は避けるべきであろう。一方、細
胞および媒体の間の充分な接触時間をもつ必要がある。
一般原則として、室温付近の温度においては期待する結
果を得るためには30〜120分間、より特に45〜90分間、
の間の接触時間で充分である。次に細胞を遠心または他
の適当な技術により分離する。好適にはそれらを同じ媒
体中または他の水性媒体中に、実際には純水中に、再懸
濁させることによりそれらを洗浄する。その後それらを
再び分離し、次に圧縮または乾燥することができ、すな
わち例えば動物飼料中の蛋白質源としてのそれらの価格
安定性を確実にするための有用な操作にかけることがで
きる。
一方、媒体からの蛋白質類を遠心し、分離し、そして
当技術で公知の技術、すなわち凍結乾燥、限外濾過、沈
澱、クロマトグラフィ他、の適当な組み合わせにより精
製することもできる。実際のところ、本発明は他の蛋白
質類との混合物から分離するのが困難な物理化学的性質
を有する蛋白質類を単離するのに特に有用である。実際
に酵母細胞の簡単な遠心により、全部または部分的に外
質隙と結合している蛋白質が、培養媒体中に溶液状で存
在している他の蛋白質類から容易に分離できる。さら
に、それらの培養媒体から単離された酵母を最少量の本
発明に従う媒体で処理することにより、興味ある蛋白質
は細胞内蛋白質と混ざらずにかなり濃縮された形で放出
される。
当技術で公知の技術、すなわち凍結乾燥、限外濾過、沈
澱、クロマトグラフィ他、の適当な組み合わせにより精
製することもできる。実際のところ、本発明は他の蛋白
質類との混合物から分離するのが困難な物理化学的性質
を有する蛋白質類を単離するのに特に有用である。実際
に酵母細胞の簡単な遠心により、全部または部分的に外
質隙と結合している蛋白質が、培養媒体中に溶液状で存
在している他の蛋白質類から容易に分離できる。さら
に、それらの培養媒体から単離された酵母を最少量の本
発明に従う媒体で処理することにより、興味ある蛋白質
は細胞内蛋白質と混ざらずにかなり濃縮された形で放出
される。
本発明の方法は、固体担体上または例えばアルギネー
トもしくはアクリルアミドゲルの如き重合体ゲル中での
固着によるような何らかの手段により不動性化された酵
母により分泌された蛋白質類の回収にも適用できる。当
技術の専門家に明らかな他の適用も本発明の範囲内であ
る。同様に、本発明は遺伝的操作の結果としてS.セレヴ
ィシエの酵母により製造された異型の（heterologous）
蛋白質類の回収用に特に適しているが、ポリペプチドが
酵母の外質隙中に局在している時には酵母の属および種
がいずれであろうとも或いは異型であってももしくはそ
うでなくてもいずれのポリペプチドの回収用にも明らか
に使用できる。
トもしくはアクリルアミドゲルの如き重合体ゲル中での
固着によるような何らかの手段により不動性化された酵
母により分泌された蛋白質類の回収にも適用できる。当
技術の専門家に明らかな他の適用も本発明の範囲内であ
る。同様に、本発明は遺伝的操作の結果としてS.セレヴ
ィシエの酵母により製造された異型の（heterologous）
蛋白質類の回収用に特に適しているが、ポリペプチドが
酵母の外質隙中に局在している時には酵母の属および種
がいずれであろうとも或いは異型であってももしくはそ
うでなくてもいずれのポリペプチドの回収用にも明らか
に使用できる。
実施例１ サッカロミセス・セレヴィシエ種、菌株GRF18（ロイ
シンおよびヒスチジン用の栄養要求株）に属しそしてプ
ラスミッド pLys△49により転換された酵母を28℃にお
いて、0.002％のヒスチジンが補充されている最少量の
媒体（グルコース:3％；酵母窒素基質:0.67％）中で成
長させた。プラスミッド pLys△49は転換された酵母に
ロイシン用の原栄養を与えるLEU2属を含んでおり、それ
はまた鶏のリゾチームの完全なcDNAも含有している（ベ
ルギー特許901,223;セントラル・ビューロー・ヴール・
シュメルカルチュアス、オオステルストラート １、バ
ーン、オランダ、に1984年12月５日に番号CBS 7130と
して保管されている菌株）。
シンおよびヒスチジン用の栄養要求株）に属しそしてプ
ラスミッド pLys△49により転換された酵母を28℃にお
いて、0.002％のヒスチジンが補充されている最少量の
媒体（グルコース:3％；酵母窒素基質:0.67％）中で成
長させた。プラスミッド pLys△49は転換された酵母に
ロイシン用の原栄養を与えるLEU2属を含んでおり、それ
はまた鶏のリゾチームの完全なcDNAも含有している（ベ
ルギー特許901,223;セントラル・ビューロー・ヴール・
シュメルカルチュアス、オオステルストラート １、バ
ーン、オランダ、に1984年12月５日に番号CBS 7130と
して保管されている菌株）。
培養が静止相に達した時に、10mlの部分標本を2500g
において10分間遠心した。次に細胞を0.5MのNaC1および
0.05重量％の濃度のポリエトキシル化されたｐ−オクチ
ルフェノール型の表面活性剤（ローム・アンド・ハース
製の商標トリトン Ｘ−100として市販されている製品
であり、該表面活性剤は一般的に１分子当たり10個のオ
キシエチレン単位を含んでいる）が補充されているpHが
6.5の3mlの0.1M燐酸塩緩衝液中に再懸濁させた。比較の
ために、培養の他の部分標本から遠心された細胞を
（１）燐酸塩緩衝液だけの中に、（２）0.5MのNaC1だけ
が補充されている同じ緩衝液の中に、そして（３）0.05
％のトリトン Ｘ−100だけが補充されている緩衝液の
中に、再懸濁させた。種々の媒体中での28℃における60
分間の培養後に、細胞を再び遠心により分離し、そして
上澄み液中に存在しているリゾチームをD.シュガー（SH
UGAR）の方法（バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・ア
クタ（Biochem.Biophys.Acta）、８、302−309、1952）
により測定した。まだ細胞と結合しているリゾチームを
測定するためには、後者を同一媒体中に再懸濁させそし
てブラウン・ホモゼナイザー中で５分間にわたりガラス
球により粉砕した。2500gにおける遠心により細胞残屑
を分離した後に、上澄み液中に存在しているリゾチーム
を上記の如くして測定した。
において10分間遠心した。次に細胞を0.5MのNaC1および
0.05重量％の濃度のポリエトキシル化されたｐ−オクチ
ルフェノール型の表面活性剤（ローム・アンド・ハース
製の商標トリトン Ｘ−100として市販されている製品
であり、該表面活性剤は一般的に１分子当たり10個のオ
キシエチレン単位を含んでいる）が補充されているpHが
6.5の3mlの0.1M燐酸塩緩衝液中に再懸濁させた。比較の
ために、培養の他の部分標本から遠心された細胞を
（１）燐酸塩緩衝液だけの中に、（２）0.5MのNaC1だけ
が補充されている同じ緩衝液の中に、そして（３）0.05
％のトリトン Ｘ−100だけが補充されている緩衝液の
中に、再懸濁させた。種々の媒体中での28℃における60
分間の培養後に、細胞を再び遠心により分離し、そして
上澄み液中に存在しているリゾチームをD.シュガー（SH
UGAR）の方法（バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・ア
クタ（Biochem.Biophys.Acta）、８、302−309、1952）
により測定した。まだ細胞と結合しているリゾチームを
測定するためには、後者を同一媒体中に再懸濁させそし
てブラウン・ホモゼナイザー中で５分間にわたりガラス
球により粉砕した。2500gにおける遠心により細胞残屑
を分離した後に、上澄み液中に存在しているリゾチーム
を上記の如くして測定した。
得られた結果を表１に示す。酵母懸濁液に0.5MのNaC1
だけをまたは0.05％のトリトン Ｘ−100だけを添加し
ても細胞と結合しているリゾチーム活性の放出をもたら
さないということがわかる。この活性は細胞を0.5MのNa
C1の存在下で粉砕することにより得られる均質物中での
み検出できた。NaC1の不存在下でまたはトリトン Ｘ−
100の存在下での粉砕により測定された活性は、0.5MのN
aC1の存在下で観察されたものの20〜30％にしか達しな
かった。それとは対照的に、NaC1およびトリトン Ｘ−
100の両方が存在している場合には細胞からのリゾチー
ムの放出に関して相当な相乗効果が生じ、この場合均質
物中で測定された活性の88％が初期の上澄み液中で観察
された。
だけをまたは0.05％のトリトン Ｘ−100だけを添加し
ても細胞と結合しているリゾチーム活性の放出をもたら
さないということがわかる。この活性は細胞を0.5MのNa
C1の存在下で粉砕することにより得られる均質物中での
み検出できた。NaC1の不存在下でまたはトリトン Ｘ−
100の存在下での粉砕により測定された活性は、0.5MのN
aC1の存在下で観察されたものの20〜30％にしか達しな
かった。それとは対照的に、NaC1およびトリトン Ｘ−
100の両方が存在している場合には細胞からのリゾチー
ムの放出に関して相当な相乗効果が生じ、この場合均質
物中で測定された活性の88％が初期の上澄み液中で観察
された。
本実施例で本発明の方法の適用により放出されるリゾ
チームの量が細胞を粉砕することにより検出できるリゾ
チームの合計量に近いという事は、この場合にリゾチー
ムが酵母外質隙中に主に局在しているということを示し
ている。しかしながら、外質隙中に分泌されていないリ
ゾチームの無視できない部分が依然として細胞内にある
ような場合もありうる。そのような場合には、本発明の
方法により回収されるリゾチーム中の収率は本実施例中
で得られたものより明らかに低いはずである。
チームの量が細胞を粉砕することにより検出できるリゾ
チームの合計量に近いという事は、この場合にリゾチー
ムが酵母外質隙中に主に局在しているということを示し
ている。しかしながら、外質隙中に分泌されていないリ
ゾチームの無視できない部分が依然として細胞内にある
ような場合もありうる。そのような場合には、本発明の
方法により回収されるリゾチーム中の収率は本実施例中
で得られたものより明らかに低いはずである。
実施例２ トリトン Ｘ−100を１重量％のセムルソルOP−５
（１分子当たり９個のオキシエチレン単位を有するポリ
エトキシル化されたｐ−オクチルフェノール；ソシエテ
・フランセイス・デ・オルガノ・シンセセ、SFOSにより
販売されている製品）により置換したこと以外は、実施
例１中に記されている工程を繰り返した。得られた結果
を表２に示す。
（１分子当たり９個のオキシエチレン単位を有するポリ
エトキシル化されたｐ−オクチルフェノール；ソシエテ
・フランセイス・デ・オルガノ・シンセセ、SFOSにより
販売されている製品）により置換したこと以外は、実施
例１中に記されている工程を繰り返した。得られた結果
を表２に示す。
酵母により製造されたリゾチームの21％が、粉砕せず
に、表面活性剤の不存在下で0.5MのNaC1により放出され
たことがわかる。これはすでに媒体中に排出されている
リゾチームの酵母壁上での吸着により説明できる。しか
しながら、本発明の方法では４倍も高いリゾチームの量
が媒体中で得られるということに注目すべきであり、こ
のことは本発明の方法で使用される両成分類の相乗効果
を明白に示している。
に、表面活性剤の不存在下で0.5MのNaC1により放出され
たことがわかる。これはすでに媒体中に排出されている
リゾチームの酵母壁上での吸着により説明できる。しか
しながら、本発明の方法では４倍も高いリゾチームの量
が媒体中で得られるということに注目すべきであり、こ
のことは本発明の方法で使用される両成分類の相乗効果
を明白に示している。
実施例３ この実施例は酵母の外質隙中に局在しているリゾチー
ムの放出に対する本発明の方法に従う表面活性剤濃度の
影響を説明するものである。
ムの放出に対する本発明の方法に従う表面活性剤濃度の
影響を説明するものである。
実施例１の工程を繰り返したが、遠心後に細胞を0.5M
のNaC1および種々の濃度のトリトン Ｘ−100が補充さ
れているpHが6.5の0.1M燐酸塩緩衝液中に再懸濁させ
た。実施例１中に記されている如き細胞の培養後に得ら
れた結果を表３に示す。
のNaC1および種々の濃度のトリトン Ｘ−100が補充さ
れているpHが6.5の0.1M燐酸塩緩衝液中に再懸濁させ
た。実施例１中に記されている如き細胞の培養後に得ら
れた結果を表３に示す。
0.01％以下のトリトン Ｘ−100濃度ではリゾチーム
の放出は観察されなかった。それとは対照的に、0.05％
の濃度では酵素の意義ある放出が観察され、それは表面
活性剤の濃度をこの値を越えて増すとさらに改良でき
た。
の放出は観察されなかった。それとは対照的に、0.05％
の濃度では酵素の意義ある放出が観察され、それは表面
活性剤の濃度をこの値を越えて増すとさらに改良でき
た。
実施例４ この実施例は酵母の外質隙中に局在しているリゾチー
ムの放出に対する本発明の方法に従う可溶性塩濃度の影
響を説明するものである。
ムの放出に対する本発明の方法に従う可溶性塩濃度の影
響を説明するものである。
実施例１の工程を繰り返したが、遠心後に細胞を0.05
％のトリトン Ｘ−100および種々の濃度のNaC1が補充
されているpHが6.5の0.1M隣接塩緩衝液中に再懸濁させ
た。実施例１中に記されている如き細胞の培養後に得ら
れた結果を表４に示す。
％のトリトン Ｘ−100および種々の濃度のNaC1が補充
されているpHが6.5の0.1M隣接塩緩衝液中に再懸濁させ
た。実施例１中に記されている如き細胞の培養後に得ら
れた結果を表４に示す。
0.1M以下のNaC1濃度では、リゾチームの放出は観察さ
れなかった。リゾチーム活性の全部が細胞と結合してお
りそして粉砕により部分的に測定できた。0.25MのNaC1
濃度からリゾチーム活性が上澄み液中で検出され、そし
て0.5Mの濃度で最高値に達した。
れなかった。リゾチーム活性の全部が細胞と結合してお
りそして粉砕により部分的に測定できた。0.25MのNaC1
濃度からリゾチーム活性が上澄み液中で検出され、そし
て0.5Mの濃度で最高値に達した。
実施例５ 実施例１の工程を繰り返したが、0.05％のトリトン
Ｘ−100および0.5MのNaC1が補充されてある燐酸塩緩衝
液中での酵母細胞の培養時間を変えた。得られた結果を
表５に示す。
Ｘ−100および0.5MのNaC1が補充されてある燐酸塩緩衝
液中での酵母細胞の培養時間を変えた。得られた結果を
表５に示す。
酵母と結合されたリゾチームを放出させるためには細
胞を媒体と充分な時間にわたり接触させて保つ必要があ
ることがわかる。30分後にリゾチームの意義ある放出が
観察されそして培養時間をさらに伸ばすとさらに改良で
きた。
胞を媒体と充分な時間にわたり接触させて保つ必要があ
ることがわかる。30分後にリゾチームの意義ある放出が
観察されそして培養時間をさらに伸ばすとさらに改良で
きた。
実施例６ この実施例では、KC1の効果をNaC1のものと比較し
た。実施例１の工程を繰り返し、そして得られた結果を
表６に示す。
た。実施例１の工程を繰り返し、そして得られた結果を
表６に示す。
0.5MのKC1またはNaC1を酵母懸濁液媒体に添加しても
細胞と結合しているリゾチーム活性の放出をもたらさな
いことがわかる。それとは対照的に、細胞を0.5MKC1お
よび0.05％のトリトン Ｘ−100を含有している媒体中
に懸濁させる時には、リゾチームはNaC1を可溶性塩とし
て使用した時と同じ割合で放出された。
細胞と結合しているリゾチーム活性の放出をもたらさな
いことがわかる。それとは対照的に、細胞を0.5MKC1お
よび0.05％のトリトン Ｘ−100を含有している媒体中
に懸濁させる時には、リゾチームはNaC1を可溶性塩とし
て使用した時と同じ割合で放出された。
実施例７ この実施例は本発明に従う一般式に適合する種々の表
面活性剤の影響を説明するものである。これらの全ての
表面活性剤の間にある差異は芳香族基のアルキル置換基
およびオキシエチレン単位数ｎにある。比較するため、
この式に相当しない他の表面活性剤類も試験した。
面活性剤の影響を説明するものである。これらの全ての
表面活性剤の間にある差異は芳香族基のアルキル置換基
およびオキシエチレン単位数ｎにある。比較するため、
この式に相当しない他の表面活性剤類も試験した。
これらの種々の表面活性剤類の活性を実施例１に記さ
れている条件下で0.5MのNaC1の存在下で試験した。得ら
れた結果を表７に示す。全ての試験した表面活性剤類の
中で、疎水性部分が本発明に従う置換された芳香族環を
有しているものだけが活性であることがわかる。
れている条件下で0.5MのNaC1の存在下で試験した。得ら
れた結果を表７に示す。全ての試験した表面活性剤類の
中で、疎水性部分が本発明に従う置換された芳香族環を
有しているものだけが活性であることがわかる。
実施例８ この実施例は、一般式およびHLB（親水性−親油性平
衡）が本発明に従っている表面活性剤類の影響を説明す
るものである。比較するため、他の表面活性剤類も試験
した。これらのうち後者は同じ一般式を満たしているが
それらのHLBが本発明で記されている限界外のものであ
る。得られた結果を表８に示す。後者の場合にはリゾチ
ームの放出が弱いかまたは０であることがわかる。
衡）が本発明に従っている表面活性剤類の影響を説明す
るものである。比較するため、他の表面活性剤類も試験
した。これらのうち後者は同じ一般式を満たしているが
それらのHLBが本発明で記されている限界外のものであ
る。得られた結果を表８に示す。後者の場合にはリゾチ
ームの放出が弱いかまたは０であることがわかる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヤツク・クラアイ ベルギー国ビー−5830マジー・フエルム デルモワ 51 (72)発明者 ジヤン・エム・エイ・ジー・デルクール ベルギー国ビー−5865バルハイン・リユ デボスカイユ ２ (72)発明者 ジヤツク・デイ・ブイ・アノチエ ベルギー国ビー−1338ラスヌ・リユドカ テユリア ５ビー (56)参考文献 特表 昭63−501121（ＪＰ，Ａ)
Claims (11)
- 【請求項１】酵母により製造されそして少なくとも部分
的にそれの細胞周辺腔中に局在しているポリペプチド類
を水性媒体中に放出させる方法において、該酵母を細胞
破壊工程に供することなく水性媒体中で（ｉ）中性でそ
して水溶性の鉱物質塩および（ii）８〜15の間にあるHL
Bを有するポリエトキシル化されたアルキルフェノール
型の水溶性の非イオン性表面活性剤からなる系により処
理することを特徴とする方法。 - 【請求項２】酵母が遺伝的に操作されていてポリペプチ
ドを製造するものである特許請求の範囲第１項の記載方
法。 - 【請求項３】酵母が遺伝的に操作されていて異型のポリ
ペプチドを製造するものである特許請求の範囲第１項記
載の方法。 - 【請求項４】異型のポリペプチドがリゾチームである、
特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】酵母がサツカロミセス属に属している、特
許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】酵母がサツカロミセス・セレヴイシエ種に
属している、特許請求の範囲第５項のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項７】酵母がGRF18菌株に属している、特許請求
の範囲第６項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】中性でそして水溶性の塩を媒体中で少なく
とも0.1Mの濃度で使用する、特許請求の範囲第１〜７項
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】非イオン性表面活性剤を少なくとも0.02％
の濃度で使用する、特許請求の範囲第１〜８項のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１０】非イオン性表面活性剤が10〜15の間にあ
るHLBを有するポリエトキシル化されたオクチル−およ
びノニルフェノール類からなる群から選択される、特許
請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】非イオン性表面活性剤が８〜12.5の間に
あるHLBを有するポリエトキシル化されたトリブチルフ
ェノールである、特許請求の範囲第１〜９項のいずれか
に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE85215849A BE903626A (fr) | 1985-11-13 | 1985-11-13 | Procede pour la recuperation de polypeptides localises dans l'espace periplasmique de la levure. |
| BE215849 | 1985-11-13 | ||
| BE903626 | 1985-11-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62118896A JPS62118896A (ja) | 1987-05-30 |
| JP2636844B2 true JP2636844B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=25654770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61266772A Expired - Lifetime JP2636844B2 (ja) | 1985-11-13 | 1986-11-11 | 酵母の外質隙中に局在するポリペプチドの回収法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0222725B1 (ja) |
| JP (1) | JP2636844B2 (ja) |
| AT (1) | ATE73490T1 (ja) |
| BE (1) | BE903626A (ja) |
| CA (1) | CA1339800C (ja) |
| DE (1) | DE3684240D1 (ja) |
| ES (1) | ES2030000T3 (ja) |
| GR (1) | GR3004042T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| NO177065C (no) * | 1988-09-26 | 1995-07-12 | Labofina Sa | Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym |
| US7319021B2 (en) | 2002-11-01 | 2008-01-15 | Promega Corporation | Cell lysis composition, methods of use, apparatus and kit |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| BE903626A (fr) * | 1985-11-13 | 1986-03-03 | Labofina Sa | Procede pour la recuperation de polypeptides localises dans l'espace periplasmique de la levure. |
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- 1986-11-13 CA CA000522859A patent/CA1339800C/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-12 GR GR910402158T patent/GR3004042T3/el unknown
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| Publication number | Publication date |
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| EP0222725B1 (en) | 1992-03-11 |
| JPS62118896A (ja) | 1987-05-30 |
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| GR3004042T3 (ja) | 1993-03-31 |
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| EP0222725A2 (en) | 1987-05-20 |
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| DE3684240D1 (de) | 1992-04-16 |
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