JP2520665B2

JP2520665B2 - 蛍光顕微分光装置

Info

Publication number: JP2520665B2
Application number: JP62260819A
Authority: JP
Inventors: 幹郎塚越; 敬宏粕谷
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 1987-10-16
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1996-07-31
Anticipated expiration: 2011-07-31
Also published as: JPH01102342A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、極微小、極微量物質を光学的・分光学的に
検出するレーザー顕微分光装置に係わり、特に、細胞等
の各種試料の微小部分に偏在する螢光物質を高速・高感
度で特定し、検出するのに好適な多波長分析型螢光顕微
分光装置に関する。

（従来の技術）光感受性螢光体色素で染色された物質は、外部から照
射された光を吸収してより波長の長い螢光を発生する。
このような性質に基づいて、従来、光源にレーザー光を
用いて螢光体色素で染色した試料に点照射し、放出され
た螢光を光検出器で検出して、試料内の微小部分に偏在
する螢光の強度分布から試料内の物質の大きさ、形状、
位置、分布等を観測する走査型レーザー螢光顕微鏡〔文
献Anal.Chem.Acta 163 231（1984）,G.J.Brakenhaffほ
か〕や試料から放出される螢光を分光器と光電子増倍管
を組み合わせ、もしくはポリクロメーターとSTI検出器
を組み合わせ、そのスペクトルや強度分布を検出し、試
料内物質を定量測定する型の定量用螢光顕微鏡などの各
種螢光顕微分光装置が開発されている。

以下、これら従来の螢光顕微鏡分光法を簡単に説明す
る。

第５図は、走査型レーザー螢光顕微鏡の構成を示す図
である。レーザー光源51からレーザー光を対物レンズ52
で微小スポットにしぼり、螢光色素で染色した試料53に
点照射する。試料から発生した螢光を集光レンズ54で集
光し、光電子増倍管等の光検出器55に導き、検出された
光電信号を試料のXY走査と同期させたディスプレイ56に
画面表示させる。この装置は、試料面を中心とする対物
レンズ52と集光レンズ54とが等距離に配置された共焦点
型を構成しており、試料が両レンズの焦点位置に配置さ
れることによって発生した螢光の強度を鮮明に検出する
ことができる。

また、第４図は定量用螢光顕微鏡の構成図である。ア
ルゴンレーザーを光源41に用いて、顕微鏡光学系に対し
て水平方向からビームスプリッター42を介して導入し、
ビームの進行方向を垂直方向に変換して対物レンズ43で
螢光染色した試料44面上に点照射する。試料からの螢光
や反射光を顕微鏡光学系に導入し、ビーム経路に設けた
反射鏡45を回転させて、前段に設けた各レンズ46で集光
させた後、分光器47あるいはポリクロメーター48に導入
する。螢光を分光器に導入した場合には、分光器内に設
けたグレーティングを回転させて螢光をスペクトルに分
け、その各々のスペクトル強度を後方に配置した光電子
増倍管49で検出する。他方、ポリクロメーターに導入し
た場合には、内蔵するグレーティングで螢光をスペクト
ル全体に分け、後方のSIT検出器50内に設けられた多数
個の光感受素子からなるダイオード・アレーあるいはTV
カメラヘッドでそのスペクトル全体を同時に検出するも
のである。

（発明が解決しようとする問題点）生細胞から生体全体の病的状態を検査したり、あるい
は細胞手術を高効率化するためには、細胞内の組織、物
質、イオン等の形状、分布、量等を明確にしなければな
らない。例えば、生細胞内のカルシウムはその濃度に応
じて外部刺激を仲介する重要な役割を担っており、この
ような生細胞内で高速に変動する微量物質からの微弱な
螢光を確実に検出するため、上述した従来の装置は、試
料から放出される螢光の強度、単一スペクトルの強度も
しくはスペクトル全体を限定して測定するものであり、
試料内に存在する物質からの部分的な情報や大まかな情
報として測定するものであって、しかも生細胞内の物質
の時間的変動に即応できないという問題点があった。従
って、従来の装置では、細胞内に分布する物質の精密な
量、すなわち絶対濃度の測定には不向きであった。ま
た、多くの場合、顕微鏡下の物質の形状は一様でないた
め、複雑な表面屈折によって、レーザー・スポット光が
変形する。こうした励起光密度の変化は螢光物質量の測
定の際に誤差を生じるという問題があった。

本発明は、レーザー励起による螢光の強度のみならず
そのスペクトル情報も取り込むことにより、螢光物質の
濃度、つまり単位体積内の螢光物質の量を測定すること
を目的とする。

（問題点を解決するための手段）上記問題点を解決するため、本発明は収束されたレー
ザー光を試料に２次元的走査し、この走査により得られ
る相異なる波長の螢光強度を測定するようにした。

具体的には、試料からの蛍光を観測するために集光す
る対物レンズ、前記対物レンズの光軸上に設置され、光
透過部分を有する試料台、レーザー光発生手段、このレ
ーザー光発生手段から発生されたレーザー光を、前記光
軸と平行に走査して、試料を前記試料台の一方側から照
明して、試料から蛍光を発生させる光走査手段、前記レ
ーザー光を収束する集光レンズ、前記試料台の他方側の
前記光軸上に設置され、前記対物レンズを通過した蛍光
を分割する部分反射鏡、前記試料台の前記他方側へ放出
され且つ前記部分反射鏡を介して得られる蛍光の内、或
る特定の波長の蛍光強度を検出する第１の光強度検出
器、前記試料台の前記他方側へ放出され且つ前記部分反
射鏡を介して得られる蛍光の内、前記或る特定の波長と
は異なる波長の蛍光強度を検出する第２の光強度検出
器、及び第１の光強度検出器及び第２の光強度検出器か
ら得られる相異なる波長の蛍光強度に演算を施して、或
る特定の物質のみに関する試料の２次元分布情報を取得
する演算回路を備える螢光顕微分光装置により実現でき
る。

（作用）相異なる波長の内一方を観測しようとする物質の存在
に依存する波長として、他方を観測する物質の存在に依
存しない波長とし、これら波長の螢光強度に基づいて演
算処理することにより、測定状態の変動に影響されるこ
となく観測しようとする物質の濃度の絶対測定を行うこ
とができる。このようにして得られた測定データは励起
レーザー光の２次元走査位置と関連して表示することが
でき、測定物質の分布情報を詳細に得ることができる。

（発明の効果）本発明によると、測定状態によらず、微小・微量物質
の分布を高精度・高感度で測定することができる。比較
的弱い励起光を用いても測定を行うことができるので、
強い光の照射を受けると状態が変化するような物質の測
定を行うことができる。そのような物質には生細胞内物
質（カルシウムイオン、水素イオン、タンパク等）が含
まれる。また、低温における物質測定、特に、光吸収の
熱効果で状態変化する場合には効果がある。これには超
電導物質の光学的測定が含まれる。

（実施例）以下、本発明の実施例について第１図のシステム構成
図を用いて説明する。

本装置は、（１）レーザー・マイクロスポットを試料
に照射する光学系、（２）試料から放射される螢光を電
気信号に変換する検出系、（３）光学系を制御し、検出
信号を処理しるコンピュータとエレクトロニクスからな
る制御・処理系の３つの部分から構成されている。

（１）の光学系において、レーザー光源１から発振さ
れたレーザー光２を変調素子３に導入する。（２）の検
出系では、試料からの螢光強度を測定するため、検出し
た信号のうらから変調成分を検出する位相敏感検出法を
用いる。このため変調素子３内の光音響偏向器によって
レーザー光を振幅変調する。変調素子は、その駆動電源
４が光学系制御ピューター18と連動しているため、コン
ピューターからの信号を受けて自動的に変調処理され
る。変調処理には、一定の周波数による通常変調と不規
則な周波数によるランダム変調があり適宜選択できる。
振幅変調されたレーザー光は、シャッター５で矩形波に
処理され、x,y軸の２個のスキャナー・ミラー６で反射
した後、光透過性部分を有するの試料台７の下方から螢
光顕微鏡の光軸と平行に導入される。スキャナー・ミラ
ーは、光学系制御コンピューターからの信号を駆動電源
８で受け、２次元走査しながら集光レンズ９に投射し
て、マイクロ・スポット光で、顕微鏡下の螢光染色した
生細胞等の試料10の面上を２次元的に照射する。試料台
７には、粗い２次元駆動系を備え、コンピューターと連
動する駆動電源11によって、試料を顕微鏡の視野内に容
易に探索できる。試料から放出される螢光は微弱なた
め、その螢光を有効に対物レンズ12によって集光する。
集光レンズ９と対物レンズ12は試料面に対して共焦点型
に配置することによって、効率的な集光が可能となる。
この集光した螢光は、レーザー光の紫外線も同時に取り
込むため、光路上に配置した紫外線遮断フィルター13で
除去する。螢光は光軸上を進み、光軸上に設けられた第
１、第２の部分反射鏡14a、14bで分岐されて、それぞれ
のバンドパス・フィルター15を通過した後、第１、第２
の検出器16a,16bに導かれ、更に、前記２つの部分反射
鏡14bを透過した螢光は、光路の最終端に用意された第
３の検出器16cに入射する。２個のバンドパス・フィル
ター15a,15bは、各々螢光の特定波長のみを透過するの
で上記３個の検出器を配置することにより複数のスペク
トル成分に分解して検出するのと同一の構成となる。

（２）の検出系には、３個の高感度・低雑音の光電子
増倍感16a,16b,16cを配置して、バンドパス・フィルタ
ー15a,15bで分光された螢光の強度を電気信号に変換
し、増幅器17で増幅してコンピューター18に導入する。

（３）の制御・処理系は、コンピューターから発生す
るパルスをD/A変換し、スキャナー・ミラー駆動電源に
信号を与え２次元走査する。更に、ミラーの回転に対応
する電圧は座標として記憶する。また、光電子増倍感か
ら得られた変調成分の信号または変調周波数の大きさを
座標と組にしてコンピューター記憶する。記憶された座
標とそれらの各点における螢光強度はコンピューターで
再構成し、TVモニター19上に画像化される。画像化には
光強度の高低により濃度、または、疑似からーで２次元
に表示する方法と強度を２軸、照射位置をｘ−ｙ平面に
よる３次元表示がある。

これらの画像は、各スペクトル成分について作成する
が、その他、複数のスペクトル成分の画像を計算し合成
することができる。例えば、螢光スペクトルが物質内に
偏在するイオン（例えば細胞内自由カルシウムイオン）
の濃度によって形をかえる場合、各スペクトル成分の例
えば２成分の強度に四則演算を施して、その濃度分布を
画像化することができる。

このように構成された螢光顕微分光装置は例えば第２
図に示される流れ図に従って作動される。

先ず、（ａ）光電子増倍管の数（スペクトルの特徴を
取り出すために必要な数）を入力する。（ｂ）データを
採る領域の大きさを指定する。（ｃ）光強度変調するか
どうかを決める。変調しないならば、スキャナーを動か
しながら螢光データを取り込む。（ｄ）変調する場合
は、光音響偏向子のパラメーターを決める。（ｅ）先
ず、変調方法を「通常変調」か「ランダム変調」か選択
し、（ｆ）、（ｇ）選択した変調法のパラメーターを入
力する。（ｈ）スキャナーミラーを駆動し、レーザー光
照射位置を決める。（ｉ）変調したレーザー光を照射し
ながら、（ｊ）螢光強度を計算機に取り込み、計算処理
して、照射点における螢光強度を測定する。次に、
（ｈ）に戻り、照射点を移動する。これらを繰り返し、
データを採る領域全体を走査し、測定を完了する。

非変調の場合も変調の場合と同様にしてレーザー光の
スキャニングおよびデータ採取が行われる。

第3A図から第3C図に本発明による測定結果を示す。こ
の実験はにんじん培養細胞（プロトプラスト）内に含ま
れるカルシウムの濃度分布を測定するために行われたも
のである。

一般にカルシウムイオンと結合した色素から放出され
た螢光を特徴づける波長をλ_１、色素だけに固有の螢光
を特徴づける波長をλ_２とする。ここで、波長λ_１と波
長λ_２における螢光強度比Ｒとする。この螢光強度比Ｒ
を用いると、次の式により、溶液中のカルシウムイオン
の濃度を求められる。

この式の中で、R_minは溶液中のカルシウムイオンがな
いときの、また、R_maxはカルシウムイオンが飽和すると
きの螢光強度比Ｒの値である。Ｃは実験的に求められる
係数である。

第3A図はカルシウムイオンと結合した色素indo-1から
放出される螢光を特徴づける波長λ_１である421nmの螢
光強度分布を示す図であり、第3B図は色素だけに固有な
螢光を特徴づける波長λ_２である467nmの螢光強度分布
を示す図である。なお、螢光励起用のレーザー光の波長
としては325nmが用いられた。このようにして得られた
相異なる波長の螢光強度を上式に代入すると第3C図に示
すカルシウムの濃度分布が得られた。第3C図を第3A図と
比較すると、本発明が極めて高感度に微量物質の測定が
行えることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明を実現するためのシステム構成図、第２図は、第１図のシステムを作動させるために用いら
れる計算機のフローチャート、第3A図および第3B図は、ニンジンの培養細胞に対して行
われた相異なる波長に対する螢光強度分布の測定結果を
示す図、第3C図は、第3A図および第3B図に示される螢光強度分布
を演算処理して得られたカルシウム濃度分布を示す図、第４図は従来の定量用螢光顕微鏡の構成図、第５図は従来の走査型レーザー螢光顕微分光装置の概略
図。（符号の説明） 1,51,41……レーザー光源、12,52,43……対物レンズ、1
0,53,44……試料、55……光検出器、56……ディスプレ
イ、42……ビームスプリッター、45……ポリクロメータ
ー、16a,16b,16c,49……光電子増倍管、50……SIT検出
器、２……レーザー光、３……変調素子、４……変調素
子駆動電源、５……シャッター、６……スキャナー・ミ
ラー、７……試料台、８……スキャナー・ミラー駆動電
源、９……集光レンズ、11……試料台駆動電源、13……
紫外光遮断フィルター、14……部分反射鏡、15a,15b…
…バンドパス・フィルター、17……増幅器、18……コン
ピューター、19……TVモニター

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料からの蛍光を観測するために集光する
対物レンズ、前記対物レンズの光軸上に設置され、光透過部分を有す
る試料台、レーザー光発生手段、このレーザー光発生手段から発生されたレーザー光を、
前記光軸と平行に走査して、試料を前記試料台の一方側
から照明して、試料から蛍光を発生させる光走査手段、前記レーザー光を収束する集光レンズ、前記試料台の他方側の前記光軸上に設置され、前記対物
レンズを通過した蛍光を分割する部分反射鏡、前記試料台の前記他方側へ放出され且つ前記部分反射鏡
を介して得られる蛍光の内、或る特定の波長の蛍光強度
を検出する第１の光強度検出器、前記試料台の前記他方側へ放出され且つ前記部分反射鏡
を介して得られる蛍光の内、前記或る特定の波長とは異
なる波長の蛍光強度を検出する第２の光強度検出器、及
び第１の光強度検出器及び第２の光強度検出器から得られ
る相異なる波長の蛍光強度に演算を施して、或る特定の
物質のみに関する試料の２次元分布情報を取得する演算
回路を備える蛍光顕微分光装置。