JP2588181B2

JP2588181B2 - 磁性・ポリマ−粒子

Info

Publication number: JP2588181B2
Application number: JP61505252A
Authority: JP
Inventors: オウエン，チャールズ，エス; シルビア，ジョン，シー; ダンジェロ，ルイス; リバティ，ポール，エー
Original assignee: Nycomed Imaging AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1997-03-05
Anticipated expiration: 2012-03-05
Also published as: JPS63501978A

Description

【発明の詳細な説明】この出願は、発明者が同一でありかつ譲渡され、1985
年10月４日に出願された出願番号784,863の一部継続出
願であり、該もとの出願内容は引用して記載されてい
る。

発明の背景本発明は磁性金属と組合わせた特定ポリマーからなる
粒子、該粒子を含む組成物、該粒子および組成物を作る
方法と使用する方法に関するものである。さらに詳しく
は、本発明はポリマーが生化学的機能を有するこのよう
な粒子に関する。

生物学的に活性な磁性粒子は様々な製剤技術および診
断技術において使用を見出すであろう。これらのうちに
は高勾配磁気分離（HGMS）があり、これは磁場を使って
懸濁液から磁場粒子を分離するものである。これらの粒
子が興味のある生物学的材料（たとえば、細胞、薬物）
に付着している場合、興味のある材料はこれにより磁性
粒子と結合していない他の材料から分離されうる。

磁性粒子が生物学的および診断システムに有効である
場合に幾つかの性質が重要である。第一に、粒子は必要
な生物学的活性、親和性または反応性を有していなけれ
ばならず、これによりその機能を実行するであろう。第
二に、粒子は、生物学的系または反応系へ放散するため
に水性媒体中で懸濁可能でなければならない。粒子懸濁
液が安定である（すなわち、沈降したり凝集したりしな
い）こともまた望まれる。最後に、磁性粒子の懸濁液を
常法により濾過滅菌できるように小さい粒径が望まれう
る。

磁性粒子はまたは有機磁性材料の調製について従来技
術では多くの技術が提案されてきている。ゲイブルら
（Gable et al.）による米国特許第4,001,288号には水
溶性と強磁性の両方を備えた磁性有機−鉄化合物の調製
について記載されている。ゲイブルらにより示された調
製において、溶液中の第一鉄を過酸化水素で処理し次い
で水酸化アンモニウムで処理して酸化鉄化合物を沈殿さ
せる。この化合物を次いで過酸化物で酸化しヒドロキシ
−カルボン酸で処理し、そしてアルカリ物質と反応させ
て可溶性物質を形成する。

ゲイブルらはまた、タンパク質または“タンパク分解
生成物”を第一鉄溶液へ導入し次いで反応させて酸化鉄
を沈澱させることも記載している。例に示されているた
だ１つの物質は過酸化水素で処理したゼラチンの加水分
解生成物である。

モルデイ（Molday）による米国特許第4,452,773号に
は多糖（特許ではデキストランおよびデキストラン誘導
体として例示）により被覆された“コロイドの大きさ
の”酸化鉄粒子について記載している。モルデイの粒子
は本発明の粒子調製で使用されるものと幾らかに似た方
法で作られるが、これらは本発明の粒子と実質的に異な
ると思われる。

クゼルリンスキー（Czerlinski）の米国特許第4,454,
234号には、溶液中で可逆的に懸濁しうる被覆磁性粒子
の調製（通常、磁性粒子基質における懸濁重合による）
が示されている。クゼルリンスキーにより示される懸濁
パラメーターは、粒子に磁性および非磁性を起こさせる
ために交互に用いられる彼の磁性粒子のキュリー温度効
果を含む。粒子が磁性である場合、これらは凝集する傾
向があるが、しかしこれに含まれるマグネタイトのキュ
リー温度以上の温度まで粒子を加熱すると再懸濁しう
る。

セニエイら（Senyei et al.）の米国特許第4,230,685
号にはマグネタイト、アルブミンおよびプロテインＡを
含む微小球の調製について記載されている。セニエイに
より示された調製はこれらの他の構成物の存在下にマグ
ネタイトを沈澱することは含まず、むしろ予備成形した
マグネタイト粒子のコーティングである。

興味があると思われる他の特許はロビンソン（Robins
on）らの米国特許第4,152,210号；モスバッハ（Mosbac
h）の第4,335,094号；ジアエバー（Giaever）の第4,01
8,886号；ケネディ（Kennedy）らの4,070,246号であ
る。これらの特許すべてが磁性生物学的粒子の調製また
は使用について記載しているが、これらのうちどれも本
発明のものと同様であるとは思われない。

用語活性ハロゲン：電子引抜基と結合した炭素原子と結合す
るかまたは隣接する炭素原子と結合するハロゲン原子
（たとえば；ヨード−アセトアミド、ヨード−アセテー
ト）利用可能な配位部：立体障害されず（自由に接近されう
る）そして金属化合物（たとえばFe₃O₄）中の金属原子
を配位するのに適する配位部。

生物機能的リガンド：本発明の強磁性ポリマー粒子と結
合してこれらの粒子へ特定の生物学的性質を付与しうる
生物学的活性を有する分子または生物学的系に特定の親
和力を有する分子。

配位部：遷移金属原子との配位結合を形成しうる“自
由”電子対を有する分子構造中の原子。

変性タンパク質：化学的または構造的変性により特定の
生物機能活性（たとえば、酵素性、抗原性、抗体、等）
を失なったタンパク質。ゲイブルらにより使用されたよ
うなもの：幾つかのアミド結合の開裂が以後に残ったま
まであり分子量＜10,000であるタンパク質残基。

粒子外結合：二官能性化合物の１つの官能基と強磁性−
ポリマー粒子の部位とが結合し、一方他の官能基が異な
った分子すなわち（一般には“リガンド”）の部位と結
合しているもの。

強磁性：永久磁性鉄組成物（真の磁気モーメントを有す
る）粒子内結合：二官能性化合物の両方の官能基が同じ磁性
−ポリマー粒子の異なった部位と結合していること。

低イオン濃度：ほぼ中性pHであって陽イオンの全濃度
（通常は緩衝剤から）が40mM未満である水溶液。

タンパク質：アミド（ペプチド）結合と連結し分子量1
0,000を越えるアミノ酸ポリマー。

再懸濁性：（たとえば、遠心分離、HGMSまたはフロキュ
レーションにより）一度凝集した物質が再分散して安定
な懸濁液を得ること。

音波処理：非常に強い超音波への暴露。

安定な懸濁液：標準温度および圧力にて２日間静置した
場合に沈降したりまたはそうでなければ凝集したりしな
い懸濁液。

発明の簡単な記載本発明は懸濁性および再懸濁性磁性ポリマー粒子の調
製およびこれにより作られる粒子からなる。このような
粒子は特に免疫検定法において有用な性質を示し、ここ
では粒子は特定の生物機能的リガンドとともに作られ次
いで高勾配磁気分離技術により分離される。

本発明方法は、利用可能な配位部を有するポリマーの
存在下に磁性化合物として金属イオンを共沈（たとえ
ば、〔Fe（II）＋Fe（III）〕または〔Fe（II）＋Cr（I
II）〕し、ポリマーと金属とを反応させて磁性−ポリマ
ー粒子を沈澱させ回収することを含む。さらに、様々な
生物機能性基を粒子へ組み込み、免疫検定法、細胞捕
獲、酵素固定化反応、NMRイメージングおよび他の診断
および分析技術での使用に有用な生物機能試薬を得るよ
うにしてもよい。

発明の詳細な説明本発明の一実施態様によれば、Fe（II）およびFe（II
I）（一般にはFecl₂およびFecl₃）を含む溶液と利用可
能な配位部を有するポリマー（たとえばタンパク質）
を、強塩基たとえば水酸化アンモニウム（NH₄OH）で処
理（滴定その他）してマグネタイト（Fe₃O₄）のような
磁性鉄酸化物をポリマーと均一に結合した形で沈澱させ
る。沈澱は、一般に迅速な撹拌と場合により音波処理を
用いた撹拌により行ない再懸濁性の磁性−ポリマー粒子
を作る。

沈澱後、粒子を洗い次いでほぼ中性pHで緩衝液中にて
再懸濁する。

本発明の他の実施態様は、共沈反応に鉄以外の他の金
属を使用することを含む。特に、Fe（III）を、他の広
い範囲の遷移金属イオンのいずれかに置き換えることが
できる。適当に選択された遷移金属イオンにより鉄を完
全に代えることができる場合もある。多くの場合、鉄以
外の金属の使用は白から暗褐色の範囲の着色粒子を製造
する。

本発明により作られた磁性−ポリマー粒子は多くの有
益な性質を示す。これらの粒子は磁性金属化合物（たと
えばマグネタイトの形態に類似した鉄、または同様な化
合物）の形を含むために磁性である。粒子は、凝集後も
再懸濁可能であり、静かに数日間貯蔵した後でさえ沈降
しない比較的安定な懸濁液を作るように配合される。さ
らに、本発明にしたがって作られる粒子は比較的小さく
（ほぼ0.01〜0.2ミクロン）、それゆえ濾過滅菌するこ
ともできる。最後に、本発明により作られる粒子は、様
々な分析、診断、および他の生物学的／医学上の用途に
有用な特定の生物機能リガンドを含むように特別仕立て
にすることができる。

磁性−ポリマー粒子の沈澱および再懸濁に続いて、こ
れらを二官能性試薬で処理してポリマーに存在する反応
部位を架橋してもよい。この架橋は、反応部位が同じ粒
子に結合する粒子内架橋かまたは次いで与えられた粒子
におけるポリマーに架橋する粒子外リガンドの反応物と
して有効であろう。第二の場合、２つの官能基の間が比
較的短かい距離の二官能性試薬が、粒子ポリマーと粒子
外の種類との結合を促進するために望ましい。逆に、粒
子内架橋は、より長くそして湾曲部から立体障害されな
い二官能性試薬を用いることにより促進され、これによ
り１つの粒子における２つの反応部位が１つの二官能性
分子により連結されうる。

前記した沈澱または再懸濁工程のいずれかの間に音波
処理を使用することに代えて、他の種類の撹拌（たとえ
ば機械的撹拌）を行なうことができる。

本発明の磁性−ポリマー粒子の再懸濁は、一般に低イ
オン濃度緩衝系（たとえば40mMリン酸塩系）中で行なわ
れる。緩衝系は非イオン性溶液に再懸濁しない粒子の再
懸濁化を可能にする。リン酸塩緩衝剤に加え、ホウ酸塩
および硫酸塩系もまた使用されうる。

本発明におけるポリマーおよび金属の均質な会合は、
ポリマーにおける配位部による共沈の間に存在する金属
の配位の結果であると思われる。ある種の配位部は、あ
る原子により形成されうる配位結合の強さと周囲の原子
により課せられる空間的障害の両方に基づいて、他より
一層“利用可能”であると仮定される。たとえば、“自
由”電子対を有する酸素原子がアミン窒素原子より強く
鉄と錯体を形成しそして非常に大きな程度までヒドロキ
シル酸素原子が錯体を形成することは知られている。す
なわち、オキシ−酸官能基を有するポリマーはアミン置
換ポリマーよりも良好な生成物粒子を提供すべきであ
る。同様に、近くまで自由に接近されうる配位部は、接
近経路または接近距離のいずれかで妨害される部位より
良好な遂行能力を得るであろう。

上記の傾向は、本発明者らが行なった様々な実験にお
いて質的に観察される。“利用可能な配位部”の存在
は、本発明の再懸濁可能な磁性−ポリマー粒子の製造に
必要と思われる。たとえば、天然タンパク質、合成タン
パク質、ポリ−アミノ酸、カリボキシ−ポリ−アルキ
ル、アルコキシ−ポリ−アルキル、アミノ−ポリ−アル
キル、ヒドロキシ−ポリ−アルキルのような様々なポリ
マーおよびこれらの様々のコポリマーはすべて本発明の
粒子を製造することが立証される。さらに、他のポリマ
ーたとえばスルホキシ−ポリ−アルキル、ポリ−アクリ
ルアミン、ポリ−アクリル酸および置換されたポリ−ア
ルキレンは本発明の粒子を製造する。

共沈反応で使用されるべき遷移金属を選択する際に、
幾つかの規準が重要であると思われる。第一に、最終化
合物はその構造中に１個以上の不対電子を有していなけ
ればならない。第二に、金属の１つはポリマーと結合す
るために利用可能な配位部を有さなければならない。第
三に、共沈は立法詰込または六方詰込（たとえば、立方
体：スピネルまたは逆スピネル）結晶構造を形成するこ
とができなければならない。この最後の要求は、化合物
が磁性であるために非常に密に充てんされる必要性から
の結果であると思われる。

最後に、本発明の粒子を調製するのに有効なポリマー
は、“特別仕立て”にして特定の生物機能活性を示すモ
ノマーを含むようにしてもよい。このようなポリマーを
使用すると生物機能を有する磁性−ポリマー粒子の直接
の沈澱が可能になり、これにより該ポリマーの特定の生
物機能活性を当てにする検定に有用とするために処理が
わずかに必要かまったく必要でなくなる。

特定の用途において、より大きく、安定性の低い粒子
が有効である。本発明の粒子は、いまだのその生物機能
性および磁性の両方を保持したままで凝集するように作
られてもよい。粒子の凝集は、懸濁液をあらかじめ決め
られた量の、たとえば塩化バリウム溶液で処理すること
により行ないうる。この処理は、粒子を予め決められた
期間懸濁液から沈降させさらに別の手段を実行するか、
またより大きな粒子が比較的小さい磁石により容易に攻
撃されるようにしてもよい。

以下の例により磁性−ポリマー粒子調製および使用の
様々なパラメーターを説明する：例１−一般的調製手段代表的（ミクロ）調製物用の出発水溶液は次のとおり
である：与えられたタンパク質の1mg/ml溶液 FeCl₃ 500mg/ml FeCl₂ 200mg/ml リン酸塩緩衝液（ほぼpH7） 20mM 水酸化アンモニウム溶液（NH₄OH） 7.5％または15％調製は、タンパク質溶液2.5mlを蒸留水を容量20mlま
で希釈することにより始まる。FeCl₂175μとFeCl₃140
μを加える。最後に、水酸化アンモニウム溶液約200
μを加える。

添加される塩基の量は通常予め計算され、反応混合物
におけるタンパク質またはポリマーの総量およびその特
定タンパク質またはポリマーの緩衝能を勘案するという
ことは注意すべきである。目的とするところは、酸化鉄
の沈澱を許す程十分な程度までpHを上げるが、しかし物
質を変性するpH以上にしないことによりタンパク質また
はポリマーの実質的活性を維持することである。

これらの物質は、連続撹拌しながらすべて反応容器へ
添加され均質反応混合物を促進する。塩基（NH₄OH）を
添加するとただちに黒色粒子が沈澱する。反応混合物
を、代表的には3,000rpmで15分間遠心分離し、上清を廃
棄する。次いでペレットをバラバラにし、物質をリン酸
緩衝液20mlで、代表的には３回の洗浄サイクルで、遠心
分離しながら洗浄する。最後の洗浄後、ペレットを再び
バラバラにし、物質を緩衝液中にて音波処理の影響下に
再懸濁する。最終溶液は、強磁性−ポリマー粒子の安定
な懸濁液である透明な薄黄色または茶色の溶液である。
方法を通して、鉄の凝集体残渣は常に見られない。

粒子のその後の処理は以下に記載のいずれかの手段に
より進められ、これには生物機能試薬との粒子内架橋ま
たは粒子外架橋が含まれる。

例1A−鉄以外の金属の使用上記したように、鉄以外の金属を本発明磁性−ポリマ
ー粒子へ混入してもよい。以下に、磁性−ポリマー粒子
の調製に使用されうるイオンの表（非−制限的）を示
す： Co（II）＋Ga（III） Ga（III）＋Er（III） Co（II）＋Ru（III） Ga（III）＋Ru（III） Co（II）＋Mn（II） Ga（III）＋Mn（II） Ga（III）＋Ｖ（III） Co（II）＋Ｖ（III） Ga（III）＋Mo（Ｖ） Ga（III）＋Fe（III）Ｖ（III）＋Fe（III） Mn（II）＋Ru（III）Ｖ（III）＋Mn（II） Co（II）＋Mo（Ｖ） Cr（III）＋Ga（III） Cr（III）＋Mn（II） Er（III）＋Ru（III） Er（III）＋Co（II） Mn（II）＋Er（III） Cr（III）＋Fe（II）上記表に加えて、その起電力電位がFe（II）をFe（II
I）へ酸化するのに不十分である選択された遷移金属と
組み合わせてFe（II）を使用することもできる。上記表
に挙げた金属のうち、Ｖ（III）だけがFe（III）を酸化
する能力があり、それゆえ不適当である。

例２−抗体結合粒子２つの溶液（それぞれ40ml）を超音波波浴中で急速に
混合し混合を促進する。２つともウシ血清アルブミン
（BSA）1.5mg/mlを含む。１つは水酸化アンモニウム（3
0％を8ml、最終濃度＝74mM）を含む。他の１つは塩化第
一鉄140mgと塩化第二鉄280mgを含む（全鉄濃度、混合後
1mg/ml）。黒色沈澱物がただちに形成する。撹拌しなが
ら氷酢酸6mlを加えることにより混合物を中和する。サ
ンプルを４つの試験管へ分け、沈澱物を遠心分離（3000
rpm、15分間）で洗い、黄金色で若干濁った上清中に残
った少量の鉄を廃棄する。ペレットを中性pHにて20mMリ
ン酸緩衝液20ml中に再懸濁する。粒子5mlを含む４つの
試験管の各々をカップホーン付属品を有するブランソン
音波処理機中で５分間音波処理する。

粒子における利用可能なアミノ基はスクシンイミジル
−プロピオノ−ジチオピリジン（SPDP）と反応して後で
抗体と結合するためのこれらの部分を作る。この反応
（粒子20ml＋SPDP5mg）は撹拌しながら氷中で１時間進
行する。次いでアミノ−反応性架橋試薬エチレン−グリ
コール−ジスクシンイミド−エステル（EGS）25mgを加
えてさらに粒子を安定化させる。混合物を撹拌しながら
さらに１時間反応させる。EGSは残りのいずれかのアミ
ノ残基と架橋しこれは結合ときわめて近似している。他
の残りのアミノ基はEGS分子の末端の１つの結合し、一
方他のものは結局加水分解してカルボキシル基になる。
この結果、粒子表面において陽電荷基の陰電荷基への正
味の転化が起こりこれはコロイド状懸濁液の安定性を促
進すると思われる。

反応期間の最後に、調製物を50ml試験管へ移し、３モ
ルNaCl水溶液10mを加えて粒子を“塩析”する。10分間
室温で凝集された後、粒子を10分間1500rpmで遠心分離
する。無色透明の上清を廃棄する。ペレットを再懸濁
し、２回以上遠心分離した後に20mMリン酸緩衝液を20ml
中の最終懸濁液を受け取る（この時点で音波処理は通常
必要ない）。

粒子を、都合良く検定される抗原として、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼに特異的なヤギ抗血清と結合
する。抗血清はSPDPとの反応により活性化される。30分
間室温にて、総タンパク質1.28mgを含む抗血清0.128ml
をSPDP12.8μｇと反応させ、リン酸緩衝液0.512mlへ希
釈する。30分後、ジチオスレイトール（DTT）3.1mgを加
えSPDPをその遊離スルフヒドリル形へ転化する。反応さ
れたAbは小さいゲル濾過カラム中で分離する（脱塩
化）。

チオール化抗血清とSPDP−活性化粒子を6.4ml含有抗
体（100％回収であれば抗血清タンパク質 .64mg）を加
えることにより反応させ鉄14mgを含む粒子とする。反応
混合物中の濃度は抗血清タンパク質については1.0mg/ml
であり粒子鉄では2.2mg/mlであり、総量6.4mlである。
４℃で１時間後、粒子を塩析し洗浄する。

ペレットを3.2mlリン酸緩衝液中で再懸濁し、１分間
音波処理を行なう。

マグネタイトが結合した抗ペルオキシダーゼの抗原結
合活性は、遊離ホースラディッシュペルオキシダーゼ
（HRP）を用いて粒子のアリコートをインキュベート
し、粒子を塩析し、これらを洗浄し、発色分析で酵素活
性について再懸濁粒子を分析する。抗体結合粒子は、無
関係な抗原に特異的である同様な抗体と結合した対照粒
子調製物と同じ程沢山の酵素を10回を越えて捕捉した。

例３沃素の放射性同位体を含む粒子粒子を例２に記載の方法により作るが、ただし少量の
放射性沃素化（¹²⁵I）BSAをタンパク質成分のトレーサ
ーとして反応物へ加え、そして沈澱反反応における鉄お
よびBSAの量を以下のように変えた４つの調製物を作
る： A.1.25mgFe/mlおよび1.5mgBSA/ml（通常の濃度） B.3.75mgFe/mlおよび1.5mgBSA/ml（鉄濃度が高い） C.1.25mgFe/mlおよび5.0mgBSA/ml（BSA濃度が高い） D.3.75mgFe/mlおよび5.0mgBSA/ml（鉄濃度およびBSA濃
度が高い）沈澱後すぐではあるがいずれの洗浄工程も行なわない
時点で、サンプルをカウント混合物中の放射性ラベルを
定量する。次いで粒子を遠心分離し、洗浄し、再懸濁
し、そしてカウントする。その結果、混合物ＡおよびＢ
についてはBSAの完全な利用（マグネタイトペレットへ
の混入）、高BSAサンプル（Ｃ）ではわずか60％の混
入、そして鉄対タンパク質のほぼ最初の比に戻るまで鉄
の量を増やした場合（サンプルＤ）には完全な混入まで
戻ることが明らかになった。鉄が完全にマグネタイト
（Fe₃O₄）へ転化したと仮定すれば４つの調製物の組成
は次のようである： A.46％タンパク質、54％マグネタイト B.22％タンパク質、78％マグネタイト C.63％タンパク質、37％マグネタイト D.49％タンパク質、51％マグネタイト沈降および音波処理による再懸濁の間のBSA損失に対
するタンパク質−マグネタイト粒子の安定性を試験す
る。再懸濁後、粒子を再び“塩析”し、上清に残った放
射性BSAをカウントする。粒子へ混入された平均40％
（標準偏差＝11％）のカウント物が損失した。この方法
を繰り返すと、次の洗浄における損失が減少した（14
％、標準偏差＝４％）。

例5.−抗原と結合した粒子を用いた磁性免疫検定の証明上記例２に記載したように、粒子を沈澱させそしてSP
DPを用いてヒトIgMと結合して磁性抗原を作る。粒子−I
gM磁性抗原は、アルカリホスファターゼ酵素（Ab−Ap）
が結合したヒトIgMに対する市販抗体と結合する。Ab−A
pの1:500の希釈液を、１％BSA含有ホスフェート100μ
中でIgM−マグネタイト約250μｇとともにインキュベー
トする。IgM−マグネタイトに結合したAb−Apの量は、
小さい磁性フィルターにインキュベーション混合物を通
過させることにより定量される。次いでフィルター床を
過剰の緩衝液で洗い、酵素基質を含む緩衝液を入れる。
15分間インキュベーションしてから、緩衝液を溶出しフ
ィルター上に捕獲された酵素により生ずる反応生成物の
量を光学密度測定により測定する。

上記方法はヒトIgMに対する競合型免疫検定法の基本
を形成する。少量の遊離IgMをインキュベーション混合
物へ加えると、磁性−抗原による酵素の捕獲は特異的に
阻害される。インキュベーション混合物におけるIgMの
関数としてフィルター上の酵素活性を減少をグラフ化し
て検量線を作る。これは、この方法を競合型免疫検定法
として使用することを可能にしIgMの未知量を測定でき
る。感度はほぼ0.15mg/ml（フィルターにおける酵素活
性の特異的捕捉を50％減少するIgMの濃度）である。

例６−活性を保持する抗体を含有する粒子の調合による
直接製造 BSAとヤギ抗体（ヤギの抗−ウサギ−免疫グロブリン
のIgG分画）の混合物を用いて７つの沈澱反応を行な
う。各々における抗体の総量は .75または.375mg/mlの
いずれかである。これへBSAを加えないか、または.37
5、.75、1.5もしくは3.0mg/mlまで総タンパク質を増や
すに十分な量のBSAを加える。各2mlサンプルへFeCl₂3.5
mgとFeCl₃7.0mgを加える。30％NH₄OH20μを加えて粒
子を沈澱させpH9.4にする。次いで配合物を酢酸で中和
し、遠心分離機中で回転しそして洗浄する。ペレット化
粒子を各々２分間音波処理して再懸濁する。各調製物の
半分を数時間二官能性試薬EGS（0.31mg/ml）を用いて処
理する。EGS処理後、1.5M NaClで粒子を塩析し、洗浄
し、そして各々１分間の音波処理により再懸濁する。

IgG（BSAなし）で作られたEGS処理なしの粒子は約24
時間のうちに懸濁液から自然に沈降する。これは、0.75
mg/mlおよび0.375mg/ml調製物の両方ともに本当であ
る。しかしながら、両方ともEGS処理を受けた調製物の
半分は懸濁液中で安定であり、使用可能である。

血球凝集反応により12のサンプルをヤギ−抗−ウサギ
−Ig活性について試験する。微量滴定板の一連の凹部に
ヤギの赤血球細胞（SRBC）とSRBCに対するウサギ抗体の
副−凝集反応濃縮物を含むように組立てる。それぞれの
列において、列の各々連続する凹部に２倍ずつ減少する
濃度で粒子を加える。数時間後、凝集が見られうる最大
凹部を各々の列について観察する。より活性な粒子がよ
り低濃度（より大きな凹部番号）で凝集する。12の調製
物についての結果を次表に示す。

２週間４℃で貯蔵後、血球凝集を総タンパク質1.5mg/
mlで作られたサンプルか繰り返す。活性は実質的に変化
しない。結合の特異性は、抗−SRBC抗体が排除されてい
る対照列の凹部では血球凝集が見られないという事実に
より示される。

結論：（ｉ）抗原結合活性はEGSにより強く影響される。同じ
総タンパク質で作られた粒子において、Abをより多量に
含む調製物においてより活性であることが見られた。

（ii）いずれかの量のAbを含むがしかし増加する量のBS
Aを含む粒子において、総タンパク質1.5mg/mlまで改善
されそしてその点以上では活性が若干低下するように見
える。

例７ ¹²⁵I−標識化タンパク質（HSA）を含む磁性粒子で実
験を行ないタンパク質組成物に関係する粒子の安定度を
評価する。

物質および方法粒子を、ICl法によりヨウ素化された¹²⁵I−ラベル化H
SAを用いて調製する。３つの調製物を、0.05,0.5および
1.0mg/mlのHSAの総タンパク質濃度を含むように作られ
る。これらサンプルの各々は同量のFeを用いて調製され
る。“温”および“冷”タンパク質の相対割合は特異的
活性（4,000c.p.m/μｇ）がそれぞれの場合同じである
ように調節される。

結果各々の場合、粒子形成後ただちに上清中に存在する放
射性ラベルの量を評価する。続く洗浄工程において失な
われる放射性ラベルの量もまた測定される。最終的に音
波処理した粒子懸濁液を放射性・ラベルについて評価
し、Fe含量およびタンパク質/Fe比がしたがって測定さ
れる。結果を第IV表に要約する。

使用される条件下で、最終Fe含量はほぼ１−1.56mg/m
lである。0.05および0.5mg/mlのタンパク質濃度を含む
調製物の場合にラベル化タンパク質のほとんどすべてを
初期沈澱物へ混入する。しかしながら、タンパク質が1m
g/mlの濃度で使用される場合、放射性ラベルの実質的割
合（ほぼ30％）が上清中に残る。このことは、これらの
条件下でタンパク質をタンパク質濃度0.5mg/mlまで混入
することに関して粒子形成が有効であることを示す。よ
り高いタンパク質濃度が飽和効果をもたらす結果となり
これにより過剰のタンパク質が溶液中に残るようであ
る。

この結論は、タンパク質Fe比が実質的にタンパク質0.
05から0.5mg/mlまで上昇するが、しかし1.0mg/mlでさら
にこれ以上の増加が見られないという事実によりさらに
立証される。

粒子は洗浄工程を通してタンパク質含量に関して比較
的安定であるようである（重大なことに、粒子が高HSA
濃度で形成すると、続く粒子の洗浄工程の間により多く
の放射性ラベルを失なう）。¹²⁵I−ラベルの損失の幾ら
かは少量の影響されないタンパク質／マグネタイト粒子
の損失により計測されるということも注意すべきであ
る。

また、これら粒子調製物における遊離タンパク質の存
在をゲル濾過により評価する実験も行なう。予備実験に
よれば非常にわずかなタンパク質が音波処理後に“粒子
−遊離”になるようであることが示された。また、調製
物を７日間まで貯蔵するともうこれ以上のタンパク質
が、“滲出”しないようである。さらに、第二の音波処
理は遊離タンパク質の割合を増加しないようである。

上記技術により、反応基を有するポリマーを使用して
光活性粒子を作り次いで特定の生物機能化合物と結合す
るようにしてもよい。

例８−比較例モルデイの調製法を反復しそしてこれらの本発明方法
と比較する試みにおいて、２系列の反応混合物を調製す
る。混合物の第一列はモルデイにより教示されるように
デキストランと鉄濃縮物で始まり、10の累乗ずつデキス
トラン濃度を逐次減少して最終粒状特性におけるデキス
トラン濃縮物効果を評価する。反応混合物の第二の系列
は本発明にしたがってデキストランと鉄濃縮物で始まり
10の累乗ずつデキストラン濃縮物を逐次増加する。これ
らの系列の調製物結果を第III表にまとめる。

比較データから明らかなように、モルデイにより示さ
れた手段に従う調製物は再懸濁性粒子をうることができ
ない。デキストランの濃度が本発明で用いられる範囲の
方向へ減少するにしたがって、生成物粒子の品質が落ち
これらの粒子の懸濁液が不安定になる。これと対照的
に、本発明により示されるようにデキストランと鉄の濃
縮物は、弱い磁性の粒子の限界的に許容されうる安定な
懸濁液を生産する。モルデイにより示される方向へデキ
ストラン濃度を増やすと、しかしながら、沈澱しない結
果となりそして粒子は製造されない。条件におけるこの
分岐点、ならびに粒子の大きさにおけるある種の性質的
差異、および鉄対ポリマー比が、モルデイにより示され
る方法および生成物と本発明によるものとの間に非常な
差異があることを示す。

前記例より、次の結論が本発明により引き出される：ｉ）本発明の粒子は、ａ）磁性であり、ｂ）水性懸濁液中で安定であり、ｃ）再懸濁性であり、ｄ）小さく（すなわち濾過滅菌可能）、ｅ）特定の生物学的機能を含むように容易に製造さ
れ、ｆ）懸濁液中で透明である。

ii）粒子は作られそして続いて通常の二官能性試薬を用
いて特定の生物機能的リガンドへ結合されてもよい。

iii）特定の生物機能的リガンドはまたは生物活性を重
大に損なうことなく共沈の間にポリマーとしても働く。

iv）二官能性試薬を用いた粒子の処理は、粒子径に非常
に影響を与えることなく、粒子と懸濁液の両方ともの、
とりわけ安定性を向上しうる。

ｖ）特定の生物機能的リガンドと結合すると、粒子は興
味のある生物学的材料に対する磁性免疫検定に用いられ
うる。

vi）粒子は溶液または組織における隣接プロトンのNMR
緩和時間を減少する。この減少はT₂（スピン−スピン）
緩和についても最も著しい。

本発明は特定の例に関連して記載されているが、それ
にもかかわらず方法条件の他の変動およびパラメーター
が発明の真の精神を逸脱することなく使用されうること
は当業者により理解されるであろう。次の請求の範囲は
このような変動のすべてを含むように構成されるべきで
あることが予定される。

工業的有用性の陳述本発明は新規磁性ポリマー粒子およびこれを作る方法
からなる。これらの粒子は、細胞捕獲を含む様々な生物
学的／医学的分野に有効であり、NMRイメージング、固
定酵素反応剤、免疫検定法および他の分析および診断技
術の対照試薬として使用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダンジェロ，ルイスアメリカ合衆国，ニュージャージー 08009，バーリン，ウォッシュバーンアベニュ 35 (72)発明者リバティ，ポール，エーアメリカ合衆国，ペンシルバニア 18966，チャーチビレ，グリーンドライブ 58 (56)参考文献特開昭55−143440（ＪＰ，Ａ) 米国特許4169804（ＵＳ，Ａ) 米国特許4247406（ＵＳ，Ａ) 米国特許4001288（ＵＳ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）磁性沈澱物を形成する反応を行ないう
る遷移金属イオンの水溶液と利用可能な配位部を有する
ポリマーを再懸濁可能な生成物を作るのに適する割合で
調製し；ｂ）前記ポリマーの存在下に前記金属イオンを反応させ
て磁性−ポリマー粒子を含んでなる磁性沈澱物を形成
し；ｃ）前記磁性−ポリマー粒子を回収する工程を含んでなる磁性−ポリマー粒子の調製方法。
【請求項２】ｄ）前記磁性ポリマー粒子を水溶液中で再
懸濁する工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項３】前記水溶液が安定な懸濁液の形成に適した
低イオン濃度である請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】ｅ）多くても0.44μｍ径の孔を有するフィ
ルターを通して懸濁液を濾過する工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】ｆ）前記磁性ポリマー粒子を、該ポリマー
に特異的な二官能性化合物と反応させる工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】ｆ）前記磁性−ポリマー粒子を、主に粒子
内結合を形成するのに適する二官能性化合物と反応させ
る工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】ｆ）前記磁性−ポリマー粒子を、主に粒子
内結合を形成するのに適する二官能性化合物と反応さ
せ、前記二官能性化合物がアリールニトレン、イミド−
エステル、Ｎ−ヒドロオキシスクシンイミド−エステ
ル、２−ジアゾ−3,3,3−トリフルオロプロピオネー
ト、マレイミド、ピリジル−ジスルフィド、ハロニトロ
ベンゼン、イソチオシアネート、ハロ−スルホネート、
活性ハロゲンおよび活性アルデヒドからなる群から選択
される末端基を有する工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項８】ｇ）前記磁性−ポリマー粒子を二官能性化
合物および生物機能的リガンドの両方と反応させる工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項９】ｇ）前記磁性−ポリマー粒子を活性化剤お
よび生物機能的リガンドの両方と反応させる工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１０】ｇ）前記磁性−ポリマー粒子を、主に粒
子外結合を形成するのに適する二官能性化合物であって
該二官能性化合物が、アリールニトレン、イミド−エス
テル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル、２−
ジアゾ−3,3,3−トリフルオロプロピオネート、マレイ
ミド、ピリジル−ジスルフィド、ハロニトロベンゼン、
イソチオシアネート、ハロ−スルホネート、活性ハロゲ
ンおよび活性アルデヒドからなる群から選択される末端
基を有するものおよび抗原、抗体、レクチン、アビジ
ン、ビオチン、ブドウ状球菌プロテインＡ（SPA）、酵
素、血清タンパク質、Clq、補体タンパク質、およびリ
ウマトイド因子からなる群から選択される生物機能的リ
ガンドの両方と反応させる工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１１】ｇ）前記磁性−ポリマー粒子を、水溶性
カルボイミド、グルタムアルデヒド、ハロゲン化シア
ン、過ヨウ素酸塩、およびタンニン酸からなる群から選
択される活性化剤および抗原、抗体、レクチン、アビジ
ン、ビオチン、ブドウ状球菌プロテインＡ（SPA）、酵
素、血清タンパク質、Clq、補体タンパク質、およびリ
ウマトイド因子からなる群から選択される生物機能的リ
ガンドの両方と反応させる工程をさらに含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１２】溶液中の遷移金属イオンがFe（II）とFe
（III）の混合物である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１３】溶液中の金属対ポリマーの重量比が100
0:1と1:10の間である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１４】前記反応（工程ｂ）を音波処理の影響下
で行なう請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１５】前記再懸濁（工程ｄ）を音波処理の影響
下で行なう請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項１６】前記再懸濁（工程ｄ）を音波処理を影響
下で行なう請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項１７】低濃度（＜40mM）の陰イオンを再懸濁
（工程ｄ）の間に溶液へ加える請求の範囲第16項記載の
方法。
【請求項１８】前記ポリマーが、合成タンパク質、天然
タンパク質、ポリ−アミノ酸、カルボキシ−ポリ−アル
キル、アルコキシ−ポリ−アルキル、アミノ−ポリ−ア
ルキル、ヒドロキシ−ポリ−アルキル、スルホキシ−ポ
リ−アルキル、カルボキシ−ポリ−アルキレン、アルコ
キシ−ポリ−アルキレン、アミノ−ポリ−アルキレン、
ヒドロキシ−ポリ−アルキレン、スルホキシ−ポリ−ア
ルキレン、ポリ−シラン、ポリ−ホスフィンおよびこれ
らのコポリマーの群から選択される請求の範囲第１項記
載の方法。
【請求項１９】前記陰イオンがホスフェート、ボレート
またはスルフェートの群から選択される請求の範囲第17
項記載の方法。
【請求項２０】前記ポリマーが利用可能な配位部を有す
るオキシ−酸官能基を含む請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項２１】前記ポリマーが利用可能な配位部を有す
るタンパク質である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２２】ｈ）塩を前記懸濁液へ加えてそのイオン
濃度を増加し、前記磁性−ポリマー粒子の凝集および沈
澱を起こさせるのに適するモル濃度とし；ｉ）前記凝集し沈澱した粒子を分離し；ｊ）安定懸濁液を形成させるのに適する低イオン濃度の
水溶液に前記磁性−ポリマー粒子を再懸濁する工程をさらに含む請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項２３】前記遷移金属イオンが、少なくとも１つ
の不対電子を有しスピネルまたは逆スピネル構造を有す
る共沈物を形成するものからなる群から選択される請求
の範囲第１項記載の方法。
【請求項２４】前記遷移金属イオンが次の群； Co（II）＋Ga（III） Ga（III）＋Er（III） Co（II）＋Ru（III） Ga（III）＋Ru（III） Co（II）＋Mn（II） Ga（III）＋Mn（II） Ga（III）＋Ｖ（III） Co（II）＋Ｖ（III） Ga（III）＋Mo（Ｖ） Ga（III）＋Fe（III）Ｖ（III）＋Fe（III） Mn（II）＋Ru（III）Ｖ（III）＋Mn（II） Co（II）＋Mo（Ｖ） Cr（III）＋Ga（III） Cr（III）＋Mn（II） Er（III）＋Ru（III） Er（III）＋Co（II） Mn（II）＋Er（III） Cr（III）＋Fe（II）から選択される一対のイオンからなる請求の範囲第１項
記載の方法。
【請求項２５】前記遷移金属イオンがFe（II）およびFe
（II）をFe（III）へ酸化するには不十分な起電力ポテ
ンシャルを有する遷移金属イオンからなる請求の範囲第
１項記載の方法。
【請求項２６】ｋ）反応により利用可能な配位部を有す
る磁性沈澱物およびポリマーを形成しうる水溶液を調製
し；ｌ）理論量より過剰の強塩基を加え；ｍ）前記溶液を攪拌し；ｎ）磁性−ポリマー粒子を沈澱させ；ｏ）前記磁性−ポリマー粒子を回収する工程からなる強磁性−ポリマー粒子を調製方法。
【請求項２７】塩基の添加（工程ｌ）を、溶液がやや塩
基性pHになるまで塩基で溶液を滴定することにより行な
う請求の範囲第26項記載の方法。
【請求項２８】前記ポリイマーがタンパク質であり、前
記溶液のpHが前記タンパク質を変性するのに要求される
より低く保たれている請求の範囲第26項記載の方法。
【請求項２９】請求の範囲第３項の方法により調製され
る磁性−ポリマー粒子の安定水性懸濁液。
【請求項３０】ａ）反応して磁性沈澱物を形成しうる遷
移金属イオンの水溶液と利用可能な配位部を有するポリ
マーを、再懸濁可能な粒子を作るのに適する割合で調製
し；ｂ）前記ポリマーの存在下に前記金属イオンを反応させ
て磁性ポリマー粒子からなる磁性沈澱物を形成し；ｃ）前記磁性−ポリマー粒子を回収し；ｄ）前記磁性−ポリマー粒子を水溶液を再懸濁し；ｅ）前記磁性−ポリマー粒子を、主に粒子外結合を形成
するのに適する二官能性化合物と生物機能的リガンドで
あって該生物機能的リガンドは前記予め決められた種類
をものと結合しうる特異性があるものの両方と反応さ
せ；ｆ）前記生物機能的リガンドを含む前記磁性ポリマー粒
子の懸濁液へ前記予め決められた種類の未知量を含む混
合物をさらし、これにより前記生物機能的リガンドを前
記予め決められた種類と結合させ；ｇ）磁場を有する磁気フィルターに前記混合物を通過さ
せ、該フィルターは前記磁性−ポリマー粒子を保持する
に適するものであり；ｈ）前記磁場を前記フィルターから除去し、そして前記
保持された磁気−ポリマー粒子を溶出し；ｉ）前記予め決められた種類と関連する所望のデータを
提供するに適する予め選択された分析方法により前記溶
出した磁性−ポリマー粒子を分析する工程からなる予め決められた種類の分析方法。
【請求項３１】工程ｄが、前記磁性−ポリマー粒子を低
イオン濃度を有する水性緩衝溶液中に再懸濁させ前記懸
濁液を多くても0.44μｍ径の孔を有するフィルターに通
して濾過し前記懸濁液を滅菌することを含む：請求の範囲第30項記載の分析方法。
【請求項３２】前記二官能性化合物がアリールニトレ
ン、イミド−エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
−エステル、２−ジアゾ−3,3,3−トリフルオロプロピ
オネート、マレイミド、ピリジル−ジスルフィド、ハロ
ーニトロベンゼン、イソチオシアネート、ハロ−スルホ
ネート、活性ハロゲンおよび活性アルデヒドからなる群
から選択される末端基を有する：請求の範囲第30項記載の分析方法。
【請求項３３】前記生物機能的リガンドが、抗原、抗
体、レクチン、アビジン、ビオチン、ブドウ状球菌プロ
テインＡ（SPA）、酵素、血清タンパク質、Clq、補体タ
ンパク質、およびリウマトイド因子からなる群から選択
される：請求の範囲第30項記載の分析方法。
【請求項３４】前記生物機能的リガンドが、抗原および
これらの抗体、ハプテンおよびこれらの抗体、ホルモン
およびこれらのレセプター、ビタミンおよびこれらのレ
セプター、毒素およびこれらのレセプラー、薬物および
これらのレセプター、ならびに酵素およびこれらの補因
子の群から選択される結合対の半分を提供するように選
択される：請求の範囲第30項記載の分析方法。
【請求項３５】前記懸濁液をさらに凝集剤で処理して前
記磁性−ポリマー粒子の凝集を促進する請求の範囲第30
項記載の分析方法。
【請求項３６】前記凝集剤が第II族金属の塩である請求
の範囲第35項記載の分析方法。
【請求項３７】前記凝集粒子を手で握る永久磁石を用い
て濾過する請求の範囲第35項記載の分析方法。
【請求項３８】前記凝集剤により起こされる凝集量は、
手で握る永久磁石により懸濁液1mlから３分で前記凝集
粒子の捕捉ができるほど十分であるが、しかし１時間未
満で前記凝集粒子を懸濁液から沈澱させるには不十分で
ある請求の範囲第35項記載の分析方法。