JP2023537364A - アプタマーを用いた高機能性人工臓器の製作方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、アプタマーを用いた灌流可能な血管を含む高機能性人工臓器の製作方法などに関し、本発明のアプタマーを脱細胞保持体のコーティング剤として用いるとき、血管の付着能、生存能および血管形成能などを増進させて、従来の抗体より効率的な脈管構造の再建が可能である。したがって、アプタマーを用いて製作された血管化された人工肝は、生体内で血栓形成が減少するだけでなく、肝機能性を増進させる効果を示すところ、本発明のアプタマーを使用して製作した人工臓器を用いた疾患治療方法としての応用が期待される。【選択図】図５ａ

Description

本発明は、アプタマーを用いた高機能性人工臓器の製作方法などに関する。

本出願は、２０２０年８月６日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－００９８３１４号および２０２０年１１月１２日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－０１５０９１３号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。

人工臓器バイオ技術は、幹細胞と細胞の成長因子（細胞液栄養分など）を３次元バイオ人工保持体に培養し、この型枠によって人工臓器を作る技術を含む、多様な方式で身体構成臓器の代替機器を製作する技術である。現代医学の発達に伴い、ドナーを介した臓器移植は、ほぼすべての臓器を対象に行われているが、ドナーの不足によって多くの患者が恩恵を受けられず、人工臓器は、生体親和性が不足して副作用が発生しているのが現状である。

一方、肝硬変など慢性肝疾患は、毎年約２百万人の患者を死に至らせる病気である。最近、数十年間免疫学と臓器移植術の画期的な発展に伴い、末期肝疾患において肝移植術が多く施行されており、現在先天性あるいは後天性肝疾患における唯一の治療法は、肝移植術と認識されているが、ドナーが不足している。このような観点から、組織工学を介した人工肝の生産は、ドナー臓器の代替材として脚光を浴びている。韓国は、肝関連疾患による死亡率が他の疾患に比べて非常に高く、移植用臓器の不足によって移植待機者が相当数に至り、肝移植最多国家の１つであり、このような状況を改善できる技術の開発が必要である。

肝保持体の製作のために、組織工学や３次元プリンタ技術応用および幹細胞を用いた臓器復元（ｏｒｇａｎｏｉｄ）など多様な方法が研究されているが、臓器微細構造の模倣不可とサイズの制限という技術的限界を克服していない。これを克服し、安全性と機能性を有する人体臓器模倣保持体として、動物の臓器から細胞を全て除去した脱細胞保持体が有用な基質と評価されている。免疫反応を誘発できる細胞成分を除去すると同時に、保持体内微細構造と生化学的シグナルなど臓器特異的微細環境が造成されていて、ヒトの細胞を注入したとき、保持体内細胞の３次元組織化が容易であるという長所がある。したがって、脱細胞保持体は、人工臓器を生産するための適切な基質として用いられ得、脱細胞保持体を用いて多様な臓器を再建しようとする研究が行われている。

肝は、組織学的に非常に複雑な血管構造を有しており、心拍出量の２５％以上の血液が通過する臓器であるから、人工肝の成功した再建のためには、臓器の血管化が核心といえる。血管構造が形成されていない人工臓器は、移植後に授与者の血流と連結された後、急性免疫反応によって血管内血栓が形成され、それによる移植失敗（ｇｒａｆｔ ｆａｉｌｕｒｅ）が発生する可能性が高い。したがって血管構造を効率的に再建するための多様なコーティング剤が研究されている。

アプタマーは、短い配列からなる一本鎖核酸であり、特定のタンパク質に対する結合力が高く、免疫原性が低く、大量生産が可能であるという長所があるので、抗体の代替剤として応用されている。また、アプタマーは、医学的な診断に主に活用されており、がんやウイルス性疾患をターゲットする治療剤として脚光を浴びている。しかしながら、アプタマーが組織工学の観点からコーティング剤としての有用性を有することは明らかにされていない。

また、ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）は、ヒトの組織適合抗原の１つであり、同種由来細胞あるいは人工臓器を患者に移植するとき、ヒト白血球抗原型が一致しない場合、免疫拒否反応が発生することがある。最近、このようなヒト白血球抗原－Ａ、Ｂ、Ｃタイプを遺伝子編集を用いて除去することによって確立された汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）細胞が多く研究されている。しかしながら、ヒト白血球抗原－Ａ、Ｂ、Ｃを除去した細胞も、移植時に、ＮＫ細胞に対して依然として敏感性を示すという限界がある。したがって、このようなＮＫ細胞の反応を抑制する「攻撃無力化（Ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）シグナル」を過発現させることによって、最終的に免疫反応を回避できる細胞の製作が可能である。特に、このような特性を有する汎用幹細胞（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＵＳＣ）において各系統に分化した細胞は、人工臓器の製作時に、免疫拒否反応の発生を最小化するための細胞組成物として応用され得る。

したがって、本技術では、核酸アプタマーをコーティング剤として使用して脈管構造の再建効率を最大化させ、人工臓器の移植後に血栓形成を最小化できる技術を最初に確立した。また、本技術を通じて汎用幹細胞（ＵＳＣ）由来肝構成細胞などを用いて生体内で移植が可能であり、機能性が増進された血管化された人工肝を製作した。

Ｋ．Ｈ．Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｋ．Ｍ．Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｓ．Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｍ．Ｗｏｏ，Ｈｅｐａｒｉｎ－ｇｅｌａｔｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｌｉｖｅｒｓ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ ３８（２０１６）８２－９３

これより、本発明者らは、核酸アプタマーをコーティング剤として使用して脈管構造の再建効率を最大化させ、人工臓器の移植後に副作用を最小化できる技術を最初に確立した。また、本発明者らは、核酸アプタマーを用いて生体内で移植が可能であり、機能性が増進された人工臓器を製作できることを最初に確認することによって、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、アプタマーを含む人工臓器製作用組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、アプタマーを含む血管コーティング用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、アプタマーを用いた人工器官の製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記方法で製造された人工器官を提供することにある。

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当該技術分野における通常の技術者が明確に理解することができる。

前記本発明の目的を達成するために、本発明は、アプタマーを含む人工器官製作用組成物を提供する。

また、本発明は、アプタマーを含む組成物の人工器官製作用途を提供する。

また、本発明は、アプタマーを処理する段階を含む人工器官の製造方法を提供する。

また、本発明は、アプタマーを含む血管コーティング用組成物を提供する。

また、本発明は、アプタマーを含む組成物の血管コーティング用途を提供する。

また、本発明は、アプタマーを含む組成物を処理する段階を含む血管コーティング方法を提供する。

また、本発明は、前記方法で製造された人工器官を提供する。

本発明の一具現例において、前記人工器官は、生体適合性でありうる。

本発明の他の具現例において、前記人工器官は、例えば、血管を含む器官であれば、限定されず、具体的には、肝であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記アプタマーは、抗ＣＤ３１アプタマーであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記アプタマーは、配列番号１で表される塩基配列を含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記アプタマーは、血管内皮細胞特異的であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記アプタマーは、インテグリンベータ３およびリン酸化Ａｋｔからなる群から選ばれる１つ以上の発現を増加させることができるが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記アプタマーは、切断されたカスパーゼ－３の発現を減少させることができるが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、実質細胞および非実質細胞からなる群から選ばれる１つ以上の細胞をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、幹細胞由来細胞であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記細胞は、幹細胞由来分化細胞を含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、幹細胞由来実質細胞をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、幹細胞由来非実質細胞をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）、汎用幹細胞（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＵＳＣ）、骨髄由来幹細胞（Ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、脂肪由来幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）および胎盤由来幹細胞（Ｐｌａｃｅｎｔａ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれる１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の具現例において、前記汎用幹細胞は、下記特徴を１つ以上有していてもよいが、これに限定されるものではない。
ＨＬＡ遺伝子が除去される；および
攻撃無力化シグナルが過発現する。

本発明のさらに他の具現例において、前記製造方法は、下記段階を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
ａ）個体から器官を提供する段階；
ｂ）前記提供された器官を脱細胞化する段階；および
ｃ）前記脱細胞化した器官にアプタマーを処理する段階。

本発明のさらに他の具現例において、前記製造方法は、下記段階からなる群から選ばれる１つ以上の段階をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
ｄ－１）脱細胞化した器官を血管内皮細胞で再細胞化させる段階；
ｄ－２）脱細胞化した器官を実質細胞で再細胞化させる段階；および
ｄ－３）脱細胞化した器官を非実質細胞で再細胞化させる段階。

本発明のアプタマーを脱細胞保持体のコーティング剤として用いるとき、血管の付着能、生存能および血管形成能などを増進させて、従来の抗体より効率的な脈管構造の再建が可能である。したがって、アプタマーを用いて製作された血管化された人工肝は、生体内で血栓形成が減少するだけでなく、肝機能性を増進させる効果を示すところ、本発明のアプタマーを使用して製作した人工臓器を用いた疾患治療方法としての応用が期待される。

図１ａ～図１ｇは、抗ＣＤ３１アプタマーの特性を分析した結果を示す図である：図１ａは、ＣＤ３１－アプタマー複合体を形成する抗ＣＤ３１アプタマーの機能的構造を示す図である；図１ｂ～図１ｄは、ＨＵＶＥＣ、ＨｅｐＧ２細胞およびＭＳＣに対するｃｙ５標識抗ＣＤ３１アプタマーの用量依存的結合を確認した結果を示す図であり、図１ｂは、ＨＵＶＥＣ、ＨｅｐＧ２細胞およびＭＳＣのＦＡＣＳプロファイルで抗ＣＤ３１アプタマーの用量依存的結合効率を示し、図１ｃは、結合速度を定量化した結果を示し、図１ｄは、ＨＵＶＥＣ、ＨｅｐＧ２細胞およびＭＳＣに結合した抗ＣＤ３１アプタマーのＭＦＩ（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の定量結果を示す図である；図１ｅは、ｃｙ５標識抗ＣＤ３１アプタマー（上段、赤色）および抗ＣＤ３１抗体（下段、赤色）で染色されたＨＵＶＥＣの免疫細胞化学的イメージを示す図である；図１ｆおよび図１ｇは、抗ＣＤ３１アプタマー（上段、赤色）および抗ＣＤ３１抗体（下段、赤色）で染色されたＨｅｐＧ２細胞およびＭＳＣの免疫細胞化学的イメージを示す図である。 図２ａ～図２ｊは、抗ＣＤ３１アプタマーがせん断応力下で内皮細胞（ＥＣ，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を細胞外基質（ＥＣＭ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）にインテグリン媒介付着することを示す図である：図２ａは、ＥＣＭ構成要素を示す図である；図２ｂは、せん断されたＨＵＶＥＣの代表位相差イメージを示す図である；図２ｃは、付着速度を示す図である；図２ｄは、装置をＰＢＳ（ｖｅｈｉｃｌｅ、ｕｎｃｏａｔｅｄ）、抗ＣＤ３１アプタマー（ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ）および抗ＣＤ３１抗体（Ａｂ－ｃｏａｔｅｄ）でそれぞれコートしたｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す図である；図２ｅ～図２ｇは、それぞれのコーティング剤でコートされた微小流体装置内せん断応力露出後、静的ＨＵＶＥＣｓおよび露出したＨＵＶＣＥｓにおいてインテグリンベータ３、トータルＡｋｔおよびリン酸化Ａｋｔのウェスタンブロット分析結果を示す図である；図２ｈ～図２ｉは、ＰＢＳ（ｖｅｈｉｃｌｅ、ｕｎｃｏａｔｅｄ）、抗ＣＤ３１アプタマー（ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ）および抗ＣＤ３１抗体（Ａｂ－ｃｏａｔｅｄ）でそれぞれコートしたグループにおいてせん断応力に露出したＨＵＶＥＣｓおよび静的ＨＵＶＥＣで切断されたカスパーゼ－３（ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３）発現のウェスタンブロット分析結果を示す図である；図２ｊは、静的ＨＵＶＥＣに正規化された各グループのせん断ＨＵＶＥＣでＮＯＳ３（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ３）発現のｑＲＴ－ＰＣＲ結果を示す図である。 図３ａ～図３ｌは、脱細胞化した肝スキャフォールドのＨＵＶＥＣを使用した効率的な再内皮化結果を示す図である：図３ａは、ＨＵＶＥＣを用いた脱細胞化したラット肝スキャフォールドの再内皮化方法を示す図である；図３ｂは、抗ＣＤ３１アプタマー（ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ）または抗ＣＤ３１抗体（Ａｂ－ｃｏａｔｅｄ）でコートされたスキャフォールドまたは非コートされたスキャフォールドにおいてＣＦＤＡ標識ＨＵＶＥＣを有する内皮血管の代表免疫蛍光イメージを示す図である；図３ｃは、各スキャフォールドの再内皮化血管の内皮範囲を示す図である；図３ｄは、各スキャフォールドの再内皮化血管の平均数を定量した図である；図３ｅは、門脈を介してデキストランの灌流後、各構造物の下大静脈から排出された血管内デキストランの定量結果を示す図である；図３ｆは、ＺＯ－１（Ｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ－１）で染色されたＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ構造物の拡大共焦点イメージを示す図である；図３ｇは、静的ＨＵＶＥＣ、非コートされた、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄおよびＡｂ－ｃｏａｔｅｄ再内皮化構造物においてＶＥ－カドヘリンおよびＣＬＤＮ５（Ｃｌａｕｄｉｎ ５）のｑＲＴ－ＰＣＲ検出結果を示す図である；図３ｈは、レザズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）還元灌流分析を行って、３日、５日および７日にＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬を使用して各構造物の生存力を確認した結果を示す図である；図３ｉは、切断されたカスパーゼ－３（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）で染色された各グループの再内皮化構造物の代表共焦点イメージを示す図である；図３ｊは、各グループで切断されたカスパーゼ－３を発現する細胞を定量した結果を示す図である；図３ｋは、各グループによる再内皮化構造物においてＥＬＩＳＡで定量した生成されたＮＯの量を示す図である；図３ｌは、７日に各グループにやいて再内皮化した構造物から分泌されたヒトＶＥＧＦをＥＬＩＳＡで定量した結果を示す図である。 図４ａ～図４ｇは、再内皮化構造物がヒト血液灌流後に低い血栓を形成することを示す結果である：図４ａは、血栓形成を評価するためにヒトの血液を再内皮化構造に伝達するのに使用される方法を示す図である；図４ｂは、ヒト血液灌流後、各スキャフォールドの肉眼イメージを示す図であり、内皮化しないＤＬＭを陰性対照群として使用した；図４ｃは、インテグリンαIIｂ（緑色）で染色された各グループの収穫された構造物の代表免疫組織化学イメージを示す図である；図４ｄは、インテグリンαIIｂ発現の蛍光強度を定量した図である；図４ｅは、ＤＬＭグループにおける血液灌流液を一定時点に収穫した後、血液分析器を使用して血小板定量化を行った結果を示す図である。図４ｆは、各グループの再内皮化構造物において血液灌流液を一定時点に収穫した後、血液分析器を使用して血小板定量化を行った結果を示す図である；図４ｇは、各グループの血液灌流構造物において血小板凝集に関与する遺伝子であるＣＤ６３、ＰＬＳＣＲ１、ＴＢＸＡＳ１およびＴＨＢＳ１のＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す図である。 図５ａ～図５ｍは、機能性成熟が強化されたＶＢＨＬ構造を確認した結果を示す図である：図５ａは、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＸ２細胞、ＨＵＶＥＣおよびＭＳＣを用いた脱細胞化したラット肝スキャフォールドの再細胞化過程を説明する概略図である；図５ｂは、コートされないＶＢＨＬ構造物（ＣＴＬ－ＶＢＨＬ）または抗ＣＤ３１アプタマー（ＡＰＴ－ＶＢＨＬ）および抗ＣＤ３１抗体（Ａｂ－ＶＢＨＬ）でコートされたＶＢＨＬ構造物の２１日目の代表免疫蛍光イメージである；図５ｃは、各グループ血管の内皮範囲を示す図である；図５ｄは、フィールド当たりの平均内皮血管数を定量化した結果である；図５ｅは、α－ＳＭＡ（赤色）で染色されたＣＴＬ－ＶＢＨＬ、ＡＰＴ－ＶＢＨＬおよびＡｂ－ＶＢＨＬ構造物の代表免疫組織化学イメージである；図５ｆは、デキストラン灌流分析結果を示す図である；図５ｇ～図５ｈは、指定された時点に各グループのＶＢＨＬ構造物からＶＥＧＦおよびＮＯ分泌をＥＬＩＳＡで定量化した結果を示す図である；図５ｉおよび図５ｊは、指定された時点に各グループのＶＢＨＬ構造物から分泌されたアルブミンおよびウレアの量をＥＬＩＳＡで定量化した結果を示す図である；図５ｋは、１７日および２０日にＡＰＴ－ＶＢＨＬ構造物において向上した生存力を示す結果である；図５ｌは、ＴＵＮＥＬ分析の代表共焦点イメージを示す図である；図５ｍは、無作為化したフィールドでＴｄＴ－陽性細胞を定量化した結果を示す図である。 図６ａ～図６ｅは、抗ＣＤ３１アプタマーがコートされたＶＢＨＬ構造物の成功した生体内の再灌流結果を示す図である：図６ａは、ＶＢＨＬ構造物の補助移植写真を示す図であり、腎臓静脈（黄色矢印）は、ＶＢＨＬ構造物の下大静脈に連結され、腎臓動脈（白色矢印）は、構造物の門脈に連結し、血管クランプ（青色矢印）を除去した後、ＶＢＨＬ構造物を生体内腎臓循環システムに再灌流させた；図６ｂは、移植後に収穫された構造物の代表イメージを示す図である；図６ｃは、インテグリンαIIｂ（緑色）で染色された各グループの収穫された構造物の代表共焦点イメージである；図６ｄは、インテグリンαIIｂ発現の蛍光強度を定量した結果を示す図である；図６ｅは、移植後、各ＶＢＨＬ構造物においてＣｄ６３、Ｐｌｓｃｒ１およびＴｈｂｓ１のＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す図である。 図７ａ～図７ｆは、チオアセトアミド（ＴＡＡ）誘発肝線維症にＶＢＨＬ構造物を移植した結果を示す図である：図７ａは、ＶＢＨＬ構造物をＴＡＡ誘導肝硬変ラットに移植する方法の概略図である；図７ｂは、各構造物を移植した後４週目に収穫された宿主肝組織セクションの代表Ｈ＆Ｅ染色イメージおよび肝セクションの代表的なピクロシリウス（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ）赤色染色結果を示す図である；図７ｃは、各グループの宿主肝での線維化程度を定量した結果を示す図である；図７ｄは、各群の宿主肝で表示された線維症関連遺伝子、αＳｍａ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｔｇｆ－ベータ１およびＴｉｍｐ１のｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す図である；図７ｅおよび図７ｆは、ラット血清のうちＡＬＴおよびＡＳＴレベルのＥＬＩＳＡ測定結果を示す図であり、赤色線は、正常範囲を意味する。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、アプタマーを含む人工器官製作用組成物を提供する。

また、本発明は、アプタマーを含む血管コーティング用組成物に関する。

組織工学（ｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）とは、細胞と様々な物質の組み合わせを用いた任意の構造物（鋳型物）に細胞を保持させる方法であり、このような構造物（鋳型物）をスキャフォールドと呼び、これを作る目的は、損傷を受けた組織や器官を代替できる構造物、すなわち器官を作ることにある。種類は、様々なものがあるが、生体構造物（すなわち、臓器）を脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）させて細胞を除去した後、微細構造および臓器の輪郭のみを残した構造物（鋳型物）をバイオスキャフォールドという。

本発明の人工器官は、バイオスキャフォールドにアプタマーを処理し、目的しようとする器官の構造、例えば、血管構造が再建されたことを特徴とするが、これに限定されるものではない。具体的には、本発明のアプタマーは、脱細胞保持体の血管壁にコートされ、血管内皮細胞と特異的に結合することによって、血管構造を再建または生成することができる。

本発明者らは、脱細胞保持体の壁に血管内皮細胞が付着できるように、抗ＣＤ３１アプタマーで脱細胞保持体の血管壁をコートする場合、血管障壁の機能が維持される高機能性の脈管構造が再建されることを確認した（本発明の実施例参照）。

本発明において、前記血管は、脱細胞保持体の血管であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記血管は、肝血管であってもよく、例えば、肝門脈（ｐｏｒｔａｌ ｖｅｉｎ）、肝類洞、肝静脈または肝動脈であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記人工器官は、生体適合性でありうる。本発明の用語「生体適合性」は、「移植適合性」と混用され、細胞移植時に免疫拒否反応を起こさない性質を意味する。免疫拒否反応の原因である遺伝子の発現を減少させることによって、細胞、組織、または器官に移植適合性を持たせることができ、これに関する非制限的例示として、前記ＨＬＡ遺伝子の発現レベルを減少させることによって、細胞、組織または器官に移植適合性を持たせることができる。移植適合性細胞は、免疫適合抗原がホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）であるか、ヌル（ｎｕｌｌ）細胞を含むが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記人工器官は、例えば、肝（ｌｉｖｅｒ）、腎臓、心臓、弁膜、尿管、膀胱、肺臓、膵臓などでありうるが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記人工器官は、血管を含む器官であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、アプタマーとは、目的物質と特異的に結合できる物質であり、それ自体で安定した三次構造を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸）を意味し、特異的に標的タンパク質（物質）と結合することができる。アプタマーの製造は、一般的なアプタマーの製造方法によって、確認しようとする標的物質に対して選択的かつ高い結合力を有するオリゴヌクレオチドの配列を結合して合成した後、オリゴヌクレオチドの５’末端や３’末端をアプタマーチップの官能基に結合することができるように、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－ＯＨまたはＮＨ_２で修飾させることによって行われ得るが、これに限定されない。

本発明において、前記アプタマーは、抗ＣＤ３１アプタマーであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記抗ＣＤ３１アプタマーは、配列番号１で表される塩基配列を含むか、配列番号１で表される塩基配列からなってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記アプタマーは、血管内皮細胞特異的であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。それだけでなく、本発明のアプタマーは、血管内皮細胞のみを標的して血管を再建することに限定されず、臓器の再建時に、肝実質の再建、胆管の再建などに臓器の種類に関係なく用途が拡大することができる。すなわち、肝実質の再建時には、肝実質細胞が特異的に発現するタンパク質と結合するアプタマーを用いることができ、胆管の再建時には、胆管細胞が特異的に発現するタンパク質と結合するアプタマーを用いることができる。

したがって、本発明の前記アプタマーは、目的細胞が特異的に発現するタンパク質に特異的でありうるが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記アプタマーは、インテグリンベータ３およびリン酸化Ａｋｔからなる群から選ばれる１つ以上の発現を増加させることができるが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記アプタマーは、切断されたカスパーゼ－３の発現を減少させることができるが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記組成物は、通常、生理的条件（例えば、３７℃）下で細胞と混和可能な溶液で（例えば、生理的組成物で）組織または臓器マトリックスに伝達され得る。前記組成物は、緩衝液、栄養素（例えば、糖、炭水化物）、酵素、増殖および／または分化培地、サイトカイン、抗体、抑制因子、成長因子、塩類溶液、または血清由来タンパク質などを含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記組成物は、実質細胞をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。本発明において使用された用語「実質細胞」とは、細胞固有の機能を行う主要部分を構成する細胞を意味する。本発明において、前記実質細胞は、具体的には、肝実質細胞、腎臓実質細胞、角膜実質細胞、血管内皮細胞などであってもよく、好ましくは、肝実質細胞、すなわち肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）でありうるが、これに限定されるものではない。本発明において、肝実質（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）細胞は、非病的条件で肝の全体８０％を占める。

本発明において、前記実質細胞は、ドナーと同じ種に由来したものであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記組成物は、幹細胞由来実質細胞をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。前記実質細胞は、ヒト白血球抗原が除去されたおよび／または攻撃無力化シグナルを過発現するヒトの汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）幹細胞から分化した実質細胞であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記組成物は、非実質細胞をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。前記非実質細胞は、肝の内皮細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ，Ｉｔｏ ｃｅｌｌ，ｌｉｐｏｃｙｔｅｓ，ｆａｔ－ｓｔｏｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）、胆管細胞、ｐｉｔ細胞、血管上皮細胞および線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）からなる群から選ばれる１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記組成物は、幹細胞由来非実質細胞をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。前記幹細胞由来非実質細胞は、ヒト白血球抗原が除去されたおよび／または攻撃無力化シグナルを過発現するヒトの汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）幹細胞から分化した非実質細胞であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記細胞は、幹細胞由来分化細胞を含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。

本発明において使用された用語「幹細胞」とは、未分化状態で一定期間にわたって自分と同じ細胞を持続的に作り出すことができる性質と、適当な条件下で特定の細胞に分化する性質を有している細胞を意味する。

本発明において、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）、汎用幹細胞（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＵＳＣ）、骨髄由来幹細胞（Ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、脂肪由来幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）および胎盤由来幹細胞（Ｐｌａｃｅｎｔａ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれる１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記汎用幹細胞は、ＨＬＡが除去されたり、攻撃無力化シグナルを過発現することを特徴とするが、これに限定されるものではない。本発明は、ヒト白血球抗原が除去されたおよび／または「攻撃無力化」シグナル過発現幹細胞由来構成細胞を含む汎用人工臓器を構築することによって、移植時に免疫拒否反応を最小化させて、臨床に適用可能なものと期待される。

本発明において、前記汎用幹細胞は、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩノックアウトｉＰＳＣ細胞またはＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩノックアウトＭＳＣ細胞であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記攻撃無力化シグナルは、ＣＤ４７またはＣＤ２４であってもよいが、これに限定されるものではない。

また、本発明は、アプタマーを処理する段階を含む人工器官の製造方法を提供する。
本発明において、前記人工器官の製造方法は、次の段階を含んでもよいが、これに限定されるものではない：
ａ）個体から器官を提供する段階；
ｂ）前記提供された器官を脱細胞化する段階；および
ｃ）前記脱細胞化した器官にアプタマーを処理する段階。

本発明において、前記方法は、ｄ－１）脱細胞化した器官を血管内皮細胞で再細胞化させる段階；
ｄ－２）脱細胞化した器官を実質細胞で再細胞化させる段階；および
ｄ－３）脱細胞化した器官を非実質細胞で再細胞化させる段階からなる群から選ばれる１つ以上の段階をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記個体は、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウサギなどの各種哺乳動物群の中から選択することができる。

本発明において、前記脱細胞化は、当業界において知られた方法で行われ得るが、本発明の一実施例では、個体から収得した肝の肝門脈を脱イオン水およびＰＢＳで洗浄した後、デオキシリボヌクレアーゼで洗浄した後、過酸化酢酸で滅菌した。例えば、以下の参考文献は、肺、肝、腎臓、脳および四肢の灌流基盤脱細胞化を記述している：Ｖａｎ Ｐｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．，７４（３）：８９３－８；ｄｅｎ Ｂｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．，８：４６６－７１；Ｆｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）， ７７（６）：６５７－６１；Ｍａｚｚｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，９９９（１）：８１－９０；Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ，６（３）：１８３－９１。灌流基盤脱細胞化の代案として、細胞を除去する脱細胞化溶液に浸漬することによって、生物学的組織および臓器を脱細胞化することができ。例えば、米国特許第６，３７６，２４４号および第６，７５３，１８１号を参照されたい。

本発明において、灌流に適合した生理的緩衝液は、移植を含む貯蔵および／または臓器灌流に使用され得る栄養供給物、例えば、ブドウ糖がある緩衝液、ＥＧＭ－２、ＥＧＭ－２ＭＶ、ＤＭＥＭ、プロモセル（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）内皮細胞培地、ミディアム２００（Ｍｅｄｉｕｍ ２００）、ＤＭＥＭＦ／１２を含むが、これに限定されない。また、前記緩衝液は、内皮細胞の培養に適合した培養培地溶液またはリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）を含むが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記脱細胞化時に、灌流の方向（例えば、前行性および逆行性）を交互にすることは、全器官または組織から効果的に細胞を除去することを助けることができる。本明細書に記述されたような脱細胞化は、本質的に器官を内部から細胞を除去して、ＥＣＭにほとんど損傷を引き起こさないが、これに限定されるものではない。器官または組織は、４～４０℃間の適切な温度で細胞を除去することができる。器官または組織のサイズおよび重量および細胞崩壊媒質内の特定の洗剤および洗剤の濃度に応じて、器官または組織は、一般的に固形器官または組織のグラム当たり、約２～約１２時間細胞崩壊媒質に灌流させる。洗浄液を含む器官は、組織のグラム当たり、約１～約１２時間灌流され得る。灌流は、一般的に、拍動性血流、流速および圧力を含む生理学的条件によって調整される、

本発明において、器官または組織を生成させるための再細胞化は、脱細胞化した器官内におよびその上に導入される再生性細胞の数が器官（例えば、どんな器官であるか、およびその器官のサイズおよび重量）または組織および再生性細胞の類型および発育段階全てによって異なっていてもよい。異なる類型の細胞は、これら細胞が到達する個体群密度（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ）に関して異なる傾向を有することができる。同様に、異なる器官または組織は、異なる密度で再細胞化することができる。例えば、脱細胞化した器官または組織は、少なくとも１，０００，１０，０００，１００，０００，１，０００，０００，１０，０００，０００または１００，０００，０００個）の再生性細胞に「接種」されてもよく；または、再細胞化後、約１，０００細胞／組織ｍｇ（湿潤重量、すなわち脱細胞化前の重量）～約１００，０００，０００細胞／組織ｍｇ（湿潤重量）を有していてもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記方法は、アプタマーが処理された器官を生物反応器で１～１００日、１～９０日、１～８０日、１～７０日、１～６０日、１～５０日、１～４０日、１～１ヶ月、１～３週、１～１５日、１～２週、５～１５日、５～２週、１週～３週または約２週間培養させる段階をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。

また、本発明は、前記方法で製造された人工器官を提供する。

前記人工器官は、移植用臓器であり、移植後に授与者の免疫拒否反応を誘発しないものであってもよいが、これに限定されるものではない。

前記人工器官は、治療剤スクリーニング用途に使用されてもよく、好ましくは、肝疾患治療剤スクリーニング用途に使用されてもよいが、これに限定されるものではない。

本願明細書の全体において、任意の部分が或る構成要素を「含む」というとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。本願明細書の全体において使用される程度の用語「約」、「実質的に」などは、言及された意味に固有な製造および物質許容誤差が提示されるとき、その数値でまたはその数値に近接した意味として使用され、本発明の理解を助けるために、正確または絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用するのを防止するために使用される。本願明細書の全体において使用される用語「～（する）段階」または「～の段階」は、「～のための段階」を意味しない。

本願明細書の全体において、マーカッシュ形式の表現に含まれた「これらの組合せ」の用語は、マーカッシュ形式の表現に記載された構成要素からなる群から選ばれる一つ以上の混合または組合せを意味するものであって、前記構成要素からなる群から選ばれる一つ以上を含むことを意味する。

本願明細書の全体において、「Ａおよび／またはＢ」の記載は、「ＡまたはＢ、またはＡおよびＢ」を意味する。

任意の実施例が別に具現可能な場合に、特定の段階は、説明される順序と異なってに行われてもよい。例えば、連続して説明される２つの段階は、実質的に同時に行われてもよく、説明される順序と反対の順序で行われてもよい。

本明細書および請求範囲に使用された用語や単語は、通常的または辞書的意味に限定して解すべきものではなく、発明者は、自分の発明を最も最善の方法で説明するために用語の概念を適切に定義することができるという原則に基づいて本発明の技術的思想に符合する意味や概念で解すべきである。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、ただ本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

実験方法および材料
１．アプタマー準備および分析
配列番号１のｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅを有する抗ＣＤ３１一本鎖ＤＮＡアプタマー（７６ｍｅｒ、２１９６６－１８－０１）をＡｐｔａｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（韓国）で合成し、特性化した。滅菌Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＤＥＰＣ処理水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に抗ＣＤ３１アプタマーを溶解させた後、－２０℃で保管した。実験を行う前に、アプタマーを９５℃で１０分間加熱し、室温で冷却させて、適切なフォールディングを誘導した。抗ＣＤ３１アプタマーがＣＤ３１＋ＥＣを特異的に標的にすることを確認するために、５－末端にｃｙ３で標識されたアプタマー（５’－ｃｙ３－ａｐｔａｍｅｒ－３’）で免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーを行った。

＜抗ＣＤ３１アプタマー＞
５’－ＴＣＡ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＴＴＣ（ｐｒｉｍｅｒ）－Ｇ６Ａ ＧＡＧ ＧＡＧ Ｇ６Ａ ＣＧ６ ＡＡ６ Ｇ６Ｃ ６ＧＧ Ｇ６Ａ ６ＡＣ ＣＣＣ ＧＡ６ ＡＡ６ ６（配列番号１；ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＡＧ（ｐｒｉｍｅｒ）－３’
６＝ＮａｐｄＵ［５－（Ｎ－Ｎａｐｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ］

２．細胞培養
ＡＴＣＣ（米国）から購入したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）およびヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ，ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を内皮成長培地－２（ＥＧＭ－２、スイスロンザ）に維持させた。ソウル大学校機関審査委員会（ＩＲＢ Ｎｏ．１６０８／００１－０２１）の承認下に、ＭＳＣは、Ｄｏｎｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５０（４）（２０１８）３５．に記載のとおり確立された。ＡＴＣＣから購入した肝がん腫細胞（ＨｅｐＧ２細胞）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国）から購入したＬＸ－２ヒト星細胞（ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ）を高グルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）で培養した。すべての培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）および抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（１％Ｐ／Ｓ，Ｇｉｂｃｏ））および２０μｇ／ｍｌプリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＵＳＡ）が補充された。培養培地は、４８時間ごとに交替された。細胞は、５％ＣＯ_２加湿培養器で３７℃に維持させた。

３．微小流体装置設計および細胞分離分析
３Ｄ微細流体システムを使用してコーティング剤による細胞分離速度を評価した。ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ，ＰＤＭＳ，Ｓｙｌｇａｒｄ １８４；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）を使用して、３個のマイクロチャネルを有する装置をソフトリソグラフィおよび複製モールディングで製造した。ＰＤＭＳ塩基と硬化剤（１０：１）の混合物で構成されたＰＤＭＳ予備重合体をシリコンウェハーに注いで硬化させた。次いで、ＰＤＭＳブロックを完全に固化した後、ウェハーから分離した。

生検パンチを使用して入口および出口をパンチングした後、ＰＤＭＳブロックを減圧接着剤ポリカーボネートフィルムに付着させた。追加実験を行う前に、装置を乾燥オーブンに一晩維持して疎水性を回復させ、ＵＶ照射によって滅菌させた。微小流体装置をタイプ１コラーゲン（ラットテール、＃３５４２３６，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）、ビトロネクチン（＃Ａ３１８０４，Ｇｉｂｃｏ）およびフィブロネクチン（＃３５６００８，Ｃｏｒｎｉｎｇ）の混合物１００μｇ／ｍｌでコートした。

その後、装置を下記各コーティング剤でコートした；ＰＢＳ（陰性対照群）、６００ｎＭ抗ＣＤ３１アプタマーおよび５０μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３１抗体、５×１０^５のＨＵＶＥＣを各チャネルにシーディングし、２時間インキュベートした。次いで、流体せん断応力を注入注射器ポンプ（ＰＨＤ ２０００ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ，Ｈａｒｖａｒｄ ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を使用してＨＵＶＥＣの単一層に適用した。変形されたＰｏｉｓｅｕｉｌｌｅ方程式に基づいてせん断応力を計算した（数式１参照）。

［数式１］
Ｔｗ＝６μＱ／ｗＨ^２

（Ｔｗ：せん断応力（ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２）、μ：３７℃での粘度（Ｐｏｉｓｅ）、Ｑ：流量（ｍＬ／ｓ）、ｗ：チャネル幅（ｃｍ）およびＨ：チャネル高さ（ｃｍ））

１％ＦＢＳが補充されたＥＧＭ－２を指示された流速で１０分間チャネルを通過させた。それぞれの流れに対して、流れ後、表面に付着した細胞のイメージを光学顕微鏡（ＩＸ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を使用してキャプチャーし、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して計数した。せん断応力に対する反応によってＨＵＶＥＣの変化を分析するために、せん断応力１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２に３０分間露出後、細胞からＲＮＡおよびタンパク質を抽出した。

４．脱細胞化したラットの肝スキャフォールドの製造
全身ヘパリン注入法（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｈｅｐａｒｉｎｉｚａｔｉｏｎ）後、８週齢の雌スプラーグドーリーラット（２５０－３００ｇ）から天然肝を収得した。肝門脈を２４Ｇカテーテルでカニューレ化し、脱イオン水で０．１％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）で６時間灌流させた後、ＰＢＳで１０時間洗浄した。次いで、スキャフォールドを０．１ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ１（ＤＮａｓｅ １；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間灌流させ、ＰＢＳで２時間洗浄した。スキャフォールドからバイオバーデンを除去するために、０．１％過酸化酢酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で滅菌し、抗生剤を含有するＰＢＳに４℃に保管した。すべてのラット実験は、ソウル大学校の動物管理委員会（ＳＮＵ－１７０１１３－２）の承認を受けた。

５．ラット肝スキャフォールドの再内皮化
滅菌した脱細胞化した肝マトリックススキャフォールドを安定化させるために、ＥＧＭ－２を１時間灌流させた後、これらは、肝門脈を介して下記それぞれのコーティング剤を注入することによって、４℃で１時間コートした：ＰＢＳ、６００ｎＭ抗ＣＤ３１アプタマーおよび５０μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３１抗体（１４－０３１９－８０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）。合計１×１０^７ＨＵＶＥＣをＶｙｂｒａｎｔ ＣＦＤＡ ＳＥ細胞追跡器キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してカルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ）で標識した。

１０％ＦＢＳが補充されたＥＧＭ－２に懸濁されたＣＦＤＡ標識されたＨＵＶＥＣおよび抗生剤を門脈を介して０．５ｍｌ／分の速度で伝達した。２時間静的培養を維持した後、再内皮化構造物を生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）内で連動注入ポンプを使用して培地とともに１．５ｍｌ／分の速度で灌流させた。培養培地は、４８時間ごとに交替し、追加分析のために、サンプルを７日目に収穫した。内皮カバレッジおよび再内皮化血管の数は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって定量化された。

６．脱細胞化したラット肝に肝実質細胞および非実質細胞の伝達
脱細胞化した肝スキャフォールドを製造するとき、胆管を２６Ｇカテーテルでカニューレ化し、門脈を２４Ｇカテーテルでカニューレ化した。脱細胞化後、合計４×１０^７のＨｅｐＧ２細胞を胆管を介して半分でスキャフォールドの実質空間に伝達し、２日間生物反応器内で維持させた。２日後、ＨｅｐＧ２細胞４×１０^７個をさらに実質に伝達し、構造物を１４日まで培養した。

１４日目に、ＣＦＤＡ標識されたＨＵＶＥＣ ６×１０^６個およびＭＳＣの３×１０^６個の混合物を門脈を介して血管ルーメンに伝達し、同時に胆管を介して１×１０^７個のＬＸ２細胞を注射した。すべての細胞を０．５ｍｌ／分の速度で伝達した。静的培養を２時間維持した後、構造物を連動注入ポンプを使用して１．５ｍｌ／分の速度で灌流させた。１４日まで、ＶＢＨＬ構造物は、１０％ＦＢＳおよび抗生剤を有するＤＭＥＭ高グルコース培地で維持された。１４日から２１日まで、培地を１０％ＦＢＳおよび抗生剤を有するＥＧＭ－２に交替した。２１日に収得されたＶＢＨＬ構造物に対して追加分析を行った。

７．統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０を使用して統計分析を行った。すべての値は、平均±標準偏差を使用して報告された。ｐ＜０．０５の値を有意なものと見なした。２つのグループ間の統計分析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ，ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄスチューデントｔ－検定で行った。多重グループ比較のために、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ ｈｏｃテストで双方向ＡＮＯＶＡを行った。提示されたデータは、少なくとも３回の独立的な実験結果を示す。

８．免疫蛍光染色
細胞または組織切片を４％ホルムアルデヒドで１０分間固定させた。次いで、サンプルを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間透過させ、５％ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で１時間遮断した。次いで、サンプルを４℃で一晩中下記の１次抗体でプローブした：ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３１（１４－０３１９－８０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－Ａｌｂｕｍｉｎ（ＧＴＸ１０２４１９，ＧｅｎｅＴｅｘ，ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ａｂ４５９３９，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）、ａｎｔｉ－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｌｐｈａ（ＧＴＸ１０１１７８，ＧｅｎｅＴｅｘ）、ａｎｔｉ－ＺＯ－１（＃４０－２２００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ａｎｔｉ－ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３（＃９６６４，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（＃９２７１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ３（＃１３１６６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ－ＩｎｔｅｇｒｉｎαIIｂ（ｓｃ－３６５９３８，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）およびａｎｔｉ－α－Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（ａｂ７８１４，Ａｂｃａｍ）。蛍光－染料接合された二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識および５４９標識；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１時間適用した。核をＤＡＰＩ（ｓｃ３５９８，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１０分間染色し、細胞を蛍光装着培地（Ｓ３０２３８０，ＤＡＫＯ、デンマーク）に装着した。染色されたシグナルは、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ ２０００共焦点レーザースキャニング顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）により可視化された。同様に、パラフィン包埋組織セクションからパラフィンを除去し、水和させ、４％ホルムアルデヒドで固定した後、上記のとおり染色した。

９．フローサイトメトリー
濃度依存的方式で抗ＣＤ３１アプタマーの結合動力学を推定するために、ＨＵＶＥＣを１ｍＭのＭｇＣｌ_２および２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンで構成された反応緩衝液で異なる濃度のｃｙ５標識抗ＣＤ３１アプタマーと４℃で２０分間培養した。抗ＣＤ３１アプタマーの特異性を検査するために、ＨｅｐＧ２細胞およびＭＳＣを比較した。細胞を１ｍｌの反応緩衝液で洗浄し、ＰＢＳに懸濁させ、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）で分析した。ＰＥコンジュゲートされた抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ５５５４４６，ＢＤバイオサイエンス）を陽性対照群として使用した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＵＳＡ）を使用してデータを分析した。

１０．細胞付着能の分析
ラットの腹部大動脈を収穫し、脱細胞化のために撹拌した０．０５％ＳＤＳに浸漬させた。脱細胞化した動脈スキャフォールドを縦方向に切断し、内部構造を露出させ、０．１％過酸化酢酸で滅菌した。その後、スキャフォールドをコーティング剤に２時間浸漬させた；ＰＢＳ（陰性対照群）、６００ｎＭ抗ＣＤ３１アプタマーおよび５０μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ３１抗体（１４－０３１９－８０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、陽性対照群）。次いで、コートされたスキャフォールドを２４個のウェルプレートに移し、１×１０^６個のＨＵＶＥＣを動脈スキャフォールドの内部表面にシーディングした。指示された時点（２時間および４時間）で静的培養を維持した後、細胞が分注されたスキャフォールドをＰＢＳで洗浄し、新しいプレートに移した。スキャフォールドは、テトラゾリウム基盤ＭＴＴ分析を行って、生存細胞の数を定量化した。ＭＴＴ分析のために、サンプルを１０％のＭＴＴストック溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する培地で３７℃で４時間維持させた。次いで、上清液を除去し、ジメチルスルホキシドをパープルホルマザンの可溶化のために各ウェルに添加した。波長５４０ｎｍにおける吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して測定した。

１１．ｑＲＴ－ＰＣＲ
ＮｕｃｌｅｏＺＯＬ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して細胞または操作された作製物からトータルＲＮＡを抽出した。その後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出したＲＮＡから相補的ＤＮＡを合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＩ ７３００ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）で行った。標的ｍＲＮＡ発現レベルの相対的な定量は、２（ΔΔ^{ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ}）（２－^ΔΔＣＴ）方法によって決定された。各遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子発現で標準化した。使用されたプライマー配列を表１に示した。

１２．ウェスタンブロット
ＰＲＯ－ＰＲＥＰ（ｉＮｔＲｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、韓国）を使用してタンパク質を抽出し、全細胞溶解物を超音波処理した。組織サンプルからタンパク質を抽出するために、組織を鋼鉄ビーズおよびＰＲＯ－ＰＲＥＰで均質化した後、超音波処理した。遠心分離後、上清液を新しいチューブに移し、分析した。ＤＣ分析キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を定量化した。同量のタンパク質（１０μｇ）を８～１５％アクリルアミドトリス－グリシンゲルにローディングした。目的タンパク質を次の一次抗体でプローブした；ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ（ＡＢ２３０２，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ３（＃１３１６６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ－Ａｋｔ（＃４６９１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（＃９２７１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ－ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３（＃９６６４，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｎｔｉ－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｌｐｈａ（ＧＴＸ１０１１７８，ＧｅｎｅＴｅｘ）、ａｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ａｂ２４１３，Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－ＣｏｌｌａｇｅｎIV（ａｂ１９８０８，Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－Ｌａｍｉｎｉｎ（ａｂ１１５７５，Ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－ＣＫ１８（ＭＡＢ３２３４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ａｎｔｉ－ＣＹＰ２Ｅ１（ＣＳＢ－ＰＡ００６４２５ＥＡ０１ＨＵ，ＣＵＳＡＢＩＯ，Ｃｈｉｎａ）およびａｎｔｉ－ＡＦＰ（Ａ０００８，ＤＡＫＯ）。４℃で１次抗体とともに一晩中インキュベートした後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を適用した。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）でプローブした後、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ＨＤ２（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ．，ＵＳＡ）により特定タンパク質バンドを導き出した。

１３．組織検査
サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、４℃で一晩中４％パラホルムアルデヒドに固定させた。組織をパラフィン包埋し、１０μｍの厚さに連続的に切断した。組織セクションの脱パラフィン化後、水和のために１００％～７０％の範囲の降順で一連のエタノールを使用した。次いで、組織スライスをＨ＆Ｅおよびピクロシリウスレッド溶液（０．１％ダイレクトレッド８０および０．１％ファーストグリーンＦＣＦ）で染色した。すべての試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＰＡＳ染色は、ＰＡＳ染色キット（ａｂ１５０６８０，Ａｂｃａｍ）を使用して行った。染色後、セクションを水道水で洗浄し、一連の昇順濃度のエタノールを使用して脱水させ、装着した。Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアおよび光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で視覚化し、線維化の定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで行った。

１４．レザズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）減少灌流の分析
無毒性レザズリン系溶液であるＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａ１３２６１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造社のガイドによって使用した。ＨＵＶＥＣに対する標準曲線を描くために、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１および２百万個の細胞を６個のウェルプレートにシーディングした。６時間培養した後、細胞を洗浄し、培地を完全なＥＧＭ－２（１：２０比）と混合された２ｍｌのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬に代替した。３７℃で培養１時間後、培地を回収した後、マイクロプレートリーダーを使用して波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準曲線に相当して、操作された構造物に３０ｍｌのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ－中間混合物を３７℃で１時間灌流させた。収穫した培地は、前述したとおり分析した。

１５．ＦＩＴＣ－接合デキストラン灌流の分析
操作された組織で再内皮化血管の透過性を評価するために、門脈を介した５００ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（ＦＤ５００Ｓ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の灌流を用いた。ＦＩＴＣ－デキストラン（０．２ｍｇ／ｍＬ）２５ｍＬを２０ｍｍＨｇで投与した。下大静脈から排出された流体のデキストランは、血管内デキストランと見なされるが、末梢の血液は、血管他デキストランと見なした。全デキストランの量は、排出された流体の量に乗算した蛍光強度（４９０ｎｍにおける吸光度）で測定した。

１６．ＴＵＮＥＬアッセイ
操作された構造物から細胞死した細胞を検出するために、ＡｐｏｐＴａｇ Ｒｅｄ Ｉｎ ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。組織セクションをパラフィン除去し、タンパク質分解酵素Ｋで消化させた。平衡緩衝液をセクションに適用した後、３７℃インキュベーターで１時間ＴｄＴ酵素でプローブした。停止／洗浄緩衝剤で洗浄した後、抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ローダミン－接合）をセクションに適用した。次いで、これらのセクションをＰＢＳで洗浄した後、核をＤＡＰＩで染色した。共焦点顕微鏡でＴＵＮＥＬ陽性細胞を検出した。

１７．分泌されたＮＯおよびＶＥＧＦの定量
生物工学構造物から分泌されたＮＯの濃度は、ＮＯ Ｐｌｕｓ検出キット（ｉＮｔＲＯＮ）を使用して測定した。調節された培地を指示された時点に回収し、細胞破片を遠心分離により除去した。その後、コンディショニングされた培地の上清液から製造社の指示によってＮＯを測定した。波長５４０ｎｍにおける吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して測定された。構造物は、成長因子なしでＥＢＭ－２（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ－２）で培養され、ヒトＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（ＤＶＥ００，Ｒ＆Ｄシステム、米国）に露出した。１２時間後に、それぞれの操作された構造物から調節された培地のＶＥＧＦ定量のために上清液を収得した。波長４５０ｎｍにおける吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して測定した。

１８．生体外（Ｅｘ ｖｉｖｏ）ヒト血液灌流の分析
１×１０^７のＨＵＶＥＣでさらに満たされたスキャフォールドは、ヒト血液との灌流前に７日間１０％ＦＢＳおよび抗生剤が補充されたＥＧＭ－２で維持された。韓国赤十字中央血液センターから得られたヘパリン処理されたヒト血液を培養培地（１：１）と混合し、各スキャフォールドの門脈を介して灌流させた。指示された時点に、血液灌流液を収集し、灌流液内血小板の数をＡｄｖｉａ ２１２０ｉ血液学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｉｎｅｅｒｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して計数した。灌流２４時間後、サンプルをＰＢＳで洗浄し、スキャフォールド内で血栓発生程度を評価するために、遺伝子発現分析および免疫染色を行った。抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、血栓形成遺伝子を標的にするプライマーを用いてＰＣＲで増幅させた。また、免疫蛍光染色法に記載の手続きに従ってパラフィン包埋組織ブロックを切片化し、インテグリンαIIｂで染色した。

１９．アルブミン／ウレアＥＬＩＳＡ分析
調節された培地で構造物から分泌されたアルブミンタンパク質の量は、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡキット（ａｂ１０８７８８，Ａｂｃａｍ）を使用して決定した。ＶＢＨＬ構造物からコンディショニングした培地を指示された時点に収穫した。遠心分離後、上清液のうち分泌されたアルブミンの濃度を製造社の勧告によってＥＬＩＳＡを使用して定量化した。波長４５０ｎｍにおける吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して測定された。また、調節された培地で収集された上清液から分泌されたウレアの量を測定した。ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ Ｕｒｅａ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用して、ウレアの濃度を波長５２０ｎｍで吸光度を測定することによって定量化した。

２０．血管化した肝構造物の生体内の再灌流
まず、次のようなカテーテル挿入で脱細胞化した肝構造物を製造した：２２Ｇカテーテル－門脈、２６Ｇカテーテル－胆管および２０Ｇカテーテル－下大静脈。ＶＢＨＬ構造物は、実験方法６．に記載のとおり製造された。ＶＢＨＬ構造物は、生物反応器内で２１日間維持された後、多様なサイズのカテーテルによって宿主腎臓循環系に直接連結された。前記手続きのために、１歳の健康なラットを麻酔して左腎臓を露出させた。腎臓動脈と静脈を固定させた後、２４Ｇカテーテル各々でカテーテルを挿入した。構造物の門脈および下大静脈に配置されたカテーテルは、腎臓動脈および静脈に配置されたカテーテルにそれぞれ連結された。それぞれの連結部分をＶｅｔｂｏｎｄ接着剤（３Ｍ，ＵＳＡ）で固定させた。血管クランプを除去した後、生体内で２時間血液を灌流させた。その後、収穫した肝構造物を追加分析を行った。

２１．ＴＡＡ－誘導慢性肝の損傷ラットモデルおよびＶＢＨＬ構造物の移植
ＶＢＨＬ構造物の生体内機能を評価するために、４週齢の雌ラットで慢性肝の損傷を誘導した。飲水を含有する０．３ｇ／ＬのＴＡＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１２週間ラットに持続的に投与した後、誘導性肝線維症を分析した。ラット血清におけるＡＬＴおよびＡＳＴレベルは、ＡＬＴ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｋ７５２－１００，Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｃｈｉｎａ）およびＡＳＴ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｋ７５３－１００，Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して測定した。８週間ラットで肝硬変を誘導した後、ラットの開腹術を行って、肝を露出させた。次いで、各グループのＶＢＨＬ構造物から繊維質カプセルを除去した後、宿主肝の中央葉と右横葉との間に移植し、固定させた。ＶＢＨＬ構造物は、脱細胞化したラット肝を用いて実験方法６．パートに記載のとおり製造された。４週後、肝構造物が移植された宿主の肝をさらに収穫し、追加分析を行った。一方、手術前および後に血清サンプルを収得した。

実施例１．抗ＣＤ３１アプタマーの特性の検証
図１ａのように、ＣＤ３１タンパク質に特異的に結合できる抗ＣＤ３１アプタマーの製作後、フローサイトメーターを用いてＣＤ３１を発現する細胞とアプタマー間の結合力を検証した。

その結果、図１ｂおよび図１ｃに示されたように、６００ｎＭ、８００ｎＭのアプタマーは、約９９％の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と結合することができ、ＣＤ３１を発現しないＨｅｐＧ２とＭＳＣは、約２％程度の細胞と結合した。また、アプタマー濃度に応じた血管内皮細胞との結合力を定量したとき、６００ｎＭのアプタマーでその結合力が飽和されるので、６００ｎＭでアプタマー濃度条件を最適化した。

また、図１ｅ～図１ｇに示されたように、細胞免疫染色法を用いて６００ｎＭのアプタマーがＨＵＶＥＣと結合するが、ＨｅｐＧ２とＭＳＣと結合しないことを確認した。上記結果を基に抗ＣＤ３１アプタマーがＣＤ３１特異的に結合することを検証した。

実施例２．アプタマー処理時に血管内皮細胞の付着能の評価および血管内皮細胞への影響の確認
図２ａに示されたように、微小流体装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）内を細胞外基質（ＥＣＭ）成分でコートした後、抗ＣＤ３１アプタマー（ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ）と抗ＣＤ３１抗体（Ａｂ－ｃｏａｔｅｄ、陽性対照群）をそれぞれコートし、ＨＵＶＥＣを注入した後、一定の速度で液体を流しながら細胞の付着能を評価した。

その結果、図２ｂおよび図２ｃに示されたように、コーティングをしない群に比べて、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群では、１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２のせん断応力（ｓｈｅｅｒ ｓｔｒｅｓｓ）を加えたとき、８０％以上の細胞が強く付着しており、２０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２の強いせん断応力を加えたときにも、６１．５％の高い付着能を示した。陽性対照群であるＡｂ－ｃｏａｔｅｄ群の場合、２０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２のせん断応力で処理時に、５１％の付着能を示した。これによって、抗ＣＤ３１アプタマーが、抗ＣＤ３１抗体に比べて、さらに高い効率で血管内皮細胞の付着能を増進させることを示す。

また、各コーティング剤によるＨＵＶＥＣの付着能の差異を媒介する機序を調べてみるために、微小流体装置内細胞からＲＮＡを抽出して、ｍＲＮＡ発現パターンを分析した。

インテグリンタンパク質は、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ，ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎで構成され、ｅｘｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎが細胞外基質と結合すると、細胞内にシグナルが伝達されて、多様なシグナル伝達体系を活性化させることが知られている。これによって、せん断応力によるインテグリンタンパク質の活性化の有無を確認した。

その結果、図２ｅ～図２ｇに示されたように、実際にアプタマーがコートされた微小流体装置内で１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ^２のせん断応力を受けたＨＵＶＥＣでは、インテグリンだけでなく、下位シグナル伝達体系であるＡｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇまで活性化したことを確認した。Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇは、血管内皮細胞で細胞の生存および血管形成能と関連があると報告されている。これによって、図２ｉに示されたように、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群において細胞死マーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３の発現が減少することをまた確認した。

実施例３．脱細胞保持体内血管内皮細胞の再細胞化を介した血管構造再建時におけるアプタマーの効能の検証
図３ａのように、ラット肝から脱細胞保持体を製作した後、コーティング剤を用いて血管内壁をコートした。ＣＦＤＡ（緑色）で標識されたＨＵＶＥＣを再細胞化した後、７日間培養し、再建された各血管構造を確認した。

その結果、図３ｂに示されたように、抗ＣＤ３１アプタマーをコーティング剤で処理した保持体内では、血管内皮化が十分に行われたことを確認した。

また、図３ｃおよび図３ｄに示されたように、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群において１つの血管当たり約８０％の内皮化が行われ、保持体内で約８０％の血管内皮化が行われることを確認した。これによって、コーティングをしないｕｎｃｏａｔｅｄ群に比べて、アプタマーを処理した群において内皮化効率が最大化されたことを確認した。

また、図３ｅに示されたように、再建された血管の障壁機能を評価するために、門脈カテーテルを介してデキストランを注入したとき、血管外に漏れない血管内デキストラン（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｘｔｒａｎ）の量がＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群において大きく増加することを確認した。したがって、抗ＣＤ３１アプタマーをコーティング剤で処理する場合、脱細胞保持体内障壁機能が良好に維持される高機能性の血管構造が効率的に再建されることを検証した。

これに加えて、体外培養時に培養する細胞の生存率は、再建される人工臓器の機能性に大きく影響を及ぼすことができるので、免疫染色法を用いて培養された細胞の細胞死程度を分析した。

その結果、図３ｉおよび図３ｊに示されたように、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群においてコーティングをしないか、抗ＣＤ３１抗体をコートした群に比べて、細胞死が減少していた。

その後、再建された血管化臓器の血管特異的な機能性を検証するために、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）を施行した。

その結果、図３ｋおよび図３ｌに示されたように、ＨＵＶＥＣが再細胞化された保持体から分泌されるＮＯ（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）とＶＥＧＦの量を分析したとき、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群においてＮＯとＶＥＧＦの分泌量が他の群に比べて大きく増加していることを確認した。

総合的に、抗ＣＤ３１アプタマーをコーティング剤として使用した場合、血管再建効率および障壁機能が増加するだけでなく、血管のｖｉａｂｉｌｉｔｙおよび血管形成能（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）も増進されることを検証した。

実施例４．生体外のヒト血液灌流を介した保持体内血栓形成の評価
図４ａのように、血管の再建程度を綿密に検証するために、ヒトの血液をＨＵＶＥＣが再細胞化した後７日間培養した保持体内に灌流させて、血栓形成程度を生体外で評価した。前記分析法によって、実際にヒトに人工臓器が移植されたとき、血栓が形成される程度を間接的に評価することができた。
その結果、図４ｂに示されたように、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群において目視で血栓形成が減少していた。それだけでなく、図４ｃおよび図４ｄに示されたように、免疫染色を通じてＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群において血栓マーカーであるｉｎｔｅｇｒｉｎ αIIｂの発現が減少していることを確認した。

また、図４ｅおよび図４ｆに示されたように、灌流液で血小板の個数を定量したとき、再内皮化しない脱細胞化した肝マトリックス（Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｖｅｒ ｍａｔｒｉｘ，ＤＬＭ）群では、保持体内凝固現象によって灌流４時間後に灌流液に残存する血小板の個数が２０％未満に減少したが、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群では、血液灌流２４時間後にも約６０％の血小板が残存していることを確認した。

それだけでなく、図４ｇに示されたように、ＡＰＴ－ｃｏａｔｅｄ群において血小板凝固に関連したマーカー（ＣＤ６３、ＰＬＳＣＲ１、ＴＢＸＡＳ１およびＴＨＢＳ１）の発現が減少していた。

前記結果に基にして、アプタマーコーティング時に、より効率的な血管内皮化を通じて灌流可能な血管の形成が可能となり、血液灌流時に血栓形成を最小化することを検証した。

実施例５．アプタマーを用いた血管化人工肝の製作および機能性の評価
アプタマーを活用して血管構造が再建された人工肝（Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ；ＶＢＨＬ）を再建するために、次のように脱細胞保持体内肝実質細胞（ＨｅｐＧ２）と肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ，ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などを図５ａのような方法で培養した。

その結果、図５ｂ～図５ｄに示されたように、アプタマーをコートした後、血管内皮化を行った人工肝組織（ＡＰＴ－ＶＢＨＬ）では、９０％以上の血管内皮化が行われると同時に、肝実質部分も良好に再建されたことをアルブミン免疫染色法を用いて確認した。

また、図５ｅに示されたように、ａＳＭＡ免疫染色法を用いてアプタマー処理時にｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌがｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎに良好に生着していることを確認した。一方、コートをしないか、抗体を処理した群では、ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎが発達していないことを観察した。

また、図５ｆに示されたように、肝門脈を介してデキストランを流し、血管内デキストランを定量化したとき、ＡＰＴ－ＶＢＨＬ群において大きく増加していることを確認した。これによって、肝組織の血管障壁機能が維持されていることを確認した。

したがって、アプタマー処理時に、血管内皮化だけでなく、血管壁を構成するｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎまで再建することによって、障壁機能を良好に維持する高機能性の血管を収得することができた。

これに加えて、ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙを用いて人工肝組織内細胞死程度を定量化した。

その結果、図５ｌに示されたように、ＡＰＴ－ＶＢＨＬ群において最も少ない細胞死を示し、これは、人工肝の機能性と連結される。

これに加えて、血管特異的機能性を確認するために、ＮＯ生産量と人工肝から分泌されるＶＥＧＦ量を測定した。

その結果、図５ｇおよび図５ｈに示されたように、ＡＰＴ－ＶＢＨＬ群が、他の群に比べて優れた機能性を示した。

また、肝特異的機能性を確認するために、人工肝から分泌されるＡｌｂｕｍｉｎとＵｒｅａ成分を定量するＥＬＩＳＡを施行した。

その結果、図５ｉおよび図５ｊに示されたように、培養２１日目に分泌されるアルブミンとウレアの量も、ＡＰＴ－ＶＢＨＬ群において最も高いことを確認した。特に、肝の機能性は、血管を再建した後から差異を示したので、アプタマーコーティングを介した高機能性の血管再建が人工肝組織の全般的な機能性の維持に重要な役割を行うことが分かる。

実施例６．アプタマーを処理した血管化人工肝の生体内血栓形成の評価
図６ａのように、人工肝の肝門脈と下大静脈をそれぞれラットの腎動脈と腎静脈と連結して、生体内で血液を灌流させることによって、血管化人工肝の生体内血栓形成程度を評価した。具体的には、腎臓静脈（黄色矢印）は、ＶＢＨＬ構造物の下大静脈に連結され、腎臓動脈（白色矢印）は、構造物の門脈に連結、血管クランプ（青色矢印）を除去した後、ＶＢＨＬ構造物を生体内腎臓循環システムに再灌流させた。

その結果、図６ｂに示されたように、アプタマーを処理した人工肝では、目視で血栓形成が観察されなかった。

また、図６ｃおよび図６ｄに示されたように、血栓マーカーであるｉｎｔｅｇｒｉｎ αIIｂの発現も減少していることを確認した。

それだけでなく、図６ｅに示されたように、血液凝固に関連したｍＲＮＡマーカー（Ｃｄ６３、Ｐｌｓｃｒ１、Ｔｈｂｓ１）の発現を分析したとき、ＡＰＴ－ＶＢＨＬ群において血液凝固関連マーカーの発現が最も減少していた。

したがって、前記結果を基にアプタマー処理を通じて生体内で血栓形成を最小化できる人工肝培養に成功したことを検証した。

したがって、本発明のアプタマーコーティング剤を用いる場合、人工肝の移植後に発生しうる最も大きい副作用を最小化して、人工肝移植の成功率を高めることができることが期待される。

実施例７．アプタマーを処理した血管化人工肝の生体内肝機能性の評価
図７ａのように、チオアセトアミド（ＴＡＡ）を用いて肝線維化を誘発したラットモデルに血管化人工肝を移植して、生体内における肝特異的機能性を評価した。ＴＡＡ誘導８週後、ラットは、脱細胞化した肝マトリックス（ＤＬＭ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）またはＶＢＨＬ構造物（ＣＴＬ－ＶＢＨＬ；ＣＴＬ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、ＡＰＴ－ＶＢＨＬ；ＡＰＴ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、Ａｂ－ＶＢＨＬ；Ａｂ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）の異種性（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）移植を受けた。

具体的な実験群は、次の通りである：
１）Ｓｈａｍ
２）ＤＬＭ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ；細胞を入れない脱細胞保持体単独で移植
３）ＣＴＬ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ；コートをせずに再建した人工肝を移植
４）ＡＰＴ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ；抗ＣＤ３１アプタマーをコーティング剤で処理した人工肝を移植
５）Ａｂ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ；抗ＣＤ３１抗体をコーティング剤で処理した人工肝を移植

４週後、ドナーラットの肝をサンプリングしてＨ＆Ｅ組織染色とピクロシリウス（Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ）レッド組織染色（赤色：コラーゲン、緑色：細胞の細胞質）を行った。

その結果、図７ｂおよび図７ｃに示されたように、脱細胞保持体および人工肝を移植したとき、肝の好酸性変化および線維化程度がｓｈａｍ群に比べて減少した。その中でも、アプタマーを処理した人工肝を移植したとき、肝の線維化程度が最も多く減少していることを確認した。

また、図７ｄに示されたように、授与者の肝で発現するｍＲＮＡを分析したとき、線維化と関連があるマーカー（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（Ｓｍａ）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｔｇｆ－ｂｅｔａ１、Ｔｉｍｐ１）の発現がＡＰＴ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ群において明確に減少していることを確認した。

また、図７ｅおよび図７ｆに示されたように、ラットの血清レベルで肝の損傷指標であるＡＬＴ、ＡＳＴレベルを確認したとき、ＡＰＴ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ群では、手術後に血清ＡＬＴ、ＡＳＴレベルが正常レベル（赤色線の間）に維持されることを確認した。

したがって、本発明のアプタマーを処理した人工肝は、向上した肝特異的機能性が生体内で維持され、これは、ドナーの損傷した肝機能を補助することを示す。

このように、本発明者らは、アプタマーを人工臓器に適用できることを最初に確認した。

前記結果から、アプタマーを脱細胞保持体のコーティング剤として用いるとき、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－Ａｋｔシグナル伝達体系を介して血管の付着能および生存能、血管形成能などを増進させて、従来の研究で使用する抗ＣＤ３１抗体より効率的な脈管構造の再建が可能である。したがって、本発明を用いて製作された血管化された人工肝は、生体内で血栓形成を減少させるだけでなく、肝機能性を増進させる効果を示す。また、これは、組織工学的観点から人工肝の肝疾患治療剤としての適用可能性を提示する結果である。

上述した本発明の説明は、例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。

本発明のアプタマーを脱細胞保持体のコーティング剤として用いるとき、血管の付着能、生存能および血管形成能などを増進させて、従来の抗体より効率的な脈管構造の再建が可能である。したがって、アプタマーを用いて製作された血管化された人工肝は、生体内で血栓形成が減少するだけでなく、肝機能性を増進させる効果を示すところ、本発明のアプタマーを使用して製作した人工臓器を用いた疾患治療方法としての応用が期待されるので、産業上の利用可能性がある。

Claims (20)

1. アプタマーを含む人工器官製作用組成物。
2. 前記組成物は、実質細胞および非実質細胞からなる群から選ばれる１つ以上の細胞をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記細胞は、幹細胞由来分化細胞を含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
4. 前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）、汎用幹細胞（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＵＳＣ）、骨髄由来幹細胞（Ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、脂肪由来幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）および胎盤由来幹細胞（Ｐｌａｃｅｎｔａ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれる１つ以上であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
5. 前記汎用幹細胞は、下記の特徴を１つ以上有することを特徴とする請求項４に記載の組成物：
   ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）遺伝子が除去される；および
   攻撃無力化シグナルが過発現する。
6. 前記アプタマーは、抗ＣＤ３１アプタマーであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
7. アプタマーを含む血管コーティング用組成物。
8. 前記アプタマーは、抗ＣＤ３１アプタマーであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
9. 前記アプタマーは、配列番号１で表される塩基配列を含むことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
10. 前記アプタマーは、インテグリンベータ３およびリン酸化Ａｋｔからなる群から選ばれる１つ以上の発現を増加させることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
11. 前記アプタマーは、切断されたカスパーゼ－３の発現を減少させることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
12. アプタマーを処理する段階を含む人工器官の製造方法。
13. 前記製造方法は、下記段階を含むことを特徴とする請求項１２に記載の製造方法：
    ａ）個体から器官を提供する段階；
    ｂ）前記提供された器官を脱細胞化する段階；および
    ｃ）前記脱細胞化した器官にアプタマーを処理する段階。
14. 前記製造方法は、下記段階からなる群から選ばれる１つ以上の段階をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の製造方法：
    ｄ－１）脱細胞化した器官を血管内皮細胞で再細胞化させる段階；
    ｄ－２）脱細胞化した器官を実質細胞で再細胞化させる段階；および
    ｄ－３）脱細胞化した器官を非実質細胞で再細胞化させる段階。
15. 請求項１２に記載の方法で製造された人工器官。
16. 前記人工器官は、生体適合性であることを特徴とする請求項１５に記載の人工器官。
17. 前記器官は、肝であることを特徴とする請求項１５に記載の人工器官。
18. アプタマーを含む組成物の人工器官製作用途。
19. アプタマーを含む組成物を処理する段階を含む血管コーティング方法。
20. アプタマーを含む組成物の血管コーティング用途。