JP2628667B2

JP2628667B2 - 位置非特異性リパーゼ

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Publication number: JP2628667B2
Application number: JP62506545A
Authority: JP
Inventors: 三千代石井
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1986-10-17
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1997-07-09
Anticipated expiration: 2012-07-09
Also published as: EP0287634B1; EP0287634A1; JPH01501120A; WO1988002775A1; ATE117018T1; DE3750982D1; CA1339844C; DE3750982T2

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、溶液状および固定化状態で上昇した熱安定
性の新規な位置非特異性リパーゼ、その製造方法並びに
エステル加水分解、エステル合成およびエステル交換へ
の用途に関する。

〔定義〕

次の定義の下線を引いた語が本明細書において用いら
れる。

リパーゼとは、水不溶性カルボン酸エステル類のエス
テル結合に影響を及ぼす反応（例えば加水分解、エステ
ル結合の合成および交換）を促進する酵素を意味する。

固定化リパーゼとは、“固定化生物触媒の特徴に対す
るガイドライン（Guidelines for the characterizatio
n of immobirized biocatalysts）”（1983）、Enzyme
Microb.Technol.,5,304-307に定義されるような、固定
化酵素または固定化細胞の形態におけるリパーゼを意味
する。誘導体化リパーゼとは、リパーゼを固定化するこ
となく化学的に装飾したものを意味する。可溶性リパー
ゼとは、固定化もまたは誘導体化のいずれをも行ってい
ない未修飾リパーゼを意味する。

位置特異性リパーゼ（または特異性リパーゼと略す）
とは、トリグリセリド分子の１−および３−位の脂肪族
アシル基と優先的に反応するものであり、そして位置非
特異性リパーゼ（または非特異性リパーゼと略す）と
は、トリグリセリドの３つの脂肪族アシル基すべてと同
等の速度で反応するものをいう。

〔従来の技術〕

微生物起源（細胞内および細胞外双方）、並びに植物
および動物起源の広範な種々のリパーゼが既知である。
細胞外微生物リパーゼの一般的な言及については、A.R.
Macraeの「微生物酵素及びバイオテクノロジー（Microb
ial Enzymes and Biotechnology）」（編者、W.Fogart
y）,ISBN O-85334-185-O.Applied Science Publishers
Ltd.,1983、の225ff頁を参照のこと。

次の微生物に由来する非特異性リパーゼが既知であ
る：スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus
aureus)〔Vadehra,D.V.（1974）.Lipids,9,158〕、ペ
ニシリウム・シクロピウム(Penicillium cyclopium)
〔Okumura,S.,等（1976）Agricultural and Chemistry,
40,655並びにRenshaw E.C.およびSan Clemente C.L.（1
966）Developments in Industrial Microbiology,8,21
4〕、コリネバクテリウム・アクネス(Corynebacterium
acnes)〔Hassing,G.H.（1971）.Biochimica et Bioph
ysica Acta,242,381およびPablo G.（1974）The Journa
l of Investigative Dermatology,63,231〕、プロピオ
バニクテリウム・アクネス等、（1981）.Journal of Ge
neral Microbiology,124,393〕、カンディダ・シリンド
ラセア(Candida cylindracea)〔また、カンディダ・ル
ゴサ(C.rugosa）として知られている〕〔Benzonana,G.
およびEsposito,S.（1971）.Biochimica et Biophysica
Acta,231,15;並びにKimura,Y.（1983）Eur.J.Appl.Mic
robiol.Biotechnol.,17,107〕、カンディダ・クルベー
タ（Candida curvata)〔D.Montet等（1985）,Fette Se
ifen Anstrichmittel,87,181〕。しかしながら、引用文
献および本明細書の例におけるデータは、これらのリパ
ーゼのすべては約60℃以上で長時間使用するには熱安定
性が不十分であることを示している。またさらに、S.ア
ウレウス、C.アクネス、およびP.アクネスは病原微生物
の疑いがあるか、または病原微生物と判明している。ゲ
オトリクム・カンディダム（Geotrichum candidum）由
来のリパーゼ〔Jensen,R.G.（1974）Lipids,9,149;Jens
en,R.G等（1972）Lipids7,738;並びにTsujisaka,Y.およ
びIwai,M.（1984）化学と工業、58,60〕は、位置非特異
性であるが、しかし一定の不飽和脂肪族アシル基に対し
ては高い特異性を有し、しかも熱安定性でない。

さらに、フミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanu
ginosa）〔Liu,W.H.,Beppu,T.およびArima,K.（1973）A
gricultural and Biological Chemistry,37,1349〕およ
びクロモバクテリウム・ビスコスムChromobacterium v
iscosum）〔Sugiura,M.およびIsobe,M.（1975）Chemica
l and Pharmaceutical Bulletin,23,1226〕由来のリパ
ーゼが非特異性リパーゼとして開示されている。しか
し、その後の結果〔Biotechnology and Genetic Engine
ering Reviews,vol 3.（９月、1985）200頁〕は、これ
らの２種のリパーゼが実際には特異性であることを示し
ている。またさらに、本明細書の例におけるデータも、
C.ビスコスムのリパーゼが特異性であることを実証す
る。

固定化非特異性リパーゼはY.Kimura等により、Eur.J.
Microbiol.Biotechol.17(1983）、107-112頁に開示され
ている。該リパーゼはカンディダ・シリンドラセアに由
来するものであり、記載中のデータは該固定化リパーゼ
が約40℃の至適温度を有し、そして50℃においてかなり
の失活があることを示す。

固定化非特異性リパーゼおよびその脂質のランダムな
エステル交換への用途は、Macrae,A.R.により（1983）,
Journal of the American Oil Chemists′Society（JAO
CS），60,291に開示されている。しかしながら、処理温
度は40℃だけであった。この低い温度は、カンディダ・
シリンドラセアリパーゼの熱安定性がおそらく劣るため
に選ばれたのであろう。

熱安定性で非特異性リパーゼの必要性は、溶媒を用い
ないで約60℃以上の高い融点を有する基質の処理、例え
ばマーガリン工業での脂質のランダム化について存在す
る。この言及は、A.R.MacraeおよびR.C.Hammond:“リパ
ーゼ”の現在及び将来の利用（Present and Future App
lications of Lipases）",Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews,3,193-217（1985）になされてい
る。従来技術の調整品の熱安定性が満足できるものでな
いことから、本発明の目的は、可溶性または固定化状態
において60℃以上における長期間の使用に対して十分な
熱安定性を有する非特異性リパーゼを提供するにある。
リパーゼは、これらを経済的に製造することができるた
めには微生物性でなければならない。

〔発明の陳述〕

本発明者等は、カンディダ属に属する多数の菌株が新
規な非特異性リパーゼを産生することを見い出した。驚
くべきことに、これらの新規なリパーゼは可溶性および
固定化状態で、C.クルベータ（C. curvata)およびC.ルゴ
サ〔C. rugosa,C.シリンドラセア（C. cylindracea)〕由
来のものを含む従来知られているすべての非特異性リパ
ーゼより、より一層熱に安定である。

従って、本発明の態様の第１は、位置非特異性カンデ
ィダリパーゼ調整品であって、pH6.5の0.08Mのシトレー
ト−ホスフェート緩衝液中、70℃で60分インキュベーシ
ョン後の残留リパーゼ活性が、10％超、好ましくは50％
超であり、最も好ましくは80％超であることを特徴とす
る前記調製品を提供する。

本発明の第２の態様では、位置非特異性リパーゼ調製
品であって、（ａ）pH6.5かつ60℃で60分間インキュベ
ーションし、次に（ｂ）pH6.5の0.1Mシトレート−ホス
フェート緩衝液中、65℃で60分インキュベーションした
後のリパーゼ活性が、（ａ）後に残存する該活性の少な
くとも20％であることを特徴とする前記調製品を提供す
る。

本発明の第３の態様では、C.アンタルクチカ（C. anta
ectica）、C.ツクバエンシス（C. tsukubaensis）、C.フ
ミコーラ（C. humicola）もしくはC.ホリオルム（C. holi
orum）の菌株由来のリパーゼ、またはかかるリパーゼと
免疫化学的同一性を示し、しかも好ましくは前記リパー
ゼと同一の分子量を有するリパーゼを含んで成ることを
特徴とする位置非特異性リパーゼ調製品を提供する。

本発明の第４の態様では、カンディダ・アンタルクチ
カ、C.ツクバエンシス、C.オーリクラリアエ（C. auricu
lariae）、C.ホリオルムまたはC.フミコーラの菌株の培
養で得られることを特徴とする位置非特異性リパーゼ調
製品を提供する。

本発明の第５の態様では、前記のリパーゼの固定化に
より得られる固定化非特異性リパーゼ調製品を提供す
る。

本発明の第６の態様では、水で部分的にかまたは完全
に飽和されている基質による連続固定床エステル交換
（好ましくはアシドリシス）における60℃でのリパーゼ
活性の半減期が1,000時超であることを特徴とする熱安
定性を有する固定化非特異性カンディダリパーゼ調製品
を提供する。

本発明の第７の態様では、トリオレイン中、80℃で72
時間インキュベーションした後の残留リパーゼ活性が10
％超、最も好ましくは50％超であることを特徴とする熱
安定性を有する固定化非特異性カンディダリパーゼ調製
品を提供する。

さらに本発明は、位置非特異性リパーゼの製造方法で
あって、カンディダ・アンタルクチカ、C.ツクバエンシ
ス、C.オーリクラリアエ、C.フミコーラまたはC.ホリオ
ルムの菌株を、好気性条件下で資化性炭素源、窒素源お
よびリンを含有する栄養培地で培養し、好ましくは引き
続き発酵ブロスからリパーゼを回収することを含んで成
ることを特徴とする前記製造方法を提供する。

またさらに本発明は、次の（ａ）遺伝子の発現を促進する機能をコードするDNA配
列およびカンディダリパーゼをコードするDNA配列を含
んでなる適当な組換えDNAのクローニングベクターを提
供する工程；（ｂ）工程（ａ）由来のクローニングベクターで適当な
宿主生物体を形質転換する工程；並びに（ｃ）形質転換した宿主を適当な培地で培養し、所望に
より該培地からリパーゼを回収する工程、を含んで成る
非特異性カンディダリパーゼの製造方法を提供する。

最後に、本発明は、前記のリパーゼ調製品または前記
の方法で産生されるリパーゼのリパーゼが触媒する方法
（即ち、加水分解、エステル合成またはエステル交換）
における用途を提供する。

〔発明の具体的な説明〕

本発明によるリパーゼは、カンディダ属、特にN.J.W.
Kreger van Rijにより、The Yeast,a Taxonomic Study
third revised and enlarged edition,Elsevier,Amster
dam（1984）に定義されているようなカンディダのグル
ープＩに属する菌株の培養により産生され得る。グルー
プＩは、カンディダの担子菌類アナモルフを包含する。
好ましい菌株は、前記の本に定義されるようなC.アンタ
ルクチカ（C. antarctica）（Goto等）Kurtzman等、C.ツ
クバエンシス（C. tsukubaensis）、C.オーリクラリアエ
（C. auriculariae）、C.フミコーラ（C. humicola）また
はC.ホリオルム（C. foliorum）である。また、C.アンタ
ルクチカは、別名スポロボロマイセス・アンタルクチカ
（Sporobolomyces antarcticus)（Goto等）、ステリグ
マトマイセス・アフィディス（Sterigmatomyces aphid
is)（HenningerおよびWindisch）、およびトリコスポロ
ン・オリザエ（Trichosporon oryzae）（Ito等）とし
て記載されており、そしてC.オーリクラリアエは別名ト
ルロプシス・オーリクラリアエ（Torulopsis auricula
riae）として記載されていることが認められる。

好ましいカンディダ菌株は、後に例示するリパーゼの
１以上に対し免疫化学的同一性を示す非特異性リパーゼ
を産生するものである。

好ましい菌株は、C.アンタルクチカの次の３株を包含
し、これらの菌株はブタペスト条約の条件に従いDeutsc
he Sammlung von Mikroorganismen（DSM）に寄託されて
いる。

寄託番号寄託日 DSM 3855 1986.9.29 DSM 3908 1986.12.8 DSM 3909 1986.12.8 さらにまた、好ましい菌株は下記のものを包含し、こ
れらの菌株は、下記に示す寄託番号に基づきCentralbur
eau voor Schimmelculturen（CBS）,American Type Cul
ture Collection（ATCC）,Agricultural Research Cult
ure Collection（NRRL）及び発酵研（IFO）から第三者
に自由に分譲され得る。

C.アンタルクチカ CBS 5955,ATCC 34888,NRRL Y-8295
（タイプ・ストレイン） C.アンタルクチカ CBS 6678,ATCC 28323 C.アンタルクチカ CBS 6821,NRRL Y-7954 C.ツクバエンシス CBS 6389,ATCC 24555,NRRL Y-7792
（タイプ・ストレイン） C.オーリクラリアエ CBS 6379,ATCC 24121,IFO 1580
（タイプ・ストレイン） C.フミコーラ CBS 571,ATCC 14438,IFO 0760（タイプ
・ストレイン） C.フミコーラ CBS 2401,ATCC 9949,NRRL Y-1266,IFO 0
753 C.フミコーラ IFO 1527 C.ホリオルム CBS 5234,ATCC 18820（タイプ・ストレ
イン）上に示したような５種の好ましいカンディダ菌株のすべ
てのタイプ・ストレインが、本発明のリパーゼの産生を
することが見い出された。

上記菌株の変異株および変種もまた、本発明の範囲内
にあると考慮される。

当該技術分野で知られている遺伝子工学技術は、他の
菌種に本発明のリパーゼ産生能力を転移するために使用
することができる。かかる菌種の使用もまた、本発明の
範囲内にあると考慮される。

熱安定性本発明のリパーゼは、可溶性および固定化状態で良好
な熱安定性を有する。C.アンタルクチカ、C.オーリクラ
リアエおよびC.ツクバエンシスのリパーゼが好ましく、
特に、これらの熱安定性のためにC.アンタルクチカ由来
のリパーゼが好ましい。

本発明による数種のリパーゼ調製品は、熱処理期間の
始めのうちは、それらがかなり速やかに活性を失うが、
しかし一定時間後に残存する活性はその後の熱処理に対
して非常に安定である。この挙動は異なる熱安定性の２
種以上のリパーゼの存在、および／または熱不安定のプ
ロテアーゼの存在および／または限定した量のリパーゼ
安定化構成要素の存在のためであるかも知れない。

C.アンタルクチカリパーゼの熱処理は、例えば60℃で
１−３時間により特に熱安定性のリパーゼをもたらす。

カンディダの培養によるリパーゼの製造本発明で使用されるカンディダ菌株は、好気性条件
下、当該技術分野で公知の成分からなる培地、資化性炭
素源および窒素源と他の微量栄養素とを一緒に含む栄養
培地で培養できる。

好ましい炭素源は、炭水化物、脂質および他のエステ
ル類であることができる。好ましい窒素源は、無機物
（例えば、硝酸塩もしくはアンモニウム塩）または有機
物（例えば酵母エキストラクト、コーン・ステープ・カ
ラー、大豆粉、綿実粕もしくはコーングルテン）である
ことができる。

培地のpHは、3.5-9.5、好ましくは5.5-8.5であること
ができる。発酵温度は、15-40℃、好ましくは20-34℃で
あることができる。

発酵後、液状酵素濃厚物は、ブロスから夾雑物の除去
により、そして所望によりエバポレーションによるか、
または逆浸透により濃縮することで製造することができ
る。なお、最後に保存剤を該濃厚物に添加することもで
きる。

固形酵素調製品は塩、例えばNa₂SO₄沈澱または水混和
性溶媒、例えばエタノールもしくはアセトン沈澱により
精製および／または濃縮したブロスから調製することが
でき、またさらに適当な乾燥手段、例えばスプレードラ
イをブロス中の除去に用いることもできる。

誘導体化（化学的に修飾した）リパーゼは、当該技術
分野で既知のいずれかの方法により調製することができ
る。一例としては、Matsushima.A.等（1986）,Biotechn
ology Letters,8,72-78に開示されているポリエチレン
−グリコール（PEG）変性法がある。

成分リパーゼＡおよびＢ C.アンタルクチカのリパーゼは、２成分のリパーゼＡ
およびＢを含むことが見い出された。それぞれの特性お
よび用途は、本明細書で後に説明する。

精製リパーゼＡおよびＢは、発酵後のリパーゼから、
例えばゲル濾過により調製することができる。

他方、組換えDNA技術は、リパーゼＡおよびＢをコー
ドする遺伝子の選択的な転換に使用することができる。
これについての好ましい方法は、以下に記載される。

リパーゼＡはより熱安定性であり、リパーゼＢはＡよ
り一層アルカリ耐性である。そのため高温またはpHでの
処理は、それぞれ主成分としてリパーゼＡまたはＢを含
有する調製品を得るために使用することができる。

リパーゼＡは、43KDの分子量および8.0±0.2の等電点
（pI）を有する。リパーゼＢは、33KDの分子量および6.
0±0.2のpIを有する。

リパーゼの免疫化学的な特性の決定本発明の好ましいリパーゼは、上記のカンディダ菌の
１つ由来のリパーゼ、殊に上記の菌株の１つ由来の、具
体的にはDSM3855由来のリパーゼＡまたはＢと免疫学的
な相同性を示す。

最も好ましいリパーゼは、これらのリパーゼの１つと
免疫学的な相同性も、同一の分子量をも併有する。

免疫学的な試験に用いられる抗血清の調製は、N.H.Ax
elsen:Handbook of Immunoprecipitation-in Gel Techn
iques（Blackwell Scientific Publications,1983）の
第41章に記載されている。

タンパクの免疫学的な相同性および分子量は、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）（例え
ば、ノボ分析法AG217-GBによる）、次いでJ.Hald等、Jo
urnal of Reproductive Immunology,vol.10,15〜26頁
（1987）に基づく免疫ブロッティングにより測定するこ
とができる。

DSM3855由来の精製リパーゼＡ（例7.由来）に対して
生じる単一特異性のラビット抗血清を、上記した方法に
よるSDS-PAGEの免疫ブロッティングに用いて次のリパー
ゼについて試験した。

C.アンタルクチカ由来：例３のように調製される粉末の
0.2OU溶液 C.ツクバエンシス由来：例５由来の粉末の0.2OU溶液 C.オーリクラリアエ由来：例６由来の粉末の0.1OU溶液 C.フミコーラ由来：例6B由来の粉末の0.75％溶液 C.ホリオルム由来：例6A由来の粉末の３％溶液 43KD位にC.アンタルクチカのリパーゼは、強いバンドを
示し、そしてC.ツクバエンシスおよびC.フミコーラのリ
パーゼは弱いバンドを示した（即ち、これらはC.アンタ
ルクチカ由来のリパーゼと免疫学的に同一性を有し、か
つ同じ分子量を有するリパーゼを産生する）。C.オーリ
クラリアエおよびC.ホリオルムのリパーゼについては、
どのようなバンドも観察されなかった。

また、同一性試験は、周知のオクテルロニー（Ouchte
rlony）の二重免疫拡散法か、またはN.H.Axelsenによる
上記の本の第５章および第14章に開示されている交差免
疫電気泳動法により行うことができる。

組換えDNA技術によるリパーゼの産生組換えDNA技術は、リパーゼを高収率で得るために、
または単一成分のリパーゼ、例えば前述のC.アンタルク
チカ由来のリパーゼＡまたはＢを良好な収率で産生せし
める目的で使用することができる。

好ましい方法は、宿主としてアスペルギルス（Asperg
illus）菌株を用いそして次の工程を含んで成る。

（ａ）遺伝子の発現を促進する機能をコードするDNA配
列およびカンディダリパーゼをコードするDNA配列を含
んで成る適当な組換DNAクローニングベクターを供給す
る工程；（ｂ）（ａ）工程由来のクローニングベクターを用い適
当な宿主生物体を形質転換する工程；並びに（ｃ）形質転換した宿主を適当な培地で培養し、そして
所望により培地からリパーゼを回収する工程。

特に、引用により本明細書の内容となるEPO,238,023
の宿主としてのA.オリーゼ（A. oryzae）を使用すること
が好ましい。

固定化リパーゼ本発明の実施については、当該技術分野のいずれかの
既知の方法、例えばK.Mosbach（編者）:Methods in Enz
ymology,44，“Immobilized Enzymes"（Academic Pres
s,New York,1976）に記載の方法によりリパーゼを固定
化することができる。酵素固定化に利用できる方法は、
細胞均質化物の架橋法、不溶性の無機もしくは有機担体
への共有結合法、ゲル中への包括法およびイオン交換樹
脂もしくは他の吸着剤への吸着法が包含される。また、
Macrae A.R.およびHammond R.C.（1985）,Biotechnolog
y and Genetic Engineering Reviews,3,193に開示され
ているような、粒状の担体上への被覆法も使用すること
ができる。

固定化方法は、好ましくは粒状の多孔質樹脂を使用す
る。リパーゼは該樹脂上に容易に吸着することができる
か、または当該技術分野で既知のグルタルアルデヒドも
しくは他の架橋剤を用いる架橋により該樹脂上に結合す
ることができる。

好ましい樹脂のタイプは、例えばアクリル、ポリスチ
レンまたはフェノールホルムアルデヒド型の弱塩基陰イ
オン交換樹脂である。商品化されている製品の例として
は、Lewatit E1999/85（Bayer製、West Germany）及
びDulite ES-568（Rohm＆Haas）が挙げられる。この
タイプの樹脂上への固定化は、引用により本明細書の内
容となるEPO140542に従うのが好ましい。

他の好ましい樹脂のタイプは、フェノールホルムアル
デヒド型の吸着樹脂である。この樹脂上への固定化は、
引用により本明細書の内容となる、DK85-878に従って行
うのが好ましい。

さらに他の好ましい樹脂のタイプは、アクリル型の吸
着樹脂である。商品の例ではLewatit E2001/85（Baye
r製）がある。

他の好ましい固定化方法は、無機担体を用い、そして
好ましくはリパーゼを吸着または共有結合により該担体
へ付着せしめる。かかる担体および固定化技術は、K.Mo
sbach（編者）:Methods in Enzymology,44，“Immobili
zed Enzymes"（Academic Press,1976）に開示されてい
る。

リパーゼ触媒作用を利用する方法本発明のリパーゼは、次の方法のいずれかに使用する
ことができる（カッコ内には反応体を示した）。

エステル加水分解方法（エステル＋水）エステル合成方法（酸＋アルコール）エステル交換方法、アシドリシス方法（エステル＋酸）アルコリシス方法（エステル＋アルコール）エステルの相互交換またはエステルの転位方法（エステ
ル＋エステル）を包含する。

前記アルコールは、モノーもしくは多価の一級および
／または二級アルコールまたはこれらの混合物であるこ
とができる。前記酸は、いずれかのカルボン酸またはこ
れらの混合物であることができる。前記エステルは、前
述のアルコールおよび酸由来のいずれかのエステルまた
はこれらの混合物であることができる。いくつかの有利
な方法の具体例を以下に説明する。

エステル加水分解方法この方法は、回分式かまたは連続式かのいずれかによ
り実施することができる。回分反応器中では、脂質およ
び水が必要量のリパーゼと共に機械的に撹拌される。反
応時間は、酵素量および所望の転化率に依存するが、一
般的に４−６時間から３−４日迄である。固定化リパー
ゼを用いるならば、反応終了時に回収しそして再使用す
ることができ、それによって工程の経済性を改善するこ
とができる。

連続方法では、固定化リパーゼを保持する反応容器を
通して、その融点以上で脂質が流される。種々の方法、
例えば脂質に水を分散させるか、または固定化リパーゼ
中に断続的に水を吸着させるかにより、この系に水を添
加することができる。

回収における節約のために、一般に水の含量は40％
（w/w）以下に保たれる。温度は反応混合物の融点以上
にされ、80℃程度の温度とすることができる。好ましい
温度は45-70℃である。

該方法の例は脂質の開裂である。高率の加水分解が望
まれるならば、リパーゼＡもリパーゼＢをも含んでいる
C.アンタルクチカのリパーゼを用いることが好ましい。

本方法の第２の例は、コレステロールエステルの加水
分解である。

第３の例として、高含有量のオレイン酸またはリノレ
イン酸を含有する脂質はC.アンタルクチカのリパーゼ、
好ましくはリパーゼＡにより加水分解することができ
る。飽和脂肪酸は加水分解されるが、オレイン酸および
リノレイン酸は大部分が未反応のまま残る。遊離の脂肪
酸を取り除いた後は、ほぼ完全な加水分解を化学的にま
たは酵素的に、例えばC.アンタルクチカのリパーゼＢに
より行うことができる。分離後、オレイン酸またはリノ
レイン酸の高含有率の脂肪酸が得られる。この方法によ
り、オリーブ油からオレイン酸を得ることができ、そし
て綿実油、大豆油またはサンフラワー油からリノレイン
酸を得ることができる。

エステル合成方法本発明は、他の方法では製造することが困難な二級ア
ルコールのエステル化、そして酸またはアルコールが高
い融点を有するもののエステル化に特に有利である。

本方法は、回分的にか、または連続的に実施すること
ができる。回分方法では、固定化リパーゼを回収しそし
て再利用することで経済性を高めることができる。好ま
しくは反応期間を通じて、例えば減圧蒸留またはモノキ
ュラシーブへの吸着により水を除去する。反応温度は、
反応混合物を液体にするような、好ましくは60-90℃よ
り好ましくは60-80℃である。

単鎖のアルコール（一級または二級）からのエステル
を合成するには、C.アンタルクチカリパーゼに含有され
るリパーゼＢを用いるのが好ましい。長鎖の非揮発性ア
ルコールからエステルを合成するには、C.アンタルクチ
カリパーゼに含有されるリパーゼＡを用い、水の除去の
ため減圧下で実施することが好ましい。

エステル交換この方法では有機溶媒、例えばヘキサンまたは他の炭
化水素を反応混合物中に含ませることができる。しかし
ながら、本発明のリパーゼの優れた熱安定性のために、
殆どの場合溶媒を用いることなく溶媒した器質について
該方法を実施することが可能であり、かつ好ましいであ
ろう。

また、反応混合物は酵素の活性を持続せしめるため
に、少量の水を含ませることもできる。飽和までの含有
量の水を使用することができるが、高い水の含有率は加
水分解により好ましくない高率の副生物を誘導する。

反応体の純度により、固定化リパーゼの最高の生産性
を達成するために該反応に先立ち精製が必要である可能
性がある。通常の精製方法、例えば漂白法、アルカリ精
製法および脱臭法を用いることができる。

本発明のリパーゼの優れた熱安定性のために、反応温
度は90℃までの高さであることができる。反応温度の下
限は、反応混合物の融点および粘度により決定される。
好ましい温度は、60-90℃、最も好ましくは60-80℃であ
る。

エステル交換に関しては、簡便性および経済性の理由
で固定化リパーゼが特に好ましい。また、成分Ａを含有
するC.アンタルクチカリパーゼが好ましい。反応は、回
分式または連続式に遂行することができる。

回分方法では、基質および必要により適当な溶媒が固
定化リパーゼを充填して好ましい温度に加熱されている
回分反応容器中で混合される。基質は、水で部分的にま
たは完全に飽和せしめることができる。酵素量は、所望
の転化率および反応時間に基づき10％までとすることが
できる。反応時間は2,3時間から数日とすることができ
る。反応後、酵素は濾別されそして所望により溶媒洗浄
後、再使用される。

連続方法では、固定化リパーゼを含有するカラムを通
して基質が流される。基質は、酵素カラムに挿入される
前に水で部分的にまたは完全に飽和することができる。
これは、例えば水で飽和した樹脂を充填している予備カ
ラムによるか、または基質貯蔵容器中で基質を水で飽和
せしめることにより行われる。所望の転化率は、カラム
を通過する流速の調製、即ち滞留を変化せしめることに
より達成することができる。

かかる系での操作時間は、数千時間までとすることが
できる。活性の漸減が生ずる場合は、流速を低下する、
即ち反応混合物の滞留時間を増大せしめることにより補
うことができる。最初の滞留時間は、所望の転化率次第
であり、具体的には５分から２時間とすることができ
る。

この方法の実用例は、脂質のランダム化や多不飽和脂
肪酸のグリセリドの製造である。

脂質のランダム化この方法の好ましい態様は、反応混合物がトリグリセ
リド脂質である脂質のランダムエステル交換であり、反
応はトリグリセリド分子間のアシル基の交換により生ず
る。

反応混合物は、単一の脂質分画から成ることができ、
この場合は３つの異なる位置のアシル基間で交換が起こ
る。

また、反応混合物は２種以上の脂質から成っていても
よく、具体的には１つは外界温度で液体であり、他の１
つは高い融点を示す脂質である。後者は、天然源からの
精留によるか、または水素添加により得ることができ
る。かかる混合物のランダム化により得られる生成物
は、マーガリン製造業で有用である。

エステル交換方法の他の好ましい態様では、反応体は
トリグリセリド脂質およびカルボン酸エステルから成
り、特にメチルまたはエチルエステルから成る。

エステル交換後、該生成物をさらに処理することもで
きる。副生物、例えば遊離の脂肪酸は常法、例えば苛性
アルカリ精製によりその後除去することができる。

生成物それ自体は、特別な用途に応じて、精留し、他
の油または類似物と配合することができる。

多不飽和脂肪酸のグリセリド本発明のリパーゼは、脂質および脂肪酸または高含有
率の多不飽和脂肪酸（PUFA）を有するエステル（特にメ
チルもしくはエチルエステル）のアシドリシスまたはエ
ステル交換に用いて、ダイエット飲食品用の高PUFA含有
率の脂質を製造することができる。この目的には、C.ア
ンタルクチカリパーゼがPUFAのエステル交換反応につい
て高い活性を有することから特に適している。

図面の説明第１図、第２図および第３図は、それぞれC.アンタル
クチカ、C.ツクバエンシスおよびC.オーリクラリアエの
リパーゼに対するpH−活性曲線を示す（詳細は例14で示
す）。

第４図は、C.アンタルクチカのリパーゼＡおよびＢに
対するpH−活性曲線を示す（詳細は例７に示す）。

第５図および第６図は、それぞれ種々の温度で固定化
C.アンタルクチカのリパーゼを用いるアシドリシスおよ
びエステル交換の結果を示す（詳細は例31に示す）。

第７図および第８図は、それぞれｎ−プロパノールお
よびイソプロパールを用いて、固定化C.アンタルクチカ
によるミリスチン酸エステル合成の結果を示す（詳細は
例37に示す）。

第９図および第10図は、それぞれ固定化C.アンタルク
チカのリパーゼを用いる連続アシドリシスおよびエステ
ル交換の結果を示す（詳細は例36および39に示す）。

発明の実験例可溶性リパーゼ活性のアッセイ（LUおよびOU）２方法が用いられる。第１の方法は、一定のpHでのト
リブチリンの加水分解に基づく。１LU（リパーゼ単位）
は、乳化剤としてのアラビアガムを有するpH7.0、30℃
にて１分当たり１μmol滴定される酪酸を遊離する酵素
量である。さらに詳細は、請求により入手可能なノボ分
析法（Novo Analytical Method）AF95/5に示されてい
る。

オリーブ油の加水分解によるリパーゼ単位の活性測定
（OU）は次のように行われる。

酵素溶液1ml、乳状液〔オリーブ油25mlおよび２％ポ
リビニルアルコール〔（MW約72,000）75mlをワーリング
ブレンダー中で乳化した〕5ml、および緩衝液（50mMト
リス−マレエート緩衝液pH7.0）を混合し、10分間40℃
にて振盪している温浴中でインキュベートする。反応
は、停止剤（アセトン500ml、エタノール500mlおよび1N
NaOH 11ml）を添加して停止する。サンプルおよびブラ
ンクサンプル（停止剤を加えた後乳化）は、0.05NNaOH
によりpH9.2まで滴定する。活性（OH）は、サンプルと
ブランクとの間の滴下NaOHにおける差異から計算され、
そして１分当たりに１μｍ遊離するフリーの脂肪酸とし
て表示する。

可溶性リパーゼの非特異性これはトリグリセリドの短時間加水分解で得られたジ
グリセリド（DG）の分析により測定することができる。
特異性リパーゼは、ほとんど1,2-DGのみを生成するが、
他方非特異性リパーゼはDG分画中にかなりの含有率の1,
3-DGを与える。加水分解および処理時間は、アシル転移
を避けるために短めにしておかねばならない。

より具体的には、測定は次のように行われる。

酵素液（4-1000U/ml）250μｌ、トリス−マレエート
緩衝液（pH7.0）250μｌおよび基質（トリオレイン:2％
ポリビニルアルコール,MW72,000;1:3）をエッペンドル
フ遠心管中で混合し、40℃で30-90分間振盪した。反応
は、CHCl₃を10mlを混合することにより停止した（0.2％
リトコール酸が内部標準として使用されうる）。前記CH
Cl₃はNa₂SO₄で乾燥した。１μｌを薄層クロマトグラフ
ィーロッド（Chromarod Type SII,Newman-Howell Associates Lt
d）上にスポットし、そして溶媒としてヘキサン／エー
テル／酢酸（70:30:1）を用いて20分間展開した。部分
グリセリドはFIDアナライザー（Iatroscan TH 10,Newma
n-Howell Associates Ltd）により定量した。結果は、
総DG中の1,3-DGの％として記載した。このようにして、
特異性リパーゼは０を与え、そして完全な非特異性リパ
ーゼは約33％を与えることが予期されるであろう。

固定化リパーゼのアシドリシス活性（BIU,BIU-2）この活性は、溶媒の存在下または不存在下でパルミチ
ン酸とトリオレインとの反応により測定した。パルミチ
ン酸の総取り込みをトリグリセリドのFAME-GLCにより測
定した。２−位への取り込みは、トリグリセリドを膵リ
パーゼで処理して１−および３−位を加水分解した後、
得られる２−モノグリセリドをFAME-GLCで分析すること
により測定した。

FAME-GLC（脂肪酸メチルエステル−ガス−液体クロマ
トグラフィ）は、the American Oil Chemists′Society
（AOCS）により公表されているCe2-66法およびCe1-62法
に従い行うことができる。

溶媒を用いる反応の場合は、反応混合物はトリオレン
0.6g、パルミチン酸0.174および石油エーテル8.083gか
ら構成する。溶媒を用いない反応についてはトリオレイ
3.0gおよびパルミチン酸0.87gを用いた。

いずれの場合も適当量の酵素を水和し、１−４時間、
所定の温度で前記反応混合物とインキュベートした後、
濾過して反応を停止した。濾過物をアルミカラムで精製
し、そしてトリグリセリドをFAME-GLCにより分析した。
別に、濾過物2ml由来のトリグリセリドを活性アルミナ4
g上で同様に精製した。トリグリセリド約100mg、膵リパ
ーゼ溶液（SigmaカタログNo.L3126由来の豚膵リパーゼ2
50mgを1Mトリス緩衝液、pH8、10mlに溶解した）3ml、2M
CaCl₂ 300μｌおよび0.2％（W/V）タウロコール酸塩0.
75mlを混合した。この乳化物を40℃の湯浴中、２分間加
熱し、そしてウィーレイ（Whirley）ミキサーで1.5分間
混合した後、その反応を96％エタノール4mlを添加して
停止した。サンプルを分液ロートに移し、ジエチルエー
テル（４×20ml）で抽出した。エーテル相を脱イオン水
20mlで４度洗浄した後、エーテル相をNa₂SO₄で乾燥しそ
してエバポレートした。サンプルを1,1,1−トリクロル
エタン1mlに溶解した。グリセリドをMerck社製のプレコ
ートTLCプレートシリカゲル60（110℃で30分活性化し
た）により、展開溶媒としてジエチルエーテル/n−ヘキ
サン（70:30）を用いて飽和した展開槽中で分離した。
このTLCは20℃で40分続けた。

モノグリセリドバンドをヨウ素蒸気で確認して削り取
り、ジエチルエーテル10mlで３度抽出した。エーテル相
を濾過し、蒸発せしめそしてサンプルをメチル化し、次
いでGLCにより分析した。

1BIU（バッチエステル交換単位）は、溶媒の存在下ま
たは不存在下で所定の温度における１μmole/分の初速
度でパルミチン酸を取り込む固定化リパーゼの量を示
す。1BIU-2（２位におけるBIU）は、２−位の取り込み
に由来する同様のものを意味する。

固定化リパーゼの相互転移エステル化活性（BIU）この活性は、等モル量のトリオレインおよびトリパル
ミチン混合物により測定した。混合トリグリセリド（PO
O,PPO等）の生成物は、高性能液体クロマトグラフィー
（HPLC）により測定した。

より具体的には、トリオレイン（OOO）0.8855gおよび
トリパルミチン（PPP）0.8073g（それぞれ1mM）を溶融
し、そして乾燥状酵素250mgを10％（w/w）水にて加湿し
て添加した。サンプルを所定の温度で15分間、湯浴中で
振盪した後、HPLCで分析した。

HPLCは、G.W.Jensen,J.Chromatogr.,204,407（1981）
に従い行うことができる。

1BTU（バッチ相互転移エステル化単位）は、所定の温
定における１μmole/分の初速で混合トリグリセリドを
生成する固定化リパーゼの量として定義した。

固定化リパーゼの非特異性指数（NSI₁,NSI₂）これは、エステル交換（例えばアシドリシス）による
最高の測定値を示した。２−位における交換の測定は非
特異性を示す。ここでは、トリオレインおよびパルミチ
ン酸を用いるNSI₁法並びにXOXトリグリセリド（Ｘ＝パ
ルミチン酸／ステアリン酸、Ｏ＝オレイン酸）およびラ
ウリン酸を用いるNSI₂法の２方法を用いた。最良の方法
はNSI₁であるが、分析が非常に扱いにくい。NSI₂法は簡
便に行うことができるが、その結果はリパーゼの脂肪酸
特異性により影響を受ける。この２つのアシドリシス法
は、可溶性リパーゼについて使用される加水分解法によ
りも、アシル基の移動のために誤差の生ずる傾向は少な
い。

NSI₁法では、BIUおよびBIU-2が測定されそして指数は
NSI₁＝3X BIU-2/BIUとして算出される。この値は、完全
な特異性リパーゼでは０となり、そしてすべての３つの
位置で等しく反応する非特異性リパーゼでは１となるに
ちがいない。

NSI₂法では、固定化リパーゼは活性化の必要に応じ、
一般に約10％水に水和される。次の混合物を使用した。

ココアバターステアリン345mg（Aarhus OileA/S、Den
markより購入、約95％のXOXトリグリセリドを含有す
る）、ラウリン酸（Merck）480mg（純度99％）、石油エーテル（BDH）8.1g（沸点80-100℃）、および固定化リパーゼ250mg（乾燥物）。

上記成分の混合物を適当な転化率を得るに必要な時間
および温度（40-60℃の範囲内）で、振盪湯浴中でイン
キュベートした。その後、純粋なトリグリセリドをアル
ミナクロマトグラフィーにより単離し、脂肪酸組成をFA
ME-GLCで測定した。

指数は次のように決定した。

NSI₂＝3X（オレインの減少量）／（ラウリンの取り込
み量）特異性および非特異性リパーゼ間の識別は、30-6
5％の範囲内のラウリン酸取り込みがもっとも適してい
ると考えられる。

培地次の組成の培地を例で使用した。各々の培地は121-13
0℃で20-90分間オートクレーブした。

ファルマメディアの組成は、発酵培地組成物（Fermen
tation Media Formulation）についてのTraders′ガイ
ド（Traders′Oil Mill Co.,50-51頁）に開示されてい
る。

例1.C.アンタルクチカに由来するリパーゼの製造寒天−３スラント上のカンディダ・アンタルクチカ(C
andida antarctuca）菌株（DSM 3855）培養物をBou-3
培地800mlを有する 2000ml振盪フラスコに移し、26℃で１日振盪した（200r
pm、振幅約2cm）。

得られる培養ブロスを、7lのCale-2培地を有する一般
的な10l発酵槽について種母として用いた。

発酵条件は次の通りであった。

発酵槽の型式：実験用発酵槽FL110（BiotecAB製、Bro
mma,Sweden）。

通気:6Nl/分攪拌:520rpm（各々６枚翼を備える２個の攪拌機による
攪拌）温度:26℃ pH:未調整時間:119時間リパーゼの収量は157LU/mlであった。

発酵槽から取り出した培養ブロスを6000Aローターを
備えたソールバル（Sorvall）RC-3B遠心機により4,100r
pmで35分間遠心した。上澄液（総量5l）を10,000MWカッ
トオフの濾過シートを備えるミリポア（Millipore）由
来のペリコン（Pellicon）限外濾過装置による限外濾過
（そしてそれぞれ同一容量の水で５度洗浄した）で600m
lに濃縮した。99％冷エタノール600mlを前記UF−濃厚物
の560mlに加え、混合物を４℃で30分間攪拌した後、前
記と同様に遠心した。次に、一次エタノール沈殿物由来
の上澄液に99％冷エタノール2.5倍量加えた。この混合
物を30分間攪拌しそして前記と同様に遠心した。この遠
心由来のペレットを約230mlの水に溶解し、そして凍結
乾燥して22gの粉末（16,200LU/g）が得られた。

このリパーゼをエタノール溶離による疎水的相互作用
クロマトグラフィーを用いてさらに精製し、次いで減圧
下で乾燥して約92,000LU/gの粉末を得た。

対照例１ C.クルベータ（C.curvata）リパーゼの調製カンディダ・クルベータ(Candida curvata)CBS570菌
株（別名、ATCC10567）を用いた。CBSはCentraalbureau
voor Schimmelcultures,Baarn,Netherlandsを示し、AT
CCはAmerican Type Culture Collection,Rockville,MD,
USAを示す。この菌株の寒天−３スラント（例１参照）
上の培養物を、それぞれBou-3培地（例１参照）100mlを
有する４個500ml振盪フラスコに移し、26℃で１日振盪
した（200rpm,振幅約2cm）。Bou-3振盪フラスコの培養
ブロスを種母として用い、各々LR-15培地200mlを含有す
る200個の500ml振盪フラスコを接種した。

LR-15培地組成は次の通りであった。成分濃度ファルマメディア 50 g/l K₂PHO₄ 5 − NaNO₃ 1 − MgSO₄．7H₂O 0.5− Tween-80 20 − pH 7.0（HClで調整）（121℃、40分間オートクレーブした）ツウィーン−80（Tween-80）は、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノオレイン酸エステルである（Merckから
入手した）。

各々の振盪フラスコを0.5-2mlのBou-2培養ブロスで接
種し、26℃で４日間、200-300rpm（振幅約2cm）にて振
盪した。

この振盪フラスコ由来の培養ブロスを15LU/mlのリパ
ーゼ活性を有する総量で29.5lまでの収穫物を与えるも
のとして採集した。該ブロスを例１に記載したように遠
心し、次いでまた例１に記載したように濃縮したが、し
かし１容量の水で２度洗浄しただけである。かくして、
168LU/mlのリパーゼ活性を有する濃厚物3.9lを与えた。

例2.パイロットプラントにおけるC.アンタルクチカ由来
のリパーゼの製造カンディダ・アンタルクチカ菌株DSM3855の培養物をY
PG−寒天含有のフェルンバッハ（Fernbach）フラスコに
接種した。

このフェルンバッハ・フラスコを26℃で８日間培養し
た後、通常の混合により接種しそして次の組成を有する
培地300lを含有する種母発酵槽を通気した。

酵母エキストラクト 3.0kg KH₂PO₄ 0.2− Na₂HPO₄．12H₂O 0.2− グルコース 0.3− Pluronic 60L 125 ml pH 5.6 前記ブロスを26℃で１日発酵後、通常の混合物を接種
に使用し、次の組成を有する培地1500lを含有する発酵
槽を通気した。

酵母エキストラクト 7.0kg ファルマメディア 56.0− KH₂PO₄ 4.0− Na₂HPO₄．12H₂O 3.0− シュクロース 4.2− MgSO₄．7H₂O 1.4− 大豆油 42 l Pluronic 60L 600 ml pH 6.2 発酵は、26℃で５日間、1000Nl/分の通気および200rp
mの攪拌をしながら行った。

次の方法によりリパーゼを回収した。

１）培養ブロスのドラム濾過、２）澄明な濾過、３）限
外濾過による濃縮、４）50％W/Wまでエタノールを添
加、５）澄明な濾過、６）限外濾過による濃縮、７）77
％W/Wまでエタノールを添加、８）遠心、９）減圧乾
燥、10）水に再溶解、11）回分式疎水相互作用精製（リ
パーゼを疎水性マトリックスに吸着せしめ、水で洗浄そ
して50％W/Wエタノールで溶離した）、12）エタノール
を留去し次いで凍結乾燥した。得られた粉末は143,000L
U/gの活性を有していた。

例3.C.アンタルクチカリパーゼ粉末の製造カンディダ・アンタルクチカDSM3855培養物をPDA−寒
天スラント上に保存した。

PDA−寒天の組成：バクトじゃがいもデキストロース寒天（Difco） 39g/l 寒天 10 − （121℃で20分間オートクレーブした）。

Cale培地を含有する50個の振盪フラスコを寒天スラン
トから接種し、25℃で64時間培養した。

ブロス（46OU/ml）を最高4,400gで20分間遠心した。
上澄を１に濃縮し、HIP10-20カートリッジ（カットオ
フ10,000MW）を備えるアミコン（Amicon）限定濾過装置
で水１を用いて脱塩し、そして凍結乾燥した。この粉
末の活性は4000OU/gであった。

例4.C.アンタルクチカリパーゼの製造 PDA−寒天スラント（例３参照）上に保存した菌株DSM
3908およびDSM3909の培養物を、YS-4,YS-25またはCa4a
培地を含有する振盪フラスコに移し、25℃で２または３
日間培養した。ブロスのリパーゼ活性（OU）を測定し
た。

結果菌株培地発酵時間 OU/ml 1. DSM 3908 YS-4 ３日 8.5 2. DSM 3908 YS-25 ２− 4.0 3. DSM 3908 Ca4a ３− 26.0 4. DSM 3909 YS-4 ３− 10.5 5. DSM 3909 YS-25 ２− 5.0 6. DSM 3909 Ca4a ２− 23.3 例5.C.ツクバエンシスリパーゼの製造カンディダ・ツクバエンシス(Candida tsukubaensi
s)CBS6389培養物をPDA−寒天スラント（PDA−寒天の組
成は例３に示した）上に保存した。

２個のYeDP振盪フラスコを接種し、25℃で24時間培養
した。

この培養物を用いてCG-Ig培地を含有する52個の振盪
フラスコを接種した。

該振盪フラスコを25℃で４日間培養した。ブロスを最
高4,400gで20分間遠心した。上澄（3l）を450mlに濃縮
しそしてHIP10-20カートリッジを備えたアミコン限外濾
過装置上で水2lにより脱塩し、凍結乾燥して223OU/g,13
5LU/gの粉末24gを得た。

例6.C.オーリクラリアエリパーゼの製造カンディダ・オーリクラリアエ(Candida auriculari
ae)CBS6379の培養物をPDA−寒天スラント上に保存し
た。

70個のCG4h振盪フラスコを前記寒天スラントで接種し
そして25℃で４日間培養した。

ブロスを最高4,400gで20分間遠心し、次いで最高12,2
00gで10分間遠心した。HIP10-20カートリッジを備えた
アミコン限外濾過装置上で上澄5.5lを950mlまで濃縮
し、そして凍結乾燥して93OU/gおよび3.4LU/gの粉末29.
1gを得た。

例7.C.ホリオルムリパーゼの製造 CBS5234の培養物をPDA−寒天スラント上に保存した。
それぞれCG4h培地150mlを含有する60個の振盪フラスコ
を前記寒天スラントで接種した後、25℃で４日間培養し
た。

ブロスを最高4,000rpmで25分間遠心し、次いで最高1
0,000rpmで10分間遠心した。アミコン限外濾過装置（PI
H10-20）上で上澄6lを550mlに濃縮し、脱イオン水１
で脱塩した後、凍結乾燥して活性275OU/gまたは313LU/g
の粉末38.4gを得た。

例8.C.ヒュミュラリパーゼの調製 CBS571を、PDA−寒天スラント上で４日間25℃で培養
した。

YePD培地（例５に組成を示す）の種培養物を、寒天ス
ラントから接種し、ついで17時間25℃で培養した。YS-4
培地（例４参照）を含有する39個の振とうフラスコを、
種培養物から接種し、ついで４日間25℃で培養した。

ブロスを、4,000rpmで15分間遠心し、ついで15分間1
2,000rpmで遠心した。上澄み（1,300ml）を、アミコンP
IH10-20を用い濃縮し、ついで4lの脱イオン水で脱塩
し、最終濃度を200mlとした。これを凍結乾燥し、活性
度2,000OU/gを用する粉末10.4gを得た。

例9.5種類のカンディダ種由来のリパーゼの製造以下に示す各々の菌株を、PDA−寒天スラント（例３
参照）上に接種し、ついで３日間25℃で培養した。

ついで細胞を9mlの滅菌脱イオン水に懸濁させ、ついで
種培養物としてYePD培地（例５参照）中に接種し、17〜
23時間培養した。２〜7mlの培養ブロスと、Ca19g培地、
YS-4培地またはYS-25培地（例４参照）とともに振とう
フラスコ内で再接種し、ついで振とうしながら３日間25
℃で培養した。ついでブロスのpH及びリパーゼ活性（O
U）を測定した。

対照として、C.カルバタ（curvata）CBS570を、同様の
方法で、YS-25培地中４日間培養した。活性は34.8OU/g
であった。

例10C.アンタルクチカ由来の成分リパーゼＡ及びＢの分
離及び特性例２において得られたアンタルクチカ由来の部分精製
リパーゼを、更に次のように精製した。1gの酵素粉末
を、pH6のトリス−アセテート50mMに懸濁された。1gのD
EAE−セファデックスA50を膨潤させついでpH6のトリス
−アセテート50mM中で洗浄し、ついで酵素懸濁液に添加
した。混合物を室温で１時間攪拌しついで半融ガラス漏
斗上でろ過した。ついでろ液を超遠心法により濃縮しつ
いでpH4.5のシトレート緩衝液20mMに対し透析し、つい
で同緩衝液で平衡化したCM−セファロースカラムに適用
した。溶離液としてＢ−酵素が溶出しついでＡ−酵素が
塩グラディエントにより溶出した。

８〜25％ SDS PAGEグラディエントゲルを用い、ファ
ルマシアフェースト（商標）システムを用い、Ａ及びＢ
酵素の分子量を測定した。Ａ及びＢ酵素に対する分子量
は、それぞれ43kDおよび33kDであった。Ａ及びＢ酵素に
対する等電点を、3.5〜9.5のpH範囲でLKBアンフォリン
ページプレートを用いて測定した。Ａ酵素に対するpIは
8.0±0.2であり、Ｂ酵素に対しては、6.0±0.2であっ
た。

更にＢ酵素を精製するため、CM−セファロースからの
溶離液として得られたプールを、pH10の20mMボレートに
対し透析し、ついで同じ緩衝液で平衡化したモノ−Ｑ
（商標）（ファルマシア）カラムに適用した。活性なＢ
酵素が、ファルマシアFPLC装置を用い塩グラディエント
により溶出せしめた。

酵素のpH安定性Ａ及びＢ酵素を、pH6または７に対し20mMのホスフェ
ート緩衝液中で希釈し、ついでpH8,9または10に対し20m
Mのボレート緩衝液中で希釈した。最終酵素濃度を、OD
₂₈₀＝１になるまで調節し、ついで室温で1.5時間インキ
ュベートし、更に４℃で一夜インキュベートした。下記
の表にLU法により測定した残留活性（％）を示す。pH7
の酵素活性を、100％として調節した。Ａ酵素は、４℃
で一夜インキュベーションしたのちpH10で全体として不
活性であるように思われ、一方Ｂ酵素は、pH10でその活
性の78％超を有していたがpH6では安定性が少なかっ
た。

活性に対する温度の効果リパーゼ活性をLU法により測定した。ただし温度は変
化せしめた。結果を次に示すが、30℃での活性を100％
とした。

活性に対するpHの効果リパーゼ活性をLU法により測定したが、pHは変化させ
た。酵素が存在しない場合の各々のpHにおける得られた
結果を、自発的加水分解に対し対照として用いた。結果
を第４図に示す。ブロスＡ及びＢ酵素に対する最適pH
は、pH7付近であった。

例11 リパーゼの熱安定性例９（Ca 19gまたはYS-4培地を用いる）におけるごと
く調製した培養ブロスのサンプルを、60℃、70℃及び84
℃で30分間熱処理した。熱処理サンプル及び熱処理しな
い対照サンプルのリパーゼ活性を、pH5.5で寒天中にオ
リーブ油、ポリビニルアルコール（PVA）及びブリリア
ントグリーンを含有する拡散プレートにサンプサを適用
し、ついで30℃で24時間拡散後色変化の帯域（直径（m
m））を測定することによって検出した。

以下の内容が明らかにされる。すなわちC.アンタルク
チカ及びC.フミコーラ由来のリパーゼは84℃まで安定で
ありC.ホリオルムは、70℃まで安定であり、更にC.オー
リクラリアエは60℃まで安定であり、一方従来技術のC.
カルバタは60℃で不安定であった。

例12 可溶性リパーゼの熱安定性以下のリパーゼの熱安定性を比較した。

本発明： C.アンタルクチカ：例１で得られた粉末の0.8％溶液精製リパーゼA:例10で得られたサンプルを、pH7の15mM
のトリス−マレエート緩衝液に対し一夜透析した。

参考： C.シリンダラシア：名糖産業から得られるリパーゼOFの
１％溶液 C.カルバタ：参考例１からのUF−コンセントレート次の緩衝液を実施例で用いた：トリス−マレエート緩衝液0.1M、pH6.0: 0.1Mのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン50ml
及び0.1Mのマレイン酸26ml シトレート−ホスフェート緩衝液0.1M、pH6.5: 0.05Mのクエン酸142ml及び二塩基性リン酸ナトリウム
（Na₂HPO₄）355ml ホスフェート緩衝液0.1M、pH7.5: 0.1MのNaH₂PO₄ 16ml及び0.1MのNa₂HPO₄ 8₄ml 試験管内で1mlのリパーゼ溶液と4mlの緩衝液を混合し
て、熱安定性を測定した。試験管を60℃、65℃または70
℃の水浴中で60分間インキュベートした。熱安定性は、
インキュベーションする前、酵素緩衝液混合物の活性
（LU/ml）のパーセントで残留活性（LU/ml）として表わ
す。

結果（残留活性）は次のとおりであった：トリスマレエート緩衝液を用いてC.カルバタに対しpH
6でのインキュベーションが含まれていた。何故ならそ
れらはリパーゼに関する記載（Fette Seifen Anstrechm
ittel 1985,87:181-185）におけるD.モンテット等によ
って用いられた条件であり、従ってこのリパーゼに対し
適当であると考えられる。以下の内容を結論づけること
が出来る。すなわちC.アンタルクチカリパーゼ及びリパ
ーゼＡは従来技術のC.シリンダラシア及びC.カルバタリ
パーゼよりはるかに熱安定性である。

例13 熱処理後のリパーゼの熱安定性この実験において、リパーゼサンプルをまず、60℃
で、pH6.5で１時間次のように処理した：本発明： C.ツクバエンシス：例５で得られる粉末を、pH6.5の
緩衝液（上記参照）に溶解し（７％）ついで60℃で１時
間予備処理した。

精製リパーゼA:カラム（例10）からの溶出液を、15ml
のトリス−マレエート緩衝液（pH7）に対し一夜透析
し、pH6.5の緩衝液で５倍に希釈しついで60℃で１時間
予備処理した。

対照： C.カルバタ：参考例１からのUF−コンセントレート
を、pH6.5に調節しついで60℃で、pH6.5で１時間インキ
ュベートした。この予備処理サンプルを、熱安定性実験
に対し緩衝液（pH6,6.5,7.5、上記参照）中５倍に希釈
した。

ついで上記予備処理サンプルを、65℃でかつpH6.0,6.
5または7.5で１時間インキュベートした。結果は次のと
おりであった：以下の内容が明らかである。すなわち本発明の２種の
リパーゼは60℃での予備処理中にある程度の活性は失う
が、予備処理したサンプルは65℃で非常に安定である。
C.カルバタからの従来技術のリパーゼは65℃で急速に失
活する。

例14 C.アンタルクチカリパーゼの熱安定性例３におけるごとく得られたリパーゼを、水に溶解し
（１％）、ついで更に50mMのトリスマレエート緩衝液
（pH7）中で５倍に希釈した。この溶液を、０分、60分
及び180分間60℃で予備処理し、ついで種々の温度で30
分間熱処理した。各々の工程後の残留活性を、OU法によ
り測定した。

結果は以下の内容を示す。いく分かのリパーゼ活性
が、60℃で予備処理中に失なわれるが、残存リパーゼ活
性は、80℃においてさえ極めて熱安定性である。

あるデーターが相当に100％を超えている理由は明ら
かでない。

例15 C.アンタルクチカリパーゼに対する活性対温度 C.アンタルクチカリパーゼ（例３で得られる粉末0.1
％）の酵素活性を30℃、40℃、50℃、60℃、65℃及び70
℃で測定した。活性を、本明細書中に記載したOU法によ
り測定したが、インキュベーションは種々の温度で行な
った。結果は次のとおりであった。

インキュベーション温度 30 40 50 60 65 70 活性（OU/ml） 2.1 2.3 3.4 5.2 6.3 5.8 例16 リパーゼのpH活性 C.アンタルクチカ（例３からの粉末0.2％溶液）、C.
ツクバエンシス（例５からの粉末の3.0％溶液）、C.オ
ーリクラリアエ（例６からの粉末の3.0％溶液）、C.フ
ミコーラ（例７）及びC.ホリオルム（例８）の活性に対
するpH依存性を測定した。

pHを、0.5の単位の段階で4.0から10.5まで変化させ
た。用いた緩衝液は、pH4.0〜5.5の酢酸ナトリウム／酢
酸（C.アンタルクチカに対し200mM及び他のリパーゼに
対し100mM）、pH5.5〜8.5の50mMのトリス−マレエート/
NaOH、pH9.0〜10.5のグリシン/NaOH（C.アンタルクチカ
に対し200mM及び他のリパーゼに対し100mM）。

測定はOU法におけると同様に行なったが、1mlの酵素
溶液及び5mlのトリス−マレエート緩衝液のかわりに緩
衝液に溶解した5mlの酵素を用いた。

pH活性曲線を、C.アンタルクチカ、C.ツクバエンシス
及びC.オーリクラリアエに対しそれぞれ第１図、第２図
及び第３図に示す。C.フミコーラ及びC.ホリオルムリパ
ーゼに対する曲線は類示のものであった。従って全ての
リパーゼはpH7〜８付近で最高を示す。

例17 可溶性リパーゼの非特異性例９におけると同様に調製した培養ブロスを、すでに
説明した非特異性法により試験した。結果は、全ジクリ
セリドのパーセントで1,3−グリセリドとして示す：カンディダアンタルクチカ由来のリパーゼ（例３で得
られた粉末の0.2％溶液）、C.ツクバエンシス（例５で
得られた粉末の3.0％溶液）、C.オーリクラリアエ（例
６で得られた粉末の3.0％溶液）を同様の方法で測定し
た。

C.アンタルクチカ： 41％ C.ツクバエンシス： 48％ C.オーリクラリアエ:50％全てのリパーゼは非特異性であると思われる。

例18 成分C.アンタルクチカリパーゼの基質特異性精製リパーゼＡ及びＢ（例10による）の種々の基質に
対する活性を比較した。トリブチリン及びオリーブ油に
対する活性を、LU法及びOU法に従ってそれぞれ測定し
た。エチルオレエート、メチルラウレート及びラセミジ
オレインに対する活性を、次の変法によるLU法により測
定した：トリブチリンのかわりに１％基質（Nu Check P
repから入手出来る99％純粋なメチルラウレート、Nu Ch
eck Prepから入手出来る99％純粋なメチルオレエート、
またはシグマから入手出来る99％純粋なラセミジオレイ
ン）、及びpH7.0のかわりにpH8.5で水酸化ナトリウムの
滴定による。

以下に結果を、トリブチリンに対する相対活性（％）
として表わす：基質リパーゼＡリパーゼＢトリブチリン（LU） 100％ 100％オリーブ油（OU） 110％ 65％ラセミジオレイン 27％ 313％メチルラウレート 22％ 140％メチルオレエート８％ 60％以下の内容が明らかである。すなわちリパーゼＢは、
ジグリセリド及びメチルエステルに対し高活性を有し、
一方リパーゼＡはトリグリセリドに対し活性に関しそれ
らよりも比較的低活性である。

例19 陰イオン交換樹脂によるC.アンタルクチカリパーゼの固
定化例１で記載したごとく得られたカンディダアンタルク
チカリパーゼ0.6gを、水で希釈し7.5gとし、ついでpH7
に調節した弱塩基性陰イオン交換樹脂（バイエル社製
品）Lewatit E1999/85の1.5g乾燥物と混合した。

混合物を、室温で24時間回転せしめた。水で洗浄後、
調製物を真空下で室温で乾燥し、1.83g（乾物含量98
％）を得た。ろ液中に残存する活性は、39％であり、こ
れは乾物固定化リパーゼ1gあたり約19000LUの量に相当
する。

例20 陰イオン交換樹脂による固定化例２におけるごとくして得られたC.アンタルクチカリ
パーゼ12.5mlリパーゼ溶液（12,500LU/ml）及びpH7に調
節した4.25g乾物Duolite ES-568弱塩基性陰イオン交
換樹脂（ロームアンドハアス社製品）を、混合しついで
室温で24時間回転せしめた。水で洗浄後、調製品を室温
下で乾燥し、4.6gの乾物固定化リパーゼを得た。ろ液中
に残存する活性は、33％であり、これは乾物固定化リパ
ーゼ1gあたり約22700LUの量に相当する。活性は、9.2BI
U/gでありこの活性は先に示した方法により測定した。

例21 陰イオン交換樹脂による固定化例２におけるごとくして得られたC.アンタルクチカリ
パーゼ100ml（15000LU/mlを有する）、pH7に調節した洗
浄Lewatit E1999/85弱塩基性陰イオン交換樹脂46g
（乾燥重量）と混合した。混合物を室温で24時間撹拌し
た。水で洗浄後、調製物を室温で真空下で乾燥し51.5g
（乾物含量98％）を得た。ろ液中に残存する活性は１％
であり、これは29,200LU/gの量に相当する。活性は37.6
BIU/gであった。

例22 吸着剤樹脂による固定化例２に記載したごとくして得られた12500LU/mlのC.ア
ンタルクチカリパーゼ60mlを、pH7に調節した洗浄Lewat
it E2001/85非イオン性樹脂（バイエル社製品）の25g
（乾燥重量）と混合した。混合物を、室温で24時間撹拌
した。水で洗浄後、調製物を室温で真空下で乾燥し、25
g（乾燥乾物含量98％）を得た。残存ろ液中の活性は、
1.6％でありこれは30,200LU/gの量に相当した。

例23 吸着剤樹脂による固定化 15,000LU/mlのC.アンタルクチカリパーゼ及び50gの樹
脂を用い先の実施例を繰り返えし、58g（乾物含量98
％）を得、残存ろ液中の活性は２％であり、これは25,8
00LU/gの量に相当する。活性は52.2BIU/gであった。

例24 精製リパーゼＡの固定化担体の調製:10gのLewatit 2001/85を、Ｇ−２ガラス
フィルター上で洗浄し、0.05Nの水酸化ナトリウムを用
いpH−シュタットによりpH7に調節し（２時間の操
作）、再び洗浄し、ガラスフィルター上で乾燥した。乾
物を、61.55％として測定し更に2.5gの乾燥重量を固定
化に対し用いた。

酵素の調製：リパーゼＡ（例10）を、15mMのトリス−モ
リエート緩衝液（pH8）に対し一夜透析し、8000LU/mlで
15mlを得た。

固定化：担体及び酵素を一夜混合し、ガラスフィルター
上で洗浄し、真空下で２時間乾燥した。乾物は96％であ
った。溶液中に残存する活性は２％であり、これは28,2
00LU/gに相当する。

例25 精製リパーゼＡの固定化担体を先の例におけるごとく調製した。乾物は、76.3
2％として測定され、更に4.4gの乾燥重量を固定化に対
し用いた。

酵素は先の例におけるごとく調製し、5400LU/mlで24.
7ml得た。

固定化：担体及び酵素を一夜混合し、ガラスフィルター
上で混合し、ついで真空下で５時間乾燥した。乾物は10
0％であった。活性の28％が溶液中に残存し、これは22,
300LU/gの量に相当した。

例26 精製リパーゼＢの固定化先の例で調製した2.6gの乾燥重量の担体を、固定化に
対し用いた。

リパーゼＢ（最10）を例24におけるごとく調製し、32
00LU/mlで24.9ml得た。

固定化：担体及び酵素を一夜混合し、ガラスフィルター
で洗浄し、真空下で５時間乾燥した。乾物は100％であ
った。活性の6.4％が溶液中に残存しこれは29,200LU/g
の量に相当した。

活性は4.4BIU/gであった。NSI₂分析を250mgの乾物リ
パーゼ及びわずか4mlの反応混合物を用いて２時間行な
った。ラウリン酸の混入は、わずか14モル％であり、更
にNSI₂は0.65であり、これはリパーゼＢが非特異性であ
ることを示す。

例27 固定化C.アンタルクチカリパーゼ及び固定化リパーゼＡ
の性質例22によって得られる固定化カンディダアンタルクチ
カ並びに例24で得られる固定化精製リパーゼＡの活性、
熱安定性及び非特異性を比較した。

活性を、BIU分析（60℃、有機溶剤無し）により及び7
0℃でのBTU分析の両方で測定した。

非特異性を、NSI、及びNSI₂分析の両方により測定し
た。

熱安定性を次の方法により測定した： 1.2gのトリオレインを、150mg（乾燥重量）の10％水
和酵素に添加した。ついでサンプルを、80℃で３日間イ
ンキュベートした。残存活性（BIU）を、348mgのパルミ
チン酸とともに12mlの石油エーテルを添加した後40℃で
測定した。熱安定性を、冷蔵庫内に３日間保存した対照
サンプルの活性（％）で表わす。

結果を次表に示す：２種の固定化製品は、全ての試験において極めて類示
の性質を有する。双方とも非特異性であり、加酸分解及
びエステル交換を触媒するのに有効であり、更に双方と
も極めて熱安定性である。

例28 固定化酵素の活性及び特異性次の固定化リパーゼを、対照として調製した：Ａ）12,000LU/g（名糖産業製品）を有する2.72gのカン
ディダシリンタラシアリパーゼを、25mlの水に溶解し
た。弱塩基性アニオン交換樹脂（バイエル社製品）をLe
watit E1999/85 8.5gの乾物を、pH6に調節し、ついで
リパーゼ溶液と混合した。室温で24時間回転後、水で洗
浄し調製品を室温で真空下で乾燥し9.27g（乾物含量97
％）を得た。漏液中に残存する活性は、0.2％であり、
これは1gの乾物固定化あたり28,000LUの量に相当する。

Ｂ）65,700LU/gの活性を有するクロモバクテリウムビス
コサムリパーゼ（東洋醸造（日本）製品）2.0gを、25ml
の水に溶解した。弱塩基性アニオン交換樹脂Dulolite
ES-568N（ロームアンドハース社（USA）製品）4.25gの
乾物をpH7に調節し、ついでリパーゼ溶液と混合した。
室温で４時間回転後、調製品を漏下し、水で洗浄後つい
で真空下で乾燥した。収率は4.52g（乾物94％）であり
漏液中の残存活性は６％であり、これは1gの乾物固定化
リパーゼあたり28,000LUの量に相当する。

非特異性指数（NSI₂）を、明細書中先に記載したごと
く、固定化C.アンタルクチカリパーゼ（例19の製品）、
２種の上記調製品及び固定化ムコールマイヘイ（Mucor
miehei）リパーゼ（Lipozyme IM20、ノボインダスト
リーA/S製品）を用いて測定した。

下記の表に脂肪酸組成を、60℃で２時間反応後モル％
で示す。

これらの結果は以下の内容を示す。すなわち２種のカン
ディダリパーゼは、位置非特異性であり、更にクロモバ
クテリウム及びムコールマイヘイは1,3−特異性であ
る。

例29 固定化リパーゼの熱安定性カンディダアンタルクチカ及びカンディダシリンダラ
シアリパーゼ（それぞれ例19及び28）の固定化製品の熱
安定性を次のように調べた： 250mgの乾物調製品を10％w/wに水和した。600mgのトリ
オレインを添加し、ついで70℃で0,2,4及び24時間イン
キュベートした。インキュベーション後、サンプルを冷
却し、174mgのパルミチン酸を含有する12mlの石油エー
テルを添加し、ついで混合物を40℃で１時間インキュベ
ートした。各々の場合に混入したパルミチ酸（w/w ％）
を、先に述べたごとくAF 206法に記載したごとく行いそ
の結果を次表に示す：結果は固定化C.アンタルクチカリパーゼの秀れた熱安
定性を示す。何故なら該リパーゼは、70℃で24時間後ほ
とんど全てのその安定性を保持しており、一方従来技術
のリパーゼはほとんどその活性を失っている。

一次の可逆反応として計算すると、C.アンタルクチカ
リパーゼは70℃で24時間後ほぼ90％の活性を保持してお
り、C.シリンダラシアリパーゼの残留活性は10％未満で
あることが推定される。

例30 固定化C.アンタルクチカリパーゼによる酸分解及びエス
テル交換例22の固定化製品を、BIU及びBTU法に従い種々の温度
で溶剤を用いず酸分解（トリオレイン＋パルミチン酸）
及びエステル交換（トリオレイン＋トリパルミチン）に
対し用いた。

活性（BIU及びBTU）をそれぞれ第５図及び第６図に示
す。これらは明らかに固定化リパーゼの極めて秀れた熱
安定性を示しており、最高の活性は試験した最高の温
度、すなわち85〜90℃で見いだされた。

例31 固定化C.アンタルクチカリパーゼによるエステル合成エステル合成を触媒するため固定化C.アンタルクチカ
（例22から調製）、固定化精製リパーゼＡ（例25から調
製）及び固定化精製リパーゼＢ（例26から調製）の能力
を、次の方法で比較した：使用前20時間10％水和した15
0mg（乾燥重量）、1.5mMのアルコール（１−プロパノー
ル、２−プロパノールまたはオレイルアルコール（工業
純度、BDH））及び1.5mMの遊離脂肪酸（ミリスチン酸
（純度99％、シグマ社）またはオレイン酸（92％、BD
H）を、8mlのバイアル中で混合しついで60℃の水浴中で
振とうした。約1gのサンプルを、20分及び90分インキュ
ベートした後取り出した。150mlの中和エタノールをサ
ンプルに添加しついで残存遊離脂肪酸を水酸化カリウム
で滴定した。得られたエステル合成物を、100％マイナ
ス滴定残存遊離脂肪酸として計算する。

結果を次表に掲げる：以下の内容が明らかである。すなわち固定化リパーゼ
Ｂは、全ての実験においてリパーゼＡよりもエステル合
成に対しより有効であり、双方とも長鎖及び短鎖アルコ
ールを有し、更に双方とも第１及び第２アルコールを有
する。

固定化リパーゼＡは、長鎖アルコールの場合にエステ
ル収率が低いが、長鎖アルコールの場合にはより有効で
ある。

固定化C.アンタルクチカリパーゼ（リパーゼＡ及びリ
パーゼＢの双方を含む）は、短鎖アルコールに対しリパ
ーゼＢと同様の収率を与え、更に長鎖アルコールに対し
リパーゼＡまたはＢよりＤよりよい収率を与える。

例32 固定化リパーゼを用いた加酸分解における脂肪酸の影響 250mg（乾燥分）の固定化C.アンタルクチカリパーゼ
（例27から調製）または150mg（乾燥分）の固定化リパ
ーゼＡ（例25から調製）を、20時間で10％に水和しつい
で３ミリモルのトリカプリン（シグマ級II）及び３ミリ
モルの以下の脂肪酸の一種と混合した:8mlのバイアル中
のレウリン酸（メルクアート805333）、ミリスチン酸
（シグマ級99％）、パルミチン酸（BDH特に純粋）、ス
テアリン酸（メルクアート800673）、オレイン酸（Nu C
heck製品99％）及びリノレイン酸（Nu Check製品99
％）。混合物を70℃で振とう水浴中でインキュベート
し、サンプルを活性を測定するまで適当な時間後取り出
した。トリグリセリドを精製し、メチル化し、GLCで分
析しついで活性を、先に記載したBIU法で前記のごとく
計算した。

結果を次に示す：例33 固定化リパーゼを用いた加酸分解における脂肪酸の影響他の実験において、150mg（乾燥分）の固定化C.アン
タルクチカリパーゼ（例22からの調製）または固定化精
製リパーゼＡ（例25からの調製）を、20時間10％に水和
し、ついで次の反応物を各々の３ミリモルと混合した:8
mlバイエル中のトリラウリン（シグマ社、等級98％）、
パルミチン酸（BDH、特に純粋）、オレイン酸（Nu Chec
k製品、99％純度）、及びリノレイン酸（Nu Check製
品、99％純度）。反応混合物を70℃の振とう浴に入れ
る。固定化C.アンタルクチカリパーゼに対し1.5時間及
び3.5時間後サンプルを取り出し更に固定化リパーゼＡ
に対し1.5時間及び5.5時間後取り出し、トリグリセリド
を精製しエチル化しついで先に記載したごとくGLCによ
り分析した。結果を以下に示す：以下の内容が明らかである。すなわちリパーゼＡは、
飽和酸に対するよりもモノ−及びジ−不飽和酸に対しは
るかに低い活性を有する。C.アンタルクチカリパーゼ
（リパーゼＡ及びリパーゼＢの双方を含有）はモノ−及
びジ−不飽和酸に対しほんのわずかに低い活性を有す
る。

例34 ポリ不飽和脂肪酸を用いた固定化リパーゼの加酸分解ポリ不飽和脂肪酸をトリグリセリドに導入するため固
定化C.アンタルクチカ（例22からの調製）、固定化精製
リパーゼＡ（例25からの調製）及びムコールマイヘイ由
来の固定化特異的リパーゼ（Lipozyme IM20、ノボイ
ンダストリーA/S製品）の能力を、8mlのバイアル中、25
0mg（乾燥分）の固定化リパーゼ（10％水和）、1276mg
のトリラウリン（シグマ社、等級98％）及び2500mgの脂
肪酸混合物を混合することによって比較した。脂肪酸混
合物を、パルミチン酸と加水分解メンヘーデン油からの
多不飽和脂肪酸リッチフラクション（真空蒸溜により得
る）と混合することによって得た。脂肪酸混合物は、2
4.9モル％のパルミチン酸（C16:0）、20.4モル％のエイ
コサペンタエン酸（C20:5）、7.2モル％のドコサペンタ
エン酸（C22:5）及び26.2モル％のドコサヘキサノン酸
（C22:6）。反応は70℃の振とう水浴中で行なった。サ
ンプルを３時間及び５時間後取り出し、ついでトリグリ
セリドを精製し、メチル化し、ついで前述のようにGLC
により分析した。

トリグリセリドの脂肪酸組成（モル％）及びこれらの
割合を以下に示す：以下の内容が明らかである。すなわちC.アンタルクチ
カリパーゼは、飽和酸に対するのと同様にほぼ同程度に
容易に多不飽和酸の導入において有効である。本発明の
２種のリパーゼは、C22:6酸を導入するのに有効であ
る。

例35 固定化酵素を用いたエステル合成第１及び第２アルコールからエステルを合成する際、
カンディダアントラクチカ由来のリパーゼ並びにムコー
ルマイヘイ由来の1,3−位置特異性リパーゼの活性にお
ける際の説明。

11.42g（0.05モル）のミリスチン酸（メルク社、純度
98％）及び3.01g（0.05モル）のｎ−プロパノールもし
くはイソプロパノール（メルク社、純度99％）を、1gの
固定化リパーゼとともに60℃で一緒に振とうした。カン
ディダアンタルクチカ由来の固定化リパーゼ（例22から
の調製）またはムコールマイヘイ由来の商業的に入手可
能な1,3−位置特異性リパーゼ（Lipozyme IM20）のい
ずれかを10％の水分含量に調節した。

エステル化反応を、サンプルを取り出しついで未反応
の脂肪酸を滴定することによって行った（例31に記載の
ごとく）。

ｎ−プロパノール及びイソプロパノールを用いた結果
をそれぞれ第７図及び第８図に示す。

結果は以下の内容を示す。すなわちC.アンタルクチカ
リパーゼは、第１及び第２アルコールの双方を用いたエ
ステル合成に対し有効であり、一方位置特異性ムコール
リパーゼは、第１アルコールに対してのみ有効である。

長鎖エステルを合成するためのカンディダアンタルク
チカリパーゼの能力をまた調べた。

11.42g（0.05モル）のミリスチン酸（メルク社純度98
％）及び10.72g（0.05モル）のミリスチルアルコール
（メルク社純度98％）を、60℃で真空下固定化リパーゼ
（例22から調製）とともに反応せしめた。測定されたエ
ステル（％）を以下に示す：結果は以下の内容を示す。すなわちC.アンタルクチカ
リパーゼは、短鎖及び長鎖アルコールを用いた双方のエ
ステル合成に対し有効である。

例36 連続酸分解 4.5gの固定化C.アンタルクチカリパーゼ（例21）を、
内径1.5cmのジャケットカラムに充填した。

カラムは熱循環水のための水ジャケットを備え、60℃
または80℃に保持された。水飽和樹脂（Duolite ES56
1）を含有するプレカラムを、酵素カラムの前に置き、
ついで同じ温度に保持した。３未満のパーオキシド値を
有する71％の高精製大豆油並びに29％の分析用等級ラウ
リン酸からなる基質を、カラムにポンプ注入した。酵素
カラムの出口で、サンプルを分析用に取り出し、ついで
ラウリン酸の導入をGLCにより測定した。14％w/wのラウ
リン酸の導入を行ないついで流速を調節し、その値での
転換を保持した。流速の測定は実際の転換が14±１％に
なった時行なった。プレカラムが乾燥する時は、いつも
新しいものに取り換えた。

アルミナカラムプロマトグラフィにより遊離脂肪酸及
びモノ−及びジグリセリドを除去し、しかる後NaOH₃に
よりトリグリセリドをメチル化しついで最終的にGLCに
よりメチルエステルを分析することによって該サンプル
を分析した。

結果は第９図に示すが、この９図中、流速（トリグリ
セリド（ｇ）／時間／固定化酵素（ｇ））の自然対数時
間（時）が示される。以下の内容が明らかである。すな
わち、60℃で、リパーゼの活性は2400時間中ほぼ一定で
あり、すなわち調製品は極めて安定である。

例37 脂肪加水分解オリーブ油を8lのサーモスタット制御したタンク中撹
拌しながらC.アンタルクチカリパーゼ（例２におけるご
とく調製）を用いて60℃で加水分解した。油対水の割合
は60:40または70:30（w/w）であり、リパーゼの用量は7
5LU/油（ｇ）であった。結果（加水分解％）は次のとお
りであった：以下の内容が明らかである。すなわち本質的に完全な
加水分解が得られ、リパーゼは、60℃で４日後において
さえ活性であった。

例38 熱処理後のリパーゼの熱安定性 C.アンタルクチカ由来のリパーゼ（例１からの粉末の
0.1％溶液）、C.ツクバエンシス由来のリパーゼ（例５
で得たもの３％）及びC.オーリクラリアエ由来のリパー
ゼ（例６から得たもの３％）を試験した。

各々の酵素溶液をまず、60℃で１時間予備試験し、つ
いで０℃、40℃、50℃、60℃、70℃または80℃で30分間
インキュベートした。活性をOU法で測定した。

以下の内容が明らかにされる。すなわち熱処理C.アン
タルクチカリパーゼは、80℃でさえ極めて熱安定性であ
る。熱処理C.ツクバエンシスリパーゼは、70℃までは安
定であり、更に熱処理C.オーリクラリアエリパーゼは60
℃〜70℃まで安定である。

例39 連続エステル交換例23の固定化リパーゼを、ヤシ油中間フラクションと
大豆油の同量の基質混合物とともに60℃で用いた。他の
条件は例36と同様であった。

出口のサンプルをHPLCにより分析し、ついで流速を調
節し、出口のトリオレイン含量をほぼ６％に保持した。
これは約63％の平衡変換を意味し、出口含量は11.0％で
あった。尚測定は出口含量が６％±１％のとき行なっ
た。

結果を、第９図（例36）と同様の方法で第10図に示
す。流速は約±20％の変化を示すが、60℃での約1,000
時間の操作において失活は認められない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き微生物の受託番号ＤＳＭ３８５５

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】位置非特異性リパーゼであって、（１）pH6.5,65℃で60分間インキュベーション後、少な
くとも20％の残留活性を保持し、（２）約pH7〜８に最適活性を有し、（３）C.アンタルクチカおよびC.ツクバエンシスから成
る群から選ばれるカンジダ菌株により生産される細胞外
リパーゼと免疫化学的同一性を示し、（４）約43kD又は約33kDの分子量を有することを特徴と
する、前記リパーゼ。
【請求項２】カンジダ菌株がC.アンタルクチカDSM 385
5,DSM 3908,DSM 3909,CBS 5955,CBS 6678,CBS 6821、お
よびC.ツクバエンシスCBS 6389から成る群から選ばれる
請求の範囲第１項記載のリパーゼ。
【請求項３】リパーゼが約65℃の最適温度を有しそして
菌株がC.アンタルクチカDSM 3855である、請求の範囲第
２項記載のリパーゼ。
【請求項４】約43kDの分子量および約8.0の等電点を有
する、請求の範囲第３項記載のリパーゼ。
【請求項５】約33kDの分子量および約6.0の等電点を有
する、請求の範囲第３項記載のリパーゼ。
【請求項６】固定化された形態にある、請求の範囲第１
〜５項のいずれかに記載のリパーゼ。
【請求項７】固定化リパーゼが、連続エステル交換にお
いて60℃で1000時間を超えるリパーゼ活性の半減期を有
する、請求の範囲第６項記載のリパーゼ。
【請求項８】リパーゼが弱塩基性アニオン交換樹脂又は
吸着剤樹脂により固定化されている、請求の範囲第６又
は７項記載のリパーゼ。
【請求項９】pH6.5,65℃で60分間インキュベーション
後、少なくとも20％の残留活性を保持し、約pH7〜８に
最適活性を有し、C.アンタルクチカおよびC.ツクバエン
シスから成る群から選ばれるカンジダ菌株により生産さ
れる細胞外リパーゼと免疫化学的同一性を示し、約43kD
又は約33kDの分子量を有する位置非特異性リパーゼの製
造方法であって、（１）C.アンタルクチカおよびC.ツク
バエンシスから成る群から選ばれるリパーゼ生産カンジ
ダ菌株を好気的に培養し、次いで（２）リパーゼを回収
することを含んでなる、前記製造方法。
【請求項１０】更に回収されたリパーゼを約60℃で１〜
３時間加熱することを含んでなる請求の範囲第９項記載
の方法。
【請求項１１】更に回収されたリパーゼを固定化するこ
とを含む、請求の範囲第９項記載の方法。