JP2018154572A - ペプチドワクチン及び当該ペプチドに対する特異抗体を有効成分とする医薬 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療への、プロレニンプロセグメントの部分アミノ酸配列からなるペプチドの新たな利用を提供することを目的とするものである。【解決手段】本発明は、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチン、及び同ペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はその誘導体を有効成分とする医薬に関する。本発明によれば、プロレニンに特異的な免疫応答を誘導することができ、糖尿病及び／又は糖尿病合併症に対するワクチンとして利用することができる。また、本発明のワクチンは薬物としての効果を長時間発揮させることができ、薬物投与回数に関する患者負担を低減することが可能となる。また、本発明の特異抗体を含む医薬は、糖尿病及び／又は糖尿病合併症に対する医薬として利用することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、プロレニンの部分アミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチン、及び当該ペプチドに対する特異抗体を有効成分とする医薬に関する。

生活習慣病の一つである糖尿病、特にＩＩ型糖尿病は、肥満、過食、運動不足、ストレス、飲酒、高齢化等を原因とする疾患であり、肝臓や腎臓等の器官、組織に損傷を与え、様々な合併症を引き起こす。

糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の患者数は、世界全体で爆発的に急増しており、２０３０年までには世界全体で５億人に、また合併症の一つである糖尿病網膜症に罹患する患者数は１億５千万人に達すると、それぞれ推算されている。糖尿病性腎症及び糖尿病網膜症等の合併症は働き盛り世代に生じることから、それら合併症の患者数の増加は、結果として社会全体における労働力の減少と医療費の増大とを助長する。したがって、糖尿病及び糖尿病合併症を予防又は治療することができれば、患者自身のＱＯＬの改善に留まらず、糖尿病によってもたらされる社会的な損失を減少することができると期待される。

糖尿病及び糖尿病合併症に対する予防又は治療方法の開発のために、それらの発症メカニズムに関する研究が進められている。例えば、糖尿病合併症の発症にレニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の過剰な活性化が関与していることが明らかにされたことで、最終産物のアンジオテンシンＩＩを標的としたＲＡＳ阻害薬の創薬が試みられてきた。

近年になって、糖尿病においてＲＡＳがアンジオテンシンＩＩ非依存性に一部活性化していることが報告された。この知見から、アンジオテンシンＩＩのみならずアンジオテンシンＩＩ非依存性のＲＡＳ活性化を抑制することにより、効果的に糖尿病網膜症の発症を抑制できるとの期待が高まっている。

レニンは、４０６アミノ酸からなるプレプロレニンがＮ末端２３番目のアミノ酸残基のＣ末端側が酵素的に切断されてプロレニンとなり、さらにプロレニンのＮ末端４３番目のアミノ酸残基のＣ末端側が酵素的に切断されることで、３４０個のアミノ酸からなる活性型タンパク質として産生される。

プロレニンはアンジオテンシンＩＩ受容体には結合しない不活性物質であると考えられてきたが、近年、プロレニンと結合するプロレニン受容体が見出されたこと、糖尿病網膜症の重症度と血中プロレニン濃度との間に正の相関があること（非特許文献１）、血中プロレニン濃度が高いと糖尿病網膜症をより早期に発症すること（非特許文献２）等が報告されるに至り、糖尿病におけるプロレニンとプロレニン受容体の役割が注目されている。

プロレニンは、Ｎ末端１番目から４３番目までのアミノ酸残基で構成される領域（プロレニンプロセグメント）を介してプロレニン受容体と結合することが確認されている。プロレニンプロセグメントの詳細な研究から、プロレニンのＮ末端１１番目から１５番目のアミノ酸領域（Ｈａｎｄｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）がプロレニン受容体との結合に関与することが明らかにされた（非特許文献３）。これに基づいて、Ｈａｎｄｌｅ ｒｅｇｉｏｎを含むペプチドをデコイペプチドとして利用することでアンジオテンシンＩＩ非依存性のＲＡＳ活性化を阻害する試みが提唱されている。特許文献１では、プロレニンのＮ末端１０番目から１９番目のアミノ酸配列からなるペプチドをストレプトゾトシンで糖尿病を誘発したアンジオテンシンＩＩ受容体ノックアウトマウスに皮下投与することで、アンジオテンシンＩＩ非依存性の糖尿病性腎症の発症又は進展が抑制されることが報告されている。

プロレニンによるアンジオテンシンＩＩ非依存性のＲＡＳ活性化に着目した上記の試みは、いずれもプロレニンプロセグメントの部分アミノ酸配列からなるペプチド自体を、アンタゴニスト的に使用するものである。

国際公開第ＷＯ２００４／０７３７４０号パンフレット

Ｙｏｋｏｔａ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，２００５；８９；８７１−８７３ Ｙｏｋｏｔａ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｎｉｎ Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｓｙｓｔ．，２０１１；１２（３）；２９０−２９４ Ｓｕｚｕｋｉ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３；２７８（２５）：２２２１７−２２

本発明は、糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療への、プロレニンプロセグメントの部分アミノ酸配列からなるペプチドの新たな利用を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、プロレニンプロセグメントの特定の部分アミノ酸配列からなるペプチドを抗原として生体に投与すると、プロレニン特異的免疫応答が誘導されるとともに、糖尿病及び糖尿病合併症が改善されることを見出し、下記の各発明を完成させた。

（１）下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチン。
ａ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列；
ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜３０個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）上記ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された、欠失した又は挿入されたアミノ酸配列。
（２）前記ａ）のアミノ酸配列が配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列である、（１）に記載のワクチン。
（３）糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療のための、（１）又は（２）に記載のワクチン。
（４）糖尿病性微小血管障害の予防及び／又は治療のための、（１）又は（２）に記載のワクチン。
（５）糖尿病性神経障害、糖尿病網膜症及び／又は糖尿病性腎症の予防及び／又は治療のための、（１）又は（２）に記載のワクチン。
（６）下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はその誘導体を有効成分とする医薬。
ａ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列；
ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜３０個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）上記ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された、欠失した又は挿入されたアミノ酸配列。
（７）前記ａ）のアミノ酸配列が配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列である、（６）に記載の医薬。
（８）糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療のための、（６）又は（７）に記載の医薬。
（９）糖尿病性微小血管障害の予防及び／又は治療のための、（６）又は（７）に記載の医薬。
（１０）糖尿病性神経障害、糖尿病網膜症及び／又は糖尿病性腎症の予防及び／又は治療のための、（６）又は（７）に記載の医薬。

本発明のワクチンは、これを投与された生体においてプロレニンに特異的な免疫応答を誘導することができ、したがって従来のレニン−アンジオテンシン系に影響を与えることなく、糖尿病及び／又は糖尿病合併症に対するワクチンとして利用することができる。また、代謝の早いペプチド自体を薬物として投与する場合と比較して、本発明のワクチンは薬物としての効果を長時間発揮させることができ、薬物投与回数に関する患者負担を低減することが可能となると期待される。また、本発明の特異抗体を含む医薬は、糖尿病及び／又は糖尿病合併症に対する医薬として利用することができる。

担体又は本発明のワクチンを投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける抗体価の推移を示すグラフである。 担体又は本発明のワクチンを投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来抗血清の、組換え型マウスプロレニンに対する反応性を示すグラフである。 担体又は本発明のワクチンを投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来抗血清の、組換え型マウスプロレニン（図中、左の写真。左のメンブレンは担体を投与したマウス由来抗血清、中央のメンブレンは本発明のワクチンを投与したマウス由来抗血清、右のメンブレンは抗プロレニン／レニン抗体を使用）及びレニン（図中、右の写真。左のメンブレンは抗プロレニン／レニン抗体、右のメンブレンは本発明のワクチンを投与したマウス由来抗血清を使用）に対する反応特異性をウェスタンブロッティングで検出した結果を示す写真である。 担体、マウスプロレニンのＮ末端６番目から２０番目のアミノ酸配列からなるペプチドとＫＬＨとのコンジュゲート（Ｅ１）、マウスプロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチドとＫＬＨとのコンジュゲート（本発明のワクチン、Ｅ２）及びマウスプロレニンのＮ末端１７番目から２６番目のアミノ酸配列からなるペプチドとＫＬＨとのコンジュゲート（Ｅ３）を投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける抗体価の推移を示すグラフである。 本発明のワクチンを投与した糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）における抗体価の推移を示すグラフである。 担体を投与した正常マウス（ｄｂ／ｍマウス）、担体を投与したｄｂ／ｄｂマウス及び本発明のワクチンを投与したｄｂ／ｄｂマウスのそれぞれの血糖値の推移を示すグラフである。 担体を投与したｄｂ／ｍマウス、担体を投与したｄｂ／ｄｂマウス及び本発明のワクチンを投与したｄｂ／ｄｂマウスについて、ワクチン投与後１６週目と２０週目に網膜電図検査を行ったときのａ波（上段パネル）及びｂ波（下段パネル）の潜時を測定した結果を表すグラフである。

本発明の第１の態様は、下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチンに関する。
ａ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列；
ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜３０個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）上記ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された、欠失した又は挿入されたアミノ酸配列。

本発明の第１の態様は、プロレニンプロセグメントの部分アミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチンを包含する。当該部分アミノ酸配列は、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列に相当する。アミノ酸を１文字表記で示した場合、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列の好ましい例は、ヒトのプロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列であるＴＦＫＲＩＦＬＫＲＭ（配列番号１）、又はマウスプロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列であるＴＦＥＲＩＰＬＫＫＭ（配列番号２）である。

また、本発明の第１の態様には、ｂ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜３０個付加されたアミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチンも包含される。ここで、付加されるアミノ酸は１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個が特に好ましい。

抗原提示細胞は、細胞内に取り込んだ免疫原性タンパク質をプロセッシングによってフラグメント化し、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子等の抗原提示分子を介して、前記フラグメントを抗原として提示することが知られている。

プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートは、抗原提示細胞内に取り込まれた後、プロセッシングを受けたその断片がＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子等の抗原提示分子を介して抗原提示されることで、所望の免疫応答が誘導されると推察される。そのため、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸残基を有するペプチドと担体とのコンジュゲートも、抗原提示細胞のかかるプロセッシングによってフラグメント化されることで、最終的にはプロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチド又はプロセッシングを受けたその断片が抗原提示されることとなる。このように、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸残基を有するペプチドは、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチドと同様の免疫応答誘導能を示すことから、本発明に係るコンジュゲートを構成するペプチドとして利用することが可能である。

本発明の第１の態様には、ｃ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された、欠失した又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチンも包含される。その好ましい例は抗原性に対するサイレント置換、欠失及び付加、特に保存性アミノ酸間の置換であり、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列に含まれるエピトープの抗原性を変化させないものである。

以下、プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチドをプロレニン部分ペプチド７−１６と、またプロレニン部分ペプチド７−１６、前記ｂ）のペプチド及び前記ｃ）のペプチドを纏めて表すときはプロレニン部分ペプチドと表記する。

プロレニン部分ペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法、例えばペプチドの合成法に関する文献「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗら著、１９８４年、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ発行）、「Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎら編、２０００年、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ発行）、又は「第５版 実験化学講座 第１６巻 有機化合物の合成ＩＶ」（日本化学会編、丸善株式会社発行）を参照して、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の有機化学的合成方法によって作製することができる。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。前記各文献の記載は、参照により本明細書に取り込まれる。

プロレニン部分ペプチドは、これをコードする核酸に種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、組み換えタンパク質として製造することも可能である。マウス及びヒトのプレプロプロレニン又はプロレニンのアミノ酸配列及びそれらをコードする核酸の塩基配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。それら塩基配列情報を基にして、プロレニン部分ペプチドをコードする核酸を化学合成したり、又は適当な遺伝子ソースからクローニングしたりすることは、当業者の通常の作業能力の範囲内で行うことができる。

プロレニン部分ペプチドは、そのＮ末端及び／又はＣ末端にＦｌａｇタグ、ポリヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ等のタグペプチドが付加された形態で製造されてもよく、また蛍光タンパク質、グルタチオントランスフェラーゼその他のタンパク質との融合タンパク質の形態で製造されてもよい。これらタグペプチド及び他のタンパク質は、担体とのコンジュゲートの作製の際に取り除かれることが好ましい。また、プロレニン部分ペプチドは、蛍光物質、発光物質、ビオチンその他の適当な標識剤で標識されていてもよい。

本発明の第１の態様であるワクチンは、前記プロレニン部分ペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とする。本発明における担体とは、免疫原性が低いか又は単独では免疫原性がない物質（ハプテン）と結合することで、該物質に免疫原性を付与する又は該物質に対する抗体を誘導することのできる物質を意味する。

担体の代表例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）その他の高分子量タンパク質を挙げることができる。特に好ましい高分子タンパク質はＫＬＨである。また、担体は金ナノ粒子（特開２００６−３３５７２２）等の金属粒子、多糖類等でもよい。好ましい担体は高分子量タンパク質であり、ＫＬＨが特に好ましい。

プロレニン部分ペプチドと担体とのコンジュゲート（以下、本発明に係るコンジュゲートと表す）は使用する担体毎に知られている方法によって作製することができ、特別な方法は特に必要とされない。本発明に係るコンジュゲートは、典型的には、プロレニン部分ペプチドと担体とを、例えばＭＢＳ法（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）又はＥＤＣ法（１−ｅｔｈｙ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等により化学的に結合させることにより作製することができる。

本発明の第１の態様であるワクチンは、本発明に係るコンジュゲートの他にアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントとしては、本発明に係るコンジュゲートと一緒に又は別に投与して、その抗原に対する免疫応答を非特異的に高める物質であれば、限定されない。アジュバントの例としては、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、又はカルボキシビニルポリマー等の沈降性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン、フロイント、モンタナイド、不完全フロイントアジュバント又は完全フロイントアジュバント等の油性アジュバントを挙げることができる。アジュバントは２種以上を混合して用いてもよい。

アジュバントの配合量は、抗原に対する免疫応答を誘導し得る量であれば特に限定されず、アジュバントの種類等により適宜選択すればよい。

本発明の第２の態様は、前述のプロレニンプロセグメントの部分アミノ酸配列からなるペプチド、すなわち下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はその誘導体を有効成分とする医薬に関する。
ａ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列；
ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜３０個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）上記ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された、欠失した又は挿入されたアミノ酸配列。

本発明の第２の態様に係る抗体は、上記プロレニンプロセグメントの部分アミノ酸配列からなるペプチド、好ましくは前出の本発明の第１の態様に係る当該ペプチドと担体とのコンジュゲートを抗原として誘導される、当該ペプチドに対して特異的に結合する抗体である。後述の実施例において示されるように、本発明の第一の態様のワクチンを投与された生体においては血中抗体価の上昇すなわち特異抗体量の増加が認められており、この特異抗体量の増加が糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療に奏功するものと推定される。したがって、本発明の第２の態様に係る抗体を生体に投与して生体内の特異抗体量を増加させることもまた、糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療に奏功するものと期待される。

本発明の第２の態様の抗体の作製、すなわち適当な動物に対する抗原投与と抗体の誘導及び抗体の精製、又は当該ポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製は、いずれも当業者に公知の各種手法を用いて行うことができる。さらには、前記特異抗体についての一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチド、ヒト化抗体その他の抗体誘導体の作製も、当業者に公知の各種手法を用いて行うことができ、これらは本発明の第２の態様に包含される。

本発明のワクチン又は医薬は、製剤化のために一般的に利用される種々の物質、特にタンパク質を有効成分とする医薬の製造に好適に利用される賦形剤、安定化剤その他の医薬的に許容可能な成分、又は他の医薬活性成分等を含む医薬組成物であり得る。

本発明のワクチン又は医薬は、糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療のために好適に用いることができる。糖尿病合併症としては、大血管障害、糖尿病性微小血管障害、白内障、高脂血症等を挙げることができる。また糖尿病性微小血管障害には、糖尿病性神経障害、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症が含まれる。

本発明のワクチン又は医薬は、糖尿病合併症、特に糖尿病性微小血管障害の予防及び／又は治療に用いることができる。特に、糖尿病性神経障害、糖尿病網膜症及び糖尿病性腎症の予防及び／又は治療に有効である。

本発明のワクチン又は医薬は、投与された対象にプロレニン特異的免疫応答の誘導をもたらすことから、糖尿病及び／又は糖尿病合併症に加えて、高血圧症の予防及び／又は治療のために、さらには動脈硬化症、脳血管障害又は心血管疾患等の大血管障害の予防及び／又は治療のために用いることもできる。

本発明のワクチン又は医薬は、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、眼球注射を含む眼内投与、鼻腔内投与等により投与することができる。好ましくは非経口投与により、より好ましくは皮下投与、皮内投与又は眼内投与により投与する。

本発明のワクチン又は医薬は、投与経路に応じて、種々の製剤形態、例えば、固形製剤、液状製剤等をとり得る。例えば、内服用固形剤若しくは内服用液剤等の経口製剤、又は注射剤若しくは点滴剤等の非経口製剤とすることができる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖又はＤ−ソルビトール等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。

本発明のワクチン又は医薬の投与量は、対象の年齢、体重、適応される疾患、症状等によっても異なるが、例えば、プロレニン部分ペプチドの投与量として１日に体重あたり当り約０．１μｇから１ｍｇ／ｋｇが好ましく、当該量を数日から数カ月に１回投与するのが好ましい。

本発明のワクチン又は医薬は、糖尿病、糖尿病合併症、高血圧症又は大血管障害に罹患している又は罹患のおそれがある対象に対して使用される。対象は、ヒト及びヒト以外の様々な動物、例えばイヌやネコ等の愛玩動物、ウシやブタ等の家畜動物、マウスやラット等の実験動物などであり、好ましくはヒトである。

本発明は、その必要がある対象に有効量の第一の態様のワクチン又は第二の態様の医薬を投与することを含む、糖尿病及び／又は糖尿病合併症を予防及び／又は治療する方法も包含する。ここで有効量は、糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療に有効な量を意味し、用法、患者の年齢、疾患の状態その他の条件等に応じて適宜決定される。

以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ コンジュゲートの作製及び抗体産生の確認
１）マウスプロレニン部分ペプチドの合成
マウスのプロレニンの抗原性ペプチドとしてＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列（配列番号２）を選択した。文献「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ（１９８４）、Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）」及び「第５版 実験化学講座１６ 有機化合物の合成ＩＶ」等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。

得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水等の混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用いて、０．１％ＴＦＡ−Ｈ_２０／ＣＨ_３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的のペプチド（マウスプロレニン部分ペプチド７−１６）を得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーで確認した。

２）コンジュゲート（ＰｒｏＶ）の作製
上記１）で得たマウスプロレニン部分ペプチド７−１６のＮ末端にシステインを付加し、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を介してＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシガイヘモシアニン、株式会社ペプチド研究所）と連結して、ＫＬＨと前記ペプチドとのコンジュゲートであるＰｒｏＶを調製した。また、マウスプロレニン部分ペプチド７−１６とＢＳＡとのコンジュゲートも同様にして調製した。

３）野生型マウスにおける抗体産生の確認
２０μｇのＫＬＨと、加熱殺菌乾燥済みＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｈ３７Ｒａ，ＡＴＣＣ ２５１７７）１ｍｇ、パラフィン油０．８５ｍＬ、及びマンナイドモノオレエート０．１５ｍＬを含有する完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｆ５５８１）との混合物を、又は５μｇ若しくは２０μｇのｐｒｏＶと前記完全フロイントアジュバントとの混合物である本発明のワクチンを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（三協ラボサービス株式会社）にそれぞれ皮下投与した。投与から１４日後に、完全フロイントアジュバントを不完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ，Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｌｉｑｕｉｄ，Ｓｉｇｍａ，Ｆ５５０６）に代えた各混合物を追加で皮下投与して、初回投与から７０日後まで１４日毎に採血しながら飼育した。

本発明のワクチンを投与したマウスの血清におけるプロレニン部分ペプチド７−１６とＢＳＡとのコンジュゲートに対する抗体価を、４５０ｎｍの吸光度の半値（Ｈａｌｆ ｍａｘｉｍｕｍ）として測定した。その結果を図１に示す。図１においてワクチン投与時は０日と表示される。ワクチン投与後２８日目から７０日目にかけて安定して抗体価が保持されていることが確認された。

ＫＬＨ混合物又はワクチンを投与後７０日目の各マウスの血液から抗血清を調製し（Ｍｅｌｏｎ Ｇｅｌ ＩｇＧ Ｓｐｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ））、ＥＬＩＳＡ法によって組換え型マウスプロレニン（Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｒｅｎｉｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＡＮＡ ＳＰＥＣ，ＡＳ−７２１７４）に対する反応性を確認した。市販されている抗プロレニン／レニン抗体（ａｎｔｉ−Ｒａｔ，ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｒｅｎｉｎ／ｒｅｎｉｎ ＩｇＧ ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＹ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，ＭＢＳ１３５２０８）を陽性対照として用いた。その結果、本発明のワクチンを投与したマウス由来の抗血清に組換え型マウスプロレニンに反応する抗体が存在することが確認された（図２）。

また、組換え型マウスプロレニン、組換え型ラットレニン（Ｒａｔ Ｒｅｎｉｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＡＮＡ ＳＰＥＣ，ＡＳ−７２１４１）又はマウスプロレニン部分ペプチド７−１６のＢＳＡコンジュゲート（ＢＳＡ−Ｅｐｉｔｏｐｅ）に対する、上記抗血清、対照の市販抗プロレニン／レニン抗体（ａｎｔｉ−Ｒａｔ，ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｒｅｎｉｎ／ｒｅｎｉｎ ＩｇＧ ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＹ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，ＭＢＳ１３５２０８）の結合特異性を、ウェスタンブロッティング法によって確認した。抗血清は組換え型マウスレニンには結合せず、組換え型マウスプロレニン及びＢＳＡ−Ｅｐｉｔｏｐｅに特異的に結合することが確認された（図３）。

実施例２ 抗原の至適化
マウスプロレニンのＮ末端６番目から２０番目のアミノ酸配列（配列番号３）からなるペプチドとＫＬＨとのコンジュゲート（Ｅ１）及びマウスプロレニンのＮ末端１７番目から２６番目のアミノ酸配列（配列番号４）からなるペプチドとＫＬＨとのコンジュゲート（Ｅ３）を、実施例１の１）及び２）と同様にして調製した。また、上記各ペプチドとＢＳＡとのコンジュゲートも同様にして調製した。

実施例１の３）と同様に、本発明に係るコンジュゲートであるＰｒｏＶ（実施例２に限り、Ｅ２と表す）、Ｅ１及びＥ３をそれぞれアジュバントと共にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに投与し、血清における各ペプチドとＢＳＡとのコンジュゲートに対する抗体価を、４５０ｎｍの吸光度の半値（Ｈａｌｆ ｍａｘｉｍｕｍ）として測定した（図４）。

Ｅ１又はＥ２を投与したマウスにおいて抗体産生が確認され、またＥ２が最も高い抗体価を持続することが確認された。一方、Ｅ３の投与では抗体価は検出限界以下であった。

実施例３ 網膜神経障害の予防
１）ワクチン投与
糖尿病モデルマウスであるｄｂ／ｄｂマウス及び正常マウスであるｄｂ／ｍマウス（いずれも８週齢の雄）は、日本チャールス・リバー株式会社から購入した。２０μｇのＫＬＨと前出の完全フロイントアジュバントとの混合物をｄｂ／ｍマウス及びｄｂ／ｄｂマウスに、２０μｇのｐｒｏＶと前出の完全フロイントアジュバントとの混合物である本発明のワクチンをｄｂ／ｄｂマウスに、それぞれ皮下投与した。投与から２週間後に、完全フロイントアジュバントを不完全フロイントアジュバントに代えた前記混合物及びワクチンをそれぞれ追加で皮下投与して、初回投与から２４週齢まで、２週間毎に採血しながら飼育した。

２）糖尿病モデルマウスにおける抗体産生の確認
本発明のワクチンを投与したマウス（ｄｂ／ｄｂ＋ｐｒｏＶ）におけるプロレニン部分ペプチド７−１６とＢＳＡとのコンジュゲートに対する抗体価を、４５０ｎｍの吸光度の半値（Ｈａｌｆ ｍａｘｉｍｕｍ）として測定した。その結果を図５に示す。図５においてワクチン投与日は０週と表示される。ワクチン投与後４週目から１６週目にかけて、安定して抗体価が保持されていることが確認された。
３）血糖値の測定
図６に、ＫＬＨと完全フロイントアジュバントとの混合物を投与したｄｂ／ｍマウス（ｄｂ／ｍ＋ＫＬＨ）、ＫＬＨと完全フロイントアジュバントとの混合物を投与したｄｂ／ｄｂマウス（ｄｂ／ｄｂ＋ＫＬＨ）及びｄｂ／ｄｂ＋ｐｒｏＶの血糖値を、ワンタッチウルトラビュー（ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社）を用いて測定した結果を示す。本発明のワクチンを投与することによって、糖尿病モデルマウスにおける血糖値の上昇を有意に抑制することができることが確認された。

４）網膜電図
ワクチン投与後１６週目と２０週目に、誘発反応測定装置ＰｕＲＥＣ及びＬＥＤ発光装置ＬＳ（有限会社メイヨー）を用いて、ｄｂ／ｍ＋ＫＬＨ、ｄｂ／ｄｂ＋ＫＬＨ及びｄｂ／ｄｂ＋ｐｒｏＶに対して網膜電図検査を行い、ａ波とｂ波の潜時を測定した。ａ波については、いずれのマウスでも潜時の延長は観察されなかった（図７上段）。一方、ｂ波については、ｄｂ／ｄｂ＋ＫＬＭでは潜時の延長が明確に観察されたが、ｄｂ／ｄｂ＋ｐｒｏＶの潜時の延長はｄｂ／ｍ＋ＫＬＨのそれとほぼ同程度であった（図７下段）。以上から、本発明のワクチンの投与によって、糖尿病モデルマウスにおける網膜神経障害の進行が有意に抑制されることが確認された。

Claims (10)

1. 下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるペプチドと担体とのコンジュゲートを有効成分とするワクチン。
   ａ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列；
   ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜３０個付加されたアミノ酸配列；
   ｃ）上記ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された、欠失した又は挿入されたアミノ酸配列。
2. 前記ａ）のアミノ酸配列が配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のワクチン。
3. 糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療のための、請求項１又は２に記載のワクチン。
4. 糖尿病性微小血管障害の予防及び／又は治療のための、請求項１又は２に記載のワクチン。
5. 糖尿病性神経障害、糖尿病網膜症及び／又は糖尿病性腎症の予防及び／又は治療のための、請求項１又は２に記載のワクチン。
6. 下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体及び／又はその誘導体を有効成分とする医薬。
   ａ）プロレニンのＮ末端７番目から１６番目のアミノ酸配列；
   ｂ）上記ａ）のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜３０個付加されたアミノ酸配列；
   ｃ）上記ａ）のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換された、欠失した又は挿入されたアミノ酸配列。
7. 前記ａ）のアミノ酸配列が配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列である、請求項６に記載の医薬。
8. 糖尿病及び／又は糖尿病合併症の予防及び／又は治療のための、請求項６又は７に記載の医薬。
9. 糖尿病性微小血管障害の予防及び／又は治療のための、請求項６又は７に記載の医薬。
10. 糖尿病性神経障害、糖尿病網膜症又は糖尿病性腎症の予防及び／又は治療のための、請求項６又は７に記載の医薬。

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