JP2018171058A - 植物中でのロタウイルス様粒子の産生 - Google Patents

Abstract

【課題】植物中でウイルス様粒子(ＶＬＰ)を製造する方法の提供。【解決手段】第一核酸は、ＶＰ２等のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する第一調節領域を含み、さらに１個以上の増幅エレメント及び／又は区画ターゲティング配列を含み得る。第二核酸は、ＶＰ６等のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結した第二調節領域を含む。第三核酸はＶＰ４等のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した第三調節領域を含む。第四核酸は、ＶＰ７等のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結した第四調節領域を含む。上記核酸を植物、植物の一部又植物細胞へ導入し、核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートし、ＶＬＰを産生させる。【選択図】なし

Description

本発明は、植物中でのロタウイルス構造タンパク質産生に関する。より具体的に、本発明は、植物中でのロタウイルス構造タンパク質含有ウイルス様粒子の産生に関する。

ロタウイルス感染は、主として５歳未満の小児を冒す世界的な問題である。これは重篤な胃腸炎を起こし、最悪の場合死に至る。

ロタウイルスは、消化器系および呼吸器を冒すウイルスのレオウイルス科(ロタウイルス属)のメンバーである。この名称はネガティブコントラスト電子顕微鏡で観察したときのビリオンの車輪様の見かけに由来する(図１ａ；先行文献)。ロタウイルスは通常球状であり、その外殻および内殻または二重殻カプシド構造にちなんで名づけられた。それぞれ直径で、外側カプシドは約７０nmであり、内側カプシドは約５５nmである。ロタウイルスの二重殻カプシドは、内側タンパク質殻およびゲノムを含むコアを囲む。ロタウイルスのゲノムは少なくとも１１個のロタウイルスタンパク質をコードする二本鎖ＲＮＡセグメントから成る。

ｄｓＲＮＡは６個の構造タンパク質(ＶＰ)および６個の非構造タンパク質(ＮＳＰ)をコードする(図１ｃ；先行文献)。構造タンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含む(図１ｂ；先行文献)。３個の同心層がそれぞれＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７の集合により形成され、ＶＰ４はウイルス構造の表面上の“スパイク”を形成する。ＮＳＰは感染細胞で合成され、複製サイクルの種々の部分で機能するかまたは宿主タンパク質のいくつかと相互作用して、感染に対する発病または免疫応答に影響を与える(Greenberg and Estes, 2009)。

ＶＰ２は１０２kDaタンパク質であり、ウイルスコアの最も豊富なタンパク質である。これは最内側構造タンパク質層を形成し、ウイルスコアの成分および転写酵素の正確な集合のための足場を形成する(Lawton, 2000)。ＶＰ１は、１２５kDaの最大ウイルスタンパク質であり、ロタウイルスのためのＲＮＡ依存性ポリメラーゼとして作用し、コア複製中間体を形成し、その正二十面体頂上でＶＰ２と結合する(Varani and Allain, 2002; Vende et al., 2002)。ＶＰ３は、９８kDaタンパク質であり、またウイルスゲノムと直接結合し、ウイルスｍＲＮＡに５’キャップ構造を付加するｍＲＮＡキャッピング酵素として作用する。まとめると、ＶＰ１およびＶＰ３は、ＶＰ２カプシド層の外側５回対称頂点に結合する複合体を形成する(Angel, 2007)。ＶＰ６は、ウイルスコアの中間殻を形成する４２kDaタンパク質であり、主要なカプシドタンパク質であり、ビリオンの総タンパク質質量に占める割合は５０％を超える(Gonzalez et al., 2004; Estes, 1996)。これは遺伝子転写に必須であり、レオウイルス科の他のメンバーであるブルータングウイルスで見られるように、コアにおいてＶＰ１をＶＰ２に固着させることによりロタウイルスＲＮＡの被包に役割を有し得る。これはまたロタウイルスの５群(Ａ〜Ｅ)の分類を決定し、Ａ群が最も一般的にヒトを冒す(Palombo, 1999)。ロタウイルスＡ群のＶＰ６は、少なくとも４個のサブグループ(ＳＧ)を有し、これはＳＧ特異的エピトープであるＳＧ Ｉ、ＳＧ II、ＳＧ(Ｉ＋II)およびＳＧ非(Ｉ＋II)の存在または非存在に依存する。Ｂ群およびＣ群は共通Ａ群抗原を欠くがヒトに感染することも知られており、一方Ｄ群は動物、例えばニワトリおよびウシにしか影響しない(Thongprachum, 2010)。

２個の外側カプシドタンパク質は、３７kDa糖タンパク質ＶＰ７(Ｇ)および８７kDaプロテアーゼ感受性ＶＰ４(Ｐ)であり、ウイルスの血清型を決定する。これら２個のタンパク質は中和抗体応答を誘発し、それゆえにロタウイルス血清型をＧ−Ｐ抗原組み合わせによる二重命名法(例えばＧ１ Ｐ[８]またはＧ２ Ｐ[４])で分類するために使用される(Sanchez-Padilla et al., 2009)。ＶＰ４タンパク質は二量体化してウイルスの外殻に６０個のスパイクを形成し、これは宿主細胞侵入の初期段階に直接関与する。スパイクタンパク質は、アミノ酸(ａａ)位置２４８に開裂部位を含む。感染すると、これはプロテアーゼトリプシンにより開裂されて、ＶＰ５(５２９ａａ、６０kDa)およびＶＰ８(２４６ａａ、２８kDa)を生じる(Denisova et al., 1999)。この過程はウイルス感染力(細胞付着および宿主細胞の侵襲)を高め、スパイク構造を安定化させる(Glass, 2006)。ＶＰ７糖タンパク質はウイルスの第三のまたは外部層を形成する。現在まで、２７種のＧおよび３５種のＰ遺伝子型が知られている(Greenberg and Estes, 2009)。ＶＰ４およびＶＰ７はウイルス中和に関与する主要抗原であり、ワクチン開発の重要な標的である(Dennehy, 2007)。

感染した哺乳動物細胞において、ロタウイルスは独特な形態形成モードを経て、完全三層ＶＰ２／６／４／７ウイルス粒子を形成する(Lopez et al., 2005)。三層カプシドは極めて安定な複合体であり、糞口感染およびウイルスの小腸への送達を可能にし、そこで絨毛の先端付近で非分裂分化型腸細胞に感染する(Greenberg and Estes, 2009)。第一に、無傷ウイルスは、ウイルス表面上の６０個のＶＰ４二量体スパイクを介してシアル酸非依存性受容体に結合する(Lundgren and Svensson, 2001)。ウイルス表面上の６０個のＶＰ４二量体スパイクは、ウイルスがこれらの細胞受容体に結合することを可能とする。ＶＰ４はトリプシンによるタンパク質切断に感受性であり、これは立体構造変化をもたらし、一連の共受容体との相互作用のために糖タンパク質の表面上にさらなる付着部位を露出させる。

しかしながら、ウイルスが宿主の原形質膜を通って送達される以外、多段階付着および侵入過程は明確に理解されていない。また侵入過程に関与するＶＰ７外側カプシド殻は、本過程中で除去され、二層粒子(ＤＬＰ)が小胞内の細胞質に送達される(図２；先行文献)。ＤＬＰは小胞から出て、非膜結合細胞質封入体に入る。ＶＰ１によるゲノムの初期転写は、ｄｓＲＮＡが細胞質に決して露出されないように粒子内で開始する。ＲＮＡ複製およびコア形成がこれらの非膜結合細胞質封入体内で起こる。新生(＋)ＲＮＡは続いて細胞質に運搬され、ウイルスタンパク質合成の鋳型として役立つ。ＶＰ４はサイトゾルで産生され、粗面小胞体(ＲＥＲ)に運搬され、ＶＰ７はＲＥＲに分泌される。サイトゾル内でＶＰ２およびＶＰ６が産生され、ビロソームに集合し、続いてＲＥＲ区画に出芽し、その過程で一過性膜外被を受ける(Lopez et al., 2005; Tian et al., 1996)。ＲＥＲにおいて、ウイルス粒子の一過性外被は除去され、ＶＰ４およびＶＰ７タンパク質単量体に置き換わり、ロタウイルス糖タンパク質ＮＳＰ４の重大な関与を伴う(Tian et al., 1996; Lopez et al., 2005; Gonzalez et al., 2000)。ＮＳＰ４はＥＲ膜における細胞内受容体として機能し、新たに製造されたサブウイルス粒子およびおそらくまたスパイクタンパク質ＶＰ４と結合する(Tian et al., 1996)。ＮＳＰ４はまたヒトに毒性であり、下痢の原因因子である。完全な、成熟粒子はその後分泌のためにＲＥＲからゴルジ体を通って原形質膜に輸送される(Lopez et al., 2005)。

ヒト集団を多様な血清型のロタウイルスから保護するのに適するロタウイルスワクチンを産生するために、多種多様な試みが成されている。これらの試みは、種々のジェンナー式方法、免疫原としての生存弱毒化ウイルスの使用、ウイルス様粒子、核酸ワクチンおよびウイルスサブユニットの使用を含む。現在まで、２種の経口ワクチンが上市されているが、しかしながら、系統変動および他の病原体の存在のために、開発途上国のいくつかではその効果は低い。

米国特許番号４,６２４,８５０、４,６３６,３８５、４,７０４,２７５、４,７５１,０８０、４,９２７,６２８、５,４７４,７７３および５,６９５,７６７は各々多様なロタウイルスワクチンおよび／またはその製造方法を記載する。この群のメンバーが共有している特徴は、これらのワクチンの各々が最終的ロタウイルスワクチンの製造をウイルス粒子全体の使用に頼ることである。有効で、多価のワクチンに対する長年にわたる必要性を考えると、この一連の研究は、このようなワクチンの必要性への取り組みにおいて一部しか成功していないことは明らかである。

古典的ワクチン産生法から離れて、分子生物学分野での進歩は個々のロタウイルスタンパク質の発現を可能にしている。Crawford et al. (J Virol. 1994 September; 68(9): 5945-5952)は、主要カプシドタンパク質をコードするＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をバキュロウイルス発現系にクローン化し、各タンパク質を昆虫細胞で発現させた。ロタウイルス主要構造タンパク質の種々の組み合わせの同時発現は、安定なウイルス様粒子(ＶＬＰ)の形成をもたらした。ＶＰ２とＶＰ６のみまたはＶＰ４を伴う同時発現は、二層ロタウイルス粒子に類似したＶＰ２／６ＶＬＰまたはＶＰ２／４／６ＶＬＰの産生をもたらした。ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７のＶＰ４を伴うまたは伴わない同時発現は、三層ＶＰ２／６／７ＶＬＰまたはＶＰ２／４／６／７ＶＬＰを産生し、これは天然感染性ロタウイルス粒子に類似した。ＶＬＰは、粒子の電子顕微鏡試験で天然粒子の構造特性および機能特性である、ＶＰ４およびＶＰ７上の非中和および中和エピトープ存在およびＶＰ２／４／６／７ＶＬＰの血球凝集活性を維持した。

種々のタンパク質組成のウイルス様粒子から産生したワクチン候補は、サブユニットワクチンとしての可能性を示している。O'Neal et al. (“Rotavirus Virus-like Particles Administered Mucosally Induce Protective Immunity,” J. Virology, 71(11):8707-8717 (1997))は、ＶＰ２およびＶＰ６またはＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７を含むＶＬＰは、マウスにコレラ毒素と共にまたは無しで投与したとき、免疫化マウスに防御免疫を誘発したが、ＶＬＰをコレラ毒素(ＣＴ)と共に投与したとき保護がより有効であったことを示した。

コア様粒子(ＣＬＰ)およびＶＬＰはまたウシの免疫化に使用されている。Fernandez, et al. (“Passive Immunity to Bovine Rotavirus in Newborn Calves Fed Colostrum Supplements From Cows Immunized with Recombinant SA11 rotavirus core-like particle (CLP) or virus-like particle (VLP) vaccines,” Vaccine, 16(5):507-516 (1998))。この研究において、ＣＬＰおよびＶＬＰが受動免疫を作る能力を試験した。このグループは、受動免疫誘発においてＶＬＰがＣＬＰよりも有効であったと結論付けた。

植物が組み換えタンパク質の大規模産生のために使用されることが増えている。例えばＵＳ２００３／０１７５３０３は、安定な形質転換トマト植物での組み換えロタウイルス構造タンパク質ＶＰ６、ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７の発現を開示する。

Saldana et al.は、カリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)３５Ｓプロモーターおよび組み換えアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用してトマト植物の細胞質でＶＰ２およびＶＰ６を発現した(Saldana et al., 2006)。電子顕微鏡試験は、２／６ＶＬＰに集合したのは粒子のごく一部であることを示した。保護的免疫応答がマウスで検出され、これは集合していないＶＰのある程度の寄与によるものであり得る。個々のタンパク質はＶＰ８およびＶＰ６の場合と同様、マウスで免疫応答を誘発することが示されている(Zhou et al., 2010)。

Matsumura et al.,(2002)は、トランスジェニックジャガイモ植物で初めてウシロタウイルスＡ群ＶＰ６発現および集合を報告した。彼らの研究において、カリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)３５ＳプロモーターおよびＶＰ６遺伝子を担持する組み換えアグロバクテリウム・ツメファシエンスにより制御されたトランスジェニックジャガイモ植物が使用された。タンパク質は発現され、精製され、免疫原性試験が行われた。成熟マウスでの免疫応答は、血清中のＶＰ６抗体の存在を示した。しかしながら、彼らは集合したＶＰ６タンパク質の証拠を示さなかった。マウスで免疫応答を誘発できる単純単量体または三量体であったかもしれない。他のグループの研究は、ジャガイモウイルスＸ(ＰＶＸ)ベクターを使用してベンサミアナタバコでＶＰ６集合を示した(O'Brien et al., 2000)。ＶＰ６タンパク質が植物で発現されたとき、ＰＶＸタンパク質桿状体に融合したときにのみ集合することを発見した。開裂が起こると、ＶＰ６は、Marusic et al., (2001)によるＨＩＶ−ＰＶＸの類似の研究でみられたとおり、正二十面体ＶＬＰに集合した。この結果は、おそらく、ロタウイルスタンパク質はＶＬＰを形成するためにさらなる因子または増強を必要とし得ることを示唆する。

ＶＬＰの産生は、１個以上の組み換えタンパク質の合成および集合の二者が必要であるために、困難な作業である。４種の異なったタンパク質の１８６０個の単量体により形成されるカプシドを有するＲＮＡウイルスであるロタウイルスのＶＬＰはこれに当てはまる。ＶＬＰ産生のために、２種から３種の組み換えタンパク質の同時発現および集合が必要である。これらは、１２０分子のＶＰ２(内層)、７８０分子のＶＰ６(中間層)および７８０分子の糖タンパク質ＶＰ７(外層)を含み、最終的に二層または三層粒子を形成する。さらに、ほとんどのＶＬＰ産生は、数種の組み換えタンパク質の同時発現および集合を必要とし、これは − ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)の場合 − 単一宿主細胞で起こることを必要とする。

より最近の研究は、テンサイ黒焼ウイルス(Beet black scorch virus)(ＢＢＳＶ)仲介発現系を使用したアカザ(Chenopodium amaranticolor)でのコドン最適化ヒトロタウイルスＶＰ６の発現の成功を示した。本タンパク質は、ＢＢＳＶのコートタンパク質読み取り枠の置換として操作された。植物ベースのＶＰ６タンパク質でのメスＢＡＬＢ／ｃマウスへの経口免疫は、高力価の抗ＶＰ６粘膜ＩｇＡおよび血清ＩｇＧを誘発した(Zhou et al., 2010)。しかしながら、このグループは、ＶＰ６タンパク質がＶＬＰまたは粒子に集合するか否かについて記載しなかった。

ロタウイルスＶＰ７はまたタバコ植物での発現が成功しており、マウスでのその中和免疫応答の維持が示された(Yu and Langridge, 2001)。ＶＰ７発現にトランスジェニックジャガイモ植物を使用した他の研究は、ＶＰ７遺伝子が形質転換植物で５０世代を超えて安定であることを示した。第５０世代のＶＰ７タンパク質は成熟マウスで防御抗体および中和抗体の両方を誘発した(Li et al., 2006)。

Yang et al. (Yang Y M, Li X, Yang H, et al. 2011)は、タバコ植物でＡ群ＲＶ(Ｐ[８]Ｇ１)の３種のロタウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７を同時発現し、これらのタンパク質の発現レベルならびにロタウイルス様粒子形成および免疫原性を試験した。ＶＬＰはトランスジェニックタバコ植物から精製され、電子顕微鏡およびウェスタンブロットにより分析された。Yang et al.の結果は、植物由来ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質が直径６０〜８０nmの２／６または２／６／７ロタウイルス様粒子に自己集合することを示した。

本発明は、植物中でのロタウイルス構造タンパク質産生に関する。より具体的に、本発明はまた植物中でのロタウイルス構造タンパク質含有ウイルス様粒子の産生にも関する。

本発明によって、植物中でロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法(Ａ)であって、
ａ) 植物内で活性であり、第一ロタウイルス構造タンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第一調節領域を含む第一核酸、植物内で活性であり、第二ロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含む第二核酸および植物内で活性であり、第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域を含む第三核酸を植物、植物の一部または植物細胞に導入し、
ｂ) 植物、植物の一部または植物細胞を、第一、第二および第三核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生することを含む、
方法(Ａ)を提供する。

さらに、植物内で活性であり、第四ロタウイルス構造タンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第四調節領域を含む第四核酸を工程ａ)で植物、植物の一部または植物細胞に導入してよく、工程ｂ)で植物、植物の一部または植物細胞をインキュベートしたときに発現する。

上記方法(Ａ)において、第一ロタウイルス構造タンパク質はＶＰ２であってよく、第二ロタウイルス構造タンパク質はＶＰ６であってよく、第三ロタウイルス構造タンパク質はＶＰ４またはＶＰ７であってよい。さらに、第四ロタウイルス構造タンパク質はＶＰ７またはＶＰ４であってよい。ＶＰ４をプロセシングまたは開裂して、ＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。ＶＰ４の開裂は、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼまたはスブチリシンを使用して行い得る。プロテアーゼを植物内で同時発現させてよい。

本発明はまたロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を製造するための方法(Ｂ)であって、
ａ) 植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む核酸を植物、植物の一部または植物細胞に導入し、
ｂ) 植物、植物の一部または植物細胞を、第一核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生することを含む、
方法(Ｂ)を提供する。

上記方法(Ｂ)は、さらに工程ａ)において、植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含む第二核酸を導入し、工程ｂ)において植物、植物の一部または植物細胞をインキュベートしたとき、第二核酸を発現させることを含み得る。

上記方法(Ｂ)は、さらに、植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域を含む第三核酸を工程ａ)において植物、植物の一部または植物細胞に導入し、工程ｂ)において植物、植物の一部または植物細胞をインキュベートしたとき、第三核酸を発現させることを含み得る。

さらに、方法(Ａ)または(Ｂ)において、付加的核酸を植物、植物の一部または植物細胞で発現させてよく、ここで、該付加的核酸は、植物内で活性であり、サイレンシングのサプレッサーをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む。

ヌクレオチド配列のコドン使用頻度を好ましいヒトコドン使用頻度、増大したＧＣ含量、またはこれらの組み合わせに適合させ得る。

ロタウイルス構造タンパク質は切断型、天然または非天然シグナルペプチドを含み得る。非天然シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナル(ＰＤＩ)ペプチドであり得る。

第一、第二、第三または第四ヌクレオチド配列またはこれらの組み合わせは、ササゲモザイクウイルス(ＣＰＭＶ)調節領域に作動可能に連結し得る。

上記方法(Ａ)または(Ｂ)は、さらに
ｃ) 植物、植物の一部または植物細胞を収穫し
ｄ) ＲＬＰを植物、植物の一部または植物細胞から精製する
工程を含み得る。

方法(Ａ)または(Ｂ)における収穫または精製工程中、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンを使用して、ＶＰ４をプロセシングまたは開裂して、ＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。

ＲＬＰは７０〜１００nm範囲のサイズであり得て、カルシウム存在下で精製し得る。

本発明は、上記方法(Ａ)または(Ｂ)により製造されたＲＬＰを提供する。産生されたＲＬＰは、少なくともＶＰ４ロタウイルス構造タンパク質を含み得る。ＶＰ４を、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンを使用してＶＰ５およびＶＰ８に開裂し得る。プロテアーゼは植物内で共発現させても、収穫、精製中に添加しても、その両者でもよい。さらに方法(Ａ)または(Ｂ)により産生されたＲＬＰは二層ＲＬＰおよび／または三層ＲＬＰであり得る。

さらに、ヌクレオチド配列を提供する。ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１４または配列番号４５により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を有し得る。ＶＰ６をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、配列番号１８または配列番号４６により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を有し得る。ＶＰ７をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９、２０、４８、４９、５２、５３、５４または５７により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を有し得る。そして、ＶＰ４をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５、１６、４７、５０または５１により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を有し得る。さらにＶＰ２は、配列番号１または配列番号２５により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされ得る。ＶＰ６は、配列番号３または配列番号３１により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされ得る。ＶＰ７は、配列番号４、３９、４３または５９により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされ得る。ＶＰ４は、配列番号２または配列番号３６により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされ得る。３３。１個以上のロタウイルス構造タンパク質はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６および／またはＶＰ７であり得る。ＶＰ４はＶＰ５およびＶＰ８にプロセシングされ得る。１個以上のロタウイルス構造タンパク質はロタウイルス株Ｇ９ Ｐ[６]、ロタウイルスＡ群ＷＡ株、ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株およびロタウイルスＳＡ１１株から選択され得る。

上記方法(Ａ)において、第一、第二および第三核酸配列またはこれらの組み合わせは、植物内で活性であり、１個以上のコモウイルスエンハンサー、１個以上の増幅エレメントおよびロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含んでよく、ここで、レプリカーゼをコードする第四核酸を植物、植物の一部または植物細胞に導入し得る。

上記方法(Ｂ)において、第一、第二、第三または第四核酸配列またはこれらの組み合わせは、植物内で活性であり、１個以上のコモウイルスエンハンサー、１個以上の増幅エレメントおよびロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含んでよく、ここで、レプリカーゼをコードする第五核酸を植物、植物の一部または植物細胞に導入し得る。

さらに、本発明によって、植物中でロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法(Ｃ)であって、
ａ) 植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む核酸を植物または植物の一部に導入し、
ｂ) 植物、植物の一部を第一核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生することを含む、
方法(Ｃ)を提供する。

さらに、第二核酸を植物または植物の一部に導入してよく、第二核酸は、植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含み、ここで、第二核酸は、工程ｂ)において植物または植物の一部をインキュベートしたときに発現する。

さらに第三ヌクレオチド配列を植物または植物の一部に導入してよく、第三核酸は、植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域を含み、ここで、第三核酸は、工程ｂ)において植物または植物の一部をインキュベートしたときに発現する。

上記方法(Ｃ)は、さらに植物の収穫およびＲＬＰの抽出の工程を含み得る。

方法(Ｃ)の１個以上のロタウイルス構造タンパク質はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ６であり得る。第一または第二ヌクレオチド配列によりコードされる１個以上のロタウイルス構造タンパク質はＶＰ２またはＶＰ６であり得る。第三ヌクレオチド配列によりコードされる１個以上のロタウイルス構造タンパク質はＶＰ４であり得る。ＶＰ４を開裂してＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。

第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、さらに１個以上の区画ターゲティング配列および／または増幅エレメントをコードし得る、含み得る、またはコードしかつ含み得る。１個以上の区画ターゲティング配列は、１個以上のロタウイルス構造タンパク質を植物細胞の小胞体(ＥＲ)、葉緑体、色素体またはアポプラストに指向させる。

本発明はまたロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)の製造方法(Ｄ)であって、
ａ) 植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む核酸を含む植物または植物の一部を提供し；
ｂ) 植物、植物の一部または植物細胞を、該核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生することを含む、
方法(Ｄ)を提供する。

さらに方法(Ｄ)の植物または植物の一部は；
ｉ) 植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含む第二核酸または、
ii) 第二および第三核酸をさらに含んでよく、ここで、第二核酸は植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含み、第三核酸は植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域を含み、
ここで、第二核酸または第二核酸と第三核酸は工程ｂ)における植物または植物の一部のインキュベート時に発現する。

方法(Ｄ)における該１個以上の構造タンパク質はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ６であり得る。第一または第二ヌクレオチド配列によりコードされる１個以上のロタウイルス構造タンパク質はＶＰ２またはＶＰ６であり得る。第三ヌクレオチド配列によりコードされる１個以上のロタウイルス構造タンパク質はＶＰ４であり得る。ＶＰ４は、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンを使用してＶＰ５およびＶＰ８に開裂してよい。プロテアーゼは植物内で共発現させても、収穫、精製中に添加しても、その両者でもよい。

本発明は、上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)またはこれらの組み合わせにより産生されたＲＬＰを提供する。ＲＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを含み得る１個以上のロタウイルス構造タンパク質を含み得る。

本発明は、免疫応答を誘発するための有効量の直前に記載したとおり方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)またはこれらの組み合わせにより製造されたＲＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

本発明はまた、対象におけるロタウイルス感染に対する免疫を誘発する方法であって、直前に記載したＲＬＰを該対象に投与することを含む、方法を提供する。ＲＬＰは対象に経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下で投与し得る。

本発明はまた、上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)またはこれらの組み合わせにより産生されたＲＬＰを含む植物体も提供する。本植物体は、対象におけるロタウイルスウイルス感染に対する免疫誘発に使用し得る。本植物体はまた食品添加物として混合してよい。

上記方法(方法Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ)において、植物または植物の一部は、さらにサイレンシングのサプレッサーをコードする他の核酸配列と共に投与してよく、またはさらにこれを含んでよい。

さらに、本発明はまた植物中でロタウイルス構造タンパク質を産生する方法(Ｅ)であって、
ａ) 植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む核酸を植物または植物の一部に導入し；
ｂ) 植物または植物の一部を該の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、１個以上のロタウイルス構造タンパク質を産生することを含む、
方法(Ｅ)も提供する。

この発明の概要は本発明の全ての性質を必ずしも記載していない。

本発明のこれらおよび他の性質は、添付する図面を参照する次の記載からより明らかとなり、当該図面は次のとおりである：

ロタウイルス構造および遺伝子−タンパク質割当を示す。(Ａ)ロタウイルス粒子の透過型電子顕微鏡(棒は１００nmを表す)。(Ｂ)内、中間および外を含むウイルスカプシドタンパク質の組織化。(Ｃ)サイズおよび機能により配置したロタウイルスｄｓＲＮＡセグメント。ｄｓＲＮＡはポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離できる(Ｄ)。(Ｃ)におけるタンパク質は(Ｄ)におけるｄｓＲＮＡセグメントにより示される。画像はCrawford et al., 1997(Ａ)、Swiss Institute of Bioinformatics, 2008(Ｂ)およびGreenberg and Estes, 2009(Ｄ)から。

ロタウイルス細胞侵入および複製を示す。ロタウイルスが細胞に侵入したとき、ＶＰ４およびＶＰ７が無くなり、二層粒子(ＤＬＰ)が形成される。ｄｓＲＮＡ転写が開始し、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７翻訳を生じる。レプリカーゼ活性を有する後代コアはウイルス工場(バイロプラズムとも呼ばれる)で産生される。後期転写がこれらの後代コアで起こる。ウイルス工場の末梢で、これらのコアはＶＰ６で被覆され、未成熟ＤＬＰを形成し、これが小胞体の膜を通って出芽し、一過性脂質膜を獲得し、これはＥＲ常在ウイルス糖タンパク質ＮＳＰ４およびＶＰ７で修飾される；これらの被覆粒子はＶＰ４も含む。粒子がＥＲ槽に向かい移動するに連れて、一過性脂質膜および非構造タンパク質ＮＳＰ４が失われ、同時にウイルス表面タンパク質ＶＰ４およびＶＰ７が再配列されて最外側ウイルスタンパク質層を形成し、成熟感染性三層粒子となる(Swiss Institute of Bioinformatics (ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html参照)。

アグロバクテリウムベクターｐＴＲＡｃ、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰおよびｐＴＲＡｋｃ−ＥＲＨを示す。Ｐ３５ＳＳ、重複転写エンハンサーを有するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；ＣＨＳ、カルコンシンターゼ５’非翻訳領域；ｐＡ３５Ｓ、ＣａＭＶ ３５Ｓポリアデニル化シグナル；ＳＡＲ、タバコＲｂ７遺伝子の足場付着領域；ＬＢおよびＲＢ、Ｔ−ＤＮＡ組込みの左右の境界；ＣｏｌＥ１ｏｒｉ、大腸菌の複製開始点；ＲＫ２ｏｒｉ、アグロバクテリウムの複製開始点；ｂｌａ、アンピシリン／カルベニシリン耐性ｂｌａ遺伝子；ＬＰＨ、マウスｍＡｂ２４重鎖由来のシグナル−ペプチド配列；ｈｉｓ６、６×Ｈｉｓタグ配列；ＳＥＫＤＥＬ、ＥＲ保留シグナル配列；ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ、ジャガイモ(Solanum tuberosum)からのルビスコ小サブユニット遺伝子(ｒｂｃＳ１)の葉緑体移行ペプチド配列；ｎｐｔ II、カナマイシン耐性ｎｐｔ II遺伝子；ＰｎｏｓおよびｐＡｎｏｓ、ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーターおよびポリアデニル化シグナル(Maclean et al., 2007)。

ロタウイルスクローニングおよび浸潤技法の概要を示す。

アポプラストタンパク質抽出法を示す。(Ａ)植物細胞およびアポプラストの位置の説明。ＶＰタンパク質はサイトゾルで発現され、アポプラストに向けられる(赤色矢印)。(Ｂ) − タイムトライアル後、植物葉をＰＢＳで減圧浸潤し(１)、穿孔したスピンカラムに入れ(２)、次いで２mlエッペンドルフチューブ中で遠心分離して、樹液を集める(３)。

７日間にわたる植物葉細胞区画中でのロタウイルスＶＰ６タンパク質発現のウェスタンブロットを示す。マウス抗ロタウイルスＶＰ６抗体(１：５０００)を使用して膜をプローブした。(＋)および(−)は、それぞれサイレンシングサプレッサー有りまたは無しでの発現を示す。赤線は分析した多様なサンプル中のＶＰ６タンパク質の位置を示す(〜４０kDa)。ＶＰ６の発現および抽出効率は細胞質で最良であった。

ベンサミアナタバコ植物葉の細胞質における３日目のｈｉｓタグ付ロタウイルスタンパク質の個々の発現を示すウェスタンブロットを示す。＋ｖｅ − 細菌で発現させたロタウイルスＶＰ２；Ｍ − 分子量マーカー；ＶＰ − ロタウイルスカプシドタンパク質。ＶＰ７浸潤は葉の黄変を起こした(ｂ)。

種々のベンサミアナタバコ植物葉細胞区画を標的化した３日目のロタウイルスＶＰ２(ａ)およびＶＰ４(ｂ)の発現を示す。ＶＰ２およびＶＰ４に対するそれぞれのニワトリ抗ロタウイルス血清(１：２０００)をタンパク質のプロービングに使用した。ｃＴｐ − 葉緑体；ＥＲ − 小胞体；ｐＴＲＡｃ − 細胞質；Ａ − アポプラスト；ネガティブコントロール(−ｖｅ) − サイレンシングサプレッサーのみで浸潤した植物；(ａ)のポジティブコントロール(＋ｖｅ) − 細菌発現ＶＰ２、(ｂ) − 細菌発現ＶＰ４；(−)および(＋) サイレンシングサプレッサー有りまたは無し；Ｍ −分子量マーカー。矢印は当該タンパク質バンドの位置を示す。

ベンサミアナタバコ葉細胞質における同時発現ＶＰ２／６／４の３日目抽出物のウェスタンブロット分析を示す。タンパク質をニワトリ抗ロタウイルス血清(抗ＶＰ２(１／５０００)および抗ＶＰ４(１／５０００))およびマウス抗ＶＰ６抗体(１：５０００)の混合物でプローブした。組み換えアグロバクテリウムの浸潤をサイレンシングサプレッサーと共に行った。ネガティブコントロール(−ｖｅ) − サイレンシングサプレッサーのみを浸潤させた植物全体；Ｍ − 分子量マーカー。

酢酸ウラニルで染色した３日目に細胞質から抽出したロタウイルスタンパク質の電子顕微鏡写真を示す。(ａ)サイレンシングサプレッサーで抽出したネガティブタンパク質サンプル抽出物；(ｂ)ＶＰ６タンパク質抽出物；(ｃ)ＶＰ２／６タンパク質抽出物および(ｄ)ＶＰ２／６／４タンパク質抽出物。棒＝２００nm。検出された全ＲＬＰは直径７０〜１００nmの間であった。(ｂ)の矢印はＶＰ６葉鞘／マットを示す。(ｃ)の矢印はＲＬＰの例を示す。全タンパク質をサイレンシングサプレッサー存在下で発現させた。全てをマウス抗ＶＰ６抗体(１：２０００)で捕捉した。

同時発現ＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４のスクロース勾配精製(ａ)、スクロース勾配精製ＶＰ２／６(ｂ)およびＶＰ２／６／４(ｃ)のドットブロットを示す。タンパク質抽出物をスクロース勾配(１０〜６０％)に載せ、超遠心した。フラクションを(ｂ)マウス抗ＶＰ６抗体(１：５０００)および(ｃ)ニワトリ抗ＶＰ２およびＶＰ４血清(１：５０００)とのプロービングにより分析した。

ＶＰ２／６フラクションのウェスタンブロット分析(ａ)、フラクションＶＰ２／６フラクション１６および１７のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色ゲル写真(ｂ)およびフラクション１６および１７のウェスタンブロット分析(ｃ)を示す。マウス抗ＶＰ６(１：５０００)およびニワトリ抗ＶＰ２血清(１：５０００)をウェスタンブロット(ａ)に使用し、(ｃ)ではマウス抗ＶＰ６(１：５０００)のみ使用した。(ａ)および(ｃ)のネガティブコントロール(−ｖｅ) − 細菌発現ＶＰ４および(ｂ)のネガティブコントロール(−ｖｅ) − サイレンシングサプレッサーで浸潤し、スクロース勾配精製した植物；粗製− 非精製ＶＰ２／６抽出物；(ａ)のポジティブコントロール(＋ｖｅ) − 細菌発現ＶＰ２、(ｂ)および(ｃ)のポジティブコントロール(＋ｖｅ) − 植物発現ＶＰ６；ＶＰ６−ＳＦ９ − ＳＦ９昆虫細胞で発現された既知濃度のＶＰ６タンパク質。矢印は興味あるタンパク質バンドを示す。

スクロース密度勾配精製ＶＰ２／６のフラクションの総可溶性タンパク質アッセイを示す。(ａ) − ＩｇＧ標準曲線、(ｂ) − ７５０nmで取ったフラクションの吸光度測定値。興味ある点：フラクション１６〜１９。

細胞質同時発現ＶＰ２／６／４フラクションのスクロース密度勾配分析を示す。７５０nmでの生吸光度測定値を、ＶＰ２／６／４のドットブロットで先に検出されたタンパク質ピークを確認するために取った。

スクロース密度勾配精製ＶＰ２／６粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す。(ａ)および(ｂ)の両方とも、銅グリッド上に見られた２個の切片を示す。検出した全ＲＬＰは直径７０〜１００nmであった。サンプルをマウス抗ＶＰ６抗体(１：２０００)で捕捉した。棒は２００nmを示す。

ロタウイルスＶＰ２のアミノ酸配列(配列番号１)およびヌクレオチド配列(配列番号１３および１４)を示す。 ロタウイルスＶＰ４のアミノ酸配列(配列番号２)およびヌクレオチド配列(配列番号１５および１６)を示す。 ロタウイルスＶＰ６のアミノ酸配列(配列番号３)およびヌクレオチド配列(配列番号１７および１８)を示す。 ロタウイルスＶＰ７のアミノ酸配列(配列番号４)およびヌクレオチド配列(配列番号１９および２０)を示す。

図１７ＡはプライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(配列番号２１)のヌクレオチド配列を示す。図１７ＢはプライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(配列番号２２)のヌクレオチド配列を示す。図１７Ｃは構築物１１９１の模式図を示す。プラスミド直線化に使用したＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を図中注釈を付す。

左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界まで(下線)の構築物１１９１のヌクレオチド配列を示す(配列番号２３)。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシング阻害剤発現カセットを有する２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ。

ロタウイルスＡ群ＷＡ株のＶＰ２(ｏｐｔ)をコードするヌクレオチド配列を示す(配列番号４５)。

ロタウイルスＡ群ＷＡ株のＶＰ２のアミノ酸配列を示す(配列番号２５)。

構築物番号１７１０の模式図を示す。

構築物１９３の模式図を示す。プラスミド直線化に使用したＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を図中注釈を付す。 構築物１９３のヌクレオチド配列を示す(配列番号２６)。構築物１９３は左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界まで(下線)で示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシング阻害剤発現カセットを伴うＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系における２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ。

発現カセット１７１０のヌクレオチド配列を示す(配列番号２７)。２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７１０を示す。ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ２(ｏｐｔ)に下線を付す。

構築物番号１７１１の模式図を示す。

図２５ａはプライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列を示す(配列番号２８)。図２５ｂはプライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列を示す(配列番号２９)。図２５ｃは２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７１３を示す(配列番号３０)。ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６(ｏｐｔ)に下線を付す。図２５ｄはロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６(ｏｐｔ)をコードするヌクレオチド配列を示す(配列番号４６)。

ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６のアミノ酸配列を示す(配列番号３１)。

構築物番号１７１３の模式図を示す。

２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７１４のヌクレオチド配列を示す(配列番号３２)。ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６(ｏｐｔ)に下線を付す。

構築物番号１７１４の模式図を示す。

図３０ＡはプライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列を示す(配列番号３３)。図３０ＢはプライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列を示す(配列番号３４)。

２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７３１のヌクレオチド配列を示す(配列番号３５)。ロタウイルスＡ群ロタリックス株からのＶＰ４(ｏｐｔ)に下線を付す。 株ＲＶＡ／ワクチン／ＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのロタウイルスＡ群ＶＰ４の最適化コーディング配列を示す(配列番号４７)。 ２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７３０のヌクレオチド配列を示す(配列番号４４)。ロタウイルスＡ群ロタリックス株からのＶＰ４(ｏｐｔ)に下線を付す。

ロタウイルスＡ群ロタリックス株からのＶＰ４のアミノ酸配列を示す(配列番号３６)。

構築物番号１７３０の模式図を示す。 構築物番号１７３１の模式図を示す。

図３４ＡはプライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列を示す(配列番号３７)。図３４ＢはプライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列を示す(配列番号３８)。図３４Ｃは２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７３３のヌクレオチド配列を示す。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ７に下線を付す(配列番号２４)。図３４ＤはロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ７をコードするヌクレオチド配列を示す(配列番号４８)。図３４Ｅは株ＲＶＡ／ワクチン／ＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのロタウイルスＡ群ＶＰ７の最適化コーディング配列を示す(配列番号５４)。

ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ７のアミノ酸配列を示す(配列番号３９)。

構築物番号１７３３の模式図を示す。

プライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ２＋４ｃのヌクレオチド配列を示す(配列番号４０)。

構築物１１９２の模式図を示す。プラスミド直線化に使用したＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素部位を図中注釈を付す。

左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界まで(下線)の構築物１１９２のヌクレオチド配列を示す(配列番号４１)。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシング阻害剤発現カセットを伴う２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＮＯＳを示す。

２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７３５のヌクレオチド配列を示す(配列番号４２)。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＰＤＩＳＰ／ＶＰ７(ｏｐｔ)に下線を付す。 ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＰＤＩＳＰ／ＶＰ７(ｏｐｔ)をコードするヌクレオチド配列(配列番号４９)。

ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＰＤＩＳＰ／ＶＰ７のアミノ酸配列を示す(配列番号４３)。

構築物番号１７３５の模式図を示す。

株ＲＶＡ／サル−ｔｃ／ＺＡＦ／ＳＡ１１−Ｈ９６／１９５８／Ｇ３Ｐ５Ｂ[２]からのロタウイルスＡ群ＶＰ４のコーディング配列を示す(配列番号５０)。 株ＲＶＡ／サル−ｔｃ／ＺＡＦ／ＳＡ１１−Ｈ９６／１９５８／Ｇ３Ｐ５Ｂ[２]からのロタウイルスＡ群ＶＰ４の最適化コーディング配列を示す(配列番号５１)。 株ＲＶＡ／サル−ｔｃ／ＺＡＦ／ＳＡ１１−Ｈ９６／１９５８／Ｇ３Ｐ５Ｂ[２]からのロタウイルスＡ群ＶＰ７のコーディング配列を示す(配列番号５２)。 株ＲＶＡ／サル−ｔｃ／ＺＡＦ／ＳＡ１１−Ｈ９６／１９５８／Ｇ３Ｐ５Ｂ[２]からのロタウイルスＡ群ＶＰ７の最適化コーディング配列を示す(配列番号５３)。

プライマーＩＦ−ＴｒＳＰ＋Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列を示す(配列番号５５)。 プライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列を示す(配列番号５６)。 株ＲＶＡ／ワクチン／ＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのロタウイルスＡ群ＶＰ７の最適化コーディング配列のヌクレオチド配列を示す(配列番号５７)。 ２Ｘ３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１７３４のヌクレオチド配列を示す(配列番号５８)。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ７に下線を付す。 ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＴｒＳｐ−ＶＰ７のアミノ酸配列を示す(配列番号５９)。 構築物番号１７３４の模式図を示す。

イオジキサノール密度勾配遠心分離によるＶＰ２およびＶＰ６を含むロタウイルス様粒子の精製を示す。図４５Ａ 遠心分離前およびフラクション１〜１０の負荷のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(フラクション１はチューブの底にある)。ロタウイルス抗原の位置は矢印で示す。図４５Ｂ ウサギポリクローナル抗ロタウイルス抗体を使用した(Ａ)と同じフラクションのウェスタンブロット分析。図４５Ｃ ウサギポリクローナル抗ＶＰ２抗体を使用した(Ａ)と同じフラクションのウェスタンブロット分析。

イオジキサノール密度勾配遠心分離によるＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７を含むロタウイルス様粒子の精製を示す。図４６Ａ 遠心分離前およびフラクション１〜１０のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(フラクション１はチューブの底にある)。ロタウイルス抗原の位置は矢印で示す。図４６Ｂ ウサギポリクローナル抗ロタウイルス抗体を使用した(Ａ)と同じフラクションのウェスタンブロット分析。図４６Ｃ ウサギポリクローナル抗ＶＰ７抗体を使用した(Ａ)と同じフラクションのウェスタンブロット分析。

イオジキサノール密度勾配遠心分離によるＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含むロタウイルス様粒子の精製を示す。図４７Ａ 遠心分離前およびフラクション１〜１０のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析(フラクション１はチューブの底にある)。ロタウイルス抗原の位置は矢印で示す。図４７Ｂ ウサギポリクローナル抗ロタウイルス抗体を使用したＡ)と同じフラクションのウェスタンブロット分析。図４７Ｃ ウサギポリクローナル抗ＶＰ７抗体を使用した(Ａ)と同じフラクションのウェスタンブロット分析。

抗ＶＰ４特異的ＥＬＩＳＡによるＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含む精製ロタウイルス様粒子のＶＰ４含量の評価を示す。

ＶＰ２およびＶＰ６を含む精製ロタウイルス様粒子(左パネル)およびＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含む精製ロタウイルス様粒子(右パネル)の低温電子顕微鏡像を示す。

次の記載は好適実施例である。

本発明は、１個以上のロタウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子(ＶＬＰ)(すなわちロタウイルス様粒子、ロタウイルスＶＬＰまたはＲＬＰ)および植物中でロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法に関する。それゆえに、ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)は１個以上のロタウイルス構造タンパク質を含み得る。ＲＬＰは二層または三層であり得る。

本発明は、一部、植物でロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法を提供する。本方法は、植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む１個以上の核酸の植物または植物の一部への導入を含む。続いて植物または植物の一部を該核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートし、ＲＬＰを産生する。

さらに、本発明は、一部、植物でロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)ワクチン候補を産生する方法に関する。本方法は、植物内で活性であり、第一ロタウイルス構造タンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第一調節領域を含む第一核酸、植物内で活性であり、第二ロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含む第二核酸および植物内で活性であり、第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域の植物、植物の一部または植物細胞への導入を含む。続いて植物、植物の一部または植物細胞を、第一、第二および第三核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生する。ＲＬＰは単層、二層または三層であり得る。

“ロタウイルス構造タンパク質”は、あらゆる天然に存在するまたは変異ロタウイルス株または単離株に存在するロタウイルスから単離されたロタウイルス構造タンパク質配列の一部または全てを意味し得る。それゆえに、用語ロタウイルス構造タンパク質等はウイルス生活環の間に変異により産生されたまたは選択圧(例えば、薬物治療、宿主細胞指向性または感染力の拡大など)に応答して産生された天然に存在するロタウイルス構造タンパク質配列変異体を含む。当業者には認識されるとおり、このようなロタウイルス構造タンパク質配列およびその変異体は組み換え法を使用して産生してもよい。

さらに、構造タンパク質は、例えばＶＰ２およびＶＰ６のようなカプシドタンパク質および／または例えばＶＰ４のような表面タンパク質を含み得る。構造タンパク質はさらに例えばＶＰ７を含み得る。

ロタウイルス構造タンパク質の非限定的例はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７ならびにＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７のフラグメントである。本発明によって使用し得るＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質のフラグメントの非限定的例は、ロタウイルス株Ｇ９ Ｐ[６]、ロタウイルスＡ群ＷＡ株、ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株およびロタウイルスＳＡ１１株からのＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質を含む。

ＶＰ２構造タンパク質の例は、限定と解釈してはならないが、配列番号１および配列番号２５のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ２構造タンパク質は、配列番号１、配列番号２５に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＶＰ２構造タンパク質は、配列番号１３、１４、２５または４５に示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列によりコードされ得る。

ＶＰ４構造タンパク質の例は、限定と解釈してはならないが、配列番号２および配列番号３６のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ４構造タンパク質は、配列番号２、配列番号３６に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＶＰ４構造タンパク質は、配列番号１５、１６、４７、５０または５１に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列によりコードされ得る。

ＶＰ６構造タンパク質の例は、限定と解釈してはならないが、配列番号３および配列番号３１のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ６構造タンパク質は、配列番号３、配列番号３１に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＶＰ６構造タンパク質は、配列番号１７、１８または４６に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列によりコードされ得る。

ＶＰ７構造タンパク質の例は、限定と解釈してはならないが、配列番号４、配列番号３９、配列番号４３および配列番号４７のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ７構造タンパク質は、配列番号４、配列番号３９および配列番号４３に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＶＰ７構造タンパク質は、配列番号１９、２０、４８、４９、５２、５３または５４に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性のようなこれらの範囲内のあらゆる類似性パーセントを含む)を有する配列によりコードされ得る。

アミノ酸配列類似性または同一性は、ＢＬＡＳＴ(basic local alignment search tool)２.０アルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用してコンピュータ処理し得る。アミノ酸配列類似性または同一性をコンピュータ処理する技術は当業者に周知であり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用はALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403-410)およびALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)に記載されている。

用語“ウイルス様粒子”(ＶＬＰ)または“ウイルス様粒子群”または“ＶＬＰ”は、例えばロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６および／またはＶＰ７構造タンパク質であるが、これらに限定されない、自己集合で、１個以上の構造タンパク質を含む、構造をいう。ロタウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰはまた“ロタウイルスＶＬＰ”、“ロタウイルス様粒子(ＲＶＬＰ)”、“ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)”、“ロタウイルス様粒子”、“ＲＶＬＰ”または“ＲＬＰ”と呼んでもよい。ＶＬＰまたはＲＬＰは、一般的に形態的におよび抗原性的に感染により産生されるビリオンに類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠き、ゆえに非感染性である。ＶＬＰはまた植物宿主細胞を含む適当な宿主細胞で産生され得る。宿主細胞からの抽出後、適当な条件下での単離およびさらなる精製により、ＶＬＰは無傷構造として精製され得る。ＲＬＰは単層、二層または三層ＲＬＰであり得る。単層ＲＬＰは、ＶＰ２またはＶＰ６のような１個のロタウイルス構造タンパク質発現により得ることができる。二層ＲＬＰは、例えばＶＰ２およびＶＰ６の、ＶＰ４を伴うまたは伴わない同時発現のような２個のロタウイルス構造タンパク質発現により得ることができる。三層ＲＬＰは、例えば、ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７の、ＶＰ４を伴うまたは伴わない同時発現のような、少なくとも３個のロタウイルス構造タンパク質の同時発現により得ることができる。ＶＰ４の同時発現は、天然ロタウイルスに類似するスパイクを有する粒子をもたらす。ＶＰ４をプロセシングまたは開裂してＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。このプロセシングは、宿主内で、内在性プロテアーゼ群を使用してまたは適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの同時発現により行い得る。あるいは、ＶＰ４を、ＲＬＰ抽出法の任意の工程中にまたはＲＬＰ精製後、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの添加によりプロセシングしてＶＰ５およびＶＰ８を産生させてよい。

ロタウイルス構造タンパク質の各々は異なる特徴およびサイズを有し、ＲＬＰへの集合のために種々の量で必要である。用語“ロタウイルスＶＬＰ”、“ロタウイルスウイルス様粒子(ＲＶＬＰ)”、“ロタウイルスウイルス様粒子(ＲＬＰ)”、“ロタウイルスウイルス様粒子”、“ＲＶＬＰ”または“ＲＬＰ”は、１個以上のロタウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子(ＶＬＰ)をいう。ロタウイルス構造タンパク質の例は、ＶＰ２、ＶＰ４(またはＶＰ５およびＶＰ８)、ＶＰ６およびＶＰ７構造タンパク質を含むが、これらに限定されない。

本発明はまた植物でＲＬＰを産生する方法を提供し、ここで、第一ロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２またはＶＰ６タンパク質をコードする第一核酸(第一核酸)を、第二ロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ６またはＶＰ２タンパク質をコードする第二核酸と同時発現させ得る。さらに、第三ロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ４またはＶＰ７をコードする第三核酸を、第一核酸、第二核酸および第三核酸類が植物で同時発現するように、第一および第二核酸と同時発現させ得る。第一核酸、第二核酸および第三核酸は同じ工程で植物に導入しても、連続的に植物に導入してもよい。適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンをコードする核酸を宿主内で同時発現させることにより、ＶＰ４をプロセシングまたは開裂してＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。あるいは、ＶＰ４を、ＲＬＰ抽出の任意の工程中またはＲＬＰ精製後、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの添加により処理し得る。

さらに、第一ロタウイルス構造タンパク質をコードする第一核酸、第二ロタウイルス構造タンパク質をコードする第二核酸および第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三核酸を発現する植物を、さらに第四ロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ７またはＶＰ４タンパク質をコードする第四核酸で、第一核酸、第二核酸、第三核酸および第四核酸が植物で同時発現されるように形質転換してよい。宿主内で適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンをコードする核酸の同時発現によりＶＰ４をプロセシングまたは開裂してＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。あるいは、ＶＰ４を、ＲＬＰ抽出の任意の工程中またはＲＬＰ精製後、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの添加により処理し得る。

さらに、１個以上のロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２またはＶＰ６タンパク質をコードする第一核酸を発現する第一植物を、例えばＶＰ６またはＶＰ２タンパク質であるがこれらに限定されない１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第二核酸を発現する第二植物と交配させて、それぞれＶＰ２とＶＰ６またはＶＰ６とＶＰ２をコードする第一核酸および第二核酸を同時発現する後代植物(第三植物)を産生し得る。さらに、それぞれＶＰ２とＶＰ６またはＶＰ６とＶＰ２をコードする第一核酸および第二核酸を発現する第三植物を、例えばＶＰ４またはＶＰ７であるが、これらに限定されない１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第三核酸を発現する第四植物と交配させて、さらにそれぞれＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ４またはＶＰ７をコードする第一核酸、第二核酸および第三核酸を同時発現する後代植物(第五植物)を産生し得る。第一、第二、第三または第四植物のいずれか一つで、植物内で宿主プロテアーゼを使用してまたは適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンをコードする核酸を同時発現させて、ＶＰ４をプロセシングまたは開裂してＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。あるいは、ＶＰ４を、ＲＬＰ抽出の任意の工程中またはＲＬＰ精製後、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの添加により処理し得る。

下にさらに詳述するとおり、ＲＬＰは、植物内で、例えばＶＰ２、ＶＰ６またはＶＰ７であるが、これらに限定されない１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする核酸(第一核酸)の発現により産生し得る。例えばＶＰ７、ＶＰ６またはＶＰ２であるが、これらに限定されない第二ロタウイルス構造タンパク質をコードする第二核酸を植物内で同時発現させ得る。さらに、例えばＶＰ６、ＶＰ７またはＶＰ２であるが、これらに限定されない第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三核酸を植物内で同時発現させ得る。該核酸、第二核酸および第三核酸は同じ工程で植物に導入しても、連続的に植物に導入してもよい。該核酸、第二核酸および第三核酸を植物に一過性方法でまたは安定な方法で導入し得る。

さらに、第一ロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２タンパク質をコードする第一核酸を発現する植物を、例えばＶＰ６またはＶＰ７であるが、これらに限定されない第二ロタウイルス構造タンパク質をコードする第二核酸で、第一核酸および第二核酸の両者が植物内で同時発現されるように形質転換し得る。植物を、例えばＶＰ７またはＶＰ６であるが、これらに限定されない第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三核酸でさらに形質転換し得る。

あるいは、ＶＰ６またはＶＰ７タンパク質(第二核酸)を発現する植物を、ＶＰ２タンパク質をコードする第一核酸で、第一核酸および第二核酸の両者が植物内で同時発現されるように形質転換し得る。植物は、例えばＶＰ７またはＶＰ６であるが、これらに限定されない第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三核酸でさらに形質転換し得る。

さらに、第一および第二ロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２およびＶＰ６タンパク質をコードする第一および第二核酸を発現する植物を、第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三核酸、例えばＶＰ４またはＶＰ７で形質転換し得る。適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンをコードする核酸の同時発現により、ＶＰ４をプロセシングまたは開裂してＶＰ５およびＶＰ８を産生してよい。あるいは、ＶＰ４を、ＲＬＰ抽出の任意の工程中またはＲＬＰ精製後、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの添加により処理し得る。

本発明はまた、植物内で活性のある調節領域に作動可能に連結する１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする１個以上の核酸および１個以上の区画ターゲティング配列および／または増幅エレメントを植物、植物の一部または植物細胞に導入することを含む、植物でＲＬＰを産生する方法も提供する。次いで、植物、植物の一部または植物細胞を１個以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生する。１個以上のロタウイルス構造タンパク質はＶＰ２、ＶＰ４(またはＶＰ５およびＶＰ８)、ＶＰ６、ＶＰ７、またはＶＰ２、ＶＰ４(またはＶＰ５およびＶＰ８)、ＶＰ６、ＶＰ７のフラグメントまたはこれらの組み合わせであり得る。

本発明は、さらに例えばＶＰ２、ＶＰ４(またはＶＰ５およびＶＰ８)、ＶＰ６、ＶＰ７またはこれらの組み合わせであるが、これらに限定されない１個以上のロタウイルス構造タンパク質を含むＲＬＰを提供する。ＲＬＰは、本発明により提供される方法の１個以上により産生され得る。

ＲＬＰの発生は、任意の適当な方法、例えば密度勾配遠心分離または分子ふるいクロマトグラフィーを使用して検出し得る。ＲＬＰは、例えば電子顕微鏡または分子ふるいクロマトグラフィーにより、構造およびサイズを評価し得る。

分子ふるいクロマトグラフィーに関して、総可溶性タンパク質を、凍結粉砕植物原料サンプルを抽出緩衝液中で均質化(Polytron)し、不溶性物質を遠心分離により除去することにより、植物組織から抽出し得る。氷冷アセトンまたはＰＥＧでの沈殿も有効であり得る。可溶性タンパク質を定量し、抽出物をSephacryl^ＴＭカラム、例えばSephacryl^ＴＭ Ｓ５００カラムを通して抽出する。ブルーデキストラン２０００を校正基準として使用し得る。クロマトグラフィー後、フラクションをさらに免疫ブロットで分析して、フラクションのタンパク質含量を決定し得る。

分離したフラクションは、例えば上清(遠心分離したならば、沈降または沈殿)または濾液(濾過したならば)であり、タンパク質または例えばナノチューブ、ナノ球体のような上部構造タンパク質または単層(ｓｌ)、二層(ｄｌ)または三層(ｔｌ)ＲＬＰのような高次、高分子量の粒子に富む。

分離したフラクションをさらに処理して、例えば、さらなる遠心分離段階、沈殿、クロマトグラフィー段階(例えば分子ふるい、イオン交換、親和性クロマトグラフィー)、接線流濾過またはこれらの組み合わせにより、タンパク質、上部構造タンパク質または高次粒子を単離、精製、濃縮またはこれらの組み合わせに付し得る。精製タンパク質、上部構造タンパク質またはＲＬＰのような高次粒子の存在は、例えば、天然またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適当な検出抗体を使用するウェスタン分析、キャピラリー電気泳動、電子顕微鏡または当業者には明白な任意の他の方法により確認し得る。

本発明によって産生されるＲＬＰは植物、植物の一部または植物体から精製、あるいは一部精製してよくまたは当業者に知られた方法を使用して経口ワクチンとして投与してよい。

ＲＬＰ精製は、勾配遠心分離を含み、例えばスクロース、イオジキサノール、ＯｐｔｉＰｒｅｐ^ＴＭまたは塩化セシウム(ＣｓＣｌ)密度勾配を使用して、形質転換植物バイオマスからＲＬＰを精製または一部精製し得る。例えば図４５に示すとおり、イオジキサノール段階的勾配またはイオジキサノール連続的勾配を使用して、ＲＬＰおよび／または発現ロタウイルス構造タンパク質を精製し得る。

カルシウム(Ｃａ^２＋)濃度は三層粒子(ＴＬＰ)から二層粒子(ＤＬＰ)への形質転換に重要であり、株依存性であることが示されている(例えば引用により本明細書に包含させるMartin et al. Journal of Virology, Jan 2002参照)。ＴＬＰからの外側カプシドタンパク質の完全な除去(ＴＬＰ脱カプシド化)はナノモル濃度範囲の[Ｃａ^２＋]で起こる。それゆえに、ＲＬＰの精製および／または抽出はカルシウム存在下で行ってよく、勾配遠心分離の工程はカルシウム存在下、例えばＣａＣｌ_２存在下で実施し得る。ＣａＣｌ_２濃度は、例えば、１mM〜１０００mMの範囲またはその間の範囲の任意の量、例えば２mM、３mM、４mM、５mM、６mM、７mM、８mM、９mM、１０mM、１１mM、１２mM、１３mM、１４mM、１５mM、２０mM、２５mM、３０mM、４０mM、５０mM、１００mM、１５０mM、２００mM、２５０mM、３００mM、３５０mM、４００mM、４５０mM、５００mM、５０mM、６００mM、６５０mM、７００mM、７５０mM、８００mM、８５０mM、９００mM、９５０mMまたはその間の任意の量であり得る。

植物または植物フラグメントは最小限プロセシングされていてよい。用語“最小限プロセシング”なる用語は、興味あるタンパク質および／またはＲＬＰを含む植物体あるいはその一部、例えば、植物またはその一部が、植物抽出物、ホモジネート、植物ホモジネートのフラクションなどを生じるように一部精製されている(すなわち最小限プロセシングされている)ことを意味する。一部精製は、植物細胞構造を破壊し、それにより、例えば遠心分離、濾過またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない方法により分離し得る可溶性植物成分および不溶性植物成分を含む組成物を製造することを含み得るが、これらに限定されない。この点に関し、葉または他の組織の細胞外間隙に分泌されたタンパク質を、吸引または遠心分離抽出により容易に得ることができ、または組織をローラーを通すかまたは粉砕などを行い加圧下に抽出して細胞外間隙内からタンパク質を搾り出すまたは遊離させ得る。最小限プロセシングはまた可溶性タンパク質の粗製抽出物の調製を含み得て、なぜならこれらの調製物が二次的植物生成物の混入が無視できるからである。さらに、最小限プロセシングは、葉からの可溶性タンパク質の水性抽出、続く任意の適当な塩での沈殿を含み得る。他の方法は、抽出物の直接使用を可能にするための大規模浸軟および絞り汁抽出を含み得る。ＲＬＰを、任意の適当な方法、例えば機械的または生化学的抽出を使用して精製または抽出し得る。

１個以上のロタウイルス構造タンパク質を、最大２ｇ／kg生植物重量の量で合成し得る。例えば、合成構造タンパク質の量は、１〜２ｇ／kg生重量またはその間の任意の量、例えば１.０ｇ／kg生重量、１.１ｇ／kg生重量、１.２ｇ／kg生重量、１.３ｇ／kg生重量、１.４ｇ／kg生重量、１.５ｇ／kg生重量、１.６ｇ／kg生重量、１.７ｇ／kg生重量、１.８ｇ／kg生重量、１.９ｇ／kg生重量、２ｇ／kg生重量またはその間の任意の量であり得る。例えば、構造タンパク質は最大１.５４ｇ／kg生植物重量の量で合成し得る。

さらに、ＲＬＰは最大１.５ｇ／kg生植物重量の量で合成し得る。例えば、合成ＲＬＰ量は０.５〜１.５ｇ／kg生重量または０.５ｇ／kg生重量、０.６ｇ／kg生重量、０.７ｇ／kg生重量、０.８ｇ／kg生重量、０.９ｇ／kg生重量、１.０ｇ／kg生重量、１.１ｇ／kg生重量、１.２ｇ／kg生重量、１.３ｇ／kg生重量、１.４ｇ／kg生重量、１.５ｇ／kg生重量のようなその間の任意の量であり得る。例えば、ＲＬＰを最大１.１ｇ／kg生植物重量の量で合成し得る。

上に定義したＲＬＰのサイズ(すなわち直径)は、例えば動的光散乱(ＤＬＳ)または電子顕微鏡(ＥＭ)方法で測定して、通常５０〜１１０nmまたはその間の任意のサイズであり得る。例えば、無傷ＲＬＰ構造のサイズは約７０nm〜約１１０nmの範囲またはその間の任意のサイズ、例えば７５nm、８０nm、８５nm、９０nm、９５nm、１００nm、１０５nmまたはその間の任意のサイズであり得る。

本発明は、さらに植物内で活性のある調節領域に作動可能に連結する１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ヌクレオチド配列は、例えばヒトコドン使用頻度または植物コドン使用頻度について最適化し得る。さらに１個以上のロタウイルス構造タンパク質は１個以上の増幅エレメントに作動可能に連結し得る。さらに１個以上のロタウイルス構造タンパク質は１個以上の区画ターゲティング配列に作動可能に連結し得る。ヌクレオチド配列によりコードされる１個以上のロタウイルス構造タンパク質は例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６またはＶＰ７であり得る。さらにヌクレオチド配列によりコードされる１個以上のロタウイルス構造タンパク質は、例えばロタウイルスＡ〜Ｇ群の任意のもの由来であるが、より好ましくはロタウイルスＡ群由来である。さらに、ヌクレオチド配列によりコードされる１個以上のロタウイルス構造タンパク質は、Ｇ１〜Ｇ２７およびＰ１〜Ｐ３４由来、より好ましくはＧ１〜Ｇ１９およびＰ１〜Ｐ２７由来のＧ型およびＰ型の任意の組み合わせの遺伝子型を有する任意のロタウイルス株由来であってよく、Ｇ１Ｐ[８]、Ｇ２Ｐ[４]、Ｇ２Ｐ[８]、Ｇ３Ｐ[８]、Ｇ４Ｐ[８]、Ｇ９Ｐ[６]、Ｇ９Ｐ[８]、ロタウイルスＡ群ＷＡ株、ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株またはロタウイルスＳＡ１１株を含むが、これらに限定されない。

本発明で言及する核酸配列は、該核酸配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で個々に定義する１個以上のヌクレオチド配列または核酸配列の相補体とハイブリダイズするならば、配列または配列の相補体と“実質的に相同”、“実質的に類似”または“実質的に同一”である。配列は、少なくとも約７０％または７０〜１００％またはその間の任意の量、例えば７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、１００％またはその間の任意の量のヌクレオチドが規定長のヌクレオチド配列にわたりマッチするとき、このような相同配列は、ここに記載する配列またはコード化産物の特性の１個以上を示すならば、“実質的に相同”、“実質的に類似”、“実質的に同一”である。

例えば、本発明は、例えば配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４に定義された配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはその間の任意の量同一である１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当分野で知られた任意の方法で最適化したヒトコドンであり得る。

さらに、本発明は、例えば配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、４５、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４に定義された配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはその間の任意の量同一である例えば核酸によりコードされた、ロタウイルス構造タンパク質を含むＲＬＰＳを提供する。

このような配列類似性または同一性は、ＤＮＡＳＩＳ(例えば次のパラメータを使用するが、これらに限定されない：ＧＡＰペナルティ５、最適な対角線の数５、固定ＧＡＰペナルティ１０、ｋタプル２、浮動ギャップ１０およびウィンドウサイズ５)内に提供されるようなヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定し得る。しかしながら、配列比較のためのアラインメントの他の方法、例えばSmith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482)、Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)、Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)のアルゴリズムおよびこれらのアルゴリズムのコンピューター制御実施(ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ、ＮＩＨから入手可能)または手動アラインメントおよび目視(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement参照)またはストリンジェントな条件下のサザンまたはノーザンハイブリダイゼーション(Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982参照)が当分野で周知である。好ましくは、実質的に相同である配列は、分子の規定長にわたり少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％配列類似性を示す。

このようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４×ＳＳＣ中、６５℃で一夜(約１６〜２０時間)ハイブリダイゼーション、続いて６５℃で１時間、０.１×ＳＳＣで洗浄または６５℃で各々２０分または３０分の０.１×ＳＳＣでの２回洗浄を含む。あるいは固有配列領域について、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中、４２℃で一夜(１６〜２０時間)、続いて６５℃で１時間、０.１×ＳＳＣでの洗浄または６５℃でそれぞれ２０分または３０分の０.１×ＳＳＣでの２回洗浄または一夜(１６〜２０時間)またはチャーチ水性リン酸緩衝液(７％ＳＤＳ；０.５Ｍ ＮａＰＯ_４緩衝液ｐＨ７.２；１０mM ＥＤＴＡ)中、６５℃でのハイブリダイゼーション、それぞれ５０℃で２０分または３０分の０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの２回洗浄またはそれぞれ６５℃で２０分または３０分の２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの２回洗浄であり得る。

ロタウイルス構造ポリペチドをコードする核酸は“ロタウイルス核酸”、“ロタウイルスヌクレオチド配列”、“ロタウイルス核酸”または“ロタウイルスヌクレオチド配列”と記載し得る。例えば、限定と解釈してはならないが、１個以上のロタウイルス構造タンパク質またはロタウイルス構造ポリペチドを含むウイルス様粒子は“ロタウイルスＶＬＰ”、“ＲＶＬＰ”または“ＲＬＰ”と記載し得る。

多くの生物は、伸長しているペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドン使用に対する偏りを示す。コドン優先性またはコドン偏り、生物間でのコドン使用頻度の差は、遺伝暗号縮重により提供され、多くの生物で十分に裏付けられている。コドン偏りはしばしばメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の翻訳効率と相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ(ｔＲＮＡ)分子の利用能に依存すると考えられている。細胞内で選択したｔＲＮＡが優勢であることは、一般的にペプチド合成で最も高頻度で使用されるコドンを反映する。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づきある生物における最適遺伝子発現のために調整できる。異種性に発現するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の最適化は、発現収率改善のための重要な工程であり得る。最適化必須要件は、宿主が外来タンパク質を産生する能力を改善する段階を含み得る。

“コドン最適化”は、天然配列のコドンの少なくとも１個、１個以上または相当数を、他の生物または種の遺伝子でより高頻度でまたは最も高頻度で使用され得るコドンに置き換えることによる、興味ある細胞中の発現を増強するための核酸配列の修飾として定義される。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対して特定の偏りを示す。

本発明は、コドン最適化している合成ポリヌクレオチド配列、例えばヒトコドン使用法または植物コドン使用法について最適化している配列を含む。コドン最適化ポリヌクレオチド配列は植物で発現し得る。より具体的にヒトコドン使用法または植物コドン使用法について最適化した配列を植物で発現させ得る。理論に縛られることを望まないが、ヒトコドンについて最適化した配列は配列のグアニン−シトシン含量(ＧＣ含量)が増え、植物での発現収率を改善すると考えられる。

翻訳が非効率なタンパク質コーディング領域の翻訳動態を改善するための、当分野で知られる種々のコドン最適化方法がある。これらの方法は、主として、ある宿主生物のコドン使用頻度の同定に頼る。ある遺伝子または配列がこの生物で発現されるべきであるならば、続いて、かかる遺伝子および配列のコーディング配列を、興味ある配列のコドンを宿主生物のコドンでより高頻度で使用されるものに置き換えるように修飾する。

ロタウイルス構造タンパク質またはポリペチドは、例えばコモウイルスベースの発現カセットおよびジェミニウイルスベースの増幅エレメントであるが、これらに限定されないウイルスベースのＤＮＡまたはＲＮＡ発現系を含む発現系で発現させ得る。

ここに記載する発現系は、二分節ウイルスまたは二分節ゲノムを有するウイルスに基づく発現カセットを含み得る。例えば、二分節ウイルスはコモウイルス科のものであり得る。コモウイルス科の属は、コモウイルス、ネポウイルス、ファバウイルス、チェラウイルスおよびサドワウイルスを含む。コモウイルスは、ササゲモザイクウイルス(Cowpea mosaic virus)(ＣＰＭＶ)、ササゲ重度モザイクウイルス(Cowpea severe mosaic virus)(ＣＰＳＭＶ)、スカッシュモザイクウイルス(Squash mosaic virus)(ＳｑＭＶ)、赤クローバー斑紋ウイルス(Red clover mottle virus)(ＲＣＭＶ)、豆鞘斑紋ウイルス(Bean pod mottle virus)(ＢＰＭＶ)、カブ輪点ウイルス(Turnip ringspot virus)(ＴｕＲＳＶ)、ソラマメトゥルーモザイクウイルス(Broad bean true mosaic virus)(ＢＢｔＭＶ)、ソラマメステインウイルス(Broad bean stain virus)(ＢＢＳＶ)、ダイコンモザイクウイルス(Radish mosaic virus)(ＲａＭＶ)を含む。本発明の種々の面に有用であり得るエンハンサー配列を含むコモウイルスＲＮＡ−２配列の例は、ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２(GenBank Accession No. NC_003550)、ＲＣＭＶ ＲＮＡ−２(GenBank Accession No. NC_003738)、ＢＰＭＶ ＲＮＡ−２(GenBank Accession No. NC_003495)、ＣＰＳＭＶ ＲＮＡ−２(GenBank Accession No.NC_003544)、ＳｑＭＶ ＲＮＡ−２(GenBank Accession No.NC_003800)、ＴｕＲＳＶ ＲＮＡ−２(GenBank Accession No. NC_013219.1)、ＢＢｔＭＶ ＲＮＡ−２(GenBank Accession No. GU810904)、ＢＢＳＶ ＲＮＡ２(GenBank Accession No. FJ028650)、ＲａＭＶ(GenBank Accession No. NC_003800)を含むが、これらに限定されない。

二分節コモウイルスＲＮＡゲノムのセグメントをＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と呼ぶ。ＲＮＡ−１は複製に関与するタンパク質をコードし、一方ＲＮＡ−２は細胞間移行および２個のカプシドタンパク質に必要なタンパク質をコードする。ＣＰＭＶ、ＣＰＳＭＶ、ＳｑＭＶ、ＲＣＭＶまたはＢＰＭＶを含む任意の適当なコモウイルスベースのカセットを使用でき、例えば、発現カセットはＣＰＭＶに基づき得る。

“発現カセット”は、宿主細胞での興味ある核酸の転写のための適当なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、かつ操作可能に(または操作可能なように)連結された興味ある核酸を含むヌクレオチド配列をいう。

発現系はまたジェミニウイルスからの増幅エレメント、例えば、マメ黄化萎縮ウイルス(bean yellow dwarf virus)(ＢｅＹＤＶ)からの増幅エレメントも含み得る。ＢｅＹＤＶは双子葉植物に適したマストレウイルス属に属する。ＢｅＹＤＶは、一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する単分節(monopartite)であり、ローリング・サークル機構により極めて高い複製数まで複製できる。ＢｅＹＤＶ由来ＤＮＡレプリコンベクター系は植物での急速高収率タンパク質産生に使用されている。

ここで使用する用語“増幅エレメント”は、ジェミニウイルスゲノムの長遺伝子間領域または長遺伝子間反復(ＬＩＲ)の１個以上の少なくとも一部を含む核酸セグメントをいう。ここで使用する“長遺伝子間領域”または“長遺伝子間反復”は、ジェミニウイルスＲｅｐタンパク質による切除および複製を仲介できるｒｅｐ結合部位を含む長遺伝子間領域の領域をいう。ある面において、１個以上のＬＩＲを含む核酸セグメントはさらにジェミニウイルスゲノムの短遺伝子間領域または小遺伝子間領域(ＳＩＲ)を含み得る。ここで使用する“短遺伝子間領域”または“小遺伝子間領域”は、相補鎖(マストレウイルスの短ＩＲ(ＳＩＲ))をいう。任意の適当なジェミニウイルス由来増幅エレメントをここで使用し得る。例えば、引用によりここに包含するＷＯ２０００／２０５５７；ＷＯ２０１０／０２５２８５；Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17)参照。１個を超えるＬＩＲ、例えば２個のＬＩＲを構築物で使用するならば、プロモーター、ＣＭＰＶ−ＨＴ領域および興味ある核酸配列およびターミネーターを、２個のＬＩＲの各々で一括りにする。さらに、増幅エレメントは、例えば、引用によりここに包含するHalley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240に記載のGenbank受託番号ＤＱ４５８７９１により寄託された配列から開始されなければならない。ＬＩＲを含む核酸セグメントは、ヌクレオチド２４０１〜２５６６および１〜１２８と連結する。ＳＩＲを含む核酸セグメントは、ヌクレオチド１１５４〜１２１２である。

ここに記載するとおり、ベンサミアナタバコ葉のアグロインフィルトレーションによるマメ黄化萎縮ウイルス(ＢｅＹＤＶ)由来ベクターとＲｅｐ／ＲｅｐＡ供給ベクターの共導入は、効率的レプリコン増幅および堅固なタンパク質産生をもたらす。

コモウイルスベースの発現カセットおよびジェミニウイルス由来増幅エレメントは別々のベクターを構成してよくまたは構成成分は１個のベクターに含まれていてよい。２個のベクターを使用するならば、第一および第二ベクターを植物細胞に同時にまたは別々に導入してよい。

ウイルスレプリカーゼはまた興味ある核酸の発現を増加させるために、ここに記載する発現系に包含させてよい。レプリカーゼの非限定的例は、ＢｅＹＤＶ ＲｅｐおよびＲｅｐＡをコードするＢｅＹＤＶレプリカーゼ(ｐＲＥＰ１１０)である(Ｃ２／Ｃ１；Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714；これは引用により本明細書に包含させる)。レプリカーゼの他の非限定的例はHalley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240に記載され、Genbank受託番号ＤＱ４５８７９１により寄託され、これは引用により本明細書に包含させる。Ｃ１：Ｃ２遺伝子を含む核酸セグメントはヌクレオチド１３１０〜２４００である。

“同時発現”は、２個または２個を超えるヌクレオチド配列が、植物内でおよび植物の同じ組織でほぼ同時に発現することを意味する。しかしながら、これらのヌクレオチド配列は正確に同時に発現する必要はない。むしろ、２個以上のヌクレオチド配列は、コードした生成物が相互作用する機会を有するような方法で発現する。２個以上のヌクレオチド配列は、一過性発現系を使用して同時発現でき、ここで、２個以上の配列を、両配列が発現されるような条件下、植物にほぼ同時に導入する。あるいは、ヌクレオチド配列の１個を含むプラットホーム植物を、さらなる興味あるタンパク質をコードする配列で安定な方法で形質転換し、例えば１個以上のロタウイルス構造タンパク質をプラットホーム植物に一過性方法で導入し得る。

タンパク質の正確な折りたたみはタンパク質安定性、多量体形成、ＲＬＰ形成および機能に重要である。タンパク質の折りたたみは、タンパク質配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内密集の程度、折りたたまれた、一部折りたたまれたまたは折りたたまれていないタンパク質に結合し、または一過性に関連し得る補因子の利用能を含むが、これらに限定されない１個以上の因子により影響を受け得る。さらにタンパク質が発現する場所である植物内の区画または亜区画は、タンパク質の発現レベルおよび折りたたみに影響を与え得る。

１個以上のロタウイルス構造タンパク質の発現は、トランスジェニック植物のアグロインフィルトレーションにより特定の植物細胞区画および／または亜区画に標的化し得る。区画または亜区画は例えば色素体、小胞体(ＥＲ)、葉緑体またはアポプラストであり得る。理論に縛られることを望まないが、区画または亜区画ターゲティングは、細胞質蓄積よりも標的区画または亜区画へのタンパク質蓄積を増やし得る。区画または亜区画蓄積は、細胞質に存在するプロテアーゼ群による分解からタンパク質を保護しおよび／または植物細胞の機能に影響することなく高濃度での蓄積を可能にし得る。

それゆえに、発現カセットまたはベクターは、植物内の所望の区画または亜区画へベクターまたはベクターからのロタウイルス構造タンパク質またはポリペチド発現を指向するのに適し得る。

例えば、発現カセットまたはベクターは、色素体のチラコイド膜、特にチラコイド膜の転移機構と相互作用できる部分を包含させることにより発現ロタウイルス構造タンパク質またはポリペチドを色素体に標的化するのに適合させ得る。この相互作用は、ロタウイルス構造タンパク質またはポリペチドの、発現された場所である細胞質から色素体への移入を誘発し得る。理論に縛られることを望まないが、細胞質からの移入機構は、タンパク質の適切な折りたたみに重要であり得る。発現カセットまたはベクターを、形質転換され、ロタウイルス構造タンパク質またはポリペチドの発現が完全に色素体で起こるように色素体自体を標的化するのに適合させ得ることは認識される。

用語“ターゲティング配列”は、ターゲティング配列がベクターまたは発現カセットに包含され得ることを意味する。このようなターゲティング配列はペプチドに翻訳され、これはベクターまたはその産物を、色素体のような植物内の所望の区画または亜区画に指向させ得る。例えば、タンパク質を色素体にターゲティングするための色素体シグナルペプチド(当分野では“色素体輸送ペプチド”とも呼ばれる)は当分野で知られる。使用し得る色素体輸送ペプチドの非限定的例はｒｂｃｓ１−ｃＴＰである。葉緑体移行ペプチド配列の適当な例は、例えば、ジャガイモ(Solanum tuberosum)からのルビスコ小サブユニット遺伝子(ｒｂｃＳ１)である。

それゆえに、ロタウイルス構造タンパク質またはポリペチドは、残りのポリペチドまたはタンパク質と同じまたは異種性のシグナルペプチドを含み得る。用語“シグナルペプチド”は当分野で周知であり、新たに翻訳したポリペチドの特定のオルガネラへの転位を指向し得るまたはポリペチド鎖の特定のドメインの他に対する位置決めを助ける、一般的にポリペチドのＮ末端で見られるアミノ酸の短い(約５〜３０アミノ酸)配列を一般的にいう。非限定的例として、シグナルペプチドは、タンパク質の小胞体への転位を標的とし得るおよび／または新生ポリペチドの膜アンカードメインに対するＮ末端近位ドメインの位置決めを助け、成熟タンパク質、例えば限定と解釈してはならないが、ロタウイルス構造タンパク質の開裂および折りたたみを助ける。

シグナルペプチド(ＳＰ)はタンパク質またはウイルスタンパク質に対して天然であってよく、またはシグナルペプチドは発現するタンパク質またはウイルスタンパク質の一次配列に関して異種性であり得る。例えばロタウイルス構造タンパク質の天然シグナルペプチドを使用して、ロタウイルス構造タンパク質を植物系で発現させ得る。

シグナルペプチドはまた非天然、例えば、ロタウイルスタンパク質以外のウイルスからのタンパク質、ウイルスタンパク質または天然構造タンパク質由来または植物、動物または細菌ポリペチド由来であり得る。使用し得るシグナルペプチドの非限定的例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(ＰＤＩＳＰ)(受託番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３)であり得る。さらに、シグナルペプチドは完全に欠失していても切断されていてもよい。切断または切断型は、アミノ酸残基の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはその間の任意の量がシグナルペプチドから欠失していることを意味する。好ましくは、切断型アミノ酸残基は連続的であり、切断は第二メチオニン以降に起こる。

本発明は、それゆえに、天然、非天然シグナルペプチドまたは切断型シグナルペプチドを含む、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６および／またはＶＰ７のようなロタウイルス構造タンパク質およびこのようなロタウイルス構造タンパク質をコードする核酸類を提供する。

本発明の１個以上の遺伝子構築物を、本発明のヌクレオチド配列または構築物またはベクターで形質転換した任意の適当な植物宿主で発現させ得る。適当な宿主の例は、アルファルファ、キャノーラ、アブラナ属、トウモロコシ、タバコ属、ジャガイモ、人参、エンドウマメ、カラスムギ、コメ、ダイズ、小麦、オオムギ、ヒマワリ、綿などを含む農作物を含むが、これらに限定されない。

ロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１個、２個、３個、４個または５個のバイナリープラスミドベクターを使用して植物宿主に導入され得る。各バイナリープラスミドベクターは、それゆえに、１個、２個、３個、４個または５個のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

１個以上の本発明の遺伝子構築物は、さらに３’非翻訳領域を含み得る。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に作用できる任意の他の制御シグナルを含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子の部分をいう。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆体３’末端へのポリアデニル酸トラックの付加を行うことにより特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは、一般に、標準形式５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在により認識されるが、変異は珍しくない。適当な３’領域の非限定的例は、ノパリンシンターゼ(ＮＯＳ)遺伝子のようなアグロバクテリウム腫瘍誘発(Ｔｉ)プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナル、ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子のような植物遺伝子、リブロース−１,５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット(ｓｓルビスコ；ＵＳ４,９６２,０２８；これは引用により本明細書に包含させる)、ＵＳ７,１２５,９７８(これは引用により本明細書に包含させる)に記載されるプラストシアニン発現制御に使用されるプロモーターを含む３’転写非翻訳領域である。

本発明の遺伝子構築物の１個以上はまたさらに必要に応じて翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーいずれかのエンハンサーを含んでよい。エンハンサーは転写される配列の５’または３’に位置し得る。エンハンサー領域は当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドン、隣接配列などを含み得る。開始コドンは、存在するならば、転写配列の正確な翻訳を提供するために、コーディング配列の読み枠に同調し得る(“インフレーム”)。

本発明の構築物を、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して植物細胞に導入できる。このような技法のレビューについて、例えばWeissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); およびMiki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)参照。他の方法は、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、例えば、プロトプラストを使用するエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカーおよび真空浸潤がある。例えば、Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002)、米国特許番号４,９４５,０５０；５,０３６,００６；および５,１００,７９２、米国特許出願番号０８／４３８,６６６(１９９５年５月１０日出願)および０７／９５１,７１５(１９９２年９月２５日出願)を参照のこと(これら全ては引用により本明細書に包含させる)。

一過性発現
理論に縛られることを望まないが、タンパク質濃度および種々のロタウイルス構造タンパク質の比率は、ＲＬＰの集合効率に重要であり得る。それゆえに感染効率および感染時間は、植物中のＲＬＰのタンパク質濃度およびアッセンブリー効率全体に重要であり得る。

本発明の構築物は植物または植物の一部で一過性に発現し得る。植物、植物の一部または植物細胞における組み換えアグロバクテリウム・ツメファシエンスの染色体外発現に依存する一過性発現系を、種々の細胞区画または亜区画を標的としたロタウイルス構造タンパク質の発現に使用し得る。一過性発現系は高速産生を可能にする。さらに、大量のタンパク質が、植物への組み換えアグロバクテリウムの浸潤後数日以内に獲得できる(Rybicki, 2010;Fischer et al., 1999)。長遺伝子配列を発現することおよび１個を超える遺伝子を同時に同じ細胞で発現させることも可能であり、多量体タンパク質の効率的集合が可能となる(Lombardi et al., 2009)。

ロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１個、２個、３個、４個または５個の形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンス株中で植物宿主に導入され得る。

しかしながら、一過性発現中、転写後遺伝子サイレンシングが植物での異種性タンパク質の発現を制限し得る。例えば、トマト黄化壊疽ウイルスからのＮｓｓであるがこれに限定されないサイレンシングのサプレッサーの同時発現を使用して、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を相殺し得る(Brigneti et al., 1998)。サイレンシングの代替的サプレッサーは当分野で周知であり、例えばＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ(タバコエッチ病ウイルス(Tobacco etch virus)１／ＨＣ−Ｐｒｏ)、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルス(Tomato bushy stunt virus)のｐ１９(ＴＢＳＶ ｐ１９)、トマト縮葉ウイルス(Tomato crinkle virus)のカプシドタンパク質(ＴＣＶ−ＣＰ)、キュウリモザイクウイルス(Cucumber mosaic virus)の２ｂ(ＣＭＶ−２ｂ)、ジャガイモウイルスＸのｐ２５(ＰＶＸ−ｐ２５)、ジャガイモウイルスＭのｐ１１(ＰＶＭ−ｐ１１)、ジャガイモウイルスＳのｐ１１(ＰＶＳ−ｐ１１)、ブルーベリースコーチウイルス(Blueberry scorch virus)のｐ１６(ＢＳｃＶ−ｐ１６)、カンキツトリステザウイルス(Citrus tristexa virus)のｐ２３(ＣＴＶ−ｐ２３)、ブドウ葉巻随伴ウイルス−２(Grapevine leafroll-associated virus-2)のｐ２４(ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４)、ブドウウイルスＡのｐ１０(ＧＶＡ−ｐ１０)、ブドウウイルスＢのｐ１４(ＧＶＢ−ｐ１４)、ハナウド潜在ウイルス(Heracleum latent virus)のｐ１０(ＨＬＶ−ｐ１０)またはニンニク潜在ウイルス(Garlic common latent virus)のｐ１６(ＧＣＬＶ−ｐ１６)を含むが、これらに限定されず、ここに記載するとおり使用し得る(Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14；これは引用により本明細書に包含させる)。それゆえに、サイレンシングのサプレッサー、例えばＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０は、植物または植物の一部内で高レベルのタンパク質産生をさらに確実にするために１個以上のロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６またはこれらの組み合わせと共に同時発現させ得る。

本発明はまた上記方法であって、ここで、付加的(第二、第三、第四または第五)ヌクレオチド配列を植物内で発現させ、サイレンシングのサプレッサーをコードする該付加的(第二、第三、第四または第五)ヌクレオチド配列は、植物で活性な付加的(第二、第三、第四または第五)調節領域と作動可能に連結している。サイレンシングのサプレッサーをコードするヌクレオチド配列は、例えばＮｓｓ、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０であり得る。

下記のとおり、一過性発現方法を使用して、本発明の構築物を発現させ得る(Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348参照；これは引用により本明細書に包含させる)。あるいは、Kapila et al., 1997(これは引用により本明細書に包含させる)により記載の吸引ベースの一過性発現方法を使用し得る。これらの方法は、例えば、アグロイノキュレーションまたはアグロインフィルトレーション、シリンジ浸潤の方法を含むが、これらに限定されず、しかしながら、他の一過性方法も上記のとおりに使用してよい。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーションまたはシリンジ浸潤を用いて、所望の核酸を含むアグロバクテリアの混合物を、組織、例えば葉、植物の空気中の部分(茎、葉および花)、他の植物の一部(茎、根、花)または植物全体の細胞間間隙に挿入させる。表皮通過後、アグロバクテリアは感染し、ｔ−ＤＮＡコピーを細胞に伝達する。ｔ−ＤＮＡはエピソームで転写され、ｍＲＮＡは翻訳され、感染細胞での興味あるタンパク質の産生に至るが、しかしながら、ｔ−ＤＮＡの核内への侵入は一過性である。

形質転換植物細胞の同定を助けるために、本発明の構築物を、さらに植物選択可能マーカーを包含するように操作してよい。有用な選択可能マーカーは、抗生物質、例えば、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンまたはフォスフィノスリシン、グリホサート、クロルスルフロンのような除草剤などの化学物質に対する耐性を提供する酵素群を含む。同様に、ＧＵＳ(ベータ−グルクロニダーゼ)のような色変化またはルシフェラーゼもしくはＧＦＰのような発光により同定可能な化合物の産生をもたらす酵素群を使用し得る。

また本発明の一部と見なされるのは、本発明の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物、植物細胞または種子である。植物細胞から植物全体を再生する方法も当分野で知られている。一般に、形質転換植物細胞を、選択可能マーカーが形質転換植物細胞の同定を容易にする抗生物質のような選択剤を含み得る適当な培地で培養する。カルスが形成されたら、既知方法に従い適当な植物ホルモン剤を使用して芽形成を促進でき、植物再生のために芽を発根培地に移す。続いて、本植物を使用して、種子からまたは栄養繁殖技法を使用して、反復産生を確立し得る。トランスジェニック植物はまた組織培養を使用せずに産生できる。

本願における用語“調節領域”、“調節エレメント”または“プロモーター”の使用は、典型的に、しかし常にではなく、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの両者から成り得る遺伝子のタンパク質コーディング領域の上流である核酸の一部を示すことを意図する。調節領域が活性であり、興味ある遺伝子と連動する(operative association)かまたは作動可能に連結しているとき、これは興味ある遺伝子の発現をもたらし得る。調節エレメントは、器官特異性の仲介または発育的もしくは一時的遺伝子活性化の制御を可能にし得る。“調節領域”はプロモーターエレメント、基底プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に対する応答により誘導可能なエレメント、ネガティブ調節エレメントまたは転写エンハンサーのようなプロモーター活性を仲介するエレメントを含み得る。ここで使用する“調節領域”は、また転写後活性になるエレメント、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列およびｍＲＮＡ不安定性決定因子のような遺伝子発現を調節する調節エレメントも含み得る。これらの後者のエレメントのいくつかはコーディング領域の近位に位置し得る。

本開示の文脈において、用語“調節エレメント”または“調節領域”は、典型的に、特定の部位での転写開始に必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の因子を認識することにより、コーディング領域の発現を制御する、通常は、しかし必ずではないが、構造遺伝子のコーディング配列の上流(５’)にあるＤＮＡの配列をいう。しかしながら、イントロン内または配列の３’に位置する他のヌクレオチド配列も興味あるコーディング領域発現の制御に寄与し得る。特定の部位での開始を確実にするためのＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子を認識する調節エレメントの例は、プロモーターエレメントである。ほとんどの、しかし全てではない、真核プロモーターエレメントは、通常転写開始部位の約２５塩基対上流に位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対から成る保存核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターエレメントは、転写開始を担う基底プロモーターエレメントならびに遺伝子発現を修飾する他の調節エレメント(上記のとおり)を含む。

発育的に制御される、誘導可能であるまたは恒常的であるものを含む、数タイプの調節領域がある。発育的に制御される調節領域またはその制御下に差次的発現が制御される遺伝子は、ある器官または器官の組織内で、その器官または組織発育中の特定の時期に活性化される。しかしながら、発育的に制御されるいくつかの調節領域は、ある器官または組織で特定の発育的段階で優勢に活性であり得るが、同様に植物内の他の器官または組織で発育的に制御された方法でまたは基底レベルで活性であり得る。組織特異的調節領域、例えば種子特異的調節領域は、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む(Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130)。葉特異的プロモーターの例は、プラストシアニンプロモーターを含む(引用により本明細書に包含させるＵＳ７,１２５,９７８参照)。

誘導可能調節領域は、インデューサーに応答して１個以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化できるものである。インデューサー非存在下で、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。典型的に、転写を活性化するために誘導可能調節領域と特異的に結合するタンパク質因子は不活性形態で存在でき、その後これはインデューサーにより直接的または間接的に活性形態に変換される。しかしながら、本タンパク質因子は存在しなくてもよい。インデューサーはタンパク質、代謝物質、成長調節因子、除草剤またはフェノール性化合物のような化学因子または熱、低温、塩または毒性エレメントにより直接的にまたはウイルスのような病原体または病因物質を介して間接的に負荷される生理学的ストレスであり得る。誘導可能調節領域を含む植物細胞は、例えば散布、散水、加熱または類似方法によって細胞または植物にインデューサーを外的に適用することによりインデューサーに暴露され得る。誘導可能調節エレメントは植物または非植物遺伝子であり得る(例えば引用により本明細書に包含させるGatz, C. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358)。潜在的誘導可能プロモーターの例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーター(引用により本明細書に包含させるGatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108)、ステロイド誘導可能プロモーター(引用により本明細書に包含させるAoyama. T. and Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404)およびエタノール誘導可能プロモーター(引用により本明細書に包含させるSalter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180)、サイトカイニン誘導可能ＩＢ６およびＣＫＩ １遺伝子(引用により本明細書に包含させるBrandstatter, I. and Kieber J.J., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985)およびオーキシン誘導可能エレメント、ＤＲ５(引用により本明細書に包含させるUlmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971)を含むが、これらに限定されない。

恒常的調節領域は、植物の多様な部分でおよび植物生育をとおして連続的に遺伝子発現を指示する。既知恒常的調節エレメントの例は、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写産物(Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812)、イネアクチン１(Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165)、アクチン２(An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121)またはｔｍｓ ２(引用により本明細書に包含させる米国５,４２８,１４７)およびトリオースリン酸イソメラーゼ１(Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467)遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子(Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646)、アラビドプシスユビキチン１および６遺伝子(Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646)およびタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子(Mandel et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004)と関連するプロモーターを含む。

ここで使用する用語“恒常的”は、恒常的調節領域の制御下にある遺伝子が、全細胞型で同じレベルで発現されていることを必ずしも示さず、むしろ遺伝子は広範な細胞型で、存在量の変動はしばしば観察されるが、発現されていることを示す。恒常的調節エレメントは作動可能に連結しているヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をさらに増強するために他の配列と連結してよい。例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ系はササゲモザイクウイルス(ＣＰＭＶ)の非翻訳領域由来であり、関連するコーディング配列の翻訳の増強が証明される。“天然”とは、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在するまたは“野生型”であることを意味する。“作動可能な連結”とは、特定の配列、例えば調節エレメントおよび興味あるコーディング領域が、遺伝子発現の仲介または調節のような意図する機能を実行するために直接的または間接的に相互作用することを意味する。作動可能な連結をした配列の相互作用は、例えば、作動可能な連結をした配列と相互作用するタンパク質が介在し得る。

植物内で産生されたＲＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンを含むロタウイルスＶＰ７構造タンパク質を誘発し得る。それゆえに、本発明はまた植物特異的Ｎ−グリカンを有するＶＰ７を含むＲＬＰを提供する。

さらに、植物内でのＮ−グリカン修飾は知られており(例えば引用により本明細書に包含させる米国６０／９４４,３４４参照)、修飾Ｎ−グリカンを有するＶＰ７が産生され得る。例えば低フコシル化、低キシロシル化または両方、フコシル化およびキシロシル化Ｎ−グリカンを有する修飾糖鎖付加パターンを含むＶＰ７を得ることができまたは修飾糖鎖付加パターンを有するＶＰ７を得ることができ、ここで、該タンパク質はフコシル化、キシロシル化または両者を欠き、ガラクトシル化が増加している。さらに、翻訳後修飾、例えば、末端ガラクトース付加の調節は、野生型植物が発現するＶＰ７と比較したとき、発現されたＶＰ７でフコシル化およびキシロシル化の減少をもたらし得る。

例えば、限定と解釈してはならないが、修飾糖鎖付加パターンを有するＶＰ７の合成は、例えば、哺乳動物ＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴであるが、これらに限定されないベータ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼ(ＧａｌＴ)をコードするヌクレオチド配列と共にＶＰ７を同時発現させることにより達成でき、しかしながら、他の源由来のＧａｌＴも使用し得る。ＧａｌＴの触媒ドメインはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(ＧＮＴ１)のＣＴＳドメイン(すなわち細胞質尾部、膜貫通型ドメイン、茎領域)と融合して、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を産生してよく、該ハイブリッド酵素をＶＰ７と同時発現し得る。ＶＰ７はまた、例えば哺乳動物ＧｎＴ−IIIまたはヒトＧｎＴ−IIIであるが、これらに限定されないＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴ−III)をコードするヌクレオチド配列と同時発現してよく、他の源由来のＧｎＴ−IIIも使用し得る。さらに、ＧｎＴ−IIIと融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含むＧＮＴ１−ＧｎＴ−IIIハイブリッド酵素も使用し得る。

それゆえに本発明はまた修飾Ｎ−グリカンを有するＶＰ７を含むＲＬＰも提供する。

理論に縛られることを望まないが、ＶＰ７上の植物Ｎ−グリカンの存在は、抗原提示細胞によるＶＰ７の結合を促進することにより免疫応答を刺激し得る。植物Ｎ−グリカンを使用した免疫応答の刺激はSaint-Jore-Dupas et al. (2007)により提案されている。

本発明を、次の実施例においてさらに説明する。

実施例１
ベンサミアナタバコ植物葉でのロタウイルスタンパク質発現およびＶＬＰ産生
次の分析を、Ｇ９ Ｐ[６]ロタウイルス株からのロタウイルスカプシドタンパク質を利用し、ロタウイルス様粒子がベンサミアナタバコ葉細胞の種々の区画で形成されるか否かを評価した。タバコ植物葉でのＶＰ２およびＶＰ６ならびにＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＶＰ４の種々の組み合わせの同時発現を試験した。

材料および方法
プラスミド構築
ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７の植物コドン最適化ロタウイルスｃＤＮＡは、Geneart, Germanyから供与された。プラスミドＤＮＡを製造社の指示に従い、ＤＨ５−α化学的コンピテント大腸菌細胞(E. cloni^TM, Lucigen)に形質転換した。Rainer Fischer(Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, IME, Germany)から供与された新規バイナリーアグロバクテリウムベクターｐＴＲＡｃ(細胞質)、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ１−ｃＴＰ(葉緑体ターゲティング)およびｐＴＲＡｋｃ−ＥＲＨ(小胞体ターゲティング)を本研究に使用した。さらなるベクター、ｐＴＲＡｋｃ−Ａ(アポプラスト)は、多重クローニング部位におけるＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位での制限酵素(ＲＥ)消化によるｐＴＲＡｋｃ−ＥＲＨの修飾に由来した(図３)。これはヒスチジンタグおよびタンパク質をＥＲに保留するＫＤＥＬ配列を除去する。タンパク質はその代わりにアポプラストにターゲティングされる。

ＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ６ ｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで制限酵素(ＲＥ)消化し、一方ＶＰ７をＡｆｌIII／ＸｈｏＩで切断した。制限酵素ＡｆｌIII、ＮｃｏＩおよびＭｌｕＩは、互換性粘着末端を有する。ＤＮＡのｐＴＲＡｃ、ｐＴＲＡｋｃ−ｒｂｃｓ−ｃＴＰおよびｐＴＲＡｋｃ−Ａへの直接クローニングのために、ベクターを、各々ＡｆｌIII／ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩ／ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位でそれぞれＲＥ消化した。ベクターへのＤＮＡのクローニングを標準的プロトコールに従い行い、続いて化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５−α細胞(E. cloni^TM, Lucigen)へ形質転換した。選択した組み換えコロニーをコロニーＰＣＲで確認した。ｐＴＲＡｋｃ−ＥＲＨへのクローニングのために、ＮｏｔＩ制限酵素部位を付加して、ＰＣＲ増幅により各４個のロタウイルスｃＤＮＡの停止コドンを置き換えた。ｃＤＮＡを表１に詳述するプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分変性、続いて９５℃で３０秒５サイクルの変性、５２℃で１分のアニーリングおよび７２℃で１.５分伸長であった。さらに２０サイクルを次のとおり行った；９５℃で３０秒、５７℃で１分、７２℃で１.５分および７２℃で５分。増幅フラグメントを、製造社の指示に従いｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ(Promega)にクローン化した。形質転換を化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５−α(E. cloni^TM, Lucigen)で行った。次いでコロニーＰＣＲを他の３構築物で行ったとおり選択したコロニーで行った。

陽性コロニーからのｐＧＥＭ−ＶＰ ＤＮＡを配列決定して、ＰＣＲのフィデリティーを確認した。ＤＮＡをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、適当なＤＮＡフラグメントをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位でｐＴＲＡｋｃ−ＥＲＨにクローン化してｐＴＲＡｋｃ−ＥＲＨ−ＶＰを形成した。次いで形質転換を大腸菌ＤＨ５−α細胞で先に行ったとおり行った。コロニーＰＣＲも実施して、選択したコロニーにおけるロタウイルスＤＮＡを確認した。

アグロバクテリウム形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株はRainer Fischer教授(Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Aachen, Germany)から供与され、先に記載されたとおりエレクトロコンピテントとした(Shen and Forde, 1989)。３００ngの単離ロタウイルスｐＴＲＡ−ＶＰ構築物を１００μlのエレクトロコンピテントＧＶ３１０１細胞と０.１cmエレクトロギャップキュベット(BioRad^ＴＭ)中で混合し、GenePulser(BioRad)中、次の設定で電気穿孔した：１.８kV、２５μFおよび２００Ω。インキュベーションを、１時間、２７℃で９００μlのＬＢで行い、５０μg／mlカルベニシリン(ｃａｒｂ)、３０μg／ml カナマイシン(ｋａｎ)および５０μg／ml リファンピシン(ｒｉｆ)を含むＬＡプレートに播種した。プレートを２７℃で３日間インキュベートした。陽性形質転換体を確認するために、プラスミドＤＮＡを組み換えアグロバクテリウムコロニーから単離し、大腸菌コンピテントＤＨ５−α細胞に戻し形質転換した。次いでこれらを１００μg／ml アンピシリン(ａｍｐ)ＬＡ上で選択した。コロニーＰＣＲおよびｃＤＮＡ上の制限酵素消化を行い、形質転換体の成功を確認した。関連する組み換えアグロバクテリウムのグリセロール原液を製造し、−７０℃で貯蔵した。

組み換えアグロバクテリウム浸潤
本研究に使用したアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ ４４０４(ｐＢＩＮ−ＮＳｓ)はMarcel Prins(Laboratory of Virology, Wageningen University, Binnenhaven, Netherlands)から得た。これは、トマト黄化壊疽ウイルス(ＴＳＷＶ)で見られるＮＳサイレンシングサプレッサーを含んだ。グリセロール原液からの組み換えアグロバクテリウム(ｐＴＲＡ−ＶＰ)を２７℃で一夜、５０μg／ml ｃａｒｂ、３０μg／ml ｋａｎおよび５０μg／ml ｒｉｆ添加ＬＢ中で増殖させた。次いで組み換えアグロバクテリウムおよびＬＢＡ４４０４(ｐＢＩＮ−ＮＳｓ)を各々誘導培地(ＬＢ、１０mM ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸ＭＥＳ、２mM ＭｇＳＯ_４、２０μM アセトシリンゴン、５０μg／ml ｃａｒｂ、３０μg／ml ｋａｎおよび５０μg／ml ｒｉｆおよびｐＨ５.６)に接種した。

培養物を２７℃で一夜インキュベートした。アグロバクテリウム細胞を４０００rpmで５分、４℃の遠心分離により回収し、２ml浸潤培地(１０mM ＭＥＳ、１０mM ＭｇＣｌ_２、３％スクロース、ｐＨ５.６、２００μM アセトシリンゴンおよび無菌水)に再懸濁した。細胞の光学密度(ＯＤ_６００)を確認し、浸潤培地で希釈して０.２５のＯＤ_６００とした。各ｐＴＲＡ−ＶＰ構築物について、ＬＢＡ４４０４を組み換えアグロバクテリウムと最終０.５のＯＤ_６００まで混合した。同時発現試験のために、各構築物を合計０.５のＯＤ_６００まで添加した、例えば；混合物のＯＤ_６００が０.５に等しくなるまでＶＰ２ − ０.２５およびＶＰ６ − ０.２５。誘導および浸潤培地で使用したアセトシリンゴンはアグロバクテリウムのｖｉｒ遺伝子活性化を助ける。

傷つけた植物細胞はフェノール性化合物を遊離し、これはアグロバクテリウムのＶｉｒ ＡおよびＶｉｒ Ｇ遺伝子により検出され、その後宿主細胞でのタンパク質発現誘導に至る(Zupan, J. et al., 2000)。続いて、細胞を室温で１時間インキュベートして、アセトシリンゴンにｖｉｒ遺伝子を誘導させた。３週齢野生型ベンサミアナタバコ植物をＶＰタンパク質を発現する組み換えアグロバクテリウムで浸潤させた。これは、植物全体の吸引浸潤または植物葉の腹側の背軸性気腔への組み換えアグロバクテリウム(ｐＴＲＡ−ＶＰ)注入を含んだ。組み換えアグロバクテリウムを、サイレンシングサプレッサーＬＢＡ ４４０４(ｐＢＩＮ−ＮＳｓ)を伴いまたは伴わずに浸潤させた。

最初に、２mlのアグロバクテリウム浸潤培地懸濁液を、各植物に構築物あたり１シリンジを使用して注入した。構築物あたり１植物を７日間のタイムトライアルにわたり使用した。またロタウイルスタンパク質の同時発現を行い、ここで、ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ４をベンサミアナタバコ植物葉の細胞質に同時に発現させた。試験した組み合わせはＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４であった。ＶＰ４“スパイク”タンパク質はＶＰ６と結合でき、ゆえに、これらがＲＬＰ構造に付加される可能性がある。ＶＰ７クローニングを試みたが、宿主細胞に対する毒性問題が課題であることが判明した。組み換えＶＰ７アグロバクテリウムは浸潤後１日以内に葉細胞を殺した。これを回避するために１７℃の低温での植物の浸潤およびタイムトライアルの３日後および／または５日後の浸潤のようないくつかの方法を試した。かくして、ＶＰ７をタバコ植物におけるその毒性のために同時発現試験から除外した。

タンパク質抽出
葉全体または構築物あたり２個の葉片を収穫し、液体窒素中で粉砕した。粉砕した葉物質を、Completeプロテアーゼ阻害剤(無ＥＤＴＡ；Roche)含有無菌ＰＢＳに再懸濁した。ついでこれを５分、１３０００rpmで遠心分離し、ペレット(植物葉物質)を廃棄した。次いで１００μlの各構築物を５×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ充填緩衝液と混合し、２分、９５℃で沸騰させ、さらなるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロットの準備が整った。サンプルの残りをさらに使用するまで−２０℃で貯蔵した。図４はロタウイルスｃＤＮＡについてのクローニングおよび浸潤手順の概要を示す。

アポプラストタンパク質抽出
アポプラスト構築物であるｐＴＲＡｋｃ−Ａでさらなる抽出法を行った。アポプラストは植物細胞の原形質膜と細胞壁の間の自由に拡散する間隙である(図５ａ)。細胞質でのタンパク質発現は輸送配列を有し、これによりアポプラストに標的化され、それゆえにこれらはここに蓄積される。下記抽出法において、各抽出日からの葉全体をCompleteプロテアーゼ阻害剤含有無菌ＰＢＳで吸引浸潤または注入浸潤した。吸引浸潤について、個々の植物葉をＰＢＳに懸濁し、吸引タンク中１００mbarで１０分の吸引下に置いた。次いで葉を巻き、底に孔が開いたスピンカラム(Qiagenスピンカラムに類似)に穏やかに入れた(図５ｂ２)。孔は固形葉物質を通すことなく葉からの流体を容易に通す。スピンカラムを２mlエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離を４０００rpmで１５分行った(図５ｂ３)。濾液を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロット分析のためのタンパク質ローディング・ダイを１００μlの各濾液サンプルに添加した。

ウェスタンブロットおよびクーマシー染色
ウェスタンブロットおよびクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを先に記載のとおり使用した。マウス抗ロタウイルスＶＰ６抗体(US Biologicals)(１：５０００)、抗マウスヒスチジンタグ抗体(Sigma(登録商標))(１：２０００)、ニワトリ抗ＶＰ２およびニワトリ抗ＶＰ４血清(１：２０００)を使用して、それぞれのタンパク質の各々をウェスタンブロットでプローブした。クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、Syngene Gel Documentation Systemを使用したバンドの密度走査によりタンパク質を定量した。

電子顕微鏡
発現タンパク質がＲＬＰに集合しているか否かを決定するために、免疫捕捉(immune-trapped)粒子の透過型電子顕微鏡検査(ＴＥＭ)を細胞質発現ＶＰ６、ＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４の発現３日目に、全てサイレンシングサプレッサーＮｓｓ存在下で行った。グロー放電炭素／銅グリッドを２０μlのマウス抗ロタウイルスＶＰ６抗体(１：５０００)上に５分置き、無菌蒸留水で３回洗浄した。次いでグリッドを１０μlのタンパク質抽出物上におき、２分放置し、再び無菌蒸留水で３回洗浄した。最後に、グリッドを２０μlの２％酢酸ウラニル上、１分浮遊させて、ＴＥＭ(Zeiss 912 OMEGA Energy Filter Transmission Electron Microscope, University of Cape Town)下で視察した。

スクロース勾配から単離したサンプルについて、銅グリッド上での免疫捕捉前にスクロースを最初に透析により除去しなければならない。除去しなければ、グリッド上に結晶を形成し、結合した炭素と物質の構造を妨害するために、スクロース結晶がＴＥＭ下のサンプルの明確な視察を阻止する。スクロースフラクションを１００００ＭＷ透析カセットに入れ、０.４Ｍ ＮａＣｌ含有無菌ＰＢＳで４時間透析し、緩衝液を交換し、一夜、４℃で撹拌しながら放置した。透析により体積が増えるため、タンパク質サンプルの濃縮が必要であった。サンプルを３時間減圧凍結乾燥し、２mlの無菌ＰＢＳに再懸濁して、さらなる分析の準備ができた。

ＲＬＰのスクロース勾配精製
植物タンパク質抽出物を、最初にミラクロスで濾過して、固形植物体を除去した。１０〜６０％スクロースのスクロース勾配を４０mlチューブに各々無菌ＰＢＳ(ｐＨ７.４)に溶解した５mlのスクロースの６層を作ることにより設定した。５〜１０ml体積の浄化したタンパク質サンプルを次いで各勾配カラムの頂上に乗せた。

１５００００ｇ(ＳＷＴｉ２８スウィング型ローター、Beckman Coulter)での超遠心分離を４℃で１時間３０分行った。遠心分離の最後に、２mlフラクションをチューブを穿孔することにより各カラムの底から回収した。次いでドットブロットを行って、興味あるタンパク質を含むフラクションを決定した。各フラクションについて、１μlのサンプルをニトロセルロース膜上の格子に載せ、これをＢＳＡブロッキング緩衝液でブロッキングした。次いでウェスタンブロット分析を通常どおり行った。タンパク質をＶＰ６についてはマウス抗ＶＰ６抗体(１：５０００)または他の２種のタンパク質についてはニワトリ抗ＶＰ２およびＶＰ４血清(１：５０００)でプローブした。

総可溶性タンパク質アッセイ
総可溶性タンパク質(ＴＳＰ)をブラッドフォードアッセイにより決定した。これは、細胞質同時発現ＶＰ２／６中の蓄積タンパク質のレベルを比較するために行った。タンパク質ＩｇＧ(１.４３mg／ml原液)を標準として希釈系列で使用した。５μlの標準およびサンプルを各々清潔な乾燥したマイクロタイタープレートに添加した。総可溶性タンパク質試薬ＡおよびＢを製造社の指示に従い添加した(Bio-Rad Dc Protein Assay)。全ての実験を３組行った。吸光度測定値を７５０nmでマイクロプレートリーダー(Bio-tek PowerWave XS)を使用して記録した。

結果
植物葉細胞区画でのＶＰ６の発現
ＶＰ６は、サイレンシングサプレッサーを伴いおよび伴わずに、全細胞区画で発現し、標的化された(図６；(線はＶＰ６を印す、〜４２kDa))。細胞質において、タンパク質はタイムトライアルの１日目から発現し、１週間にわたる試験の間細胞質でタンパク質蓄積は増え続けた(図６ａ)。ＥＲにおいて、タンパク質蓄積は３日目のみに明らかに見られた(図６ｂ)。タンパク質は他のタンパク質より高いバンドサイズ(約１１kDa多い)で動いた。これは、おそらくタンパク質のＣ末端に付加した６−ヒスチジンタグならびに開裂部位(ｐＰｒｏＥｘベクター配列と呼ぶ)の結果である。

葉緑体でのタンパク質蓄積は１〜３日目に起こった(図６“葉緑体”)。サイレンシングサプレッサーは、その非存在下ではタンパク質が検出されなかったため、タンパク質に影響を有した。５〜７日目にはタンパク質発現はなかった。アポプラストは、ＥＲと同様、タイムトライアルの３〜５日目にタンパク質蓄積が最良であり(図６“アポプラスト”)、１日目および７日目にはなかった。サイレンシングサプレッサーは、特に３日目に好影響を有し、省略したときと比較して高いタンパク質検出レベルをもたらした。〜４０kDa印の部分に、おそらく、ＶＰ６タンパク質上のシグナル伝達タグの開裂の結果である２個の可視バンドも見ることができる。

ＥＲ、葉緑体およびアポプラストは、全て３日目にタンパク質発現が最高であり、サイレンシングサプレッサー存在下で最もタンパク質が蓄積した。細胞質はタイムトライアルの間中、高く、増え続けるタンパク質発現を示したために、タンパク質蓄積の点で最高であった。

細胞質におけるヒスチジンタグ付ロタウイルスタンパク質発現
４種のロタウイルスＶＰをさらなるベクターであるｐＴＲＡｃ−ＨＴにクローン化した。このベクターは、細胞質を標的とするタンパク質に対する６−ヒスチジンタグを含み、興味あるタンパク質に対する抗体が利用可能ではないとき、抗ヒスチジンタグ抗体の使用により検出を容易にする。我々の場合、ＶＰ６のみ市販抗体があり、それゆえに我々は、血清待ちの間全タンパク質の初期検出のためにこの手順を試した。細胞質もＶＰ６発現に十分働き、我々が他のタンパク質を試す動機付けとなった。

７日間タイムトライアルの３日目抽出物のウェスタンブロット結果はＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ６の発現成功を示した(図７ａ)。植物でＶＰ７を発現させるために、種々の技法を試した。しかしながら、ＶＰ７を用いた植物浸潤は、１日目から葉を黄変させ、タイムトライアル期間中に立ち枯れまで進んだ(図７ｂ)。植物がまだ良い状態であるように見えた浸潤１日目の後でさえも、これらの条件下でタンパク質発現は検出されなかった。

植物でのＶＰ２およびＶＰ４の発現
ＶＰ２およびＶＰ４をベンサミアナタバコ植物葉に浸潤させ、ＥＲ、葉緑体、細胞質およびアポプラストを標的化した。我々は、大腸菌で陽性クローンを得ることができなかったため、アポプラストを標的としたＶＰ２のベクターを発現することが不可能であった。しかしながら、タンパク質発現および標的化は他の３区画で成功した(図８ａ)。ニワトリ抗ＶＰ２および抗ＶＰ４血清(１：２０００)を抽出物のウェスタンブロット分析に使用した。ＶＰ２およびＶＰ４バンドは、それぞれ図８ａおよび８ｂに見られるとおり、１００kDa印(矢印で示すタンパク質バンド)の直ぐ下に見られた。発現はＶＰ２について細胞質およびＥＲで最良であり、ＶＰ４については細胞質およびアポプラストで最良であるように見えた。サイレンシングサプレッサーはタンパク質発現に顕著な効果を有しなかった。ウェスタンブロットに見られるとおり、ＶＰ２ ＥＲ構築物で発現をわずかに上昇させたのみであり、残りではほとんどなかった。ＶＰ４構築物は全てサイレンシングサプレッサー存在下で発現された。

細胞質でのＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４の同時発現
細胞質はロタウイルスカプシドタンパク質発現に最良であり、最高抽出効率を示すように見えた。全てのさらなる発現実験は、それゆえに細胞質を標的化したタンパク質で行った。

ＶＰ２およびＶＰ６はマウスで防御的免疫原性応答を伴いＲＬＰを形成することが示されており、それゆえに細胞質でのＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４同時発現を試験した。同時発現ＶＰ２／６／４の３日目抽出物を、抗ＶＰ２およびＶＰ４血清(１／５０００)およびマウス抗ＶＰ６抗体(１：５０００)を用いてウェスタンブロットで検出した(図９)。ＶＰ６発現は先に決定したとおり極めて高かったが、ＶＰ２およびＶＰ４の発現は１００kDa印での極めて弱いバンドから明らかなとおり極めて低かった。これは、ほとんどの宿主細胞資源がＶＰ６の過発現に利用され、ＶＰ２および／またはＶＰ４にほとんど残らない結果となった、同時発現に起因し得る。検出されたバンドがＶＰ２およびＶＰ４であるのかまたはこの２種のタンパク質のいずれかであるのかを決定することも困難であった。１３０kDaの上の極めて濃いバンドはおそらく二量体化ＶＰ６タンパク質である。５５kDaので可視バンドは豊富な植物酵素ルビスコである可能性が高い。

細胞質発現ＶＰ６ならびに同時発現ＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４の透過電子顕微鏡的分析を行い、タンパク質粒子および集合したＲＬＰを確認した(図１０)。これは、ＶＰ２および／またはＶＰ４の同時発現が実際に成功したことも確認した。ＶＰ６は、図１０ｂの矢印で示すとおり、単独で発現したとき、集合してタンパク質の殻を形成する。ＶＰ２添加により、粒子は集合してＲＬＰを形成した(図１０ｃ)。ＶＰ２は他のタンパク質が集合して最終的に完全ロタウイルス構造を形成することを可能にする、足場タンパク質として働く。ＶＰ６は、それ自体ＶＰ２と結合するが、同時発現ＶＰ２／６／４でＶＰ４構造を決定するのはなお容易ではなかった。図１０ｄの電子顕微鏡写真はおそらく純粋に集合したＶＰ２／６粒子である。しかしながら、ＶＰ４はタンパク質集合中にＶＰ６と結合し、これはＶＰ７結合前に起こることが示された。これらのＶＰ４構造は安定ではなく、電子顕微鏡検査法の操作手順の間にＲＬＰ構造が崩れる可能性がある。

ＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４のスクロース勾配精製
ＶＰ２／６およびＶＰ２／６／４を、１０〜６０％スクロースの範囲のスクロース勾配で精製した(図１１ａ)。２mlフラクションを各チューブの底から回収し、マウス抗ＶＰ６抗体および／またはニワトリ抗ＶＰ２およびＶＰ４血清でプローブして、どのフラクションがタンパク質を含むかを決定した。ＶＰ２／６タンパク質は、ブロット上でＶＰ６タンパク質が陽性であるとして、フラクション１６および１７で見られた(図１１ｂ)。ニワトリ抗ＶＰ２およびＶＰ４血清を用いたＶＰ２／６／４ブロット分析では、全フラクションを通して陽性結果が示された。これは、おそらくニワトリ血清による高レベルの背景タンパク質検出の結果である。しかしながら、ドットの強度は図１１ｃで見られるとおりフラクション１７および１８で最高であり、これはこれらのフラクション中の興味あるタンパク質が高濃度であるためであると考えられる。

これらの結果を合わせて(図１１ｂおよび１１ｃ)、ロタウイルスタンパク質は、フラクション１６〜２０の範囲にあった。

フラクションのウェスタンブロットおよびクーマシー染色
同時発現ＶＰ２／６のウェスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、フラクション１３〜２０におけるＶＰ２およびＶＰ６タンパク質の存在を確認した。マウス抗ＶＰ６抗体でプローブしたＶＰ６タンパク質のウェスタンブロット分析は丁度フラクション１６〜２０で陽性であった(図１２ａ、一番下の矢印および図１２ｃ)。ニワトリ抗ＶＰ２血清でプローブしたＶＰ２タンパク質はフラクション１７〜２０で見られた(図１２ａ、一番上の矢印)。ＶＰ２はこれまでの同時発現試験でＶＰ６より発現が少ないことが示されており、これはまたここでＶＰ６と比較してＶＰ２タンパク質バンドの強度が低い図１２ａにおいても示された。

ドットブロットによりＶＰ６タンパク質を含むことが先に決定された(図１１ｂ)同時発現ＶＰ２／６のフラクション１６および１７を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。既知濃度のタンパク質ＳＦ９昆虫細胞発現ＶＰ６(０.９１μg／μl)をＶＰ２／６粗製タンパク質の濃度を決定するために包含させた(図１１ｂおよびｃ)。これは、Syngene Gel Documentation Systemを使用する粗製タンパク質バンド(粗製と表示したレーン)の密度走査により行い、結果的に我々は葉物質１キログラムあたりのＶＰ２／６の量を決定できた。産生したタンパク質は約１.５４ｇ／kg生重量(ＦＷ)であることが判明した。１.１mgの精製ＲＬＰを１ｇの植物原料から得た(１.１ｇ／kg)。

ＶＰ２／６の総可溶性タンパク質アッセイ
総可溶性タンパク質(ＴＳＰ)を、ＶＰ２／６タンパク質の相対量を決定するために同時発現ＶＰ２／６フラクションで決定した(図１３)。タンパク質濃度は、ＩｇＧ標準を使用して、フラクション１７および１８でそれぞれ０.５３８mg／mlおよび１.０１２mg／mlであると計算された(図１３ａ)。これらのフラクションのＶＰ２／６に対応するタンパク質バンドをSyngene Gel Documentation System上の密度走査で計算し、それぞれ約０.１０８mg／mlおよび０.２０２mg／mlであることが判明した。

それゆえに、フラクション１７および１８のＶＰ２／６のＴＳＰは両者とも約２０％ＴＳＰであった。スクロースカラムのＲＬＰの大部分はフラクション１５〜約２０に相当する１５〜２５％スクロースであることが判明し、そこで、グラフは突然ピークに達し、続いて減少することが示される。抽出物中の多様な物質の密度の差は、我々に興味あるタンパク質の分離と、それによる精製を可能にした。クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、顕著なバンドを１個しか示さず、タンパク質が比較的純粋であることを示した(図１２ｂ)。

精製ＶＰ２／６のＴＥＭ
精製ＶＰ２／６フラクションを一緒にプールし、スクロースを除去するために高塩ＰＢＳで透析して、透過電子顕微鏡で観察した。ＴＥＭを行い、純度を決定し、ＲＬＰが精製手順後も無傷のままであることを確認した。図１５に見られるとおり、主として宿主細胞の生成物から成るほとんどの背景物質(図１０ｂ、ｃおよびｄ)を除去し、ＲＬＰを残した。ほとんどのＲＬＰは無傷のままであったが、幾分かはおそらくＥＭグリッド上の条件による変形の結果、形を失っているように見えた。

ベンサミアナタバコ葉中のロタウイルス構造タンパク質発現の予備的分析
この予備的分析は、宿主発現系例としてのベンサミアナタバコ葉中のロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２(配列番号１)、ＶＰ４(配列番号２)、ＶＰ６(配列番号３)およびＶＰ７(配列番号４)の発現に焦点を当てた。ここで選択したロタウイルス株は、南アフリカおよび他のサハラ以南地域で優勢に伝播しているＧ９ Ｐ[６]株である。この株を標的とするＲＬＰワクチンは、アフリカのサハラ以南での疾患の負荷を軽減するのに役立つはずである。

アグロバクテリウムが介在する一過性発現系を本分析で使用した。一過性発現は、トランスジェニック発現とは逆に、宿主の染色体へのロタウイルスカプシドタンパク質遺伝子の組込みなしに、比較的短時間に、タンパク質の急速発現を可能にする。ベンサミアナタバコ葉における組み換えアグロバクテリウム浸潤の３日目までにほとんどのタンパク質は発現され、検出可能な量まで蓄積された。下に示すとおり、表２に詳述するとおり、植物葉細胞区画においてＰ２、ＶＰ４およびＶＰ６を含む数種のロタウイルス構造タンパク質の発現の成功が観察された：

糖タンパク質ＶＰ７の発現は、おそらく植物細胞に対するその毒性のために観察されなかった。この予備的研究について、天然シグナルペプチドを含むＶＰ７を使用したことは注目に値した。同時発現試験中の３日目の浸潤も試験した。これは、このタンパク質が発現し、その直後ＶＰ２およびＶＰ６と集合してＲＬＰを形成するか否かを見るために試みた。この研究において観察された組み換えＶＰ７の毒性は先に記載されている(Williams et al., 1995; McCorquodale, 1987;Arias et al., 1986)。

トランスジェニックジャガイモでのこれまでのＶＰ７発現試験が記載されている(Li et al., 2006;Choi et al., 2005; Wu et al., 2003)。Choi et. al. (2005)はサルロタウイルスＶＰ７を使用し、Li et. al. およびWu et. al. (Li et al., 2006;Wu et al., 2003)はヒトＡ群Ｇ１ ＶＰ７を使用した。ここに記載する結果はヒトロタウイルスＧ９ ＶＰ７を使用した。

ＶＰ２は、我々が適当なｃＤＮＡをクローンできず、時間的制約により他の構築物を進める前に数回の試験しか可能でなかったためアポプラストを除き、全区画で発現され、標的化された。ＶＰ２の発現レベルは全ての区画で顕著に低いことが示された。Saldana et al. 2006により引用されたこれまでの研究において、植物での発現に最適化された配列を有するＶＰ２は、植物細胞でｍＲＮＡが検出されるにも関わらず、発現不可能であると結論付けた。彼らは、いずれにしても合成ＤＮＡを使用して、それをトマト植物細胞で発現させるように処理した。ＶＰ２発現の困難さの理由は、不適切なｍＲＮＡ翻訳の結果であるまたはｍＲＮＡが植物細胞を不安定化させるある配列モチーフを含むことである可能性が最も高い(Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002)。ＶＰ６と比較してＶＰ２の発現レベルの発現が低い証拠は、Mena et al. (2006), Saldana et al. (2006), Vieira et al. (2005)およびLabbe et al. (1991)により植物および昆虫細胞発現試験の両方で見られた。

ビリオン構造の表面上にスパイクを形成する外側カプシドタンパク質ＶＰ４は発現され、細胞質、ＥＲおよびアポプラストでの蓄積が標的化された。タンパク質蓄積は葉緑体で観察されなかった。ＶＰ２で観察されたとおり、ＶＰ４のタンパク質発現レベルはウェスタンブロットでＶＰ６で見られるより低かった。本タンパク質はトリプシン開裂部位を有し、これは２個のタンパク質、ＶＰ５およびＶＰ８をもたらした。ベンサミアナタバコ葉中の局所トリプシンが、本タンパク質の幾分かを産生と同時に開裂し、指定区画での無傷ＶＰ４の蓄積が低濃度レベルとなる可能性がある。本タンパク質は主要中和抗原であることが示されているが、ワクチン開発のために全タンパク質をクローン化する試みは少ない(Khodabandehloo et al., 2009; Mahajan et al., 1995; Nishikawa et al., 1989)。しかしながら、昆虫細胞および酵母発現系での数試験で、ＶＰ４のＶＰ５またはＶＰ８サブユニットの発現が示されている(Andres et al., 2006; Favacho et al., 2006;Kovacs-Nolan et al., 2001)。今日まで、本研究は、植物発現系での全タンパク質の発現を示した始めての研究である。

ＶＰ６は全区画で発現され、過発現が細胞質で観察され、この区画でタンパク質蓄積は１日目〜７日目まで観察された。これはプロテアーゼ活性および遺伝子サイレンシングが細胞質での外来タンパク質の蓄積を減らすまたは妨げるとのいくつかの論文に反する(Fischer et al., 2004)。さらに、正しいｐＨ条件を前提として、ＶＰ６は管状またはらせん形粒子に自己集合することが知られており、我々の研究で見られる粒子と酷似する(図９ｂ)(Estes et al., 1987)。ＶＰ６はウイルスコアの約５０％を構成し、それゆえにロタウイルスワクチン開発における主要抗原である。上で得られた結果により、我々は、細胞質でのＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ４の同時発現をさらに研究できた。

細胞質で同時発現されたとき、ＶＰ２およびＶＰ６は集合してＲＬＰを形成した。一過性発現系からの１.２７〜１.５４ｇ／kg ＦＷの極めて高いタンパク質収率が観察された。スクロースカラムで精製したとき、保持されるＶＰの量は１.１ｇ／kg ＦＷであった。この収率は、ベンサミアナタバコにおける一過性発現系を使用した抗体であるＩｇＧの産生で得られた最大１.５ｇ／kg ＦＷの収率と同等である(Vezina et al., 2009)。Saldana et al. (2006)は、現在まで、トランスジェニックトマト植物でロタウイルスＶＰ２およびＶＰ６の同時発現に約１％総可溶性タンパク質のレベルまで成功したことが知られる唯一のグループであった。昆虫細胞発現系でのＶＰ２／６の集合は文書で十分に裏付けられている(Vieira et al., 2005; O'Brien et al., 2000)。これらのＶＰ２／６ ＲＬＰはまたロタウイルス感染に対する防御免疫を提供することも知られている(Zhou et al., 2011, Saldana et al., 2006)。ゆえに、植物発現系で我々が産生したＶＰ２／６ ＲＬＰは、サブユニットロタウイルスワクチン開発の適当な候補である。

ＶＰ２／６／４はまた同時発現され、検出されている。同時発現タンパク質の総タンパク質吸光度測定値における第一可視ピーク(図１４、フラクション１６)は集合したＶＰ２／６／４である可能性があるが、ＴＥＭ下でこのフラクションを試験しておらず、ＲＬＰは検出されなかった。検出されたタンパク質ピークは、ＶＰ４単量体またはそのそれぞれのＶＰ５およびＶＰ８サブユニットの蓄積によるものであり得る。第二ピーク(フラクション１８)は、ＴＥＭ下で試験したとき、ＶＰ２／６サンプルで見られたものに極めて類似したＲＬＰ構造を示した。しかしながら、Crawford et al.は、先に、ＶＰ４はＴＥＭ下で見ることができず、ＶＰ２／６／４およびＶＰ２／６／４／７粒子は、ＴＥＭ下で類似構造および直径を有すると報告している(Crawford 1994)。我々のＶＰ２／６／７ＲＬＰ、ＶＰ２／６／４／７ＲＬＰおよびＶＰ２／６ＲＬＰの観察は類似しており、常套のＴＥＭ下で全て類似に見える。

実施例２
構築物
Ａ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７１０)
ロタウイルスＡ群ＷＡ株のＶＰ２をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用してＰｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドの２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ２コーディング配列を含むフラグメントを、鋳型として最適化ＶＰ２遺伝子配列(図１９、配列番号４５)を使用して、プライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図１７Ａ、配列番号２１)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図１７Ｂ、配列番号２２)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ２タンパク質配列(Genbank受託番号ＣＡＡ３３０７４)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図１７Ｃ)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Left borderからｔ−ＤＮＡ Right borderまでの配列を図１８に示す(配列番号２３)。得られた構築物に番号１７１０をつけた(図２３、配列番号２７)。ロタウイルスＡ群ＷＡ株のＶＰ２のアミノ酸配列を図２０に示す(配列番号２５)。プラスミド１７１０の図を図２１に示す。

ＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系におけるＢ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７１１)
ロタウイルスＡ群ＷＡ株のＶＰ２をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドのＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳにクローン化した。ＶＰ２コーディング配列を含むフラグメントを、鋳型として最適化ＶＰ２遺伝子配列(配列番号４５)を使用して、プライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図１７Ａ、配列番号２１)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図１７Ｂ、配列番号２２)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ２タンパク質配列(Genbank受託番号ＣＡＡ３３０７４)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して、ＢｅＹＤＶ(ｍ)増幅系の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにクローン化した。構築物１９３(図２２Ａ)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１９３は、ＢｅＹＤＶ(ｍ)増幅系のＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図２２Ｂに示す(配列番号２６)。得られた構築物に番号１７１１をつけた(図２３、配列番号２７)。ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ２のアミノ酸配列を図２０に示す(配列番号２５)。プラスミド１７１１の図を図２４に示す。

Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７１３)
ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドの２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ６コーディング配列を含むフラグメントを、鋳型として最適化ＶＰ６遺伝子配列(配列番号４６)を使用して、プライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図２５ａ、配列番号２８)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図２５ｂ、配列番号２９)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ６タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＡＡ４７３１１)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図１７ｃ)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットでの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図１８に示す(配列番号２３)。得られた構築物に番号１７１３をつけた(図２５ｃ、配列番号３０)。ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６のアミノ酸配列を図２６に示す(配列番号３１)。プラスミド１７１３の図を図２７に示す。

ＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系におけるＤ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７１４)
ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドのＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳにクローン化した。ＶＰ６コーディング配列を含むフラグメントを、鋳型として最適化ＶＰ６遺伝子配列(配列番号４６)を使用して、プライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図２５ａ、配列番号２８)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図２５ｂ、配列番号２９)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ６タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＡＡ４７３１１)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用してＢｅＹＤＶ(ｍ)増幅系の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにクローン化した。構築物１９３(図２２Ａ)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１９３は、ＢｅＹＤＶ(ｍ)増幅系のＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図２２Ｂに示す(配列番号２６)。得られた構築物に番号１７１４をつけた(図２８、配列番号３２)。ロタウイルスＡ群ＷＡ株からのＶＰ６のアミノ酸配列を図２６に示す(配列番号３１)。プラスミド１７１４の図を図２９に示す。

Ｃ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７３０)
ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドの２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳにクローン化した。ＶＰ４コーディング配列を含むフラグメントを鋳型として最適化ＶＰ４遺伝子配列(図３１Ｂ、(配列番号４７)を使用して、プライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図３０Ａ、配列番号３３)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図３０Ｂ、配列番号３４)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ４タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６６０)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにクローン化した。構築物番号１１９１(図１８、配列番号２３)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットでの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図１８に示す(配列番号２３)。得られた構築物に番号１７３０をつけた(図３１Ｃ、配列番号５０)。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのＶＰ４のアミノ酸配列を図３２に示す(配列番号３６)。プラスミド１７３０の図を図３３Ａに示す。

ＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系におけるＥ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７３１)
ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドのＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系を含む２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳにクローン化した。ＶＰ４コーディング配列を含むフラグメントを鋳型として最適化ＶＰ４遺伝子配列(配列番号４７)を使用して、プライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図３０Ａ、配列番号３３)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図３０Ｂ、配列番号３４)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ４タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６６０)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用してＢｅＹＤＶ(ｍ)増幅系の２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにクローン化した。構築物１９３(図２２Ａ)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１９３は、ＢｅＹＤＶ(ｍ)増幅系のＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図２２Ｂに示す(配列番号２６)。得られた構築物に番号１７３１をつけた(図３１、配列番号３５)。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのＶＰ４のアミノ酸配列を図３２に示す(配列番号３６)。プラスミド１７３１の図を図３３Ｂに示す。

Ｆ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７３３)
ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのその天然シグナルペプチドを伴うＶＰ７をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドの２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ７コーディング配列を含むフラグメントを鋳型として最適化ＶＰ７遺伝子配列(配列番号５４)を使用して、プライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図３４Ａ、配列番号３７)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図３４Ｂ、配列番号３８)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ７タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６８２)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図１７Ｃ)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図１８に示す(配列番号２３)。得られた構築物に番号１７３３をつけた(図３４Ｃ、配列番号２４)。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのその天然シグナルペプチドを伴うＶＰ７のアミノ酸配列を図３５に示す(配列番号３９)。プラスミド１７３３の図を図３６に示す。

Ｄ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７３４)
ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの天然シグナルペプチドの切断変異体を伴うＶＰ７をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドの２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ７コーディング配列を含むフラグメントを鋳型として最適化ＶＰ７遺伝子配列(図４４Ｃ、配列番号５７のｎｔ８８〜９８１に対応)を使用して、プライマーＩＦ−ＴｒＳＰ＋Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図４４Ａ、配列番号５５)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図４４Ｂ、配列番号５６)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ７タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６８２)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図１７Ｃ)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図１８に示す(配列番号２３)。得られた構築物に番号１７３４をつけた(図４４Ｄ、配列番号５８)。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの切断型シグナルペプチドを伴うＶＰ７のアミノ酸配列を図４４Ｅに示す(配列番号５９)。プラスミド１７３４の図を図４４Ｆに示す。

ＢｅＹＤＶ(ｍ)＋レプリカーゼ増幅系におけるＧ−２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＰＤＩＳＰ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７３５)
ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ７をコードする配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセットを含むプラスミドの２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。野生型シグナルペプチドを伴わないＶＰ７コーディング配列を含むフラグメントを、最適化ＶＰ７遺伝子配列(配列番号５４)を使用して、プライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ２＋４ｃ(図３７Ａ、配列番号４０)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図３４Ｂ、配列番号３８)を使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ７タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６８２)を逆翻訳し、ヒトコドン使用頻度、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドと共にインフレームでクローン化した。構築物１１９２(図３８)を制限酵素ＳａｃIIおよびＳｔｕＩで消化し、直線化プラスミドをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ集合反応に使用した。構築物番号１１９２は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットのアルファルファＰＤＩシグナルペプチドを用いるインフレームでの目的遺伝子の“Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ”クローニングを対象としたアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下でＴＢＳＶ Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物もまた含む。バックボーンはｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、ｔ−ＤＮＡ Ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒからｔ−ＤＮＡ Ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒまでの配列を図３９に示す(配列番号４１)。得られた構築物に番号１７３５をつけた(図４０、配列番号４２)。ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＰＤＩＳＰ／ＶＰ７のアミノ酸配列を図４１に示す(配列番号４３)。プラスミド１７３５の図を図４２に示す。
＊ 好ましいヒトコドンの使用に好都合となるようにおよびＧＣ含量増加のために最適化配列を修飾した
† ＷｔＳｐ：野生型シグナルペプチド、ＳｐＰＤＩ：植物起源のシグナルペプチド、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子からクローン化、ＴｒＳｐ：切断型野生型シグナルペプチド、ＷｔＳｐ(Ｍ３０)の２番目のＭｅｔからＴｒＳｐ開始。
＊[最適化]は、配列がコドン使用頻度、ＧＣ含量およびＲＮＡ構造に基づき最適化されていることを意味する。

実施例３
遺伝子構築物の集合およびアグロバクテリウム形質転換
プラスミド１７１０、１７１３、１７３０および１７３４を含む全プラスミドを、エレクトロポレーション(Mattanovich et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17:6747)によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス(ＡＧＬ１；ATCC, Manassas, VA 20108, USA)を形質転換するのに使用し、あるいは、ＣａＣｌ_２調製コンピテント細胞を使用したヒートショック(XU et al., 2008, Plant Methods 4)に使用し得る。作製したアグロバクテリウム・ツメファシエンス株中のプラスミドの完全性を制限酵素マッピングにより確認した。あるバイナリープラスミドで形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンス株をＡＧＬ１／“プラスミド番号”と命名する。例えば、構築物番号１７１０で形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を“ＡＧＬ１／１７１０”と名づける。

植物バイオマス調製、接種、アグロインフィルトレーションおよび収穫
ベンサミアナタバコ植物を、市販ピートモス培養土を満たしたフラット中、種子から生育させた。植物を、１６／８光周期および２５℃日中／２０℃夜間の温度管理下、温室で生育させた。播種３週間後、個々の小植物を選択し、鉢に移植し、同じ環境条件下、さらに３週間温室で生育させた。

各構築物でトランスフェクトしたアグロバクテリアを、１０mM ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸(ＭＥＳ)および５０μg／ml カナマイシンを添加した植物性起源のＬＢ培地、ｐＨ５.６でＯＤ_６００が０.６〜２.５に達するまで増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を、各構築物について適当な比となるように混合し、浸潤培地(１０mM ＭｇＣｌ_２および１０mM ＭＥＳ ｐＨ５.６)で２.５×ＯＤ_６００とした。アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を一夜、４℃で貯蔵した。浸潤の日、培養バッチを浸潤培地で、２.５懸濁液体積に希釈し、使用前に温めた。ベンサミアナタバコの植物全体を、気密性ステンレススチールタンク中、２０−４０トールの減圧下、２分間、細菌懸濁液に上下逆に入れた。浸潤後、植物を、収穫までの３〜１２日インキュベーション期間温室に戻した。収穫したバイオマスを、粒子精製に使用するまで凍結させた(−８０℃)。

ロタウイルス様粒子の抽出および精製
タンパク質を、ブレンダーで３体積の抽出緩衝液(ＴＮＣ：１０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ７.４、１４０mM ＮａＣｌ、１０mM ＣａＣｌ_２)を用いる機械的抽出により凍結バイオマスから抽出した。スラリーを大孔ナイロンフィルターで濾過して、大きな残骸を除き、５０００ｇで５分、４℃で遠心分離した。上清を回収し、再び５０００ｇで３０分(４℃)で遠心分離して、さらに残骸を除去した。上清をデプスフィルタで濾過し、限外濾過し、濾液を７５０００ｇで２０分(４℃)、遠心分離してロタウイルス様粒子を濃縮した。粒子含有ペレットを１／１２体積のＴＮＣに再懸濁し、不溶物を５０００ｇで５分、遠心分離して除去した。上清をミラクロスで濾過し、イオジキサノール密度勾配に充填した。

密度勾配遠心分離を次のとおり行った。５％〜４５％のイオジキサノールの段階的勾配を含むチューブを調製し、ロタウイルス様粒子を含む濾過抽出物を重層した。勾配を１２００００ｇで４時間(４℃)遠心分離した。遠心分離後、１mlフラクションを下から上に向けて回収し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。さらなる分析に選択したフラクションについてイオジキサノールを除去するために、選択したフラクションを７５０００ｇで２０分(４℃)遠心分離し、ペレット化粒子を新鮮なＴＮＣ緩衝液に再懸濁した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce Biochemicals, Rockport IL)により決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元または非還元条件下に分離し、クーマシーブルーで染色した。染色されたゲルを走査し、濃度測定分析をImageJ Software(NIH)で行った。

免疫ブロッティングのために、電気泳動タンパク質をポリビニレンジフルオライド(ＰＶＤＦ)膜(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)に電気泳動転写した。免疫ブロッティング前に、膜を５％脱脂乳および０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０のＴｒｉｓ緩衝食塩水(ＴＢＳ−Ｔ)溶液で１６〜１８時間、４℃でブロッキングした。

免疫ブロッティングを、適当な抗体(表５)と、２μg／mlで０.１％ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０中２％脱脂乳中でインキュベートすることにより行った。化学発光検出に使用した二次抗体は表５に示すとおりであり、示すとおり、０.１％ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０中２％脱脂乳で希釈した。免疫反応性複合体を、基質としてルミノールを使用する化学発光により検出した(Roche Diagnostics Corporation)。ヒトＩｇＧ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素結合をEZ-Link Plus(登録商標)Activated Peroxidase結合キット(Pierce, Rockford, IL)を使用して行う。
抗ＶＰ４酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)
Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレートを、１５０mM ＮａＣｌ含有１０mM ＰＢＳ ｐＨ７.４(リン酸緩衝化食塩水)で１：１０００００希釈したマウスモノクローナル抗ＶＰ４(Koki Taniguchi教授より恵与)で１６〜１８時間、４℃で被覆した。インキュベート後、プレートを１Ｍ ＮａＣｌ含有０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有１０mM ＰＢＳ ｐＨ７.４で３回洗浄し、１５０mM ＮａＣｌ含有０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有１０mM ＰＢＳ ｐＨ７.４中５％ＢＳＡで１時間、３７℃でブロッキングした。ブロッキング工程後、プレートを１０mM ＰＢＳ ｐＨ７.４、１Ｍ ＮａＣｌ含有０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。サンプルを添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。次いでプレートを１Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＣａＣｌ_２、０.５mM ＭｇＣｌ_２含有０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有１０mM ＰＢＳ ｐＨ７.４で３回洗浄した。残りの全ての洗浄工程について、洗浄緩衝液は同じままであり、３回目の洗浄の間、プレートを洗浄溶液の完全除去前に１０分、室温でインキュベートした。１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＣａＣｌ_２、０.５mM ＭｇＣｌ_２含有０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有１０mM ＰＢＳ ｐＨ７.４中３％ＢＳＡで１：１００００希釈したロタウイルスに対して惹起したウサギポリクローナル抗体(Koki Taniguchi教授より恵与)を添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。次いでプレートを３回洗浄し、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＣａＣｌ_２、０.５mM ＭｇＣｌ_２含有０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有１０mM ＰＢＳ ｐＨ７.４中３％ＢＳＡで１：５０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体(111-035-144, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)を添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。プレートを３回洗浄した。最終洗浄後、プレートをSureBlue TMBペルオキシダーゼ基質(KPL, Gaithersburg, MD)と２０分、室温でインキュベートした。１Ｎ ＨＣｌ添加により反応を停止させ、Ａ４５０値をMultiskan Ascentプレートリーダー(Thermo Scientific, Waltham, MA)で読んだ。

ＶＰ２およびＶＰ６を含むロタウイルス様粒子の産生
ＶＰ２およびＶＰ６を含むロタウイルス様粒子をベンサミアナタバコ中の一過性発現により産生した。植物を、１：１比のＡＧＬ１／１７１０とＡＧＬ１／１７１３の混合物を含むアグロバクテリアの接種によりアグロインフィルトレーションし、収穫前７日間インキュベートした。ロタウイルス様粒子を、材料および方法の章に記載した方法を使用してバイオマスから精製した。イオジキサノール密度勾配上での浄化した抽出物の遠心分離後、チューブの底からの最初の１０フラクションをクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図４５Ａに示すとおり、ロタウイルス抗原(ＶＰ２およびＶＰ６)は、ロタウイルス様粒子が見られることが予測される濃度であるイオジキサノールの濃度が約３５％である、密度勾配のフラクション２および３で主に見られた。これらのフラクションへの植物タンパク質の極少量の混入が見られた。抗ロタウイルス過免疫ウサギ血清およびポリクローナルウサギ抗ＶＰ２抗体を用いたフラクションのウェスタンブロット分析は、密度勾配フラクション中のＶＰ２およびＶＰ６の同一性を確認した(図４５Ｂおよび４５Ｃ)。フラクション２および３を貯留し、イオジキサノールを高速遠心分離により除去し、再懸濁し、精製粒子を低温電子顕微鏡分析に出して(NanoImaging Services Inc., La Jolla, CA)、ロタウイルス粒子を模倣する粒子へのＶＰ２およびＶＰ６の集合を確認した。図４９(左パネル)に示すとおり、ＶＰ２／ＶＰ６粒子の極低温ＥＭ画像は、ロタウイルス様粒子への抗原の正しい集合を確認した。

ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７を含むロタウイルス様粒子の産生
ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７を含むロタウイルス様粒子をベンサミアナタバコ中の一過性発現により産生した。植物を、１：１：１比ＡＧＬ１／１７１０、ＡＧＬ１／１７１３、ＡＧＬ１／１７３４の混合物を含むアグロバクテリアの接種によりアグロインフィルトレーションし、収穫前７日間インキュベートした。ロタウイルス様粒子を、材料および方法の章に記載した方法を使用してバイオマスから精製した。イオジキサノール密度勾配上での浄化した抽出物の遠心分離後、チューブの底からの最初の１０フラクションをクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図４６Ａに示すとおり、ロタウイルス抗原(ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７)は、ロタウイルス様粒子が見られることが予測される濃度であるイオジキサノールの濃度が約３５％である、密度勾配のフラクション２および３で主に見られた。これらのフラクションへの植物タンパク質の極少量の混入が見られた。抗ロタウイルス過免疫ウサギ血清およびポリクローナルウサギ抗ＶＰ７抗体を用いるフラクションのウェスタンブロット分析は、密度勾配フラクションにおけるＶＰ６およびＶＰ７の同一性を確認した(図４６Ｂおよび４６Ｃ)。

ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含むロタウイルス様粒子の産生
ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含むロタウイルス様粒子をベンサミアナタバコ中の一過性発現により産生した。植物を、１：１：１：１比のＡＧＬ１／１７１０、ＡＧＬ１／１７３０、ＡＧＬ１／１７１３、ＡＧＬ１／１７３４の混合物を含むアグロバクテリアの接種によりアグロインフィルトレーションし、収穫前７日間インキュベートした。ロタウイルス様粒子を、材料および方法の章に記載した方法を使用してバイオマスから精製した。イオジキサノール密度勾配上での浄化した抽出物の遠心分離後、チューブの底からの最初の１０フラクションをクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図４７Ａに示すとおり、４種のロタウイルス抗原(ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７)のうち３種が可視であり、主にロタウイルス様粒子が見られることが予測される濃度であるイオジキサノールの濃度が約３５％である密度勾配のフラクション３で見られた。これらのフラクションへの植物タンパク質の極少量の混入が見られた。ＶＰ４は、同じ分析を精製ヒトロタウイルスビリオンで行ったときに見ることができなかったため、クーマシー染色ゲルでＶＰ４が検出可能レベルで存在しないことは予測された。抗ロタウイルス過免疫ウサギ血清およびポリクローナルウサギ抗ＶＰ７抗体を用いるフラクションのウェスタンブロット分析は、密度勾配フラクションでのＶＰ６およびＶＰ７の同一性を確認した(図４７Ｂおよび４７Ｃ)。イオジキサノールを高速遠心分離によりフラクション３から除去し、再懸濁し、精製粒子をＥＬＩＳＡで分析して、ＶＰ４の存在を確認した。図４８に示す結果は、ＶＰ２／ＶＰ６およびＶＰ７を含むネガティブコントロール粒子が背景シグナルレベルしかもたらさなかったため、ＥＬＩＳＡがＶＰ４を特異的に認識することを明らかに示した。対照的に、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７抗原を含む精製粒子の３個の異なるロットの分析は、同じ条件下でアッセイしたとき、強く、均一なシグナルを示した。精製ＶＰ２／ＶＰ４／ＶＰ６／ＶＰ７ ＲＬＰを低温電子顕微鏡分析に出して(NanoImaging Services Inc., La Jolla, CA)、ロタウイルス粒子を模倣する粒子への４抗原の集合を確認した。図４９(右パネル)に示すとおり、ＶＰ２／ＶＰ４／ＶＰ６／ＶＰ７粒子の極低温ＥＭ画像は、ロタウイルス様粒子への抗原の正しい集合を確認した。

表６は、本発明の種々の態様において提供される配列の一覧である。
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全ての引用文献は、引用により本明細書に取り込む。

本発明は１つ以上の態様に関して記載している。しかしながら、多くの変更および修飾を、特許請求の範囲において定義する本発明の範囲から逸脱することなく成し得ることは当業者には明らかである。

Claims (50)

1. 植物、植物の一部または植物細胞中でロタウイルス様粒子（ＲＬＰ）を製造する方法であって：
   ａ）植物内で活性であり、第一ロタウイルス構造タンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第一調節領域を含む第一核酸、植物内で活性であり、第二ロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含む第二核酸および植物内で活性であり、第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域を含む第三核酸を、植物、植物の一部または植物細胞に導入し、
   ｂ）植物、植物の一部または植物細胞を、第一、第二および第三核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生する
   ことを含む、方法。
2. 植物内で活性であり、第四ロタウイルス構造タンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第四調節領域を含む第四核酸を工程ａ）において植物、植物の一部または植物細胞に導入し、工程ｂ）において植物、植物の一部または植物細胞をインキュベートしたとき発現させる、請求項１に記載の方法。
3. 第一ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ２であり、第二ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ６であり、第三ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ４である、請求項１に記載の方法。
4. 第一ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ２であり、第二ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ６であり、第三ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ７である、請求項１に記載の方法。
5. 第一ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ２であり、第二ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ６であり、第三ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ４であり、第四ロタウイルス構造タンパク質がＶＰ７である、請求項２に記載の方法。
6. 付加的核酸を、植物、植物の一部または植物細胞で発現させるものであり、ここで、該付加的核酸が植物内で活性であり、サイレンシングのサプレッサーをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む、請求項１または２に記載の方法。
7. ヌクレオチド配列のコドン使用頻度を、好ましいヒトコドン使用頻度、増大したＧＣ含量またはこれらの組み合わせに適合させる、請求項１または２に記載の方法。
8. ロタウイルス構造タンパク質が、切断型、天然または非天然シグナルペプチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
9. 非天然シグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナル（ＰＤＩ）ペプチドである、請求項８に記載の方法。
10. 第一、第二および第三ヌクレオチド配列またはこれらの組み合わせが、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）調節領域に作動可能に連結する、請求項１に記載の方法。
11. 第一、第二、第三または第四ヌクレオチド配列またはこれらの組み合わせがササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）調節領域に作動可能に連結する、請求項２に記載の方法。
12. ｃ）植物、植物の一部または植物細胞を収穫し、
    ｄ）ＲＬＰを植物、植物の一部または植物細胞から精製する（ここで、ＲＬＰのサイズが７０〜１００nm範囲である）
    工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
13. ＲＬＰをカルシウム存在下で精製する、請求項１２に記載の方法。
14. ＲＬＰが、少なくともＶＰ４ロタウイルス構造タンパク質を含む、請求項１または２に記載の方法で製造したＲＬＰ。
15. ＲＬＰが二層ＲＬＰである、請求項３に記載の方法により製造したＲＬＰ。
16. ＲＬＰが三層ＲＬＰである、請求項４または５に記載の方法により製造したＲＬＰ。
17. ロタウイルス構造タンパク質が、ロタウイルス株Ｇ９ Ｐ[６]、ロタウイルスＡ群ＷＡ株、ロタウイルスＡ群ワクチンＵＳＡ／ロタリックス−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株およびロタウイルスＳＡ１１株から選択される、請求項１または２に記載の方法。
18. ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１３、配列番号１４または配列番号４５により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を含む、請求項３、４および５のいずれか１つに記載の方法。
19. ＶＰ６をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１７、配列番号１８または配列番号４６により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を含む、請求項３、４および５のいずれか１つに記載の方法。
20. ＶＰ７をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１９、２０、４８、４９、５２、５３、５４または５７により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を含む、請求項４または５に記載の方法。
21. ＶＰ４をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１５、１６、４７、５０または５１により定義したヌクレオチド配列と８０％〜１００％同一性を含む、請求項３または５に記載の方法。
22. ＶＰ２が、配列番号１または配列番号２５により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされる、請求項３、４および５のいずれか１つに記載の方法。
23. ＶＰ６が、配列番号３または配列番号３１により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされる、請求項３、４および５のいずれか１つに記載の方法。
24. ＶＰ７が、配列番号４、３９、４３または５９により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされる、請求項４または５に記載の方法。
25. ＶＰ４が、配列番号２または配列番号３６により定義したアミノ酸配列と８０％〜１００％同一性を有するアミノ酸配列によりコードされる、請求項３または５に記載の方法。
26. 第一、第二および第三核酸配列またはこれらの組み合わせが、植物内で活性であり、１個以上のコモウイルスエンハンサー、１個以上の増幅エレメントおよびロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含み、レプリカーゼをコードする第四核酸が植物、植物の一部または植物細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
27. 第一、第二、第三または第四核酸配列またはこれらの組み合わせが、植物内で活性であり、１個以上のコモウイルスエンハンサー、１個以上の増幅エレメントおよびロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含み、そしてレプリカーゼをコードする第五核酸が植物、植物の一部または植物細胞に導入される、請求項２に記載の方法。
28. 第一、第二および第三ヌクレオチド配列またはこれらの組み合わせが、さらに区画ターゲティング配列に作動可能に連結する、請求項１に記載の方法。
29. 第一、第二、第三または第四ヌクレオチド配列またはこれらの組み合わせが、さらに区画ターゲティング配列に作動可能に連結する、請求項２に記載の方法。
30. 植物、植物の一部または植物細胞中でロタウイルス様粒子（ＲＬＰ）を製造する方法であって：
    ａ）植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む核酸を、植物、植物の一部または植物細胞に導入し、
    ｂ）植物、植物の一部または植物細胞を、第一核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生する
    ことを含む、方法。
31. 植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含む第二核酸を工程ａ）において植物、植物の一部または植物細胞に導入し、工程ｂ）において植物、植物の一部または植物細胞をインキュベートしたとき発現させる、請求項３０に記載の方法。
32. 植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域を含む第三核酸を工程ａ）において植物、植物の一部または植物細胞に導入し、工程ｂ）において植物、植物の一部または植物細胞をインキュベートしたとき発現させる、請求項３１に記載の方法。
33. １個以上のロタウイルス構造タンパク質が、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７からなる群から選択される、請求項３０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
34. 付加的ヌクレオチド配列を、植物、植物の一部または植物細胞の中で発現させ、該付加的ヌクレオチド配列はサイレンシングのサプレッサーをコードし、該付加的ヌクレオチド配列は植物で活性な調節領域と作動可能に連結する、請求項３０〜３３のいずれか１つに記載の方法。
35. １個以上のロタウイルス構造タンパク質がロタウイルス株Ｇ９ Ｐ[６]由来である、請求項３０〜３４のいずれか１つに記載の方法。
36. ヌクレオチド配列が、さらに区画ターゲティング配列に作動可能に連結する、請求項３０〜３５のいずれか１つに記載の方法。
37. 区画ターゲティング配列が１個以上のロタウイルス構造タンパク質を、植物細胞の小胞体（ＥＲ）、葉緑体、色素体またはアポプラストに指向させる、請求項２８、２９および３６のいずれか１つに記載の方法。
38. 区画ターゲティング配列が、アポプラストシグナルペプチドまたは色素体シグナルペプチドをコードする、請求項３７に記載の方法。
39. ｃ）植物、植物の一部または植物細胞を収穫し、
    ｄ）ＲＬＰを植物、植物の一部または植物細胞から精製する（ここで、ＲＬＰのサイズが７０〜１００nm範囲である）
    工程をさらに含む、請求項３０〜３８のいずれか１つに記載の方法。
40. 植物、植物の一部または植物細胞中でロタウイルス様粒子（ＲＬＰ）を製造する方法であって：
    ａ）植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節領域を含む核酸を含む、植物、植物の一部または植物細胞を提供し；
    ｂ）植物、植物の一部または植物細胞を、該核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生する
    ことを含む、方法。
41. 植物、植物の一部または植物細胞中でロタウイルス様粒子（ＲＬＰ）を製造する方法であって：
    ａ）植物内で活性であり、第一ロタウイルス構造タンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第一調節領域を含む第一核酸、植物内で活性であり、第二ロタウイルス構造タンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第二調節領域を含む第二核酸、および植物内で活性であり、第三ロタウイルス構造タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第三調節領域を含む第三核酸を、植物、植物の一部または植物細胞を提供し；そして
    ｂ）植物、植物の一部または植物細胞を、第一、第二および第三核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、ＲＬＰを産生する
    ことを含む、方法。
42. 植物、植物の一部または植物細胞が、工程ａ）において植物内で活性であり、第四ロタウイルス構造タンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列に作動可能に連結する第四調節領域を含む第四核酸を伴い提供され、第四ロタウイルス構造タンパク質は工程ｂ）において植物、植物の一部または植物細胞をインキュベートしたときに発現される、請求項４１に記載の方法。
43. ＲＬＰが、少なくともＶＰ４ロタウイルス構造タンパク質を含む、請求項３０〜４２のいずれか１つに記載の方法により製造されたＲＬＰ。
44. 対象に免疫応答を誘発するための有効量の請求項１４、１５、１６および４３のいずれか１つに記載のＲＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
45. 請求項４４に記載の組成物を投与することを含む、対象におけるロタウイルス感染に対する免疫を誘発する方法。
46. 組成物を対象に、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下により投与する、請求項４５に記載の方法。
47. 請求項１〜１３および１７〜４２のいずれか１つに記載の方法により製造されたＲＬＰを含む、植物体。
48. 植物、植物の一部または植物細胞でロタウイルス構造タンパク質を製造する方法であって、
    ａ）植物内で活性であり、１個以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結する調節領域を含む核酸を、植物、植物の一部または植物細胞に導入し；
    ｂ）植物、植物の一部または植物細胞を、該核酸の一過性発現を可能にする条件下でインキュベートして、１個以上のロタウイルス構造タンパク質を産生する
    ことを含む、方法。
49. ヌクレオチド配列がさらに区画ターゲティング配列に作動可能に連結する、請求項４８に記載の方法。
50. １個以上のロタウイルス構造タンパク質がＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６またはＶＰ７である、請求項４８に記載の方法。