JP2018174811A - 解析方法および解析システム - Google Patents

Abstract

【課題】測定の精度を向上させる。
【解決手段】複数のウェル１２が配列された基体部１１を有する解析デバイス１０を用いて生化学的反応を検出するための解析方法は、ウェル１２に生化学的反応のための試料および試薬を充填して生化学的反応を行い、基体部１１の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得し、画像に基づいて、撮影範囲に含まれるウェル１２の総数に対する、生化学的反応によってシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合を算出し、割合に応じて、基体部１１を撮影する撮影枚数の全数を決定し、撮影枚数の全数が１枚よりも多い場合には、基体部１１を撮影枚数の全数に至るまでに必要な枚数撮影し、基体部１１の撮影により取得した全ての画像に基づいて、試料を解析する。
【選択図】図１

Description

本発明は、解析方法および解析システムに関する。

従来、疾患や体質の診断を、生体分子を解析することによって行うことが知られている。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析による体質診断や、体細胞変異解析による抗がん剤の投与判断、ウィルスのタンパク質やＤＮＡの解析による感染症対策などが知られている。

また、がんの治療薬では、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害薬）の投与前後で変異型ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）のコピー数を定量することで、治療効果の指標とできることが示唆されている。従来はリアルタイムＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いた定量が行われていたが、検査に使用された核酸の総量が変化することが定量性に影響を与えることが明らかになっている。このため、今日では核酸の総量が定量性に影響しないデジタルＰＣＲが開発されている。

デジタルＰＣＲでは、次のようにして試料中の核酸を定量する。まず、ＰＣＲ反応試薬と核酸との混合物を多数の微小液滴に分割する。これらの微小液滴に対して、混合物中の核酸のうち検出対象となる核酸を鋳型とするＰＣＲ増幅を行い、鋳型核酸を含んだ微小液滴からＰＣＲ増幅による蛍光などのシグナルを検出する。そして、微小液滴の全数のうちシグナルが検出された微小液滴の割合を求めることによって、試料中の核酸を定量する。例えば特許文献１や非特許文献１には、微少量の容積を有するウェルまたはチャンバー内で酵素反応を行うことで、デジタルＰＣＲを利用して生体物質検査を行うことが記載されている。

デジタルＰＣＲに使用される微小液滴の作製方法として、試薬と核酸との混合物を封止液で分断することで微小液滴を作製する方法や、基板上に孔を空けた中に試薬と核酸との混合物を入れた後に封止液で孔を封止することで微小液滴を作製する方法などが知られている。また、特許文献２には、少量の試薬で大量の実験データを短時間で獲得するためにマイクロチャンバー内でエマルジョン（液滴）を製造する方法が記載されている。

デジタルＰＣＲでは、ＰＣＲ反応試薬と核酸との混合物は、１つの微小液滴に存在する鋳型核酸が１個または０個となるように希釈されている。また、デジタルＰＣＲでは、核酸増幅の感度を高めるために、また多数の微小液滴に対して同時に核酸増幅を行うために、各微小液滴の体積は小さいほうが好ましい。例えば非特許文献１には、各チャンバーの容積が６ｎｌとなるように形成されたマイクロアレイ状の反応容器が記載されている。また、非特許文献２には、深さ３μｍおよび直径５μｍのマイクロウェルが流路内に多数形成されたマイクロアレイに対して流路に試料を流して各マイクロウェルに試料を導入した後、流路内の余剰試薬を封止液で押し出すことによって、各マイクロウェル内に試料を導入する方法が記載されている。

また、例えば特許文献３には、微小空間内でインベーダー反応を行うことで遺伝子の一塩基の違いを検出する方法が記載されている。

特表２００３−５１１００９号公報 特許第４９１１５９２号公報 国際公開第２０１５／１１５６３５号公報

「ＰＬＯＳ ＯＮＥ」、２００８年、第３巻、第８号、ｅ２８７６ 「Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ」、２０１２年、第１２号、ｐ．４９８６−４９９１

特許文献１には、多数の微小空間のうちいくつが光ったかによって測定対象のオリゴヌクレオチドの濃度を算出することが記載されている。しかしながら、測定対象が低濃度の場合や高濃度の場合には精度の高い測定が難しい。

本発明は、上述した事情に鑑みたものであって、測定の精度を向上させることが可能な解析方法および解析システムを提供することを目的とする。

本発明の第一の態様は、複数のウェルが配列された基体部を有する解析デバイスを用いて生化学的反応を検出するための解析方法であって、前記ウェルに前記生化学的反応のための試料および試薬を充填して前記生化学的反応を行い、前記基体部の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得し、前記画像に基づいて、前記撮影範囲に含まれる前記ウェルの総数に対する、前記生化学的反応によってシグナル増幅が行われた前記ウェルの数の割合を算出し、前記割合に応じて、前記基体部を撮影する撮影枚数の全数を決定し、前記撮影枚数の全数が１枚よりも多い場合には、前記基体部を前記撮影枚数の全数に至るまでに必要な枚数撮影し、前記基体部の撮影により取得した全ての画像に基づいて、前記試料を解析する解析方法である。

上記の解析方法において、前記割合が６０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも２枚であってもよい。

上記の解析方法において、前記割合が７０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも３枚であってもよい。

上記の解析方法において、前記割合が８０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも５枚であってもよい。

上記の解析方法において、前記割合が９０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも１０枚であってもよい。

上記の解析方法において、前記割合が１％以下である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも３枚であってもよい。

上記の解析方法において、前記割合が０．１％以下である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも５枚であってもよい。

上記の解析方法において、前記割合が０．０１％以下である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも１０枚であってもよい。

本発明の第二の態様は、生化学的反応を検出するための解析システムであって、複数のウェルが配列された基体部を有する解析デバイスと、前記基体部を撮影可能な撮影部を有し、前記生化学的反応を検出可能な検出機と、算出部および判断部を有し、前記検出機を制御する制御装置と、を備える解析システムである。前記制御装置は、前記撮影部を、前記基体部の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得するように制御し、前記算出部を、前記画像の撮影範囲に含まれる前記ウェルの総数に対する、前記生化学的反応によってシグナル増幅が行われた前記ウェルの数の割合を算出するように制御し、前記判断部を、前記割合に応じて、前記基体部を撮影する撮影枚数の全数を決定するように制御する。

上記の解析方法および解析システムによれば、測定の精度を向上させることができる。

本発明の一実施形態に係る解析デバイスの概略断面図である。 図１のＩＩ−ＩＩ矢視図である。 前記実施形態に係る解析方法における試料および試薬の充填手順を示す図である。 前記解析方法によって取得する画像の一例を示す図である。 前記解析方法における撮影手順のフローチャートである。 前記実施形態に係る解析システムの全体概略図である。

以下、本発明の一実施形態に係る解析方法および解析システムついて、図１から図６を参照して説明する。

本実施形態に係る解析方法は、生体分子の解析に使用される。解析する測定対象物としては、細胞や、エクソソーム、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）（以下、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｍＲＮＡをまとめてＲＮＡ類と適宜称する。）、タンパク質などが挙げられる。

また、本実施形態に係る解析方法では、解析デバイス１０を用いる。よって、まず本実施形態に係る解析デバイス１０について説明する。以下で説明する解析デバイス１０は、核酸定量用に使用するものであるが、これに限らず、例えばタンパク質の解析に使用してもよい。

図１は、解析デバイス１０の概略断面図である。図２は、図１のＩＩ−ＩＩ矢視図である。図１および図２に示すように、解析デバイス１０は、複数のウェル１２が配列された基体部１１を有している。

基体部１１は、板状に形成されている。ウェル１２は、基体部１１の一方の面に形成されており、底を有する円筒状に形成されている。平面視において、ウェル１２は、基体部１１に三角格子状に配列されている。ウェル１２の中心線間の距離は、ウェル１２の直径よりも大きく設定されている。ここで、ウェル１２の中心線とは、ウェル１２の開口部の重心を通り、ウェル１２の深さ方向と平行な直線を指す。本実施形態では、ウェル１２の中心線は、円筒の中心軸線である。なお、ウェル１２の配列は三角格子状に限らず、例えば四角格子状であってもよい。

基体部１１の一方の面の側には、基体部１１を覆うように配置されたカバー部１３が設けられている。カバー部１３は、板状に形成されている。基体部１１の周縁部とカバー部１３の周縁部との間には、スペーサー１４が設けられている。これによって、基体部１１とカバー部１３との間に、各種の液体が流れる流路１５として機能する空間が形成されている。カバー部１３の一端側には、流路１５と連通する注入口１６が設けられている。また、カバー部１３の他端側には、流路１５と連通する排出口１７が設けられている。注入口１６は、流路１５に液体を導入するのに用いられ、排出口１７は、流路１５から液体を排出するのに用いられる。

続いて、基体部１１の構成についてより詳細に説明する。基体部１１は、基板１１ａと、基板１１ａ上に形成された壁部層１１ｂと、を有している。

基板１１ａは、実質的に透明な材料から構成された板状部材である。基板１１ａの材料としては、例えば樹脂やガラスなどを用いることができる。具体的には、基板１１ａは、例えばポリスチレンやポリプロピレンから構成されている。また、基板１１ａは、解析デバイス１０を搬送する装置や作業者の手作業による取扱い時に破損しない程度の剛性を有している。

壁部層１１ｂは、複数の貫通孔が形成されている層である。複数の貫通孔は、三角格子状に配列されている。壁部層１１ｂに形成された複数の貫通孔と、基板１１ａの表面とによって、基板１１ａを底とするウェル１２が形成されている。壁部層１１ｂの厚さは、例えば３μｍである。また、壁部層１１ｂと壁部層１１ｂと向かい合うカバー部１３との間の距離は、例えば１００μｍである。

壁部層１１ｂの材料としては、例えば樹脂やガラスなどを用いることができる。また、壁部層１１ｂの材料は、基板１１ａの材料と同じでもよいし、異なっていてもよい。壁部層１１ｂを構成する樹脂の例としては、シクロオレフィンポリマーや、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂などが挙げられる。

また、壁部層１１ｂは、基板１１ａに直接形成してもよいし、壁部層１１ｂを形成した部材を接着や溶着などによって基板１１ａに固定してもよい。壁部層１１ｂは、例えば、壁部層１１ｂを形成するために基板１１ａ上に形成された層を基板１１ａが露出するまでパターニングすることなどによって、複数の貫通孔となるパターンを形成することができる。また、壁部層１１ｂは、例えば、基板１１ａにおいて壁部層１１ｂを形成する側の全面に疎水性膜を形成し、この疎水性膜に対してエッチングや、エンボス形成、切削などの加工が施されることによって、複数の貫通孔を形成することができる。

ウェル１２の容積は、適宜設定されている。後述するように、ウェル１２内で解析する測定対象物の生化学的反応が起こる。ウェル１２の容積は小さいほうが、この生化学的反応によって発生するシグナルが検出可能となるまでの反応時間を短くすることができる。また、ウェル１２の容積は、例えば１００ｐＬ（ピコリットル）以下である。ウェル１２内で生体分子の識別を行う場合に、ウェル１２の容積が大きくなるとシグナルが希釈されて検出感度が低下する。ウェル１２の容積を１００ｐＬ以下とすることによって、ウェル１２内で生体分子の識別を行う場合であっても、検出感度を維持することができる。また、より具体的には、シグナルを飽和させて十分なシグナルを発生させるのに要する時間を短縮する目的がある場合には、ウェル１２の容積は、解析対象の分子が１つのウェル１２に１つ以下入るような液量に基づいて設定される。生化学反応の一例としては、ＰＣＲを利用したリアルタイムＰＣＲ法による蛍光変化や、ＬＡＭＰ法（商標登録）を利用した濁度の変化、ＥＬＩＳＡ法を利用した濁度または発光強度の変化などが挙げられる。

ウェル１２の間隔（隣り合うウェル１２の周縁間の最短距離）は、各ウェル１２においてシグナルが検出可能な分解能に応じて設定されている。

なお、壁部層１１ｂは、基板１１ａと同じ材料で一体化されていてもよい。また、壁部層１１ｂは、基板１１ａと同じ材料で一体成形されていてもよい。壁部層１１ｂが基板１１ａと一体成形される場合は、基板１１ａにエッチングや、エンボス形成、切削などの加工が施されることによって、壁部層１１ｂに、ウェル１２に相当する部分が形成される。

また、壁部層１１ｂは、着色されていてもよい。壁部層１１ｂが着色されていると、ウェル１２内で蛍光や、発光、吸光などの光の測定をする場合に、測定対象となるウェル１２に近接する他のウェル１２からの光の影響を軽減することができる。

次に、本実施形態に係る解析デバイス１０とともに用いる検出反応試薬（試薬）について説明する。検出反応試薬は、解析対象となる生体分子やマイクロビーズなどの粒子が分散される溶媒である。解析対象を捕捉する粒子として、細胞や、菌、ウィルス、ゲル、エマルジョン、ミセルなどを用いることも可能である。検出反応試薬は、壁部層１１ｂとカバー部１３との間に形成された流路１５に、注入口１６から注入可能な溶液である。検出反応試薬は、解析対象の物質に関連する鋳型核酸に対する酵素反応などの生化学的反応を行うための試薬である。鋳型核酸に対する生化学的反応は、例えば、鋳型核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。検出反応試薬は、例えば核酸を検出可能な方法に応じて選択される。具体的には、インベーダー（登録商標）法や、ＬＡＭＰ法（商標登録）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法、蛍光プローブ法などに使用される試薬が、本実施形態に係る検出反応試薬に含まれる。

また、例えば、特定の遺伝子が解析（検出）対象の場合、鋳型核酸そのもの、または鋳型核酸の一部分が解析対象となる。

次に、本実施形態に係る解析デバイス１０とともに用いる油性封止液について説明する。油性封止液は、解析デバイス１０の流路１５内に導入された検出反応試薬を、ウェル１２内に封止するために使用される。油性封止液は、壁部層１１ｂとカバー部１３との間に形成された流路１５に、注入口１６から注入可能な溶液である。油性封止液は、解析対象の物質を含む試料と混合しない材料から適宜選択することができる。油性封止液としては、ミネラルオイルや、クロロホルム、スクアレン、ヘキサデカン、フッ素系液体のＦＣ−４０などを用いることができる。

検出対象となるシグナルが蛍光の場合には、ウェル１２中に収容された検出反応試薬に含まれる蛍光色素などに測定用の励起光を当てて、発生した蛍光を測定する。このとき、カバー部１３が励起光を受けて、蛍光を発することがある。これを自家蛍光という。この場合に、カバー部１３の自家蛍光によって、本来測定すべきウェル１２中の蛍光のＳ／Ｎ比が悪くなり、測定精度が下がることがある。このようなことを防止してＳ／Ｎ比を向上させるために、光吸収性の物質を油性封止液に使用したり、光吸収性の物質を油性封止液へ溶解させたものを使用したりすることができる。また、光吸収性の物質を油性封止液に混合することも可能である。

光吸収性の物質は、励起光または観察する波長を吸収する性質を有する物質であり、油性封止液に溶解する材料から適宜選択することができる。光吸収性の物質としては、顔料や、染料、クエンチャー（励起エネルギー吸収剤）などが挙げられる。光吸収性の物質を含む油性封止液を使用することで、次のような効果を得ることができる。例えば、基体部１１側から励起光を照射し、ウェル１２内に存在する検出対象からの蛍光を測定する場合、光吸収性の物質を含む油性封止液によって、カバー部１３側に入射される励起光が吸収されるので、カバー部１３の自家蛍光の発生を抑制できる。加えて、カバー部１３が励起光を受けて蛍光した光を、光吸収性の物質を含む油性封止液が吸収するため、発生したカバー部１３の自家蛍光が測定側（基体部１１側）に到達することを防止できる。したがって、Ｓ／Ｎ比の悪化を防止し、測定精度を高くすることができる。

次に、本実施形態に係る解析方法について説明する。まず、解析デバイス１０のウェル１２に、生化学的反応のための試料および検出反応試薬を充填して生化学的反応を行う。具体的には、解析対象となるＤＮＡなどの生体分子などの物質を含む試料と、解析対象の物質に応じた検出反応試薬とを混合し、混合液２１を作製する。この混合液２１を解析デバイス１０の注入口１６から流路１５に注入し、図３（ａ）に示すように混合液２１でウェル１２および流路１５を満たす。続いて、油性封止液２２を注入口１６から流路１５に注入し、図３（ｂ）に示すように油性封止液２２で流路１５を満たす。このとき、流路１５を満たしていた混合液２１は、解析デバイス１０の排出口１７から排出される。同時に、ウェル１２内の混合液２１が油性封止液２２によって封止される。これによって、図３（ｃ）に示すように混合液２１がウェル１２に充填される。この状態で、例えば解析デバイス１０を加熱することなどによって、各ウェル１２内で酵素反応などの所定の生化学的反応が起こる。この生化学的反応によってウェル１２内で所定のシグナル増幅が行われる。以下では、増幅されるシグナルが蛍光である場合を例として説明する。

生化学的反応が完了した後、蛍光顕微鏡（検出機）で解析デバイス１０の基体部１１を基板１１ａ側から撮影し、例えば図４に示すような画像を取得する。このとき、基体部１１に配列されるウェル１２の数は、通常は例えば１００万個などであり、膨大であるので、基体部１１の一部のみを撮影範囲として撮影する。撮影範囲としては、例えば１万個のウェル１２を含む範囲である。続いて、取得した画像から発光している点（図４では白色の点）の数、すなわちシグナル増幅が行われたウェル１２の数を計測する。発光している点とは、所定の閾値以上の蛍光値を有する点である。そして、撮影範囲に含まれるウェル１２の総数に対するシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合を算出する。

上記で算出した割合を基にポアソン分布を考慮した計算を行うことによって、解析対象の物質を定量することができる。例えば、解析対象の物質が１個のウェルに２分子以上入っている場合でも発光している点としては１個と計測されるが、上述した統計的な計算を行うことによって、適切に定量することができる。しかしながら、解析対象の物質が１個のウェルに統計的に１．５分子以上入るような高濃度の場合には、測定の精度が低下する。これは、測定誤差の影響が大きくなるためである。例えば、１００００個のウェルのうち９８５０個のウェルが発光している場合には１１６ｐＭ（ピコモーラー）と算出され、９８００個のウェルが発光している場合には１１２ｐＭと算出される。よって、０．５％程度（９８５０個のウェルに対する５０個のウェル）の誤差であっても、濃度が大きく変化する。また、低濃度の場合も同様に測定の精度が低下する。例えば、１００００個のウェルのうち１個のウェルが発光している場合には０．００３ｐＭと算出され、２個のウェルが発光している場合には０．００６ｐＭと算出される。よって、１個のウェルの違いで、濃度が２倍変化する。このように、測定誤差に対して、精度が維持できる濃度領域が変化する。

本実施形態に係る解析方法では、上述した高濃度の場合や低濃度の場合でも測定精度を高く維持するため、解析デバイス１０の基体部１１の撮影を図５に示すフローチャートに従って行う。まず、基体部１１の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得する（ステップＳ１）。取得した画像から発光している点の数、すなわちシグナル増幅が行われたウェル１２の数を計測し、撮影範囲に含まれるウェル１２の総数に対するシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合を算出する（ステップＳ２）。

続いて、算出した割合に基づいて、基体部１１を撮影する撮影枚数の全数を決定する。撮影枚数の全数が１枚よりも多い場合には、基体部１１を撮影枚数の全数に至るまでに必要な枚数撮影する。具体的には、まず、算出した割合が９０％以下であるか否か判定する（ステップＳ３）。算出した割合が９０％を超える場合には、撮影枚数の全数を１０枚とする（ステップＳ１３）。算出した割合が９０％以下である場合には、算出した割合が８０％以下であるか否か判定する（ステップＳ４）。算出した割合が８０％を超える場合には、撮影枚数の全数を５枚とする（ステップＳ１４）。算出した割合が８０％以下である場合には、算出した割合が７０％以下であるか否か判定する（ステップＳ５）。算出した割合が７０％を超える場合には、撮影枚数の全数を３枚とする（ステップＳ１５）。算出した割合が７０％以下である場合には、算出した割合が６０％以下であるか否か判定する（ステップＳ６）。算出した割合が６０％を超える場合には、撮影枚数の全数を２枚とする（ステップＳ１６）。

算出した割合が６０％以下である場合には、算出した割合が１％以下であるか否か判定する（ステップＳ７）。算出した割合が１％を超える場合には、撮影枚数の全数を１枚とする（ステップＳ１７）。算出した割合が１％以下である場合には、算出した割合が０．１％以下であるか否か判定する（ステップＳ８）。算出した割合が０．１％を超える場合には、撮影枚数の全数を３枚とする（ステップＳ１８）。算出した割合が０．１％以下である場合には、算出した割合が０．０１％以下であるか否か判定する（ステップＳ９）。算出した割合が０．０１％を超える場合には、撮影枚数の全数を５枚とする（ステップＳ１９）。算出した割合が０．０１％以下である場合には、撮影枚数の全数を１０枚とする（ステップＳ１０）。撮影枚数の全数を決定した（ステップＳ１０、Ｓ１３〜Ｓ１９）後、撮影枚数の全数が１枚よりも多いか否か判断する（ステップＳ１１）。撮影枚数の全数が１枚よりも多い場合には、基体部１１を撮影枚数の全数に至るまでに必要な枚数撮影する（ステップＳ１２）。このとき、基体部１１において１枚目の画像の撮影範囲とは異なる撮影範囲で撮影し、互いに撮影範囲が重複しないようにする。基体部１１を撮影枚数の全数に至るまで撮影した後、基体部１１の撮影を終了する。また、撮影枚数の全数が１枚である場合には、そのまま基体部１１の撮影を終了する。

基体部１１の撮影を終了した後、基体部１１の撮影により取得した全ての画像に基づいて、試料を解析する。具体的には、次の２つの形態が例として挙げられる。
（１）解析対象を捕捉する粒子を用いない場合
画像撮影対象領域には、ウェル１２がある一定数存在することが予め分かっている。取得した全て画像から、発光している点、すなわちシグナル増幅が行われたウェル１２の数を計測し、取得した画像（画像撮影対象領域）に含まれる上記ウェル１２の全数に対するシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合を算出する。算出した割合に基づいて、試料中の解析対象の物質を定量する。
（２）解析対象を捕捉する粒子を用いる場合
解析対象の物質を捕捉する粒子としてビーズを用いた場合、ある画像撮影対象領域で取得した画像中でビーズの入っているウェル１２の数を数える（計測する）。このとき、顕微鏡の明視野画像でビーズの数を数えることができる。次に、明視野画像と同じ画像撮影対象領域の蛍光画像（暗視野画像）で、上記ビーズの入っているウェルのうち、発光している点、すなわちシグナル増幅が行われたウェル１２の数を計測する。計測したウェル１２の数から、次の式によって試料中の解析対象の物質を定量する。
ｘ＝１０００ｙ／（ｋｈｖＮａ）
(ビーズと混ぜるＤＮＡ総数＜ビーズ総数およびウェル総数の場合)
ターゲット濃度（ＭＯＬ／Ｌ）＝ｘ
発光した全ウェル数＝ｙ
ビーズがＤＮＡを捕捉する効率＝ｋ
ビーズのウェルへの封入効率=ｈ
ビーズと混ぜるターゲット溶液容量（ｍｌ）＝ｖ
アボガドロ定数＝Ｎａ

本実施形態に係る解析方法は、複数のウェル１２が配列された基体部１１を有する解析デバイス１０を用いて生化学的反応を検出するための解析方法であって、ウェル１２に生化学的反応のための試料および試薬を充填して生化学的反応を行い、基体部１１の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得し、画像に基づいて、撮影範囲に含まれるウェル１２の総数に対する、生化学的反応によってシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合を算出し、割合に応じて、基体部１１を撮影する撮影枚数の全数を決定し、撮影枚数の全数が１枚よりも多い場合には、基体部１１を撮影枚数の全数に至るまでに必要な枚数撮影し、基体部１１の撮影により取得した全ての画像に基づいて、試料を解析する。

このような解析方法によれば、基体部１１を撮影した１枚目の画像に基づいて算出した割合に応じて、基体部１１を撮影する撮影枚数の全数を決定する。このため、例えば高濃度の場合や低濃度の場合など測定誤差が大きくなると考えられる場合の撮影枚数を増やすことによって、このような場合の測定精度を向上させることができる。加えて、測定誤差が小さいと考えられる場合には撮影枚数を増やさないようにすることによって、撮影時間の増加を抑制できる。

なお、上述した撮影手順において、ステップＳ１３では、算出した割合が９０％を超える場合には、撮影枚数の全数を１０枚としたが、これに限らず、１０枚を超える枚数であってもよい。ステップＳ１４において、算出した割合が８０％を超える場合に、撮影枚数の全数を５枚としたが、これに限らず、５枚を超える枚数であってもよい。ステップＳ１５において、算出した割合が７０％を超える場合に、撮影枚数の全数を３枚としたが、これに限らず、３枚を超える枚数であってもよい。ステップＳ１６において、算出した割合が６０％を超える場合に、撮影枚数の全数を２枚としたが、これに限らず、２枚を超える枚数であってもよい。ステップＳ１８において、算出した割合が０．１％を超える場合に、撮影枚数の全数を３枚としたが、これに限らず、３枚を超える枚数であってもよい。ステップＳ１９において、算出した割合が０．０１％を超える場合に、撮影枚数の全数を５枚としたが、これに限らず、５枚を超える枚数であってもよい。ステップＳ１０において、算出した割合が０．０１％以下である場合に、撮影枚数の全数を１０枚としたが、これに限らず、１０枚を超える枚数であってもよい。

次に、本実施形態に係る解析システム１について、図６を参照して説明する。図６は解析システム１の全体概略図である。図６に示すように、解析システム１は、上述した解析デバイス１０と、上述した蛍光顕微鏡などの検出機３０と、制御装置４０と、を有している。

検出機３０は、例えば蛍光を検出可能な蛍光顕微鏡などのように、上述した所定の生化学的反応を検出可能に構成されている。また、検出機３０は、解析デバイス１０の基体部１１を撮影可能な撮影部３１を有している。撮影部３１は、基体部１１を撮影して画像を取得する。検出機３０はさらに、解析デバイス１０が載置される載置部３２を有している。検出機３０では、解析デバイス１０が載置部３２に載置された状態で、撮影部３１は基体部１１を基板１１ａ側から撮影することが可能である。また、載置部３２は、公知の駆動機構によって、解析デバイス１０に撮影部３１のピントが合ったまま、解析デバイス１０を移動させることが可能に構成されている。よって、載置部３２が基体部１１を適宜移動させることによって、撮影部３１による基体部１１の撮影範囲を変更することができる。

制御装置４０は、検出機３０と電気的に接続されており、検出機３０を制御することができる。制御装置４０は、算出部４１と、判断部４２と、を有している。算出部４１は、検出機３０の撮影部３１が撮影によって取得した画像に基づいて、シグナル増幅が行われたウェル１２の数を計測し、画像の撮影範囲に含まれるウェル１２の総数に対するシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合を算出する。判断部４２は、算出した割合に基づいて、基体部１１を撮影する撮影枚数の全数を決定する。撮影枚数の全数の具体的な決定方法は、上述した図５に示すフローチャートと同様である。

本実施形態に係る解析システム１は、生化学的反応を検出するための解析システムであって、複数のウェル１２が配列された基体部１１を有する解析デバイス１０と、基体部１１を撮影可能な撮影部３１を有し、生化学的反応を検出可能な検出機３０と、算出部４１および判断部４２を有し、検出機３０を制御する制御装置４０と、を備える。制御装置４０は、撮影部３１を、基体部１１の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得するように制御する。制御装置４０は、算出部４１を、画像の撮影範囲に含まれるウェル１２の総数に対する、生化学的反応によってシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合を算出するように制御する。制御装置４０は、判断部４２を、生化学的反応によってシグナル増幅が行われたウェル１２の数の割合に応じて、基体部１１を撮影する撮影枚数の全数を決定するように制御する。

このような構成によれば、上述した本実施形態に係る解析方法を制御装置４０の制御によって自動で行うことができる。加えて、上述した本実施形態に係る解析方法と同様の効果が得られる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

〔実施例１〕
＜核酸定量用アレイデバイスの作製＞
０．５ｍｍの厚さを有するガラス製の基板にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子製）をスピンコートし、１８０℃で３時間熱硬化させ、フォトリソグラフィー技術を使って直径５μｍのウェルを１００万個持つ基体部を作製した。ＣＹＴＯＰ（登録商標）をスピンコートすることによって基板に形成された層が、フォトリソグラフィーにより成形されることによって壁部層となった。ＣＹＴＯＰ（登録商標）をスピンコートすることによって基板に形成された層の厚さは３μｍである。

続いて、基体部との隙間が１００μｍとなるように、カバー部としてカバーガラスを設置した。基体部とカバー部との間には、粘着テープからなるスペーサーを配置した。さらに、基体部とカバー部との間の流路に、水性液体を置換液として注入し、直径５μｍのウェルと、基体部とカバー部との間の流路との全体に、水性液体を満たした。本実施例では、水性液体の組成は、２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２である。

＜試料と検出反応試薬との混合液の注入＞
インベーダー反応試薬（２μＭ アレルプローブ、１μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０Ｕ／μＬ クリベース）と、検出用人工合成ＤＮＡとを混合し、この混合液を基体部とカバー部との間の流路に注入した。ここで、検出用人工合成ＤＮＡの濃度は、基体部に形成された直径５μｍのウェル１００００個に平均１分子が入る濃度である０．００３ｐＭ（全ウェルのうち０．１７％のウェルに検出用人工合成ＤＮＡが充填される。）を添加した。インベーダー反応試薬と検出用人工合成ＤＮＡとの混合液を注入した後、油性封止液として、基体部とカバー部との間の流路にＦＣ−４０（ＳＩＧＭＡ）を注入し、直径５μｍのウェルを封止することで、独立した核酸検出反応容器を構成した。

＜蛍光強度の測定＞
次に、１００万個の独立した核酸検出反応容器を有する本実施例の核酸定量用解析デバイスを、６３℃のオーブンにてインキュベートして、１５分後に取り出した。この解析デバイスを蛍光顕微鏡でウェルの底方向から撮影し、各ウェルの蛍光強度を観察した。ここでは、反応後の核酸検出反応容器は、蛍光顕微鏡（ツァイス社、ＡＸ１０）、光源（ＬＥＪ社、ＦｌｕｏＡｒｃ００１．２６Ａ Ｕｓａｂｌｅ ｗｉｔｈ ＨＢＯ １０）、センサー（浜松ホトニクス社、ＥＭ−ＣＣＤ Ｃ９１００）、フィルター（オリンパス社、Ｕ−ＭＮＩＢＡ２）、解析ソフト（浜松ホトニクス社、ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ ２．６：露光時間 ４８８ｍｓ、ＥＭゲイン １２０、オフセット ０、ビニング ×１）を用いて撮影され、自家蛍光に対して十分なＳ／Ｎ比を有して蛍光を発する核酸検出反応容器の数が計測された。１回の撮影で１００００万個のウェルを測定し、５回撮影を行なった。

〔実施例２〕
検出用人工合成ＤＮＡの濃度を、基体部に形成された直径５μｍのウェル１００００個に平均１００００分子入る濃度である２８ｐＭ（全ウェルのうち６４％のウェルに検出用人工合成ＤＮＡが充填される。）とした。それ以外の条件は実施例１と同様の条件で、実施例１と同様にウェルの測定を行った。

〔実施例３〕
検出用人工合成ＤＮＡの濃度を、基体部に形成された直径５μｍのウェル１００００個に平均２００００分子入る濃度である５６ｐＭ（全ウェルのうち８７％のウェルに検出用人工合成ＤＮＡが充填される。）とした。それ以外の条件は実施例１と同様の条件で、実施例１と同様にウェルの測定を行った。

〔実施例４〕
検出用人工合成ＤＮＡの濃度を、基体部に形成された直径５μｍのウェル１００００個に平均４００００分子入る濃度である１１２ｐＭ（全ウェルのうち９８．５％のウェルに検出用人工合成ＤＮＡが充填される。）とした。それ以外の条件は実施例１と同様の条件で、実施例１と同様にウェルの測定を行った。

表１および表２に、実施例１から４の結果を示す。表１および表２において、サンプル濃度は、検出用人工合成ＤＮＡの濃度である。また、表１および表２には、このサンプル濃度に対応する、ウェル１００００個当たりの分子数（平均分子数）と、ウェルに充填される割合と、を表示している。表１において、計測したウェルの数は、５回の撮影で取得した５枚の画像のそれぞれについて蛍光を発するウェルの数を計測した結果を示している。表２において、算出濃度は、表１に示す計測したウェルの数に基づいてポアソン分布を考慮した統計的な計算によって算出した検出用人工合成ＤＮＡの濃度であり、使用した画像の枚数毎に表示している。例えば、表２の１〜３枚目では、１〜３枚目の画像に基づいて、すなわち表１の１枚目の計測したウェルの数と、２枚目の計測したウェルの数と、３枚目の計測したウェルの数と、の全てに基づいて統計的な計算によって算出した検出用人工合成ＤＮＡの濃度を示している。

表１および表２に示すように、ウェル１００００個に平均１００００分子入る濃度である場合には、複数回撮影を行った方がよいと分かった。また、ウェル１００００個に平均１分子が入る濃度である場合、および平均２００００分子以上入る濃度である場合にも複数回撮影を行った方がよいと分かった。この結果より、測定対象の濃度が極度に高い場合および低い場合には、１枚目の撮影結果から撮影枚数を決定し算出することで短時間に精度の高い定量解析ができることが分かった。

以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。

１ 解析システム
１０ 解析デバイス
１１ 基体部
１１ａ 基板
１１ｂ 壁部層
１２ ウェル
１３ カバー部
１４ スペーサー
１５ 流路
１６ 注入口
１７ 排出口
２１ 混合液
２２ 油性封止液
３０ 検出機
３１ 撮影部
３２ 載置部
４０ 制御装置
４１ 算出部
４２ 判断部

Claims (9)

1. 複数のウェルが配列された基体部を有する解析デバイスを用いて生化学的反応を検出するための解析方法であって、
   前記ウェルに前記生化学的反応のための試料および試薬を充填して前記生化学的反応を行い、
   前記基体部の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得し、
   前記画像に基づいて、前記撮影範囲に含まれる前記ウェルの総数に対する、前記生化学的反応によってシグナル増幅が行われた前記ウェルの数の割合を算出し、
   前記割合に応じて、前記基体部を撮影する撮影枚数の全数を決定し、
   前記撮影枚数の全数が１枚よりも多い場合には、前記基体部を前記撮影枚数の全数に至るまでに必要な枚数撮影し、
   前記基体部の撮影により取得した全ての画像に基づいて、前記試料を解析する
   解析方法。
2. 請求項１に記載の解析方法であって、
   前記割合が６０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも２枚である
   解析方法。
3. 請求項２に記載の解析方法であって、
   前記割合が７０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも３枚である
   解析方法。
4. 請求項３に記載の解析方法であって、
   前記割合が８０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも５枚である
   解析方法。
5. 請求項４に記載の解析方法であって、
   前記割合が９０％以上である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも１０枚である
   解析方法。
6. 請求項１に記載の解析方法であって、
   前記割合が１％以下である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも３枚である
   解析方法。
7. 請求項６に記載の解析方法であって、
   前記割合が０．１％以下である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも５枚である
   解析方法。
8. 請求項７に記載の解析方法であって、
   前記割合が０．０１％以下である場合には、前記撮影枚数の全数は少なくとも１０枚である
   解析方法。
9. 生化学的反応を検出するための解析システムであって、
   複数のウェルが配列された基体部を有する解析デバイスと、
   前記基体部を撮影可能な撮影部を有し、前記生化学的反応を検出可能な検出機と、
   算出部および判断部を有し、前記検出機を制御する制御装置と、
   を備え、
   前記制御装置は、
   前記撮影部を、前記基体部の一部のみを撮影範囲として１枚撮影して画像を取得するように制御し、
   前記算出部を、前記画像の撮影範囲に含まれる前記ウェルの総数に対する、前記生化学的反応によってシグナル増幅が行われた前記ウェルの数の割合を算出するように制御し、
   前記判断部を、前記割合に応じて、前記基体部を撮影する撮影枚数の全数を決定するように制御する
   解析システム。

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