JP2025536281A - 核酸の濃縮および検出 - Google Patents

Abstract

核酸分子の濃縮および検出のためのシステムおよび方法を提供する。特に、非所望核酸分子を含む試料中から、所望の核酸分子を選択的に濃縮するためのシステムおよび方法を提供する。この方法では、所望の核酸分子と非所望核酸分子、例えば野生型と変異型との間で相補性が異なるプローブを用いる。プローブは、例えばビオチンを介して固相に結合されていてもよい。非所望核酸分子に結合したプローブが切断されることで、非所望核酸分子が放出され、所望核酸分子が固相に結合することで濃縮される。さらに、本方法は、プローブからの差次的な放出も利用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１０月１９日に提出された米国仮特許出願第６３／３８０，１０５号の優先権を主張するものであり、その開示は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

核酸分子の濃縮および検出のためのシステムおよび方法が本明細書で提供される。特に、非所望核酸分子を含む試料中の所望の核酸分子を選択的に濃縮するためのシステムおよび方法が本明細書で提供される。

野生型分子のプールにおける低頻度バリアントの標的化検出は、癌の早期検出、癌の進行のモニタリング、癌治療の標的化、非侵襲的出生前検査、特定の（ネオ）抗原を標的化するＴ細胞集団のモニタリングのために臨床的に重要であり、また、移植臓器拒絶の早期警告のために臨床的に重要である。ハイブリダイゼーション捕捉と次世代シークエンシング（ＮＧＳ）との組合せは、低頻度バリアントの標的化多重化検出に最も一般的に適用される方法であるが、幾つかの最適ではない特性を有している。概して、ハイブリダイゼーション捕捉は、対象となる標的領域を濃縮するが、バリアント分子を濃縮しない。その結果、シークエンシングリードの大部分は、バリアント分子ではなく野生型に由来することとなる。これは、無駄が多く、コストがかさみ、希なバリアントの検出を、保存、ライブラリ調製およびシークエンシングからのバックグラウンドエラーに対して行うことを骨の折れるものとする。その結果、ＮＧＳでは、約０．１％未満のバリアントをルーチンで検出するには特異性が不十分となる。ライブラリ調製方法の改変（例えば、二重シークエンシング）によって特異性を向上して、単一分子から正確なシークエンシングデータを得ることが可能である。残念ながら、二重シークエンシングのような方法もまた感度を減少させる（例えば、ライブラリ調製方法を修正して末端修復を回避することによって、および意図的に分子ボトルネックを課すことによって）。本明細書に記載のシステムおよび方法は、例えば、非所望または所望の分子の選択的修飾（例えば、消化）に基づく改変されたハイブリダイゼーション捕捉方法を使用して、対象となる標的領域中に位置するバリアント分子を濃縮することを可能とする。これにより、必要とされるシークエンシングリード数が減少するだけでなく、現在のＮＧＳの検出限界を下回る低頻度バリアント分子の多重化された検出への道が開かれる。

核酸分子の濃縮および検出のためのシステムおよび方法が本明細書で提供される。特に、非所望核酸分子を含む試料中の所望の核酸分子を選択的に濃縮するためのシステムおよび方法が本明細書で提供される。

例えば、幾つかの実施形態では、試料（例えば、２つ以上の異なる核酸分子を含む）を、プローブと、第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを第２の異なる核酸分子にハイブリダイズしたプローブに対して選択的に修飾（例えば、切断）するための試薬と、接触させることを含む、方法が本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、上記方法は、第１の核酸分子を第２の核酸分子に対して濃縮または枯渇することを更に含む。

例えば、幾つかの実施形態では、上記方法は、核酸分子の混合物を含む試料中の第１の核酸分子を、第１の核酸分子上の標的領域への相補性が試料中の他の核酸分子に対してとは異なるプローブと第１の核酸分子を接触させることによって濃縮または枯渇すること；切断反応を行うこと；ならびに第１の核酸分子を濃縮または枯渇することを含む。幾つかの実施形態では、プローブは、第１の核酸分子の標的領域との相補性が、試料中の第２の核酸の対応する標的領域よりも高い。幾つかの実施形態では、プローブは、第１の核酸分子の標的領域との相補性が、試料中の第２の核酸の対応する標的領域よりも低い。幾つかの実施形態では、第１の核酸と第２の核酸とは、配列バリエーション（例えば、点変異、欠失、挿入、マルチヌクレオチド変化、融合など）によって異なる。幾つかの実施形態では、プローブは、相補性が高い配列の標的領域と完全に相補的であり、相補性が低い配列の対応する標的領域に見出される配列バリエーションと１つまたは複数のミスマッチを有する配列を含む。幾つかの実施形態では、プローブは、第１および第２の核酸分子の両方の標的領域と１つまたは複数のミスマッチを含むが、相補性が低い核酸の標的領域とより多くのミスマッチを含む。特に、プローブは、第１の核酸にプローブがハイブリダイズしたときにプローブの切断が第２の核酸に対してとは異なるように設計されることで、第１の核酸を第２の核酸に対して選択的に濃縮または枯渇することを可能とする。

例えば、幾つかの実施形態では、ａ）第１および第２の核酸配列を含む試料を、第１および第２の核酸配列との相補性が異なるプローブに曝露すること；ｂ）プローブを修飾すること（例えば、切断反応を行う）；ならびにｃ）第１の核酸配列を第２の核酸配列に対して濃縮または枯渇することを含む、試料中の第１の核酸配列の第２の核酸配列に対する比を増加または減少させるための方法が本明細書で提供される。

プローブは、切断前または切断中に除去される１つまたは複数の構成要素を備え得る。例えば、プローブは、非相補的フラップまたはその他のブロッキング基を３’末端または５’末端に備え得、これは、ブロッキング基が除去されるまで消化またはポリメラーゼ反応を防止するものである。ブロッキング基は、任意の適切な機構（例えば、酵素的切断、化学反応、温度変化、物理的切断など）によって除去することができる。任意の適切なブロッキング基を用いることができ、これには、ホスホロチオエート結合の採用、修飾された塩基（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’フルオロなど）、反転またはジデオキシヌクレオチド、リン酸化の使用およびスペーサーの採用などが挙げられるが、これらに限定されない。明確に異なる核酸分子にハイブリダイズしたときに差次的切断産物を提供するプローブの配列は、最初のプローブの任意の適切な場所に位置し得る。例えば、ミスマッチ配列は、プローブの３’末端の３’末端塩基に位置し得る。ミスマッチ配列は、プローブの３’末端の内部に位置し得る。ミスマッチ配列は、プローブの中央に位置し得る。ミスマッチ配列は、プローブの５’半分内またはプローブの５’末端（例えば、５’末端塩基）に位置し得る。

プローブの５’または３’末端は、識別子（例えば、試料識別子）として働く領域（例えば、５’または３’テール）を含み得る。かかる配列は、例えば、混合試料から、特定の試料または特定の領域の捕捉された分子を選択的にプルダウンするのに有用である。かかる識別子は、複数の異なる標的が同じ試料または同じ反応容器中で反応している多重化反応において特に有用であり得る。

幾つかの実施形態では、方法は、プローブの組合せを同じ試料調製物において用い、そのうちの幾つかは、バリアントを含む配列を濃縮または枯渇するように設計され（例えば、上に記載の）、そのうちの幾つかは、単に対象となる領域を捕捉するように設計されている（例えば、任意の公知のハイブリダイゼーション／捕捉技術またはアプローチを使用して）。例えば、幾つかの実施形態では、かかる組合せ方法は、体細胞バリアントと同じシークエンシング処理において、ＭＳＩまたはコピー数バリアントが分析される場合に有用である：体細胞バリアントが濃縮される一方で、ＭＳＩ／ＣＮＶ分析に使用される遺伝子／領域が標準的な方法によって捕捉される。潜在的な問題の１つは、標準的なｈｙｂ／ｃａｐプローブが、濃縮／枯渇方法論において使用される酵素および／または試薬によって好ましくない修飾をされる可能性があることである。これを避けるために、幾つかの実施形態では、標準的なハイブリダイゼーション／捕捉オリゴヌクレオチドは、修飾酵素／試薬に対して耐性にされる。例えば、標準的なハイブリダイゼーション／捕捉オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡではなくＲＮＡを使用することによって、修飾された塩基または骨格の修飾を使用することによって、あるいは、プローブ中に意図的にミスマッチさせた領域を導入することによって修飾することができる。標準プローブおよび濃縮／枯渇プローブのプローブハイブリダイゼーションを同時に行った後、続いて、それらを分離することが利益をもたらし得るシナリオが幾つか存在する。幾つかの実施形態では、このことは、異なる取付けのための化学を異なるプローブの種類に対して使用することによって行うか、あるいは、取り付けた部分を自身に含む（または固体支持体に予め連結した）相補的「リンカー」オリゴへのハイブリダイゼーションを介して固体支持体上に差次的に捕捉され得る、プローブ上の異なる５’または３’配列によって行う。

本発明の方法を適用することができる分析物／配列は、探究される標的ポリヌクレオチド配列を含む核酸、例えば、天然に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡ分子または合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態では、分析物／配列は、典型的には分析物／配列およびその他の生物学的物質を含む水溶液中に存在し、幾つかの実施形態では、分析物／配列は、試験のための対象とならないその他のバックグラウンド核酸分子と共に存在する。幾つかの実施形態では、分析物／配列の存在量は、これらのその他の核酸成分に対して低い。幾つかの実施形態では、例えば、分析物が細胞性物質を含む生物学的標本に由来する場合、本明細書に記載の濃縮または枯渇方法を実施する前に、これらのその他の核酸および外来の生物学的物質の一部または全てが、試料調製手法、例えば、ろ過、遠心分離、クロマトグラフィーまたは電気泳動を使用して除去される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、シークエンシングライブラリを含む混合物に含まれる。シークエンシングライブラリは、一本鎖分子もしくは二本鎖分子のいずれかもしくは両方に由来し、および／またはこれらを含む場合があり、また、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。ライブラリ配列は、修飾、例えば、アダプター、固有分子インデックス（ＵＭＩ）、またはプライマー結合配列などを含み得、任意の適切な工程（例えば、タグ付き断片化）によって調製され得る。

本発明の構成および方法は、これらに限定されないが、環境（例えば、水、土壌、空気など）試料および生物学的試料を含む任意の種類の試料に対して用いることができる。生物学的試料は、植物、動物、および感染症病原体などを含む任意の供給源からのものであり得る。適切には、幾つかの実施形態では、分析物／配列は、哺乳類対象（特にヒト患者）から採取された生物学的試料、例えば、血液、血漿、痰、尿、皮膚、生検または外科的切除試料に由来する。幾つかの実施形態では、生物学的試料は、存在する細胞を破壊することによって分析物／配列が放出されるように溶解に供される。他の実施形態では、分析物／配列は、試料それ自体に遊離形態（例えば、血液または血漿中に循環している無細胞ＤＮＡ）で既に存在し得る。本発明の構成および方法は、対象となる分析物の対立遺伝子頻度が低い可能性がある過去において難易度が高かった試料種で特に有用である。かかる試料としては、血液、尿、ｃｙｔｏｓｐｏｎｇｅ収集試料（例えば、食道試料）、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）由来試料、胸膜液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）が挙げられる。

幾つかの実施形態では、試料は、プールされた試料である。プールされた試料は、複数の試料をまとめて混合してバッチとし、このバッチで、プールされたコレクションが試験されることを含む。このアプローチにより、より限られた量のリソースを使用して試験可能な個別の試料の数が増加する。対象となるプールされた試料としては、感染症病原体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＩＶ、ＨＣＶなど）の存在に関して試験される献血血液試料、農業試料、食品試料、精子試料、および生物学的試料が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、プールされた試料は、複数の異なる供給源からプールされた試料を有する（その生成の性質上）環境収集試料（例えば、廃水試料）である。試料をプールすると、試料が互いに希釈されるためにバリアントの対立遺伝子頻度が減少する可能性がある一方、スクリーニングの効率を大幅に増加させ得る。本明細書で提供される技術は、非常に低い対立遺伝子頻度での検出を可能にするため、プールされた試料の分析に特によく適している。幾つかの実施形態では、初期試料それぞれの一部を、バーコードまたはその他の複合調製ステップを使用することなくプールし、プールされた試料を試験する。陽性の結果が得られたら、プールされていない試料の残りを個別に試験することができる。

本明細書に記載の方法で有用である構成（例えば、試薬、キット、反応混合液、機器、ソフトウェア）も本明細書で提供される。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法を行うのに必要、十分、または有益な１つまたは複数の試薬を含む構成が本明細書で提供される。例えば、幾つかの実施形態では、構成は、既知の第１の配列および既知の第２の配列と差次的に相補的である配列（例えば、既知の第１の配列と完全に相補的であるが、既知の第２の配列と不完全に相補的である）を含む１つもしくは複数のプローブ；所望の核酸にハイブリダイズしたプローブを、非所望核酸にハイブリダイズしたプローブに対して選択的に修飾する１つもしくは複数の試薬；ならびに／またはプローブを切断もしくは消化する１つもしくは複数の薬剤を含む。幾つかの実施形態では、構成は、標的核酸分子を分離する標的核酸単離構成要素を更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数の固体支持体を含む。幾つかの実施形態では、構成は１つまたは複数のバッファーを含む。幾つかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ（例えば、磁性または常磁性ビーズ）である。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数のエピジェネティック修飾感受性または依存性制限酵素を更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼを更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数のトランスポソームを更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含む。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数のトランスポサーゼを更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数のリガーゼを更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、増幅（例えば、ＰＣＲ）、シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、または検出反応を行うための試薬を更に含む。幾つかの実施形態では、構成は、１つまたは複数の分子ビーコンプローブを更に含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数の分子ビーコンプローブは、蛍光標識されている。幾つかの実施形態では、構成は、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写するための構成要素を更に含む。

幾つかの実施形態では、構成は、本明細書に記載の方法のいずれかの特定の時点における反応液を含む反応混合液である。幾つかの実施形態では、反応混合液は、本明細書に記載の方法のプローブ／核酸ハイブリダイゼーション複合体を含む。幾つかの実施形態では、反応混合液は、本明細書に記載の方法の捕捉された核酸分子を含む。幾つかの実施形態では、反応混合液は、消化反応を受けた試料に存在していた所望の標的核酸の濃度よりも高いまたは低い所望の標的核酸の濃度を含む領域を含む。例えば、幾つかの実施形態では、試料；標的核酸にハイブリダイズしたプローブを修飾するための試薬；試料からの第１の核酸分子であって、第１の核酸分子とプローブの識別領域が相補的である配列を有するプローブにハイブリダイズした第１の核酸分子；ならびに試料からの第２の核酸分子であって、第２の核酸分子とプローブの識別領域が完全には相補的ではない前記配列を有するプローブにハイブリダイズした第２の核酸分子を含む、反応混合液が本明細書で提供される。

構成の使用（例えば、キットの使用、反応混合液の使用、試薬の使用、機器の使用、ソフトウェアの使用）も本明細書で提供される。例えば、試料中の標的核酸を濃縮または枯渇するための構成の使用が本明細書で提供される。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法で有用である装置および機器が本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、装置および機器は、試料の回収および反応容器への分配で有用である。幾つかの実施形態では、装置および機器は、上記方法を行うための反応チャンバーを提供する。幾つかの実施形態では、装置および機器は、反応液を収容するため、および／または濃縮された所望の標的核酸の単離もしくは所望の標的核酸の枯渇のための複数のゾーンまたは領域（例えば、ウェル、チャンネルなど）を提供する。幾つかの実施形態では、装置および機器は、核酸分子の増幅またはシークエンシングで有用である。幾つかの実施形態では、装置および機器は、核酸分子の検出で有用である。幾つかの実施形態では、装置および機器は、ユーザーからの情報を受け取るおよび伝えるのに有用である。例えば、装置および機器は、ユーザーの指示を受け取るためのユーザーインターフェース、およびユーザーに結果を視覚的に提示するためのディスプレイを含み得る。

幾つかの実施形態では、計算装置が本明細書で提供される。計算装置は、本明細書に記載の方法を容易にするための機器または装置を制御するのに有用である。幾つかの実施形態では、計算装置は、データを収集、分析および報告する。幾つかの実施形態では、計算装置は、コンピュータプログラムを実行する１つまたは複数のプロセッサを備える。幾つかの実施形態では、計算装置は、１つまたは複数のコンピューティングステップを実行するようにプロセッサに指示する命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体（例えば、ソフトウェア）を備える。

幾つかの実施形態では、核酸分子の混合物を含む試料中の第１の核酸分子を濃縮または枯渇することを含む、方法であって、濃縮または枯渇することは、第１の核酸分子の標的領域への相補性が試料中の第２の核酸分子に対してとは異なるプローブと試料を接触させること；任意選択で、前記第１の核酸分子にハイブリダイズした前記プローブを前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブに対して選択的に修飾することで、前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを活性化すること；前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを、他のプローブに対して選択的に消化すること；ならびに前記第１の核酸分子を濃縮または枯渇すること、によるものである、方法が本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、第１および第２の核酸分子は、末端修復された核酸分子を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の核酸分子はＡテール化された核酸分子である。幾つかの実施形態では、第１および第２の核酸分子は、１つまたは複数のアダプター配列を含む。

幾つかの実施形態では、第１および第２の核酸分子は増幅される。幾つかの実施形態では、プローブは、切断剤との接触によって活性化される。幾つかの実施形態では、切断剤は、制限エンドヌクレアーゼ、フラップエンドヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、ＲＮａｓｅ、Ｃａｓタンパク質、アルゴノートファミリー酵素、ＤＮＡ－ホルムアミドピリミジングリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、アプリン／アピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ １）、および化学的切断剤からなる群から選択される。

幾つかの実施形態では、消化することは、前記プローブをエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼである。幾つかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼである。

幾つかの実施形態では、プローブは、その３’もしくは５’末端または内部に結合部分を含み、前記結合部分が、任意選択で、ビオチン、またはリンカー分子がハイブリダイズすることができる配列であり、リンカー分子が、固体支持体に結合するように修飾される。

幾つかの実施形態では、上記方法は、消化することの前で、前記プローブをある表面上に捕捉するステップを更に含む。幾つかの実施形態では、上記表面はビーズを含む。

幾つかの実施形態では、上記方法は、前記第１の核酸分子または第２の核酸分子を前記プローブから差次的に遊離させるステップを更に含む。幾つかの実施形態では、遊離させることは、温度を上昇させることを含む。幾つかの実施形態では、遊離させることは、ｐＨを変化させることを含む。幾つかの実施形態では、遊離させることは、塩濃度を変化させることを含む。幾つかの実施形態では、遊離させることは、消化するステップを含む。幾つかの実施形態では、遊離させることは、切断事象の後の融解によって、その他の反応条件を変えることなく生じる。

幾つかの実施形態では、上記方法は、前記第１または第２の核酸分子を検出するステップを更に含む。幾つかの実施形態では、検出することは、前記第１または第２の核酸分子をシークエンシングすることを含む。

幾つかの実施形態では、プローブは、前記第１の核酸分子中のある位置と相補的であり、前記第２の核酸分子中の対応する位置とミスマッチである塩基を含む。幾つかの実施形態では、消化することは、前記第１および第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを、非相補鎖よりも相補鎖を優先的に消化する酵素（例えば、ミスマッチ位置で停止する酵素）と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、消化することは、前記第１および第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを、相補鎖よりも非相補鎖を優先的に消化する酵素と接触させることを含む。

幾つかの実施形態では、プローブは、３’末端、５’末端または内部ブロッキング基を含む。幾つかの実施形態では、プローブの活性化は、前記ブロッキング基を、前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去するが、前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去しない切断剤を使用して行われる。幾つかの実施形態では、消化することは、プローブを、ブロッキング基を欠くプローブを切断するが、ブロッキング基を有するプローブを切断しないヌクレアーゼと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、プローブの活性化は、前記ブロッキング基を含む核酸断片を、前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去するが、前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去しない切断剤を使用して行われる。幾つかの実施形態では、消化することは、前記核酸断片をポリメラーゼと以下の条件下で接触させることを含み、当該条件は、断片が伸長され、かつ前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して、任意選択で上流プライマーを用いて、置換または消化されるような条件である。

幾つかの実施形態では、活性化することおよび消化することは、加ピロリン酸分解を含まない。

幾つかの実施形態では、上記方法は、試料を捕捉プローブと接触させることを更に含み、捕捉プローブは、前記第２の核酸分子にハイブリダイズするか、または前記第１の核酸分子もしくは前記第２の核酸分子ではない試料中の別の核酸分子にハイブリダイズする。

幾つかの実施形態では、上記方法は、特定の断片化プロファイルを有する分子を濃縮することを含む。幾つかの実施形態では、捕捉は、核酸断片を、断片化ブレークポイントおよびアダプター配列と配列同一性を有するプローブを用いて捕捉することを含む。幾つかの実施形態では、捕捉は、特定の５’および３’ブレークポイントを有する分子の捕捉を含み得る。幾つかの実施形態では、捕捉は、各ブレークポイントの逐次的なハイブリダイゼーションおよび捕捉を含み得る。他の実施形態では、捕捉は、特定の５’および３’断片化ブレークポイントを有する分子を捕捉するために、複数のプローブを使用したハイブリダイゼーションおよび捕捉を含み得る。断片化パターンは、ヌクレオソーム構成、クロマチン構造、遺伝子発現、および起源組織のヌクレアーゼ含量に関する情報を含み、断片の大きさ、断片末端のヌクレオチドモチーフ、一本鎖ジャグ末端、および断片化エンドポイントのゲノム位置の形態の特徴的なシグネチャをもたらす。例えば、断片化ブレークポイントは、無細胞ＤＮＡ中の分子の起源と思われる組織を同定するのに使用することができる。腫瘍学では、これは、特に、スクリーニング試験において、癌の特定のタイプまたはサブタイプを同定するのに使用することができる。

前記第１および第２の核酸分子を含む試料において上に記載の方法を行うのに十分、必要、または有益な試薬を含むキットが更に本明細書で提供される。

例示的な標的濃縮および検出方法を示す図である。 例示的な標的濃縮および検出方法を示す図である。 例示的な標的濃縮および検出方法を示す図である。 例示的な標的濃縮および検出方法を示す図である。 例示的な標的濃縮および検出方法を示す図である。

幾つかの実施形態では、システムおよび方法は、所望および／または非所望の配列に少なくとも部分的にハイブリダイズする１つまたは複数のプローブを用いる。プローブは、所望の配列の存在下で非所望の配列に対して差次的に切断または分解されるように構成される。本明細書で使用する場合、用語「標的分子」は、プローブにハイブリダイズする試料中の核酸分子を指す。幾つかの実施形態では、プローブは、標的分子にその３’末端もしくは５’末端、または内部のいずれかでハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、プローブまたは標的分子のいずれかは、固体表面に取り付けられる。幾つかの実施形態では、プローブはＤＮＡを含む。幾つかの実施形態では、プローブはＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、プローブはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む。幾つかの実施形態では、プローブは、１つまたは複数の合成塩基（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ））を含む。幾つかの実施形態では、プローブは、合成骨格修飾を含む。

幾つかの実施形態では、システムおよび方法は、プローブ／標的ハイブリダイゼーション複合体中のプローブを切断または消化する。幾つかの実施形態では、用いる切断／消化機構は、一方の鎖（例えば、プローブ）に対して選択的である。幾つかの実施形態では、切断／消化機構は鎖選択的ではない。幾つかの実施形態では、プローブまたは標的は、例えば、修飾された核酸（例えば、３’／５’末端ブロッキング修飾、内部塩基／骨格修飾など）を作り出すために使用されるプライマーまたはアダプターの修飾によって保護される。幾つかの実施形態では、プローブまたは標的は、増幅中に修飾を導入することによって保護される（例えば、骨格のホスホロチオエート修飾）。

幾つかの実施形態では、活性化ステップは、プローブを切断／消化反応に供せるようにするために用いる。幾つかの実施形態では、プローブは、３’、５’、または内部修飾によって消化できないようになる。幾つかの実施形態では、修飾は、標的に対するミスマッチである。幾つかの実施形態では、ミスマッチは、プローブの末端（例えば、３’末端または５’末端）にある。幾つかの実施形態では、ミスマッチは内部にある。幾つかの実施形態では、ミスマッチは、２つ以上の塩基を含む。幾つかの実施形態では、ミスマッチ領域は、プローブが標的にハイブリダイズしたときにフラップまたはバブルを提供する。幾つかの実施形態では、プローブは、１つまたは複数の修飾（例えば、骨格の修飾、例えば、ホスホロチオエート（ＰＴＯ）、塩基修飾、リンカーなど）を伴って調製される。幾つかの実施形態では、修飾は、ＲＮＡ塩基を、他はＤＮＡからなるプローブに含めることである。幾つかの実施形態では、修飾は、プローブの環状化を含む。

幾つかの実施形態では、かかるプローブは、異なる標的（例えば、対立遺伝子）への差次的ハイブリダイゼーションに基づいて選択的に「活性化」された後、このプローブが消化されることが可能となる。幾つかの実施形態では、活性化ステップにより、プローブにニックまたはギャップがもたらされる。

幾つかの実施形態では、活性化は、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼを使用して行われる。幾つかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、メチル化／修飾特異的エンドヌクレアーゼである。幾つかの実施形態では、両方の鎖が切断酵素によって切断されるのを避けるために、一方の鎖は、消化をブロックするために、修飾された塩基または骨格の修飾（例えば、ホスホロチオエート連結）を含み得る。幾つかの実施形態では、活性化は、フラップエンドヌクレアーゼを使用して行われる。幾つかの実施形態では、活性化は、ミスマッチ修復酵素またはミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣｅｌＩ、Ｓ１、Ｔ７Ｅ１、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）を使用して行われる。幾つかの実施形態では、活性化は、ＲＮａｓｅ酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ２）を使用して行われる。幾つかの実施形態では、活性化は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる（例えば、Ｃａｓ酵素または一方の鎖のみを切断する変異体の使用を含む）。幾つかの実施形態では、活性化は、アルゴノートファミリー酵素（例えば、Ａｇｏ１、Ａｇｏ２、Ａｇｏ３、Ａｇｏ４、Ｈｉｌｉ、Ｈｉｗｉ、Ｈｉｗｉ２、Ｈｉｗｉ３、ａｕｂｅｒｇｉｎｅ、ＰＩＷＩ、Ａｇｏ５、Ａｇｏ６、Ａｇｏ７、Ａｇｏ８、Ａｇｏ９、Ａｇｏ１０、Ａｌｇ－１、Ａｌｇ－２など）を使用して行われる。幾つかの実施形態では、活性化は、ミスマッチの化学的切断（ＣＣＭ）（例えば、ヒドロキシルアミン＋過マンガン酸カリウム、続いて、ピペリジン）を使用して行われる。

幾つかの実施形態では、活性化はＤＮＡ修復酵素を使用して行われる。例えば、幾つかの実施形態では、上記方法は、所望の切断位置での意図的なＧ：Ａミスマッチを作り出すように設計されたプローブのハイブリダイゼーションを含む。ＤＮＡ修復酵素ＭｕｔＹグリコシラーゼは、ミスマッチ構造を認識し、二重鎖からミスペアのＡを選択的に除去して、標的鎖中に脱塩基部位を作り出す。ＡＰ－エンドヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼＩＶは、添加すると、骨格を切断し、ＤＮＡ鎖を２つの断片に分裂させる。

幾つかの実施形態では、プローブの消化は、標的への差次的ハイブリダイゼーションに基づいて、選択的に行われる。幾つかの実施形態では、プローブの消化は、活性化されたプローブに選択的な一般的な消化方法を用いる。幾つかの実施形態では、消化の方向は３’→５’である。幾つかの実施形態では、消化の方向は５’→３’である。幾つかの実施形態では、消化は、プローブの内部切断によるものである。幾つかの実施形態では、消化は、加ピロリン酸分解（無機リン酸が攻撃基である切断）を使用しない。

３’→５’消化が望ましい幾つかの実施形態では、３’→５’エキソヌクレアーゼが用いられる。かかるエキソヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥｘｏＩ）、エキソヌクレアーゼＴ（ＥｘｏＴ）、エキソヌクレアーゼＶＩＩ（ＥｘｏＶＩＩ）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）、およびＤＮＳが挙げられるが、これらに限定されない。

３’→５’消化が望ましい幾つかの実施形態では、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが用いられる（例えば、校正ポリメラーゼ、例えば、ＰＨＵＳＩＯＮ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｑ５（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（Ｒｏｃｈｅ）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）。

５’→３’消化が望ましい幾つかの実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼが用いられる（例えば、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪｆ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶ（ＥｘｏＶ）、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＥｘｏＶＩＩＩ）、Ｔ５エキソヌクレアーゼ）。

５’→３’消化が望ましい幾つかの実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが用いられる。幾つかのかかる実施形態では、５’（または内部）でブロックされたプローブは、ブロッキングオリゴヌクレオチドとして作用し、標的に対するプライマーの伸長を妨げることができる。差次的ハイブリダイゼーションに基づくプローブの選択的切断は、ブロックされた５’末端の融解をもたらし、上流プライマーの伸長が可能となる間に、残りのハイブリダイズしたプローブは５’→３’方向に消化され（あるいは、鎖置換によって置換され）、標的分子が遊離する。同様な実施形態では、切断されたプローブの５’セクションはそれ自体がプライマーとして作用することができる。

内部切断では、上に記載の「活性化」方法のいずれかを単独の消化方法として使用することができる。幾つかの実施形態では、切断されたプローブから得られた断片は、融解温度（Ｔ_ｍ）が完全なプローブよりも低いため、温度、ｐＨなどの上昇による標的からの選択的変性が可能となる。

幾つかの実施形態では、本システムおよび本方法は、核酸配列を濃縮または枯渇する方法として選択的消化を使用する。幾つかの実施形態では、消化反応は、ハイブリダイズした鎖の間の相補性に依存し、特定の特性（例えば、特定の配列または構造）を有する鎖のみを消化する。この反応によって、特定の特性を有するある特定の配列は、選択的に短縮または消化される一方、この特定の特性を有しない配列は、消化されないまたはあまり消化されないままとなる。この反応を行うと、短縮された配列またはより消化された配列にハイブリダイズした分子を回収し、分析することができる。あるいは、この反応を行うと、より短縮された配列またはより消化された配列を分析することができる。あるいは、この反応を行うと、消化を受けていない配列を分析することができる。

試料は、濃縮または枯渇を１回または複数回繰り返して対象となる配列を更に濃縮することができる。例えば、幾つかの実施形態では、濃縮または枯渇の第２のラウンドは、第１のラウンドが完了した後に第１のラウンドと同じ試薬を使用して行われる。幾つかの実施形態では、濃縮または枯渇の第１のラウンドと第２のラウンドとの間に増幅反応を使用することができる。他の実施形態では、濃縮または除去される標的核酸の異なる配列に選択的な異なるプローブが使用される。このアプローチは、濃縮または枯渇させる配列が、除去される配列と少なくとも２塩基の位置で異なる場合に特によく適している。例えば、野生型に対して２つの多型を含む標的核酸は、第１の多型に基づく濃縮または枯渇の第１のラウンド、および第２の多型に基づく濃縮または枯渇の第２のラウンドを受け得る。指数関数的な濃縮または枯渇は、複数ラウンドを用いることによって達成することができる。幾つかの実施形態では、標的核酸は、濃縮または枯渇の前に、合成配列を生成するように改変され（例えば、多型を加える）、その結果、合成配列が、合成配列を含まない配列に対する濃縮または枯渇の対象となる。幾つかの実施形態では、２つ以上の核酸は、反応の任意の所与のラウンドにおいて複数のプローブを使用して濃縮または枯渇され得る。幾つかの実施形態では、反応の１ラウンドまたは複数ラウンドにおいて、特定の核酸を濃縮させる一方、第２の核酸を枯渇させることができる。

本発明の一態様では、少なくとも第１および第２の配列を含む試料中の第１の核酸配列の第２の核酸配列に対する比を変える方法であって、ａ）１つまたは複数の核酸分析物を含む試料を、ｉ）第１および第２の配列と差次的に相補的であるプローブ（例えば、前記プローブの３’末端またはその他の領域が、第１または第２の配列の一方と完全に相補的であるが、他方と不完全に相補的である）；ｉｉ）任意選択で、活性化酵素または試薬；およびｉｉｉ）第１の配列にハイブリダイズしたプローブを第２の配列に対して選択的に切断または消化するヌクレアーゼを含む、第１の反応混合液に導入するステップ、ならびにｂ）第１の配列、またはその切断もしくは消化産物を、第２の配列、またはその切断もしくは消化産物から分離するステップを含む、方法が提供される。

幾つかの実施形態では、アニーリングがより良好（例えば、完全）なものである任意のプローブ複合体の分離は、アニーリングがより良好（例えば、完全）なものであるプローブ配列複合体が、アニーリングがより不良（例えば、不完全）なものであるプローブ配列複合体よりも優先される反応条件を使用して行われる。これは、反応混合液の温度の変化、および／または反応混合液のｐＨの変化、および／または反応混合液の塩分濃度の変化の形態を取り得る。幾つかの実施形態では、化学薬剤（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミドなど）は、核酸を変性させて濃縮または枯渇を促進するために用いられる。幾つかの実施形態では、核酸分子（置換オリゴヌクレオチド）および酵素またはタンパク質が、ハイブリダイズした核酸分子を分離するのに使用される。

幾つかの実施形態では、２つのプローブ、二本鎖標的核酸の順方向鎖用のものおよび逆方向鎖用のものが用いられる。幾つかの実施形態では、プローブは、所望の反応を妨げるような様式で互いにハイブリダイズすることがないように設計することが有益である。

幾つかの実施形態では、プローブは、濃縮または枯渇される核酸分子を含む試料に曝露される前または後に固体支持体上に捕捉される。幾つかの実施形態では、プローブは、固体支持体上の対応するストレプトアビジン部分によって捕捉されるビオチン部分を含む。幾つかの実施形態では、プローブは、リンカー分子にハイブリダイズし、このリンカー分子自体が修飾、例えば、ビオチン部分を含み、この修飾によって固体支持体上に捕捉される。幾つかの実施形態では、固体支持体はビーズである。幾つかの実施形態では、ビーズは磁性または常磁性ビーズである。

上記技術は、対象となる核酸分子を分けるためまたはそれを濃縮するための捕捉の使用に限定されない。分子は、例えば、大きさ、電荷もしくは形状またはその他の物理的もしくは化学的性状の違いに基づいて、分けたり濃縮したりすることができる。幾つかの実施形態では、対象となる核酸へある部分が付加され（例えば、クリックケミストリー修飾で）、その結果、付加された部分によって、選択可能な識別特性が対象となる核酸に付与される。

幾つかの実施形態では、１つまたは複数の洗浄ステップが、１つまたは複数のステップの間に実施される。幾つかの実施形態では、洗浄およびハイブリダイゼーションステップは、２５℃～９５℃の間に温度を上げて実施される。

幾つかの実施形態では、試料は、核酸分析物のアダプタータグ付きライブラリを含む。

幾つかの実施形態では、配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ＨＤＡ（ｈｅｌｉｃａｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、およびＮＥＡＲ（ｎｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）など）によって同定される。幾つかの実施形態では、配列は、マイクロアレイ分析によって同定される。

幾つかの実施形態では、配列はシークエンシングによって同定される。幾つかの実施形態では、配列は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）（例えば、ブリッジ増幅シークエンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＳＭＲＴシークエンシング（ＰａｃＢｉｏ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシング、ナノポアシークエンシング、およびパイロシークエンシングなど）によって同定される。

本発明の構成および方法は、これらに限定されないが、環境（例えば、水、土壌、空気など）試料および生物学的試料を含む任意の種類の試料に対して用いることができる。生物学的試料は、植物、動物、および感染症病原体などを含む任意の供給源からのものであり得る。適切には、幾つかの実施形態では、分析物／配列は、哺乳類対象（特にヒト患者）から採取された生物学的試料、例えば、血液、血漿、痰、尿、皮膚、生検または外科的切除試料に由来する。幾つかの実施形態では、生物学的試料は、存在する細胞を破壊することによって分析物／配列が放出されるように溶解に供される。他の実施形態では、分析物／配列は、試料それ自体に遊離形態（例えば、血液または血漿中に循環している無細胞ＤＮＡ）で既に存在し得る。本発明の構成および方法は、対象となる分析物の対立遺伝子頻度が低い可能性がある過去において難易度が高かった試料種で特に有用である。かかる試料としては、血液、尿、ｃｙｔｏｓｐｏｎｇｅ収集試料（例えば、食道試料）、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）由来試料、胸膜液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）が挙げられる。

幾つかの実施形態では、試料は、プールされた試料である。プールされた試料は、複数の試料をまとめて混合してバッチとし、このバッチで、プールされたコレクションが試験されることを含む。このアプローチにより、より限られた量のリソースを使用して試験可能な個別の試料の数が増加する。対象となるプールされた試料としては、感染症病原体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＩＶ、ＨＣＶなど）の存在に関して試験される献血血液試料、農業試料、食品試料、精子試料、および生物学的試料が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、プールされた試料は、複数の異なる供給源からプールされた試料を有する（その生成の性質上）環境収集試料（例えば、廃水試料）である。試料をプールすると、試料が互いに希釈されるためにバリアントの対立遺伝子頻度が減少する可能性がある一方、スクリーニングの効率を大幅に増加させ得る。本明細書で提供される技術は、非常に低い対立遺伝子頻度での検出を可能にするため、プールされた試料の分析に特によく適している。幾つかの実施形態では、初期試料それぞれの一部を、バーコードまたはその他の複合調製ステップを使用することなくプールし、プールされた試料を試験する。陽性の結果が得られたら、プールされていない試料の残りを個別に試験することができる。

分析される標的の核酸は、任意の対象となる標的核酸であり得る。幾つかの実施形態では、分析は、研究、診断、または治療の目的のためのものである。幾つかの実施形態では、試料がヒト対象からのものである場合、目的は、１つまたは複数の疾患または病態の分析、検出、治療、または治療の選択のためのものであり得る。上記技術は、多因子疾患および障害の分析で特に有用であり、該疾患および障害としては、癌（例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、頭頸部癌、眼癌、脳癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、中皮腫、骨髄腫、前立腺癌、皮膚癌、甲状腺癌、膵臓癌、骨癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、精巣癌、肛門癌、直腸癌、口腔癌、唾液腺癌、肉腫、および甲状腺癌）、自己免疫疾患、喘息、繊毛関連疾患、口蓋裂、糖尿病、心臓疾患、高血圧、炎症性腸疾患、知的障害、気分障害、肥満、不妊症、ならびに屈折異常が挙げられるが、これらに限定されない。

幾つかの実施形態では、分析される核酸は、メチル化配列であるか、あるいは、メチル化配列に由来する。上記技術は、標的核酸中の任意の特定の位置または複数の位置でのメチル化状態を区別するのに使用される。最初、メチル化配列を、化学的処置（例えば、酸化、還元、亜硫酸水素塩処置）の使用によって、またはメチル化依存性制限酵素への曝露によって、もしくは任意のその他の適切なアプローチによって修飾し、続いて、修飾された配列を濃縮および／または同定することが可能である。

幾つかの実施形態では、試料中に存在するＲＮＡの標的化された領域は、ＤＮＡに転写される。

上記技術の幾つかの実施形態は、固体表面を用いる。核酸捕捉に適合し得る任意の固体表面を直接的または間接的に用いることができる。固体支持体としては、とりわけ、ガラス、金属、ゲル、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、セラミック、およびろ紙でできているものが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）、マイクロ粒子、ナノ粒子、カラム、またはスライドなどである。幾つかの実施形態では、固体支持体は、生分子との反応、あるいは、生分子とのカップリングまたはコンジュゲーションを促進するために以下の官能基のうちの１つまたは複数を含むように修飾される：アミン基、カルボン酸基、スルホン酸基、トリメチルアミン基および／またはエポキシド基。幾つかの実施形態では、ストレプトアビジンは、固体表面に取り付けられる。幾つかの実施形態では、固体支持体は、デキストラン修飾表面である。幾つかの実施形態では、固体支持体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ修飾表面である。幾つかの実施形態では、固体支持体は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはＰＶＰ修飾表面である。幾つかの実施形態では、固体支持体は、多糖または多糖修飾表面である。幾つかの実施形態では、多糖は、デキストラン、フィコール、グリコーゲン、アラビアゴム、キサンタンゴム、カラゲナン、アミロース、寒天、アミロペクチン、キシランおよび／またはβ－グルカンのうちの１つまたは複数から選択される。幾つかの実施形態では、固体支持体は、化学樹脂または化学樹脂修飾表面である。幾つかの実施形態では、化学樹脂または化学樹脂修飾表面は、以下の樹脂のうちの１つまたは複数から選択される：イソシアネート、グリセロール、ピペリジノ－メチル、ポリＤＭＡＰ（ポリマー結合ジメチル４－アミノピリジン）、ＤＩＰＡＭ（ジイソプロピルアミノメチル）、アミノメチル、ポリスチレンアルデヒド、トリス（２－アミノメチル）アミン、モルホリノ－メチル、ＢＯＢＡ（３－ベンジルオキシベンズアルデヒド）、トリフェニル－ホスフィンまたはベンジルチオ－メチル。

幾つかの実施形態では、捕捉部分は、プローブまたは標的核酸を固体表面と会合させるために使用される。幾つかの実施形態では、捕捉部分は、化学的に切断可能なリンカー、例えば、ジスルフィド、アリル、またはアジドでマスクされたヘミアミナールエーテルリンカーを介して固体支持体に共有結合によって取り付けられる。幾つかの実施形態では、捕捉部分は、アミドまたはホスホロチオエート結合を介して固体支持体に共有結合によって取り付けられる。幾つかの実施形態では、プローブまたは標的は、捕捉部分を導入するように改変した部分を組み込むことができる。幾つかの実施形態では、反応は、アルキン標識オリゴヌクレオチドをアジドビオチンコンジュゲートと反応させることを含む。

幾つかの実施形態では、捕捉部分はオリゴヌクレオチド配列を含み、固体表面は相補的オリゴヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、融解温度を変化させるために、１つまたは複数の修飾された塩基および／または当業者に公知のその他のかかる修飾を含む。幾つかの実施形態では、１つまたは複数の修飾された塩基および／または当業者に公知のその他のかかる修飾の存在は、融解温度の低下をもたらす。幾つかの実施形態では、１つまたは複数の修飾された塩基および／または当業者に公知のその他のかかる修飾の存在は、融解温度の上昇をもたらす。幾つかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０および２００塩基の間である。幾つかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０、２０、３０、４０、５０、および１００塩基の間である。幾つかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０～２０、１０～３０、１０～４０および１０～５０塩基の間である。幾つかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０～２０、１０～３０および１０～４０塩基の間である。幾つかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０～２０および１０～３０塩基の間である。幾つかの実施形態では、相補的配列の長さは、１０～２０塩基の間である。

幾つかの実施形態では、捕捉部分は、化学修飾を含み、化学修飾と固体支持体との間の相互作用を介して固体支持体に取り付けられる。幾つかの実施形態では、化学修飾はビオチンであり、固体支持体はストレプトアビジンを更に含む。幾つかの実施形態では、捕捉されたオリゴヌクレオチド配列は、固体支持体から遊離させる。幾つかの実施形態では、捕捉されたオリゴヌクレオチド配列は、固体支持体から化学変性によって遊離させる。幾つかの実施形態では、化学変性は、適切な濃度の塩基の使用によって達成される。幾つかの実施形態では、０．１ＭのＮａＯＨを使用することができる。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、ジスルフィドリンカーの場合、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）の添加を介して；パラジウム錯体またはアリルリンカーの添加を介して；あるいはアジドでマスクされたヘミアミナールエーテルリンカーの場合、ＴＣＥＰの添加を介して化学的リンカーが切断されることによって固体支持体から遊離させる。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド配列から非標準的な塩基を除去し、得られた脱塩基部位で切断することによって固体支持体から遊離させる。幾つかの実施形態では、非標準的な塩基はウラシルであり、これは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって除去される。代替の実施形態では、非標準的な塩基は８－オキソグアニンであり、これは、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）によって除去される。

幾つかの実施形態では、捕捉部分は、オリゴヌクレオチド領域であり、遊離は、反応混合液の加熱によって行われる。幾つかの実施形態では、反応混合液は、３７℃～１００℃まで１～２０分間にわたって加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、１～１５分間にわたって加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、１～１０分間にわたって加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、１～５分間にわたって加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、５分間にわたって加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、３７℃～８５℃まで加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、３７℃～７５℃まで加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、３７℃～６５℃まで加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、３７℃～５５℃まで加熱される。幾つかの実施形態では、反応混合液は、３７℃～４５℃まで加熱される。

当業者は、反応混合液を加熱して相補的オリゴヌクレオチド領域を遊離させる温度は、該領域の長さをはじめとする多くの要因に依存することを理解する。

幾つかの実施形態では、遊離は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド配列の切断によって達成される。この切断は、前または後に記載の手段のいずれかによって、あるいは、当業者に公知の手段のいずれかによって達成することができる。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、化学的に切断される。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、酵素的に切断される。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、制限酵素によって切断される。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、エピジェネティック修飾感受性または依存性制限酵素によって切断される。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、メチル化感受性または依存性制限酵素によって切断される。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、ヒドロキシメチル化感受性または依存性制限酵素によって切断される。

幾つかの実施形態では、配列は、バリアントまたは野生型配列の濃縮の前または後に酵素的または化学的に変換して、メチル化状態を検出することができるようにする。当業者は、用語「濃縮」は、前または後に記載の標的配列および非標的配列の混合物からの標的配列の選択的単離を指すことを理解する。

幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、光切断可能なリンカーを含み、オリゴヌクレオチド配列は、固体支持体からこのリンカーの切断によって遊離する（例えば、ＵＶ光によって）。この修飾は、化学的骨格修飾であってもよい。

幾つかの実施形態では、試料核酸は、本明細書に開示される方法を適用する前に断片化される。当業者は、ＤＮＡを断片化するのに使用され得る複数の手法が存在することを理解する。かかる方法としては、超音波処理、針せん断、噴霧、ポイントシンクせん断、圧力セルの通過（フレンチプレス）および酵素的方法が挙げられる。幾つかの実施形態では、断片化は、超音波処理によって達成される。幾つかの実施形態では、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ、ＮＪ）装置を使用することができる。幾つかの実施形態では、断片化は音響せん断によって達成される。幾つかの実施形態では、Ｃｏｖａｒｉｓ（登録商標）機器（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用することができる。幾つかの実施形態では、断片化は、噴霧によって達成される。噴霧は、ＤＮＡが噴霧器ユニットの小孔の中を強制的に押し出されるもので、その結果、微細なミストが形成され、回収される。断片の大きさは、噴霧器を通してＤＮＡを押し出すために使用されるガスの圧力、ＤＮＡ溶液が孔を通過する速度、溶液の粘度、および温度によって決められる。幾つかの実施形態では、断片化は、流体力学的せん断によって達成される。幾つかの実施形態では、Ｄｉｇｉｌａｂ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）からのＨｙｄｒｏｓｈｅａｒを使用することができる。幾つかの実施形態では、断片化は、ポイントシンクせん断によって達成される。幾つかの実施形態では、断片化は、針せん断によって達成される。幾つかの実施形態では、断片化は、フレンチプレスの使用によって達成される。幾つかの実施形態では、断片化は酵素的断片化によって達成される。幾つかの実施形態では、断片化は制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成される。幾つかの実施形態では、断片化はトランスポソーム媒介性断片化である。幾つかの実施形態では、断片化は、Ｃａｓ９によって達成される。幾つかの実施形態では、断片化は、本明細書にその全体が参照により組み込まれるＵＳ１０５７７６４４に記載されているＣａｓ９によって達成される。幾つかの実施形態では、１つまたは複数の異なる断片化手法が使用され得る。幾つかの実施形態では、１つまたは複数の同じまたは異なる断片化手法が、上記方法の１つまたは複数の異なる時点で使用され得る。

幾つかの実施形態では、配列の断片化およびアダプタータグ付けは、上記方法の同じ時点または同じステップで行われる。かかる例の１つが、ＩｌｌｕｍｉｎａによるＮｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔである。

当業者は、アダプタータグ付き配列／ライブラリを調製するのに使用され得る複数の手法が存在することを理解する。

幾つかの実施形態では、核酸は、断片化に続いて、末端を研磨およびＡテール化した後、１つまたは複数のアダプターにライゲーションし得る。

幾つかの実施形態では、核酸は、断片化に続いて、末端を研磨し、平滑末端ライゲーション反応でアダプターにライゲーションさせることができる。

幾つかの実施形態では、断片化に続いて、アダプターを一本鎖ＤＮＡにライゲーションさせる。

幾つかの実施形態では、断片化に続いて、ターミナルトランスフェラーゼ酵素を使用して非鋳型塩基を断片の３’末端に付加することで、断片を二本鎖にするためのプライミング用部位が提供される。

幾つかの実施形態では、ＤＮＡリガーゼの代わりにトポイソメラーゼを使用することができる。

幾つかの実施形態では、ＴＯＰＯクローニングを使用して、断片化されたＤＮＡにアダプターを付加することができる。

幾つかの実施形態では、断片化に続いて、トランスポサーゼを使用して核酸にアダプター配列を付加することができる。

幾つかの実施形態では、断片化に続いて、標準的なトランスポゾンを使用することができるが、次いで、オリゴヌクレオチドの置換えを使用して、Ｙ型アダプターを作り出すために修飾される。

幾つかの実施形態では、試料がアダプタータグ付きライブラリである場合、ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ライブラリ分子のクロスハイブリダイゼーション（いわゆる「デイジーチェーン化」）を防止するために使用される。

幾つかの実施形態では、試料は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。

任意のシークエンシング方法論を使用して、標的核酸分子を分析することができる。幾つかの実施形態では、シークエンシングはマクサム・ギルバートシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングはサンガーシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングはショットガンシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングは１分子リアルタイムシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングはイオン半導体シークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングはパイロシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングは、合成によるシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングはコンビナトリアルプローブアンカー合成（ｃＰＡＳ）である。幾つかの実施形態では、シークエンシングはライゲーションによるシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングはナノポアシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングはＧｅｎａｐＳｙｓシークエンシングである。幾つかの実施形態では、シークエンシングは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）である。

幾つかの実施形態では、患者をスクリーニングするための方法であって、前または後のいずれかに記載の方法の実施形態を使用して、患者由来の試料中の１つまたは複数の特定の核酸配列の有無を検出することを含む、方法が提供される。

当業者は、かかるスクリーニングは、１つまたは複数の病態に対して治療を受けている患者をモニターするのに有益であり、その治療状態を患者の試料中の１つまたは複数の核酸配列のレベルによって確認することができることを理解する。

例えば、１つまたは複数の癌に対して治療を受けている患者の治療状態は、血中の１つもしくは複数の核酸配列のレベルならびに／または１つもしくは複数の特定のバリアントの存在および／もしくは非存在によって確認することができる。高レベルの循環腫瘍核酸配列ならびに／または１つもしくは複数の特定のバリアントの存在および／もしくは非存在を使用して、特定の治療が所望の効果を有しているか否かを推測することができる。したがって、特定の治療が成功したか否かをモニターするための方法であって、かかる成功が、特定の核酸配列の有無および／または患者由来の試料中のそれぞれのレベルによって推測することができる、方法が提供される。

幾つかの実施形態では、寛解中の患者を疾患の再発を検出するためにモニターする方法が提供される。

幾つかの実施形態では、表面上健康な人をスクリーニングして、これらに限定されないが、癌を含む１つまたは複数の疾患状態の存在を検出する方法が提供される。

幾つかの実施形態では、１つまたは複数の疾患状態と診断された患者における１つまたは複数の遺伝子マーカーの存在および／または非存在を検出し、１つまたは複数のマーカーの存在および／または非存在を使用して、どの治療を患者が受けるべきかを決定する、方法が提供される。

幾つかの実施形態では、患者の１つまたは複数の癌を診断および／またはモニターするための方法であって、前または後のいずれかに記載の方法の実施形態を使用して、患者由来の試料中の１つまたは複数の特定の核酸配列の有無を検出することを含む、方法が提供される。

当業者は、１つまたは複数の特定の核酸配列が個体に特異的である場合がある（例えば、シークエンシングなどの同定方法によって組織生検または外科的切除から同定される）ことを理解し、かかる場合には、個々の患者に特異的なパネルが使用され得ることを理解する。

当業者は、幾つかの実施形態では、パネルが、ヒトゲノムの公知のホットスポット領域、すなわち、所与の癌の種類において繰り返し変異する領域をカバーすることを更に理解する。

当業者は、幾つかの実施形態では、パネルが、ヒトエクソームの標的領域または全体をカバーすることを更に理解する。

幾つかの実施形態では、非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）のための方法であって、前または後のいずれかに記載の方法の実施形態を使用して、患者由来の試料中の１つまたは複数の特定の核酸配列の有無を検出することを含み、患者が妊娠患者である、方法が提供される。幾つかの実施形態では、試料は、妊娠患者の血液の血漿および／または血清である。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、かかる試料に関連した共通のＳＮＰのパネルを使用して試料の胎児画分を濃縮および／または定量するために用いられる。

幾つかの実施形態では、患者を治療する方法であって、
－ 前または後に記載の本発明の実施形態のいずれかを実施して、患者由来の試料中の１つまたは複数の特定の核酸配列の有無を検出するステップ；
－ 前記配列の有無に基づいて１つまたは複数の治療決定を行うステップを含む、方法が提供される。

幾つかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の開始である。幾つかの実施形態では、治療決定は、特定の治療の中止である。幾つかの実施形態では、治療決定は、特定の治療薬の用量の増加である。幾つかの実施形態では、治療決定は、特定の治療薬の用量の減少である。幾つかの実施形態では、治療決定は、特定の治療薬の投与頻度の増加である。幾つかの実施形態では、治療決定は、特定の治療薬の投与頻度の減少である。幾つかの実施形態では、治療決定は、追加の薬品の既存の治療レジメンへの追加である。幾つかの実施形態では、治療決定は、薬品の既存の治療レジメンからの除去である。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法を実行するのに必要、十分、または有益な構成要素の１つもしくは複数または全てを含むキットが提供される。例えば、幾つかの実施形態では、キットは、１つまたは複数のプローブ、固体支持体、酵素、ブロッキングオリゴヌクレオチド、緩衝液、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴＷＥＥＮ２０など）、アダプター、クラウディング剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、硫酸デキストランなど）、溶媒（例えば、ホルムアミド、エチレンカーボネートなど）、反復配列（ＣＯＴ－１ ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、およびリボソームＲＮＡをブロックするオリゴヌクレオチドなど）にハイブリダイズする添加剤、捕捉部分（例えば、ビオチン；例えば、プローブの一部として）、金属イオン、ブロッキングオリゴヌクレオチド、シークエンシング試薬、増幅試薬（等温増幅試薬；指数関数的増幅試薬（例えば、熱安定性ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、バッファー、標識された検出プローブ））、転写試薬、使用説明書、ソフトウェア、機器、陽性対照、ならびに陰性対照などを含む。１つまたは複数の入れ物は、１つまたは複数の構成要素を個別に収容することができる。

幾つかの実施形態では、前または後に記載の複数のプローブを含むキットが提供される。

幾つかの実施形態では、１～１，０００，０００個の別個のプローブを含むキットが提供される。幾つかの実施形態では、１～１００，０００個の別個のプローブを含むキットが提供される。幾つかの実施形態では、１～１０，０００個の別個のプローブを含むキットが提供される。幾つかの実施形態では、１～１，０００個の別個のプローブを含むキットが提供される。

幾つかの実施形態では、シークエンシングデータを分析するために生物情報学的アプローチが使用される。幾つかの実施形態では、特定のバリアントの有無を評価する。他の実施形態では、複数のバリアントからのデータを組み合わせて、特定の標的核酸の有無に対する確率的推定を導出する。

例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングデータの分析は、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑなどのツールを使用してＢＣＬファイルをＦＡＳＴＱ形式に変換および多重化解除することを含む。幾つかの実施形態では、シークエンシングリードは分子識別子を含む。この場合、分子識別子は、シークエンシングリードから抽出し、ＦＡＳＴＱヘッダーに追加し、シークエンシングリードをクリップすることができる。幾つかの実施形態では、非標準的な塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴではない）を有するバーコードをフィルタリングすることができる。得られたリードは、次いで、バーコード配列をアライメントに追加するために、ツール、例えば、ｂｗａ ｍｅｍを－Ｃオプションを用いて使用してアライメントすることができる。アライメントは、次いで、座標によってソートし、重複リードをマークし、ｂｉｏｂａｍｂａｍ２、ｂａｍｓｏｒｍａｄｕｐ、およびｂａｍｍａｒｋｄｕｐｌｉｃａｔｅｓｏｐｔを使用してリードをリード座標、メイト座標、および光学的重複補助タグでアノテートすることができる。リードは、適切な対としてマークされていない場合、あるいは、光学的重複、補足、ＱＣ不合格、マッピングされていないまたは二次アライメントとしてマークされていた場合にフィルタリングすることができる。各リードは、次いで、参照名、ソートされたリードおよびメイト断片化ブレークポイント、フォワードおよびリバースリードバーコード、ならびにリード鎖を含んでなる補助タグでマークされ得る。

幾つかの実施形態では、シークエンシングデータは、リードフラグおよびタグの様々なサブセット（リードおよびメイト座標、光学的重複フラグ、ＵＭＩ配列、ＭＩＤ配列、アライメントスコア、ならびに二次アライメントスコアなどを含む）を用いるバリアントコーリングアルゴリズムを使用して分析される。この場合、シークエンシングデータの分析は、２つのモデルの下でデータ観測の確率を比較する。第１のモデルは、シークエンシングアーチファクトの分布を指定するヌルモデルである。第２のモデルは、真のバリアントを許容するモデルである。この場合、代替モデルの下での確率がヌルモデルの下での確率を上回ると、バリアントがコールされる。幾つかの実施形態では、予め特徴付けられた試料のパネルは、第１のモデルの誤差分布をモデル化するのに役立ち得る。

幾つかの実施形態では、補助タグを使用して、同じ入力分子、および／または同じ入力分子の同じ鎖に由来する可能性が高いリードを識別することができる。幾つかの実施形態では、コンセンサス塩基品質スコアは、同じ補助タグを共有するリードから導出することができる。

幾つかの実施形態では、バリアントは、人工知能アルゴリズム、例えば、畳み込みニューラルネットワークを使用して、識別される。

幾つかの実施形態では、シークエンシングデータは、アーチファクトを除去するために更にフィルタリングされ得る。例示的なフィルターとしては、所与のシークエンシングリード上に存在するミスマッチの数；アライメントスコアおよび次善のアライメントスコア；塩基品質スコアまたはコンセンサス塩基品質スコア；所与のバリアント部位をカバーする最小リード数；シークエンシングリード中のバリアントの位置；リードが５’クリップされているかどうか；リードが不適切な対であるかどうか；リードがインデルを含んでいるかどうか；ならびに所与のバリアントのバリアント対立遺伝子頻度が挙げられる。幾つかの実施形態では、共通のＳＮＰを含むか、あるいはアライメントアーチファクトが生じやすいゲノムの領域がフィルタリングされる。当業者に公知の多くの他のフィルターが存在する。

幾つかの実施形態では、対照試料をシークエンシングして、バリアントをフィルタリングして除く。例えば、頬側上皮またはその他の組織源からのＤＮＡを、生殖細胞系列バリアントを除去するためにシークエンシングすることができる。別の実施形態では、バフィーコートまたは白血球ＤＮＡを、クローン造血に由来する体細胞変異をフィルタリングして除くためにシークエンシングすることができる。

本発明の構成、方法、およびキットは、広範囲な適用および設定で有用である。幾つかの実施形態では、これらは、配列が試料中で検出されることが望ましい任意の方法論で有用である。幾つかの実施形態では、これらは、複雑な試料中の少数（例えば、希な）配列を検出することが望ましい任意の方法論で有用である。上に記載の例示的な使用に加えて、多数の追加の例示的な使用が以下に提示される。

幾つかの実施形態では、構成、方法、およびキットは、感染症の分析および治療で有用である。上記技術は、試料中に存在する可能性がある低頻度変異の検出に特に価値がある。例えば、上記技術は、治療抵抗性（例えば、抗生物質抵抗性、抗ウイルス剤抵抗性など）感染症（例えば、ＨＩＶ、結核など）に関連する低頻度変異を検出するのに有用である。上記技術は、シークエンシングのための細菌またはウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの選択的プルダウンで更に有用である。

上述したように、上記技術は、複雑な試料中の分析物の分析および／または濃縮に特によく適している。研究および臨床的関心が高まっている分野の１つに、マイクロバイオーム分析があり、この分析では、上記技術は、所望の細菌ＤＮＡをシークエンシングまたはその他の分析においてより高い特異性で選択するために有用である。

上記技術はまた、多くの異なる試料のハイスループット分析および多重化分析でも有用である。これらの利点は、多種多様な遺伝子型判定への適用で有用であり、これらの用途としては、法医学的分析、父子／母子鑑定、疾患分析（例えば、癌、感染症）、薬品感受性試験、農業および食品検査（例えば、選抜育種の補助のため、微量汚染物質を同定するためなど）が挙げられる。

上記技術は、合成核酸（例えば、ＤＮＡ）のエラー訂正で有用である。合成核酸は研究、診断、および臨床適応において使用される。多くの場合、意図しない配列または非所望の配列を有する核酸分子の使用を避けたり最小限に抑えたりすることが重要である。上記技術は、所望の分子を非所望の分子から識別および単離するのに有用である。

核酸編集は、研究、合成生物学、および臨床への適用において重要なプロセスとして台頭してきている。例えば、核酸のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ編集、および関連したプロセスは、重要なプロセスとして台頭してきている。これらの編集手法の多くは、意図された編集産物、編集されていない産物、および意図されていない編集産物を含む分子の混合集団をもたらす。本明細書で提供される技術は、意図された編集産物の同定、選択、および単離を容易にする。

上記技術はまた、環境モニタリングでも有用である。農業利用に加えて、上記技術は、微量の対象となる分析物を含む可能性のある環境試料の分析に特によく適している。かかる試料としては、在来種および侵入種の生物の分析、侵入種の早期検出、空気および水の汚染、ならびに古代のＤＮＡの分析が挙げられるが、これらに限定されない。試料の種類としては、土壌、水、雪、糞便、粘液、生殖体、脱落した皮膚、死体、毛髪および空気が挙げられるが、これらに限定されない。

上記技術は、特定の試料由来の核酸の所望のサブセットを他のサブセットから単離するのに有用である。例えば、上記技術は、葉緑体およびミトコンドリアゲノムの単離および分析で有用である。

上記技術は、操作された細胞および天然細胞の細胞株スクリーニングで有用である。かかる細胞株としては、細胞培養（初代および不死化）、幹細胞（胚性、人工多能性、脱分化など）、細胞療法を意図した分化細胞、研究または臨床への適用のためのエクスビボで改変した細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）、ならびに遺伝子操作された細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

上記技術は、損傷した核酸またはその他の非所望の核酸を損傷していない核酸または所望の核酸から分離して除去するのに有用である。例えば、上記技術は、メチル化分析の前に、損傷したＤＮＡを試料から除去するのに使用することができる。

上記技術は、細胞（例えば、胚、卵子、精子）、リポソーム、エキソソーム、および核酸ベクター（例えば、遺伝子治療ベクター）などを、対象に投与する前に移植前スクリーニングを行うのに有用である。幾つかの実施形態では、上記技術は、培養培地に適用して、生細胞をかく乱することなくスクリーニングすることができる。

上記技術は、薬品毒性スクリーニングで有用である。上記技術は、特定の薬品の使用に関連する可能性のあるＤＮＡの損傷、変異の生成、およびメチル化の変化などの同定に特によく適している。

上記技術は、核酸のフラグメントーム解析で有用である。例えば、関連する相関情報（例えば、起源組織、癌などの疾患との関連など）と特定の配列を関連付けるブレークポイント上に存在するか、あるいは、それと合致するプローブを使用することができる。

上記技術は、核酸の複雑性の減少が望ましい任意の適用で使用することができる。例えば、上記技術は、全ゲノムの複雑性の減少に使用することができる。幾つかのかかる実施形態では、制限酵素消化またはその他の核酸断片化工程が使用された後、既知の末端配列と一致するプローブを使用して切断された分子のみを取り出すステップが続く。

上記技術は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を評価するのに有用である。反復ヌクレオチド（例えば、ＧＴ／ＣＡ反復）の存在、数、または性質が異なる標的核酸分子は、試料中で濃縮および／または同定される。ＭＳＩは、これらに限定されないが、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝胆道癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌を含む多くの疾患および病態と関連している。

上記技術はまた、腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）を評価するのにも有用である。ＴＭＢは、数ある用途の中でも特に免疫チェックポイント療法のための予想バイオマーカーとして注目されてきている。現在、ＴＭＢを評価するのに、次世代全ゲノムシークエンシングが採用されているか、あるいは、遺伝子のサブセットの配列を提供する遺伝子パネルが評価されている。本明細書で提供される技術の使用により、より高感度でコストおよび負担が顕著に軽減されたＴＭＢ評価が可能になる。

上記技術は、ハプロタイプ分析で有用である。遺伝子型ではなくハプロタイプとして報告されているゲノム情報は、個別化医療および多種多様な研究への適用においてますます重要になってきている。ハプロタイプは、より複雑ではないバリアント、例えば、単一ヌクレオチドバリアントよりも特異的であり、また、予後や診断、腫瘍の分析および移植のための組織のタイピングにおいて適用されている。現在、シークエンシングは、分子ハプロタイプ分析の最も一般的な形態である。シークエンシング技術のエラー率は、正確な情報を得るための障壁となっている。本明細書で提供される技術は、効率的で非常に正確なハプロタイプ分析を可能とする。

幾つかの実施形態では、アッセイ構成要素は、特定の多型（例えば、ＳＮＰ）を避けるように設計されている。これは、オフターゲット分子の望ましくない持ち越し、あるいは、オンターゲット分子の回収不足を回避するために、好ましい場合がある。幾つかの実施形態では、プローブは、公知の多型（例えば、ＳＮＰ）を含む領域にハイブリダイズしないように設計される。幾つかの実施形態では、避ける多型を含まない標的配列の鎖を標的化するように、プローブが設計され、かつ／または捕捉が構成される。幾つかの実施形態では、複数のプローブが各標的に対して用いられ、各プローブが異なる対立遺伝子（例えば、ＳＮＰ対立遺伝子）を標的化する。幾つかの実施形態では、ユニバーサル塩基（例えば、イノシン）が、公知の多型部位（例えば、ＳＮＰ部位）に対応するプローブに加えられ、これは、その位置に多型配列が含まれていても野生型配列が含まれていても、まるで、多型位置で配列が一致しているかのように消化される（あるいは、消化されない）。

上記技術は、任意の所望の配列または関心の配列を濃縮することができるため、上記技術は、既存の核酸方法論を強化することができる。例えば、多くの核酸シークエンシングアプローチは、標的核酸中に反復配列領域が存在するとシークエンシングが難しくなる。本明細書で提供される技術は、反復領域の除去を可能とし、かかるシークエンシング反応をより正確に、また、より効率的にする。
実施例

二本鎖特異的（ミスマッチによってブロックされる）３’→５’エキソヌクレアーゼ消化
抽出されたＤＮＡは、標準的なライブラリ調製を受ける：末端修復、Ａテール化およびアダプターライゲーション。最初の段階では、標的配列へのプローブハイブリダイゼーションが行われる。プローブ配列は、変異標的配列と完全に一致し、野生型標的配列と少なくとも１つのミスマッチを有する。プローブは、５’末端で修飾を有することで、ある表面への取付けが可能となっている。二本鎖特異的ＤＮＡエキソヌクレアーゼは、プローブを３’→５’方向に消化する。ＷＴ分子にアニーリングしたプローブの消化は、ミスマッチの存在によって停止する。変異標的にアニーリングしたプローブは、変異標的と十分に相補的である限り、あるいは、反応が停止するまで（例えば、プロテイナーゼの添加によって）消化される。変異標的は、遊離する（例えば上清に）が、野生型分子は、部分的に消化されたプローブ（固体支持体（例えば、ビーズ）に取り付けられた）にアニーリングしたままとなる。したがって、変異標的は野生型標的から容易に分離されて、変異標的の濃縮が可能となる。このプロセスの代表的な概略図を図１に示す。

制限酵素活性化およびそれに続く３’→５’エキソヌクレアーゼ消化
抽出されたＤＮＡは、標準的なライブラリ調製を受ける：末端修復、Ａテール化およびアダプターライゲーション。最初の段階では、標的配列へのプローブハイブリダイゼーションが行われる。プローブ配列は、３’末端で、オリゴヌクレオチドの修飾もしくはミスマッチの存在（または上に記載の他の方法）によって消化がブロックされる。プローブ配列は、変異標的配列と完全に一致し、野生型標的配列と少なくとも１つのミスマッチを有する。幾つかの実施形態では、プローブは、５’末端で修飾されて、ある表面への取付けが可能となる。次の段階では、酵素（例えば、制限酵素）選択性により、変異標的に完全にアニーリングしたプローブは、ニックが入るが、野生型分子にアニーリングしたプローブは、ニックを入れることができない。変異体標的は、プローブの３’末端ブロックが除去されて、プローブの３’→５’消化およびその後の遊離（例えば、上清に）が可能となる。このプロセスの代表的な概略図を図２に示す。

ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ活性化およびそれに続く３’→５’エキソヌクレアーゼ消化
抽出されたＤＮＡは、標準的なライブラリ調製を受ける：末端修復、Ａテール化およびアダプターライゲーション。最初の段階では、標的配列へのプローブハイブリダイゼーションが行われる。プローブ配列は、３’末端で、オリゴヌクレオチドの修飾もしくはミスマッチの存在（または上に記載の他の方法）によって消化がブロックされる。プローブ配列は、野生型標的配列と完全に一致し、変異標的配列と少なくとも１つのミスマッチを有する。幾つかの実施形態では、プローブは、５’末端で修飾を有することで、固体表面への取付けが可能となっている。次の段階では、ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ選択性により、プローブは、ミスマッチ部位でニックが入るが、野生型分子にアニーリングしたプローブは、ニックを入れることができない。変異体標的は、プローブの３’末端ブロックが除去されて、プローブの３’→５’消化およびその後の遊離（例えば、上清に）が可能となる。このプロセスの代表的な概略図を図３に示す。

ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ活性化およびそれに続く５’→３’エキソヌクレアーゼ消化
抽出されたＤＮＡは、標準的なライブラリ調製を受ける：末端修復、Ａテール化およびアダプターライゲーション。最初の段階では、標的配列へのプローブハイブリダイゼーションが行われる。プローブ配列は、５’末端で、オリゴヌクレオチドの修飾もしくはミスマッチの存在（または上に記載の他の方法）によって消化がブロックされる。プローブ配列は、野生型標的配列と完全に一致し、変異標的配列と少なくとも１つのミスマッチを有する。幾つかの実施形態では、プローブは、３’末端で修飾されることで、固体表面への取付けが可能となっている。次の段階では、ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ選択性により、プローブは、ミスマッチ部位でニックが入るが、野生型分子にアニーリングしたプローブは、ニックを入れることができない。変異体標的は、プローブの５’末端ブロックが除去されて、プローブの５’→３’消化およびその後の遊離（例えば、上清に）が可能となる。このプロセスの代表的な概略図を図４に示す。

ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ活性化およびそれに続く置換
抽出されたＤＮＡは、標準的なライブラリ調製を受ける：末端修復、Ａテール化およびアダプターライゲーション。最初の段階では、標的配列へのプローブハイブリダイゼーションが行われる。プローブ配列は、５’末端で、オリゴヌクレオチドの修飾もしくはミスマッチの存在（または上に記載の他の方法）によって消化がブロックされる。プローブ配列は、野生型標的配列と完全に一致し、変異標的配列と少なくとも１つのミスマッチを有する。幾つかの実施形態では、プローブは、３’末端で修飾を有することで、ある表面への取付けが可能となっている。次の段階では、酵素選択性により、プローブは、ミスマッチ部位でニックが入るが、野生型分子にアニーリングしたプローブは、ニックを入れることができない。プローブは、ニックが入ることによって、以下の２つのオリゴヌクレオチドへと分割される：５’末端がブロックされたオリゴヌクレオチドおよび３’末端がビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチド。５’末端がブロックされたオリゴヌクレオチドは、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長のためのプライマーとして機能する。変異標的配列は、３’末端がビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチドの置換によって上清に遊離する。このプロセスの代表的な概略図を図５に示す。

Claims (33)

1. 核酸分子の混合物を含む試料中の第１の核酸分子を濃縮または枯渇することを含む、方法であって、濃縮または枯渇することは、
   第１の核酸分子の標的領域への相補性が試料中の第２の核酸分子に対する相補性とは異なるプローブと試料を接触させること；任意選択で、前記第１の核酸分子にハイブリダイズした前記プローブを前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブに対して選択的に修飾することで、前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを活性化すること；前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを、他のプローブに対して選択的に消化すること；ならびに前記第１の核酸分子を濃縮または枯渇すること、
   によるものである、方法。
2. 前記第１および第２の核酸分子が、末端修復された核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１および第２の核酸分子がＡテール化された核酸分子である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記第１および第２の核酸分子が、タグまたはアダプター配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 前記第１および第２の核酸分子が増幅される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 前記プローブが、切断剤との接触によって活性化される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 前記切断剤が、制限エンドヌクレアーゼ、フラップエンドヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、ＲＮａｓｅ、Ｃａｓタンパク質、アルゴノートファミリー酵素、ＤＮＡ－ホルムアミドピリミジングリコシラーゼ、アプリン／アピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ、および化学的切断剤からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記消化することが、前記プローブをエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 前記エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼである、請求項８に記載の方法。
10. 前記エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼである、請求項８に記載の方法。
11. 前記プローブが、その３’または５’末端に結合部分を含み、前記結合部分が、任意選択で、ビオチン、またはリンカー分子がハイブリダイズすることができる配列であり、リンカー分子が、固体支持体に結合するように修飾されている、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記消化することの前または後で、前記プローブをある表面上に捕捉するステップを更に含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記表面がビーズを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１の核酸分子または第２の核酸分子を前記プローブから差次的に遊離させるステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記遊離させることが、温度を上昇させることを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記遊離させることが、ｐＨを変化させることを含む、請求項１４に記載の方法。
17. 前記遊離させることが、塩濃度を変化させることを含む、請求項１４に記載の方法。
18. 前記遊離させることが、前記消化することを含む、請求項１４に記載の方法。
19. 前記第１または第２の核酸分子を検出するステップを更に含む、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記検出することが、前記第１または第２の核酸分子をシークエンシングすることを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記プローブが、前記第１の核酸分子中のある位置と相補的であり、前記第２の核酸分子中の対応する位置とミスマッチである塩基を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記消化することが、前記第１および第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを、非相補鎖よりも相補鎖を優先的に消化する酵素と接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記消化することが、前記第１および第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブを、相補鎖よりも非相補鎖を優先的に消化する酵素と接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。
24. 前記プローブが、３’末端、５’末端または内部ブロッキング基を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
25. 前記プローブの活性化が、前記ブロッキング基を、前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去するが、前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去しない切断剤を使用して行われる、請求項２４に記載の方法。
26. 前記消化することが、プローブを、ブロッキング基を欠くプローブを切断するが、ブロッキング基を有するプローブを切断しないヌクレアーゼと接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記プローブの活性化が、前記ブロッキング基を含む核酸断片を、前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去するが、前記第２の核酸分子にハイブリダイズしたプローブから除去しない切断剤を使用して行われる、請求項２４に記載の方法。
28. 前記消化することが、前記核酸断片をポリメラーゼと以下の条件下で接触させることを含み、前記条件は、断片が伸長され、かつ前記第１の核酸分子にハイブリダイズしたプローブが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して、任意選択で上流プライマーを用いて、置換または消化されるような条件である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記活性化することおよび前記消化することが、加ピロリン酸分解を含まない、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
30. 試料を捕捉プローブと接触させることを更に含み、前記捕捉プローブは、前記第２の核酸分子にハイブリダイズするか、または前記第１の核酸分子もしくは前記第２の核酸分子ではない試料中の別の核酸分子にハイブリダイズする、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。
31. 第１および／または第２の核酸分子が一本鎖核酸分子である、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
32. 第１および／または第２の核酸が、１つまたは複数のメチル化ヌクレオチドを含む、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
33. 前記第１および第２の核酸分子を含む試料において請求項１から３２のいずれかに記載の方法を行うのに十分な試薬を含む、キット。