JP2591615B2 - インターロイキン−１β誘導体及び医薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新しいポリペプチド、更に詳しくはインター
ロイキン−１β（IL−１β）の新しい誘導体、並びにIL
−１β及びその新しい誘導体の医薬用途に関する。

第２回国際リンホカインワークシヨツプにおいて、か
つてリンパ球活性化因子（Lymphocyte Activating Fact
or;LAF）、マイトジエニツク プロテイン（Mitogenic
Protein）、ヘルパ−ピーク−１（Helper peak−１）、
Ｔリンパ球代替因子［Ｔ−cell replacing factor III
（TRF−III）、Ｔ−cell replacing factor Mφ（TRF
M）］、Ｂセルアクチベーテイング フアクター（Ｂ−c
ell activating factor）、Ｂリンパ球分化因子（Ｂ−c
ell differation factor）などの呼称で報告されてきた
生理活性物質は、いずれもインターロイキン−１（IL−
１）なる呼称に統一されることが決定された［Cellular
Immunol.,48、433−436（1979）］。この決定は、上記
各生理活性物質は物質として区別できず生理活性を異な
る角度から把えて表現していたにすぎないとの理由に基
づいている。

上記IL−１は、更に例えばＴリンパ球やＢリンパ球を
活性化し、インターロイキン２の産生亢進作用や抗体産
生を亢進させる作用を有し、また肝細胞に作用して蛋白
質合成を亢進させる作用、プスタグランデイン産生を亢
進させる作用等を有することも報告されている［Review
s of Infectious Disease,Vol.6,No.1,51−59（198
4）、New England.J.of Med.,311,1413（1984）等参
照］。

しかして、物質としてのIL−１の本体に関しては現在
尚不明ではあるが、最近になってLAF活性を有するポリ
ペプチドもしくはその前駆体をコードする異なる２種の
遺伝子の存在がようやく報告された［Proc.Natl.Acad.S
ci.,Vol.81,7907−7911（1984）、Nature.Vol.315,641
（1985）、Nucleic Acid Research,Vol.13（16）,5869
（1985）］。これらの報告は２種の遺伝子の塩基配列か
ら推定される159個のアミノ酸配列を有する「IL−１
α」と153個のアミノ酸からなる「IL−１β」を記して
いる。

しかしながら、従来よりコンデイシヨンド メデイウ
ム（conditioned medium）もしくは部分精製したと報告
されるものの前述の生理活性と、上記塩基配列から推定
されるポリペプチドとの関連は、今尚明らかにはされて
いない。

また、上記公知の生理活性物質としてのIL−１は、内
因性の発熱物質（endogeneous pyrogen:EP）とも同一物
質であるとされ、発熱性を示すことが知られている［Na
ture,304,449（′1983）;Cell.Immunol.,63,164（198
1）;J.Exp.Med.,150,709（1979）;J.Immunol.,130，
（６）2708（1983）；同，132（３）1311（1984）等参
照］。この事実から、従来の生理活性としてのIL−１は
もとより、仮に物質として均一なIL−１が提供されたと
しても、その医薬用途への適用は、極めて困難とされて
いる。

本発明は医薬用途に有効に使用できる新しい有用なIL
−１β誘導体であるポリペプチドを提供しようとするも
のである。

本発明は新しいIL−１β誘導体であるポリペプチドの
医薬用途を提供しようとするものである。

本発明は新しいIL−１β誘導体をコードする遺伝子及
びこれを用いて遺伝子工学的手法でIL−１β誘導体であ
るポリペプチドを製造する方法を提供しようとするもの
である。

本発明はまた均質なIL−１β自身の新しい医薬用途を
提供しようとするものである。

上記本発明の目的及びそれら以外の本発明の目的は以
下の記載により明かにする。

本発明のIL−１β誘導体（ポリペプチド）はインター
ロイキン−１βの下記（Ａ）式で表わされるアミノ酸配
列に於て、 式（Ａ） Ala−Pro−Val−Arg−Ser−Leu−Asn−Cys−Thr−Leu− Arg−Asp−Ser−Gln−Gln−Lys−Ser−Leu−Val−Met− Ser−Gly−Pro−Tyr−Glu−Leu−Lys−Ala−Leu−His− Leu−Gln−Gly−Gln−Asp−Met−Glu−Gln−Gln−Val− Val−Phe−Ser−Met−Ser−Phe−Val−Gln−Gly−Glu− Glu−Ser−Asn−Asp−Lys−Ile−Pro−Val−Ala−Leu− Gly−Leu−Lys−Glu−Lys−Asn−Leu−Tyr−Leu−Ser− Cys−Val−Leu−Lys−Asp−Asp−Lys−Pro−Thr−Leu− Gln−Leu−Glu−Ser−Val−Asp−Pro−Lys−Asn−Tyr− Pro−Lys−Lys−Lys−Met−Glu−Lys−Arg−Phe−Val− Phe−Asn−Lys−Ile−Glu−Ile−Asn−Asn−Lys−Leu− Glu−Phe−Glu−Ser−Ala−Gln−Phe−Pro−Asn−Trp− Tyr−Ile−Ser−Thr−Ser−Gln−Ala−Glu−Asn−Met− Pro−Val−Phe−Leu−Gly−Gly−Thr−Lys−Gly−Gly− Gln−Asp−Ile−Thr−Asp−Phe−Thr−Met−Gln−Phe− Val−Ser−Ser （Ａ） ａ）１位Ala、３位Val、４位Arg、５位Ser、８位Cys、1
1位Arg、30位His、71位Cys、93位Lys、97位Lys、98位Ar
g、99位Phe、103位Lys、120位Trp、121位Tyr及び153位S
erから選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失さ
れているか又は他のアミノ酸で置換されていること、 ｂ）１位のAlaから９位のThrに至るアミノ酸配列又はそ
の中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失されているこ
と（但し上記ａに記載の１位Ala、３位Val、４位Arg、
５位Ser及び８位Cysから成る群から選ばれたアミノ酸残
基の少くとも１つが欠失されている場合を除く）、 ｃ）103位のLysから153位のSerに至るアミノ酸配列又は
その中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失されている
こと（但し上記ａに記載の103位Lys、120位Trp、121位T
yr及び153位Serから成る群から選ばれたアミノ酸残基の
少くとも１つが欠失されている場合を除く）、 ｄ）式（Ａ）のＮ末端に、Met又は下記式（Ｂ）で示さ
れる１′位のMetから116′位のAspに至るアミノ酸配列
若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列が付加され
ていること、 式（Ｂ） Met−Ala−Glu−Val−Pro−Glu−Leu−Ala−Ser−Glu− Met−Met−Ala−Tyr−Tyr−Ser−Gly−Asn−Glu−Asp− Asp−Leu−Phe−Phe−Glu−Ala−Asp−Gly−Pro−Lys− Gln−Met−Lys−Cys−Ser−Phe−Gln−Asp−Leu−Asp− Leu−Cys−Pro−Leu−Asp−Gly−Gly−Ile−Gln−Leu− Arg−Ile−Ser−Asp−His−His−Tyr−Ser−Lys−Gly− Phe−Arg−Gln−Ala−Ala−Ser−Val−Val−Val−Ala− Met−Asp−Lys−Leu−Arg−Lys−Met−Leu−Val−Pro− Cys−Pro−Gln−Thr−Phe−Gln−Glu−Asn−Asp−Leu− Ser−Thr−Phe−Phe−Pro−Phe−Ile−Phe−Glu−Glu− Glu−Pro−Ile−Phe−Phe−Asp−Thr−Trp−Asp−Asn− Glu−Ala−Tyr−Val−His−Asp （Ｂ） というａ）〜ｄ）の条件の少なくとも１つを充足する改
変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、
少なくとも71位Cysが他のアミノ酸で置換されているこ
とにより特徴付けられる。

上記及び以下の本明細書に於けるアミノ酸及びポリペ
プチドの表示は、IUPAC及びIUAC−IUBによる命名法又は
規則に於ける略号乃至当該分野で慣用されている略号に
よる表示法に従うものとする。また塩基配列に於ける核
酸の表示も同様とする。アミノ酸の数又は位置は、欠落
及び付加がある場合であっても、全てIL−１βのアミノ
酸配列即ち前記式（Ａ）アミノ酸配列に従って表示す
る。但しアミノ酸位置を示す数値のうちダツシユを付し
たものは式（Ｂ）のアミノ酸配列に従う。

本発明のIL−１β誘導体は、IL−１βの前記式Ａ）に
示されるアミノ酸配列において、上記ａ）〜ｄ）の要件
の１つ又は２以上を組み合わせて充足するアミノ酸配列
を含有する新規なポリペプチドである。好ましい誘導体
は前記要件ａ）〜ｃ）の少くとも１つを充足するアミノ
酸配列を有するもの及びａ）〜ｃ）の少くとも１つの要
件とｄ）の要件とを同時に満足するアミノ酸配列を有す
るものである。

本発明のIL−１β誘導体であるポリペプチドの好まし
い具体例を挙げると次の通りである。

１）少くとも１位Alaが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

２）少くとも３位Valが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

３）少くとも４位Argが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

４）少くとも５位Serが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

５）少くとも８位Cysが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

６）少くとも11位Argが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

７）少くとも30位Hisが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

８）少くとも71位Cysが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

９）少くとも93位Lysが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

10）少くとも97位Lysが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

11）少くとも98位Argが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

12）少くとも99位Pheが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

13）少くとも103位Lysが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

14）少くとも120位Trpが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

15）少くとも121位Tyrが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

16）少くとも153位Serが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。

17）１位のAlaから３位のValに至るアミノ酸配列、１位
のAlaから６位のLeuに至るアミノ酸配列又は１位のAla
から９位のThrに至るアミノ酸配列が少くとも欠失され
ているポリペプチド。

18）151位Valから153位Serに至るアミノ酸配列、149位G
lnから153位Serに至るアミノ酸配列、145位Aspから153
位Serに至るアミノ酸配列、141位Glnから153位Serに至
るアミノ酸配列、121位Tyrから153位Serに至るアミノ酸
配列又は103位Lysから153位Serに至るアミノ酸配列が少
くとも欠失されているポリペプチド。

19）式（Ａ）のＮ末端にMet、式（Ｂ）で表わされるア
ミノ酸配列77′位のMetから116′位Aspに至るアミノ酸
配列、71′位Metから116′位Aspに至るアミノ酸配列、3
2′位Metから116′位Serに至るアミノ酸配列又は１′位
Metから116′位Aspに至るアミノ酸配列を少くとも有す
るポリペプチド。

上記本発明のIL−１β誘導体は、IL−１βのアミノ酸
配列の特定位置の特定アミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れたアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、
この置換を行い得る他のアミノ酸は、人体蛋白質を構成
するα−アミノ酸であれば、いずれでもよいが、中性ア
ミノ酸であるのが好適である。但し、Cysは、そのSH基
に基づいて、分子内又は分子間ジスルフイド結合を形成
することがあり、これを考慮すれば該アミノ酸はCys以
外の上記アミノ酸であるのが好ましい。特に好ましいも
のとして例えば４位Argの場合はGlyを、８位Cysの場合
はSer又はAlaを、11位Argの場合はGlnを、30位Hisの場
合はTyrを、71位Cysの場合はSer、Ala又はValを、93位L
ysの場合はLeuを、98位Argの場合はLeuを、103位Lysの
場合はGlnを、120位Trpの場合はArgを、121位Tyrの場合
はGlnを、それぞれ好ましいものとして例示することが
できる。

本発明のIL−１β誘導体ならびに本明細書に記載の方
法に従い得られる均質なIL−１βは、例えばLAF活性、
腫瘍細胞増殖抑制活性（GIF活性）、即ち腫瘍細胞に対
して特異的にその増殖を抑制する活性、コロニー刺激因
子（Colony stimulating factor:CSF）、インターフエ
ロン（interferon:IFN）、インターロイキン２（interl
eukin−2:IL−２）、インターロイキン３（interleukin
−3:IL−３）等の種々のサイトカイン（cytokine）類の
産生促進活性、即ち例えばヒト細胞に作用してそれらサ
イトカイン類の産生を著しく促進させる活性、抗炎症活
性、特に例えば関節炎モデル動物に投与することによっ
て関節炎の進行を効果的に抑制する活性、放射線障害防
止作用、即ち骨髄移植時の放射線全身照射、癌治療等に
おける放射線照射、放射線事故時における生体障害乃至
は重篤な副作用等を予防する作用乃至防止する作用等を
有している。本発明誘導体は上記各活性のいずれか少な
くともひとつの点で優れているか、或いは（及び）より
毒性が低く副作用が少ない点で優れている。従って本発
明誘導体ならびに上記の均質なIL−１βは例えば抗体産
生促進やワクチンの効果増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍
剤、例えばCSF、IL−２及びIL−３等のサイトカイン産
生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等の医薬品とし
て有用である。

殊に上記均質なIL−１β自身が関節炎等の炎症に著効
を示すという本発明による新たな知見は、従来IL−１が
炎症をメデイエートし、その惹起に関与するとされてい
た事実によれば、おどろくべきことである。また、本発
明誘導体は上記各活性のいずれか少なくともひとつの点
で優れているか、或いは（及び）より毒性が低く副作用
が少ない点で優れている。

とりわけ、本発明誘導体は、CSF産生促進剤として有
用であり、これをヒトに投与するときには、ウィルス感
染や抗原抗体反応等の危険性を生じることなく、癌化学
療法や放射線療法後の骨髄低形成による顆粒球減少を有
効に回復できる（顆粒球減少治療剤）。上記CSF産生促
進剤は、またその本来のCSF産生促進作用により、CSFの
作用に基づく各種疾病の予防及び治療剤としても有効に
利用できる。例えば、CSFは顆粒球やマクロファージの
機能を促進させる作用がある〔ロペッツら（Lopez,A.F.
et al.）,J.Immunol.,131,2983（1983）、ハンダムら
（Handam,E.et al.）同122,1134（1979）及びバダスら
（Vadas,M.A.et al.），同130,795（1983）〕ので、種
々の感染症の予防及び治療剤として臨床応用が期待され
ており、上記CSF産生促進剤も同様に臨床応用が期待さ
れる。

殊に、近年生体防御能が低下乃至障害された個体（co
mpromised host）に、それまで無害であった病原体が病
原性を発揮して惹起される、所謂日和見感染症（opport
unistic infection或いはterminal infection）は、臨
床的に問題となる病原体（起炎菌）がシュードモナス
（Pseudomonas）セラティア（Serratia）等のグラム陰
性桿菌、ヘルペス（Herpes simplex,HSV）、バリセラ−
ゾースタ（Varicella zoster,VZV）、サイトメガロウイ
ルス（Cytomegalovirus,CMV）等のウイルス、キャンデ
ィダ（Candida albicans）アスペルギルス（Aspergillu
s fumigatus）、ノカルディア（Nocardia asteroidea）
等の真菌、カリニ原虫（Pneumocystis carinii）、トキ
ソプラズマ（Toxoplasma gondii）等の原虫等であり、
現用の抗生物質中には、之等の病原菌に対して充分な効
果を奏し難く、該日和見感染症に対する新しい薬剤の研
究開発が切望されている。本発明誘導体は、かかる日和
見感染症の予防及び治療剤としても有用であり、特にか
かる日和見感染症が高頻度に見られる抗癌剤投与時、即
ち急性白血病の化学療法や骨髄移植時における各種の感
染症、例えばガンジダ症、クリプトコックス症、アスペ
ルギルス症、接合菌症、黒色真菌感染症、ウィルス感染
症、サイトメガロウィルス肺炎、之等の合併症等の予防
及び治療剤として有用なものである。

更に本発明誘導体ならびに上記のIL−１βは、上記医
薬用途以外に、そのサイトカイン産生促進活性に基づい
て、例えば細胞株からの各種有用サイトカインのインビ
トロ（in vitro）製造に際して極めて有効に使用し得
る。かかる細胞株からの天然型サイトカインの製造は、
ことに糖蛋白質であるサイトカインにおいて着目されて
おり、効率的にかつ大量に有用サイトカインを収得する
ことができる。

本発明誘導体中、少くとも71位Cysを置換乃至は欠失
させたもの、特に上記Cysを他のアミノ酸、例えばSer、
Ala、Val等で置換したものは、高活性を示す。

また、少くとも４位Arg又は少くとも８位Cysを置換乃
至は欠失させた本発明誘導体、及び少くとも103位以降
の少なくともひとつのアミノ酸を欠失させた本発明誘導
体は、いずれもプロスタグランジンＥ（PGE）産生促進
作用が弱く、従って発熱作用等の副作用ならびに毒性が
より少ない特徴を有し、更に少くとも４位Argを置換乃
至は欠失させた本発明誘導体は、GIFならびにLAF活性に
比較して、CSF産生促進活性ならびに抗炎症活性がより
強い特徴を有している。

更に、本発明誘導体中、式（Ａ）のＮ末端に少くとも
上記特定のアミノ酸もしくはポリペプチドが付加したも
のは、GIF活性及びLAF活性に比してCSF産生促進作用及
び抗炎症作用がより高い特徴を有し、しかも毒性が低く
且つ作用の持続性の点で医薬品として、殊に経口剤乃至
は座剤として利用する場合に、より有効である。

更に、本発明誘導体、ことに少くとも８位Cys及び／
又は71Cysを置換乃至は欠失させたもの、特に上記Cysを
他のアミノ酸、例えばSer、Ala、Val等で置換したもの
は、種々の条件下におけるIL−１受容体への結合性にお
いて優れている。尚、本発明誘導体の内でIL−１βに比
しその分子中にCysをより少なく含むか又は含まないも
のは、CysのSH基に基づく分子内もしくは分子間結合の
不要な形成を考慮すれば、より好ましいものである。

本発明のポリペプチドは、例えば遺伝子工学的手法に
より製造することができる。即ち、前記本発明に係わる
特定のポリペプチドをコードする遺伝子を利用し、これ
を微生物のベクターに組込んで該微生物細胞内で、複
製、転写、翻訳させることによって製造することができ
る。この方法は、特に大量生産が可能である点より有利
である。

上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、
例えばホスフアイト トリエステル法〔ネイチヤー（Na
ture），310,105（1984）〕等の常法に従って、核酸の
化学合成により全合成することもできるが、IL−１βも
しくはその前駆体をコードする遺伝子を利用するのが簡
便であり、該遺伝子より、上記化学合成手段を含む常法
に従って、前記特定のアミノ酸配列をコードする核酸配
列に改変することにより容易に製造できる。

IL−１β又はその前駆体をコードする遺伝子は公知
（記述）であり、我々も我々の先の出願（特願昭60−13
8281号）に記したようにIL−１βをコードする遺伝子を
得、これを用いて遺伝子工学的手法でIL−１βを収得す
るに成功した。之等の一連の遺伝子工学的手法は後記の
参考例において明らかにする。

上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方法に従えば
よく、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて
実施される〔遺伝子工学的手法としては、例えば、Mole
cular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory（198
2）が参照される〕。

例えば、DNAの切断、結合、リン酸化等を目的とする
制限酵素、DNAリガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、D
NAポリメラーゼ等の各種の酵素処理等の常套手段等が採
用でき、それら酵素は市販品として容易に入手できる。
之等各操作における遺伝子乃至核酸の単離、精製も常
法、例えばアガロース電気泳動法等に従えばよい。また
得られる遺伝子の複製は、一部後述するように通常のベ
クターを利用する方法に従えばよい。また、所望のアミ
ノ酸配列をコードするDNA断片や合成リンカーは上記し
た化学合成により容易に製造できる。尚、上記において
所望のアミノ酸に対応するコドンは自体公知でありまた
その選択は任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使
用頻度等を考慮した常法に従えばよい〔Nucl.Acids.Re
s.,9,43−74（1981）〕。またこれらの核酸配列のコド
ンを一部改変するには、例えば常法どうり、15〜30マー
程度の、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーを用いたサイト−スペシフィック
ミュータジエネシス（Site−Specific Mutagenesis）
〔Proc.Natl.Acad.Sci.,81,5662−5666（1984）〕等の
方法を採用することができる。

上記方法により得られる所望の遺伝子は、例えばマキ
サム−ギルバートの化学修飾法〔Maxam−Gilbert,Meth.
Enzym.,65,499−560（1980）〕やM13フアージを用いる
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法〔Messing,J.and Viei
ra,J.,Gene,19,269−276（1982）〕等により、その塩基
配列の決定及び確認を行なうことができる。

上記操作及び方法の具体例は、後記参考例及び実施例
に記述するが、該方法は特に限定されず、当業界におい
て周知の各種方法のいずれを採用してもよい。

かくして、本発明によれば前記した特定のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子も影
響される（以下この遺伝子を「本発明遺伝子」とい
う）。

本発明のポリペプチドは、上記特定の遺伝子（本発明
遺伝子）を利用し、従来公知の一般的な遺伝子組換え技
術に従い製造できる。より詳細には、上記本発明遺伝子
が宿主細胞中で発現できるような組換えDNAを作成し、
これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を
培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のい
ずれをも用いることができる。該真核生物の細胞には、
脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞として
は、例えばサルの細胞であるCos細胞〔Y.Gluzman,Cell,
23,175−182（1981）〕やチヤイニーズ・ハムスター卵
巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔G.Urlaub a
nd L.A.Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,77,4216−422
0（1980）〕等がよく用いられているが、之等に限定さ
れる訳ではない。脊椎動物細胞の発現ベクターとして
は、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロ
モーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位
及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは
更に必要により複製起源を保有していてもよい。該発現
ベクターの例としては、SV40の初期プロモーターを保有
するpSV2dhfr〔S.Subramani,R.Mulligan and P.Berg,Mo
l.Cell.Biol.,１（９）,854−864〕等を例示できるが、
これに限定されない。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられて
おり、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用で
きる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、
例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つpAM82〔A.Miyanohara et al.Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,80,1−５（1983）〕等を好ましく利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によ
く用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製
可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本
発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモ
ーター及びSD（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配
列、更に蛋白合成開始に必要なATGを付与した発現プラ
スミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌として
は、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）K12株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にpBR322がよく
用いられるが、これに限定されず、公知の各種の菌株及
びベクターがいずれも利用できる。プロモーターとして
は、例えばトリプトフアン・プロモーター、P_Lプロモー
ター、lacプロモーター、lppプロモーター等を使用する
ことができ、いずれの場合にも本発明遺伝子を発現させ
ることができる。

トリプトフアン・プロモーターを用いる場合を例にと
り詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトフアン・プ
ロモーター及びSD配列を持つベクターpTM1〔今本文男、
代謝、Vol.22,289（1985）〕を使用し、SD配列の下流に
存在する制限酵素Cla I部位に、必要に応じてATGを付与
した所望のポリペプチドをコードする遺伝子を連結させ
ればよい。

尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダー
ゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白質発現系に
よることもできる。

かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及
びこれによる形質転換の方法としては、一般に用いられ
ている方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集
め、CaCl₂処理して自然にDNAを取り込みやすい状態にし
て、ベクターを取込ませる方法等を採用できる。上記方
法においては、通常知られているように形質転換の効率
を一層向上させるためにMgCl₂やRbClを更に共存させる
こともできる。また、宿主細胞をスフエロプラスト又は
プロトプラスト化してから形質転換させる方法も採用す
ることができる。

かくして得られる所望の形質転換株は、常法に従い培
養することができ、該培養により、所望のポリペプチド
が生産、蓄積される。該培養に用いられる培地として
は、通常の細胞培養に慣用される各種の培地のいずれで
もよく、その具体例としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、
M9倍地等及び之等に通常知られている各種の炭素源、窒
素源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地を例示でき
る。尚、上記トリプトフアン・プロモーターを用いた場
合には、一般にプロモーターが働くようにするためにカ
ザミノ酸を添加した、例えばM9最小培地を用いて培養す
ることができ、該培地中には培養の適当な時期にインド
ールアクリル酸等のトリプトフアン・プロモーターの働
きを強めるための薬剤を添加することもできる。

このようにして得られる活性物を含有する培養物から
の目的ポリペプチド、即ち本発明ポリペプチドの精製、
単離は常法に従って行なうことができる。尚、本発明ポ
リペプチドを宿主から抽出するに当っては、例えば浸透
圧シヨツク法等の温和な条件を採用するのが、その高次
構造保持の面からより好ましい。

上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物理、
化学的性質を利用した各種の処理操作に従い実施するこ
とができる〔例えば「生化学データーブツクII」pp1175
〜1259、第１版第１印刷、1980年６月23日、株式会社東
京化学同人発行参照〕。該方法としては、具体的には例
えば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外過、分子ふる
いクロマトグラフイー（ゲル過）、液体クロマトグラ
フイー、遠心分離、電気泳動、アフイニテイクロマトグ
ラフイー、透析法、之等の組合せ等を採用できる。

より具体的には、上記操作は、例えば以下のごとくし
て実施できる。即ち、まず培養上清より予め目的とする
ポリペプチドを部分精製する。この部分精製は、例えば
アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ジ
メチルホルムアミド（DMF）等の有機溶媒や酢酸、過塩
素酸（PCA）、トリクロロ酢酸（TCA）等の酸を蛋白沈澱
剤として用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／又
は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外過処理
等により行なわれる。之等の各処理の操作及び条件は、
通常のこの種方法のそれらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル過に付すこ
とにより目的物質の活性が認められる画分を収得する。
ここで用いられるゲル過剤としては、特に限定はな
く、例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲ
ル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロース
ゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも利用で
きる。之等の具体例としては、セフアデツクスＧタイ
プ、同LHタイプ、セフアロースタイプ、セフアクリルタ
イプ（以上、フアルマシア社）、セルロフアイン（チツ
ソ（株））、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオ
ーラド社）、ウルトロゲル（LKB社）、TSK−Ｇタイプ
（東洋曹達（株））等の市販品を例示できる。

目的とするポリペプチドは、上記ゲル過により得ら
れる活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラム
を用いたアフイニテイークロマトグラフイー、DEAE法、
CM法、SP法等のイオン交換カラムクロマトグラフイー、
クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマトグラ
フイー等に付すことにより、又は之等各操作の組合せに
より更に精製することができ、均質な物質として単離す
ることができる。

上記クロマトフオーカシング法は、公知の各種方法に
より実施できる。カラムとしては、例えばPBE94（フア
ルマシア社製）等を、開始緩衝液としては、例えばイミ
ダゾール−塩酸等を、また溶出液としては、例えばポリ
バツフアー74（フアルマシア社製）−塩酸（pH4.0）等
を使用できる。

上記逆相高速液体クロマトグラフイーは、例えばC₄ハ
イポアー逆相HPLCカラム（バイオ−ラド社（Bio−Rad L
aboratories））等を用いて、移動剤としてアセトニト
リル、トリフルオロ酢酸（TFA）、水等及び之等の混合
溶媒を用いて実施できる。

かくして本発明IL−１β誘導体（ポリペプチド）を単
離、収得できる。IL−１βをコードする遺伝子から同種
の遺伝子組換え操作でIL−１βを収得できる。

得られる本発明ポリペプチド又はIL−１βは、前述し
た如く優れた薬理活性を有することから、前述した各種
の医薬用途に有用な医薬製剤とすることができる。斯か
る医薬製剤にはたとえば抗体産生やワクチン効果の増強
並びに免疫不全症の治療等の免疫刺激剤、抗腫瘍剤、サ
イトカイン類の産生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止
剤、日和見感染症治療剤等が包含される。該医薬製剤
は、通常本発明ポリペプチド又はIL−１βの薬理有効量
と共に適当な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態
に調製される。該製剤担体としては使用形態に応じた製
剤を調製するのに通常慣用される充填剤、増量剤、結合
剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈
剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形態は、これが
本発明ポリペプチド又はIL−１βを効果的に含有する状
態であれば、特に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆
粒剤、丸剤等の固剤であつてもよいが、通常液剤、懸濁
剤、乳剤等の注射剤形態とするのが好適である。またこ
れは使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る
乾燥品とすることもできる。之等の製剤組成物はいずれ
も常法に従い調製され得る。

得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じた適
当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は、静脈
内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により投与さ
れ、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され得
る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量は、
該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用され
る患者の症状等に応じて適宜選択され、一定ではない
が、通常有効成分を約１〜80重量％程度含有する製剤形
態に調製して、この製剤をこれに含有される有効成分量
が一日成人一人当り約0.1μｇ〜10mg程度となる範囲で
投与するのが望ましい。該投与は、一日１回である必要
はなく一日３〜４回に分けることもできる。

実施例 以下、IL−１βを製造する参考例及び本発明誘導体を
製造する実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明す
る。

下記各例では、本発明誘導体に関して、之等を簡略化
するため、以下の略号を付した。

また、以下の各例において各種生理活性は、次の方法
により測定した。

〈活性の測定〉 （１）IL−１活性の測定 オツペンハイムら（J.J.Oppenheim et al）の方法
〔J.Immunol.,116,1466（1976）〕に従い、C3H/He J系
マウスの胸腺細胞を利用して測定したLAF活性により表
示した。

（２）GIF活性の測定 96ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液0.1mlを入れ、次に各ウエルにヒ
トメラノーマ細胞A375を２×10⁴個/mlの濃度で含有する
10％FCSを含むイーグルスMEM浮遊液0.1mlを加え、炭酸
ガス培養器（ナフコ社製）内で４日間培養する。培養終
了後、0.05％ニユウトラルレツド（和光純薬社製）0.05
mlを各ウエルに加え、37℃で２時間培養する。上澄液を
除去した後、リン酸緩衝生理食塩水0.3mlを各ウエルに
静かに加えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、
各ウエルにリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液
0.1mlを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞
内に取込まれた色素量を、96ウエル−マイクロタイトレ
ーシヨンプレート用光度計（タイターチエツクマルチス
キヤン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度
540mμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群（コ
ントロール群）の細胞増殖の50％抑制を示す試験群、即
ち対照群の吸光度測定値の1/2の吸光度測定値を示す試
験群、の希釈率の逆数をとり、これをGIF活性単位とす
る。従つて例えばこのGIF活性が10単位の場合、この供
試液は10倍希釈してもなお細胞増殖を50％抑制する活性
を有する。

参考例１ プラスミドpGIF−αの製造 ヒトリンパ球の調製 ヒト末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度
勾配遠心法〔Eur.J.Immunol.４,808（1974）〕により末
梢血リンパ球1.9×10¹⁰個を得た。

このリンパ球を４×10⁸/mlの細胞濃度で、ヒト血清５
％を含むRPMI1640培地に懸濁させ、直径9cmのシヤーレ
に分注後、５％炭酸ガス中、37℃で１時間培養した。そ
の後、シヤーレ底部に付着していない細胞を除去し、ウ
シ胎児血清10％、TPA（シグマ（Sigma）社製）0.5ng/ml
及びLPS（デイフコ（Difco）社製）10μg/mlを含むRPMI
1640培地にて細胞を刺激した。５％炭酸ガス中、37℃で
４時間培養した後、PBS及び0.02％EDTAにて付着性リン
パ球９×10⁸個を得た。

mRNAの調製 上記で得たヒト付着性リンパ球を、6M−グアニジン
チオシアネート溶液（6M−グアニジンイソチオシアネー
ト、5mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）、0.1M2−メルカ
プトエタノール、0.5％ザルコシル（Sarkosyl）30mlに
て溶解後、G18G注射針をつけた50ml注射筒を用いてDNA
をせん断した。この溶液に塩化セシウム（CsCl）12gを
添加し、完全に溶解させた後、その6.4mlずつを5.7M C
sCl（5.7M CsCl−0.1M EDTA）4mlに重層し、ベツクマ
ンローター（Beckman SW−40Ti rotor）にて25℃で315
00rpmで20時間遠心した。沈澱したRNAのペレツトを70％
エタノールで洗浄後、TE溶液（10mMトリスHCl,pH7.5,1m
M EDTA）に溶解し、1/9容の3M酢酸ナトリウム（pH5.
2）及び2.2容のエタノールを加えて、−70℃で１時間放
置した。４℃にて15000rpmで20分間遠心し、RNAを回収
し、TE溶液に溶解させた。

かくして付着性リンパ球約９×10⁸細胞から、全RNA25
0μｇを得た。

次に、上記で得たRNAからmRNAを取得するために、オ
リゴ（dT）−セルロース（Collaborative Research In
c.）を用いてカラムクロマトグラフイーを行なつた。吸
着は、10mMトリスHCl（pH7.5）,0.5MNaCl,1mM EDTAに
て行ない、カラムを同溶液にて洗浄後、10mMトリスHCl
（pH7.5）及び1mM EDTAにてRNAを溶出させた。

この結果、溶出されたmRNA量は、17.5μｇであつた。

cDNAの調製 上記で得たmRNAから、cDNAを、インビトロで合成
し、オカヤマ−ベルグのプラスミドベクター〔Okayama,
H.and Berg,P.,Mol.Cell.Biol.,２,161（1982）〕を用
いて組換え体DNAを作成し、これをエシエリヒア・コリ
にトランスホームして、cDNAライブラリーを作製した。
各手法は次の通りである。

−１）ベクター・プライマーとリンカーDNAの調製 pBR322−SV40（0.71〜0.86）DNA400μｇを、Kpn I（N
EB）700単位で、37℃で５時間消化し、0.25M EDTA（pH
8.0）40μと10％SDS20μとの混液で反応を停止させ
た後、等容のフエノール−クロロホルム（1:1）で抽出
し、エタノールにてDNAを沈澱させ、遠心後、70％エタ
ノールで洗浄し、DNAを回収した。得られたDNAを140mM
カコジル酸ナトリウム,30mMトリスHCl（pH6.8）,1mM C
oCl₂,0.1mM DTT及び0.25mM dTTP（α−³²P−dTTP 0.
5μCiを含む）200μに溶解させ、ターミナルトランス
フエラーゼ（TTase,PL）400単位にて30分間dT鎖の伸長
を行なわせ、0.25M EDTA20μと10％SDS10μとを加
えて反応を停止させ、フエノール−クロロホルム抽出を
４回繰返した後、エタノール沈澱にてDNAを回収した。
この結果、dT鎖は約70塩基伸長された。

次に、上記で得たDNAを、Hpa I（NEB）17単位を用い
て、37℃で６時間消化し、アガロース（低融点アガロー
ス,BRL,1％）電気泳動にて約2.7kbのDNA断片の回収を行
なつた。

電気泳動後、エチジウムブロマイド0.5μg/mlにてDNA
を染色し、UV照射下で約2.7kbの断片を含むアガロース
を切り出し、５倍容の20mMトリスHCl（pH8.0）−1mM E
DTAを加え、65℃で５分間でアガロースを溶解後、フエ
ノール抽出、フエノール−クロロホルム（1:1）抽出及
びクロロホルム抽出を順次行ない、エタノール沈澱にて
DNAを回収した。

次にオリゴ（dA）セルロースカラムクロマトグラフイ
ーでベクタープライマーDNAの精製を行なつた。上記DNA
を10mMトリスHCl（pH7.3）−1mM EDTA−1M NaCl緩衝
液1mlに溶かし、氷冷した後、同緩衝液で平衡化したカ
ラムに載せ、同緩衝液1mlで洗浄後、室温に戻して、10m
MトリスHCl（pH7.3）−1mM EDTAで、DNAを溶出した。
溶出のピーク画分を集め、エタノール沈澱にてDNAを回
収後、10mMトリスHCl（pH7.3）−1mM EDTA100μに溶
かし、４℃で保存した。

リンカーDNAを次の通り調製した。即ち、pBR322−SV4
0（0.19〜0.32）DNA100μｇを、Pst I（NEB）120単位
で、37℃下、1.5時間消化後、反応を停止させ、フエノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行なつた。
DNAを回収し、140mMカコジル酸ナトリウム、30mMトリス
HCl（pH6.8）、1mM CoCl₂、0.1mM DTT、0.25mM dGTP
（１μCiのα−³²P−dGTPを含む）50μに溶解し、TTa
se60単位を20分間作用させた。この結果、18残基のdG鎖
が付加された。反応停止後、DNAを回収し、Hind III
（宝酒造）50単位で消化し、前記したようにアガロース
（1.8％）電気泳動で約0.28kbのDNA断片を回収し、2.3
μｇのリンカーDNAを得た。

−２）cDNAの合成とcDNAライブラリーの作製 RNA5μｇを減圧乾燥した後、5mMトリスHCl（pH8.3）1
0μに溶解し、65℃で５分間加熱した。直ちに37℃に
移し、反応混合液20μ（50mMトリスHCl（pH8.3）、8m
M MgCl₂、30mM KCl、0.3mM DTT、2mM dNTP、10μCi
α−³²P−dCTP）、ベクター・プライマー1.4μｇを加
え、５分間37℃にて保温した。

RTase（リバーストランスクリプターゼ、生化学工業
社製）10単位を加え、37℃で15分間反応させた後、再度
RTase10単位を加え、更に15分間保温した。0.25M EDTA
（pH8.0）２μと10％SDS1μとを加えて反応を停止
させた後、フエノール−クロロホルム抽出を行ない、4M
酢酸アンモニウム20μとエタノール80μとを加え、
15分間−70℃で凍らせた後、室温で融解し、15000rpm、
４℃で10分間遠心し、沈澱させた。沈澱を10mMトリスHC
l（pH7.3）20μに溶かし、4M酢酸アンモニウム20μ
とエタノール80μとを加えて再沈澱させた。

沈澱を回収し、70％エタノールで洗つた後、15μの
140mMカコジル酸ナトリウム、30mMトリスHCl（pH6.
8）、1mM CoCl₂、0.1mM DTT、0.2μｇポリＡ及び66μ
Ｍ〔α−³²P〕dCTP（10μCi）に溶解した。TTase（P.
L.）18単位を加え、37℃で５分間反応させた後、０℃に
急冷し、0.25M EDTA1.3μと10％SDS 0.65μとで
反応を停止させ、フエノール−クロロホルム抽出及びエ
タノール沈澱を行なつた。

沈澱を遠心して回収後、Hind III（宝酒造）４単位で
37℃で２時間消化し、反応停止後、フエノール−クロロ
ホルム抽出し、エタノール沈澱を行なつた。沈澱を回収
後、10mMトリスHCl（pH7.3）及び1mM EDTAの10μに
溶かし、エタノール３μを加え、−20℃で保存した。

上記で得た試料１μをリンカーDNA5ngと共に、10mM
トリスHCl（pH7.5）−1mM EDTA−0.1M NaCl10μ中
で、65℃で２分間、次いで42℃で30分間保温した後、０
℃に冷却した。これに20mMトリスHCl（pH7.5）、4mM M
gCl₂、10mM（NH₄）₂SO₄、0.1M KCl、0.1mM β−NAD、
50μg/ml BSA及び６μg/mlエシエリヒア コリDNAリガ
ーゼの混合溶液を90μ加え、全液量を100μとし、1
2℃で一夜保存した。

次いで、10mM dNTP 0.5μ、10mM NAD 0.56μ
、エシエリヒア・コリDNAポリメラーゼＩ（ベーリン
ガーマンハイム社製）0.5μ及びRNase H（PL）0.2μ
を加え、12℃及び25℃で順次１時間ずつ保温した後、
−20℃で凍結保存した。

エシエリヒア コリHB101株を、LB培地（バクト−ト
リプトン10g、バクト−イースト抽出物5g及びNaCl10g/
）にて、OD₅₅₀＝0.45まで培養し、５分間氷冷後、４
℃で8000rpmで５分間遠心して菌体を回収した。菌体の
ペレツトを氷冷した30mM酢酸カリウム、100mM RbCl、1
0mM CaCl₂、50mM MnCl₂、15％グリセリンに懸濁さ
せ、０℃で５分間保ち、４℃、8000rpm、５分間遠心
し、得られた菌体を、10mM MOPS（モルホリノプロパン
スルホニツクアシツド）、75mM CaCl₂、10mM RbCl、1
5％グリセリンに再度懸濁させ、０℃にて15分間保温し
て、コンピテント細胞を作製した。かくして得られたコ
ンピテント細胞は、その後−70℃で保存した。

凍結菌液を室温で融解し、400μの菌液に対して上
記DNA試料20μを加え、30分間０℃に放置した後、42
℃で90秒間熱シヨツクを与え、再び０℃で１〜２分間静
置した。これにLB培地2mlを加え、37℃で30分間保温
し、50容のLB培地に植菌し、37℃で６時間培養した後、
50μg/mlになるようにアンピシリンを加え、更に一液培
養し、cDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラ
リーは、50％グリセリン中で−20℃にて保存した。

−３）合成プローブの作製 IL−１βをコードするcDNAを有する形質転換株の選出
のためのプローブとして、下記核酸配列に対する相補的
な塩基配列（最下段に示す）を、以下の方法により合成
した。

即ち、N,N−ジアルキルメチルホスホロアミダイト誘
導体を縮合ユニツトとして用いた、固相ホスフアイト
トリエステル法〔Nature,310,105（1984）〕にて、自動
合成機（380A DNA Synthesizer,Applied Biosystems
Inc.,Foster City,California 94404,USA）を用いて、
目的とする完全保護DNAを合成した。続いて該完全保護D
NAを28％アンモニア水で55℃で10時間処理することによ
り、５′末端のOH基に結合している保護基としてのDMTr
（ジメトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、Ｇ、Ｃの
アミノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部分保護DN
A（DMTr体）を得た。次いでこのDMTr体をC₁₈を担体とす
る逆相HPLCにより精製した後、80％酢酸で室温で10分間
処理して上記DMTr基を脱離させ、続いて得られる塩基
を、7M尿素を含む10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
及びバイオ−ゲルＰ−30（バイオ−ラド社製）により精
製して、目的のDNA（60mer）を得た。

上記で得たDNA6μｇを、50μの反応溶液（50mMトリ
スHCl（pH7.6）、10mM MgCl₂、10mM ２−メルカプト
エタノール、50μCi〔γ−³²P〕−ATP）中で、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼ（宝酒造）12単位と、37℃にて１時
間反応させ、DNAの５′末端をラベルした。ラベルされ
たDNAと未反応の³²Pを分別するために、バイオゲルＰ−
30（バイオ−ラド社）によるカラムクロマトグラフイー
を行なつた。ラベルされたDNA画分を1/9容の3M酢酸ナト
リウムと2.5容のエタノールにて沈澱させ、遠心して、
回収後、10mMトリスHCl（pH8.0）−1mM EDTA 400μ
に溶解し、−20℃で保存した。

得られたプローブの比活性は10⁷cpm/μgDNA以上であ
つた。

−４）cDNAライブラリーのスクリーニング アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地上に径80mmの
ニトロセルロースフイルター（ミリポアHAIF08250）を
置き、この上にフイルター当り5000コロニーになるよう
に希釈した前記cDNAライブラリー菌液をまき、37℃にて
一夜培養した。フイルターは、合計24枚を作製した。

コロニーの出現したフイルターに新しいニトロセルロ
ースフイルターを載せることによつて、レプリカフイル
ターを作製した。

元のフイルター（マスターフイルター）を、４℃にて
保存し、レプリカフイルターを、上記した寒天培地上で
37℃で６時間培養後、クロラムフエニコール200μg/ml
を含むLB寒天培地上に移し替え、37℃で一夜培養した。

フイルターを、0.5M NaOH、1MトリスHCl（pH8.0）及
び1MトリスHCl（pH8.0）−1.5M NaClの順で処理し、風
乾後、80℃真空下で２時間ベーキングを行なつた。

ベーキング済みのフィルターを、0.6M NaCl、0.06M
クエン酸３ナトリウム、2mg/mlフィコール（Ficoll）、
2mg/mlポリビニルピロリジン、2mg/mlBSA、0.1％SDS及
び0.1mg/mlサルモン スペラム（Salmon Sperm）DNAの2
0ml中で軽く振盪しながら、68℃にて一夜保温した。溶
液を0.6M NaCl、0.06Mクエン酸３ナトリウム、2mg/ml
フィコール（Ficoll）、2mg/mlポリビニルピロリジン、
2mg/mlBSA、0.1％SDS及び10⁶cpm/mlプローブに替え、42
℃で一昼夜軽く振盪し、ハイブリダイゼーシヨンを行な
つた。

ハイブリダイゼーシヨンの終わつたフイルターを取り
出し、0.6M NaCl、0.06Mクエン酸ナトリウム、0.1％SD
Sにて室温で３回洗浄し、その後、60℃で同溶液にてフ
イルターのバツクグラウンドのカウントがGMサーベイメ
ーターで200cpmになるまで洗浄した。

フイルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線フイルム
（フジRX）に−70℃にて２日間オートラジオグラムを行
なつた。

フイルムを現像後、シグナル領域に存在するコロニー
をマスターフイルターよりかき取り、上記の方法を繰返
してポジテイブシグナルを有するコロニーの単離を行な
い、強いシグナルを有するクローンＩ−２を単離した。

−５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドpGIF−αのcDNAの
制限酵素地図を作製した。

その結果を第１図に示す。

第１図よりcDNA中には、Nco I（日本ジーン）、Hind
III（日本ジーン）、Pvu II（日本ジーン）及びAcc I
（日本ジーン）により切断される個所がそれぞれ１個所
ずつ存在し、５′末端よりその順序で之等制限酵素によ
る切断個所が存在していることが確認された。また、cD
NAの長さは、約1.5kbであり、分子量約18kdのIL−１を
充分にコードできることが判った。

次に、pGIF−αのcDNAの塩基配列を、マキサム−ギル
バートの化学修飾法及びM13フアージを用いるジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法にて決定した。その結果を次式
に示す。

上記図より、合成プローブと相補的な領域が５′末端
より312番目〜371番目に存在（図に下線を付して示す）
し、ヒトコドン使用頻度から導いた塩基配列に75％の相
同性を示した。

また、pGIF−αのcDNA中の最長のリーデイングフレー
ム（reading frame）を検索したところ、５′末端より5
7番目から771番目の領域である。

上記ヒトIL−１前駆体蛋白質をコードするcDNAを有す
るプラスミドpGIF−αは、これをエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）χ1776株に保有させ、該株を工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）に、「Escheric
hia coli χ1776/pGIF−α」なる名称で、微工研条寄第
948号（FERM BP−948）として寄託されている。

参考例２ ポリペプチドＩの製造 上記参考例１で得たプラスミドpGIF−αを、制限酵素
Acc I及びCla Iにより切断した後、約1.2キロベースペ
アー（kbp）のDNA断片をアガロースゲル電気泳動により
単離精製した。このDNA断片をDNAポリメラーゼＩ（クレ
ノー断片）を用いて、制限酵素Acc I及びCla I切断部分
を平滑末端とした。

一方BamH Iリンカー（５′_HOCGGATCCG_OH3′）の５′
末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、
これを先の平滑末端としたDNA断片に、T4DNAリガーゼを
用いて連結した後、制限酵素BamH Iで切断し、更に制限
酵素Msp Iで切断し、得られた反応物をアガロースゲル
電気泳動に付して、約540ベースペア（bp）のMsp I−Ba
mH I DNA断片を単離精製した。

次に、下記オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ）及び
（II）を以下のようにして合成した。

５′_HOCGATAATGGCTCCTGTACGTTCTCTGAACTGCACTCTC_OH3′
（Ｉ） ５′_HOCGGAGAGTGCAGTTCAGAGAACGTACAGGAGCCATTAT_OH3′
（II） 即ち、マクロポーラスシリカに結合した５′−Ｏ−ジ
メトキシトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド
（アプライド バイオシステムズ社製）を出発原料と
し、３′側より５′側へ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル
及びＮ−保護デオキシモノヌクレオチド−３′−ホスホ
アミダイトを縮合単位として、自動合成機（アプライド
バイオシステムズ社製、380A DNAシンセサイザー）
を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続いてチ
オフエノールを用いた処理による脱メチル化及び28％ア
ンモニアを用いた室温での処理により、シリカよりヌク
レオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチドを得
た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行なつた
〔Hunkapiller等、Nature,310,105（1984）〕。

次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオチドを28％
アンモニア水2mlで55℃で10時間処理してＮ−保護基を
脱離させ、５′−Ｏ−ジメトキシトリチルオリゴヌクレ
オチドを得た。この1/5量を用いて、ODS（山村化学研究
所社製）を担体とする逆相高速液体クロマトグラフイー
により精製後、80％酢酸150μで室温で20分間処理し
て粗オリゴヌクレオチドを得た。これをODSを担体とす
る逆相高速液体クロマトグラフイーにより更に精製し
て、目的とするオリゴヌクレオチドを得た。

上記で合成した合成オリゴデオキシヌクレオチド
（Ｉ）及び（II）の各５′末端を、T4ポリヌクレオチド
キナーゼによりリン酸化し、上記で得たMsp I−BamH I
DNA断片に、T4DNAリガーゼを用いて連結後、制限酵素
BamH I及びCla Iで切断し、得られた反応物をアガロー
スゲル電気泳動に付して、約580bpのCla I−BamH I DNA
断片を単離精製した。

他方、プラスミドpTMI〔今本文男，代謝,Vol.22,289
（1985）〕を、制限酵素BamH I及びCla Iで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動によりtrpプロモーター領域を含
む約4.4kbpのDNA断片を単離精製した。このDNA断片と、
先に調製した約580bpのCla I−BamH I DNA断片とを、T4
DNAリガーゼで連結して所望のポリペプチドＩ発現用プ
ラスミドp trpGIF−αを得た。

該プラスミドを、エシエリヒア・コリーHB101にトラ
ンスフオームさせ、目的のトランスフオーマントを、ボ
イリング法（boiling method）により得られるプラスミ
ドDNAの制限酵素分析により選択した〔T.Maniatis,E.F.
Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning,pp366,Col
d Spring Harfor Laboratory,（1982）〕。

以上の概略を第２図に示す。

また上記トランスフオーマントに組込まれたプラスミ
ドp trp GIF−αは、これをエシェリヒア・コリχ1776
にトランスフオームさせ、該形質転換体を、「Escheric
hia coliχ1776/p trp GIF−α」なる名称で1985年12月
12日に工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第949
号（FERM BP−949）として寄託した。

（２）形質転換体の培養 上記形質転換体（エシェリヒア・コリHB101/p trp GI
F−α）を、アンピシリン50μg/ml及びＬ−トリプトフ
アン20μg/mlを含むLB培地（１％トリプトン、0.5％酵
母エキス及び0.5％NaCl）10ml中で、37℃で一晩振盪培
養し、この1mlをアンピシリン50μg/ml及び１％カザミ
ノ酸を含むM9最小培地（0.6％Na₂HPO₄、0.3％KH₂PO₄、
0.05％NaCl、0.1％NH₄Cl、2mM MgSO₄、0.2％グルコー
ス及び0.1mM CaCl₂）50mlに植菌し、37℃で振盪培養
し、550nmでの吸光度（O.D.）が1.0となつた時点で菌体
を集め、15％シユークロース−50mMトリスHCl（pH8.0）
−50mM EDTA（pH8.0）の溶液5mlに懸濁させ、10mg/ml
リゾチーム〔10mMトリスHCl（pH8.0）で溶解した溶液〕
500μを加え、更に0.3％トリトンX100−187.5mM EDT
A（pH8.0）−150mMトリスHCl（pH8.0）の溶液5mlを加
え、室温で15分間放置後、更によく懸濁させ、遠心分離
によつてGIF活性を有する菌体抽出物上清を得た。

（３）ポリペプチドＩの精製 イオン交換クロマトグラフイー（CM−HPLC） 上記で得た菌体抽出物上清を50mM酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.5）で透析後、ギルソンハイパーフオーマンス
リキツド クロマトグラフイー システム（ギルソン
（Gilson）社製）によるイオン交換クロマトグラフイー
（CM−HPLC）にかけた。その条件は次の通りである。

カラム:IEX−535CM（6.0×150mm、東洋曹達社製） 溶離液:A液＝50mM酢酸ナトリウム（pH5.5、Ｂ液＝0.5M
NaCl含有50mM酢酸ナトリウム（pH5.5） 流速:0.5ml/分 フラクシヨン容積： リテンシヨンタイム ０〜60分…2ml/4分／チユーブ 60〜120分…0.5ml/分／チユーブ 120〜180分…2ml/4分／チユーブ 濃度勾配： 時間（分） ％Ｂ 0 0 40 0 120 20 140 100 165 100 170 0 逆相高速液体クロマトグラフイー 上記CM−HPLCで得たリテンシヨンタイム90〜91分の画
分を、次いで逆相高速液体クロマトグラフイーに付し
た。その条件は、次の通りである。

カラム:C₄ハイポアー逆相カラム（RP304）バイオ−ラド
社、直径4.6×250mm 溶離液:A液＝0.1％TFA、Ｂ液＝アセトニトリル:1％TFA
（9:1） 流速:1ml/分 チヤートスピード： リテンシヨンタイム ０〜50分…５分/cm 50〜80分…２分/cm 濃度勾配： 時間（分） ％Ｂ 0 0 5 0 15 20 75 45 80 100 85 100 90 0 フラクシヨン容積:2ml/2分／チユーブ リテンシヨンタイムが63.9〜65.3分に、GIF活性に一
致する単一の蛋白の吸光度ピークを示す目的のポリペプ
チドＩが得られた。

得られたポリペプチドＩは、IL−１活性を有し、その
比活性は、GIF活性として2.7×10⁷単位/mg蛋白であっ
た。

（４）ポリペプチドＩの同定 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE） Laemmli,U.K.の方法〔Nature,277,680（1970）〕に従
い、上記（３）で得たポリペプチドＩのSDS−PAGEを行
なつた。その条件は次の通りである。

試料：上記逆相高速液体クロマトグラフイーににおける
ポリペプチドＩ画分を乾固した後、ラエメリーのサンプ
ル バツフアー〔1/20体積の２−メルカプトエタノール
を含む（2ME⁺）又は含まない（2ME^-）〕に溶解し、100
℃で４分間処理した。

ゲル：厚さ1.5mmの15％ポリアクリルアミドゲルを使用
した。

電気泳動装置：バイオ−ラド（Bio−Rad）社製プロテア
ンを用いた。

泳動条件:40mAの定電流で２時間泳動させた。

泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバースタインキ
ツト（Silver stain kit）を用いて染色した。その結
果、ポリペプチドＩは2ME⁺下においては約17Kの位置
に、また2ME^-下においては約17.5Kの位置にそれぞれ単
一のバンドとして泳動された。

等電点電気泳動法（IEF） ポリペプチドＩの等電点電気泳動を、pH範囲3.5〜9.5
のアンフオラインPAGプレート（LKB社製）及びモデル14
15（バイオ−ラド社製）を用いて行なつた。その条件は
次の通りである。

試料：前記（３）で得たポリペプチドＩの0.037μｇ、
0.074μｇ及び0.74μｇの各々、及び以下のマーカープ
ロテイン（p Iマーカープロテイン）の計４レーンを使
用した。

〈マーカープロテイン〉 アミログルコシダーゼ（3.50）、 大豆トリプシンインヒビター（4.55）、 β−ラクトグロブリンＡ（5.20）、 ウシ カルボニツク アンヒドラーゼ（bovine carbo
nic anhydrase）Ｂ（5.85）、 ヒト カルボニツク アンヒドラーゼ（human carbon
ic anhydrase）Ｂ（6.55）、 ウマ ミオグロビン−アシデイツクバンド（horse my
oglobin−acidic band）（6.85） ウマ ミオグロビン−ベイシツクバンド（horse myog
lobin−basic band）（7.35）、 レンチル レクチン−アシデイツクバンド（lentil l
ectin−acidic band）（8.15）、 レンチル レクチン−ミドルバンド（lentil lectin
−middle band）（8.45）、 レンチル レクチン−ベイシツクバンド（lentil lec
tin−basic band）（8.65）及び トリプシノーゲン（9.30）。

電極液：陽極液＝1M H₃PO₄ 陰極液＝1M NaOH 泳動条件：定電力1W/cmゲル幅で90分間冷却下（10℃）
に泳動させた。

染色：染色は、シルバー スタイン キツトで行なつ
た。

上記泳動後、ゲルを1cm間隔でスライスし、蒸留水1ml
にて振盪抽出（２日）４、pHを測定し、等電点を算出し
た。

その結果、ポリペプチドＩの等電点（p I）は6.8±0.
1であり、この位置に単一のバンドとして泳動された。

アミノ酸組成比 上記（３）の逆相高速液体クロマトグラフイーにより
得られたポリペプチドＩ画分の30μを、12mm×120mm
のパイレツクス製肉厚硬質試験管の底部に注意深く入
れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターにて減圧
乾燥した。乾燥試料の入つた試験管に4N−メタンスルホ
ン酸〔0.2％の３−（２−アミノエチル）インドール含
有、ピアース（Pierce）社製〕50μを加え、0.1〜0.2
mmHgで１分間脱気後、減圧封管した。加水分解は118℃
のヒーター中で24時間を要して行なつた。開管後、4N−
水酸化ナトリウム46μで中和し、希釈用クエン酸緩衝
液で450μとした。

アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作所
製、日立835型分析計）を用い、上記試料溶液250μを
注入して行なつた。分離されたアミノ酸は、オルトフタ
ルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の前後に
分析した標準アミノ酸で作成した検量線によつて行なつ
た。

その結果を、Pheを基準（９モル）として、各アミノ
酸の含有モル比で下記第１表に示す。尚、上記分析条件
下においては、Pro及びCysは測定できない。またSer、T
hr及びMetについては、上記分析条件下での回収率
を（）中に示した。

第 １ 表 アミノ酸 モル比 Asp及び／又はAsn 17.1 Ser 10.9（80％） Thr 5.4（90％） Glu及び／又はGln 23.8 Gly 8.3 Ala 5.0 Val 10.8 Met 5.5（90％） Ile 4.9 Leu 15.1 Tyr 3.9 Phe （９） Lys 14.9 His 0.9 Trp 0.8 Arg 3.0 アミノ酸配列 上記（３）の逆相高速クロマトグラフイーで得たポリ
ペプチドＩ画分の150μを、アプライドバイオシステ
ム社製プロテインシークエンサーにて分析した。生じた
PTH−アミノ酸を、33％アセトニトリル水溶液100〜50μ
にて適宜希釈し、その５μをウオーターズ710B型オ
ートサンプラーにて注入した。クロマトグラフイーのシ
ステムは、ベツクマン112型ポンプ２台を、421型コント
ローラーで作働させた。カラムはウルトラスフエアーOD
S−５μｍの充填された2mm×250mmを用い、カラムヒー
ターにて55℃に保つた。流速は0.3ml/分とし、20mM酢酸
ナトリウムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジ
エント溶出法で分離し、269nmでモニターした。分析は4
5分とした。

20サイクルの分析の結果、前記（３）で得たポリペプ
チドＩのＮ末端20個のアミノ酸配列は、以下のものであ
ると認められた。

Ala−Pro−Val−Arg−Ser−Leu−Asn− Cys−Thr−Leu−Arg−Asp−Ser−Gln− Gln−Lys−Ser−Leu−Val−Met− 尚、Serは副生物の一つで確認し、更に322nmに吸収を
示すデヒドロ体としての確認も行なつた。サイクル８で
は副生物のピークからCysであると推定し、更に元の試
料をカルボキサミドメチル化した後の分析でCysと確認
した。

また、ポリペプチドＩをトリプシンで消化して得たペ
プチド断片につき、それらのアミノ酸組成を分析し、Ｃ
端部ペプチドも欠損することなく、正確に含まれている
ことを確認した。

即ち、ポリペプチドＩ 60μｇを１％炭酸水素アンモ
ニウム600μに溶解し、該溶液に、予め１％炭酸水素
アンモニウムに溶解させたトリプシン（0.2mg/ml、クー
パー社製）溶液の20μを加え、37℃で24時間放置して
トリプシン切断ペプチドを得た。このペプチド混合物
を、逆相HPLC〔Ｃ−18,300Å,4.6×150mm;0.1％TFAをＡ
液及び１％TFA1/10容を含むアセトニトリルをＢ液とし
て、該Ｂ液を１％/3分の割合で増加させるプログラムに
より溶出させる〕に付し、Ｂ液が40％までで全ての成分
を単離した。之等のペプチドをアミノ酸分析に供した。
このアミノ酸組成から予想される全てのペプチド断片が
同定でき、特にＣ端部ペプチドについては、塩基性アミ
ノ酸が含まれておらず、そのアミノ酸組成の結果は、予
想されるアミノ酸を正確に含んでいたことから、前記
（３）で得られたポリペプチドＩのＣ端部は、予想され
た通りに正確であることが確認された。

また、各ペプチド断片につき、上記と同様にしてそれ
らのアミノ酸配列を分析した。その結果、確認された配
列は全てIL−１βに一致した。確認されたペプチド断片
につき、之等をIL−１βのアミノ酸番号により次に示
す。

〈確認されたペプチド断片（アミノ酸番号）〉 １〜４、５〜11、12〜16、 17〜27、28〜63、64〜65、 66〜74、75〜88、89〜92、 95〜98、99〜103、104〜109、 110〜138、139〜153 以上の結果から、前記（３）で得たポリペプチドＩ
は、前記定義の配列で特定されるポリペプチドＩである
ことが確認された。尚、ポリペプチドＩの分子量の計算
値は、17376.59である。

実施例１ 本発明IL−１β誘導体の製造 ポリペプチドVIの製造 上記参考例２で得たp trp GIF−αを利用して、サイ
ト−スペシフイツク ミユータジエネシス（Site−Spec
ific Mutagenesis）〔Proc.Nat.Acad.Sci.,81,5662−56
66（1984）〕の方法に従い、IL−１β（ポリペプチド
Ｉ）のアミノ末端から71番目のCysをSerに変更したポリ
ペプチドVIを以下の通り製造した。

即ち、M13mp11フアージベクターを、一本鎖（ss）DNA
鋳型として用いた。まず、プラスミドp trp GIF−αよ
り、EcoR I/BamH I DNAフラグメントを切り出し、M13mp
11フアージ（RF）のEcoR IとBamH Iの制限酵素サイトに
クローニングし、これから一本鎖（ss）DAN（M13−GIF
−α）を得、これをミユータジエネシスの鋳型とした。

合成オリゴヌクレオチド（５′−CTGTCCTCAGTGTTG−
３′（プライマー）〕を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化し、これをssM13−GIF−α DNAとハイブリ
ダイズし、アニーリング後、dNTPsの存在下、DNAポリメ
ラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びT4DNAリガーゼ
で各々処理し、15℃で18時間インキユベートした。

得られたDNAをJM105コンピテント細胞にトランスフオ
ームし、生じたコロニーを、寒天プレート上に50コロニ
ー植菌し、37℃で18時間培養した。生育したコロニーを
含むフイルターを通常の方法によりアルカリ変性し、乾
燥後、80℃で２時間ベーキング処理を行なった。このフ
イルターをプレハイブリダイズした後、このものと、上
記プライマーの５′末端を³²P−ｒ−ATPでラベルした³²
P−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズさせたフイルターを、６×SSCバッフアー
で、室温で10分間、次いで37℃で10分間各々洗浄し、乾
燥後、−70℃で18時間オートラジオグラフイーを行なつ
た。

変異した５クローンの内から代表としてM13−GIF−α
−71Sを選びこれをJM105に感染させて培養し、ssDNA及
びFR DNAを調製した。

上記で得たssDNAのM13ジデオキシチェイン ターミネ
ーション シークエンシングにより目的の遺伝子の変異
の確認を行なった。

また上記RF DNAにおいて、新しくできた制限酵素Dde
Iサイトも確認できた。

JM105で増殖させたRF DNAより、EcoR I/BamH Iフラ
グメントを調製し、これを前記（１）と同様にして発現
プラスミドに組込み、所望のポリペプチドVI発現プラス
ミド（p trp GIF−α−71S）を得た。

該プラスミドは、これをエシエリヒア・コリHB101に
保有させ、該株は微工研に「Esherichia coli HB101/p
trp GIF−α−71S」なる名称で微工研寄第1296号（FERM
BP 1296）として寄託されている。

このプラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様に
して、菌体抽出物上清を得、該上清のGIF活性を測定し
た。その結果、培養液1ml当りのGIF活性（単位/ml培養
液）は、エシェリヒア・コリHB101を宿主として2.4×10
⁶であつた。

これより、参考例２−（３）と同一の手段により、目
的のポリペプチドVIを単離、精製した。

ポリペプチドIVの製造 プラスミドp trp GIF−αを利用して上記と同様に
して、ポリペプチドIVを製造した。

即ち、M13mp11フアージベクターを、一本鎖（ss）DNA
鋳型として用いた。まずプラスミドp trp GIF−αよ
り、EcoR I/BamH I DNAフラグメントを切り出し、M13mp
11フアージ（RF）のEcoR IとBamH Iの制限酵素サイトに
クローニングし、これから一本鎖（ss）DNA（M13−GIF
−α）を得、これをミュータジェネシスの鋳型とした。

合成オリゴヌクレオチド〔５′−CTGAACTCGACTCTC−
３′（プライマー）〕を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
でリン酸化し、これをssM13−GIF−α DNAとハイブリ
ダイズし、アニーリング後、dNTPsの存在下、DNAポリメ
ラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びT4DNAリガーゼ
で各々処理し、15℃で18時間インキユベートした。

得られたDNAをJM105コンピテント細胞にトランスフオ
ームし、生じたコロニーを、寒天プレート上に100コロ
ニー植菌し、37℃で18時間培養した。生育したコロニー
を含むフイルターを通常の方法によりアルカリ変性し、
乾燥後、80℃で２時間ベーキング処理を行なった。この
フイルターをプレハイブリダイズした後、このものと、
上記プライマーの５′末端を、³²P−ｒ−ATPでラベルし
た³²P−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたフイルターを、６×SSCバッフア
ーで、室温で10分間、次いで37℃で10分間各々洗浄し、
乾燥後、−70℃で18時間オートラジオグラフイーを行な
った。

変異した４クローンの内から代表としてM13−GIF−α
−8Sを選びこれをJM105に感染させて培養し、ssDNA及び
RF DNAを調製した。

上記で得たssDNAのM13ジデオキシチェイン ターミネ
ーシヨン シークエンシングにより目的の遺伝子の変異
の確認を行なった。

また上記RF DNAにおいて、新しくできた制限酵素Hin
f Iサイトも確認できた。

JM105で増殖させたRF DNAより、EcoR I/BamH Iフラ
グメントを調製し、これを参考例２−（１）と同様にし
て発現プラスミドに組込み、所望のポリペプチドIV発現
プラスミド（p trp GIF−α−8S）を得た。

このプラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様に
して、菌体抽出物上清を得た。該上清のGIF活性は、宿
主してエシェリヒア・コリHB101を用いた場合、1.2×10
⁵単位/ml培養液であり、エシェリヒア・コリW3110を用
いた場合、6.2×10⁵単位/ml培養液であつた。

上記上清より、参考例２−（３）と同一の手段によ
り、目的のポリペプチドVIを単離、精製した。

ポリペプチドＶの製造 上記及びで得たプラスミドp trp GIF−α−71S及
びp trp GIF−α−8Sの各々を、制限酵素EcoR I及びHin
d IIIで切断後、p trp GIF−α−8Sから約400bpのDNAフ
ラグメントを、またp trp GIF−α−71Sから約4600bpの
DNAフラグメントをそれぞれ取り出し、両者をライゲー
シヨンして、IL−１β（ポリペプチドＩ）のＮ末端から
８番目及び71番目のCysをいずれもSerに変更させた所望
のポリペプチドＶの発現用プラスミドp trp GIF−α−8
S71Sを得た。

このプラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様に
して、菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリHB101を宿
主とする場合はGIF活性として1.4×10⁴単位/ml培養液、
またエシェリヒア・コリW3110を宿主とする場合はGIF活
性として５×10⁵単位/ml培養液）を得、これより参考例
２−（３）と同一の手段により、目的のポリペプチドＶ
を単離、精製した。

ポリペプチドIIの製造 上記と同様にして、５′−GCTCCTGTAGGTTCTCTG−
３′をプライマーとして用いることにより、ポリペプチ
ドII発現用プラスミドp trp GIF−α−4Gを得た。

該プラスミドは、これをエシエリヒア・コリHB101に
保有させ、該株は微工研に「Esherichia coli HB101/p
trp GIF−α−4G」なる名称で微工研寄第1297号（FERM
BP 1297）として寄託されている。

該プラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様にし
て菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリHB101を宿主と
して、GIF活性として2.8×10⁵単位/ml培養液）を得、こ
れより参考例２−（３）と同一の手段により、目的のポ
リペプチドIIを単離、精製した。

この精製操作において、SP−HPLCの主ピークの前半部
の再クロマトグラフイーによりポリペプチドXXXXVIIIを
精製品として得た。ポリペプチドXXXXVIIIは、ポリペプ
チドIIと同程度のCSF産生促進活性を有し、同様に、GIF
活性、LAF活性及びPGE産生促進活性がいずれも低い特徴
を示した。

ポリペプチドIIIの製造 上記と同様にして、５′−GCACTCTCCAGGACTCACA−
３′をプライマーとして用いることにより、ポリペプチ
ドIII発現用プラスミドp trp GIF−α−11Qを得た。

該プラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様にし
て菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリHB101を宿主と
して、GIF活性として2.8×10⁶単位/ml培養液）を得、こ
れより参考例２−（３）と同一の手段により、目的のポ
リペプチドIIIを単離、精製した。

ポリペプチドVIIの製造 上記と同様にして、５′−TCTTCAACTAGATAGAA−
３′をプライマーとして用いることにより、ポリペプチ
ドVII発現用プラスミドp trp GIF−α−102CTを得た。

該プラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様にし
て菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリHB101を宿主と
して、GIF活性として7.4×10⁴単位/ml培養液）を得、こ
れより参考例２−（３）と同一の手段により、目的のポ
リペプチドVIIを単離、精製した。

ポリペプチドVIIIの製造 上記と同様にして、５′−AAAGGCGGCTAGGATATAA−
３′をプライマーとして用いることにより、ポリペプチ
ドVIII発現用プラスミドp trp GIF−α−140CTを得た。

該プラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様にし
て、エシェリヒア・コリW3110を宿主として用いること
により、菌体抽出物上清（GIF活性として5.8×10³単位/
ml培養液）を得、これより参考例２−（３）と同一の手
段により、目的のポリペプチドVIIIの単離、精製した。

また、上記プラスミドp trp GIF−α−140CTを、エシ
ェリヒア・コリHB101を宿主として発現させることによ
つて、同様に菌体抽出物上清（GIF活性として1.3×10⁶
単位/ml培養液）が得られ、これより上記と同様にして
ポリペプチドＩが単離、精製された。

尚、上記において、エシェリヒア・コリHB101を宿主
とする場合には、ナンセンスサプレツサーとしてSupEが
働き、UAGの終止コドンがGlnとして読まれて（read thr
oughされて）ポリペプチドＩが発現される。一方宿主を
エシェリヒア・コリW3110とする場合には、SupE遺伝子
がコードされていないため、上記UAGが終止コドンとし
て働き、140個のアミノ酸配列からなるポリペプチドVII
Iが発現される。

ポリペプチドＩ〜VIIIの同定 前記〜で得られた本発明のIL−１β誘導体（ポリ
ペプチドＩ〜VIII）につき、参考例２−（４）と同様に
してSDS−PAGE（18％ポリアクリルアミドゲル、2ME⁺）
を行なった。

その結果、ポリペプチドＩ〜ポリペプチドVIIは、い
ずれも約17.5kdの位置に、またポリペプチドVIIIは約16
kdの位置に、それぞれ単一のバンドとして泳動された。

また、ポリペプチドＩのGIF活性に対する中和抗血清
（参考例２−（３）で得たポリペプチドＩを通常の方法
に従い、家兎に免疫して作製した抗血清、以下同じ）を
用いたウエスタンブロツテイング〔Western blotting,P
roc.Natl.Acad.Sci.,USA,76,1420（1979）〕により、ポ
リペプチドＩ〜ポリペプチドVIIIの各々を、相当する位
置に単一のバンドとして確認した。

実施例２ 参考例２−（１）で得た形質転換体（エシエリヒア
・コリHB101/p trp GIF−α）を、アンピシリン50μg/m
l及びＬ−トリプトフアン20μg/mlを含むLB培地400ml中
で、37℃で一晩培養し、この400mlを１％カザミノ酸を
含むM9最小培地20に植菌し、37℃で8.5時間培養し
た。

遠心分離により集菌し、得られる菌体を1M Na₂HPO₄
に懸濁させ、一夜冷室に放置した後、10mMトリスHCl緩
衝液（pH8.0）に対して２日間透析した。

得られた透析液を遠心分離（10000rpm、30分間）して
上清を得た。

大腸菌培養液300分に相当する上記上清を集め、こ
れを100mM酢酸でpH5.0に調製した後、SP−ゼータプレツ
プ250カートリツジ〔LKB社製〕に付し、流速30ml/分で
始め、10mM酢酸ナトリウム（pH5.3）で100分、続いて0.
1M NaClを含む50mM酢酸ナトリウム（pH5.5）で220分、
更に1M NaClを含む50mM酢酸ナトリウム（pH5.5）でそ
れぞれ溶出させた。各分画をHPLCによりチェックし、目
的物の含まれているフラクシヨン、即ち0.1M NaClを含
む50mM酢酸ナトリウム（pH5.5）のフラクション（フラ
クションNo.8〜10）を集めた。

これを100mM酢酸でpH4.5とした後、HPLC〔東洋曹達株
式会社製、TSKゲルSP−5PW、5.5×20cm〕に付し、下記
条件で溶出させて、リテンションタイム（r.t.）65〜72
分の分画を採取した。

溶離液A:50mM 酢酸ナトリウム（pH5.5） 溶離液B:0.5M NaCl含有50mM酢酸ナトリウム（pH5.5） 流速:30ml/分 濃度勾配： 時間（分） ％Ｂ 0 0 30 0 84 9 104 100 124 100 134 0 180 0 かくしてポリペプチドＩの精製品を得た。

これを、限外過（YM−５メンブラン）により、20mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）の溶液組成となるよ
うに緩衝液を交換しつつ、濃縮（20mg/ml）した。

更に、ポジタインフイルターNFZ（日本ポール社製）
を装着した過装置に、上記濃縮液を供して滅菌過し
た後、パイロジエンが100pg/mg蛋白以下の精製品を得
た。

上記精製法により、大腸菌培養液300より、ポリペ
プチドＩの約3gを収得した。

上記のHPLC（SP−5PW）の溶出において、メイン
ピークの前半のフラクション（r.t.64〜65分）を採取
し、これを再度クロマトグラフイーに付すことにより、
ポリペプチドＸを得た。2.7×10⁶GIF単位/mg蛋白。

また同様に、メインピークの後半のフラクション（r.
t.72〜76分）より、ポリペプチドXIを得た。2.8×10⁷GI
F単位/mg蛋白。

上記及びで得られたポリペプチドＩ、Ｘ及びXI
のアミノ酸分析を、参考例２−（４）と同様にして行な
った。結果を下記第２表に示す。

またポリペプチドＸ及びXIについては、参考例２−
（４）におけるアミノ酸配列分析と同様にして、それら
のＮ末端部配列を確認、同定した。

ポリペプチドＩは、分子内に２個のCys（８位及び7
1位）を有している。之等Cysの側鎖SH基の存在状態を、
下記方法により調べた。

a.参考例２−（３）で得たポリペプチドＩの約５ナノモ
ル相当（0.1M NaClを含有する50mM酢酸ナトリウム（pH
5.5）溶液100μ）を、Ａ、Ｂ及びＣの３本の試験管に
それぞれ分取し、各試験管に0.1MトリスHCl（pH8.45）
を含有させた6Mグアニジン塩酸溶液各300μを加え
た。

次に試験管Ａ及びＢには、6Mグアニジン塩酸溶液25μ
を加えてブランクとし、試験管Ｃには還元剤であるジ
チオスレイトール２μモルを含む6Mグアニジン塩酸溶液
25μを加え、各試験管に１分間窒素ガスを吹込んだ
後、50℃で２時間放置した。

次いで、試験管Ａには、ブランクとして、6Mグアニジ
ン塩酸溶液25μを、試験管Ｂ及びＣにはヨードアセト
アミド４μモルを含む6Mグアニジン塩酸溶液25μモルを
加え、各試験管に１分間窒素ガスを吹込んだ後、暗所で
25℃下に30分間放置した。

上記の通り処理した試験管Ａ、Ｂ及びＣに、それぞれ
10％TFA5μを加え、逆相HPLC（C₃）により蛋白質を精
製した。

精製蛋白質の約1/10量を試験管に取り、乾燥後、4N−
メタンスルホン酸にて加水分解し、アミノ酸組成を調べ
た。

その結果、試験管Ｂ及びＣからは、カルボキシメチル
システインが、ほぼ同量検出された。このことから、試
験管ＡではポリペプチドＩはそのままの状態であるのに
対し、試験管Ｂ及びＣでは、Ｓ−カルボキサミドメチル
化−ポリペプチドＩに変化したことが確認でき（試験管
Ｂは還元剤にさらしていないので）、従ってポリペプチ
ドＩに含まれるCysは、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を
形成していないことが判った。

更に、上記試験管Ａ、Ｂ及びＣ中の生成物の残量
（％）を乾燥後、これらにそれぞれ１％重炭酸アンモニ
ウム溶液600μを加えて溶解させて、各々１μ/5μ
濃度に調製した。之等各液にトリプシン溶液7.5μ
をそれぞれ加え、37℃で20時間酵素消化を行なった。そ
の後、各液に10％TFA10μを加え、酵素反応を停止さ
せ、逆相HPLC（C₁₈）にて、ペプチド断片を分離した。

その結果、試験管Ｂ及びＣはほぼ同じパターンを示
し、試験管Ａは之等とは異なるパターンを示した。

上記で単離した各ペプチドのアミノ酸組成を、前記と
同様にして求めた結果、試験管Ａのペプチド断片から、
Cysを含まなければ生じないポプチドの存在を確認し
た。

以上の結果から、ポリペプチドＩのCys残基は、分内
及び分子間のいずれでもジスルフィド結合を形成してい
ないことが確認された。

b.エルマン法〔Ellman法、Arch.Biochem.Biophys.,82,7
0（1959）〕に従い、以下のごとくしてポリペプチドＩ
のSH基の定量を行なった。

即ち、参考例２−（３）で得たポリペプチドＩの200
μｇ（11.5ナノモル）を、6M塩酸グアニジン及び10mM
EDTAを含む0.1MトリスHCl緩衝液（pH8.0）1mlに溶解さ
せた。一方、新鮮な0.01M DTNB［5,5′−ジチオビス
（２−ニトロベンゾイック アシッド］を含む0.05Mリ
ン酸緩衝液（pH7.0）（以下これを「エルマン試薬」と
いう）を調製した。

対照セルに6N塩酸グアニジン及び10mM EDTAを含む0.
1MトリスHCl緩衝液（pH8.0）1mlを、また試料セルにポ
リペプチドＩを含む上記溶液1mlをそれぞれ導入し、そ
の各々にエルマン試薬各40μを加えて混合し、直ちに
412nmにおけ吸光度を測定した。最大吸光度になった
後、DTNBの分解による吸光度の減少を「０」に補正し
て、SH基の濃度を決定した。

その結果、実際に得られた412nmでの吸光度は0.328で
あった。

一方、6M塩酸グアニジンを含む水溶液中での３−カル
ボキシレート−４−ニトロチオフエノレート（３−calb
oxylate−４−nitrothio−phenolate）イオンのε
₄₁₂は、13880M^-1・cm^-1であり〔Eur.J.Biochem.,30,32
（1972）〕、このことより、ポリペプチドＩ溶液のSH基
は、0.0000245（M/）であり、ポリペプチドＩの11.5
ナノモル中にSH基が24.5ナノモル存在することとなるこ
とが判った。

上記より、ポリペプチドＩに含まれるCysは、共に遊
離のSH基を有していることが確認された。

尚、ポリペプチドＩを水又はPBS（−）に溶解し、凍
結乾燥を３〜４回繰返した場合においても、GIF活性及
び上記エルマン法によるSH基の定量値には、殆んど変化
は認められなかった。

遺伝子組換え技術に従い、大腸菌等で多量に異種蛋
白質を発現させる場合、その蛋白質は大腸菌の菌体中い
不溶性物質（inclusion body）として蓄積されることが
多く、このような場合には、目的蛋白質を菌体から採取
するに当って、例えば7M塩酸グアニジン、8M尿素又は0.
1％SDS等の変性剤を使用する過激な条件下での処理が必
要となる。しかるに、この様な処理によれば、目的蛋白
質は、その高次構造を含めて、不可逆的な損傷を受ける
おそれが多分にある。従って、できる限り上記の如き変
性剤を使用することなく、温和な条件下で目的蛋白質を
単離抽出できることが、上記遺伝子組換え技術上の重要
な関心事である。しかして、前記したに示す方法によ
れば、目的蛋白質の抽出単離を、浸透圧ショックという
非常に温和な条件の採用により行なうことができ、この
点で該方法は極めて好ましい。また該方法に従い得られ
る目的蛋白質は、より天然に近い高次構造を保持されて
おり、この点からも望ましいものである。

実施例１−に準じて、プラスミドp trp GIF−α
を利用したサイト−スペシフィックミュータジェネシス
により、下記３表に示す各ポリペプチド（本発明IL−１
β誘導体）を得た。尚、各ポリペプチドの発現、GIF活
性の測定及び精製は、上記に従うものであり、SDS−P
AGEは参考例２−（４）に示す方法に準じた。以下の各
例でも特筆しない限り同様である。

実施例１−で得たプラスミドp trp GIF−α−102
CTを用いて、宿主をエシェリヒア・コリW3110として、
同様に発現及び精製して本発明IL−β誘導体であるポリ
ペプチドXXXを得た。約11.4kd（SDS−PAGEによる、以下
同じ）。

プラスミドp trp GIF−α−4Gを利用し、プライマ
ーとして５′−GCACTCTCCAGGACTCACA−３′を用いて、
上記と同様にしてポリペプチドXIV発現用プラスミドp
trp GIF−α−4G11Qを得た。該プラスミドを用いて、
エシェリヒア・コリHB101を宿主として、同様に発現
（2.7×10⁵GIF単位/ml培養液）及び精製して、本発明IL
−１β誘導体であるポリペプチドXIVを得た。

約17.5kd。

実施例１−に準じて、プラスミドp trp GIF−α
−4G及びp trp GIF−α−98Lを用いて、ポリペプチドXV
発現用プラスミドp trp GIF−α−4G98Lを得た。

即ち、上記両プラスミドを制限酵素EcoR I及びHind I
IIで切断後、p trp GIF−α−4Gから約400bpのDNAフラ
グメントを、またp trp GIF−α−98Lから約4.6kbpのDN
Aフラグメントをそれぞれ取り出し、両者をライゲーシ
ョンさせた。

プラスミドp trp GIF−α−4G98Lを用いて、エシェリ
ヒア・コリW3110を宿主として同様に発現及び精製して
本発明IL−１β誘導体であるポリペプチドXVを得た。約
17.5kd。

上記において、プラスミドp trp GIF−α−4Gの
代りにプラスミドp trp GIF−α−11Q（その約400bpのD
NAフラグメントを使用）を用いて、同様にしてポリペプ
チドXVI発現用プラスミドp trp GIF−α−11Q98Lを得
た。該プラスミドを用い同様にして本発明IL−１β誘導
体であるポリペプチドXVIを得た。約17.5kd。

上記において、プラスミドp trp GIF−α−4Gの
代りにプラスミドp trp GIF−α−4G11Qを用いて、該プ
ラスミドからの約400bpのDNAフラグメントを使用して、
同様にしてポリペプチドXIII発現用プラスミドp trp GI
F−α−4G11Q98Lを得た。該プラスミドを用い同様にし
て本発明IL−１β誘導体であるポリペプチドXIIIを得
た。約17.5kd。

実施例１−に準じて、プラスミドp trp GIF−α
−8A及びp trp GIF−α−71Sを用いて、ポリペプチドXX
XVI発現用プラスミドp trp GIF−α−8A71Sを得た。

即ち、上記両プラスミドを制限酵素EcoR I及びHind I
IIで切断後、p trp GIF−α−8Aから約400bpのDNAフラ
グメントを、またp trp GIF−α−71Sから約4.6kbpのDN
Aフラグメントをそれぞれ取り出し、両者をライゲーシ
ョンさせた。

プラスミドp trp GIF−α−8A71Sを用い、エシェリヒ
ア・コリHB101を宿主として同様に発現（8.7×10⁵GIF単
位/ml培養液）及び精製して本発明IL−１β誘導体であ
るポリペプチドXXXVIを得た。約17.5kd。

上記において、プラスミドp trp GIF−α−71Sの
代りにプラスミドp trp GIF−α−71A（その約4.6kbpの
DNAフラグメントを使用）を用い、同様にしてポリペプ
チドXXXVII発現用プラスミドp trp GIF−α−8A71Aを得
た。該プラスミドを保有するエシエリヒア・コリHB101
は微工研に「Escherihia coli HB101/ptrp GIF−α−8A
71A」なる名称で微工条研第1298号（FERM BP 1298）
として寄託されている。該プラスミドを用い同様に発現
（1.6×10⁶GIF単位/ml培養液）及び精製して本発明IL−
１β誘導体であるポリペプチドXXXVIIを得た。約17.5k
d。

上記において、プラスミドp trp GIF−α−71Sの
代りにプラスミドp trp GIF−α−71Vを用いて、該プラ
スミドからの約4.6kbpのDNAフラグメントを使用し、同
様にしてポリペプチドXXXVIII発現用プラスミドp trp G
IF−α−8A71Vを得た。該プラスミドを用いて同様に発
現（2.1×10⁶GIF単位/ml培養液）及び精製して本発明IL
−１β誘導体であるポリペプチドXXXVIIIを得た。約17.
5kd。

上記の方法に従い、実施例１−〜及び後記実
施例３−〜の各々で得られた形質転換体より、本発
明IL−１β誘導体であるポリペプチドII〜VIII及びXXXI
〜XXXIVを製造した。

之等はいずれもSDS−PAGEで単一のバンドとして泳動
された。またポリペプチドII〜VIIIは、前記と同一の位
置に泳動され、ポリペプチドXXXI〜XXXIVは、下記の通
りであった。

ポリペプチドXXXI 約22kd ポリペプチドXXXII 約23kd ポリペプチドXXXIII 約27kd ポリペプチドXXXIV 約31kd 実施例３ U937細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫U937細胞（Ascenso,J.L.et al.,B
lood,Vol.57,p170（1981）〕1.4×10⁹個を、12−０−テ
トラデカノイルホルボール−13−アセテート（TPA）
（フアルマシア社製）25ng/ml、コンカナバリンＡ（Con
A）（シグマ社製）10μg/ml及び10％牛胎児血清（FCS）
を含むRPMI−1640培地に入れて、４×10⁵個/mlの濃度の
細胞浮遊液を調製した。

この細胞浮遊液10mlずつを、直径9cmのシヤーレー
（フアルコン3003）に分注し、５％炭酸ガス中、37℃で
３日間培養後、培養上清をアスピレーターにて除去し、
10％FCS、細菌リポポリサツカライド（LPS）（デイフコ
社製）10μg/ml、ムラミルジペプチド（MDP）（和光純
薬社製）１μg/ml及びTPA1ng/mlを含むRPMI−1640培地1
0mlを、各シヤーレーに分注した。この培地にて５％炭
酸ガス中、37℃で18時間培養し、シヤーレ底部に付着し
たU937細胞をmRNA調製用の材料として利用した。

mRNAの調製 RNAの抽出は、グアニジニウム／熱フエノール（guani
dium/hot phenol）法〔Feramisco,J.R,et al.,J.Biol.C
hem.,Vol.257,p11024（1982）;Maniatis,T.,Fritsch,E.
F.and Sambrook,J.,（1982）,Molecular Cloning:A Lab
oratory Manual,pp.194−195,Cold Spring Harbor Labo
ratory,Cold Spring Harbor,New York〕とグアニジニウ
ム／セシウムクロライド（guanidinium/cesium chlorid
e）法〔Glisin,V.et al.,Biochemistry,Vol.13,p2633 1
974）;Chirgwin,J.H.et al.,（1979）,Biochemistry,1
8,5294−5299〕との組合せにより行なった。

上記で培養したU937細胞を洗浄するために、培養上
清を除去した後、各シヤーレを5mlのPBS（−）溶液にて
すすぎ、その後、各シヤーレに1mlの4M−グアニジン・
イソチオシアネート混合液〔4M−グアニジンイソチオシ
アネート（Fluka社製）、50mMトリスHCl（pH7.6）、10m
M EDTA、２％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム〕
を添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバーポリスマ
ンとパスツールピペツトにて回収して、細胞溶解液420m
lを得た。この溶解液を60℃に保ち、18G注射針に通過さ
せることにより、染色体DNAをせん断し、その後60℃に
保温したフエノールを等量加え、18G注射針にて更に溶
液を混合し、せん断した。次いでこの混合液に0.1M酢酸
ナトリウム−10mMトリスHCl（pH7.4）−1mM EDTA液210
mlとクロロホルム−イソアミルアルコール（24:1容積
比）混液420mlとを加え、60℃に保温しながら、15分間
激しく攪拌した。混合液を氷冷後、3000rpm、４℃で20
分間遠心し、水層を回収した。水層に２容のエタノール
を加え、−70℃にて一夜放置後、粗RNA沈澱を得た。該
粗RNAを、6Mグアニジン・イソチオシアナート−5mMクエ
ン酸ナトリウム（pH7.0）−0.1Mβ−メルカプトエタノ
ール−0.5％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム液48m
lに溶解させ、塩化セシウム19.2gを添加して溶解させ
た。次にこの混合液7mlずつを、5.7M塩化セシウム−0.1
M EDTA（pH7.5）の4mlに重層し、ベツクマンSW40Tiロ
ーターにて、25℃、31500rpmで20時間遠心して、RNAを
分取した。

かくして得られたRNA量は9.7mgであつた。

次に上記で得られたRNAからmRNAを取得するため、オ
リゴ（dT）−セルロース（コラボレイテイブ リサーチ
（Collaborative Research,Inc.社製）を用いて、カラ
ムクロマトグラフイーを行なった。吸着は10mMトリスHC
l（pH7.5）−0.5M NaCl−1mM EDTAにて行い、溶出は1
0mMトリスHCl（pH7.5）−1mM EDTAにて行った。

この結果、得られたmRNAは、400μｇであつた。

cDNAライブラリーの調製 cDNAライブラリーの調製は、以下の通り、cDNAが動物
細胞において発現可能なオカヤマ−バーグ（Okayama−B
erg）法により行った。即ち、cDNAクローニングに用い
るdT鎖の付加したベクター・プライマーは、プラスミド
pCDV1より、またdG鎖の付加したリンカーDNAは、プラス
ミドpL1より、各々オカヤマらの方法〔Okayama,H.and
P.Berg.,Molecular and Cellular Biology,Vol.3,p280
（1983）〕に従って調製した。

次に上記で得たmRNA15μｇを、5mMトリスHCl（pH7.
5）−0.5mM EDTA（pH7.5）水溶液20μに溶解し、65
℃で５分間、次いで37℃で５分間インキユベートした
後、反応液（全量40μ）を、50mMトリスHCl（pH8.
3）、8mM MgCl₂、30mM KCl、0.3mMジチオスレイトー
ル、2mMの各dATP、dGTP、dCTP及びdTTP、ベクター・プ
ライマーDNA2.8μｇ、RNaseインヒビター（Promega Bi
otech社製）60ユニツト、逆転写酵素（バイオ−ラド社
製）40ユニツトになるように調整して、37℃で１時間イ
ンキユベートし、0.5M EDTA（pH7.5）、２μ及び10
％SDS2μを加えて反応を停止させた。その後、フエノ
ール・クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行い、
エタノール沈澱としてベクター・プライマーcDNA:mRNA
を回収した。

回収されたベクター・プライマーcDNA:mRNAを、140mM
カコジル酸ナトリウム、30mMトリスHCl（pH6.8）、1mM
CaCl₂、0.1mMジチオスレイトール、0.3μｇポリ
（Ａ）、66μＭ dCTP及び38ユニツトのターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（フアルマシア
社製）からなる反応液30μ中で37℃、５分間インキユ
ベートした後、0.5M EDTA（pH7.5）1.5μ及び10％SD
S1.5μを加えて反応を停止させ、フエノール・クロロ
ホルム抽出及びクロロホルム抽出を行なって、エタノー
ル沈澱としてオリゴdC鎖付加cDNA:mRNA−ベクター・プ
ライマーを回収した。

この回収された核酸を、7mMトリスHCl（pH7.5）、7mM
MgCl₂、60mM NaCl、100μg/ml牛血清アルブミン及び
12ユニツトの制限酵素Hind III（日本ジーン社製）から
なる反応液20μ中で、37℃で90分間インキユベート
し、次いで0.5MEDTA（pH7.5）１μ及び10％SDS1μ
を加えて反応を停止させた。その後、フエノール・クロ
ロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行い、エタノール
沈澱として、Hind III分解されたオリゴdC鎖付加cDNA:m
RNA−ベクター・プライマーを回収した。これを10mMト
リスHCl（pH7.5）−1mM EDTA（pH7.5）（TE（pH7.5）1
0μに溶解させた。このうちの１μを用いて、上記T
E（pH7.5）、0.1M NaCl及びオリゴdC鎖の付加されたリ
ンカーDNA14ngからなる反応液10μ中で、65℃で２分
間インキユベートし、次いで42℃で30分間インキユベー
トした後、０℃に冷却した。

上記反応液を、更に20mMトリスHCl（pH7.5）、4mM M
gCl₂、10mM（NH₄）SO₄、0.1M KCl、50μg/ml牛血清ア
ルブミン、0.1mM β−NAD（ニコチンアミド・アデニン
・ジヌクレオチド、フアルマシア社製）及び0.6μｇの
エシエリヒア・コリDNAリガーゼ（フアルマシア社製）
を含む反応液100μとなるように調整し、12℃で一夜
インキユベートした。この反応液に、dATP、dGTP、dCTP
及びdTTPの各々を40μＭになるように、またβ−NADを
0.15mMになるようにそれぞれ加え、更にエシェリヒア・
コリDNAリガーゼの0.4μｇ、エシェリヒア・コリDNAポ
リメラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）の4.6
ユニツト及びエシェリヒア・コリRNaseH（フアルマシア
社製）の１ユニツトを加え、12℃で１時間、次いで25℃
で１時間インキユベートした。

上記で得られた反応液を用いて、エシェリヒア・コリ
HB101株を形質転換させた。エシェリヒア・コリHB101株
のコンピテント・セルとしては、ベテスダ リサーチ
ラボラトリーズ社（Bethesda Research Laboratories:B
RL）の製品を使用し、該BRL社のマニユアルに従って、
上記形質転換を行なった。

かくして、約21000個からなるcDNAライブラリーが得
られた。

サルCos−１細胞へのトランスフェクシヨン 上記で得られたcDNAライブラリーを、１グループ当
り平均70クローンのグループに分け、各グループからプ
ラスミドDNAを調整した。

プラスミドDNAは、アルカリ溶菌法（Molecular Cloni
ng−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborat
ory,1982,p368）に従い調製した。

かくして各グループから調製されたプラスミドDNA
を、それぞれサル培養細胞のCos−１細胞〔Gluzman,Y.,
Cell,Vol.23,p175（1981）〕にトランスフェクションし
た。該トランスフェクションは、DEAE−デキストラン法
によつた〔Yokota,T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,
Vol.81,p1070（1984）〕。即ち、Cos−１細胞をトリプ
シン処理により、10％FCSを含むRPMI−1640培地に懸濁
させ、細胞数を１×10⁶個/mlに調整後、10％FCSを含むR
PMI−1640培地を2ml/ウエル加えた６ウエルプレート
に、各々500μずつ分注した。一晩37℃で培養後、上
清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、10μg/
mlプラスミドDNA、0.4mg/mlDEAE−デキストラン（フア
ルマシア社製）、50mMトリスHCl（pH7.4）及び10％FCS
を含むRPMI−1640培地を1ml/ウエル加えて、4.5時間37
℃で培養した。その後、上清を除き、血清を含まない培
地で細胞を洗浄し、150μＭクロロキン（シグマ社製）
及び10％FCSを含むRPMI−1640培地を2ml/ウエル加え
て、更に37℃で３時間培養した。上清を除き、血清を含
まない培地で細胞を洗浄後、10％FCSを含むRPMI−1640
培地を3ml/ウエル加えて、37℃で72時間培養した。上清
を回収した後、10％FCSを含むPRMI−1640培地を2ml/ウ
エル加え、凍結融解を２回繰返し、細胞抽出液を回収し
た。この培養上清及び細胞抽出液について、GIF活性を
測定した。

GIF活性を示したグループを10クローン／グループの2
4グループに分け、上記と同様の操作を行ない、GIF活性
を測定し、活性を示したグループについて、更にグルー
プ内の各クローンにつき、上記と同様の操作を行なっ
て、GIF活性を示すクローンを同定した。

かくして、pcD−GIF−16及びpcD−GIF−207の２種類
のクローンを得た。

之等のクローンのGIF活性（GIF単位/ml）を第４表に
示す。

第 ４ 表 クローン 培養上清 細胞抽出物 pcD−GIF−16 48.3 120.7 pcD−GIF−207 62.6 196.9 pcDV1（対照） 0 0 クローンの解析 次に、両クローン由来のGIF活性の物質としての異同
を明白にするため一定のGIF活性を示すpcD−GIF−16又
はpcD−GIF−207の培養上清及び細胞抽出物のそれぞれ
に対して、ポリペプチドＩのGIF活性に対する中和抗血
清の順次希釈液を添加し、上記各上清及び細胞抽出物に
与える影響を試験した。

その結果を第３図−ａ（pcD−GIF−16培養上清）、第
３図−ｂ（pcD−GIF−16細胞抽出物）、第３図−ｃ（pc
D−GIF−207培養上清）及び第３図−ｄ（pcD−GIF−207
細胞抽出物）に示す。各図において横軸は血清希釈倍率
を、縦軸はGIF活性（％）を各々示す。また各図中
（１）は抗ポリペプチドＩ血清を、（２）は正常血清を
それぞれ示す。

第３−ａ図及び第３−ｂ図に示す通り、pcD−GIF−16
由来のGIF活性は、抗ポリペプチドＩ血清の添加によ
り、濃度依存的に、完全に中和されたが、第３−ｃ図及
び第３−ｄ図に示す通り、pcD−GIF−207由来のGIF活性
は、抗ポリペプチドＩ血清には全く影響されなかった。
従って、pcD−GIF−207由来のGIF活性物は、ポリペプチ
ドＩ及びpcD−GIF−16由来のGIF活性物とは、免疫学的
に異なることが判明した。

また、プラスミドpcD−GIF−16及びpcD−GIF−20のcD
NAの制限酵素地図を第４図に示す。更に之等のcDNAの塩
基配列を塩基特異的化学修飾法〔Methods in Enzymolog
y,Vol.65,p499（1980）〕及びフアージM13ベクター〔Ge
ne,Vol.19,p269（1982）〕を使用したジデオキシ・チエ
ーン・ターミネーシヨン〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vo
l.74,p5463（1977）〕により決定した。

その結果、pcD−GIF−16の有するcDNAは、マーチらの
報告するIL−１βの翻訳領域cDNA配列と同一であり、pc
D−GIF−207の有するcDNAは、同じくIL−１αの翻訳領
域cDNA配列と同一であることが確認された〔Carl J.Mar
ch et al.,Nature,Vol.315,p641（1985）〕。

ポリペプチドXXXIVの製造 上記で得たフルレングス（full length）に近いIL
−１βのcDNAクローンpcD−GIF−16を、制限酵素Pvu II
で切断し、更に制限酵素Nco Iで部分切断して、380bpの
Nco I−Pvu II DNAフラグメントを、アガロースゲル電
気泳動法により単離、精製した。

このDNAフラグメントにマング・ビーン・ヌクレアー
ゼ（mung bean nuclease）を作用させて、制限酵素Nco
I切断により生じた接着末端を平滑末端とした。

次に、合成オリゴヌクレオチド〔５′−CGATAATG−
３′及び５′−CATTAT−３′〕の各５′末端をT4ポリヌ
クレオチドキナーゼによりリン酸化し、之等を先のDNA
フラグメントにT4DNAリガーゼを用いて連結後、制限酵
素Cla I及びHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳
動法により、約400bpのCla I−Hind III DNAフラグメン
ト〈Ａ〉を単離、精製した。

他方、前記で得た発現プラスミドp trp GIF−αを、
制限酵素Cla I及びHind IIIで切断し、大きい方のDNAフ
ラグメント〈Ｂ〉を、アガロースゲル電気泳動方により
単離、精製した。

上記フラグメント〈Ａ〉と〈Ｂ〉とをT4DNAリガーゼ
を用いて連結し、連結物をエシェリヒア・コリHB101に
トランスフオームさせた。ボイリング法により、得られ
るトランスフォーマントのプラスミドDNAを抽出し、制
限酵素による切断地図を解析して、目的のトランスフオ
ーマントを選択した。

かくして単離された目的トランスフオーマント（エシ
エリヒア・コリHB101/p trp GIF−α−Ｖ）を、50μg/m
lL−トリプトファンを含むLB培地10ml中で、37℃で一晩
振盪培養し、この1mlを50μg/mlアンピシリン及び１％
カザミノ酸を含むM9最小培地50mlに植菌し、37℃で振盪
培養し、550nmでの吸光度が約1.0となった時点で菌体を
集め、15％シュークロース−50mMトリスHCl−50mM EDT
A（pH8.0）の溶液5mlに懸濁させ、これに10mg/mlリゾチ
ーム〔10mMトリスHCl（pH8.0）で溶解〕溶液500μを
加え、更に0.3％トリトンX100−187.5M EDTA（pH7.0）
−150mMトリスHCl（pH8.0）の溶液5mlを加え、室温で15
分間放置後、超音波処理を行ない、遠心分離により菌体
抽出物上清を得た。

得られた菌体抽出物上清について、GIF活性の測定を
行なった所、培養液1ml当り112ユニツトであった。

ポリペプチドXXXIIの製造 前記で得たプラスミドpGIF−αを、制限酵素Nco I及
びAcc Iで切断して、約0.7kbのNco I−Acc I DNAフラグ
メントを、アガロースゲル電気泳動法により単離、精製
した。このDNAフラグメントを、DNAポリメラーゼＩ（ク
レノー断片）を用いた処理により、その両末端を平滑末
端とした。

他方、プラスミドpTM1を、制限酵素Hind IIIで切断
後、DNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、切
断部位を平滑末端とした。

上記により得られる２つのDNAフラグメントを、T4DNA
リガーゼを用いて連結し、連結物をエシェリヒア・コリ
HB101にトランスフォームし、ボイリング法によりトラ
ンスフォーマントからプラスミドDNAを抽出し、制限酵
素による切断地図から目的のトランスフォーマントを選
択した。

かくして単離されたトランスフォーマント（エシェリ
ヒア・コリHB101/p trp GIF−α−III）を、上記に示
すエシェリヒア・コリHB101/p trp GIF−α−Ｖの場合
と同様にして培養後、菌体抽出物上清を得た。この培養
上清のGIF活性は培養液1ml当り190ユニツトであった。

ポリペプチドXXXIIIの製造 このポリペプチド発現プラスミドの作成は、サイト−
スペシフィック ミユータジェネシスの方法に従い、以
下に詳述するように不要な塩基配列部位を除去すること
により実施した。

即ち、pGIF−αを、制限酵素Pst I及びAcc Iで切断
後、アガロースゲル電気泳動法により、約0.9kbのPst I
−Acc I DNAフラグメントを単離、精製し、その両末端
をT4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とした。

このフラグメントを、別途にプラスミドpTM1を制限酵
素Hind IIIで切断後、DNAポリメラーゼＩ（クレノー断
片）を用いて平滑末端として調製したDNAフラグメント
に、T4DNAリガーゼを用いて連結し、連結物をエシェリ
ヒア・コリHB101にトランスフォームし、目的トランス
フォーマントを、ボイリング法により抽出されたプラス
ミドDNAの制限酵素地図により選択した。また得られた
プラスミドのDNA塩基配列も確認した。以下このプラス
ミドを「pTM1−Ｉ−２」と呼ぶ。

次いで、プラスミドpTM1−Ｉ−２を、制限酵素EcoR I
及びHind IIIで切断して、約740bpのEcoR I−Hind III
DNAフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法により
単離、精製した。これを、M13mp11フアージ（RF）のEco
R IとHind IIIの制限酵素部位に、T4DNAリガーゼを用い
て連結した。これから一本鎖（ss）DNA（mp11−trp−I2
（E/H））を得、これをミューダジェネシスの鋳型とし
た。

合成オリゴヌクレオチド〔５′−CACGTAAAAAGGGTATCG
ATAATGAAGTGCTCCT−３′（プライマー）〕を、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化し、これをssmp11−trp
−Ｉ−２（E/H）とハイブリダイズし、アニーリング
後、dNTPsの存在下にDNAポリメラーゼＩ（クレノー断
片）及びT4DNAリガーゼで各々処理し、15℃で２晩イン
キユベートした。

得られたDNAをJM105コンピテント細胞にトランスフォ
ームし、生じたコロニーを、寒天プレート上に200コロ
ニー植菌し、37℃で18時間培養した。生育したコロニー
を含むフィルターを通常の方法によりアルカリ処理変性
し、乾燥後、80℃で２時間ベーキング処理した。このフ
ィルターをプレハイブリダイズした後、このものと上記
プライマーの５′末端を³²P−γ−ATPでラベルされた³²
P−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズさせたフイルターを６×SSCバッファーを用
い、室温で10分間、次いで0.25×SSCバッファーを用い6
0℃で５分間各々洗浄し、乾燥後、−70℃で18時間オー
トラジオグラフィーを行なった。

変異したクローンの内から、代表としてmp11−trp GI
F−α−IV（E/H）を選び、これをJM105に感染させて培
養し、ssDNA及びRF DNAを調製した。

上記で得られたssDNAのM13ジデオキシチェイン ター
ミネーション シークエンシングにより、目的遺伝子の
削除を確認した。

また、JM105で増殖させたRF DNAより約630bpのEcoR
I−Hind III DNAフラグメントを、アガロースゲル電気
泳動法により単離、精製した。

一方、プラスミドpTM1−Ｉ−２より、同様にして約4.
2kbEcoR I−Hind III DNAフラグメントを、単離、精製
し、これと先の約630bpのEcoR I−Hind III DNAフラグ
メントとを、T4DNAリガーゼを用いて連結させ、連結物
をエシェリヒア・コリHB101にトランスフォームさせ
た。

目的のトランスフォーマントは、ボイリング法に従
い、トランスフォーマントよりブラスミドを抽出し、そ
の制限酵素地図解析により選択した。

かくして単離されたトランスフォーマント（エシェリ
ヒア・コリHB101/p trp GIF−α−IV）を、前記に示
すエシェリヒア・コリHB101/p trp GIF−α−Ｖの場合
と同様にして培養後、菌体抽出物上清を得た。この培養
上清のGIF活性は培養液1ml当り336ユニツトであった。

ポリペプチドXXXIの製造 上記と同様にして、所望のポリペプチド発現プラス
ミドp trp GIF−α−IIを保有するトランスフォーマン
トを作成した。

鋳型としては、先の一本鎖DNAmp11−trp−Ｉ−２（E/
H）を用いた。またプライマーとしては、合成オリゴヌ
クレオチド〔５′−CACGTAAAAAGGGTATCGATAATGCTGGTTCC
CT−３′〕を用いた。

上記プラスミドを保有するトランスフォーマント（エ
シェリヒア・コリHB101/p trp GIF−α−IIを同様にし
て培養後、菌体抽出物上清を得た。この培養上清のGIF
活性は培養液1ml当り112ユニツトであった。

本発明IL−１β自身（ポリペプチドＩ）及びその本発
明誘導体のGIF活性については、既に記載したが、加え
て以下の試験を行なった。

尚、前記したポリペプチドＩに対する抗血清を用い
て、RIA法により測定したポリペプチドＩ換算蛋白量（m
g）当りのLAF活性（Ｕ）は、下記第５表に示す通りであ
る。

第 ５ 表 ポリペプチド LAF活性（U/mg） ポリペプチドＩ 4.5×10⁶ ポリペプチドII 1.6×10⁵ ポリペプチドIII 6.2×10⁶ ポリペプチドIV 2.6×10⁵ ポリペプチドＶ 2.1×10⁵ ポリペプチドVI 1.3×10⁷ ポリペプチドVIII 8.0×10³ 薬理試験例1:ポリペプチドＩのCSF産生促進効果試験 ヒト肺細胞のCSF産生に対する促進効果試験 CSF産生株として、ヒト肺細胞由来株HFL−１（Human
Embryonic lung Fibroblasts,ATCC登録細胞株No.CCL−1
53）を用い、以下の試験を行なった。

まず、上記HFL−１細胞を２×10⁵個/mlの細胞濃度と
なるように、10％ウシ胎児血清加ハムスター12K培養液
〔Ham,R.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.,53,288（1965）〕に
浮遊させた。次いで上記細胞懸濁液中に、種々の濃度に
調製した前記参考例で得たポリペプチドＩを加え、炭酸
ガス培養器内で37℃で24時間、48時間及び72時間各々培
養し、各培養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積さ
れたCSF量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Lew
is,I.C.et al.,J.Immunol,128,168（1982）〕。

ポリペプチドＩを用いて得られた各培養時間（hr）で
の結果を第５図に示す。図において、横軸はポリペプチ
ドＩの濃度（GIF単位/ml）を、縦軸はCSF活性（単位/m
l）を示す。

上記結果より、ポリペプチドＩの添加によれば、HFL
−１細胞株のCSF産生量は、該ポリペプチドの無添加に
比べて実に数百倍にも亢進されることが明らかである。

ヒト皮膚由来細胞のCSF産生に対するポリペプチドＩ
の促進効果試験 ヒト正常皮膚由来細胞株としてCRL−1445（ATCC.N
o.）を利用して以下の試験を行なった。

上記細胞を２×10⁵個/mlの細胞濃度となるように10％
ウシ胎児血清加ダルベツコMEM培養液〔Dulbeco,R.and F
reeman,G.,Virology,８,396（1959）〕に浮遊させた。
上記細胞浮遊液に、種々の濃度の参考例で得たポリペプ
チドＩを加え、炭酸ガス培養器内で37℃で24、48及び72
時間培養した後、培養上清を集め、産生されたCSF量を
マウス骨髄細胞を使用して上記試験と同様にして測定
した。

得られた結果を第５図と同様にして、第６図に示す。

第６図より、GIF活性として１単位/ml以上のポリペプ
チドＩをヒト正常皮膚由来の原線維芽細胞に加えること
により、該細胞のCSF産生能は著しく促進されることが
明らかである。

生体内でのCSF産生に対する促進効果試験 ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体内での
CSF産生亢進作用が発現されることを以下の動物実験に
より試験した。

即ち、正常マウス（BALB/C系マウス、静岡県実験動物
協同組合より購入）に、種々の量の参考例で得たポリペ
プチドＩ（GIF活性として10³〜10⁵単位／個体）を静脈
内投与した。上記投与後２、４、８、12及び24時間目に
各実験動物より採血し、血清中のCSF濃度をマウス骨髄
細胞を用いて測定した。

結果を第７図に示す。図において横軸は各種濃度（GI
F単位／個体）のポリペプチドＩの投与後時間（hr）
を、縦軸はCSF活性（単位/ml血清）を各々示す。また図
中（１）はポリペプチドＩの10万GIF単位／個体投与群
を、（２）は同１万GIF単位／個体投与群を、（３）は
同1000GIF単位／個体投与群を、また（４）は対照群（H
SA10μg/個体投与群）を各々示す。

第７図より、ポリペプチドＩを動物に与えた場合、動
物血清中のCSF濃度は著しく高くなっていることが判明
した。即ち、ポリペプヂトＩは注射された量に比例して
生体内でのCSF産生を著しく亢進させる作用のあること
が認められた。

薬理試験例2:ポリペプチドＩの抗関節炎試験 パースン〔Pearson,C.M.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,
91,95（1956）〕及びワードとジヨーンズ〔Ward,J.R.,J
ones,R.S.,Arthritis Rheumatism,５,557（1962）〕の
方法に準じて、アジユバント関節炎ラツトを作製した。
即ち、雌性S.D.系ラツトの尾根部皮内に、ミコバクテリ
ウム・ブチリカム（Mycobacterium butyricum）死菌を
流動パラフインに懸濁させたアジユバントを0.05ml注射
した。14日目に足腫脹に基づいて群分けし（ｎ＝６）、
その翌日より５日間に亘って、参考例で得たポリペプチ
ドＩ又はその溶媒（生理食塩水；対照群）を、皮内投与
した。経日的に足容積を測定することにより、関節炎に
対する影響を評価した。

結果を第８図に示す。図において横軸はアジユバント
投与後日数（日）を、縦軸は足体積（×0.01ml）を各々
示す。また図中（１）はポリペプチドＩの10万GIF単位
／個体投与群を、（２）は同１万GIF単位／個体投与群
を、（３）は同1000GIF単位／個体投与群を、（４）は
同100GIF単位／個体投与群を、（５）は対照群（生理食
塩水投与群）を、また（６）は正常ラツト群を各々示
す。

第８図より、対照群（グラフ（５））の足腫脹は、23
日目まで増悪したのに対し、ポリペプチドＩの投与群
（グラフ（１）〜（４））においては、その投与の４日
目（アジユバンド投与後18日目）より足腫脹の抑制作用
が認められ、最終投与４日後（アジユバンド投与後23日
目）においても関節炎の進行を阻止できることが確認さ
れた。

薬理試験例3:本発明誘導体のCSF産生促進効果試験 細胞株Ｕ−373MG〔ATCC HTB17、Glioblastoma,Astro
cytoma,Human〕を用いて、以下の試験を行なった。

上記細胞を、２×10⁵個/mlの細胞濃度となるように、
10％FCS（GIBCO社製）、MEM非必須アミノ酸（Flow社
製）及びMEMピルビン酸ナトリウム（Flow社製）を添加
したイーグルMEM培地（日水社製）に浮遊させ、種々の
濃度となるように被験物質を加えて、炭酸ガス培養器内
で37℃で24時間培養した。

各培養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積された
CSF量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Lewis,
I.C.et al.,J.Immunol,128,168（1982）〕。

結果を第９図に示す。図において、横軸は被験物質の
濃度（ng/ml）を、縦軸はCSF活性（U/ml）を示す。ま
た、図中、曲線（１）〜（７）は、以下の各ポリペプチ
ドを被験物質とした時の結果を示す。

曲線（１）…ポリペプチドVI 曲線（２）…ポリペプチドII 曲線（３）…ポリペプチドVIII 曲線（４）…ポリペプチドＶ 曲線（５）…ポリペプチドIV 曲線（６）…ポリペプチドIII 曲線（７）…ポリペプチドXXX 薬理試験例4:本発明誘導体の抗炎症試験 ウインター（Winter）らの方法〔Proc.Soc.Exptl.Bio
l.Med.,111,544−547（1962）〕に準じて、この試験を
行なった。

即ち、６〜８週齢の雄ラツト（Spraque Dawley系、日
本チャールスリバー社）を、実験前日に体重に基づいて
１群６〜８匹の各群に分けて用いた。起炎剤としてカラ
ゲニン（Marine Colloid社製）を、生理食塩水に１％と
なるように懸濁させたものを使用し、ラツトの右後肢足
蹠皮下に0.1ml注射して足浮腫を惹起させた。足浮腫を
評価するため、起炎剤注射の前後の一定時間に、右後肢
足蹠容積を、プレシモメーター（plethysmometer,Ugo−
Vasile社製）を用いて測定した。前値に対する起炎剤注
射後の容積増加率を浮腫率（swelling％）として表わし
た。

被験物質は、ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水（Dulb
eco s phosphate buffered saline）に溶解希釈し、ラ
ツトの背部皮内に0.1ml宛、起炎剤注射の１時間前に注
射した。尚、対照群として、溶媒投与群を作成し、同一
実験に供した。

結果を第10図に示す。

図において横軸は、起炎剤投与後時間（hr）を、縦軸
は浮腫率（％）を示す。また、図中、曲線（１）は対照
群を、曲線（２）はポリペプチドVIを0.1μｇ投与群
を、曲線（３）はポリペプチドVIの１μｇ投与群を、曲
線（４）はポリペプチドVIの10μｇ投与群をそれぞれ示
す。

薬理試験例5:本発明誘導体の放射線障害防止作用試験 BALB/c系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射する
20時間前に、ポリペプチドVIの１μg/マウス又は0.3μg
/マウスを腹腔内注射した。Ｘ線照射装置（MBR−1505
R、日立メディコ社）を使用し、850レントゲンのＸ線
を、上記マウスに全身照射し、以後、毎日その生存を確
認した。尚、コントロールとして、PBS投与群をおい
た。

結果を第11図に示す。図において横軸はＸ線照射後の
日数（日）を、縦軸は供試動物の生存率（％）を示し、
曲線（１）はポリペプチドVIの１μｇ投与群を、曲線
（２）はポリペプチドVIの0.3μｇ投与群を、また曲線
（３）はコントロール群をそれぞれ示す。

第11図より、コントロール群では、Ｘ線照射後18日目
に全例死亡したのに対し、ポリペプチドVI投与群では、
その投与量に依存して、放射線障害の防止作用が認めら
れ、１μｇ投与群では、約８割が放射線障害による死亡
から回避され、生存することが確認された。

薬理試験例6:本発明誘導体の日和見感染防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施し
た。

ICR系雄性マウス（６週齢）を供試動物（１群７匹）
とし、第１日目に、５−フルオロウラシル（５−Fu、協
和醗酵社製）100mg/kgを静脈内投与した。第２日目、第
４日目及び第６日目に、ポリペプチドVIの１μg/マウス
を皮下投与し、第７日目に、緑膿菌（Pseudomonas aeru
ginosa E−２）の所定量を腹腔内投与して感染させた。
第10日目に供試動物の生存数を計数して、生存率（％）
を求めた。

結果を第12図（１）〜（３）に示す。

第12図（１）は上記実験群の結果を、同（２）はポリ
ペプチドVIを投与しなかった（５−Fuのみを投与した）
対照群の結果を、また同（３）は５−Fu及びポリペプチ
ドVIのいずれも投与しなかった対照群の結果をそれぞれ
示す。

第12図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は下記各緑膿
菌投与量を採用した群Ａ〜Ｅをそれぞれ示す。

Ａ群…19000菌数／マウス投与群 Ｂ群…3800菌数／マウス投与群 Ｃ群…750菌数／マウス投与群 Ｄ群…150菌数／マウス投与群 Ｅ群…30菌数／マウス投与群 Ｆ群…６菌数／マウス投与群 製剤例１ GIF活性として１×10⁷単位/mlのポリペプチドVIの生
理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミン（HSA）を0.5％と
なるように添加して、過（0.22μｍメンブランフイル
ター）後、これを無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し
て凍結乾燥し、注射用製剤を調製した。

かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水1m
lに溶解して利用される。

〈動物細胞からのサイトカインの製造方法〉 種々の濃度のポリペプチドXXXVII及び0.01％PHA−
Ｐ存在下に、HBS−2C5B2細胞〔J.Immunol.,131,1682−1
689（1985）〕を、２×10⁵cells/wellにて培養した。培
養24時間後の上清を採取し、そのIL−２活性を、スミス
（K.A.Smith）らの方法に従い、IL−２依存性マウスＴ
細胞（CTLL2）を用いて測定した〔J.Immunol.,120,2027
（1978））〕。

結果を下記第６表に示す。

Ｕ−373MG細胞を、10％FCS加RPMI−1640培地で集密
的まで培養し、更に20ng/mlのポリペプチドXXXVIIを含
む又は含まない（コントロール）上記培地中で18時間イ
ンキュベートした。

培地を除去した後、前記実施例３−に準じて、グア
ニジニウム／セシウムクロライド法によりRNAを抽出
し、オリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィーによ
り、ポリ（Ａ）⁺RNA（mRNA）を収得した。ノザン・ブロ
ッティング法（Northern blotting）に従い、上記ポリ
（Ａ）⁺RNAの10μｇをアガロースゲル（1.2％）電気泳
動に付し分画後、ニトロセルロース・フィルターに転写
した。減圧下に80℃でベーキングし、20mMトリスHCl（p
H8.0）中で100℃５分間の処理後、50％フォルムアミ
ド、５×ssc、50mMリン酸ナトリウム（pH6.5）、４×デ
ンハルド液（Denhardt s solution）及び200μg/mlの変
性サケ精子DNA中で42℃下にプリハイブリダイゼーショ
ンを行った。

５時間後、ニックトランスレーションで放射能標識し
たGM−CSFcDNA［Science,228,810（1985）］のPst I−N
co I DNA断片又はBSF−2cDNA［Nature,324,73（198
6）］のKpn I−BamH I DNA断片と、42℃下に20時間ハイ
ブリダイゼーションを行った。フィルターを、0.1％SDS
加２×secで室温下に15分間、更に0.1％SDS加0.1×ssc
で50℃下に１時間洗浄した。オートラジオグラムは、増
感紙を用いて、−70℃下に一夜行った。

GM−CSFのDNA断片を用いた時の結果を第13図に示す。
レーンＡは本発明ポリペプチドを用いた結果を、レーン
Ｂは本発明ポリペプチドを用いないコントロールの結果
を示す。

また、BSF−２のDNA断片を用いた時の結果を第13図に
準じて第14図に示す。

以上に示す結果より、本発明ポリペプチドを用いるこ
とにより、動物細胞からの天然サイトカイン類の生産が
効率よく行い得ることが判る。

また、本発明ポリペプチドの、かかる方法への適用に
際しては、極めて微量、通常10ng/ml程度の使用で十分
であり、誘導されたサイトカイン類の精製過程をも容易
にする。

動物細胞よりサイトカインを生産する場合、産生誘
引に使用する本発明ポリペプチドがその条件下において
構造的に安定であり、細胞表面上のIL−１受容体に結合
することが必須である。すなわち、本発明ポリペプチド
がIL−１受容体に結合し、サイトカイン産生に必要なシ
グナルを細胞内に伝えることが重要である。

そこで、線維芽細胞上のIL−１受容体への結合に関し
て、以下の試験を行った。

６−wellプレート上で、一面にほぼ均一にまで増殖し
たBalb/3T3細胞（クローンA31:ATCC,CCL−163、１×10⁶
cells/well）に、¹²⁵Iで標識したポリペプチドＩ（IL−
１β）の50000cpm/well及び事前に10％FCS加Ｄ−MEM中
で37℃下にインキユベートした20ng/mlのポリペプチド
Ｉを加え、４℃で反応させた。反応液をパスツールピペ
ットで除き、10％FCS加Ｄ−MEMの1mlを加えて静かに洗
い上清をすてた。この洗浄操作を２回繰返した後、1ml
の１％SDS、0.2N NaOHで細胞を可溶化し、可溶化液及
びさらにウエルを洗浄した可溶化液中の放射能（結合放
射能）をγ−カウンターにて測定した。

尚、上記¹²⁵I標識ポリペプチドＩは、ボルトンとハン
ター（Bolton and Hunter）の方法〔Biochem.J.,133,52
9（1973）〕に従い構造、精製した（比活性;250μCi/μ
gprotein以上）。

得られた結果を下記第７表に示す。

第 ７ 表 インキユベーシヨン時間（hr） 阻止能（％） 0 100 5 約40 30 約 4 A:未標識ポリペプチドＩが存在しない時の結合した放射
能 B:プレートに非特異的に吸着した放射能 C:結合した放射能の実測値 かかる指標は、共存させたポリペプチドＩのIL−１受
容体への結合力を表わす。

上記第７表より、ポリペプチドＩ、即ちIL−１β自体
は、サイトカイン誘導条件下において、時間の経過と共
に、IL−１受容体への結合力が低下してしまうことが明
らかとなった。

そこで、上記において、24時間の事前のインキュベー
ションを行ったポリペプチドＩ、ポリペプチドVI又はポ
リペプチドXXXVIIを用いた同試験を行った。

結果を下記第８表に示す。

第 ８ 表 ポリペプチド 阻止能（％） Ｉ 約4 VI 約44 XXXVII 約87 上記結果より、動物細胞からのサイトカイン類製造に
際しては、IL−１β自体よりも、本発明ポリペプチドを
採用するのがより好ましいことが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドpGIF−αのcDNAの制限酵素地図を
示す。 第２図はプラスミドpGIF−αとプラスミドpTMIとからプ
ラスミドptrpGIF−αを構築する概略図を示す。 第３−ａ図乃至第３−ｄ図はプラスミドpcD−GIF−16由
来のGIF活性物及びプラスミドpcD−GIF−207由来のGIF
活性物の各々に対する抗ポリペプチドＩ血清（中和抗
体）の影響を示すグラフである。 第４図はプラスミドpcD−GIF−16及びプラスミドpcD−G
IF−207のcDNAの制限酵素地図を示す。 第５図、第６図及び第７図はポリペプチドＩのCSF産生
に対する促進効果試験結果を示すグラフである。 第８図はポリペプチドＩの抗関節炎試験結果を示すグラ
フである。 第９図は本発明IL−１β誘導体のCSF産生促進試験の結
果を示すグラフである。 第10図は本発明IL−１β誘導体の抗炎症試験の結果を示
すグラフである。 第11図は本発明IL−１β誘導体の放射線障害防止作用試
験の結果を示すグラフである。 第12図は本発明IL−１β誘導体の日和見感染症防御効果
試験の結果を示すグラフである。 第13図は本発明IL−１の誘導体のGM−CSF誘導産生効果
試験の結果を示す写真である。 第14図は本発明IL−１β誘導体のBSF−２誘導産生効果
試験の結果を示す写真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/14 ＡＥＤ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 38/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９７ (72)発明者 河合 一吉 徳島県板野郡松茂町満穂字満穂開拓130 −２ ソレイユ503号 (72)発明者 嶽肩 世津子 徳島市川内町加賀須野1090−18 (72)発明者 石井 清士 徳島県板野郡藍住町住吉字逆藤39−46 (72)発明者 柳原 康夫 徳島市川内町大松891−６ (72)発明者 平井 嘉勝 徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５− 49 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｏ Ｖｏｌ．315（20 Ｊ ｕｎｅ 1985）Ｐ．641−647 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ 81，（1984）Ｐ．7907− 7911 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．135 （1985）Ｐ．314−320 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．135 （1985）Ｐ．3962−3968

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】インターロイキン−１βの下記式（Ａ）で
   表されるアミノ酸配列に於いて、 ８位CysがAlaで置換されているアミノ酸配列； 71位CysがSerもしくはAlaで置換されているアミノ酸配
   列；または 71位CysがSerもしくはAlaで置換され更に８位CysがAla
   で置換されているアミノ酸配列； を有することを特徴とするポリペプチド。 Ala−Pro−Val−Arg−Ser−Leu−Asn−Cys−Thr−Leu− Arg−Asp−Ser−Gln−Gln−Lys−Ser−Leu−Val−Met− Ser−Gly−Pro−Tyr−Glu−Leu−Lys−Ala−Leu−His− Leu−Gln−Gly−Gln−Asp−Met−Glu−Gln−Gln−Val− Val−Phe−Ser−Met−Ser−Phe−Val−Gln−Gly−Glu− Glu−Ser−Asn−Asp−Lys−Ile−Pro−Val−Ala−Leu− Gly−Leu−Lys−Glu−Lys−Asn−Leu−Tyr−Leu−Ser− Cys−Val−Leu−Lys−Asp−Asp−Lys−Pro−Thr−Leu− Gln−Leu−Glu−Ser−Val−Asp−Pro−Lys−Asn−Tyr− Pro−Lys−Lys−Lys−Met−Glu−Lys−Arg−Phe−Val− Phe−Asn−Lys−Ile−Glu−Ile−Asn−Asn−Lys−Leu− Glu−Phe−Glu−Ser−Ala−Gln−Phe−Pro−Asn−Trp− Tyr−Ile−Ser−Thr−Ser−Gln−Ala−Glu−Asn−Met− Pro−Val−Phe−Leu−Gly−Gly−Thr−Lys−Gly−Gly− Gln−Asp−Ile−Thr−Asp−Phe−Thr−Met−Gln−Phe− Val−Ser−Ser （Ａ）
2. 【請求項２】71位のCysがSerで置換されている特許請求
   の範囲第１項記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】下記のアミノ酸配列を有する特許請求の範
   囲第２項記載のポリペプチド。 Ala−Pro−Val−Arg−Ser−Leu−Asn−Cys−Thr−Leu− Arg−Asp−Ser−Gln−Gln−Lys−Ser−Leu−Val−Met− Ser−Gly−Pro−Tyr−Glu−Leu−Lys−Ala−Leu−His− Leu−Gln−Gly−Gln−Asp−Met−Glu−Gln−Gln−Val− Val−Phe−Ser−Met−Ser−Phe−Val−Gln−Gly−Glu− Glu−Ser−Asn−Asp−Lys−Ile−Pro−Val−Ala−Leu− Gly−Leu−Lys−Glu−Lys−Asn−Leu−Tyr−Leu−Ser− Ser−Val−Leu−Lys−Asp−Asp−Lys−Pro−Thr−Leu− Gln−Leu−Glu−Ser−Val−Asp−Pro−Lys−Asn−Tyr− Pro−Lys−Lys−Lys−Met−Glu−Lys−Arg−Phe−Val− Phe−Asn−Lys−Ile−Glu−Ile−Asn−Asn−Lys−Leu− Glu−Phe−Glu−Ser−Ala−Gln−Phe−Pro−Asn−Trp− Tyr−Ile−Ser−Thr−Ser−Gln−Ala−Glu−Asn−Met− Pro−Val−Phe−Leu−Gly−Gly−Thr−Lys−Gly−Gly− Gln−Asp−Ile−Thr−Asp−Phe−Thr−Met−Gln−Phe− Val−Ser−Ser