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JP2025524572A - 腸管オルガノイドの分化及び培養に好適な培養培地 - Google Patents

腸管オルガノイドの分化及び培養に好適な培養培地

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JP2025524572A
JP2025524572A JP2025500128A JP2025500128A JP2025524572A JP 2025524572 A JP2025524572 A JP 2025524572A JP 2025500128 A JP2025500128 A JP 2025500128A JP 2025500128 A JP2025500128 A JP 2025500128A JP 2025524572 A JP2025524572 A JP 2025524572A
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フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ
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Abstract

本出願は、腸管オルガノイドの培養のための培養培地であって、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）及びオールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）を含むことを特徴とする培養培地に関する。本出願はまた、腸管オルガノイドを培養するためにこの培地を使用する方法にも関する。

Description

本発明は、腸管オルガノイド細胞の長期又は短期インビトロ培養に好適な培養培地に関する。
腸管は、人体において外部環境と最も大きな接触面積を有する器官であり、消化及び吸収などの生命を維持するのに欠くことのできない機能を有する。ほとんどの腸管の機能は、その内層を覆っている腸管上皮によって果たされている。腸管上皮は、２つの区画から構成される：３つの分化した細胞（粘液産生細胞、吸収上皮細胞及び内分泌細胞）からなる絨毛並びに未分化の増殖している細胞から主になる陰窩。小腸陰窩において、抗菌ペプチドを産生するパネート細胞は、陰窩の底に存在する。最近、分子遺伝学的細胞系譜解析により、パネート細胞の間に挟まれているＬｇｒ５陽性細胞（「陰窩基底部円柱（ＣＢＣ）細胞」とも呼ばれる）が腸管上皮幹細胞であることが明らかにされた。Ｌｇｒ５陽性腸管上皮幹細胞は、一過性増殖細胞（ｔｒａｎｓｉｔ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌ）と呼ばれる前駆細胞を産生するが、これらの前駆細胞は、永久的な自己複製能力を有しておらず、さらに分化能は１～３系統に限られている。一過性増殖細胞は、陰窩において２～４回の分裂により分化し、絨毛において最終分化に至る。これらの分化した細胞は、絨毛の先端で脱落し、アポトーシスによって死ぬ。腸管上皮は、代謝の速い組織であり、４～５日で陰窩幹細胞から絨毛の先端に移動する。他の分化した細胞とは異なり、パネート細胞は、分化した状態で陰窩の底に移動し、２ヵ月といった長い細胞寿命を有する。
腸管上皮幹細胞の自己複製機構は、Ｗｎｔシグナル及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナルによって制御されることが数種の遺伝子改変マウスの結果からわかっている。Ｗｎｔシグナルの抑制分子となる腺腫性結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）の腸管上皮特異的ノックアウトマウスは、腸管上皮細胞過剰増殖及び腺腫形成を示す。加えて、異所性陰窩形成は、腸管上皮細胞においてＢＭＰの阻害タンパク質であるＮｏｇｇｉｎを過剰発現しているマウスにおいて観察され、そのため、ＢＭＰシグナルは腸管上皮幹細胞に対して阻害的に作用することが示唆された。
加えて、腸管上皮細胞の長期培養は、長い間不可能であった。これは、腸管上皮幹細胞の維持に必要な成長因子が知られていなかったという事実によると考えられる。近年、腸管上皮幹細胞の長期維持の成功は、腸管上皮幹細胞を細胞外マトリックス上に接着させ、ＢＭＰ阻害剤、分裂促進成長因子及びＷｎｔアゴニストを添加した動物細胞又はヒト細胞用の基礎培地を含有する細胞培養培地の存在下において細胞を培養することによって達成された。
腸管の研究のための別の手段は、腸管オルガノイドの研究である。オルガノイドは、幹細胞から誘導される小さな自己組織化三次元組織培養物である。このような培養物は、複雑な器官のほとんどを再現するよう又は特定のタイプの細胞だけを産生するといったようにその選択された側面を発現するよう作り上げることができる。オルガノイド形成は、一般に、器官／組織特異的な培地において幹細胞又は前駆細胞を培養することを必要とする。
研究を通して、本発明の発明者らは、驚くべきことに、腸管オルガノイド細胞の長期又は短期インビトロ培養に好適な培養培地を規定することに成功した。
請求項は、従って、腸管オルガノイドの培養のための培養培地であって、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）及びオールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）を含むことを特徴とする培養培地を包含する。本発明のこの培養培地は、小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、結腸直腸癌オルガノイド、クローン病オルガノイド又は潰瘍性大腸炎オルガノイドの培養に好適である。
培地中のＮＲＧ１の濃度は、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの間とすることができる。培地中のａｔＲＡの濃度は、１０ｎＭ～１０μＭの間とすることができる。いくつかの実施形態において、本発明の培養培地は、動物血清がない。いくつかの実施形態において、本発明の培養培地は、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、組換えＮｏｇｇｉｎ、ＮＲＧ１、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２及びガストリンのいずれかを更に含む。ＮＲＧ１及びａｔＲＡを含めこれらの因子は全て、ヒト又はマウス及び組換え又は精製天然タンパク質とすることができる。本発明の培養培地はまた、Ｗｎｔ ＮＧＳ（次世代サロゲート（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ））を含むこともできる。
請求項はまた、細胞外マトリックス又は細胞膜タンパク質とのその相互作用によって細胞外マトリックスを模倣する３Ｄマトリックスと共に本発明の培地を含む組成物も包含する。このような３Ｄマトリックス細胞外マトリックスは、合成ヒドロゲル又はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）とすることができる。代わりに、とりわけ、ＵｌｔｒｉＭａｔｒｉｘ（Ｃｕｌｔｕｒｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｒｉｘ ＲＧＦ基底膜抽出物）及びＢＭＥ（Ｃｕｌｔｒｅｘ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｔｙｐｅ ２、Ｐａｔｈｃｌｅａｒ）及びコラーゲン－１又はフイブロネクチンを使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞外マトリックス又は３Ｄマトリックスは、最初の期間の後に洗い流される。
請求項は、腸管オルガノイドの培養のための本発明の培地又は本発明の組成物の使用を更に包含する。
請求項は、腸管オルガノイドを生成するための方法であって、腸管組織の単細胞又は断片の懸濁液を提供するステップ、腸管組織の単細胞又は断片の前記懸濁液を第１の培地と少なくとも１日間インキューベートし、その後、前記第１の培地を上記に記載される本発明の培地と交換するステップを含む方法を更に包含する。いくつかの実施形態において、第１の培地は、１０ｎＭの濃度でａｔＲＡを含むことができる。本発明の方法において使用される腸管組織の単細胞又は断片は、小腸、結腸、結腸直腸癌、クローン病組織、潰瘍性大腸炎組織から得られる細胞若しくは組織断片とすることができる又は胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞とすることができる。
本発明の方法において、第１の培地は、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤、例えばＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を含むことができる。本発明の方法において、第１の培地は、アクチビン／ＮＯＤＡＬ／ＴＧＦ－β経路の阻害剤、例えば阻害剤Ａ８３－０１を含むことができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態において、細胞は、第１の培地において少なくとも３日間インキューベートすることができる。
本発明の方法の第１及び第２の培地は、本発明の前記方法において使用される腸管組織の単細胞又は断片の性質に適応させることができる。例えば、小腸細胞及び／又は組織断片について、第１の培地中のＮＲＧ１についての適切な濃度は、１ｎｇ／ｍｌであり、ａｔＲＡはないのに対して、第２の培地、すなわち本発明の培地中のＮＲＧ１及びａｔＲＡについての濃度は、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び２．５μＭである。結腸由来の細胞及び組織断片について、第１の培地中のＮＲＧ１についての適切な濃度は、１ｎｇ／ｍｌであり、ａｔＲＡはなく、第２の培地中のＮＲＧ１及びａｔＲＡについての濃度は、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎＭである。
請求項はまた、本発明の方法を使用して得られる腸管オルガノイドも包含する。
以下の図面は、本発明の実施形態を説明するためのものであり、請求項によって包含される本発明の範囲を限定するものではない。
単細胞から恒常性を維持する成熟オルガノイドまでのヒト大腸及び小腸オルガノイドについての画像ベースの培地スクリーニング。Ａ）ワークフローの概略図、最初に、ウェル当たり１００個の単細胞をトリプシン処理済みの成熟結腸オルガノイドから播種する。最初の培地については、２つの異なるＥＧＦ／ＮＲＧ１の組み合わせについてテストした。培地を、４日目に、ＥＧＦ、ｈＮＲＧ１、ＷＮＴ－ＮＧＳの濃度が変動する１６種の異なる培地のうちの１つに変更し、組み合わせは合計３２個になった。オルガノイドを１０日目に固定し、５８４８個のオルガノイドを、ＤＡＰＩチャネルの最大値投影画像に基づいて分割し（ＲＤＣＮＥＴ参照）、これから形状特徴を抽出した。Ｂ）形態学的なオルガノイドの特徴に基づいてコンピュータ処理した５８４８個のヒト結腸オルガノイドの力学モデルを用いたレイアウト（Ｆｏｒｃｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌａｙｏｕｔ）（ＦＤＬ、Ｅｃｃｅｎｔｒｉｃｉｔｙ：左及びｌｏｇ１０（Ａｒｅａ）：右）。Ｃ）ＦＤＬハイライト亜集団で表したＰｈｅｎｏＧｒａｐｈクラスター（クラスター０～１５まで）。下記に例示される３つのクラスターの代表的なオルガノイド（クラスター０：青色、クラスター７：サーモンピンク及びクラスター４：濃緑色）。Ｄ）ヒト結腸オルガノイドにおいてテストした全ての培地である３２個の組み合わせのパフォーマンスを定量化するヒートマップ。培地のパフォーマンスを評価するのに重要なパラメータのスコアを示す。スコアは、培地の相対的なパフォーマンスに基づいて標準化する（０：最悪のパフォーマンス、１：最高のパフォーマンス）。詳細な培地組成物については表１を参照されたい。条件２．３．３（緑色の囲み）は、以降の実験のために選択した条件である。Ｅ）形態学的なオルガノイドの特徴に基づいてコンピュータ処理した５５３３個のヒト小腸オルガノイドの力学モデルを用いたレイアウト（ＦＤＬ、Ｅｃｃｅｎｔｒｉｃｉｔｙ：左及びｌｏｇ１０（Ａｒｅａ）：右）。Ｆ）ＦＤＬハイライト亜集団で表したＰｈｅｎｏＧｒａｐｈクラスター（クラスター０～１５まで）。下記に例示される３つのクラスターの代表的なオルガノイド（クラスター３；ライトオレンジ、クラスター１１；ライトブラウン及びクラスター４；濃緑色）。Ｇ）Ｄと同様に、ヒト小腸オルガノイドにおいてテストした８つ組み合わせのパフォーマンスを定量化するヒートマップ。ヒト結腸オルガノイドと比較して、小腸オルガノイドは、４日目以降ＷＮＴ－ＮＧＳに依存していなかった。詳細な培地組成物については表１を参照されたい。条件２．３．１（緑色の囲み）は、以降の実験のために選択した条件である。Ｈ）２、４、６、８、１０及び１３日目の固定時点の３８４ウェルプレートにおける同じ患者由来のヒトの健康な結腸及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）のオルガノイドラインの明視野画像。両方のオルガノイドタイムコースについて、選択した培地組成物を使用した（図１Ｄを参照されたい）。Ｉ）選択した培地組成物（それぞれ図１Ｄ、１Ｇを参照されたい）において成長させた成熟した結腸（上のパネル）及び小腸（下のパネル）のオルガノイドにおける主要な成熟した細胞型についての抗体染色。パネル左から右に：幹細胞（ＯＬＦＭ４；緑）及び腸細胞（ＦＡＢＰ１；赤）、杯細胞（ＭＵＣ２；赤）、一過的増殖細胞（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌ）（ＮＵＳＡＰ１；赤）、刷子細胞（ｔｕｆｔ ｃｅｌｌ）（ＰＯＵ２Ｆ３；赤）、Ｍ細胞（ＲＡＮＫＬ；赤）、増殖マーカー（ＫＩ６７；赤）、腸内分泌細胞（ＴＰＨ１；赤）、深部分泌細胞（ＲＥＧ４；赤）並びにパネート細胞（ＬＹＺ１；赤）。全てのオルガノイドにおける核マーカーは、ＤＡＰＩ（白）とする。スケールバー：Ｉにおいて１００μｍ、Ｃ、Ｆにおいて５０μｍ。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 単細胞から成熟オルガノイドまでの様々な培地組成の間の比較。Ａ）１０日目の様々な培地組成における同じオルガノイドラインについてヒト結腸オルガノイド成長効率を実証する明視野画像。２５０個の単細胞を０日目に播種した。Ｂ）４及び８日目に様々な培地について定量化したヒト結腸オルガノイド成長効率。Ｃ～Ｄ）（Ｃ）幹細胞マーカーＯＬＦＭ４（緑）及び腸細胞マーカーＦＡＢＰ１（赤）又は（Ｄ）杯細胞マーカーＭＵＣ２（赤）について全て染色した４つの異なる培地組成におけるヒト結腸オルガノイドイメージングタイムコース（すなわち２、４、６、８及び１０日目）。Ｅ）２、４、６、８、１０及び１３日目の開発した培地組成を使用する結腸の様々な生検部位（各パネルにおいて左に示す）からのオルガノイド発生を記録する蛍光画像。各発生の軌跡は、１人の異なる患者について表したものであり、腸内分泌（ＴＰＨ１；マゼンタ）、杯（ＭＵＣ２；赤）及び一過的増殖細胞（ＮＵＳＡＰ１；緑）を示す。全てのオルガノイドにおける核マーカーは、ＤＡＰＩ（白）とする。スケールバー：５０μｍ。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 腸管オルガノイドの擬時間（ｐｓｅｕｄｏｔｉｍｅ）は、ＦＭＩ組成を使用することによる再生から恒常状態までの移行を明らかにする。Ａ）ヒト結腸オルガノイドの播種及び時点におけるサンプリングの概要。Ｂ）個々のオルガノイド分割後（図１Ａ）、特徴は、擬時間（ｐａｌａｎｔｉｒ，Ｓｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１９）におけるそれらの形状－特徴に基づいて個々のオルガノイドを整理するために使用し、成熟の経過を見積もった。Ｃ）オルガノイド発生の擬時間をＤＡＰＩ、ＯＬＦＭ４、ＦＡＢＰ１、ＭＵＣ２、ＹＡＰ１及びＴＰＨ１について１０の均等なビンにした。蛍光画像（ｉｎｆｅｒｎｏ ＬＵＴ）を各ビンについて表す。右側に、全ての画像化されたオルガノイドのそれぞれのマーカーの平均強度及び重要な形状特徴を１０の擬時間のビンに対してプロットする。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ヒト結腸及び小腸オルガノイド再生の単細胞ＲＮＡシークエンシングタイムコース。Ａ－Ｄ）実験時間及びＢ－Ｅ）細胞型についてコード化したｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）による投影カラー。左結腸、右小腸。Ｃ－Ｆ）ｔ－ＳＮＥマップにおいてハイライトされた再生及び成熟細胞型における既知の細胞型マーカー遺伝子の相対的発現。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ＦＭＩ組成を使用するオルガノイド培養物についてのケースを個々に示す。Ａ）炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）患者の新しい生検材料から生成した１週間目のヒトオルガノイド。クローン（左）及び潰瘍性大腸炎患者由来の健康な（中央）と病気の（右）結腸の明視野画像。Ｂ～Ｃ）（Ｂ）７日目の様々な密度で平板培養したマウス小腸オルガノイドの明視野画像。Ｃ）ＦＭＩ組成を使用する単細胞から出芽オルガノイドまでのオルガノイド発生を実証するマウス小腸オルガノイドの明視野拡大画像。Ｄ）ＦＭＩ組成を使用するＬｇｒ５陰性又は陽性マウス結腸細胞の成長の概要。Ｓｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１９から応用。Ｅ）Ｌｇｒ５陽性（緑）（上のパネル）及び陰性（下のパネル）オルガノイド発生についての代表的な蛍光画像。Ｆ）経時の増殖性の部分（Ｋｉ６７＝赤）及び幹細胞（Ｌｇｒ５＝緑）を実証する。Ｇ）Ｌｇｒ５（緑）の他に、Ｗｎｔ標的遺伝子Ｓｏｘ９（上；赤）、ＭＵＣ２（中央；杯細胞マーカー）及びＦＡＢＰ２（下；腸細胞マーカー）を示す３つのパネル。全てのオルガノイドにおける核マーカーは、ＤＡＰＩ（青）とする。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。）
研究を通して、本発明の発明者らは、驚くべきことに、腸管オルガノイド細胞の長期又は短期インビトロ培養に好適な培養培地を規定することに成功した。
請求項は、従って、腸管オルガノイドの培養のための培養培地であって、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）及びオールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）を含むことを特徴とする培養培地を包含する。本発明のこの培養培地は、小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、結腸直腸癌オルガノイド、クローン病オルガノイド又は潰瘍性大腸炎オルガノイドの培養に好適である。
培地中のＮＲＧ１の濃度は、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの間とすることができる。培地中のａｔＲＡの濃度は、１０ｎＭ～１０μＭの間とすることができる。いくつかの実施形態において、本発明の培養培地は、動物血清がない。いくつかの実施形態において、本発明の培養培地は、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、組換えＮｏｇｇｉｎ、ＮＲＧ１、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２及びガストリンのいずれかを更に含む。ＮＲＧ１及びａｔＲＡを含めこれらの因子は全て、ヒト又はマウス及び組換え又は精製天然タンパク質とすることができる。本発明の培養培地はまた、Ｗｎｔ ＮＧＳ（次世代サロゲート）を含むこともできる。
請求項はまた、細胞外マトリックス又は細胞膜タンパク質とのその相互作用によって細胞外マトリックスを模倣する３Ｄマトリックスと共に本発明の培地を含む組成物も包含する。このような３Ｄマトリックス細胞外マトリックスは、合成ヒドロゲル又はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）とすることができる。代わりに、とりわけ、ＵｌｔｒｉＭａｔｒｉｘ（Ｃｕｌｔｕｒｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｒｉｘ ＲＧＦ基底膜抽出物）及びＢＭＥ（Ｃｕｌｔｒｅｘ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｔｙｐｅ ２、Ｐａｔｈｃｌｅａｒ）及びコラーゲン－１又はフイブロネクチンを使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞外マトリックス又は３Ｄマトリックスは、最初の期間の後に洗い流される。
請求項は、腸管オルガノイドの培養のための本発明の培地又は本発明の組成物の使用を更に包含する。
請求項は、腸管オルガノイドを生成するための方法であって、腸管組織の単細胞又は断片の懸濁液を提供するステップ、腸管組織の単細胞又は断片の前記懸濁液を第１の培地と少なくとも１日間インキューベートし、その後、前記第１の培地を上記に記載される本発明の培地と交換するステップを含む方法を更に包含する。いくつかの実施形態において、第１の培地は、１０ｎＭの濃度でａｔＲＡを含むことができる。本発明の方法において使用される腸管組織の単細胞又は断片は、小腸、結腸、結腸直腸癌、クローン病組織、潰瘍性大腸炎組織から得られる細胞若しくは組織断片とすることができる又は胚体内胚葉細胞とすることができる。
本発明の方法において、第１の培地は、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤、例えばＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を含むことができる。本発明の方法において、第１の培地は、アクチビン／ＮＯＤＡＬ／ＴＧＦ－β経路の阻害剤、例えば阻害剤Ａ８３－０１を含むことができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態において、細胞は、第１の培地において少なくとも３日間インキューベートすることができる。
本発明の方法の第１及び第２の培地は、本発明の前記方法において使用される腸管組織の単細胞又は断片の性質に適応させることができる。例えば、小腸細胞及び／又は組織断片について、第１の培地中のＮＲＧ１についての適切な濃度は、１ｎｇ／ｍｌであり、ａｔＲＡはないのに対して、第２の培地、すなわち本発明の培地中のＮＲＧ１及びａｔＲＡについての濃度は、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び２．５μＭである。結腸由来の細胞及び組織断片について、第１の培地中のＮＲＧ１についての適切な濃度は、１ｎｇ／ｍｌであり、ａｔＲＡはなく、第２の培地中のＮＲＧ１及びａｔＲＡについての濃度は、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎＭである。
請求項はまた、本発明の方法を使用して得られる腸管オルガノイドも包含する。
以下の定義は、本明細書の全体にわたって使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
本明細書において使用されるように、用語「分化全能性幹細胞」（全能幹細胞としても知られている）は、胚性及び胚体外細胞型に分化することができる幹細胞である。このような細胞から、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子及び精子の融合物から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生される細胞もまた、分化全能性である。
本明細書において使用されるように、通常ＰＳ細胞としても知られている「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、ほとんど全ての細胞、すなわち、内胚葉（胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）並びに外胚葉（表皮組織及び神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかから誘導される細胞に分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、胚性幹細胞（胚性生殖細胞を含む）から誘導される又は特定の遺伝子の発現を強制することによる成体の体細胞などの非多能性細胞の誘発を通して得られる分化全能性細胞の子孫とすることができる。
本明細書において使用されるように、通常ｉＰＳ細胞とも省略される「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、特定の遺伝子の「強制的」発現を誘発することによって成体の体細胞などの普通は非多能性の細胞から人工的に誘導される一種の多能性幹細胞を指す。
本明細書において使用されるように、通常ＥＳ細胞とも省略される「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、多能性で且つ胚盤胞、初期胚の内部細胞塊から誘導される細胞を指す。本発明の目的のために、「ＥＳＣ」という用語は、胚性生殖細胞も包含するよう時に広く使用される。
本明細書において使用されるように、「前駆細胞」という用語は、１つ以上の前駆細胞が自己複製する又は１つ以上の特殊な細胞型に分化する能力を獲得する本明細書において記載される方法において使用することができる任意の細胞を包含する。いくつかの態様において、前駆細胞は、多能性である又は多能性になる性能を有する。いくつかの態様において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外因子（例えば成長因子）の処理にかけられる。いくつかの態様において、前駆細胞は、分化全能性（又は全能）幹細胞；多能性幹細胞（誘導又は非誘導）；多分化能幹細胞；少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞及び単能性幹細胞とすることができる。いくつかの態様において、前駆細胞は、胚、乳児、子供又は成人由来のものとすることができる。いくつかの態様において、前駆細胞は、多能性が遺伝子操作又はタンパク質／ペプチド処理を介して与えられるような処理を受ける体細胞とすることができる。発生生物学において、細胞分化は、それほど特殊でない細胞がより特殊な細胞型になるプロセスである。本明細書において使用されるように、「定方向分化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」という用語は、それほど特殊でない細胞が特定の特殊な標的細胞型になるプロセスを説明する。特殊な標的細胞型の特殊性は、始原細胞の運命を定める又は変えるために使用することができる任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法は、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理及び核酸処理を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるように、「細胞構成要素」という用語は、例えば当業者によって生物学的実験において（例えばマイクロアレイ又は免疫組織化学的検査によって）典型的に測定される個々の遺伝子、タンパク質、遺伝子を発現するｍＲＮＡ及び／若しくは任意の他の様々な細胞構成成分又はタンパク質改変（例えばリン酸化）の程度などのタンパク質活性である。生体系、通常のヒト疾患の根底にある生化学的プロセスの複雑なネットワークに関する重要な発見並びに遺伝子発見及び構造決定は、今では、調査プロセスの一部としての細胞構成要素の多量のデータの利用によるものと考えることができる。細胞構成要素の多量のデータは、バイオマーカーを特定する、疾患サブタイプを識別する及び毒性の機構を特定するのを助けることができる。
本明細書において記載されるように、方法及びシステムは、培養において腸管胚発生を模倣するための時間的な一連の成長因子操作を使用して確立される。特に、方法及びシステムは、ＰＳＣ、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の両方の腸管組織へのインビトロ分化を導くために確立される。
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からの胃及び小腸オルガノイドの生成は、ヒト胃腸（ＧＩ）の発生及び疾患の研究に革命をもたらした。しかしながら、大腸オルガノイドを生成する試みは、後部腸管発生の分子的理解が骨の折れることもあり、遅れをとっている。
本発明の特定の実施形態において、「約」又は「およそ」は、参照される数から５％まで又は他の実施形態において１０％まで、他の実施形態において２５％まで変動する数を指す。
本明細書において使用されるように、「無血清」という用語は、培地が血清を本質的に含有しないという事実を指す。特定の実施形態において、主題の培地中の全血清が０％（完全にない）又は約０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０２５％、０．０５％、０．１％、１．０％若しくは１０．０％未満である。最も通常の血清のタイプは、ウシ血清の種々の形態（仔ウシ血清、ウシ胎仔血清、子ウシ血清、ドナー子ウシ血清、新生仔ウシ血清等）、ウマ血清及びヒト血清を含む。
「化学的に規定された」は、化学組成物内の種々の個々の構成要素の構造、化学式及びパーセンテージが知られている又は規定することができることを意味する。ウシ下垂体抽出物などの種々の組織抽出物は、少なくともひとつには抽出物の全ての個々の構成要素がわかっているというわけではないので、化学的に規定されない。それらの既知の構成要素について、種々の構成要素の量及び相対的なパーセンテージは、バッチごとに変動することがある（普通は変動する）。これは、一部、個々の動物が、本来、健康状態、栄養、気分、病的な感染症、外傷等の要因に応じて同じ組織においてでさえ様々なレベルの種々の化学組成物を有しているかもしれないといった事実によって引き起こされる。
特定の実施形態において、本発明の培地は、組織培養の目的で調製されたいかなる動物血清産物も含有しない。知られていない／規定されていない化学的構成要素を有するいかなる組織抽出物も含有しない。それどころか、所望の細胞型の所望の成長／増殖を保持するのに必要な全ての必須構成要素は、化学的に規定されている。全てではないにしても、これらの個々の構成要素のほとんどは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＧＩＢＣＯ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ及び／又はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）等などの種々のベンダーから商品として直ちに購入することができる。
特定の他の実施形態において、血清及び／又は組織抽出物の主題の培地における特に微量での存在は、実質的に培地の特徴に干渉しないであろう。
本発明はまた、医薬／バイオテクノロジー産物の発見及び開発を実行するための方法であって、本発明の培地及び方法を使用して単離され、増やされた種々の細胞型から誘導される腸管オルガノイドモデルの創造並びに腸管オルガノイドモデルに影響を及ぼす分子を特定するために薬物分子又はリード化合物ライブラリーをスクリーニングすることを含む方法も提供する。
「細胞培養培地」、「培養培地」（それぞれの場合において複数形は「培地（ｍｅｄｉａ）」となる）及び「培地配合物」という語句は、細胞を培養するための栄養溶液を指し、区別なく使用されてもよい。
本発明の細胞培養培地は、水性であり（しかし、乾燥粉末及び／又は凍結構成要素から戻すことができる）、溶液、好ましくは脱イオン水及び／又は蒸留水の溶液中に多くの成分を含む。
「成分」という用語は、化学的起源であるか又は生物学的起源であるかにかかわらず、細胞の増殖の成長を維持する又は促進するために細胞培養培地において使用することができる任意の化合物を指す。「構成成分」、「栄養分」及び成分」といった用語は、区別なく使用することができ、全てこのような化合物を指すことを意図する。細胞培養培地において使用される典型的な成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等を含む。細胞の培養をエキソビボで促進する又は維持する他の成分は、特定の必要に従って当業者によって選択することができる。
「細胞培養」又は「培養」によって、人工的なインビトロ環境における細胞の維持を意味する。しかしながら、「細胞培養」という用語は、総称であり、個々の細胞だけでなく、組織、器官、器官系又は生物まるごとの培養を包含するために使用されてもよく、「組織培養」、「器官培養」、「器官系培養」、「オルガノイド培養」又は「器官型培養」という用語は、場合によっては、「細胞培養」という用語と区別なく使用されてもよいことが理解されたい。
ヒト細胞などの特定の細胞は、生存するのに十分な量の９種のアミノ酸を有していなければならない。これらのいわゆる「必須」アミノ酸は、他の前駆体から合成することができない。しかしながら、システインは、部分的にメチオニンの必要を満たすことができ（両方とも硫黄を含有する）、チロシンは、部分的にフェニルアラニンの代わりになることができる。このような必須アミノ酸は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン（及び／又はシステイン）、フェニルアラニン（及び／又はチロシン）、トレオニン、トリプトファン並びにバリンを含む。特定の実施形態において、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、トレオニン、トリプトファン及びバリンだけが含まれる。
いくつか又は全ての成分は、溶液中で一緒に混ぜられると、「基本培地」を形成することができる。この基本培地に、少なくとも１つのヌクレオチド合成及び／又はサルベージ経路前駆体（例えばヒポキサンチン）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、細胞内の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを増加させる薬剤並びに酸化防止剤などの他の構成成分を本発明の完全な培養培地を配合して作るために添加することができる。ＥＧＦ及びｃＡＭＰを増加させる薬剤などのこれらの後者の添加される構成成分は、配合して作られたばかりの基本培地に添加されてもよい又はそれらは、保存液中でのように混ぜられ、本発明の完全培地を配合して作るために基本培地に添加されるまで好ましくは約－２０℃～約－７０℃で凍結させて保存されてもよい。
構成成分が腸管オルガノイドの培養に関して培地のパフォーマンスに実質的に影響を及ぼさない程度まで、主題の培地は、特定の実施形態において、このような構成成分の１つ以上を含んでもよく、その存在を許容してもよい。
培地の１つ以上の構成成分はまた、必要に応じて類似の特性の他の化学物質によって置換されてもよい。１つ以上の非必須の／不必要な構成成分を有していないこのような改変された培地は、本発明の範囲内にある。同様に、当業者は、例えば濃度の範囲（例えば１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００倍高い又は１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００倍低い）をテストすることによって、特定の細胞型についての任意の与えられた構成成分の最適なレベルをリストされた構成成分ごとに、その特定の構成成分についてリストされた濃度に基づいて又はそれから出発して決定することができる。いくつかの構成成分は、リストされた範囲の濃度を有する。任意の特定の細胞型に適切な又は最適な濃度もまた、同様に、リストされた濃度から出発して決定することができる。このようなテストをする中で、最初の広範な濃度についてのテストを、最初の実験の結果に基づいて後に減らしてもよい。例えば、最初のテストについて、目的とするある構成成分の濃度は、最初の濃度の１０－３、１０－２、１０－１、１０倍、１００倍及び１０００倍に変更してもよい。１０－２のテストが所望の成長をなお保持し、１０－３が保持しない場合、１０－２～１０－３の間の１０倍の濃度差について、最良の範囲を正確に特定するために２回目のテストにおいて更に調べられてもよい。従って、特定の細胞型についてそのように最適化された培地もまた、本発明の範囲内にある。当業者に直ちに明らかになるように、与えられた成分の濃度は、開示される範囲を超えて増加させたり減少させたりすることができ、増加した又は減少した濃度の影響は、ルーチン的な実験だけを使用して決定することができる。任意の特定の細胞型についての本発明の培地配合物の最適化は、Ｈａｍ（Ｈａｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔａ ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３－２１，１９８４）及びＷａｙｍｏｕｔｈ（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔａ ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２３－６８，１９８４）によって記載されるアプローチを使用して実行することができる。培地成分についての最適な最終濃度は、典型的に、実証研究によって、単一構成成分滴定法において又は過去及び現在の科学文献の解釈によって特定される。単一構成成分滴定法において、動物細胞を使用して、単一の培地構成成分の濃度は変化させるが、他の全ての構成要素及び変数は一定に保ち、動物細胞の生存率、成長又は健康の継続に対する単一構成成分の影響を測定する。
本明細書においてリストされる特定の因子、ビタミン及びホルモンは、当技術分野において知られているように、様々な形態で存在することができ（例えば、様々な天然に存在する又は天然に存在しない形態）、互いに代替物として使用することができることが理解されるであろう。本出願がビタミン又はホルモンを開示する場合、任意の形態の、類似の生物学的活性を有するこのようなビタミン又はホルモン（又は細胞培養培地において若しくは細胞内で改変されて若しくは代謝されて生物学的に活性な形態を提供することができる化合物）が本発明の培地及び／又は方法において使用される実施形態を本発明が包含することが理解されるべきであることもまた、認識されるであろう。
培地成分は、液体担体中に溶解することができる又は乾燥形態で維持することができる。上記に示される好ましい濃度（すなわち「１×配合物」）で液体担体中に溶解される場合、培地のｐＨは、約７．０～７．６、例えば約７．１～７．５又は約７．２～７．４に調整されるべきである。培地のモル浸透圧濃度もまた、約２７５～３５０ｍＯｓｍ、例えば約２８５～３２５ｍＯｓｍ又は約２８０～３１０ｍＯｓｍに調整することができる。液体担体のタイプ及び溶液に成分を溶解するために使用される方法は変動し、ルーチン的な実験のみで当業者によって決定することができる。典型的に、培地成分は、任意の順序で添加することができる。
細胞培養培地は、多くの成分から構成され、これらの成分は、培養培地ごとに変動する。「１×配合物」は、細胞培養培地中に見られるいくつか又は全ての成分を有効濃度で含有する任意の水溶液を指すことを意図する。「１×配合物」は、例えば、細胞培養培地又はその培地の成分の任意のサブグループを指すことができる。１×溶液中の成分の濃度は、インビトロにおいて細胞を維持する又は培養するために使用される細胞培養配合物中に見られるその成分の濃度とほぼ同じである。細胞のインビトロ培養のために使用される細胞培養培地は、定義上は１×配合物である。多くの成分が存在する場合、１×配合物中の各成分は、細胞培養培地中のそれらの成分の濃度とほぼ等しい濃度を有する。例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培養培地は、他の成分の中でも、０．２ｇ／Ｌ Ｌ－アルギニン、０．０５ｇ／Ｌ Ｌ－アスパラギン及び０．０２ｇ／Ｌ Ｌ－アスパラギン酸を含有する。これらのアミノ酸の「１×配合物」は、溶液中にほぼ同じ濃度のこれらの成分を含有する。従って、「１×配合物」を指す場合、溶液中の各成分が、記載されている細胞培養培地中に見られるものと同じ又はほぼ同じ濃度を有することが意図される。細胞培養培地の１×配合物中の成分の濃度は、当業者によく知られている。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｌｌｅｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）を参照されたい。重量モル浸透圧濃度及び／又はｐＨは、しかしながら、特により少ない成分が１×配合物中に含有される場合、培養培地と比較して１×配合物において異なっていてもよい。
「１０×配合物」は、溶液中の各成分が細胞培養培地中の同じ成分よりも約１０倍濃い溶液を指すことを意図する。例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培養培地の１０×配合物は、他の成分の中でも、２．０ｇ／Ｌ Ｌ－アルギニン、０．５ｇ／Ｌ Ｌ－アスパラギン及び０．２ｇ／Ｌ Ｌ－アスパラギン酸を含有してもよい（上記の１×配合物と比較して）。「１０×配合物」は、１×培養培地中に見られる濃度の約１０倍の濃度で、多くの追加の成分を含有してもよい。直ちに明らかになるように、「２５×配合物」、「５０×配合物」、「１００×配合物、「５００×配合物」及び「１０００×配合物」は、１×細胞培養培地と比較してそれぞれ約２５、５０、１００、５００又は１０００倍の濃度で成分を含有する溶液を表わす。ここでも、培地配合物及び濃縮溶液の重量モル浸透圧濃度及びｐＨは、変動してもよい。好ましくは、成分を含む溶液は、１×培地配合物中の同じ成分の濃度よりも濃い。成分は、１０倍濃縮（１０×配合物）、２５倍濃縮（２５×配合物）、５０倍濃縮（５０×配合物）又は１００倍濃縮（１００×配合物）することができる。より高度に濃縮された配合物を作製することができる、但し、成分は可溶性の及び安定した状態を維持することを条件とする。例えば高濃度の培養培地構成成分を可溶化する方法に関する米国特許第５，４７４号明細書を参照されたい。
培地成分が別々の濃縮溶液として調製される場合、適切な（十分な）量の各濃縮物を、１×培地配合物を産生するために希釈液と組み合わせる。典型的に、使用される希釈液は、水であるが、水性緩衝液、水性食塩水又は他の水溶液を含む他の溶液が本発明に従って使用されてもよい。
本発明の培養培地は、典型的に、望ましくない混入を防止するために滅菌される。滅菌は、滅菌培養培地を産生するために濃縮成分を混ぜた後に、例えば約０．１～１．０μｍの孔径の低タンパク質結合性濾過膜（例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．からから市販されている）による濾過によって達成されてもよい。代わりに、成分の濃縮サブグループは、濾過滅菌され、滅菌溶液として保存されてもよい。これらの滅菌濃縮物は、次いで、濃縮１×滅菌培養配合物を産生するために、無菌条件下で滅菌希釈液と混合することができる。オートクレーブ又は滅菌の他の高温ベースの方法は、本発明の培養培地の構成成分の多くが熱に不安定であり、ほとんどの熱滅菌法の間に達成される温度などの温度によって不可逆的に分解するので、好ましくない。
多くの組織培養培地は、典型的に、１つ以上の抗生物質を含有し、これらは細胞成長／増殖自体に必要ではないが、細菌及び／又は真菌などの他の有害な微生物の成長を阻害するために存在する。抗生物質は、他の微小生物の成長を阻害する又は破壊する、細菌（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種を含む）、放線菌（ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む）及び真菌などの微小生物の種々の種によって産生される比較的低分子量の天然の化学物質である。類似の構造及び作用様式の物質が化学的に合成されてもよい又は天然化合物が半合成抗生物質を産生するために改変されてもよい。これらの生合成及び半合成誘導体もまた、抗生物質として有効である。抗生物質の主要なクラスは、（１）ペニシリン、セファロスポリン及びモノバクタムを含むβ－ラクタム；（２）アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン、トブラマイシン、硫酸ネチルマイシン及びアミカシン；（３）テトラサイクリン；（４）スルホンアミド及びトリメトプリム；（５）フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン、ノルフロキサシン及びオフロキサシン；（６）バンコマイシン；（７）例えばエリスロマイシン、アジスロマイシン及びクラリスロマイシンを含むマクロライド；並びに（８）他の抗生物質、例えばポリミキシン、クロラムフェニコール及びリンコサミドである。抗生物質は、一般に以下の通りに分類することができるいくつかの作用機構を通して、それらの抗菌性の効果を達成する：（１）バシトラシン、セファロスポリン、サイクロセリン、ホスホマイシン、ペニシリン、リストセチン及びバンコマイシンなどの細菌細胞壁に対して作用する薬剤；（２）コリスチン、ノボビオシン及びポリミキシンなどの細胞膜に影響を及ぼす又は洗浄効果を発揮する薬剤；（３）複製、情報伝達及びリボソームに対するそれらの影響によるタンパク質合成といった細胞機構に影響を及ぼす薬剤、例えばアミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、フシジン、リンコマイシン、ピューロマイシン、リファンピシン、他のストレプトマイシン並びにエリスロマイシン及びオレアンドマイシンなどのマクロライド抗生物質；（４）核酸代謝に影響を及ぼす薬剤、例えばフルオロキノロン、アクチノマイシン、エタンブトール、５－フルオロシトシン、グリセオフルビン、リファマイシン；並びに（５）スルホンアミド、トリメトプリム並びに抗結核剤イソニアジド及びパラアミノサリチル酸などの中間代謝に影響を及ぼす薬物。いくつかの薬剤は、特に高濃度で、１つを超える主な作用機構を有していてもよい。加えて、細菌細胞の構造又は代謝における二次的変化は、抗菌薬の主な効果の後に生じることが多い。
従って、便宜上及び他の実際的な理由で、主題の培地に、有害な細菌／真菌／ウイルスの成長／増殖を阻害する１つ以上の抗生物質又は他の物質が追加として補足されてもよい。他の実施形態において、しかしながら、主題の培地は、初代細胞の最適な成長を確実にするために、いかなる抗生物質もなくてもよい。抗生物質がない培地において成長する細胞を扱う場合、可能性がある混入を避けるために特別な注意が払われるべきである。
本発明の培地は、種々の化学ベンダーから別々に購入される個々の構成成分から作製することができる。代わりに、特定の市販の培地が好都合に混合され、主題の培地を作製するために追加の構成成分が補足されてもよい。本発明は、従って、組織培養培地を作製するための方法であって、市販されている細胞培養培地又は２つ以上のこのような培地の混合物を本明細書において開示される１つ以上の構成成分を添加することによって補足することを含む方法を提供する。
本発明は、細胞の成長に十分な構成成分を含む腸管オルガノイド用の組織培養培地を提供する。これらの培地の組成は、変動してもよい。例えば、構成成分のいずれかの濃度は、元の濃度と比較して１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％まで又は２～３倍までの倍率まで独立して変動してもよい。一実施形態において、構成成分のそれぞれの濃度は、リストされた値から１０％以下で変動する。一実施形態において、構成成分のそれぞれの濃度は、リストされた値から２５％以下で変動する。他に示されない限り、本明細書において使用されるように、Ｘ％以下の変動は、リストされた値に対して±Ｘ％の変動を意味する。例えば、リストされた値が１００ｎｇ／ｍｌである場合、２５％の変動は、値が７５ｎｇ／ｍｌ～１２５ｎｇ／ｍｌの間の範囲にあるものとすることができることを意味する（すなわち７５～１２５ｎｇ／ｍｌ）。他に示されない限り、値の範囲が開示される場合、終点は範囲内に含まれる。さらに、他に示されない又は他に文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表現される値は、文脈が明らかに他に記述しない限り、本発明の様々な実施形態において、範囲の下限値の単位の１０分の１まで、述べられる範囲内の任意の特定の値又は部分範囲を想定することができることが理解されたい。一連の数値が本明細書において述べられる場合、本発明は、一連の中にある任意の２つの値によって定められる任意の間の値又は範囲に関する実施形態を含み、最も低い値は最小値とされてもよく、最も大きな値は最大値とされてもよいこともまた理解されたい。「約」又は「およそ」という用語が値の前に置かれる本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が列挙される実施形態を含む。「約」又は「およそ」という用語が数値の前に置かれない本発明の任意の実施形態について、本発明は、「約」又は「およそ」が値の前に置かれる実施形態を含む。
構成成分のうちのいくつかは、塩、エステル、生物学的に活性な代謝産物若しくは誘導体として又は細胞によって若しくは培地中で代謝されて、プロセシングされて若しくは分解されて本明細書において開示される構成成分のうちのいくつかの生物学的に活性な形態を産生する前駆体として提供されてもよいことが認識されるであろう。この文脈における「生物学的に活性な」は、細胞培養培地中に存在する場合に細胞に対してその所望の効果を発揮する構成成分の能力を指す。
本発明の培地は、液体又は固体粉末又は両方の組み合わせであってもよい。液体形態は、完全培地であってもよく、これは、標的細胞の成長／増殖を保持するのに十分な構成成分全てを含有する。代わりに、液体培地は、各個々のパッケージがその適切な条件（温度、湿度等）で保存されるように、別々のパッケージとして保存されてもよい。例えば、ほとんどの構成成分は、本発明の培地中にあることが所望される場合、単一の溶液中に予め溶解し、適切な条件（例えば暗中４℃及び乾燥した場所等）で保存することができる。他の構成成分のための保存条件で不安定になり得る又は他の構成成分とゆっくり反応することがある又はそうでなければ別々のストックとしてより良好に保たれる他の構成成分は、異なる一連の条件（例えば－２０℃又は－８０℃等）下で保存されてもよい。使用のすぐ前に又は直前に、これらの別々に保存された構成成分は培地全体を構成するよう一緒にされる。各別々のパッケージは、別々に又は様々な濃縮ストック（例えば２×、５×、１０×、１００×、１０００×等）として売られていてもよい又は販売されていてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の培地は、１つ以上の細胞株（例えば、本明細書において開示される１つ以上の細胞株）と共に売られ又は販売され、前記培地は、細胞株の培養に好適である。
同様に、完全培地又は個々の構成成分、そのパッケージは、乾燥粉末の形態とすることができ、これは、水溶液（水など）により戻すと、所望の培地又はその濃縮ストック（２×、５×若しくは１０×等）をもたらすであろう。
使用の少し前に別々のストックとすることができる又は別々のストックとしてより良好に保つことができる構成成分は、成長因子（例えば上皮成長因子）、ホルモン（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン）、他の不安定な酵素／タンパク質（例えばトランスフェリン、インスリン、コレラ毒素等）、ステロイド（例えばヒドロコルチゾン、コレステロール）、ビタミン（ビタミンＡ、Ｂｉ２、Ｋ３）、ｐＨ指示薬（例えばフェノールレッド）、１つ以上の緩衝液構成成分（例えば炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ）及び他の化学物質（例えばグルタチオン、１７－β－エストラジオール、Ｏ－ホスホリルエタノールアミン等）を含む。
特定の実施形態において、培地の少なくともいくつかの又は全ての構成成分は、液体／水性形態をしている。他の実施形態において、培地の少なくともいくつかの又は全ての構成成分は、固体／粉末形態をしている。
本発明の培地は、鳥、爬虫類、ヒト及び他の非ヒト哺乳類を含む様々な哺乳類由来の多様な初代細胞に好適である。後者は、非ヒト霊長類（例えばサル、ゴリラ等）、マウス、ラット、ウサギ、家畜としてのウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ及びネコを更に含む。
本明細書において使用される「実質的にない」は、全細胞集団における少なくとも約８０％純粋な、好ましくは８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上純粋な所望の細胞の集団を指す。
本発明はまた、分化、アポトーシス、化学療法／放射線療法に対する感受性又は老化を含む、腸管オルガノイドの１つ以上の特徴を増強する又はそれによい影響を及ぼす薬剤を特定するためのインビトロにおける方法であって、（１）本発明の培地中の腸管オルガノイドの培養物を、例えばこれらのオルガノイドの１つ以上の特徴を増強する又はそれによい影響を及ぼす能力について評価する候補薬剤と、薬剤が細胞に入る適切な条件下で接触させること；（２）評価する候補薬剤の存在下において特徴が例えば増強される又はそれによい影響を及ぼす程度を決定すること；及び（３）決定した程度を、同じ条件下であるが評価する候補薬剤の非存在下における腸管オルガノイドの特徴と比較することを含み、特徴が、評価する候補薬剤の存在下において、候補薬剤の非存在下においてよりも実質的に増強される又はよい影響を及ぼされる場合、評価する候補薬剤は、腸管オルガノイドの１つ以上の特徴を増強する又はそれによい影響を及ぼす薬剤である方法も提供する。
本発明はまた、同様に、腸管オルガノイドの１つ以上の特徴を阻害する又はそれに負の影響を及ぼす薬剤を特定するためのインビボにおける方法も提供する。
特定の実施形態において、薬剤は、ＲＮＡｉ分子である。特定の実施形態において、薬剤は、ｓｉＲＮＡ分子である。特定の実施形態において、薬剤は、化学化合物である。
本発明において、「単離」は、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から取り出された材料を指し、従って、その天然状態から「人工的に」変更されている。例えば、単離ポリヌクレオチドは、ベクター若しくは物質の組成物の一部であり得るか又は細胞内に含有され得、依然として「単離」されている。それというのも、そのベクター、物質の組成物又は特定の細胞はそのポリヌクレオチドの元の環境ではないためである。用語「単離」は、ゲノムライブラリーもｃＤＮＡライブラリーも、全細胞トータルＲＮＡ調製物もｍＲＮＡ調製物も、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動により分離され、ブロット上に転写されたものを含む）も、剪断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物も、当技術分野が本発明のポリヌクレオチド／配列の区別される特色を実証していない他の組成物も指さない。単離ＤＮＡ分子の更なる例としては、異種宿主細胞中で維持された組換えＤＮＡ分子又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。しかしながら、ライブラリーの他のメンバーから単離されていないライブラリー（例えば、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであるクローン中に（例えば、ライブラリーのそのクローン及び他のメンバーを含有する均質な溶液の形態で）、或いは細胞又は細胞溶解物から取り出された染色体（例えば、核型におけるような「染色体スプレッド」）内に、或いはランダムに剪断されたゲノムＤＮＡの調製物又は１つ以上の制限酵素により切断されたゲノムＤＮＡの調製物内に含有される核酸は、本発明では「単離」されていない。本明細書に更に考察される通り、本発明による単離核酸分子は、天然に、組換えにより又は合成により産生することができる。
本発明において、「分泌」タンパク質は、シグナル配列によりＥＲ、分泌小胞若しくは細胞外空間に導くことができるタンパク質及び必ずしもシグナル配列を含有するわけではないが細胞外空間に放出されるタンパク質を指す。分泌タンパク質が細胞外空間に放出される場合、分泌タンパク質は細胞外プロセシングを受けて、「成熟」タンパク質を産生することができる。細胞外空間への放出は、エキソサイトーシス及びタンパク質切断を含む多くの機構によって生じさせることができる。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ並びに一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には二本鎖、又は一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変塩基又は安定性のために若しくは他の理由のために改変されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ骨格も含有し得る。「改変」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及び異常塩基、例えばイノシンが挙げられる。種々の改変がＤＮＡ及びＲＮＡになされ得；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に又は代謝的に改変された形態を包含する。
表現「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、そのポリペプチドについてのコード配列のみを含むポリヌクレオチド並びに追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の４２℃における一晩のインキュベーションとそれに続く約５０℃における０．１×ＳＳＣ中のフィルターの洗浄を指す。ハイブリダイゼーション及びシグナル検出のストリンジェンシーの変化は、主に、ホルムアミド濃度（より低い割合のホルムアミドがストリンジェンシーの低下をもたらす）；塩条件又は温度の操作を通して達成される。例えば、中程度に高いストリンジェンシー条件としては、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ；０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４；０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中の３７℃における一晩のインキュベーションとそれに続く５０℃における１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳによる洗浄が挙げられる。さらに、いっそうより低いストリンジェンシーを達成するため、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に実施される洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）において行うことができる。上記の条件における変法は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替ブロッキング試薬の包含及び／又は置換を通して達成することができる。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ及び市販の専売配合物が挙げられる。規定のブロッキング試薬の包含は、適合性についての問題に起因して上記のハイブリダイゼーション条件の改変を要求し得る。
ポリペプチドに言及する場合の用語「断片」、「誘導体」及び「アナログ」は、そのようなポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能又は活性のいずれかを保持するポリペプチドを意味する。アナログとしては、プロタンパク質部分の開裂により活性化させて活性成熟ポリペプチドを産生することができるプロタンパク質が挙げられる。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；それは、コード領域に先行する領域及びその後に続く領域「リーダー及びトレーラー」並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結しているアミノ酸又は改変ペプチド結合により互いに連結しているアミノ酸、即ちペプチドイソスターから構成され得、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、天然プロセス、例えば翻訳後プロセシング又は当技術分野において周知の化学修飾技術のいずれかにより修飾することができる。このような修飾は、基礎的な教本及びより詳細なモノグラフ並びに膨大な研究論文に十分記載されている。修飾は、ポリペプチド中のいずれの箇所においても生じ得、その箇所としては、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端が挙げられる。同一のタイプの修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位において同一又は変動する程度で存在し得ることが認識される。さらに、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有し得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝鎖であり得、それらは分枝を有するか又は分枝を有さない環状であり得る。環状、分枝鎖及び分枝鎖環状ポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じ得るか、又は合成方法により作製することができる。修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ビオチン化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性付着、ヘム部分の共有結合性付着、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合性付着、脂質又は脂質誘導体の共有結合性付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合性付着、架橋、環化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、抗体分子又は他の細胞リガンドへの結合、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング（例えば、開裂）、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化及びユビキチン化が挙げられる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ－ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．Ｉ－１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６－６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８－６２（１９９２）参照）。
「生物学的活性を有する」ポリペプチド断片は、用量依存性を伴うか又は伴わない、特定の生物学的アッセイにおいて計測される元のポリペプチド、例えば成熟形態の活性と類似するが必ずしも同一でなくてもよい活性を示すポリペプチドを指す。用量依存性が存在する場合、それは、ポリペプチドのそれと同一である必要はなく、むしろ、元のポリペプチドと比較して所与の活性において用量依存性と実質的に類似する（即ち候補ポリペプチドは、元のポリペプチドに対して高い活性又は約２５倍以下少ない、一部の実施形態では約１０倍以下少ない活性若しくは約３倍以下少ない活性を示す）。
種ホモログは、本明細書に提供される配列から好適なプローブ又はプライマーを作製し、好適な核酸資源を所望のホモログについてスクリーニングすることにより単離及び同定することができる。
「バリアント」は、元のポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、その必須の特性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。一般に、バリアントは、元のポリヌクレオチド又はポリペプチドと全体的に密接に類似し、多くの領域において、同一である。
実際問題として、任意の特定の核酸分子又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるか否かは、慣用的には、公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的なマッチを決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｌｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列及び対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することにより比較することができる。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性におけるものである。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝ユニタリー、ｋ－タプル＝４、ミスマッチペナルティ－－１、結合ペナルティ－－３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝ｌ、ギャップペナルティ－－５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。対象配列が、内部欠失のためではなく５’又は３’欠失に起因してクエリ配列よりも短い場合、その結果を手作業により補正しなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、パーセント同一性を計算する場合、対象配列の５’及び３’トランケーションを考慮しないためである。クエリ配列に対して５’又は３’末端においてトランケートされた対象配列について、パーセント同一性は、クエリ配列の全塩基のパーセントとして、マッチング／アラインメントされていない対象配列の５’及び３’であるクエリ配列の塩基の数を計算することにより補正される。ヌクレオチドがマッチング／アラインメントされているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次いで、この割合は、規定のパラメータを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性から減算され、最終のパーセント同一性スコアに達する。この補正スコアが、本発明のために使用されるものである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによりディスプレイされる対象配列の５’及び３’塩基の外側の塩基のみが、パーセント同一性スコアを手作業により調整する目的に計算される。例えば、９０塩基の対象配列は、１００塩基のクエリ配列とアラインメントされてパーセント同一性が決定される。欠失は対象配列の５’末端において生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端における最初の１０塩基のマッチング／アラインメントを示さない。この１０個の損なわれた塩基はその配列の１０％（マッチングされていない５’及び３’末端における塩基の数／クエリ配列中の塩基の総数）に相当し、従って、１０％がＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０塩基が完全にマッチした場合、最終のパーセント同一性は９０％である。別の例において、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリ配列と比較される。この場合、欠失は内部欠失であるため、クエリとマッチング／アラインメントされていない対象配列の５’にも３’にも塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は、手作業により補正されない。再度述べると、クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない対象配列の５’及び３’の塩基のみが手作業により補正される。
本発明のクエリアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、対象ポリペプチド配列がクエリアミノ酸配列のそれぞれの１００アミノ酸につき５つまでのアミノ酸変更を含み得ることを除きクエリ配列と同一であることが意図される。換言すると、クエリアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るため、対象配列中のアミノ酸残基の５％までを挿入するか、欠失するか、又は別のアミノ酸と置換することができる。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端位置において又はそれらの末端位置の間のいずれの箇所でも、参照配列中の残基の間に個々に又は参照配列内の１つ以上の連続する群として散在して生じ得る。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列に示されるアミノ酸配列又は寄託ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるか否かは、慣用的には、公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的なマッチを決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列及び対象配列は両方ともヌクレオチド配列又は両方ともアミノ酸配列のいずれかである。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性におけるものである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントに使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝ＰＡＭ０、ｋ－タプル＝２、ミスマッチペナルティ－－Ｉ、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝ｌ、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ－－５、ギャップサイズペナルティ－－０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方。対象配列が、内部欠失のためではなくＮ又はＣ末端欠失に起因してクエリ配列よりも短い場合、その結果を手作業により補正しなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバルパーセント同一性を計算する場合、対象配列のＮ及びＣ末端トランケーションを考慮しないためである。クエリ配列に対してＮ及びＣ末端においてトランケートされた対象配列について、パーセント同一性は、クエリ配列の全塩基のパーセントとして、対応する対象残基とマッチング／アラインメントされていない、対象配列のＮ及びＣ末端であるクエリ配列の残基の数を計算することにより補正される。残基がマッチング／アラインメントされているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次いで、この割合は、規定のパラメータを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性から減算され、最終のパーセント同一性スコアに達する。この最終パーセント同一性スコアが、本発明のために使用されるものである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、対象配列のＮ及びＣ末端にある残基のみが、パーセント同一性スコアを手作業により調整する目的に考慮される。それは、対象配列の最も遠いＮ及びＣ末端残基の外側のクエリ残基位置のみである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいてディスプレイされる対象配列のＮ及びＣ末端の外側の残基位置のみが手作業により補正される。他の手作業による補正は、本発明のために行われるべきでない。
天然に存在するタンパク質バリアントは、「アレルバリアント」と呼ばれ、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ １１，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチドレベル及び／又はポリペプチドレベルのいずれかにおいて変動し得る。代わりに、天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技術により又は直接的合成により産生することができる。
タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、変異体は、ポリペプチドの特徴を改善する又は変えるために生成されてもよい。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損失することなく分泌タンパク質のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）の著者は３、８又は２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後でさえ変異体ＫＧＦタンパク質がヘパニン（ｈｅｐａｎｉｎ）結合活性を有すると報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に最大１０倍高い活性を見せた（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８））。さらに、変異体が天然に存在するタンパク質と類似の生物学的活性を保ち続けることが多いといったことが十分な証拠によって実証されている。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａについて広範囲な突然変異解析を行った。彼らはランダム突然変異誘発を使用して、分子の全長にわたって変異体当たり平均で２．５個のアミノ酸が変更されている３，５００個を超える個々のＩＬ－１ａ突然変異体を生成した。多数の突然変異を、あらゆる可能性があるアミノ酸位置で検討した。この研究者らは、「［ほとんどの分子を［結合活性にも生物学的活性にも］ほとんど影響することなく変えられる」ことを発見した。（要約を参照されたい。）事実、検討された３，５００個を超えるヌクレオチド配列から、２３個のユニークなアミノ酸配列だけが、活性が野生型と著しく異なったタンパク質を産生した。さらに、たとえポリペプチドのＮ末端又はＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が１つ以上の生物学的機能の改変又は損失をもたらすとしても、他の生物学的活性はなお保ち続けられるかもしれない。例えば、分泌形態を認識する抗体を誘発する及び／又はそれに結合する欠失変異体の能力は、分泌形態の過半数に満たない残基がＮ末端又はＣ末端から除去される場合、おそらく保ち続けられるであろう。タンパク質のＮ又はＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫原性の活性を保ち続けるかどうかは、本明細書において記載されるまたそうでなければ当技術分野において知られているルーチン的な方法によって直ちに決定することができる。
「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物又は本発明のポリペプチド若しくはｍＲＮＡを含有する他の資源から得られる任意の生物学的サンプルを意味する。示されるように、生物学的サンプルは、体液（例えば精液、リンパ液、血清、血漿、尿、滑液及び脊髄液）並びに本発明のポリペプチドを発現することが分かっている他の組織源を含む。哺乳類から組織生検材料及び体液を得る方法は、当技術分野おいてよく知られている。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含むべきである場合、組織生検材料は好ましい資源である。
「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」は、マウス腫瘍細胞によって分泌され、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって売られているゲル状のタンパク質混合物の商品名である。この混合物は、多くの組織中に見られる複雑な細胞外環境に似ており、細胞培養のための基材として細胞生物学者によって使用されている。通常の実験手順では、プラスチック製の組織培養実験器具に少容量の冷やした（４℃）Ｍａｔｒｉｇｅｌを分注する。３７℃（体温）でインキューベートすると、Ｍａｔｒｉｇｅｌタンパク質は自己集合し、実験器具の表面を覆う薄膜を産生する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で培養される細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上でなければ実験条件下で観察するのが不可能である複雑な細胞挙動を示す。例えば、内皮細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた表面に込み入ったクモの巣様の網様構造を作るが、プラスチック表面では作らない。このような網様構造は、生体組織を血液でおおう微小血管の毛細管系を大いに思い起こさせる。それゆえ、内皮細胞がこのような網様構造を構築するプロセスは、生物学の研究者にとって非常な関心のあることであり、Ｍａｔｒｉｇｅｌは、研究者がこれを観察するのを可能にする。場合によっては、研究者は、厚い三次元ゲルを産生するためにより大容量のＭａｔｒｉｇｅｌを使用する。厚いゲルの有用性は、ゲルにより細胞がゲルの表面から内部に移動するよう誘発されることである。この移動性の挙動は、腫瘍細胞転移のモデルとして研究者によって研究されている。医薬科学者は、薬物分子をスクリーニングするためにＭａｔｒｉｇｅｌを使用する。典型的な実験は、Ｍａｔｒｉｇｅｌにテスト分子を添加すること及び細胞挙動を観察することからなる。内皮細胞網様構造形成を促進するテスト分子は、組織再生治療の候補となるのに対して、内皮細胞網様構造形成を阻害するテスト分子は、抗癌治療の候補となる。同様に、腫瘍細胞移動を阻害するテスト分子もまた、抗癌薬としての可能性を有しているかもしれない。複雑な細胞挙動を刺激するＭａｔｒｉｇｅｌの能力は、その不均一な組成の結果である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主な構成成分は、ラミニン及びコラーゲンなどの構造タンパク質であり、これらは、培養細胞に培養細胞が自然環境において遭遇するであろう接着性のペプチド配列を提示する。多くの細胞型の分化及び増殖を促進する成長因子もまた、存在する。Ｍａｔｒｉｇｅｌは少量の多数の他のタンパク質を含有し、その正確な組成は知られていない。Ｍａｔｒｉｇｅｌはまた、胚性幹細胞培養において付着基材としても使用される。胚性幹細胞をフィーダー細胞の非存在下において成長させる場合、Ｍａｔｒｉｇｅｌなどの細胞外マトリックス構成成分は、多能性、未分化状態（自己複製）を維持するのに必要である。
ＮＲＧ１、ＡＲＩＡ、ＧＧＦ、ＧＧＦ２、ＨＧＬ、ＨＲＧ、ＨＲＧ１、ＨＲＧＡ、ＭＳＴ１３１、ＭＳＴＰ１３１、ＮＤＦ、ＮＲＧ１－ＩＴ２又はＳＭＤＦとしても知られているニューレグリン１は、ヒトにおいてＮＲＧ１遺伝子によってコードされる上皮成長因子ファミリーのメンバーである。ＮＲＧ１は、ＥＧＦＲファミリーの受容体に対して作用するニューレグリンファミリーにおける４つのタンパク質のうちの１つである。ニューレグリン１は、選択的スプライシングによって多数のアイソフォームが産生され、これによってニューレグリン１は多種多様な機能を実行することができる。好適なＮＲＧ１は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって販売されているＮＲＧ１である（Ｃａｔ＃ ５８９８－ＮＲ－０５０；ＮＳ０由来ヒトニューレグリン－１／ＮＲＧ１タンパク質、Ｓｅｒ２０～Ｌｙｓ２４１、Ｃ末端６－Ｈｉｓタグ付き）。
ａｔＲＡ、ＮＳＣ１２２７５８、レチノイン酸、トランスレチノイン酸、トレチノイン及びビタミンＡ酸としても知られているオールトランスレチノイン酸は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ、ＩＣ５０＝１４ｎＭ）に対するリガンドとして機能するビタミンＡの誘導体である。ＲＡＲは、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体化し、ＤＮＡ中のレチノイン酸応答エレメント（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＲＡＲＥ）に結合し、転写因子として作用し、遺伝子発現を変える。
ＲＳＰＯ１、ＣＲＩＳＴＩＮ３及びＲＳＰＯとしても知られているＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１は、第１染色体上に見られるＲｓｐｏ１遺伝子によってヒトにおいてコードされる分泌タンパク質である。ヒトにおいて、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１は、女性発生のプロセスにおいてＷＮＴ４と相互作用する。機能の損失は、女性から男性への性転換を引き起こすことがある。さらに、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１は、カノニカルなＷＮＴ／βカテニンシグナル伝達を促進する。
ＮＯＧ、Ｎｏｇ、ＳＹＭ１、ＳＹＮＳ１及びＳＹＮＳ１Ａとしても知られているＮｏｇｇｉｎは、神経組織、筋肉及び骨を含む多くの体組織の発生に関与するタンパク質である。ヒトにおいて、ｎｏｇｇｉｎは、ＮＯＧ遺伝子によってコードされる。ヒトｎｏｇｇｉｎのアミノ酸配列は、ラット、マウス及びアフリカツメガエルに対して高度に相同性である。Ｎｏｇｇｉｎは、いくつかの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の阻害剤である：Ｎｏｇｇｉｎは、少なくともＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１３及びＢＭＰ１４を阻害する。
ソマトメジンＣ、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ１Ａ、ＩＧＦＩ及びＭＧＦとも呼ばれるインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）は、小児期の成長において重要な役割を果たし、成人において同化作用を有する、インスリンに分子構造が類似しているホルモンである。ＩＧＦ－１は、ヒトにおいてＩＧＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＩＧＦ－１は、３つの分子内ジスルフィド架橋を有する単鎖の７０個のアミノ酸からなる。ＩＧＦ－１は、７，６４９ダルトンの分子量を有する。ＩＧＦ－１は、主に肝臓によって産生される。産生は、成長ホルモン（ＧＨ）によって刺激される。ほとんどのＩＧＦ－１は、６つの結合タンパク質のうちの１つに結合する（ＩＧＦ－ＢＰ）。ＩＧＦＢＰ－１は、インスリンによって調節される。
ＢＦＧＦ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦＢ、ＨＢＧＦ－２、線維芽細胞成長因子２、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びＦＧＦ－βとしても知られているＦＧＦ２は、成長因子であり、ＦＧＦ２遺伝子によってコードされるシグナル伝達タンパク質である。ＦＧＦ２は、自体が密接に関係のある分子のファミリーである特異的な線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）タンパク質に結合し、これを介して効果を発揮する。
ＧＡＳＴ及びＧＡＳとしても知られているガストリンは、胃の壁細胞による胃酸（ＨＣｌ）の分泌を促進し、胃運動を助けるペプチドホルモンである。ガストリンは、胃、十二指腸及び膵臓の幽門洞におけるＧ細胞によって放出される。ガストリンは、コレシストキニンＢ受容体に結合して、腸クロム親和性細胞様細胞においてヒスタミンの放出を刺激し、ガストリンは、Ｋ＋／Ｈ＋ＡＴＰアーゼポンプの壁細胞の頂端膜への挿入を誘発する（これは次に胃内腔へのＨ＋放出を増加させる）。その放出は、胃の管腔におけるペプチドによって刺激される。
ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌シグナル伝達タンパク質をコードする構造的に関係のある遺伝子からなる。これらのタンパク質は、腫瘍形成並びに細胞運命の調節及び胚形成の間のパターン形成を含むいくつかの発生過程に関係してきた。この遺伝子は、ＷＮＴ遺伝子ファミリーのメンバーである。この遺伝子は、進化の過程において非常に保存されており、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、アミノ酸レベルでマウスＷｎｔ１タンパク質と９８％同一であることが知られている。
Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｖｏｌｕｍｅ ２７，Ｉｓｓｕｅ ５，５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０２０，Ｐａｇｅｓ ８４０－８５１．ｅ６）は、Ｗｎｔ ＮＧＳを考案し、設計した。Ｗｎｔ ＮＧＳは、Ｆｚｄ及びＬｒｐ６とヘテロ二量体化する水溶性でＦｚｄサブタイプ特異的な「次世代サロゲート」（ＮＧＳ）Ｗｎｔである。ＮＧＳ Ｗｎｔは、腎臓、結腸、肝細胞、卵巣及び乳房を含む多数の様々なタイプのオルガノイドの長期の拡張を保持する。ＮＧＳ Ｗｎｔは、オルガノイド拡張及び単細胞オルガノイド成長においてＷｎｔ３ａ（本発明の培地の別の可能性がある選択肢）条件培地より優れている。
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は均等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法及び実施例は説明のためのものにすぎず、限定的なものではない。さらに、前記説明が医学的使用に集中しているという事実にもかかわらず、本発明の方法及び薬剤はまた、任意の非医学的な使用にも好適であることに留意されたい。
腸管オルガノイドの培養のための様々な培地の調製のためのプロトコールの例：
小腸培地組成 １×配合物
最初の例えば４日間の培養のための第１の培養培地
０．５ｎＭ Ｗｎｔ－ＮＧＳ
１μｇ／ｍｌ組換えＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－１
１００ｎｇ／ｍｌ組換えＮｏｇｇｉｎ
１×Ｂ２７（商標）サプリメント
１．２５ｍＭ ＮＡＣ
５０ｎｇ／ｍｌ ｈＥＧＦ
１ｎｇ／ｍｌ ｈＮＲＧ１
０．５μＭ Ａ８３－０１
１００ｎｇ／ｍｌ ｈＩＧＦ１
５０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２
２５ｎＭガストリン
１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（１：１００ ＃３５０５０－０３８）及び１００μｇ／ｍｌ ＰｅｎＳｔｒｅｐ（＃１５１４０－１２２）中
例えば４日間の培養後の第２の培地
０．５μｇ／ｍｌ組換えＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ１
１００ｎｇ／ｍｌ組換えＮｏｇｇｉｎ
１×Ｂ２７（商標）サプリメント
１．２５ｍＭ ＮＡＣ
５ｎｇ／ｍｌ ｈＥＧＦ
１０ｎｇ／ｍｌ ｈＮＲＧ１
１００ｎｇ／ｍｌ ｈＩＧＦ１
５０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２
２５ｎＭガストリン
２．５μｍ ａｔＲＡ（オールトランスレチノイン酸）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（１：１００ ＃３５０５０－０３８）及び１００μｇ／ｍｌ ＰｅｎＳｔｒｅｐ（＃１５１４０－１２２）中
結腸培地組成 １×配合物
最初の例えば４日間の培養のための第１の培養培地
０．５ｎＭ Ｗｎｔ（ＮＧＳ）
１μｇ／ｍｌ組換えＲ－ Ｓｐｏｎｄｉｎ１
１００ｎｇ／ｍｌ組換えＮｏｇｇｉｎ
１×Ｂ２７（商標）サプリメント
１．２５ｍＭ
５０ｎｇ／ｍｌ ｈＥＧＦ
１ｎｇ／ｍｌ ｈＮＲＧ１
０．５μＭ Ａ８３－０１
１００ｎｇ／ｍｌ ｈＩＧＦ１
５０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２
２５ｎＭガストリン
１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（１：１００ ＃３５０５０－０３８）及び１００μｇ／ｍｌ ＰｅｎＳｔｒｅｐ（＃１５１４０－１２２）中
例えば４日間の培養後の第２の培地
０．１ｎＭ Ｗｎｔ（ＮＧＳ）
０．５μｇ／ｍｌ組換えＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ１
１００ｎｇ／ｍｌ組換えＮｏｇｇｉｎ
１×Ｂ２７（商標）サプリメント
１．２５ｍＭ ＮＡＣ
５ｎｇ／ｍｌ ｈＥＧＦ
１０ｎｇ／ｍｌ ｈＮＲＧ１
１００ｎｇ／ｍｌ ｈＩＧＦ１
５０ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２
２５ｎＭガストリン２５ｎＭ
０．１μＭ ａｔＲＡ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ（１：１００ ＃３５０５０－０３８）及び１００μｇ／ｍｌ ＰｅｎＳｔｒｅｐ（＃１５１４０－１２２）中
材料及び方法
ヒトオルガノイドライン
全ての患者は、待機的大腸内視鏡検査を受けている時に調査のための使用のために追加の生検サンプルが採取されることについて同意書を提出した。ヒトの健康な結腸（Ｗ１８－５０１５７；ＨＵＢ－０２－Ａ２－０４０）及び小腸（Ｄ１ｎ（ＨＵＢ－０４－Ａ２－００１））オルガノイドは、ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＵｔｒｅｃｈｔにある発明者らの協力者であるＨＵＢ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓによって提供された。
マウスオルガノイドライン
全ての動物実験は、Ｂａｓｅｌ Ｃａｎｔｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓによって承認され、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行われた。７～１５週齢の間の雄及び雌の非近交系マウスを全ての実験に使用した。使用したマウス系統：Ｃ５７ＢＬ／６野生型（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＬｇｒ５：：ＤＴＲ－ＥＧＦＰ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
ヒトオルガノイド培養
初代組織から成長させたオルガノイドは、以前に記載されるように、大腸内視鏡検査によって収集したヒト生検材料から単離された陰窩から生成した１。オルガノイドは、トリプシン処理後４日間、１０ｍＭ Ｙ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足したＦＭＩ－ＳＴＡＲＴ培地（１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）含有ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、１００μｇ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１．２５ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）、１μｇ／ｍｌ組換えヒトＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－１（Ｎｏｖａｒｔｉｓから寄贈）、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、０．５ｎＭ ＷＮＴ－ＮＧＳ（Ｕ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ）、０．５μＭ Ａ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＧＦ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、２５ｎＭガストリン（Ｓｉｇｍａ）、１ｎｇ／ｍｌヒトＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び５０ｎｇ／ｍｌヒト又はマウスＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足）中で保った。４日間の後、オルガノイドにＦＭＩ－ＢＡＬＡＮＣＥ結腸（１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）含有ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、１００μｇ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１．２５ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）、０．５μｇ／ｍｌ組換えヒトＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－１（Ｎｏｖａｒｔｉｓから寄贈）、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、０．１ｎＭ ＷＮＴ－ＮＧＳ（Ｕ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＧＦ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、２５ｎＭガストリン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌヒトＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ（図１Ａ～Ｇ）／０．１μＭ（他）ａｔＲＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５ｎｇ／ｍｌヒト若しくはマウスＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足）又はＦＭＩ－ＢＡＬＡＮＣＥ小腸（１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）含有ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、１００μｇ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１．２５ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）、０．５μｇ／ｍｌ組換えヒトＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－１（Ｎｏｖａｒｔｉｓから寄贈）、１００ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＧＦ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、２５ｎＭガストリン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌヒトＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭ（図１Ａ～Ｇ）／１μＭ（図１Ｉ）／２．５μＭ（他）ａｔＲＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５ｎｇ／ｍｌヒト又はマウスＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足）をそれらの起源に応じて重ねた。培地は、小腸起源のオルガノイドについて成熟時間が長期にわたったため、７日目に取り換え、１０日目にもう一度取り換えた。
マウスオルガノイド培養
マウスオルガノイドは、以前に記載されるように、マウス小腸から単離された陰窩から生成した２。オルガノイドは、トリプシン処理後３日間、１０μＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足したＦＭＩ－ＳＴＡＲＴ培地中で保った。３日間の後、オルガノイドは、ＦＭＩ－ＢＡＬＡＮＣＥ結腸又はＦＭＩ－ＢＡＬＡＮＣＥ小腸において保ち、培地は、５日目にもう一度取り換えた。
画像ベースのスクリーニングアッセイ
マウス小腸及び結腸オルガノイドは、継代の５～７日後に収集し、３７℃で５分間、（０．０５％）トリプシンＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）により消化した。ヒト小腸及び結腸オルガノイドは、継代の１０～１３日後に収集し、３７℃で５～１０分間、（０．０５％）トリプシンＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）により消化した。解離した細胞は、４０μｍの孔径を有するセルストレーナーを通過させた。示す実験について、生きている単細胞を、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａ又はＳＯＮＹ ＭＡ９００セルソーター）によってソートした。前方散乱特性及び側方散乱特性は、細胞ダブレット及び死細胞を除去するために使用した。死細胞はまた、ＤＲＡＱ７染色剤（１．５μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって濾過して取り除いた。マウスオルガノイドラインは、他に示されない限り、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスから誘導した。
イメージングベースの実験は、３８４ウェルプレート（ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－３８４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号６００７５５０）又は９６ウェルプレート（μＣｌｅａｒ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５０９０）で行った。
３８４ウェルプレートでの実験について、細胞は、使用した実験及びラインに応じて約６～５０個の細胞／μｌの密度に達するよう、１０μＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＦＭＩ－ＳＴＡＲＴ中に再懸濁した。次に、３８４ウェルプレートのウェルを、常時冷却下でＡｓｓｉｓｔ Ｐｌｕｓピペッティングロボット（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して１０μｌ／ウェルの氷冷２：１ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）：ＦＭＩ－ＳＴＡＲＴ混合物により覆い、ウェルの底全体を覆った。プレートは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物の層が平らになるよう遠心分離した後で、ＲＴで１０分間インキューベートし、わずかに凝固させた。その後、１０μＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する４０μｌの細胞混合物を調製済みのウェルに慎重に重ねた。細胞は、低速（５秒間５０～７０ｒｃｆ）遠心分離機を使用して慎重に遠心分離し、Ｍａｔｒｉｇｅｌに入れた。最後に、プレートを、培養のためにインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）の中に置いた。
９６ウェルプレートでの実験について、細胞は、約６～５０個の細胞／μｌの密度に達するよう（使用した実験及びラインに応じて）、１０μＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する氷冷２：１ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）：ＦＭＩ－ＳＴＡＲＴ混合物中に再懸濁し、ウェルの中央に５μｌの液滴で播種した。プレートを２０分間３７℃でインキューベートし、Ｍａｔｒｉｇｅｌを凝固させた。この後、１０μＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足した１００μｌのＦＭＩ－ＳＴＡＲＴを、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中での培養のために添加した。
様々な培地組成についてテストするために、以前に記載されるように１，３＊、４日目及び７日目にＦＭＩ－培地組成に関して同時に培地を変更することに決めた。Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．の培地組成３の場合、Ｂｅｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．１及びＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＊の組成と比較して分化培地は必要とされなかった。そのため、発明者らは、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．の組成では始終同じ培地でオルガノイドを培養し、４日目及び７日目に新しくした。
実験の間に、培地は、４日目にＦＭＩ－ＢＡＬＡＮＣＥに変更し、７日目に一度新しくした。小腸オルガノイドは、１３日目の成熟まで成長させるために１０日目に追加で培地を新しくした。
マウスオルガノイドについて、細胞は、１：１の培地対Ｍａｔｒｉｇｅｌ比でＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と混合した。９６ウェルプレート（μＣｌｅａｒ、Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５０９０）の各ウェル中に、様々な密度を有する５μｌの液滴を播種した。３７℃での２０分間の凝固後に、１００μｌの培地を重ねた。
固定サンプル調製及びイメージング
同様のｚ範囲内での全てのオルガノイドのイメージングを可能にするために、各ウェルプレートは、固定の前に１０℃で事前に冷却した遠心分離機において１０分間１０００ｒｃｆで遠心分離した。オルガノイドは、室温で３０分間ＰＢＳ中４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において示す時点で固定した。
画像ベースのスクリーニングアッセイのために、オルガノイドは、ＲＴで３時間（ヒト）又は１時間（マウス）、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、３％ロバ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍＭ ＮＨ４Ｃｌにより透過処理し、ブロックした。一次及び二次抗体を抗体緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、３％ロバ血清）中で希釈し、表２において記載されるように加えた。核の染色のために、０．２μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を二次抗体染色ミックスに添加した。固定、ブロッキング／透過処理及び洗浄ステップは、ＥＬ４０６ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｗａｓｈｅｒ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して実行した。
ハイスループットイメージングは、２つの自動化スピニングディスク顕微鏡のうちの１つで行った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌ又はＹｏｋｏｇａｗａ ＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒ ７０００Ｓ）。Ｎｉｋｏｎ ２０ｘ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ０．７５ ＮＡ対物レンズと組み合わせたＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｎｆｏｃａｌをイメージングに使用した。部位ごとに、オルガノイドのサイズに及ぶｚ平面を取得した。５μｍ ｚステップを、他に示されない限り、全ての実験において使用した。
代わりに、Ｏｌｙｍｐｕｓ ２０ｘ ＵＰＬＳＡＰＯ ２０ｘ ０．７５ ＮＡ対物レンズと組み合わせたＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒ ７０００Ｓもまたイメージングに使用した。ここで、サーチファースト（ｓｅａｒｃｈ ｆｉｒｓｔ）イメージングアプローチを使用した（Ｗａｋｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＳｕｉｔｅのＳｅａｒｃｈ Ｆｉｒｓｔモジュール）。このために、各ウェルにおいて、ウェル領域全体をカバーするために１つの視野を４×解像度で取得した。この全体像は、次いで、オルガノイドの位置について座標を出力する特注のＩｍａｇｅＪマクロによりプログラム作動中にオルガノイドを分割するために使用した。これらの座標は、高分解能再イメージング（２０×、ＮＡ＝０．７５）のために場所のマップを生成するために使用した。部位ごとに、オルガノイドのサイズに及ぶｚ平面を取得した。５μｍ ｚステップを、他に示されない限り、全ての実験において使用した。
画像解析
個々の取得した視野を、あらゆるウェルのウェル全体像を生成するために最初に組み合わせた。次に、最大値投影画像を、全ての全体像及びチャネルについて生成した。ＤＡＰＩチャネルは、続いて、適合させたＲＤＣＮｅｔ Ｎｅｔｗｏｒｋ４を使用して個々のオルガノイドを分割するために使用した。分割後、単一のオルガノイドの領域を、分割に基づいて全体像から抽出した。全ての切り取った領域をフィルタリングステップにかけ、サイズ、ＤＡＰＩ輝度（ＤＡＰＩ－ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）又は軸比に基づいて、間違って分割されたオルガノイド及びデブリを除去した。加えて、イメージングの境界によってカットされたオルガノイドは、更なる解析のために除外した。残りのオルガノイドの特徴は、主にｐｙｔｈｏｎパッケージｓｃｉｋｉｔ－ｉｍａｇｅのｒｅｇｉｏｎｐｒｏｐｓ機能を使用してコンピュータ処理した。さらに、外れ値は、それぞれ下限値及び上限値としての０．０１及び０．９９により分位点フィルターによって除去した。
示す実験のために、擬時間を、形状－特徴空間（ｓｈａｐｅ－ｆｅａｔｕｒｅ ｓｐａｃｅ）を使用して計算した。簡単にいえば、形状－特徴のサブセットを、経時的なオルガノイド成熟をモデル化するために厳選した。このサブセットは、次いで、ｐａｌａｎｔｉｒ ｐｙｔｈｏｎパッケージ５を使用して全てのオルガノイドの擬時間を計算するために使用した。このために、最も早い及び最も遅い時点のオルガノイドを無作為に選び、５００個の中間にある無作為中間地点を使用してそれらの間の軌跡を求めた。このプロセスを５回繰り返し、オルガノイドごとに平均擬時間を計算した。
単細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）及び生データ処理
単細胞は、示す時点でオルガノイドから単離し、４０μｍの孔径を有するセルストレーナーを通過させ、ＦＡＣＳソーティングに使用してデブリ及び死細胞を除いた。細胞懸濁液を１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ機にロードし、単細胞ＧＥＭを生成した。単細胞ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーは、ＣＧ０００５２＿ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌ３’ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｖ２ＵｓｅｒＧｕｉｄｅ＿ＲｅｖＢに従ってＧｅｍＣｏｄｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｇｅｌ Ｂｅａｄ ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔを使用して調製した。ＧＥＭＲＴは、セミスカート９６ウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｐ／Ｎ ００３０ １２８．６０５）によりＢｉｏ－Ｒａｄ ＰＴＣ－２００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにおいて実行した：４５分間５３℃、５分間８５℃；４℃で保持。ＲＴ後、ＧＥＭを破壊し、一本鎖ｃＤＮＡをＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅＴＭ Ｓｉｌａｎｅ Ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐ／Ｎ ３７００２Ｄ）によりクリーンアップした。ｃＤＮＡは、平らなキャップを有する０．２ｍｌ ８ストリップｎｏｎＦｌｅｘ ＰＣＲチューブ（ＳＴＡＲＬＡＢ Ｐ／Ｎ Ｉ１４０２－３７００）によりＢｉｏ－Ｒａｄ ＰＴＣ－２００ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒを使用して増幅させた：３分間９８℃；１２×サイクル：１５秒間９８℃、２０秒間６７℃及び１分間７２℃；１分間７２℃；４℃で保持。増幅させたｃＤＮＡ産物を、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（０．６Ｘ ＳＰＲＩ）によりクリーンアップした。これらのステップの後にＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ Ｖ２（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐ／Ｎ１２０２３７）の試薬を使用してインデックス付きシークエンシングライブラリーを構築した：１）断片化、末端修復及びＡ－テーリング；２）断片化、末端修復及びＡ－テーリング後、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ １０ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（０．６Ｘ ＳＰＲＩ及び０．８Ｘ ＳＰＲＩ）によるＤｏｕｂｌｅ Ｓｉｄｅｄ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；３）アダプターライゲーション；４）ライゲーション後、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（０．８Ｘ ＳＰＲＩ）によるクリーンアップ；５）Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｋｉｔ（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐ／Ｎ－１２０２６２）を使用するサンプルインデックスＰＣＲ；６）サンプルインデックス後、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（０．６Ｘ ＳＰＲＩ及び０．８Ｘ ＳＰＲＩ）によるＤｏｕｂｌｅ Ｓｉｄｅｄ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ。バーコードシークエンシングライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ ＴＭ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ／Ｎ Ｑ３２８５４）によりＱｕｂｉｔ ２．０を使用して定量化し、ライブラリーの品質については、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐ／Ｎ ５０６７－４６２６）を使用してＡｇｉｌｅｎｔの２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで実行した。シークエンシングライブラリーは、以下のリード長を使用して２×５０ペアエンドキットによりＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００に１０ｐＭでロードした：２６サイクル Ｒｅａｄ１、８サイクル ｉ７インデックス及び９８サイクル Ｒｅａｄ２。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒスイート（１．３．０）を使用して、ｍｍ１０ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒヒトゲノム注釈ファイルに基づいてシークエンサーによって生成されたＢＣＬファイルから集合遺伝子発現マトリックスを生成した。
ｓｃＲＮＡシークエンシング解析
低品質の細胞を除外するために、発明者らは、４，５００リード未満の細胞（小腸データセットについては４，０００）又は２６％を超える転写物がミトコンドリア遺伝子に由来する細胞を除去した。低品質の特徴を除外するために、発明者らは、２７個未満の細胞において検出された転写物を除去した。データセットから望ましくない細胞及び特徴を除去した後に、発明者らは、総発現量によってデータを補正し、ライブラリーサイズ分布の平均値についてそれに掛け、結果を対数変換した。発明者らは、総ＵＭＩカウントに十分に貢献しなかったデータセットの特徴のタイプを更に除外した（非コードＲＮＡ、偽遺伝子、リボソームタンパク質、ｓｎｏＲＮＡ及びｓｎＲＮＡを含む）。前処理後、発明者らのデータセットをカウントすると、結腸オルガノイドについて９つの時点でサンプリングした５３，６４０個の細胞中転写物が１８，４６９、小腸オルガノイドについて５つの時点でサンプリングした２６，４５３個の細胞中転写物が１７，１９５であった。
発明者らは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ中のｓｃｒａｎパッケージのｍｏｄｅｌＧｅｎｅＶａｒ及びｇｅｔＴｏｐＨＶＧｓ機能を使用し、時点をブロックし、偽発見率について０．０５の閾値を使用してバリアブル遺伝子を特定した。発明者らは、Ｈｉｅ ｅｔ ａｌ．２０１９によって提唱されるｓｋｅｔｃｈＲ、幾何学的スケッチングのＲ実装を使用して密度を等しくした（ｄｅｎｓｉｔｙ ｅｑｕａｌｉｚｉｎｇ）主成分分析を実行した。６
データを可視化するために、発明者らは、最初の５０個の主成分に基づいてｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ）を使用してデータセットの次元数を更に低下させて細胞を２Ｄ空間に投影した。発明者らは、次いで、グラフベースのクラスタリングを実行するためにＳｅｕｒａｔ Ｒパッケージを使用した。既知の細胞型マーカーのクラスターの発現を可視化するために、発明者らは、ＳｅｕｒａｔパッケージのＤｏｔＰｌｏｔ機能を使用した。発明者らは、相対的な遺伝子発現に基づいてクラスターを既知の細胞型に割り当てた。
＊ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｔｅｓｔｉｃｕｌｔ－ｏｒｇａｎｏｉｄ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉｕｍ－ｈｕｍａｎ．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔｉｏｎ－ｐｒｏｄｕｃｔ－ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ
参考文献
１．Ｂｅｕｍｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍＲＮＡ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １８１，１２９１－１３０６．ｅ１９（２０２０）．
２．Ｓａｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｌｇｒ５ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｕｉｌｄ ｃｒｙｐｔ－ｖｉｌｌｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｎｉｃｈｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４５９，２６２－２６５（２００９）．
３．Ｆｕｊｉｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ Ｍａｉｎｔａｉｎ Ｓｅｌｆ－Ｒｅｎｅｗａｌ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｎｉｃｈｅ－Ｉｎｓｐｉｒｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２３，７８７－７９３．ｅ６（２０１８）．
４．Ｏｒｔｉｚ，Ｒ．，Ｄｅ Ｍｅｄｅｉｒｏｓ，Ｇ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｈ．Ｆ．Ｍ．，Ｌｉｂｅｒａｌｉ，Ｐ．＆ Ｒｅｍｐｆｌｅｒ，Ｍ．ＲＤＣＮｅｔ：Ｉｎｓｔａｎｃｅ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ．
５．Ｓｅｔｔｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ｐａｌａｎｔｉｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７，４５１－４６０（２０１９）．
６．Ｈｉｅ，Ｂ．，Ｃｈｏ，Ｈ．，ＤｅＭｅｏ，Ｂ．，Ｂｒｙｓｏｎ，Ｂ．＆ Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ｓｋｅｔｃｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｃｔｌｙ Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．８，４８３－４９３．ｅ７（２０１９）．

Claims (14)

  1. 腸管オルガノイドの培養のための培養培地であって、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）及びオールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）を含むことを特徴とする培養培地。
  2. 前記腸管オルガノイドは、小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、結腸直腸癌オルガノイド、クローン病オルガノイド又は潰瘍性大腸炎オルガノイドである、請求項１に記載の培養培地。
  3. ＮＲＧ１の濃度は、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの間にあり、ａｔＲＡの濃度は、１０ｎＭ～１０μＭの間にある、請求項１又は２に記載の培養培地。
  4. 動物血清がないことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の培養培地。
  5. 組換えＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、組換えＮｏｇｇｉｎ、ＮＲＧ１、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２及びガストリンを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の培養培地。
  6. Ｗｎｔ ＮＧＳを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の培養培地。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の培地及び細胞外マトリックス又は細胞膜タンパク質とのその相互作用によって前記細胞外マトリックスを模倣する３Ｄマトリックスを含む組成物。
  8. 前記３Ｄマトリックス細胞外マトリックスは、合成ヒドロゲル又はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）である、請求項７に記載の組成物。
  9. 腸管オルガノイドの培養のための請求項１～８のいずれか一項に記載の培地又は組成物の使用。
  10. 腸管オルガノイドを生成するための方法であって、腸管組織の単細胞又は断片の懸濁液を提供するステップ、腸管組織の単細胞又は断片の前記懸濁液を第１の培地と少なくとも１日間インキューベートし、その後、前記第１の培地を請求項１～６に記載の培地と交換するステップを含む方法。
  11. 腸管組織の前記単細胞又は断片は、小腸、結腸、結腸直腸癌、クローン病組織、潰瘍性大腸炎組織又は胚体内胚葉細胞から得られる、請求項１０に記載の腸管オルガノイドを生成するための方法。
  12. 前記第１の培地は、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤、例えばＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２及びアクチビン／ＮＯＤＡＬ／ＴＧＦ－β経路の阻害剤、例えば阻害剤Ａ８３－０１を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記細胞は、前記第１の培地において少なくとも３日間インキューベートされる、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法を使用して得られる腸管オルガノイド。
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