JP2547263B2 - 立体配座的に安定化された細胞付着ペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般にはペプチド類、さらに詳しくは細胞
接着系に関与しているペプチド類に関する。

発明の背景 細胞の他の細胞との、あるいは細胞外マトリックスと
の接着は、生物における細胞の秩序のある発育および機
能発揮に重要である。細胞接着は、ある種の接着リガン
ドおよびそれに対応する受容体によって媒介される。こ
のような接着リガンドには糖タンパク質であるフィブロ
ネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンが含まれ
る。これら３種の全てはトリペプチド配列であるアルギ
ニン−グリシン−アスパラギン酸（Arg−Gly−Asp、す
なわちＲ−Ｇ−Ｄ）を含んでおり、これがこれら分子に
結合する細胞表面の受容体の１次認識部位として機能し
ている。Arg−Gly−Asp配列を含有する合成ペプチド
は、ペプチド被覆された表面として細胞に供されると、
天然のフィブロネクチンまたはビトロネクチンと同様に
細胞接着を促進する。溶液中では、そのようなペプチド
は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーグン、
そのペプチド自体またはArg−Gly−Asp細胞接着部位を
有するいくつかの他の接着タンパク質で被覆された表面
への細胞付着を阻害し得る。

現在、それぞれのリガンドのArg−Gly−Asp配列を認
識するいくつかの受容体が同定されている。これらの受
容体の中には、特異的なリガンドにだけ親和性を有して
いるものと、程度は異なるが上記のトリペプチドを含有
する２またはそれ以上のリガンドと相互作用するものが
ある。従って、受容体認識および結合には、Arg−Gly−
Asp配列十分ではあるが、それでもなお、このペプチド
の残りのアミノ酸配列がリガンド−受容体相互作用の特
異性に重要であることがわかる。この残りの配列が結合
に影響を与える正確な機序は今までにわかっていなかっ
た。

当分野のある研究者らが持っている１つの見解は、所
与の接着タンパク質のその受容体に対する特異性は、そ
の付着タンパク質中の、Arg−Gly−Asp部位外の１また
はそれ以上の受容体結合部位の存在に依存しうるという
ものである。この見解に従えば、Arg−Gly−Asp部位は
共通の係合部位であり、別の１つあるいはそれ以上の部
位が特異性の原因となる［例えば、Yamadaら、（198
7），Biochem.and Biophys.Res.Comm．144:35;Wright
ら，（1987），PNAS 84:1965を参照］。別の可能性
は、Arg−Gly−Asp配列が受容体結合のための実質的に
全ての情報を与え、接着タンパク質に受容体特異性を付
与するのはこの配列の立体配座であるというものであ
る。種々のペプチドホルモン類の結合部位は小さいこと
が知られており（Roseら，（1985），Adv.in Chemistry
37:1）、通常、これらのペプチド類は全部で約10個の
アミノ酸を含有しているにすぎない。対照的に、２つの
フィブロネクチンポリペプチド鎖は、それぞれ2000個を
越えるアミノ酸を含有している。ただ１つのアミノ酸ト
リプレットの立体配座が、それを保持している多数の異
ったタンパク質の機能に重要でありうるという考えは新
規である。

Arg−Gly−Asp配列を含有する合成ペプチドは、細胞
の付着の促進と阻害の両方を行うことができるという点
で有用である。１またはそれ以上の種々の接着タンパク
質中のArg−Gly−Asp配列を認識することが知られてい
るか、または認識すると推定されている。少なくとも10
種類の異なる接着受容体が存在する。十分正確に、その
ような接着タンパク質の機能を再現するか、またはその
ような機能を特異的に阻害するペプチドは、例えば血
栓、転移、炎症、傷治癒、および補欠インプラントの拒
絶などの重要な生理学的現象の操作に大きな可能性を与
える。

従って、目的の受容体にとって最適の特異性を与える
アミノ酸構造を有するペプチドが必要とされている。本
発明はこの要求を満たし、そしてそれに関連したその他
の利点をも提供する。

発明の要約 本発明は、立体化学的な配座が制限されているため
に、受容体に対して高い親和性および特異性を有してい
る新規な合成ペプチドに関する。このような制限、ある
いは安定化は、例えば環化によって、螺旋などの制約立
体配座構造中に包含させることによって、天然アミノ酸
の異性体もしくはアミドなどの別の化学構造を付与する
ことによって、またはその他の方法によって得ることが
できる。このようなペプチドは、あらゆる数の範囲の残
基を有し得るが、好ましくは３〜100の範囲であり、さ
らに好ましくは７〜30の範囲である。特に、直鎖状のAr
g−Gly−Asp含有の合成ペプチドより、ビトロネクチン
受容体に対する親和性および選択性が高い環状ペプチド
が提供される。この環状ペプチドの親和性および選択性
は天然ビトロネクチンのそれに匹敵する。

ある状態では、本発明は、Arg−Gly−Asp配列の周囲
のアミノ酸の間で架橋が形成された約10アミノ酸を有す
るペプチドを含む。その適当な構造は次のようである： このぺプチドは、Arg−Gly−Asp配列と架橋を形成す
る残基の間に約１〜４個のアミノ酸を有し得る。架橋残
基は、例えばペニシアミンおよびシステイン、またはジ
ルスフィド架橋などの架橋を形成することができるその
他のアミノ酸であり得る。

別の適当な構造は次のようである： あるいは、ペプチドはアミノ酸残基の間のペプチド結
合によって環化され得る。その適当な構造の１つは次の
ようである： 本発明は、接着リガンドの特異性がArg−Gly−Asp部
位の外側の別の結合部位に帰するのではなく、そのよう
な特異性は、残りのペプチドの構造によってArg−Gly−
Asp配列に賦課された立体配座構造に起因することの証
拠を与えるものである。実際的には、本発明は、立体配
座が制限された、Arg−Gly−Asp含優のペプチドが、制
限を受けていないその対応ペプチドに比べてより高い結
合親和性および異なる受容体特異性を有し得る、という
ことを示している。このことにより、種々の受容体特性
および親和性を有する他のArg−Gly−Asp立体配座の合
成が可能である。

本発明の安定化されたペプチドはその細胞接着の性質
に関連した種々の応用分野を有している。例えば、ペプ
チドの構造が、 である１の態様では、このペプチドは直鎖状の合成Arg
−Gly−Asp分有ペプチドに比べて、ビトロネクチン受容
体に対する親和性が高く、そしてフィブロネクチン受容
体に対する親和性が低い。従って、このペプチドを用い
てビトロネクチン受容体含有細胞外細胞培養の基質に結
合するのを効率的に阻害することができる。別の態様で
は、この安定化ペプチドは、例えば細胞培養基質を被覆
することによって、ビトロネクチン受容体を発現してい
る細胞の接着を促進するために有用に用いられ得る。さ
らに、この安定化ペプチドは、細胞の付着が望ましい人
工補欠物などのインビトロ移植用の材料を被覆するのに
用い得る。

図面の簡単な説明 本発明を、本明細書に添付した図面を参考にしながら
説明する。

第１図は、環状ペプチドの粗調整物（ａ）；および精
製した環状ペプチド（ｂ）のHPLC分析のグラフである。

第２図は、同じアミノ酸配列を有する環状および直鎖
状ペプチドの存在下での、正常ラット腎細胞のフィブロ
ネクチンおよびビトロネクチンへの付着を示すグラフで
ある。

第３図は、実施例３のペプチドの配列および自動エド
マン分解によって回収したその分離産物の回収を示すも
のである。

第４図は、第３図のペプチドの溶液によって得られる
施光度の変化を温度上昇の関数として記録しており、低
温で立体配座が制限されていることを示す。

第５図は、実施例４のペプチドの軸投影図である。破
線より上の残基は親油性であり、破線より下の残基は親
水性である。

第６図は、実施例６の環状ペプチドの合成を反応式に
よって示すものである。

発明の詳細な説明 本明細書の用語「立体配座的に安定化された」または
「立体配座的に制約された」は、あるペプチドがとり得
る可能性のある立体化学構造の数に制限が課された状態
を意味する。本発明に関しては、そのような制限は、Ar
g−Gly−Asp結合部位の立体配座に課されるものであ
り、その制限は、該結合部位の可能性のある構造的立体
配座を、トリペプチド配列単独の場合に仮定される数よ
りも少ないものに制限する該結合部位の周囲の化学構造
の存在に起因している。このような立体配座的に安定化
されたArg−Gly−Asp含有ペプチドは、それでもなお、
少なくとも１つの受容体との係合活性を示す。「周囲の
化学構造」は、アミノ酸またはその他の化学的部分を指
し得、結合部位にすぐに隣接して存在する部分、ならび
に介在アミノ酸の存在によって結合部位それ自体から離
れている部分の両方を指し得る。用語「Arg−Gly−Asp
配列の周囲のアミノ酸」は、Arg−Gly−Asp配列に隣接
する残基ならびに介在残基によってArg−Gly−Asp配列
から離れている残基の両方を指す。

本明細書の用語、「Arg−Gly−Asp含有ペプチド」
は、 「Arg−Gly−Aspファミリーの受容体」、即ちArg−Gly
−Asp配列を認識し、これに結合する受容体のための結
合部位として機能することができる１またはそれ以上の
Arg−Gly−Asp含有結合部位を有するペプチドを意味す
る。Arg−Gly−Asp配列は結合活性を保持するために不
変であることが必須とわかっているが、残りのペプチド
の組成ならびにペプチドと結合して存在する他のあらゆ
る化学的結合部分は、結合部位の活性に必ずしも影響す
ることなく変わり得る。Arg−Gly−Asp配列以外に特異
的な化学構造または配列が存在する場合、結合部位の機
能を破壊しない種々の修飾は当該ペプチドの定義から逸
脱することなく包含される。

本明細書の用語「架橋」は、ペプチド骨格を形成して
いる。アミド結合以外のペプチド中の２つのアミノ酸の
間の化学結合を意味する。

本発明の用語「ペプチド結合」または「ペプチド連
結」は、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸
のα−アミノ基の間のアミド結合を意味する。

本明細書で用いるアミノ酸の略語を以下に挙げる： Ala アラニン α−ABA α−アミノイソ酪酸 Arg アルギニン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Glu グルタミン酸 Gly グリシン Leu ロイシン Lys リジン Pen ペニシラミン Pro プロリン Ser セリン SuccAla セクシニル−アラニン 本発明は、立体配座的に安定化された形態の、Arg−G
ly−Asp配列を含有する新規な合成ペプチドを提供する
ものである。ある態様では、このペプチドは、Ｘ−R₁−
R₂−Arg−Gly−Asp−R₃−R₄−Ｙの配列を含む。配列
中、R₁およびR₄はペプチド結合、またはジスルフィド架
橋などの架橋を形成するか、または形成し得るアミノ酸
であり、R₂およびR₃はそれぞれ０〜５個のアミノ酸の配
列でおり、Ｘは１またはそれ以上のアミノ酸またはＨで
あり、Ｙは１またはそれ以上のアミノ酸またはOHまたは
NH₂であり、そしてＸとＹの合計数は約０〜100個のアミ
ノ酸であるのが好ましく、より長い配列が有用であるこ
ともある。好ましい実施態様では、R₁はペニシラミンで
あり、R₄はシステインであり、R₂はグリシンであり、そ
してR₃はSer−Proであり。それぞれＸおよびＹで示され
ているNH₂およびCOOH末端に付加的なアミノ酸が存在し
うる。

このようなペプチドは、好適の化学合成法を含むあら
ゆる適当な方法によって合成し得る。直鎖状の配列は、
市販の自動ペプチド合成機を用いて合成するのが好まし
い。このようにして合成した物質は、沈澱させ、例えば
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によってさらに精
製し得る。95％以上の純度の合成ペプチドが好ましい
が、それより低い純度であってもよい。

細胞接着系に関連する特定の細胞表面受容体に対して
高い特異性及び親和性を有する本発明の安定化ペプチド
の１つを得るために、当分野で公知の方法を用いて合成
されたペプチドを環化する。例えば、残基がスルフヒド
リルを含有している場合、ペプチドの希水溶液をK₃［Fe
（CN）_６］で酸化することによってジスルフィド架橋を
得ることができる。当分野で既知の他の環化の方法もま
た用い得る。

また、本発明の安定化された環化ペプチドは、隣接し
ていないアミノ酸残基の間にペプチド結合を形成させる
ことによっても調整し得る。そのようなペプチド結合の
形成方法は、Schilleら.,Int.J.Peptide Protein Res．
25:171（1985）に記載されており、この文献の記載は本
明細書に援用されている。簡単に言うとＮ^α−Fmoc−ア
ミノ酸およびBocおよび３級−ブチルタンパク質を用い
てペプチド鎖を組み立てることにより、メリフィールド
樹脂上で環状ペプチドを合成し得る。

また、安定化されたペプチドを、当分野で公知の方法
に従い、アルファ（α）螺旋または三重螺旋などの螺旋
を形成するように設計または処理することによって調製
し得る。

本明細書に記載の安定化されたペプチドは、例えばビ
トロネクチンを含む接着タンパク質の類似物として用い
得る。好ましい配列を持った環状ペプチドのビトロネク
チン受容体に対する親和性は、類似の直鎖状配列のそれ
よりも高いので、この環状ペプチドを用いて、フィブロ
ネクチン受容体などの他の受容体に影響を及ぼすことな
くビトロネクチンの結合を阻害し得る。別の方法では、
この環状ペプチドを用いて、細胞培養の基質を被覆する
などの処理によってビトロネクチン受容体を発現してい
る細胞の付着を促進することができる。

Arg−Gly−Asp配列を含有するある特定の構造が、結
合部位に特定の特異性またはその他の特性を付与するこ
とがわかった。そのような構造には、配列−Arg−Gly−
Asp−NH₂、−Ｄ−Arg−Gly−Asp−および−Arg−Gly−A
sp−Ｄ−Ser−が含まれる。立体配座的に安定化された
後者の配列は、フィブロネクチン受容体に対して有用な
親和性を示すが、ビトロネクチン受容体にはそのような
親和性を示さない。天然のアミノ酸の鏡像異性体が存在
すると、Ｄ−Argの場合において、トリブシンなどの分
解酵素に対して耐性が付与されることがわかっている。
その他の有用なペプチドには、配列Phe−Arg−Gly−Asp
−Ser−Pro、Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−PheおよびPhe
−Arg−Gly−Asp−Ser−Pheが含まれる。

本発明のペプチドを人工補欠物またはインプラント
（例えば、血管インプラント）を含む医学装置の被覆な
どのインビボの用途に工業的に用いて、それらに対する
細胞の付着を容易にし得る。さらに、本ペプチドは、細
胞接着を促進するための基質（細胞培養基質など）の被
覆への、インビトロでの用途も有している。

本発明の他の特徴および利点は、以下に挙げるさらに
詳細な実施例によって明らかとなる。これらの実施例は
本発明の原理を説明するものであるが、これらは例示に
過ぎない。

実施例１ ペプチド合成 自動ペプチド合成機（Model 430A;Applied Biosystem
s,Foster City,California）を用い、製造元の指示に従
って、ペプチドGly−Pen−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−P
ro−Cys−Alaを合成した。フッ化水素を用いて樹脂から
切断した後、ペプチドを冷エチルエーテルで洗浄し、氷
冷エーテルでトリフルオロアセテート溶液から沈澱させ
た。次いで、このペプチドを蒸溜水に再溶解し、凍結乾
燥した。このペプチドを、Waters Bondapac^TMC₁₈（３×
30cm;10μｍパッキング、Waters Assos.,Milford,MA）
を用いるHPLCでさらに精製した。

実施例２ ペプチドの環化 実施例１に記載のようにして合成したペプチド611mg
を、予め煮沸して冷却しておいた４の水に溶解した。
ペプチドの添加直前の45分間、窒素を水中に吹き込ん
だ。ペプチドを溶解した後、フェロシアン化カリウムK₃
［Fe（CN）_６］の0.1μg/mlの水溶液を、黄色が５分間
持続するようになるまで（約5ml）、撹拌ペプチド溶液
に滴下し。この操作の間はNH₄OHの添加によって溶液のp
Hを7.0に維持した。この溶液を弱い吸引下で20時間放置
し、次いで凍結乾燥した。環化された物質をSephadex G
−15カラム（1.8×120cm）にかけることによって過剰の
K₃［Fe（CN）_６を除去した。このペプチドを、Waters B
ondapak^TMC₁₈カラム（３×30cm;10μｍパッキング）（W
aters Assos.,Milford,MA）を用いて逆相HPLCによって
精製した。ペプチドを、緩衝液Ａ（20mM酢酸アンモニウ
ム、pH7.5）を用いてカラムにかけ、40％緩衝液Ａおよ
び60％アセトニトリルからなる緩衝液Ｂの勾配液で溶解
した。第１図は、逆相HPLCによる環化ペプチドを精製結
果を示すものである。トレースａはC₁₈カラムでのペプ
チドの精製を示すものである。細胞のフィブロネクチン
またはビトロネクチンへの付着を阻害する能力を試験す
るために分画１、２および３をプールした。環状ペプチ
ドを含有する分画２を同じ方法でC₁₈カラムのクロマト
グラフィーにもう一度かけ、単一のピークを得た（トレ
ースｂ）。

C₁₂カラムによって得られた主ピーク（第１図の分画
２）は90％の回収ペプチドからなっており、単量体の環
状ペプチドであると推定された。この理由は、それが該
配列に予想される時間、カラムに保持されたこと、なら
びに環化していない物質および多量体の形態が主ピーク
から十分に離れていたためである。

実施例３ 三重螺旋構造の形成 実施例１のようにして得られた直鎖状ペプチドの細胞
付着促進Arg−Gly−Asp配列を、その記載が本明細書に
援用されている、Dedharら、（1987），J.Cell Biol．1
04:585の方法に従い、このペプチドに螺旋構造をとらせ
ることによって立体配座滴に制約を加えた。簡単に説明
すると、配列（Pro−Hyp−Gly）_４−Ala−Pro−Gly−Le
u−Arg−Gly−Asp−Thr−Gly−（Pro−Hyp−Gly）_４を
有する33アミノ酸のペプチドを、自動ペプチド合成機
（Model 430A;Applied Biosystems,Foster City,CA）を
用いて合成した。この配列を、第３図に示すように、気
相シークエンサー（Model 470A;Applied Biosystems,Fo
ster City,CA）を用い、自動エドマン分解によって確認
した。この直鎖状のペプチドを、必要最小限の量の0.05
％酢酸中、４℃で一晩、溶解させた。その記載が本明細
書に援用されている、Rhodesら、（1978），Biochemist
ry，17:3442の方法に従い、偏光分析を用いて螺旋構造
をとっていることを認識した。このペプチドは、第４図
に示すように、30℃の変曲点（二次導関数が０に等し
い:Tm）を有する「融解」曲線を与え、温度上昇につれ
て顕著に変化する高い度数の負の施光度によって判断さ
れるように、低温では三重螺旋として存在していた。

実施例４ α螺旋構造の形成 Arg−Gly−Asp含有ペプチドを適当な条件のもとでα
螺旋の立体配置をとるアミノ酸配列を有するように設計
した。その記載が本明細書に援用されている、Carbone
ら、（1987），J.Immunology 138:1838が示したよう
に、α−アミノイソ酪酸（α−ABA）およびアラニン（A
la）残基を交互に含有するペプチドは構造形成有機溶媒
中で螺旋立体配座をとる。さらに、アミノ末端に負に荷
電した基およびカルボキシル末端に正に荷電した基が存
在すると、そのような螺旋を安定化するように働く双極
子が得られる（その記載が本明細書に援用されている、
Shoemakerら、（1987），Nature 326:563）。さらに、
親水性残基が螺旋の一方の側に存在し、親油性残基が螺
旋の他方の側に存在する両親媒性の２次構造が得られる
アミノ酸の配列を選択した（その記載が本明細書に援用
されているKaiserら、（1984），Science 223:249）。

自動ペプチトシークエンサー（Model 430A;Applied B
iosystems,Foster City,CA）によって次の直鎖状配列を
調製した:SuccAla−Leu−Glu−Glu−αABA−Lys−Arg−
Gly−Asp−Ser−Leu−αABA−Gly−Lys−αABA−Ala−L
ys。

実施例１の方法に従ってペプチドを合成し、精製し
た。このペプチドのα螺旋の立体配座を第５図に図示す
る。

実施例５ 細胞接着アッセイ その記載が本明細書に援用されているRouslahtiら、
（1982），Meth.Enz．82:803およびHaymanら（1983），
PNAS 80:4003の方法に従って、それぞれフィブロネク
チンおよびヒドロネクチンをヒト血漿から精製した。フ
ィブロネクチンおよびヒトロネクチンに対する正常ラッ
ト腎細胞の接着をRouslahtiら（前出）の記載のように
してアッセイした。簡単に言うと、0.1M PBS中の12μg/
mlの濃度のフィブロネクチンまたはビトロネクチンの溶
液0.1mlを96ウェルのプラスチック製マイクロタイター
プレートのそれぞれのウェルに入れ、室温で２時間放置
した。未結合のタンパク質をPBSによる３回の洗浄で除
去した。

アッセイの１日前に、正常ラット腎細胞の集密化培養
物を通常の組織培養のトリプシンを用いて1:2に分け
た。この細胞をPBS（pH7.2）で３回洗浄した。PBS中、
0.1mg/mlの2x結晶化トリプシン（Sigma;タイプIII）（1
0ml）を加え、細胞が分離するまで37℃でインキュベー
トした。次いで、分離した細胞を遠心して集め、PBS中
の0.5mg/ml大豆トリプシンインヒビターの溶液で３回洗
浄して、トリプシンの中和を確実なものにした。最後の
遠心の前に資料を取り、トリパン・ブルー排除によって
細胞数および生存性を測定した。この細胞を10⁶細胞/ml
の濃度で最小必須倍地（MEM）に懸濁し、１つずつの細
胞の懸濁液が得られるまでピペッティングによって分散
させた。

マイクロタイターウェル中に細胞を確実に均等に分散
させるために0.1mlのMEMをそれぞれのウェルに加え、次
に0.1mlの細胞懸濁液を加えた。このプレートを37℃で
１時間インキュベートした。

付着していない細胞は、単に倍地を除き、ウェルを洗
浄することによって除去した。このプレートをPBSに浸
漬し、洗浄液を除去した。次に、この細胞をPBS中の３
％パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の１％のトル
イジン・ブルー、パラホルムアルデヒドで染色し、付着
した細胞を数えた。細胞は、表面に付着した細胞を数え
ることができる細胞カウンター（Dynatech Laboratorie
s,Alexandria,VA）を用いて数を測定した。

基質に対する細胞の付着を阻害する本発明の環状化ペ
プチドの能力を、MEM中に溶解したペプチドの保存溶液
を加えてウェル中の最終濃度を０〜10.0mMにすることに
よって、アッセイした。アッセイに加える前に、保存溶
液は炭酸水素ナトリウムで中和した。前述のようにして
ラット腎細胞を加え、ウェルをインキュベートし、そし
てアッセイした。

フィブロネクチンおよびヒドロネクチン基質への正常
なラット腎細胞の付着を阻害する環状化ペプチドの能力
をさらに詳しく測定するために、配列Gly−Pen−Gly−A
rg−Gly−Asp−Ser−Pro−Cysを有する非環状化、即ち
直鎖状のペプチド結合をアッセイした。第２図に示した
ように、本発明の環状ペプチドは直鎖状ペプチドよりも
10倍低いモル濃度でビトロネクチンへの付着を阻害した
が、フィブロネクチンへの付着を阻害するには有効では
なかった。対照的に、直鎖状のペプチドは比較的同程度
の濃度で両基質への細胞の付着を阻害した。

本発明に拘束されることを望むものではないが、本発
明の環状ペプチドはフィブロネクチンおよびビトロネク
チン受容体の結合部位に対して異なる親和性を有してい
るようである。このことは、本アッセイに用いたラット
腎細胞がフィブロネクチンおよびビトロネクチンに対し
て別々の受容体を有することが知られている事実に合致
するものである。

実施例６ ペプチド結合による環状化 その記載が本明細書に援用させているSchillerら、In
t.J.Peptide Protein Res．25:171（1985）の方法の改
良法を用いて、シクロ−（１−７）Gly−Arg−Gly−Asp
−Ser−Pro−Asp−Glyペプチドを合成した。

合成は、0.80ミリモル/gの置換率で樹脂に結合したｔ
−Boc Glyを有するPAM樹脂−TFA（Applied Biosystems,
Inc.,Foster City,CA）を用いて行った（第６図を参
照）。全てのアミノ酸をBachem Bioscience,Inc.（Phil
adelphia,PA）から入手した。樹脂（1.25g;1.0ミリモ
ル）を20mlのジクロロメタン（DCM）とともに15分間振
盪して膨張させ、N₂圧をかけてDCM除去し、この操作を
繰返した。ｔ−Boc保護基を20mlの20％TFA［Applied Bi
osystems,Inc.,Foster City,CA;DCM（Pfizer,Groton,C
N）中］で15分間反応させ、切断した。この反応を繰返
し、この時は30分間振盪した。これらの反応の間には、
樹脂を20mlのDCMで１回、２分間洗浄した。第２の反応
の後には、樹脂を20mlのDMCで６回、それぞれ２分間づ
つ洗浄し、続いて、20mlのDCM中の10％トリエチルアミ
ン（TEA）で２回それぞれ３分間づつ中和した。この樹
脂を20mlのDCMで６回、それぞれ2,分間づつ洗浄し、次
の反応に備えた。

撹拌機を装着した50mlの丸底フラスコ中で、Fmoc−As
p−ｔ−ブチルエステル［（OtBu）OH］（1.03g;2.5gモ
ル）を15mlのDCMに溶解し、次いでDCMの1M DIC（Aldric
h Chem.Co.,Milwaukee,WI）を2.5ml加えた。この混合ジ
イソプロピルカルボジイミドを５分間撹拌し、次いで０
℃でDMF（Pfzer）中の2.0Mヒドロキシベンゾトリアゾー
ル（HOBT;Aldrich）を1.25mlに加え、さらに10〜15分間
撹拌した。この混合物を樹脂に加え、１〜２時間し振盪
した。この反応をもう１回繰返し（２回結合）、結合の
間には樹脂を20mlのDCMで２回洗浄した。第２の結合が
完了した後に、樹脂を20mlのDCMで３回洗浄した。

Fmoc基の切断は20mlのDCM中の20％ピペリジン（Aldri
ch）（新たに調製）で行い、15分間振盪した。この反応
をさらに30分間繰返した。次いで、この樹脂をDMFで１
回およびDCMで５回、それぞれ2.0分間づつ洗浄した。こ
の樹脂を次の結合に備えた。

撹拌棒を装着した50ml丸底フラスコ中で、Fmoc−Pro
−OH（0.84g;2.5ミリモル）を15mlのDCMに溶解し、次い
でDCM中の1M DICを2.5ml加えた。この混合物を5.0分間
撹拌し、次いで、０℃でDMF中の2M HOBTを1.25ml加え、
さらに10〜15分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、
１〜２時間振盪した。この反応をもう１回繰返し（２回
結合）、結合の間には樹脂を20mlのDCMで２回洗浄し
た。第２の結合が完了した後に、樹脂を20mlのDCMで３
回洗浄した。前述と同じ方法を用いてFmocを切断し、こ
の物質を次の結合に備えた。

撹拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中で、Fmoc−As
p−ベンジルエステル［（OBzl）−OH］（1.11g;2.5ミリ
モル）を15mlのDCMに溶解し、次いでDCMの1M DICを2.5m
l加えた。この混合物を5.0分間撹拌し、次いで０℃でDM
F中の2.0M HOBTを1.25ml加え、10〜15分間撹拌した。こ
の混合物を樹脂に加え、１〜２時間振盪した。この反応
をもう１回繰返し（２回結合）、結合の間には樹脂を20
mlのDCMで２回洗浄した。第２の結合が完了した後に、
樹脂を20mlのDCMで３回洗浄した。前述と同じ方法を用
いてFmocを切断し、この物質を次の結合に備えた。

撹拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中で、Fmoc−Gl
y−OH（0.74g;2.5ミリモル）を15mlのDMFに溶解し、次
いでDCMの1M DICを2.5ml加えた。この混合物を5.0分間
撹拌し、次いで０℃でDMF中の2.0M HOBTを1.25ml加え、
さらに10〜15分間撹拌した。この混合物を樹脂に加え、
１〜２時間振盪した。この反応を２回行い（２回結
合）、結合の間には樹脂を20mlのDCMで２回洗浄した。
第２の結合が完了した後に樹脂を20mlのDCMで３回洗浄
した。前述の方法と同じ方法を用いてFmocを切断し、こ
の物質を次の結合に備えた。

撹拌棒を装置した50mlの丸底フラスコ中で、Fmoc−Ar
gトシレート［（（Tos）OH］（1.37g;2.5ミリモル）を1
5mlのDCMに溶解し、次いで、DCM中の1m DICを2.5ml加え
た。この混合物を5.0分間撹拌し、次いで０℃でDMF中の
2.0m HOBTを1.25ml加え、さらに10〜15分間撹拌した。
この混合物を樹脂に加え、１〜２時間振盪した。この反
応をもう一度繰返し（２回結合）、結合の間には樹脂を
20mlのDCMで２回洗浄した。第２の結合を行った後に、
樹脂を20mlのDCMで３回洗浄した。前述の方法と同じ方
法でFmocの脱保護を行い、この物質を次の結合に備え
た。

撹拌棒を装着した50mlの丸底フラスコ中で、ｔ−Boc
−Gly−OH（0.44g;2.5ミリモル）を15mlのDCMに溶解し
て、次いでDCM中の1M DICを2.5ml加えた。この混合物を
5.0分間撹拌し、次いで０℃でDMF中の2M HOBTを1.25ml
を加え、さらに10〜15分間撹拌した。この混合物を樹脂
に加え、１〜２時間振盪した。その反応を繰返し（２回
結合）、結合の間には樹脂を20mlのDCMで２回、それぞ
れ２分間づつ洗浄した。第２の結合を行った後に、樹脂
を20mlのDCMで３回、それぞれ２分間づつ洗浄した。

Gly １のｔ−Boc基およびAsp7のｔ−ブチルエステル
側の鎖の脱保護は、DCM中の20％TFAを20ml加えることに
よって同時に15分間行った。この反応をもう一度30分間
繰返した。反応の間には、樹脂をDCMで１回、２分間洗
浄した。第２の反応の後に、樹脂を20mlのDCMで６回、
それぞれ２分間洗浄づつし、次いでDCMの10％TEA、20ml
で２回、それぞれ３分間づつ中和した。この樹脂を20ml
のDCMで６回、それぞれ2.0分間づつ洗浄した。

Gly1のＮ−末端をAsp7の側鎖カルボキシル基に環化さ
せた。この環化はDMF中の2M HOBTを5ml、および1M DIC
溶液を10ml加え、４日間振盪することによって行った。
それぞれの日に古い試薬を抜き取り、樹脂を20mlのDMF
で１回、DMFで３回、それぞれ２分間づつ洗浄した。次
いで、新しい試薬（DICおよびHOBT）を加えた。

この樹脂を、当分野で公知の方法を用い、フッ化水素
で切断した。切断の後、ペプチド含有の樹脂を冷エチル
エーテルで洗浄し、次いで10％酢酸で溶解し、樹脂から
ペプチドを除去した。この瀘液を凍結乾燥した。回収さ
れた粗生成物は508mgであった。この粗生成物を、C
₁₈（１×20cm;10−μｍパッキング）カラムのHPLCによ
る精製にかけた。ペプチドを緩衡液Ａ（10mM酢酸アンモ
ニウム、pH6.0）中でこのカラムにかけ、60％アセトニ
トリルおよび40％緩衝液Ａからなる緩衝液Ｂの勾配で溶
離した。精製後の収量は210mgであった。

DMSO−d6を溶媒とするプロトンNMRによって、この化
合物が目的の環状ペプチド構造を有していることを確認
した。この化合物の1Dおよび2D（COSY、COSY−Relay、
およびNOESY）スペクトルを、カリフォルニア大学、サ
ンジエゴNMR施設で、Nicoletソフトウェアを装備した36
0MHz FT−NMRによって得た（Wuthrich,K.の「タンパク
質及び核酸のNMR〉（John Wiley ＆ Son,NY（1986）を
参照；この文献は本明細書に援用されている）。

現時点で好ましい態様を参考にして本発明を説明した
が、本発明から逸脱することなく当業者が種々の修飾を
加え得ることは理解される。従って、本発明は以下の請
求範囲によってのみ限定されるものである。

フロントページの続き (72)発明者 ルオスラーチ，エリッキ・アイ アメリカ合衆国 カリフォルニア92067 ランチョ・サンタ・フェ、ピー・オ ー・ボックス1054番 (56)参考文献 特開 昭63−215696（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−218698（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−225399（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−179891（ＪＰ，Ａ) 米国特許4683291（ＵＳ，Ａ) 欧州特許出願公開114759（ＥＰ，Ａ) Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆ ｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１（３）, 280−286（1986) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．260（26）, 14287−14291（1985)

Claims (28)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Arg−Gly−Asp含有リガンドを製造する方
   法であって、該リガンドは、Arg−Gly−Asp結合部位の
   少なくとも１つの立体化学的配座に別の配座より高い親
   和性で結合する受容体に対して、増大または減少した結
   合親和性を有し、 Arg−Gly−Asp含有リガンド中のArg−Gly−Asp係合部位
   の配座を変える工程であって、Arg−Gly−Asp含有リガ
   ンドを環状化することによって、該配座が変られる工
   程； Arg−Gly−Asp含有リガンドの受容体結合親和性が増大
   したか、あるいは減少したかを測定する工程；および 結合親和性が増大または減少したリガンドを選択する工
   程を含む、方法。
2. 【請求項２】Arg−Gly−Asp配列の周囲のアミノ酸の間
   を架橋することにより、環状化が行われる、請求項１の
   方法。
3. 【請求項３】前記架橋が、ジスルフィド架橋である、請
   求項２の方法。
4. 【請求項４】前記架橋が、ペプチド架橋である、請求項
   ２の方法。
5. 【請求項５】前記Arg−Gly−Asp含有リガンドの結合親
   和性が増大したか、あるいは減少したかを、拮抗細胞付
   着アッセイによって測定する請求項１の方法。
6. 【請求項６】前記受容体結合親和性の増大または減少
   が、細胞外マトリックス受容体の１つの型に特異的であ
   る、請求項１の方法。
7. 【請求項７】前記受容体が、ビトロネクチン受容体であ
   る、請求項６の方法。
8. 【請求項８】前記受容体が、フィブロネクチン受容体で
   ある、請求項６の方法。
9. 【請求項９】前記受容体が、gpIIb/IIIaフィブリノーゲ
   ン受容体である、請求項６の方法。
10. 【請求項１０】環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドであっ
    て、類似の直鎖状Arg−Gly−Asp含有ペプチドより少な
    くとも約10倍低いモル濃度で、Arg−Gly−Asp含有リガ
    ンドが、該リガンドに親和性を有するArg−Gly−Asp結
    合受容体に付着するのを阻害するペプチド； ただし、以下のペプチドを除く： （ｉ）配列 からなるペプチド；および、 （ii）配列 からなるペプチド （ここで、R₅は、Ｌ−Trp、Ｄ−Trp、Ｌ−Leu、Ｄ−Le
    u、Ｌ−Ile、Ｄ−Lle、Ｌ−Phe、Ｄ−Phe残基、または
    これらの残基を２〜３個含む鎖を表す）。
11. 【請求項１１】環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドであっ
    て、類似の直鎖状Arg−Gly−Asp含有ペプチドより、増
    大または減少した受容体結合親和性で、該類似の直鎖状
    ペプチドの親和性を有するArg−Gly−Asp結合受容体に
    結合するペプチド； ただし、以下のペプチドを除く： （ｉ）配列 からなるペプチド；および、 （ii）配列 からなるペプチド （ここで、R₅は、Ｌ−Trp、Ｄ−Trp、Ｌ−Leu、Ｄ−Le
    u、Ｌ−Ile、Ｄ−Lle、Ｌ−Phe、Ｄ−Phe残基、または
    これらの残基を２〜３個含む鎖を表す）。
12. 【請求項１２】前記環状化が、Arg−Gly−Asp配列の周
    囲のアミノ酸の間で架橋することによってなされる、請
    求項11のペプチド。
13. 【請求項１３】前記架橋が、ジスルフィド架橋である、
    請求項12のペプチド。
14. 【請求項１４】配列 を含む、請求項13のペプチド。
15. 【請求項１５】配列 を含む、請求項13のペプチド。
16. 【請求項１６】配列 を含む、請求項13のペプチド。
17. 【請求項１７】前記架橋が、ペプチド架橋である、請求
    項12のペプチド。
18. 【請求項１８】配列 を含む、請求項17のペプチド。
19. 【請求項１９】前記受容体結合親和性の増大または減少
    が、細胞外マトリックス受容体の１つの型に特異的であ
    る、請求項11のペプチド。
20. 【請求項２０】前記の受容体が、ビトロネクチン受容体
    である、請求項19のペプチド。
21. 【請求項２１】前記受容体が、フィブロネクチン受容体
    である、請求項19のペプチド。
22. 【請求項２２】前記受容体が、gpIIb/IIIaフィブリノー
    ゲン受容体である、請求項19のペプチド。
23. 【請求項２３】細胞の付着を阻害または促進するための
    組成物であって、環状Arg−Gly−Asp含有リガンドを含
    み、該環状Arg−Gly−Asp含有リガンドは、類似の直鎖
    状Arg−Gly−Asp含有ペプチドより高い親和性で、該類
    似の着鎖状ペプチドに親和性を有するArg−Gly−Asp結
    合受容体に結合する、組成物。
24. 【請求項２４】前記親和性が、他のArg−Gly−Asp結合
    受容体に対する結合性を高めることなしに、特定のArg
    −Gly−Asp結合受容体に対して高められている請求項23
    の組成物。
25. 【請求項２５】細胞がある基質に付着するのを阻害する
    方法であって、 a.環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドを溶液で提供する工
    程であって、該環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドは、類
    似の直鎖状Arg−Gly−Asp含有ペプチドより少なくとも
    約10倍低いモル濃度で、Arg−Gly−Asp含有リガンド
    が、該リガンドに親和性を有するArg−Gly−Asp結合受
    容体に付着するのを阻害する、工程；および b.培養細胞に該環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドの溶液
    を接触させる工程を含む、方法。
26. 【請求項２６】基質に対する細胞の付着を促進する方法
    であって、 a.環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドを基質に固定し、安
    定化ペプチド結合基質を形成する工程であって、該環状
    Arg−Gly−Asp含有ペプチドは、類似の直鎖状Arg−Gly
    −Asp含有ペプツドより少なくとも約10倍低いモル濃度
    で、Arg−Gly−Asp含有リガンドが、該リガンドに親和
    性を有するArg−Gly−Asp結合受容体に付着するのを阻
    害する、工程；および b.遊離の培養細胞を該安定化ペプチド結合基質をさらす
    工程を含む、方法。
27. 【請求項２７】細胞がある基質に付着するのを阻害する
    方法であって、 a.環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドを容液で提供する工
    程であって、該環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドは、類
    似の直鎖状Arg−Gly−Asp含有ペプチドより、増大また
    は減少した受容体結合親和性で、該類似の直鎖状ペプチ
    ドに親和性を有するArg−Gly−Asp結合受容体に結合す
    る、工程；および b.培養細胞に該環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドの溶液
    を接触させる工程を含む、方法。
28. 【請求項２８】基質に対する細胞の付着を促進する方法
    であって、 a.環状Arg−Gly−Asp含有ペプチドを基質に固定し、安
    定化ペプチド結合基質を形成する工程であって、該環状
    Arg−Gly−Asp含有ペプチドは、類似の直鎖状Arg−Gly
    −Asp含有ペプチドより、増大または減少した受容体結
    合親和性で、該類似の直鎖状ペプチドに親和性を有する
    Arg−Gly−Asp結合受容体に結合する、工程；および b.遊離の培養細胞を該安定化ペプチド結合基質にさらす
    工程を含む、方法。