JP2018146539A - 多波長蛍光分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】試料液中の測定対象成分を、濁度等の妨害成分の影響を排して精度良く求めることが可能で、しかも、別途の濁度計や光源を必要としない多波長蛍光分析装置を提供する。
【解決手段】回折格子３３を有する照射光学系で照射光Ｅを試料液液面に導き、試料液液面から発せられる応答光Ｆを回折格子７３と励起光と同じ波長の散乱光を除去するカットフィルター８５を有する検出光学系で検出器８２に導く。照射光学系により励起光を試料液の液面に導き、検出光学系により蛍光を検出器８２に導き、蛍光強度Ｉｆを得る。また、照射光学系により、補正照射光を試料液の液面に導き、検出光学系により、補正応答光を検出器８２に導き、補正応答光の強度Ｉｍを得る。そして、蛍光強度Ｉｆに基づき、前記試料液中の測定対象成分の濃度を演算する。該演算にあたり、補正応答光の強度Ｉｍを用いた補正を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料液の発する蛍光によって、試料液中の測定対象成分についての情報を得る蛍光分析装置に関する。さらに詳しくは、試料液の蛍光を濁度等の妨害成分の影響を排して、精度良く求めることが可能な多波長蛍光分析装置に関する。

試料液中の測定対象成分、測定対象成分との反応生成物、或いは測定対象成分と反応する試薬等から発せられる蛍光（強度、消光時間を含む。）を測定することにより、測定対象成分の存否や濃度を測定する蛍光分析が広く利用されている。
蛍光分析にあたっては、試料液中に濁質が存在すると、測定誤差を与えることから、種々の方法で濁度補正が行われている。

例えば、特許文献１では、藻類濃度を蛍光法で求める際に、濁質によって散乱された励起光が蛍光強度に上乗せして測定されることによる誤差を解消するため、濁度計で測定した濁度データに基づき、蛍光強度を補正することが提案されている。
また、特許文献２では、クロロフィルａ濃度を蛍光法で求める際に、発生した蛍光が濁質により反射、散乱され減光することによる誤差を解消するため、蛍光と同じ波長の光を透過させたときの透過光強度に基づき、蛍光強度を補正することが提案されている。

特開２００１−８３０９４号公報 特開２００１−３３３８８号公報

しかし、特許文献１の方法では、蛍光が濁質により反射、散乱され減光することの影響は考慮されていない。また、蛍光分析装置の他に、別途濁度計または濁度測定用セルを用意しなければならない。
特許文献２の方法では、濁質によって散乱された励起光が蛍光強度に上乗せして測定されることの影響は考慮されていない。また、蛍光測定用の光源と透過光強度測定用の光源を各々用意しなければならない。
また、特許文献１、２の何れの方法においても、濁質以外の妨害成分の影響は全く考慮されていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、試料液中の測定対象成分を、濁度等の妨害成分の影響を排して精度良く求めることが可能で、しかも、別途の濁度計や光源を必要としない多波長蛍光分析装置を提供することを課題とする。

上記の課題を達成するために、本発明は、以下の構成を採用した。
［１］ 試料液に励起光を照射した際に得られる蛍光強度Ｉｆに基づき、前記試料液中の測定対象成分の濃度を求める多波長蛍光分析装置であって、
光源と、
前記光源から発せられた光源光を鉛直方向に対して４５±１５゜の角度で前記試料液の液面に導く照射光学系と、
検出器と、
前記試料液から発せられる応答光を、前記試料液の液面の鉛直方向上方で受光し、前記検出器に導く検出光学系と、
装置全体を制御すると共に、前記検出器が得た前記応答光の強度が入力されて所定の演算を行う演算制御装置を備え、
前記照射光学系は、回折格子を有し、前記光源光の内、少なくとも前記測定対象成分による蛍光を得るための励起光と、妨害成分の濃度を測定するための１種以上の補正照射光を含む、波長が異なる複数の光を選択的に前記試料液の液面に導くように構成され、
前記検出光学系は、回折格子と前記励起光と同じ波長の散乱光を除去するカットフィルターを有し、前記応答光の内、少なくとも前記測定対象成分による蛍光と妨害成分の濃度を測定するための１種以上の補正応答光を含む波長が異なる複数の光を選択的に前記検出器に導くように構成され、
下記ステップ１〜３を行うことを特徴とする多波長蛍光分析装置。
ステップ１：前記照射光学系により、前記光源光の内、前記測定対象成分による蛍光を得るための励起光を前記試料液の液面に導き、前記検出光学系により、前記応答光の内、前記測定対象成分による蛍光を前記検出器に導き、蛍光強度Ｉｆを得る。
ステップ２：前記照射光学系により、前記光源光の内、前記補正照射光を前記試料液の液面に導き、前記検出光学系により、前記応答光の内、前記補正応答光を前記検出器に導き、補正応答光の強度Ｉｍを得る。
ステップ３：前記蛍光強度Ｉｆに基づき、前記試料液中の測定対象成分の濃度を演算する。該演算にあたり、前記補正応答光の強度Ｉｍにより求めた妨害成分の濃度に応じた補正を行う。
［２］ 前記１種以上の補正照射光は、妨害成分として濁度を測定するための濁度補正照射光を含み、
前記１種以上の補正応答光は、妨害成分として濁度を測定するための濁度補正応答光を含む［１］に記載の多波長蛍光分析装置。
［３］ 前記検出器の感度が可変であり、前記演算制御装置は、前記検出器の感度を前記応答光の強度に応じて制御可能である［１］または［２］に記載の多波長蛍光分析装置。
［４］ 前記ステップ３における演算が、下記式（１）に基づき行われる［１］〜［３］の何れか一項に記載の多波長蛍光分析装置。
Ｃ=ａ×Ｉｆ−ｋ×ｇ（Ｉｍ）＋ｂ１ ・・・（１）
但し、式（１）におけるＣは測定対象成分の濃度、ｇ（Ｉｍ）は補正応答光の強度Ｉｍから求めた妨害成分の濃度、ａ、ｂ１、ｋは係数である。
［５］ さらに、上端が開口部とされ、前記開口部に試料液のオーバーフロー面が形成されるように下方から流入した試料液がオーバーフローするオーバーフロー筒を備え、前記試料液の液面が前記試料液のオーバーフロー面である［１］〜［４］の何れか一項に記載の多波長蛍光分析装置。

本発明の多波長蛍光分析装置によれば、試料液中の測定対象成分を、別途の濁度計や光源、測定セル等を用いることなく、一つの測定系で、濁度等の妨害成分の影響を排して、精度良く求めることができる。

本発明の実施形態に係る多波長蛍光分析装置の概略構成図である。

本発明の１実施形態に係る多波長蛍光分析装置について説明する。図１に示すように、本実施形態の多波長蛍光分析装置１は、遮光性の仕切り板２と仕切り板２の上方に設置される遮光性の検出部ケース３と、仕切り板２の下方に設置される遮光性の試料ケース４と、試料ケース４の斜め下方から挿入された遮光性のオーバーフロー筒６とを備えている。

試料ケース４の下端には、試料液出口４ａが設けられている。オーバーフロー筒６は下端が試料液入口６ａとされ、上端が略水平の上側開口部６ｂとされている。
試料液Ｓは、オーバーフロー筒６の試料液入口６ａからオーバーフロー筒６の内側に流入し、オーバーフロー筒６の上端側の略水平の上側開口部６ｂからオーバーフローし、オーバーフロー面７を形成するようになっている。そして、オーバーフローした試料液Ｓは、試料液出口４ａに導かれて排出されるようになっている。
多波長蛍光分析装置１は、連続測定中、試料液Ｓの流入流出が、原則として常に継続し、常時新しい試料液Ｓによるオーバーフロー面７が形成されるようになっている。

仕切り板２と検出部ケース３とで囲まれた検出部には、光源ユニット１０、光路ユニット２０、光源側分光ユニット３０、照射光ユニット４０、受光ユニット６０、検出側分光ユニット７０、検出器ユニット８０が配置されている。
また、多波長蛍光分析装置１は演算制御装置９０を備え、演算制御装置９０により、装置全体の動作が制御される。また、検出器ユニット８０で検出された信号等が演算制御装置９０に入力され、入力された値等に基づき、必要な演算を行うようになっている。
また、図示を省略する表示器を備え、演算制御装置９０で演算された測定対象成分濃度、妨害成分濃度、検出器が得た応答光強度などを適宜表示できるようになっている。

本実施形態において、光源ユニット１０が本発明における光源であり、検出器ユニット８０における検出器８２が本発明における検出器である。また、光路ユニット２０、光源側分光ユニット３０、および照射光ユニット４０が、本発明における照射光学系を構成している。また、受光ユニット６０、検出側分光ユニット７０および検出器ユニット８０における検出器８２以外が、本発明における検出光学系を構成している。

また、光源ユニット１０、光路ユニット２０、光源側分光ユニット３０、および照射光ユニット４０、受光ユニット６０、検出側分光ユニット７０および検出器ユニット８０は、各々が、単一の取付ベースに、レンズ、マスク等の２以上の光学部材が固定されてユニット化されている。
複雑な光学系を分割してユニット化することで、各部品を小型化しても、最小限のスペースで精度良く、容易に組み立てることができる。また、検出部ケースを開けても光路に迷光が入りにくく、保守作業の際の光路調整も容易である。また、光学系を小型化することで、検出部ケース３内に光源や検出器、モーター等の駆動系電気部等を搭載することが可能となり検出部全体を小型化することができる。また、小型化により、検出部のみを装置から取り外して、ＰＣや表示器等と組み合わせてポータブル機器として使用することも可能である。また、商用電源が確保できない場合でも、検出部は外部バッテリーやソーラーバッテリーからの給電で測定することができる。

光源ユニット１０としては、Ｘｅフラッシュランプ（キセノン放電管）、Ｄ_２ランプ（重水素放電管）等を用いることができる。
光路ユニット２０は、取付ベース２１と、この取付ベース２１に固定されたマスク２２、レンズ２３、ミラー２４、レンズ２５、およびマスク２６で構成されている。光路ユニット２０は、光源ユニット１０からの光束をマスク２２、２６やレンズ２３、２５で整えつつ、ミラー２４で方向を変えて、光源側分光ユニット３０に導くように構成されている。

光源側分光ユニット３０は、取付ベース３１と、この取付ベース３１に固定されたスリット３２、回折格子３３、およびスリット３４で構成されている。すなわち、照射光学系は、回折格子３３を有している。
回折格子３３は、光路ユニット２０からスリット３２を通過して入射した光源光を分光するようになっている。回折格子３３は図示を省略するモーターにより回転可能とされており、その回転位置に応じて、分光した光源光の内、特定の波長の光がスリット３４を通過して照射光ユニット４０に入射するようになっている。すなわち、回折格子３３の回転位置により、照射光ユニット４０を介してオーバーフロー面７に照射する照射光Ｅの波長を選択できるようになっている。
スリット３４を通過させる特定の波長の光としては、少なくとも、測定対象成分による蛍光を得るための励起光（波長λｅ）と妨害成分の濃度を測定するための補正照射光を含む、波長が異なる複数の光を選択できるようになっている。選択する補正照射光は、一種（波長λｘ）でも二種以上（波長λｘ_１，λｘ_２・・・）でも良い。

照射光ユニット４０は、取付ベース４１と、この取付ベース４１に固定されたマスク４２、レンズ４３、ミラー４５、レンズ４６、マスク４７、リファレンス光検出器５１、マスク５２、およびレンズ５３で構成されている。光源側分光ユニット３０から入射した照射光Ｅは、マスク４２、５２やレンズ４３、４６で光束を整えつつ、ミラー４５を通過して、試料液Ｓによるオーバーフロー面７に対して照射されるようになっている。
また、光源側分光ユニット３０から入射した照射光Ｅの一部は、ミラー４５で反射されて、マスク５２、およびレンズ５３を経由してリファレンス光Ｒとしてリファレンス光検出器５１に至り、リファレンス光Ｒが検出される。リファレンス光Ｒの光量の検出結果は、演算制御装置９０に送られ、オーバーフロー面７に照射される照射光Ｅの光量の変動を補償できるようになっている。

照射光Ｅは、光路ユニット２０、光源側分光ユニット３０、および照射光ユニット４０により、鉛直方向に対する角度θが４５±１５゜の方向から、オーバーフロー面７に照射されるようになっている。

角度θは４５±１５゜であり、４５±１０゜であることが好ましく、４５±５゜であることが好ましく、４５゜であることが特に好ましい。角度θが好ましい下限値より大きいことにより、受光ユニット６０に入射する照射光Ｅの散乱光や反射光等の迷光を低減させることができる。また、角度θが好ましい上限値より小さいことにより、照射光Ｅの、オーバーフロー面７での反射率が増加してしまうことを防ぎ、試料液Ｓ中の測定対象成分から、充分な蛍光を応答光Ｆとして発生させることができる。また、角度θを好ましい上限値より小さくすることにより、オーバーフロー面７における照射光Ｅのスポット径が大きくなりすぎることを防止しやすい。

オーバーフロー面７に照射光Ｅを照射する場合、スポット径が大きすぎると、水面の揺らぎの影響により、応答光Ｆを安定して検出することが困難である。角度θや、照射光学系のレンズの焦点距離等を調整してスポット径を充分に小さくすることにより、オーバーフロー面７からの応答光Fに対する水面の揺らぎの影響を小さくすることが可能である。
一方、スポット径をある程度大きくすることは、応答光Ｆの光量を確保しやすい点で有利である。但し、応答光Ｆの光量は、光源ユニット１０の光量を増すことによっても大きくすることが可能なため、スポット径の下限値に特に限定はない。
スポット径は、５０ｍｍ以下であることが好ましく、５〜４０ｍｍであることがより好ましく、５〜１０ｍｍであることがさらに好ましい。

受光ユニット６０は、取付ベース６１と、この取付ベース６１に固定されたレンズ６２、およびレンズ６３で構成されている。受光ユニット６０は、照射光Ｅによってオーバーフロー面７から発せられた応答光Ｆを、照射光Ｅがオーバーフロー面７に照射されるスポット位置の鉛直方向上方で捉えられる位置に配置されている。すなわち、オーバーフロー面７からの応答光Ｆを鉛直方向上方で受光するように配置されている。そして、受光した応答光Ｆは、レンズ６２、６３により光束を整えられ、検出側分光ユニット７０に導かれるようになっている。

検出側分光ユニット７０は、取付ベース７１と、この取付ベース７１に固定されたスリット７２、回折格子７３、およびスリット７４で構成されている。すなわち、検出光学系は、回折格子７３を有している。
回折格子７３は、受光ユニット６０からスリット７２を通過して入射した応答光Ｆを分光するようになっている。回折格子７３は図示を省略するモーターにより回転可能とされており、その回転位置に応じて、分光した応答光Ｆの内、特定の波長の光がスリット７４を通過して検出器ユニット８０に入射するようになっている。すなわち、回折格子７３の回転位置により、検出器ユニット８０に入射させる応答光Ｆの波長を選択できるようになっている。
スリット７４を通過させる特定の光としては、少なくとも、測定対象成分による蛍光（波長λｆ）と妨害成分の濃度を測定するための補正応答光を含む、波長が異なる複数の光を選択できるようになっている。選択する補正応答光は、一種（波長λｍ）でも二種以上（波長λｍ_１，λｍ_２・・・、但し、波長λｍ_１の補正応答光は波長λｘ_１の補正照射光によって得られる補正応答光であり、波長λｍ_２の補正応答光は波長λｘ_２の補正照射光によって得られる補正応答光である。）でもよい。

検出器ユニット８０は、取付ベース８１と、この取付ベース８１に固定された検出器８２、マスク８３、レンズ８４およびカットフィルター８５で構成されている。検出器８２としては、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトトランジスタ、アバランシェフォトダイオードなどを適宜用いることができる。
検出器８２の感度は可変である。すなわち、検出器８２が検出する応答光Ｆ（測定対象成分による蛍光または補正応答光）の光量に応じて適切な感度が、演算制御装置９０の制御の下、選択できるようになっている。例えば、検出器８２が光電子増倍管の場合、演算制御装置９０が印加電圧を調整することにより感度を調整できるようになっている。

検出器ユニット８０では、検出側分光ユニット７０から導かれた分光後の応答光Ｆが、マスク８３、レンズ８４で光束を整えられ、さらに、カットフィルター８５で不要な波長の光を除去された後、検出器８２に導入されるようになっている。カットフィルター８５では、励起光と同じ波長の散乱光が除去される。分光後の応答光Ｆを検出器８２で検出した結果は、演算制御装置９０に送られ、測定対象成分の濃度等が求められるようになっている。
測定対象成分の濃度や妨害成分の濃度等は、適宜表示器で表示される。

本実施形態の多波長蛍光分析装置１は、励起光をオーバーフロー面７に照射する角度θが３０゜以上であるため、励起光の光路と蛍光の光路を分離することが可能である。そのため、落射方式のように、ダイクロイックミラーや干渉フィルターを必要としない。そのため、各光路に回折格子を配置して分光することにより、オーバーフロー面７に照射される照射光Ｅの波長と応答光Ｆのうち検出器８２に導入される光の波長を、測定のステップに応じて個別に選択することが可能である。
また、セル窓が試料液と接しないオーバーフロー方式であるため、汚れに強くメンテナンスが容易である。

本実施形態の多波長蛍光分析装置１は、演算制御装置９０の制御下、下記ステップ１〜３を行うようになっている。
ステップ１：前記照射光学系により、光源光の内、前記測定対象成分による蛍光を得るための励起光（波長λｅ）を試料液の液面に導き、前記検出光学系により、試料液から発せられた応答光の内、前記測定対象成分による蛍光（波長λｆ）を検出器に導き、蛍光強度Ｉｆを得る。
ステップ２：前記照射光学系により、光源光の内、前記補正照射光を試料液の液面に導き、前記検出光学系により、応答光の内、補正応答光（波長λｘ、複数の場合、波長λｘ_１，λｘ_２・・・）を検出器に導き、補正応答光の強度Ｉｍ（複数の場合強度Ｉｍ_１，強度Ｉｍ_２・・・）を得る。
但し、波長λｍ_１は波長λｘ_１の補正照射光によって得られる補正応答光の波長であり、強度Ｉｍ_１は、その時の補正応答光の強度である。同様に、波長λｍ_２は波長λｘ_２の補正照射光によって得られる補正応答光の波長であり、強度Ｉｍ_２は、その時の補正応答光の強度である。
ステップ３：前記蛍光強度Ｉｆに基づき、前記試料液中の測定対象成分の濃度を演算する。該演算にあたり、前記補正応答光の強度Ｉｍ（複数の場合強度Ｉｍ_１，強度Ｉｍ_２・・・）により求めた妨害成分の濃度に応じた補正を行う。

なお、本実施形態の多波長蛍光分析装置１はリファレンス光Ｒの光量を検出するようになっている。ステップ１における蛍光強度Ｉｆと、ステップ２における補正応答光の強度Ｉｍ（複数の場合強度Ｉｍ_１，強度Ｉｍ_２・・・）は、何れも、光源ユニット１０から発せられる照射光Ｅの光量の変動による影響を、リファレンス光Ｒの光量によって補正した後の値である。

ステップ１における励起光の波長λｅと蛍光の波長λｆとは、各々測定対象成分に応じて適宜選択することができる。
例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩類濃度を求める場合の励起光の波長λｅは２３０ｎｍとし、蛍光の波長λｆは２９０ｎｍとすることができる。また、ＢＯＤを測定する場合の励起光の波長λｅは３２０ｎｍとし、蛍光の波長λｆは４４０ｎｍとすることができる。また、水中油分濃度を測定する場合の励起光の波長λｅは、２３０ｎｍ、２６５ｎｍ、２８０ｎｍ及び３６５ｎｍの何れかとし、蛍光の波長λｆは、励起光の波長λｅが２３０ｎｍ、２６５ｎｍ及び２８０ｎｍの何れかの場合は２９０〜３６０ｎｍ、励起光の波長λｅが３６５ｎｍの場合は４４０〜４６０ｎｍとすることができる。また、フェノール濃度を測定する場合の励起光の波長λｅは２５０ｎｍとし、蛍光の波長λｆは３００ｎｍとすることができる。また、クロロフィル濃度を測定する場合の励起光の波長λｅは２５０〜３２０ｎｍまたは４３０〜４７０ｎｍとし、蛍光の波長λｆは３６０〜３７０ｎｍまたは６５０〜７００ｎｍとすることができる。

ステップ２における補正照射光は、妨害成分として濁度を測定するための濁度補正照射光を含み、補正応答光は、妨害成分として濁度を測定するための濁度補正応答光を含むことが好ましい。濁度補正照射光と濁度補正応答光の波長は、共に６６０ｎｍ付近で選択することが好ましい。得られた補正応答光の強度Ｉｍに基づき濁度を測定し、測定した濁度に応じて、測定対象成分の濃度を補正することができる。
ステップ１の蛍光強度Ｉｆとステップ２の補正応答光の強度Ｉｍ（複数の場合強度Ｉ１，強度Ｉｍ_２・・・）に大きな差があっても本実施形態では、検出器８２の感度が可変とされているため、各々の強度を正確に測定することができる。

ステップ３では、前記蛍光強度Ｉｆに基づき、試料液Ｓ中の測定対象成分の濃度Ｃを演算する。この演算にあたり、補正応答光の強度Ｉｍ（複数の場合強度Ｉｍ_１，強度Ｉｍ_２・・・）により求めた妨害成分の濃度に応じた補正を行う。
下式（１）は、補正応答光の強度Ｉｍを用いた補正を行いつつ測定対象成分の濃度Ｃを求める式の一例である。
Ｃ=ａ×Ｉｆ−ｋ×ｇ（Ｉｍ）＋ｂ１ ・・・（１）
但し、式（１）におけるＣは測定対象成分の濃度、ｇ（Ｉｍ）は補正応答光の強度Ｉｍから求めた妨害成分の濃度、ａ、ｂ１、ｋは係数である。
ｋ×ｇ（Ｉｍ）は、妨害成分の濃度に応じた測定誤差にあたる。

係数ａは、例えば、既知濃度の測定対象成分を含む校正液を用いたときの、蛍光強度と測定対象成分濃度との関係から求めることができる。すなわち、照射光Ｅとして励起光をこの校正液の液面に照射した時の蛍光の強度Ｉｆと、この校正液の測定対象成分濃度によって求めることができる。具体的には、蛍光強度Ｉｆで、この校正液の測定対象成分濃度を除することによって求めることができる。また、異なる濃度の測定対象成分を含む複数の校正液を用いて、一次関数（ａ×Ｉｆ＋ｂ）の傾きａとして求めることもできる。

校正液としては、測定対象成分以外を含まない標準液を使用することができる。また、予め測定対象成分の濃度を手分析等により求めてある実際の測定系の試料液や、実際の測定系の試料液に測定対象成分を添加した試料液を用いてもよい。

ｇ（Ｉｍ）を求めるための関数ｇ（補正検量線）は、予め、補正応答光の強度Ｉｍに対する妨害成分濃度の関係式を、校正液を用いて求めておく。校正液としては、その妨害成分以外を含まない標準液を使用することができる。また、予めその妨害成分の濃度を手分析等により求めてある実際の測定系の試料液や、実際の測定系の試料液にその妨害成分を添加した試料液を用いることができる。
濁度補正の場合、ｇ（Ｉｍ）を求めるための関数ｇ（濁度検量線）は、予め、補正応答光の強度Ｉｍに対する濁度の関係式を、標準物質であるカオリンやホルマジンを均一に分散させた懸濁液濁度標準液を用いて求めておく。

係数ｋは、その妨害成分の単位濃度あたりの誤差にあたる。例えば妨害成分を含む実際の測定系の試料液の測定値に基づき、以下の式（２）により求められる。
ｋ＝（Ｃｘ−Ｃｓ）／ｇ（Ｉｍ） ・・・（２）
ただし、ＣｘはＩｆのみから求めた測定対象成分濃度、Ｃｓは測定対象成分の真の濃度、ｇ（Ｉｍ）は妨害成分濃度である。
Ｃｘは、例えば、蛍光強度Ｉｆに係数ａを乗じて求めてもよいし、ａ×Ｉｆ＋ｂの式により求めてもよい。

係数ｂ１は、例えば測定対象成分を含まない実際の測定系の試料液を測定した際に、測定対象成分の濃度Ｃがゼロとなるようにして求められる。すなわち、測定対象成分を含まない実際の測定系の試料液について蛍光強度Ｉｆと補正応答光の強度Ｉｍを測定し、下式（３）によって求める。
ｂ１＝−ａ×Ｉｆ＋ｋ×ｇ（Ｉｍ） ・・・（３）
係数ｂ１の項を設けることにより、実際の測定系における種々の妨害成分によるゼロ点変動を補正することができる。

以上のように、係数ａ、ｂ１、ｋと関数ｇを予め求めておけば、測定対象成分濃度が未知の試料液について、ステップ１〜３を行うことにより、補正した測定対象成分濃度を求めることができる。

第１の妨害成分と第２の妨害成分を考慮した補正を行う場合、第１の妨害成分に対応する補正応答光の強度Ｉｍ_１と、第２の妨害成分に対応する補正応答光の強度Ｉｍ_２を用い、例えば以下の式（４）によって、補正した測定対象成分の濃度Ｃを求めることができる。
Ｃ=ａ×Ｉｆ−ｋ_１×ｇ_１（Ｉｍ_１）−ｋ_２×ｇ_２（Ｉｍ_２）＋ｂ２ ・・・（４）
但し、式（４）におけるａとＩｆは式（１）と同じであり、ｇ_１（Ｉｍ_１）は補正応答光の強度Ｉｍ_１から求めた第１の妨害成分の濃度、ｇ_２（Ｉｍ_２）は補正応答光の強度Ｉｍ_２から求めた第２の妨害成分の濃度、ｂ２、ｋ_１、ｋ_２は係数である。

式（４）におけるｂ２は、例えば測定対象成分を含まない実際の測定系の試料液を測定した際に、測定対象成分の濃度Ｃがゼロとなるようにして求められる。すなわち、測定対象成分を含まない実際の測定系の試料液について蛍光強度Ｉｆ、補正応答光の強度Ｉｍ_１、補正応答光の強度Ｉｍ_２を測定し、下式（５）によって求める。
ｂ２＝−ａ×Ｉｆ＋ｋ_１×ｇ_１（Ｉｍ_１）＋ｋ_２×ｇ_２（Ｉｍ_２） ・・・（５）
係数ｂ２の項を設けることにより、実際の測定系における種々の妨害成分によるゼロ点変動を補正することができる。

さらに、第３、第４の妨害成分の影響を考慮した補正を行う場合は、式（５）に、第３、第４の妨害成分の濃度に係数を乗じた値を差し引く修正項をさらに追加すればよい。
複数の妨害成分を考慮した補正を行う場合、妨害成分の一つは濁度であることが好ましい。
また、式（１）で得られるＣは測定対象成分ではなく、測定対象成分と反応する試薬等の濃度であってもよく、その場合の測定対象成分濃度は、Ｃの値から間接的に求められる。

本発明において、ステップ３の演算で濁度等の妨害成分の影響を補正できるのは、検出光学系に回折格子と励起光と同じ波長の散乱光を除去するカットフィルターを用い、迷光として検出光学系に入る散乱光の影響を排除したからである。蛍光を検出する場合、励起光の散乱光が強い場合、迷光として検出光学系に入り、実際の蛍光強度よりも高い強度を検出してしまう影響（プラス誤差）が非常に大きい。
本発明では、回折格子と励起光と同じ波長の散乱光を除去するカットフィルターを組み合わせることにより散乱光の分離性能が大幅に向上した。そのため、散乱光以外の影響を補正することが可能となった。

散乱光以外の影響としては、まず、濁質によるマイナス誤差が挙げられる。濁質によるマイナス誤差は、濁質が妨害して測定対象成分に励起光が届かず充分に励起されないことや、蛍光が検出光学系で検知できないことにより生じる。また、濁質以外の妨害成分もマイナスやプラスの誤差を与える。これらの誤差は、散乱光によるプラス誤差と比較して圧倒的に小さいため、散乱光のみを充分に分離することにより、初めてその誤差の程度を検知可能となり、その補正ができるようになった。

また、本発明では、照射光学系にも回折格子を用いた。これにより、複数の光源を用いることなく、励起光と１種以上の補正照射光を試料液に照射することが可能である。また、複数の光源を用いることなく、複数の測定対象成分の各々に適した波長の励起光を、試料液に照射することが可能である。

なお、上記実施形態では、試料液の液面をオーバーフロー面としたが、試料液の液面は一定の水位を保って流動する液の液面であってもよい。また、容器に収納された試料液の静止した液面であってもよい。
また、測定対象成分の種類は複数でもよい。その場合、照射光学系によって試料液の液面に導かれる励起光の波長は測定対象成分毎に選択すればよい。また、検出光学系によって検出器に導かれる蛍光の波長は測定対象成分毎に選択すればよい。
なお、上記実施形態では、表示器を備える構成としたが、表示器は必須ではない。

［実験例１］
図１の装置を用いて、水中油分濃度を測定した。ただし、試料液はオーバーフローさせずに、試料液容器に入れ、静止状態で測定した。ステップ１における励起光の波長λｅは２３０ｎｍとした。また、蛍光の波長λｆは３５０ｎｍとした。ステップ２における濁度補正光（濁度補正照射光及び濁度補正応答光）の波長は６６０ｎｍとした。
ステップ３における式としては、前記式（１）を用いた。式（１）における係数等は、以下のようにして求めた。

係数ａは、水中油分として水溶性油１ｍｇを純水に分散させて１Ｌとした校正液、および純水を用いて求めた。校正液の液面に波長λｅの励起光を照射した際の波長λｆの蛍光強度Ｉｆは４８０であった。純水の液面に波長λｅの励起光を照射した際の長λｆの蛍光強度Ｉｆは０（ゼロ）であった。
以上の結果を下に、水溶性油濃度と応答光の強度との関係を求めると、下式（６）の検量線が得られたのでａ＝０．００２１とした。
水溶性油濃度（ｍｇ／Ｌ）＝０．００２１×Ｉｆ・・・（６）

次に、式（２）における関数ｇを求めた。関数ｇは、カオリン１００ｍｇを純水に分散させて１Ｌとした濁度１００度の校正液、および純水を用いて求めた。校正液の液面に波長６６０ｎｍの補正照射光を照射した際の波長６６０ｎｍの補正応答光の強度Ｉｍは５５．７であった。純水の液面に波長６６０ｎｍの補正照射光を照射した際の波長６６０ｎｍの補正応答光の強度Ｉｍは０．０６であった。
以上の結果を下に、濁度と濁度補正応答光の強度Ｉｍとの関係を求めると、下式（７）の検量線（関数ｇ）が得られた。
ｇ（濁度）＝１．７９７３×Ｉｍ−０．１０７８ ・・・（７）

次に、油分が含まれない河川水を採取して試料液Ａとし、ステップ１とステップ２を行った。その結果、蛍光強度Ｉｆは７０．７、補正応答光の強度Ｉｍは７．１であった。
また、試料液Ａとは別途に、油分が含まれない河川水を採取したものに水溶性油とカオリンを添加して試料液Ｂとした。水溶性油は、試料液Ｂの油分濃度が１ｍｇ／Ｌとなるように加えた。
試料液Ｂについて、ステップ１とステップ２を行った結果、蛍光強度Ｉｆは１５９．８、濁度補正応答光の強度Ｉｍは６４であった。

試料液Ａの油分濃度を前記式（６）により求めたところ、０．１４８５ｍｇ／Ｌ（０．００２１×７０．７）となった。そこで、試料液Ａの油分濃度がゼロとなるように、前記式（６）を修正して、濁質を考慮していない、仮の油分濃度検量線である下式（８）を作成した。
油分濃度（ｍｇ／Ｌ）＝０．００２１×Ｉｆ−０．１４８５ ・・・（８）

試料液Ｂの油分濃度（前記式（２）のＣｘ、すなわち、Ｉｆのみから求めた測定対象成分濃度）を前記式（８）で求めたところ、０．１８７１ｍｇ／Ｌ（０．００２１×１５９．８−０．１４８５）となり、油分の添加濃度（前記式（２）のＣｓ、すなわち、測定対象成分の真の濃度）である１ｍｇに対して、マイナス０．８１２９ｍｇ／Ｌの誤差があった。また、試料液Ｂの濁度（前記式（２）のｇ（Ｉｍ）、すなわち、妨害成分濃度）を前記式（７）で求めたところ、１１４．９（１．７９７３×６４−０．１０７８）であった。
式（２）により、濁度（妨害成分）１度あたり（単位濃度あたり）の誤差を表す係数ｋを求めたところ，ｋ＝−０．８１２９÷１１４．９８＝−０．００７０７となった。

次に、試料液Ａの濁度を前記式（７）で求めたところ、１２．６５（１．７９７３×７．１−０．１０７８）であった。
そして、試料液Ａの係数ｂ_１を式（３）で求めたところ、ｂ１＝−０．００２１×７０．７＋０．００７０７×１２．６５＝−０．２４となった。
以上の結果を纏めると、式（１）は、下式（９）となる。
Ｃ=０．００２１×Ｉｆ＋０．００７０７×ｇ（Ｉｍ）−０．２４ ・・・（９）

前記式（９）の妥当性を評価するため、試料液Ａ、試料Ｂとは別途に、油分が含まれない河川水を採取したものに、水溶性油を添加して試料液Ｃとした。試料液Ｃは、油分濃度が０．１ｍｇ／Ｌとなるように水溶性油を添加した。
試料液Ｃについて、ステップ１とステップ２を行った結果、蛍光強度Ｉｆは９８．７、濁度補正応答光の強度Ｉｍは１０．２であった。

試料液Ｃの濁度を前記式（７）により求めると１８．２２（１．７９７３×１０．２−０．１０７８）であった。また、試料液Ｃの油分濃度を前記式（９）により求めると０．０９６ｍｇ／Ｌ（０．００２１×９８．７＋０．００７０７×１８．２２−０．２４）となり、添加濃度と良く一致していることが確認できた。

［実験例２］
図１の装置を用いて、ローダミンＢ濃度を測定した。ただし、試料液はオーバーフローさせずに、試料液容器に入れ、静止状態で測定した。ステップ１における励起光の波長λｅは３３５ｎｍとした。また、蛍光の波長λｆは５７５ｎｍとした。ステップ２における濁度補正光（濁度補正照射光及び濁度補正応答光）の波長は６６０ｎｍとした。
ステップ３における式としては、前記式（１）を用いた。式（１）における係数等は、以下のようにして求めた。

係数ａは、ローダミンＢの２ｍｇを純水に溶かして１Ｌとした試料液Ｄ、および純水について、ステップ１を行うことにより求めた。試料液Ｄの液面に波長λｅの励起光を照射した際の波長λｆの蛍光強度Ｉｆは７５．７であった。純水の液面に波長λｅの励起光を照射した際の波長λｆの蛍光強度Ｉｆは０．０１であった。
以上の結果を下に、ローダミンＢ濃度と蛍光強度Ｉｆとの関係を求めると、下式（１０）の検量線が得られたのでａ＝０．０２６４とした。
ローダミンＢ濃度（ｍｇ／Ｌ）＝０．０２６４×Ｉｆ−０．０００３・・・（１０）

次に、ローダミンＢ２ｍｇとカオリン１００ｍｇを純水に分散させて１Ｌとした試料液Ｅについてステップ１、２を行ったところ、蛍光強度Ｉｆは５８．６２、濁度補正応答光の強度Ｉｍは６２．１５であった。
この蛍光強度Ｉｆに基づき、式（１０）で求めたローダミンＢ濃度は１．５５ｍｇ／Ｌであり、真の値である２ｍｇに対して、マイナス０．４５ｍｇ／Ｌの誤差があった。
また、濁度補正応答光の強度Ｉｍに基づき前記式（７）で求めた濁度は１１１．７度であった。式（２）における係数ｋは、濁度１度あたりの誤差なので、校正液のローダミンＢ濃度の誤差を、校正液の濁度で除し（−０．４５÷１１１．７）、ｋ＝−０．００４０２９となった。
以上の結果から、下式（１１）により、濁度補正されたローダミンＢの濃度を求められることが分った。
Ｃ=０．０２６４×Ｉｆ＋０．００４０２９×ｇ（Ｉｍ）−０．０００３・・（１１）

本発明の多波長蛍光分析装置は、試料液の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩類濃度、ＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）、水中油分濃度、フェノール濃度、クロロフィル濃度を求める水質分析計として利用できる。その他、蛍光を発する性質を持つ物質またはその物質との反応生成物、あるいは蛍光試薬やプローブ（強度、消光時間を含む。）を測定し、測定対象成分の存否及び／又は濃度、あるいはその蛍光の特性（蛍光スペクトル、励起スペクトルなど）自体を測定する、任意の蛍光分析に広く適用可能である。

１…多波長蛍光分析装置、２…仕切り板、３…検出部ケース、４…試料ケース、
６…オーバーフロー筒、７…オーバーフロー面、
１０…光源ユニット、２０…光路ユニット、３０…光源側分光ユニット、
３３…回折格子、４０…照射光ユニット、６０…受光ユニット、
７０…検出側分光ユニット、７３…回折格子、８０…検出器ユニット、
８５…カットフィルター、９０…演算制御装置、
Ｓ…試料液、Ｅ…照射光、Ｆ…応答光、Ｒ…リファレンス光

Claims (5)

1. 試料液に励起光を照射した際に得られる蛍光強度Ｉｆに基づき、前記試料液中の測定対象成分の濃度を求める多波長蛍光分析装置であって、
   光源と、
   前記光源から発せられた光源光を鉛直方向に対して４５±１５゜の角度で前記試料液の液面に導く照射光学系と、
   検出器と、
   前記試料液から発せられる応答光を、前記試料液の液面の鉛直方向上方で受光し、前記検出器に導く検出光学系と、
   装置全体を制御すると共に、前記検出器が得た前記応答光の強度が入力されて所定の演算を行う演算制御装置を備え、
   前記照射光学系は、回折格子を有し、前記光源光の内、少なくとも前記測定対象成分による蛍光を得るための励起光と、妨害成分の濃度を測定するための１種以上の補正照射光を含む、波長が異なる複数の光を選択的に前記試料液の液面に導くように構成され、
   前記検出光学系は、回折格子と前記励起光と同じ波長の散乱光を除去するカットフィルターを有し、前記応答光の内、少なくとも前記測定対象成分による蛍光と妨害成分の濃度を測定するための１種以上の補正応答光を含む波長が異なる複数の光を選択的に前記検出器に導くように構成され、
   下記ステップ１〜３を行うことを特徴とする多波長蛍光分析装置。
   ステップ１：前記照射光学系により、前記光源光の内、前記測定対象成分による蛍光を得るための励起光を前記試料液の液面に導き、前記検出光学系により、前記応答光の内、前記測定対象成分による蛍光を前記検出器に導き、蛍光強度Ｉｆを得る。
   ステップ２：前記照射光学系により、前記光源光の内、前記補正照射光を前記試料液の液面に導き、前記検出光学系により、前記応答光の内、前記補正応答光を前記検出器に導き、補正応答光の強度Ｉｍを得る。
   ステップ３：前記蛍光強度Ｉｆに基づき、前記試料液中の測定対象成分の濃度を演算する。該演算にあたり、前記補正応答光の強度Ｉｍにより求めた妨害成分の濃度に応じた補正を行う。
2. 前記１種以上の補正照射光は、妨害成分として濁度を測定するための濁度補正照射光を含み、
   前記１種以上の補正応答光は、妨害成分として濁度を測定するための濁度補正応答光を含む請求項１に記載の多波長蛍光分析装置。
3. 前記検出器の感度が可変であり、前記演算制御装置は、前記検出器の感度を前記応答光の強度に応じて制御可能である請求項１または２に記載の多波長蛍光分析装置。
4. 前記ステップ３における演算が、下記式（１）に基づき行われる請求項１〜３の何れか一項に記載の多波長蛍光分析装置。
   Ｃ=ａ×Ｉｆ−ｋ×ｇ（Ｉｍ）＋ｂ１ ・・・（１）
   但し、式（１）におけるＣは測定対象成分の濃度、ｇ（Ｉｍ）は補正応答光の強度Ｉｍから求めた妨害成分の濃度、ａ、ｂ１、ｋは係数である。
5. さらに、上端が開口部とされ、前記開口部に試料液のオーバーフロー面が形成されるように下方から流入した試料液がオーバーフローするオーバーフロー筒を備え、前記試料液の液面が前記試料液のオーバーフロー面である請求項１〜４の何れか一項に記載の多波長蛍光分析装置。

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