JP2018169373A - 免疫測定方法、免疫測定用キット及びラテラルフロー型クロマトテストストリップ - Google Patents

Abstract

【課題】免疫測定により、Ｂ型肝炎ウイルス由来のアナライトを高感度に測定する。【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルスを検出又は定量するためのＢ型肝炎ウイルス測定用キットは、メンブレン１１０、及び該メンブレン１１０に、Ｂ型肝炎ウイルス由来のアナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップ２００と、アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００で標識した標識抗体１５０を含む検出試薬と、を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを高感度に検出及び定量できる免疫測定方法、それに用いる免疫測定用キット及びラテラルフロー型クロマトテストストリップに関する。

生体内には、無数の化学物質が存在することから、生体内の特定の微量成分を定性的、定量的に分析することは、極めて重要である。医療、製薬、健康食品、バイオテクノロジー、環境等の分野において、生体内の特定の箇所（化学物質）にのみ作用する薬品及び食品、生体の僅かな変化を検出する分析装置及び診断薬等は、上記技術とともに発展してきた。

上記分析技術の一つに、イムノアッセイがある。これは、免疫測定法とも呼ばれ、免疫反応の一つである、抗原−抗体間における特異的な反応を利用し、微量成分を定性的、定量的に分析する方法である。抗原−抗体間反応は感度や反応の選択性が高いため、上記分野で広く用いられている。イムノアッセイは、その測定原理により、様々な測定法がある。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス等の凝集法（ＬＩＡ、ＰＡ）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ）、赤血球凝集法（ＨＡ）、赤血球凝集抑制法（ＨＩ）等が挙げられる。

イムノアッセイは、抗原及び抗体が反応し複合体を形成した際の変化（抗原、抗体又は複合体の濃度変化）から、抗原又は抗体を定性的又は定量的に検出する。これらを検出する際に、抗体、抗原又は複合体に標識物質を結合させることで、検出感度が増大する。そのため、標識物質の標識能力は、イムノアッセイにおける検出能力を左右する重要な要素であるといえる。上記に例示したイムノアッセイにおいても、標識物質として、赤血球（ＨＡの場合）、ラテックス粒子（ＬＩＡの場合）、蛍光色素（ＦＩＡの場合）、放射性元素（ＲＩＡの場合）、酵素（ＥＩＡの場合）、化学発光物質（ＣＬＩＡの場合）等が用いられている。

ところで、標識物質として着色した微粒子を用いた場合、特別な分析装置を用いることなく目視により検出を確認することができるため、より簡便な測定ができることが期待される。このような着色した微粒子として、例えば、特許文献１では、ポリマー系ラテックス粒子の表面に結合した金ナノ粒子からなる着色ラテックスが提案されている。ポリマー系ラテックス粒子の表面に金ナノ粒子を結合させることにより、該金ナノ粒子自身が着色剤として視認性や検出感度の向上に役立つ一方、金ナノ粒子自身が抗原又は抗体に対する結合性にも優れることから、充分な濃色となる程度にまで金ナノ粒子を結合させても充分な量の抗原又は抗体を結合させ得るとされている。

上記着色ラテックスは、スチレン−アクリル酸共重合体ラテックス及び金ナノ粒子の前駆体であるＨＡｕＣｌの分散液にガンマ線を照射することで、上記ラテックスの表面に金ナノ粒子を結合させたものである。しかし、上記着色ラテックスは、金ナノ粒子がラテックスの表面のみに結合されることから、表面プラズモン吸収が発現する金ナノ粒子の担持量に制限があるうえに、金ナノ粒子が脱離しやすい。その結果、免疫測定試薬としての視認性や感度が十分でない恐れがある。また、ガンマ線等の電磁放射線を照射するため、ラテックスにダメージを与える恐れがある。さらに、特許文献１の明細書中には、上記ラテックス径や金ナノ粒子径の好ましい範囲を開示しているが、実施例においてこれらの好ましい範囲が検証されておらず、好ましい範囲の規定の根拠がない。

また、特許文献２では、金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子が開示され、顕微鏡検査法及びイムノアッセイ法に利用可能な試薬への適用が示唆されている。しかし、上記金属金で被覆されたポリマーラテックス粒子は、その材質や粒径の開示がない。さらに、イムノアッセイ法に利用可能な試薬としての効果について検証がない。そのため、金属金及びポリマーラテックス粒子における試薬としての効果は不明である。

このような背景から、本発明者らは、先に、高感度な免疫測定を可能にする標識物質として、特定の構造の樹脂−金属複合体を提案した（特許文献３、特許文献４、特許文献５）。

ところで、血液、尿、唾液などの生体試料や食品の抽出試料などの試料中に含まれるアナライトを検出又は定量する際に、ラテラルフロー型クロマトテストストリップ（以下、「テストストリップ」と記すことがある）を用いると、迅速かつ簡便にアナライトを検出できる。そのため、テストストリップは、各種臨床検査や検定試験において汎用されている。このようなテストストリップを用いたイムノクロマトグラフとして、いわゆる１ステップ型と２ステップ型が知られている。

１ステップ型のイムノクロマトグラフでは、まず、試料添加部に、アナライトを含む試料を添加する。添加された試料は、毛細管現象により、メンブレン上を試料添加部から判定部に向かって移動（展開）する。途中の反応部には、アナライトと特異的に結合する標識化リガンドが含まれているため、アナライトは、標識化リガンドと結合し、アナライト及び標識化リガンドを含む複合体が形成される。次に、形成された複合体は、判定部に移動する。判定部では、複合体中のアナライトと特異的に結合するリガンド（捕捉リガンド）が固定されている。そのため、複合体が判定部に移動すると、複合体中のアナライトと捕捉リガンドとの結合反応を介して、複合体は判定部にて捕捉される。次いで、判定部において、捕捉された複合体中の標識物質によるシグナルを検出して、試料中のアナライトを定性的ないし定量的に分析する（例えば、特許文献６）。

一方、２ステップ型のイムノクロマトグラフでは、まず、抗原などのアナライトに、該アナライトと特異的に結合し、標識化された抗体などのリガンドを接触させて複合体を形成する。次に、この複合体を移動相として、テストストリップに添加し、クロマトグラフィーの原理によりメンブレンに展開させ、メンブレンの反応部で捕捉リガンド（例えば、前記抗原に対する第二抗体）により複合体を捕捉した後、標識から発せられるシグナルを検出して、試料中のアナライトを定性的ないし定量的に分析する（例えば、特許文献７）。

特開２００９−１６８４９５号公報 特開平３−２０６９５９号公報 国際公開ＷＯ２０１６／００２７４２ 国際公開ＷＯ２０１６／００２７４３ 国際公開ＷＯ２０１７／０１０３９１ 特開２０１１−２７６９３公報 特開２００５−５２２６９８公報

イムノクロマトグラフでは、色の濃さと粒子のサイズによって、感度や視認性が左右される。感度アップの為には、少ない粒子がテストラインにキャッチされてもラインとして見えることが重要であるため、大きな粒子であることが有利である。また、人がその少ない粒子を視認するためには、濃い色の粒子で見やすくすることが望まれる。しかし、従来のテストストリップを用いたイムノクロマトグラフでは、標識物質として、酵素を含む蛋白質、金属コロイド、着色ラテックス粒子等が一般的に使用されてきた。これらの標識物質を使用したイムノクロマトグラフでは、発色性、検出感度などの点で必ずしも満足のいくものばかりではなく、改善の余地があった。

例えば、金コロイドは濃い色の粒子で、視認性は高いが、粒径が７０ｎｍ以下の小さな粒子が多く利用されているため、抗原量（ウイルスなど）が少なくなると、極端に視認性が悪くなり、感度が低下する。また、感度を上げるために金ナノ粒子のサイズを１００ｎｍ以上にすると、金本来の金属色が現れ、コロイドの染色度が著しく下がり、視認性が低下するため、やはり感度アップが難しくなる。
一方、着色ラテックス粒子は、２００ｎｍ〜３００ｎｍと比較的大きな粒子が使われることが多いため、少ない抗原量でも、大きな粒子がテストラインにキャッチされることによって、感度アップが期待できる。しかし、ラテックス自体の染色度に限界があり、金コロイドほどの濃い発色が得られない。従って、着色ラテックス粒子は大きな粒子でありながら、低い染色度のため、視認性が悪くなり、感度アップが出来ないという問題があった。しかも、着色ラテックス粒子の染色度を上げるために染料を多くすると、粒子の分散性が悪くなるため、染色度の向上も期待できない。

ところで、Ｂ型肝炎を引き起こすＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）は、全世界で約３億人以上が感染していると言われ、日本でも、１５０万人程度の感染者がいると推定されている。Ｂ型肝炎ウイルス感染の一次スクリーニング診断では、まず、採血による血液検査でＨＢｓ抗原の陽性／陰性が判断される。しかし、採血による検査は、被験者の痛みを伴うとともに、医師の監督下で行わなければならず、より多くの人がＢ型肝炎ウイルス感染の有無を確認する上で妨げとなっている。従って、例えば唾液等を検体として簡易に行うことができる非侵襲的な検査手法や検査キットの開発が望まれている。しかし、血液中のＨＢｓ抗原量に比較して、唾液中のＨＢｓ抗原量が少ないため、従来の金コロイドや着色ラテックスを使用する免疫測定では、正確な診断が困難であった。

従って、本発明の目的は、免疫測定法によって、特にＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを高感度に測定することにある。

本発明者らは、鋭意研究を行った結果、特定の構造の樹脂−金属複合体を標識物質として使用することによって、優れた発色性と検出感度が得られ、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の免疫測定方法は、試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量する方法である。
本発明の免疫測定方法は、メンブレン、及び該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップを用い、下記工程(I)〜(III)；
工程(I)：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
工程(II)：前記判定部にて、工程(I)において形成された、前記アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
工程(III)：前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含む工程を行うことを特徴とする。

本発明の免疫測定方法は、前記金属粒子が、金粒子又は白金粒子であってもよい。

本発明の免疫測定方法において、前記樹脂−金属複合体における前記金属粒子は、前記樹脂粒子外に露出した部位を有する第１の粒子と、全体が前記樹脂粒子に内包されている第２の粒子と、を含んでいてもよく、前記第１の粒子及び前記第２の粒子のうち、少なくとも一部の粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布していてもよい。

本発明の免疫測定方法は、前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であってもよい。

本発明の免疫測定方法は、前記金属粒子の平均粒子径が１〜８０ｎｍの範囲内であってもよい。

本発明の免疫測定方法は、前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が５０〜１０００ｎｍの範囲内であってもよい。

本発明の免疫測定方法は、前記抗体が、抗ＨＢｓ抗体であってもよい。

本発明の免疫測定用キットは、ラテラルフロー型クロマトテストストリップを用いて、試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量するための免疫測定用キットである。
本発明の免疫測定用キットは、メンブレン、及び該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップと、前記アナライトに特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体を含む検出試薬と、を含む。

本発明のラテラルフロー型クロマトテストストリップは、試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量するためのものである。本発明のラテラルフロー型クロマトテストストリップは、メンブレンと、前記メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、前記試料が展開する方向において、前記判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体が含まれる反応部と、を含む。

本発明の免疫測定方法によれば、樹脂−金属複合体を抗体や抗原及び蛋白質などに標識して使用することによって、優れた発色性と高い検出感度の両立が可能であり、血液、唾液、便、尿のような生物学的液体の中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトの高感度な免疫測定が可能になる。また、本発明の免疫測定用キット及びラテラルフロー型クロマトテストストリップは、視認性、目視判定性、検出感度に優れており、Ｂ型肝炎ウイルスの免疫測定において有利に利用できる。具体的には、従来の、Ｂ型肝炎ウイルスの免疫測定では、被検体（ヒト、動物等）として血液を採取し、血液中のＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを測定する必要があったが、本発明の免疫測定方法によれば、例えば被検体として唾液を採取し、唾液中のＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを測定すればよい。

本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマトテストストリップを用いた免疫測定方法の概要を示す説明図である。 本発明の一実施の形態で用いる樹脂−金属複合体の断面の構造を示す模式図である。 作製例２で得られた樹脂−金属複合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。

以下、適宜図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

［ラテラルフロー型クロマトテストストリップ］
まず、図１を参照しながら、本発明の一実施の形態に係るラテラルフロー型クロマトテストストリップ（テストストリップ）について説明する。このテストストリップ２００は、後述するように、本発明の一実施の形態の免疫測定方法に好ましく使用できるものである。以下、Ｂ型肝炎ウイルス由来のアナライトを測定する場合を例として、説明する。

テストストリップ２００は、メンブレン１１０を備えている。メンブレン１１０には、試料の展開方向において順に、試料添加部１２０、判定部１３０及び吸液部１４０が設けられている。

＜メンブレン＞
テストストリップ２００に使用されるメンブレン１１０としては、一般的なテストストリップにおいてメンブレン材料として使用されるものを適用可能である。メンブレン１１０は、例えば毛管現象を示し、試料を添加すると同時に、試料が展開するような微細多孔性物質からなる不活性物質（Ｂ型肝炎ウイルス由来のアナライト１６０、各種リガンドなどと反応しない物質）で形成されているものである。メンブレン１１０の具体例としては、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、セルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはセルロース誘導体やナイロンで構成される膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が用いられ、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙が用いられる。

テストストリップ２００は、操作をより簡便にするため、メンブレン１１０を支持する支持体を備えていることが好ましい。支持体としては、例えばプラスチック等を用いることができる。

＜試料添加部＞
テストストリップ２００は、Ｂ型肝炎ウイルス由来のアナライト１６０（以下、単に「アナライト１６０」と記すことがある）を含む試料を添加するための試料添加部１２０を有していてもよい。試料添加部１２０は、テストストリップ２００に、アナライト１６０を含む試料を受け入れるための部位である。試料添加部１２０は、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも上流側のメンブレン１１０に形成されていてもよいし、あるいは、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布などの材料で構成された試料添加パッドがメンブレン１１０に設けられて試料添加部１２０を構成していてもよい。

＜判定部＞
判定部１３０には、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されている。捕捉リガンド１３１は、アナライト１６０と特異的な結合を形成するものであれば特に制限なく使用でき、例えばアナライト１６０に対する抗体などを好ましく用いることができる。捕捉リガンド１３１は、テストストリップ２００に試料を提供した場合においても、判定部１３０から移動することがないように不動化している。捕捉リガンド１３１は、物理的又は化学的な結合や吸着等によって、メンブレン１１０に直接的又は間接的に固定されていればよい。

また、判定部１３０は、標識抗体１５０とアナライト１６０とを含む複合体１７０が、アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１に接触するような構成である限り特に限定されない。例えば、メンブレン１１０に、直接、捕捉リガンド１３１が固定されていてもよいし、あるいは、メンブレン１１０に固定されたセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッドに捕捉リガンド１３１が固定されていてもよい。

＜吸液部＞
吸液部１４０は、例えば、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料のパッドにより形成される。添加された試料の展開前線（フロントライン）が吸液部１４０に届いてからの試料の移動速度は、吸液部１４０の材質、大きさなどにより異なるものとなる。従って、吸液部１４０の材質、大きさなどの選定により、アナライト１６０の検出・定量に最適な速度を設定することができる。なお、吸液部１４０は任意の構成であり、省略してもよい。

テストストリップ２００は、必要に応じて、さらに、反応部、コントロール部等の任意の部位を含んでいてもよい。

＜反応部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００には、メンブレン１１０に、標識抗体１５０を含む反応部が形成されていてもよい。反応部は、試料が流れる方向において、判定部１３０よりも上流側に設けることができる。なお、図１における試料添加部１２０を反応部として利用してもよい。テストストリップ２００が反応部を有する場合、アナライト１６０を含む試料を、反応部又は試料添加部１２０に供すると、反応部において、試料に含まれるアナライト１６０と標識抗体１５０とを接触させることができる。この場合、試料を、単に反応部又は試料添加部１２０に供することで、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成させることができるので、いわゆる１ステップ型のイムノクロマトグラフが可能になる。

反応部は、アナライト１６０と特異的に結合する標識抗体１５０を含む限り特に限定されないが、メンブレン１１０に、直接、標識抗体１５０が塗布されてなるものであってもよい。あるいは、反応部は、例えばセルロース濾紙、グラスファイバー、不織布等からなるパッド（コンジュゲートパッド）に標識抗体１５０を含浸したものを、メンブレン１１０に固定してなるものであってもよい。

＜コントロール部＞
図示は省略するが、テストストリップ２００は、メンブレン１１０に、試料が展開する方向において、判定部１３０よりも下流側に、標識抗体１５０と特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなるコントロール部が形成されていてもよい。判定部１３０とともに、コントロール部でも発色強度が測定されることにより、テストストリップ２００に供した試料が展開して、反応部及び判定部１３０に到達し、検査が正常に行われたことを確認することができる。なお、コントロール部は、捕捉リガンド１３１の代わりに、標識抗体１５０と特異的に結合する別の種類の捕捉リガンドを用いることを除いては、上述の判定部１３０と同様にして作成され、同様の構成を採ることができる。また、コントロール部については、上記の方法以外に、鍵と鍵穴の関係を示す物質、例えば、アビジンとビオチン、酵素と基質、酵素と補酵素等の物質を用いることも出来る。好ましくはアビジンとビオチンを捕捉リガンド１３１および標識抗体１５０の代わりに用いてもよい。

［Ｂ型肝炎ウイルスの測定方法］
次に、テストストリップ２００を用いて行われる本発明の一実施の形態のＢ型肝炎ウイルスの測定方法について説明する。

本実施の形態のＢ型肝炎ウイルスの測定方法は、試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライト１６０を検出又は定量するＢ型肝炎ウイルスの測定方法である。ここで、Ｂ型肝炎ウイルスは、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物に感染するものを含む。また、Ｂ型肝炎ウイルス由来のアナライト１６０としては、抗原性を有するものであればよく、ウイルスそれ自体や、例えばＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原など、ウイルスによって放出される抗原や、ウイルスの一部分に由来するたんぱく質などであってもよい。これらの中でも、Ｂ型肝炎ウイルスの外殻を構成するたんぱく質であり、血液中や唾液中に放出されるＨＢｓ抗原が好ましい。さらに、これらの抗原に対する抗体として、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＢｅ抗体などをアナライトとしてもよい。

本実施の形態のＢ型肝炎ウイルスの測定方法は、メンブレン１１０、及び該メンブレン１１０にアナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００を用い、下記工程(I)〜(III)；
工程(I)：試料に含まれるアナライト１６０と、該アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００で標識した標識抗体１５０と、を接触させる工程、
工程(II)：判定部１３０にて、工程(I)において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体を、捕捉リガンド１３１に接触させる工程、
工程(III)：樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
を含むことができる。

工程(I)：
工程(I)は、試料に含まれるアナライト１６０を、標識抗体１５０に接触させる工程である。アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成する限り、接触の態様は特に限定されるものではない。例えば、テストストリップ２００の試料添加部１２０又は反応部（図示省略）に試料を供し、該反応部においてアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよいし、テストストリップ２００に試料を供する前に、試料中のアナライト１６０を標識抗体１５０に接触させてもよい。

工程(I)で形成された複合体１７０は、テストストリップ２００上で展開して移動し、判定部１３０に至る。

工程(II)：
工程(II)は、テストストリップ２００の判定部１３０において、工程(I)において形成された、アナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させる。複合体１７０を、捕捉リガンド１３１に接触させると、捕捉リガンド１３１は、複合体１７０のアナライト１６０に特異的に結合する。その結果、複合体１７０が判定部１３０において捕捉される。

なお、捕捉リガンド１３１は、標識抗体１５０には特異的に結合しないために、アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０が判定部１３０に到達した場合、該アナライト１６０と未結合の標識抗体１５０は、判定部１３０を通過する。ここで、テストストリップ２００に、標識抗体１５０に特異的に結合する別の捕捉リガンドが固定されたコントロール部（図示省略）が形成されている場合、判定部１３０を通過した標識抗体１５０は、展開を続け、コントロール部で該別の捕捉リガンドと結合する。その結果、アナライト１６０と複合体１７０を形成していない標識抗体１５０は、コントロール部で捕捉される。

工程(II)の後、必要に応じて工程(III)の前に、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の生化学検査で汎用される緩衝液で、テストストリップ２００を洗浄する洗浄工程を実施してもよい。洗浄工程によって、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部に捕捉されなかった標識抗体１５０（アナライト１６０と結合しておらず、複合体１７０を形成していない標識抗体１５０）を除去することができる。

洗浄工程を実施することで、工程(III)において、判定部１３０、又は、判定部１３０及びコントロール部における樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収による発色を測定する際に、バックグラウンドの発色強度を低減させることができ、シグナル／バックグラウンド比を高め、一層、検出感度や定量性を向上させることができる。

工程(III)：
工程(III)は、樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程である。上記工程(II)又は必要に応じて洗浄工程を実施した後、テストストリップ２００において、樹脂−金属複合体１００の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する。

なお、テストストリップ２００にコントロール部が形成されている場合、工程(II)によって、コントロール部にて、標識抗体１５０が別の捕捉リガンドによって捕捉され複合体が形成される。そのため、工程(III)では、テストストリップ２００おいて、判定部１３０だけでなく、コントロール部においても局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収による発色を生じさせることができる。このように、判定部１３０とともにコントロール部においても発色強度を測定することで、テストストリップ２００に供した試料が正常に展開して、反応部及び判定部１３０に到達したか否かを確認できる。

＜試料＞
本実施の形態のＢ型肝炎ウイルスの測定方法における試料は、アナライト１６０を含むものである限り特に限定されるものではない。例えば、目的のアナライト１６０を含む生体試料（すなわち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等）が挙げられる。必要に応じて、標識抗体１５０及び捕捉リガンド１３１とアナライト１６０との特異的な結合反応が生じやすくするために、上記工程(I)に先立って、試料に含まれるアナライト１６０を前処理してもよい。ここで、前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。特に、ＨＢｃ抗原等の、通常は表面に露出していない物質である場合、界面活性剤等による処理を行うことが好ましい。この目的に使用される界面活性剤として、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応等のリガンドとアナライト１６０との結合反応性を考慮して、非イオン性界面活性剤を用いることができる。

また、前記試料は、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（水、生理食塩水、又は緩衝液等）や水混和有機溶媒で適宜希釈されていてもよい。

＜標識抗体＞
標識抗体１５０は、工程(I)において、試料に含まれるアナライト１６０に接触させて、アナライトであるアナライト１６０と標識抗体１５０とを含む複合体１７０を形成するために使用される。標識抗体１５０は、アナライト１６０に特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００で標識化してなるものである。ここで、「標識化」とは、工程(I)〜(III)において、標識抗体１５０から樹脂−金属複合体１００が脱離しない程度に、抗体に樹脂−金属複合体１００が直接的に又は間接的に、化学的又は物理的な結合や吸着等で固定されていることを意味する。例えば、標識抗体１５０は、抗体に樹脂−金属複合体１００が直接結合してなるものであってもよいし、抗体と樹脂−金属複合体１００とが、任意のリンカー分子を介して結合してなるものや、それぞれが不溶性粒子に固定されてなるものであってもよい。

また、本実施の形態において、標識として使用される樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有するものである。なお、樹脂−金属複合体１００の詳細については後述する。

また、本実施の形態において、「抗体」としては、特に制限はなく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体のほか、抗原と結合能を有する抗体断片［例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ等］などを用いることができる。好ましい抗体の具体例としては、例えば抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＢｅ抗体が挙げられる。

＜標識抗体の好ましい作製方法＞
次に、標識抗体１５０の好ましい作製方法を挙げて説明する。標識抗体１５０の製造は、少なくとも、次の工程Ａ；
工程Ａ）樹脂−金属複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して結合させることによって、標識抗体１５０を得る工程
を含み、好ましくは、さらに工程Ｂ；
工程Ｂ）標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理する工程
を含むことができる。

［工程Ａ］
工程Ａでは、樹脂−金属複合体１００を第１のｐＨ条件で抗体と混合して標識抗体１５０を得る。工程Ａは、固体状の樹脂−金属複合体１００を液相中に分散させた状態で抗体と接触させることが好ましい。第１のｐＨ条件は、樹脂−金属複合体１００における金属粒子の金属種や、抗体の種類、工程Ｂで使用するブロック用緩衝液の種類によって異なる。

樹脂−金属複合体１００の金属粒子が金粒子（金合金粒子を含む；以下同様である）である場合には、第１のｐＨ条件は、酸性下、中性下及びアルカリ性下のいずれでも適用できるが、樹脂−金属複合体１００の分散と抗体の活性を維持したまま樹脂−金属複合体１００と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２〜９．５の範囲内の条件が好ましく、ｐＨ７．５〜９．０の範囲内がより好ましい。金属粒子が金粒子である場合、樹脂−金属複合体１００と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ９．５を超えると樹脂−金属複合体１００と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。

また、樹脂−金属複合体１００の金属粒子が金以外の粒子、例えば白金、パラジウムまたはそれらの合金等である場合には、第１のｐＨ条件は、樹脂−金属複合体１００の分散と抗体の活性を維持したまま樹脂−金属複合体１００と抗体を均一に接触させる観点から、ｐＨ２〜１０の範囲内の条件が好ましく、さらに例えばｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。金属粒子が金以外の粒子である場合、樹脂−金属複合体１００と抗体とを結合させるときの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると樹脂−金属複合体１００と抗体を混合した際に凝集し分散が困難となる。ただし、強酸性により抗体が失活しない場合はｐＨ２未満においても処理が可能である。

工程Ａは、第１のｐＨ条件に調整した結合用緩衝液（Binding Buffer）中で行うことが好ましい。例えば、上記ｐＨに調整した結合用緩衝液に所定量の樹脂−金属複合体１００を混合し、十分に混和する。結合用緩衝液としては、例えば、所定濃度に調整したホウ酸溶液などを用いることができる。結合用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。

次に、得られた混合液に、所定量の抗体を添加し、十分に撹拌、混合することによって、標識抗体含有液を得ることができる。このようにして得られた標識抗体含有液は、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。

［工程Ｂ］
工程Ｂでは、工程Ａで得られた標識抗体１５０を第２のｐＨ条件で処理することによって、標識抗体１５０への非特異的な吸着を抑制するブロッキングを行う。この場合、固液分離手段によって分取しておいた標識抗体１５０を、第２のｐＨ条件で液相中に分散させる。このブロッキングの条件は、樹脂−金属複合体１００における金属粒子の金属種やブロック緩衝液の種類によって異なる。

樹脂−金属複合体１００の金属粒子が金粒子であり、ブロック緩衝液としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はカゼインＮａを使用する場合には、第２のｐＨ条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体１５０の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２〜９．５の範囲内が好ましい。特に、カゼインＮａを使用する場合には、標識抗体１５０の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ７．５〜９．５の範囲内がより好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ９．５を超えると標識抗体１５０が凝集してしまい分散が困難となる。一方、ブロック緩衝液として、ＢＳＡを使用する場合には、例えばｐＨ２〜９．５の範囲内が好ましい。

また、樹脂−金属複合体１００の金属粒子が金以外の粒子である場合には、第２のｐＨ条件は、抗体の活性を保ちかつ標識抗体１５０の凝集を抑制する観点から、例えばｐＨ２〜１０の範囲内が好ましく、標識抗体１５０の非特異的な吸着を抑制する観点から、ｐＨ５〜９の範囲内がより好ましい。ブロッキングの条件が、ｐＨ２未満では強酸性により抗体が変質し失活する場合があり、ｐＨ１０を超えると標識抗体１５０が凝集してしまい分散が困難となる。

工程Ｂは、第２のｐＨ条件に調整したブロック用緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて行うことが好ましい。例えば、所定量の標識抗体１５０に上記ｐＨに調整したブロック用緩衝液を添加し、ブロック用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。ブロック用緩衝液としては、例えば、被検出物と結合しない蛋白質の溶液を用いることが好ましい。ブロック用緩衝液に使用可能な蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどを挙げることができる。また、タンパク質以外に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アミノ酸ポリマーなどの人工高分子ポリマーでも良い。より具体的には、所定濃度に調整した牛血清アルブミン溶液などを用いることが好ましい。ブロック用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の分散には、公知の方法が使用できるが、例えば超音波処理、ローテーターによる撹拌などの分散手段を用いることが好ましい。このようにして標識抗体１５０が均一分散した分散液が得られる。

以上のようにして、標識抗体１５０の分散液が得られる。この分散液から、例えば遠心分離などの固液分離手段により、固形部分として標識抗体１５０のみを分取できる。また、必要に応じて、洗浄処理、保存処理などを実施することができる。以下、洗浄処理、保存処理について説明する。

（洗浄処理）
洗浄処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に洗浄用緩衝液を添加し、洗浄用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。洗浄用緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ８〜９の範囲内に調整した所定濃度の、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、グリシンアミド緩衝液、アルギニン緩衝液などを用いることができる。洗浄用緩衝液のｐＨの調整は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどを用いて行うことができる。標識抗体１５０の洗浄処理は、必要に応じて複数回を繰り返し行うことができる。

（保存処理）
保存処理は、固液分離手段によって分取した標識抗体１５０に保存用緩衝液を添加し、保存用緩衝液中で標識抗体１５０を均一に分散させる。分散には、例えば超音波処理などの分散手段を用いることが好ましい。保存用緩衝液としては、例えば、洗浄用緩衝液に、所定濃度の凝集防止剤及び／又は安定剤を添加した溶液などを用いることができる。凝集防止剤としては、例えば、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類や、グリセリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの人工高分子、オクチルフェノールエトキシレート類、ポリソルベート類等の非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤等を用いることができる。安定剤としては、特に限定されるものではないが、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースに代表される糖類、を用いることができる。このようにして標識抗体１５０の保存処理を行うことができる。

以上の各工程では、さらに必要に応じて、界面活性剤や、アジ化ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステルなどの防腐剤を用いることができる。

＜樹脂−金属複合体＞
次に、本実施の形態のＢ型肝炎ウイルスの測定方法において、標識として使用される樹脂−金属複合体１００について詳細に説明する。図２は、本実施の形態で標識として使用する樹脂−金属複合体の断面模式図である。樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子１０と、金属粒子２０と、を備えている。

樹脂−金属複合体１００は、樹脂粒子１０に金属粒子２０が分散又は固定化されている。また、樹脂−金属複合体１００は、金属粒子２０の一部が樹脂粒子１０の表層部６０において三次元的に分布し、かつ前記三次元的に分布した金属粒子２０の一部が部分的に樹脂粒子１０外に露出しており、残りの一部が樹脂粒子１０に内包されている。

ここで、金属粒子２０には、樹脂粒子１０に完全に内包された金属粒子（以下、「内包金属粒子３０」ともいう。）、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子（以下、「一部露出金属粒子４０」ともいう。）及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属粒子（以下、「表面吸着金属粒子５０」ともいう。）が存在する。一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０は、本発明における「第１の粒子」に該当し、内包金属粒子３０は、本発明における「第２の粒子」に該当する。

例えば、樹脂−金属複合体１００を免疫測定に使用する場合、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０上に、抗体を固定化して使用する。その際、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０には、前記抗体が固定化される一方で、内包金属粒子３０には、固定化されない。しかし、内包金属粒子３０を含む金属粒子２０の全てが局在型表面プラズモン共鳴による吸収及び電子遷移による光エネルギー吸収を発現することから、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０のみならず、内包金属粒子３０も、免疫測定用標識としての視認性向上に寄与する。さらに、一部露出金属粒子４０及び内包金属粒子３０は、表面吸着金属粒子５０と比較して樹脂粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果等の物理的吸着力が強く、樹脂粒子１０から脱離しにくい。そのため、樹脂−金属複合体１００を使用した免疫測定用標識としての耐久性、安定性を優れたものにすることができる。

内包金属粒子３０は、その表面の全てが、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。また、一部露出金属粒子４０は、その表面積の５％以上１００％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。上記各用途の耐久性の観点から、その下限は、表面積の２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましい。また、表面吸着金属粒子５０は、その表面積の０％を超えて５％未満が、樹脂粒子１０を構成する樹脂に覆われているものである。

また、樹脂−金属複合体１００への金属粒子２０（内包金属粒子３０、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０の合計）の担持量は、樹脂−金属複合体１００の重量に対して、５ｗｔ％〜７０ｗｔ％であることが好ましい。この範囲であれば、樹脂−金属複合体１００は、標識物質としての視認性、目視判定性及び検出感度に優れる。金属粒子２０の担持量が５ｗｔ％未満では、抗体の固定化量が少なくなり、検出感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の担持量は、より好ましくは、１５ｗｔ％〜７０ｗｔ％である。

また、金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることが好ましい。この範囲であれば、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高い。金属粒子２０の２０ｗｔ％〜８０ｗｔ％が一部露出金属粒子４０及び表面吸着金属粒子５０であることがより好ましく、耐久性の観点から、表面吸着金属粒子５０が２０ｗｔ％以下であることがさらに好ましい。

また、金属粒子２０の６０ｗｔ％〜１００ｗｔ％が、表層部６０に存在し、表層部６０に存在する金属粒子２０の５ｗｔ％〜９０ｗｔ％が、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０であることが、金属粒子２０上への抗体の固定化量が充分確保できるため、標識物質としての感度が高くなり好ましい。換言すれば、表層部６０に存在する金属粒子２０の１０ｗｔ％〜９５ｗｔ％が内包金属粒子３０であることがよい。

ここで、前記「表層部」とは、樹脂粒子１０の表面から、深さ方向に粒子半径の５０％の範囲を意味する。また、前記「三次元的に分布」とは、金属粒子２０が、樹脂粒子１０の面方向だけでなく、深さ方向にも分散されていることを意味する。

樹脂粒子１０は、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子であることが好ましい。特に、含窒素ポリマー粒子であることが好ましい。含窒素ポリマー中の窒素原子は、視認性に優れ、抗体の固定化が容易な金、白金、パラジウムなどの金属粒子２０の前駆体であるアニオン性金属イオンを化学吸着しやすいため、好ましい。本実施の形態では、含窒素ポリマー中に吸着した金属イオンを還元し、金属ナノ粒子を形成する為、生成した金属粒子２０の一部は、内包金属粒子３０又は一部露出金属粒子４０となる。また、アクリル酸重合体のように、カルボン酸等はカチオン性金属イオンを吸着することができるため、銀、ニッケル、銅などの金属粒子２０の前駆体であるカチオン性金属イオンを吸着しやすく、銀、ニッケル、銅などの金属粒子２０を形成することが可能であり、上記金、白金、パラジウムなどの金属との合金を作ることも可能である。
一方、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有する含窒素ポリマー以外の樹脂粒子、例えばポリスチレン等の場合、前記金属イオンを樹脂内部に吸着しにくい。その結果、生成した金属粒子２０の大部分は、表面吸着金属粒子５０となる。上記のとおり、表面吸着金属粒子５０は、樹脂粒子１０との接触面積が小さいため、樹脂と金属の接着力が小さく、樹脂粒子１０から金属粒子２０が脱離する影響が大きい傾向にある。
上記含窒素ポリマーは、主鎖又は側鎖に窒素原子を有する樹脂であり、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリオキサゾール、ポリピロール、ポリアニリン等がある。好ましくは、ポリ−２−ビニルピリジン、ポリ−３−ビニルピリジン、ポリ−４−ビニルピリジン等のポリアミンである。また、側鎖に窒素原子を有する場合は、例えば、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂等幅広く利用することが可能である。

また、樹脂−金属複合体１００は、金属と樹脂のナノサイズでの複合化のしやすさの観点から、前記金属粒子２０が、金、白金、パラジウム、銀、ニッケル、銅、又はこれらの合金であることが好ましい。これらの金属は、単体もしくは合金等の複合体で使用することが可能である。ここで、例えば金合金としては、金と金以外の金属種からなり、金を１０重量％以上含有する合金を意味する。また、例えば白金合金としては、白金と白金以外の金属種からなり、白金を１重量％以上含有する合金を意味する。
免疫測定用標識物質及び免疫測定用試薬として用いる場合、より好ましくは、視認性に優れ、抗原又は抗体の固定化が容易な金、白金及びパラジウムである。これらは、局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現するため、好ましい。更に好ましくは、保存安定性がよい金、又は免疫測定における検出感度に優れる白金である。

金属粒子２０として白金粒子を使用した、樹脂−白金複合体は、他の金属種の粒子を有する樹脂−金属複合体１００と比較して、抗体などのリガンドと結合させた状態で凝集を生じにくく、極めて分散性に優れている。また、白金粒子は、酸化などの変質に強く、保存安定性にも優れている。さらに、白金粒子は、例えば２５０ｎｍ〜９００ｎｍまでの範囲の幅広い波長で局在型表面プラズモン共鳴に由来する吸収を発現し、さらに電子遷移による光エネルギー吸収の発現により、黒色に近い強い発色を呈するので、樹脂−白金複合体を標識物質として用いることによって、免疫測定において、高い視認性が得られ、アナライトの検出感度も高めることができる。この場合、白金粒子を用いることによって、他の金属の粒子に比べ、少ない担持量で優れた検出感度が得られる。従って、仮に平均粒子径が同等であれば、樹脂−白金複合体は、他の金属種の粒子を有する樹脂複合体に比べて有意に高い検出感度を示すので特に好ましい。

白金粒子は、白金のみからなるものでもよいし、白金と他の金属との合金であってもよい。白金合金において、白金と合金を形成する他の金属種としては、特に制限されないが、例えば、銀、ニッケル、銅、金、パラジウム等が好ましい。

金属粒子２０として金粒子を使用した、樹脂−金複合体は、他の金属種の粒子を有する樹脂−金属複合体１００と比較して、抗体などのリガンドと結合させた状態で凝集を生じにくく、極めて分散性に優れている。さらに、視認性に優れ、抗原又は抗体の固定化が容易である。特に、金粒子の粒子径や金粒子同士の粒子間距離を制御することで、赤色、紫色、青色等、様々な発色を呈する。そのため、樹脂−金複合体をイムノクロマトグラフの標識物質として使用する場合に、様々な色の標識物質を得ることができる。

また、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察により測長される金属粒子２０の平均粒子径は、例えば１〜１００ｎｍであることが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径が、１ｎｍ未満の場合や１００ｎｍを超える場合は、局在型表面プラズモン共鳴及び、電子遷移による光エネルギー吸収が発現しにくくなるため感度が低下する傾向がある。
金属粒子２０として白金粒子を使用する場合、白金粒子の平均粒子径は、免疫測定用標識物質及び免疫測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましくは１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、より好ましくは１ｎｍ以上３０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１ｎｍ以上２０ｎｍ以下であり、最も好ましくは１ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。特に、白金粒子の平均粒子径が１５ｎｍ以下である場合、樹脂−白金複合体をイムノクロマトグラフの標識物質として使用する場合に、特に優れた検出感度が得られる。
また、金属粒子２０として金粒子を使用する場合、金粒子の平均粒子径は、免疫測定用標識物質及び免疫測定用試薬として高い検出感度を得る観点から、好ましくは１ｎｍ以上７０ｎｍ未満であり、より好ましくは、１ｎｍ以上５０ｎｍ未満である。

また、樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、例えば３０〜１０００ｎｍであることが好ましい。樹脂−金属複合体１００の平均粒子径が３０ｎｍ未満では、例えば、金属粒子２０の担持量が少なくなる傾向がある為、同サイズの金属粒子２０を使用しても、着色が弱くなる傾向にあり、１０００ｎｍを超えると、標識物質又は試薬とした際に、メンブランフィルター等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。樹脂−金属複合体１００の平均粒子径は、標識物質又は試薬とした際の分散性を向上させるとともに、樹脂−金属複合体１００を免疫測定に用いる場合に高い検出感度を得る観点から、好ましくは１００ｎｍ以上７００ｎｍ以下であり、より好ましくは２５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下であり、最も好ましくは２８０ｎｍ以上６００ｎｍ以下である。特に、樹脂−金属複合体１００の平均粒子径が２８０ｎｍ以上であると、樹脂−金属複合体１００をイムノクロマトグラフの標識物質として使用する場合に安定して優れた検出感度が得られる。ここで、樹脂−金属複合体１００の粒子径は、樹脂粒子１０の粒子径に、一部露出金属粒子４０又は表面吸着金属粒子５０の突出部位の長さを加えた値を意味し、レーザー回折／散乱法、動的光散乱法、又は遠心沈降法により測定することができる。

樹脂−金属複合体１００の製造方法は、特に限定されない。例えば、乳化重合法により製造した樹脂粒子１０の分散液に、金属イオンを含有する溶液を加えて、金属イオンを樹脂粒子１０に吸着させる（以下、「金属イオン吸着樹脂粒子」という。）。さらに、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液中に加えることで、金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させ、樹脂−金属複合体１００を得る。

また、例えば、金属粒子２０として、金粒子を使用する場合、金属イオンを含有する溶液としては、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ_４）水溶液等が挙げられる。また、金属イオンの代わりに金属錯体を用いても良い。
また、金属イオンを含有する溶液の溶媒として、水の代わりに、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等を用いても良い。
また、前記溶液に、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属粒子２０の大きさを制御するのに有効となる。

また、還元剤は、公知の物を用いることができる。例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、クエン酸、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、塩酸ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、ホルムアルデヒド、ショ糖、ブドウ糖、アスコルビン酸、ホスフィン酸ナトリウム、ハイドロキノン、ロッシェル塩等が挙げられる。このうち、水素化ホウ素ナトリウム又は、ジメチルアミンボラン、クエン酸が好ましい。還元剤溶液には、必要に応じて界面活性剤を添加したり、溶液のｐＨを調整することが出来る。ｐＨ調整にはホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリにより調整することが出来る。
さらに還元剤溶液の温度により、金属イオンの還元速度を調整することで、形成する金属粒子２０の粒径をコントロールすることが出来る。

また、前記金属イオン吸着樹脂粒子中の金属イオンを還元して金属粒子２０を生成させる際、前記金属イオン吸着樹脂粒子を還元剤溶液に添加しても良いし、還元剤を前記金属イオン吸着樹脂粒子に添加しても良いが、内包金属粒子３０及び一部露出金属粒子４０の生成しやすさの観点から、前者が好ましい。

また、樹脂−金属複合体１００の、水への分散性を保持するために、例えば、クエン酸、ポリ−Ｌ−リシン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリビニルアルコールや、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１９４、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８０、ＤＩＳＰＥＲＢＹＫ１８４（以上、ビッグケミージャパン社製）等の分散剤を添加してもよい。さらにホウ酸やリン酸等の緩衝剤、塩酸や硫酸などの酸、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリによりｐＨを調整し、分散性を保持することが出来る。

以上の構成を有する樹脂−金属複合体１００は、特に、金属粒子２０の表面に抗体を吸着させることにより、Ｂ型肝炎ウイルスの免疫測定に好ましく適用できる。また、特に、低濃度域（高感度領域）でも目視判定性に優れ、優れた視認性と高い検出感度の両立が可能なＢ型肝炎ウイルスの免疫測定用標識物質又は免疫測定用試薬の材料として好ましく適用できる。また、免疫測定用標識物質又は免疫測定用試薬の形態に特に限定はないが、例えば、樹脂−金属複合体１００を水もしくは、ｐＨを調整した緩衝液中に分散させた分散液として使用できる。

［免疫検出・定量キット］
本発明の一実施の形態に係る免疫測定用キットは、例えばテストストリップ２００を用いて、本実施の形態のＢ型肝炎ウイルスの測定方法に基づき、試料中に含まれるアナライト１６０を検出又は定量するためのキットである。

本実施の形態の免疫測定用キットは、
メンブレン１１０及び該メンブレン１１０に、前記アナライト１６０と特異的に結合する捕捉リガンド１３１が固定されてなる判定部１３０を含むテストストリップ２００と、 アナライト１６０に特異的に結合する抗体を樹脂粒子１０に複数の金属粒子２０が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体１００で標識した標識抗体１５０を含む検出試薬と、
を含んでいる。本実施の形態の免疫測定用キットは、必要に応じて、さらにその他の構成要素を含むものであってもよい。

本実施の形態の免疫測定用キットを使用するにあたっては、試料中のアナライト１６０と検出試薬中の標識抗体１５０とを接触させて工程(I)を実施した後、テストストリップ２００の反応部又は試料添加部１２０に試料を供して、工程(II)、工程(III)を順次実施してもよい。あるいは、テストストリップ２００の判定部１３０よりも上流側に、検出試薬を塗布して、適宜乾燥させて反応部を形成した後、形成された反応部あるいは該反応部よりも上流側の位置（例えば、試料添加部１２０）に試料を添加して、工程(I)〜(III)を順次実施してもよい。本実施の形態の免疫測定用キットは、唾液等を試料として採取すればよいため、簡易にＢ型肝炎ウイルス感染の一次スクリーニング診断を行うことができる。

次に、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。以下の実施例、比較例において特にことわりのない限り、各種測定、評価は下記によるものである。

＜樹脂−金属複合体の吸光度測定＞
樹脂−金属複合体の吸光度は、光学用白板ガラス製セル（光路長１０ｍｍ）に０．０１ｗｔ％に調製した樹脂−金属複合体分散液（分散媒：水）を入れ、瞬間マルチ測光システム（大塚電子社製、ＭＣＰＤ−３７００）を用いて、金の場合５７０ｎｍ、白金の場合７００ｎｍの吸光度を測定した。金の場合５７０ｎｍでの吸光度が０．９以上を○（良好）、０．５〜０．９未満を△（可）、０．５未満を×（不可）とした。白金の場合７００ｎｍでの吸光度が０．６以上を○（良好）、０．４〜０．６未満を△（可）、０．４未満を×（不可）とした。

＜固形分濃度測定及び金属担持量の測定＞
磁製るつぼに濃度調整前の分散液１ｇを入れ、７０℃、３時間熱処理を行った。熱処理前後の重量を測定し、下記式により固形分濃度を算出した。

固形分濃度（ｗｔ％）＝［乾燥後の重量（ｇ）／ 乾燥前の重量（ｇ）］× １００

また、上記熱処理後のサンプルを、さらに５００℃、５時間加熱処理を行い、加熱処理前後の重量を測定し、下記式より金属担持量を算出した。
金属担持量（ｗｔ％）＝
［５００℃加熱処理後の重量（ｇ）／５００℃加熱処理前の重量（ｇ）］×１００

＜樹脂−金属複合体の平均粒子径の測定＞
ディスク遠心式粒度分布計（CPS Instruments社製）を用いて測定した。測定は、樹脂−金属複合体を水に分散させた状態で行った。

＜金属粒子の平均粒子径の測定＞
金属粒子の平均粒子径の測定は、樹脂−金属複合体分散液をカーボン支持膜付き金属性メッシュへ滴下して作成した基板を、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ；日立ハイテクノロジーズ社製、ＳＵ−９０００）により観測した画像から、金属粒子の面積平均径を測定した。

［作製例１］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ ３３６［アルドリッチ社製］（２．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３８０ｎｍの樹脂粒子Ａ−１を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ−１を得た。

＜樹脂−金属複合体の合成＞
前記樹脂粒子分散液Ｂ−１（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−１を調製した。
次に、純水１５８０ｍｌに前記Ｃ−１（４２．４ｍｌ）を加え、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径３９９ｎｍの樹脂−金複合体Ｄ−１を得た。前記Ｄ−１を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液Ｅ−１を得た。Ｅ−１中の樹脂−金複合体Ｆ−１の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９８であった。また、Ｆ−１における金粒子の平均粒子径は２５．１ｎｍ、金の担持量は５３．２ｗｔ％であった。

［作製例２］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ ３３６［アルドリッチ社製］（１．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４８．００ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、２．００ｇ）を加え、窒素気流下において６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５００ｇ）を２分かけて滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４２０ｎｍの樹脂粒子Ａ−２を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ−２を得た。

＜樹脂−金属複合体の合成＞
前記樹脂粒子分散液Ｂ−２（５０ｍｌ）に純水１２３３ｍｌを加えた後、３０ｍＭ塩化金酸水溶液（１００ｍｌ）を加え、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、２．５ｗｔ％金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−２を調製した。
次に、純水１５８０ｍｌに前記Ｃ−２（４２．４ｍｌ）を加え、３℃で撹拌しながら、５２８ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１０ｍｌ）を滴下した後、室温で２時間撹拌することで、平均粒子径４３８ｎｍの樹脂−金複合体Ｄ−２を得た。前記Ｄ−２を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製することで、１ｗｔ％の樹脂−金複合体分散液Ｅ−２を得た。Ｅ−２中の樹脂−金複合体Ｆ−２の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．９８であった。また、Ｆ−２における金粒子の平均粒子径は２５．０ｎｍ、金の担持量は５４．７ｗｔ％であった。Ｆ−２の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図３に示した。

［作製例３］
Ａｌｉｑｕａｔ ３３６［アルドリッチ社製］（３．００ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４９．５０ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、０．５０ｇ）を加え、窒素気流下において６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．２５０ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径３７０ｎｍの樹脂粒子Ａ−３を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ−３を得た。

＜樹脂−金属複合体の合成＞
上記樹脂粒子分散液Ｂ−３（９０ｍｌ）に純水２４５ｍｌを加えた後、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（９０ｍｌ）を加え、３０℃で３時間撹拌後、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、５ｗｔ％白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−３を調製した。
次に、純水３８２５ｍｌに前記Ｃ−３（５５ｍｌ）を加え、３℃で撹拌しながら、１３２ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１１０ｍｌ）を滴下した後、３℃で１時間撹拌した。その後２５℃で３時間撹拌することで、平均粒子径３８２ｎｍの樹脂−白金複合体Ｄ−３を得た。前記Ｄ−３を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製することで、不純物を取り除いた。その後、濃度調整を行い１ｗｔ％の樹脂−白金複合体分散液Ｅ−３を得た。Ｅ−３中の樹脂−白金複合体Ｆ−３の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．７０であった。また、Ｆ−３の白金粒子の平均粒子径は５ｎｍ、白金の担持量は３８．５ｗｔ％であった。

［作製例４］
＜樹脂粒子の合成＞
Ａｌｉｑｕａｔ ３３６［アルドリッチ社製］（１．５０ｇ）及びポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、１０．００ｇ）を３００ｇの純水に溶解した後、２−ビニルピリジン（２−ＶＰ、４９．５０ｇ）及びジビニルベンゼン（ＤＶＢ、０．５０ｇ）を加え、窒素気流下において６０℃で３０分間撹拌した。撹拌後、１８．００ｇの純水に溶解した２，２−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（ＡＩＢＡ、０．５０ｇ）を滴下し、６０℃で３．５時間撹拌することで、平均粒子径４３０ｎｍの樹脂粒子Ａ−４を得た。遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる操作を３回行った後、透析処理により不純物を除去した。その後、濃度調整を行い１０ｗｔ％の樹脂粒子分散液Ｂ−４を得た。

＜樹脂−金属複合体の合成＞
上記樹脂粒子分散液Ｂ−４（９０ｍｌ）に純水２４５ｍｌを加えた後、４００ｍＭ塩化白金酸水溶液（９０ｍｌ）を加え、３０℃で３時間撹拌後、室温で２４時間放置した。その後、遠心分離により樹脂粒子を沈殿させ、上澄みを除去する作業を３回繰り返すことで余分な塩化白金酸を除去した。その後、濃度調整を行い、５ｗｔ％白金イオン吸着樹脂粒子分散液Ｃ−４を調製した。
次に、純水３８２５ｍｌに前記Ｃ−４（５５ｍｌ）を加え、１６０ｒｐｍ、３℃で撹拌しながら、１３２ｍＭのジメチルアミンボラン水溶液（１１０ｍｌ）を滴下した後、３℃で１時間撹拌した。その後２５℃で３時間撹拌することで、平均粒子径４５４ｎｍの樹脂−白金複合体Ｄ−４を得た。前記Ｄ−４を遠心分離により沈殿させ、上澄みを除去した後、純水に再度分散させる作業を３回繰り返した後、透析処理により精製することで、不純物を取り除いた。その後、濃度調整を行い１ｗｔ％の樹脂−白金複合体分散液Ｅ−４を得た。Ｅ−４中の樹脂−白金複合体Ｆ−４の吸光度は上記方法に従って測定した結果、０．７０であった。また、Ｆ−４の白金粒子の平均粒子径は５ｎｍ、白金の担持量は３７．７ｗｔ％であった。

［作製例５］
＜金コロイドの合成＞
５００ｍｌ三つ口丸底フラスコに１ｍＭ 塩化金酸水溶液を２５０ｍｌ入れ、加熱還流装置を用い、激しく攪拌しながら沸騰させ、沸騰後３８．８ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液を２５ｍｌ添加し、溶液が淡黄色から濃紅色に変化することを確認した。攪拌しながら１０分間加熱を続けた後、室温で３０分程度攪拌放冷をおこなった。孔径２μｍのメンブランフィルターを用いて溶液をろ過し、三角フラスコに移し冷暗所で保存した。作製した粒子の平均粒径は１２．３ｎｍであった。また、吸光度は上記方法に従って測定した結果、１．３２であった。

［試薬等］
実施例、比較例では以下の試薬等を使用した。
抗ＨＢｓ抗体（７．１５ｍｇ／ｍＬ／ＰＢＳ）：アドテック株式会社製
ブロック用緩衝液：１重量％カゼインＮａを調整した。
洗浄用緩衝液：５ｍＭトリス溶液をＨＣｌでｐＨ≒８．５に調整した。
保存用緩衝液：洗浄用緩衝液に、スクロースを１０重量％濃度になるように添加した。
Ｂ型肝炎ウイルス陽性コントロール（ＰＣ）：Ｂ型肝炎ウイルス不活化抗原（アドテック株式会社製）を、検体処理液（アドテック株式会社製）を用いて１００倍希釈して調製した。ＰＣの抗原濃度は、５０００ＦＦＵ／ｍｌに相当する。
陰性コントロール：検体処理液（アドテック株式会社製）
ＰｔＮＣＰビーズ（１）：作製例３で得た樹脂−白金複合体Ｆ−３

［実施例１］
（結合工程）
マイクロチューブ［アイビス（登録商標；アズワン社製）２ｍＬ］に、樹脂−金属複合体としてＰｔＮＣＰビーズ（１）の０．０５ｍＬを投入し、抗ＨＢｓ抗体溶液０．９５ｍＬを添加した。転倒混和によって十分に混合した後、室温で１５分間かけて転倒撹拌を行い、樹脂−白金複合体Ｆ−３で標識した抗ＨＢｓ抗体を含む標識抗体含有液ａ−１を得た。

（ブロック工程）
次に、標識抗体含有液ａ−１を氷冷後、１００００ｒｐｍで１分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に、０．０５ｍＬのブロック用緩衝液と０．００２５ｍＬの非イオン界面活性剤を添加し、転倒混和によって十分に混合した後、室温で１０分間かけて転倒撹拌を行い、標識抗体含有液ｂ−１を得た。

（洗浄処理）
次に、標識抗体含有液ｂ−１を氷冷後、１００００ｒｐｍで１分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に洗浄用緩衝液１ｍＬを添加し、１０〜３０秒間かけて超音波分散処理を行った。この操作を３回繰り返し、洗浄処理とした。

（保存処理）
次に、氷冷後、１００００ｒｐｍで１分間かけて遠心分離を行い、上澄みを除去した後、固形分残渣に保存用緩衝液１ｍＬを添加し、１０〜３０秒間かけて超音波分散処理を行うことによって、標識抗体含有液ｃ−１を得た。

（パッド化）
標識抗体含有液ｃ−１を４〜８倍に希釈し、これを３０ｃｍ×１ｃｍのガラスファイバー（メルクミリポア社製）のパッドに含浸させ、２０℃で６０分間乾燥させ、標識抗体含有パッドｄ−１を得た。

（反応ストリップの作製）
ｄ−１及び、抗ＨＢｓポリクローナル抗体を固相化させたニトロセルロース膜（メルクミリポア社製）を、バッキングシートに貼り付けて「反応シート」とし、これを５ｍｍ幅に裁断し、反応ストリップｅ−１とした。

＜抗原―抗体反応の評価＞
評価は、前記反応ストリップｅ−１を用い、１５分後の発色レベルを比較した。発色レベルは金コロイド判定用色見本（アドテック社製）を用いて判定した。性能評価において、抗原はＨＢｓリコンビナント抗原（濃度：１．０ｍｇ/ｍＬ）の２倍希釈列を用いた。

具体的には、９６ウェルプレートの各ウェルに、ＰＣの２倍希釈列（８００倍〜１２８０万倍、それぞれＰＣ×８００〜ＰＣ×１２８０万と表す）及び陰性コントロールを、それぞれ１００μＬを混和した。次に、緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を１００μＬ混合して混合液を調製し、１００μＬの混合液をｅ−１に添加し、１５分後の発色レベルを評価した。その結果を表１及び表２に示した。なお、表１及び表２における発色レベルの数値が大きい程、発色が強いことを意味する。また、±は、弱陽性を意味する。

［比較例１］
ＰｔＮＣＰビーズの代わりに金コロイド（平均粒径６０μｍ）を使用したほかは、実施例と同様の方法で、ａ−２、ｂ−２、ｃ−２、ｄ−２及びｅ−２を得た。評価結果を表１及び表２に示した。

表１及び表２から、金コロイドを標識した標識抗体含有パッドｄ−２は、１０万倍希釈の抗原において発色を示すにとどまったのに対し、ＰｔＮＣＰビーズ（１）を標識した標識抗体含有パッドｄ−１は、１６０万倍希釈の抗原においても発色を示すことが確認された。

＜実検体における抗原―抗体反応の評価＞
健常人並びにＢ型肝炎患者よりサリベット（品番５１．１５３４Ｊ、ザルスタット社製）を用いて、付属のスポンジを口の中に含ませ、唾液を染み込ませた。スポンジを遠心管に入れ、１５００〜３０００×ｇで２分間遠心を行い、唾液を回収した。
採取した唾液１００μＬと緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１００μＬを混合して混合液を調製し、１００μＬの混合液を１００μＬのｄ−１及びｄ−２に添加し、それぞれの１５分後の発色ラインの有無を観察した。評価結果を表３に示した。なお、表３における＋は発色ラインの検出を意味し、−は発色ラインが検出されなかったことを意味する。

なお、上記実検体における抗原―抗体反応の評価では、ｄ−１を用いた評価を合計３０例、ｄ−２を用いた評価を合計５例実施したところ、表３に示す結果と同様の結果であった。

以上、本発明の実施の形態を例示の目的で詳細に説明したが、本発明は上記実施の形態に制約されることはない。

１０…樹脂粒子、２０…金属粒子、３０…内包金属粒子、４０…一部露出金属粒子、５０…表面吸着金属粒子、６０…表層部、１００…樹脂−金属複合体、１１０…メンブレン、１２０…試料添加部、１３０…判定部、１３１…捕捉リガンド、１４０…吸液部、１５０…標識抗体、１６０…アナライト、１７０…複合体、２００…テストストリップ

Claims (9)

1. 試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量する免疫測定方法であって、
   メンブレン、及び該メンブレンに前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップを用い、下記工程(I)〜(III)；
   工程(I)：試料に含まれる前記アナライトと、該アナライトに特異的に結合する抗体を樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体と、を接触させる工程、
   工程(II)：前記判定部にて、工程(I)において形成された、前記アナライトと標識抗体とを含む複合体を、捕捉リガンドに接触させる工程、
   工程(III)：前記樹脂−金属複合体の局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収に由来する発色強度を測定する工程、
   を含む工程を行うことを特徴とする免疫測定方法。
2. 前記金属粒子が、金粒子又は白金粒子である、請求項１に記載の免疫測定方法。
3. 前記樹脂−金属複合体における前記金属粒子は、
   前記樹脂粒子外に露出した部位を有する第１の粒子と、
   全体が前記樹脂粒子に内包されている第２の粒子と、
   を含んでおり、
   前記第１の粒子及び前記第２の粒子のうち、少なくとも一部の粒子が、前記樹脂粒子の表層部において三次元的に分布しているものである、請求項１又は２に記載の免疫測定方法。
4. 前記樹脂粒子が、金属イオンを吸着することが可能な置換基を構造に有するポリマー粒子である、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫測定方法。
5. 前記金属粒子の平均粒子径が１〜１００ｎｍの範囲内である、請求項１から４のいずれか１項に記載の免疫測定方法。
6. 前記樹脂−金属複合体の平均粒子径が３０〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項１から５のいずれか１項に記載の免疫測定方法。
7. 前記抗体が、抗ＨＢｓ抗体である、請求項１から６のいずれか１項に記載の免疫測定方法。
8. ラテラルフロー型クロマトテストストリップを用いて、試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量するための免疫測定用キットであって、
   メンブレン、及び該メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップと、
   前記アナライトに特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体を含む検出試薬と、
   を含む前記アナライトを検出又は定量するための免疫測定用キット。
9. 試料中に含まれるＢ型肝炎ウイルス由来のアナライトを検出又は定量するためのラテラルフロー型クロマトテストストリップであって、
   メンブレンと、
   前記メンブレンに、前記アナライトと特異的に結合する捕捉リガンドが固定されてなる判定部と、
   前記試料が展開する方向において、前記判定部よりも上流側に、前記アナライトに特異的に結合する抗体を、樹脂粒子に複数の金属粒子が固定化された構造を有する樹脂−金属複合体で標識した標識抗体が含まれる反応部と、
   を含むラテラルフロー型クロマトテストストリップ。