JP2017531662A - 改善されたコンジュゲーション方法及びそれから得られる合成オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲート - Google Patents

Abstract

本発明は、合成オリゴ糖／タンパク質（ＯＳ／ＰＲ）のコンジュゲートを得るための改善されたコンジュゲーション方法に関する。合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートの該方法は、免疫原性が高く、特異的で且つ均質な免疫応答を引き出すオリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートを提供する迅速な方法である。合成オリゴ糖は各モノマーの４〜８の反復単位と少なくとも１つの内蔵末端アミノリンカーを含んで成り、前記合成多糖は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ｘ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのようなグラム陰性細菌から得られる天然の多糖を模倣し、キャリアタンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ（破傷風トキソイド）またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ＣＲＭ１９７）のようなグラム陽性細菌またはそれらの組換え型から得られる。本発明の前記オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートのコンジュゲーションの化学的性質はチオエーテル結合である。本発明は１４〜２２時間の範囲での完全なプロセス所要時間を要する。前記オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートは、一価のワクチンまたは多価混合ワクチンの製造にて及び診断ツールとして有用である。【選択図】図なし

Description

本発明は、新規の合成オリゴ糖／タンパク質（ＯＳ／ＰＲ）のコンジュゲート（結合体）を得るための改善されたコンジュゲーション（結合）方法に関する。本発明はまた、前記オリゴ糖が合成オリゴ糖である新規のコンジュゲートワクチンを調製するための新規の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートにも関する。

天然の細菌莢膜多糖類の小分画に相当するオリゴ糖は、高分子量のネイティブの多糖抗原に対して作られた抗体によって認識される。オリゴ糖は、免疫原性であるだけでなく、動物モデル及びヒトにおいて特異的な抗体を引き出すことができるタンパク質コンジュゲートにてハプテンとして機能することもできるので、優れたワクチン候補としての有望な可能性を付与する。生物学研究及び新世代の有機合成ワクチン技術の分野における進歩は、病原性細菌の表面で一般に利用でき、それから精製される有機合成研究室における複合体オリゴ糖断片のさらに効果的な化学集合体を提供している。

天然の多糖類から得られるコンジュゲートはヒトのワクチンとして上手く開発されてきた。しかしながら、その使用は、たとえば、細菌多糖類のサイズ及び特性における大幅な変動、キャリアタンパク質への化学コンジュゲーションの間に不可欠な免疫優勢の特徴の破壊、コンジュゲートにおける重要な異質性の表示及び高度な毒性成分の存在、及び取り除くのが困難であり得る他の宿主の不純物のような課題に関連する。有機合成は、キャリアタンパク質への制御されたコンジュゲーションのために高い純度で且つ相対的に多い量で炭水化物エピトープを提供することができる。そのようなアプローチでは、合成糖類には人工のスペーサーが備えられてキャリアタンパク質への選択的なコンジュゲーションを容易にする。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｂ型に関連する疾患に対するコンジュゲートワクチンの出現はワクチン学にて新しい時代を開いている。新世代ワクチンの開発における主要な節目の１つは、小児期髄膜炎及び他の疾患を予防することにおけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｂ型の莢膜オリゴ糖の合成断片の有効なタンパク質コンジュゲートの開発である。合成オリゴ糖とそのコンジュゲートの開発に関する重要な事項は、エピトープのサイズ、コンジュゲートにおけるタンパク質当たりのオリゴ糖コピーの数、免疫応答に対するスペーサーの考えられる影響、及び動物モデルの選択と組み合わせたキャリアタンパク質の適正な選択のような多様性である。

合成オリゴ糖が生物学研究にとって有効なリード化合物を提供するという事実を考えると、特にワクチン技術の分野では、合成オリゴ糖及びそのタンパク質コンジュゲートの調製について重要な研究が進行中である。しかしながら、生物学的重要性のあるオリゴ糖の調製についてに一般的なプロトコールはない。各優れたコンジュゲート分子の化学合成は、長い且つ体系的な実験を要する研究プロジェクトである。原材料から生成物までの従来技術で記録されたプロセスの総時間は２０〜２４時間を要する。従来のオリゴ糖及びそのタンパク質コンジュゲートの低い収率、低い安定性及び低い純度が懸念される主要な事項である。従って、均質性と合わせて高い安定性を伴う合成オリゴ糖／タンパク質コンジュゲートならびにさらに良好な収率、安定性及び純度を伴うそのような合成コンジュゲートワクチンを得るための効率的な合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーション方法を有する緊急の長年にわたる切実なニーズがある。合成コンジュゲートワクチンの値頃感及び可用性は、時間効果の高い且つ費用効果の高いやり方で合成コンジュゲートワクチンの可用性を可能にする方法を必要とする重大な課題である。

本発明の目的
既存の先端技術における欠点を取り除くために、本発明の主要な目的は新規の合成オリゴ糖／タンパク質（ＯＳ／ＰＲ）コンジュゲートを得るためのコンジュゲーションの改善された方法を提供することである。

本発明の別の目的は、オリゴ糖／タンパク質コンジュゲートのさらに高い収率、さらに高い純度及びさらに高い安定性を可能にする、改善された合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーション方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、前記オリゴ糖とキャリアタンパク質のコンジュゲーションにとって迅速であり、且つ好都合である、改善された合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーション方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、値頃感のあるオリゴ糖／タンパク質コンジュゲートを得るための、費用効果が高い改善された合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーション方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、新規のコンジュゲートワクチンの調製のために新規の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、オリゴ糖が合成オリゴ糖である新規の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、前記オリゴ糖／タンパク質コンジュゲートが特異的で且つ均質な免疫応答を引き出す合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、一価のワクチンまたは混合ワクチンとして、及び診断ツールとしても使用される新規の合成オリゴ糖に基づいたコンジュゲートの調製のために新規の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートを提供することである。

発明の要約
従って、本発明は、新規のＯＳ／ＰＲコンジュゲートを得るための改善されたコンジュゲーション方法を提供する。本発明の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーションの方法は、高い、単一特異的な且つ均質の免疫応答を引き出すＯＳ／ＰＲコンジュゲートを提供する迅速な方法である。こうして作出されるコンジュゲートによって、これらのコンジュゲートに基づいてワクチン及び診断の信頼性を高める再現可能な成績が得られる。

本発明の方法から得られる新規の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートによって新規の合成オリゴ糖に基づくコンジュゲートワクチンが得られる。

前記合成コンジュゲートは、合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートのオリゴ糖部分が合成オリゴ糖であるという点で合成であるのに対してキャリアタンパク質はグラム陽性細菌から得られる。

本発明は、好適な長さの合成オリゴ糖、好ましくはオリゴ糖４量体及び８量体（以後、オリゴマー）の選択を含み、それはコンジュゲーションのためにタンパク質で修飾される。修飾は、そのオリゴマーへのリンカーの付加のステップと、チオール化剤を用いた前記オリゴマーの活性化とその後の前記活性化されたオリゴマー（チオール化オリゴマーである）の精製のステップとを含む。一方で、好ましくは破傷風トキソイドに限定されない好適な細菌タンパク質は活性化によって修飾される。前記チオール化オリゴマーは前記活性化された細菌タンパク質にコンジュゲートされる。

前記オリゴマーに内蔵されたリンカーは前記オリゴマーの末端でアミノ基（−ＮＨ２）を提供する。前記末端アミノ基（−ＮＨ２）はチオール化剤による活性化に利用し易い。チオール化剤は、たとえば、チオ酢酸及びＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）のような、しかし、これらに限定されない試薬の群から、好ましくはＳＡＴＡから選択される。得られるスルフヒドリル化された化合物を次いで還元剤の群から選択される求核試薬で処理して活性化オリゴマーを得、次いでそれを精製する。オリゴ糖単位当たりのチオール単位を確認するためにアッセイを行う。

前記タンパク質は、Ｎ−（ベータ−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）のような架橋剤を用いて活性化される。前記活性化されたオリゴ糖と前記活性化されたタンパク質を、コンジュゲーションのための特定の温度あるいは特定の時間のような特定の実験条件で、保持する。本発明の前記オリゴ糖／タンパク質コンジュゲートのコンジュゲーションの化学的性質はチオエーテル結合である。

本発明は、完全なプロセス所要時間が１４〜２２時間の範囲内にある合成コンジュゲーションを提供する。本発明は、窒素パージを必要とせず、特定の取り扱い技能を必要としない試薬を使用し、それによって方法を好都合で費用効果の高いものにする。

本発明は、親オリゴマーの主鎖を修飾することなくコンジュゲートを提供するので、エピトープすべてをインタクトに保持し、天然の免疫応答を生じる。

オリゴ糖とタンパク質の比は免疫応答の発生で決定的な役割を有する。本発明は、タンパク質への高いオリゴ糖負荷を確保して、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｂ型（Ｈｉｂ）及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５またはＸ（それぞれＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ、ＭｅｎＷまたはＭｅｎＸ）について０．２〜０．５の間の所望のＯＳ：ＰＲの比を確保することを提供する。オリゴ糖タンパク質コンジュゲートのコンジュゲーション全体の収率はＨｉｂについては約４５％〜６５％であり、ＭｅｎＡ／Ｃ／Ｙ／Ｗ／Ｘの血清型については２１％〜４８％である。本発明はまたオリゴマーの活性化にＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）も使用する。ＳＡＴＡは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶性であり、チオール化剤とのオリゴ糖の緩衝液における迅速な混合を可能にし、それによって方法を容易にする。本発明は、単一ステップの精製が実施され、それによって方法におけるステップを減らし、さらに良好な収率及び少ないプロセス所要時間を生じる合成コンジュゲーションの方法も提供する。

本発明の改善された方法は、ワクチンの調製に有用な多数のコンジュゲートの調製に有用である。そのようなＯＳ／ＴＴコンジュゲートのわずかな非限定例は、Ｈｉｂ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＷ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＹ−ＴＴコンジュゲート、Ｈｉｂ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＸ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＷ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートである。ワクチンは単一ワクチンとしてまたは混合ワクチンとして調製するこができる。

合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーション方法を使用することができる多数の例のうちで、非限定の一例では、前記合成で調製されたオリゴマーはヘキシルアミンリンカーによって連結され、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を用いて活性化されるが、その際、前記ＳＡＴＡはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解される。こうして得られたスルフヒドリル化されたオリゴ糖は固定した時間で非常に遅い流速での所定の条件に供され、次いで精製される。前記精製されたオリゴマーは次いで濃縮され、たとえば、塩酸ヒドロキシルアミンのような少なくとも１つの求核試薬と反応させ、チオール化されたオリゴ糖を得る。

Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）におけるＮ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステルの溶液をキャリアタンパク質、たとえば、破傷風トキソイド（ＴＴ）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉから得られる）またはＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の交差反応変異体または非毒性変異体で、本明細書ではＣＲＭとも呼ばれる）と混合し、固定された時間、所定の条件で保持する。次いで前記活性化されたキャリアタンパク質の反応混合物を精製し、回収する。

エステル化されたまたは活性化されたキャリアタンパク質と前記チオール化されたオリゴマーとを混合し、所定の条件で一晩インキュベートする。限外濾過フィルターまたは他のサイズ排除装置、たとえば、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて、オリゴマー／タンパク質のコンジュゲート原体を精製する。

本発明の改善された方法のほとんどの重要な成果は、再現可能な成績を伴う合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーションに由来するＭｅｎＡ−ＴＴ、ＭｅｎＣ−ＴＴ、ＭｅｎＸ−ＴＴ、ＭｅｎＹ−ＴＴ、ＭｅｎＷ−ＴＴ、Ｈｉｂ−ＴＴのコンジュゲートのような、しかし、これらに限定されないオリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートを提供することである。前記オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートは特異的で且つ均質な免疫応答を引き出し、一価のワクチンまたは多価の混合ワクチンの製造として及び診断ツールとして有用である。

様々な髄膜炎菌血清型の合成オリゴマーの構造の図表示を示す。末端アミン含有リンカーを伴うＭｅｎＡ。 様々な髄膜炎菌血清型の合成オリゴマーの構造の図表示を示す。末端アミン含有リンカーを伴うＭｅｎＣ。 様々な髄膜炎菌血清型の合成オリゴマーの構造の図表示を示す。末端アミン含有リンカーを伴うＭｅｎＹ。 様々な髄膜炎菌血清型の合成オリゴマーの構造の図表示を示す。末端アミン含有リンカーを伴うＭｅｎＷｉ３５。 様々な髄膜炎菌血清型の合成オリゴマーの構造の図表示を示す。末端アミン含有リンカーを伴うＭｅｎＸ。 （ａ）反応性末端チオール基を生成するためのオリゴマーの活性化の方法の図表示である。（ｂ）チオールに向けて反応性であるマレイミド基を生成するためのキャリアタンパク質の活性化を示す模式図である。（ｃ）チオエーテル結合を介したチオール化合成オリゴマーのマレイミド標識キャリアタンパク質へのコンジュゲーションを示す模式図である。 ＷａｔｅｒｓのＵＶ／ＰＤＡ検出器で見られるような、活性化タンパク質（ＴＴ及びＣＲＭ）と比べたコンジュゲートされたオリゴマー（ＭｅｎＣ）_４のＨＰ−ＳＥＣピークの特徴を示す図である。 ＷａｔｅｒｓのＵＶ／ＰＤＡ検出器で見られるような、活性化タンパク質（ＴＴ及びＣＲＭ）と比べたコンジュゲートされたオリゴマー（ＭｅｎＣ）_８のＨＰ−ＳＥＣピークの特徴を示す図である。 ＷａｔｅｒｓのＵＶ／ＰＤＡ検出器で見られるような、活性化タンパク質と比べたコンジュゲートされた四量体ＨｉｂのＨＰ−ＳＥＣピークの特徴を示す図である。 ＷａｔｅｒｓのＵＶ／ＰＤＡ検出器で見られるような、活性化タンパク質と比べたコンジュゲートされたＭｅｎＸ四量体のＨＰ−ＳＥＣピークの特徴を示す図である。 細菌ＭｅｎＸ多糖に対して生成された抗体のパーセント阻害という点で示されるような（ＭｅｎＣ）_４及び（ＭｅｎＣ）_８−ＴＴコンジュゲートの試験管内での抗原特性を示す図である。 ＥＬＩＳＡによって推定されるような合成ＭｅｎＣコンジュゲートの１、２及び３回の投与後のスイスアルビノマウスにおける抗ＭｅｎＣ血清ＩｇＧ濃度に関する免疫応答を示す図である。 （ＭｅｎＣ）_４−ＴＴコンジュゲートについての抗ＭｅｎＣ血清殺菌アッセイ力価に関する３回投与後の免疫応答を示す図である。 （ＭｅｎＣ）_８−ＴＴコンジュゲートについての抗ＭｅｎＣ血清殺菌アッセイの力価に関する３回投与後の免疫応答を示す図である。 ＥＬＩＳＡによって推定されるような抗ＭｅｎＸＩｇＧ応答に関する免疫応答及びスイスアルビノマウスにおける合成（ＭｅｎＸ）_４−ＴＴコンジュゲートの３回投与後の血清殺菌力価を示す図である。

従って、本発明は、ワクチンの調製に有用な合成オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートを調製するためのコンジュゲーションの改善された方法を提供する。

そのようなコンジュゲートのわずかな非限定例は、Ｈｉｂ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＷ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＹ−ＴＴコンジュゲート、Ｈｉｂ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＸ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＷ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートである。ワクチンは一価のワクチンとしてまたは混合ワクチンとして調製することができる。

本発明は、好適な合成オリゴマー、好ましくはオリゴ糖の４量体及び８量体の選択を含み、合成オリゴ糖は少なくとも１つの内蔵末端アミノリンカーを含んで成り、前記合成オリゴ糖は、たとえば、末端アミノリンカー（−ＮＨ２）を伴うＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、Ｘ（図ｌａ、ｌｂ、ｌｃ、Ｉｄ、ｌｅ）及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのようなグラム陰性細菌から得られる天然の多糖を模倣する。前記末端アミノ基（−ＮＨ２）はスルフヒドリル化剤による活性化に利用しやすい。末端アミノリンカーのスルフヒドリル基への変換を促すスルフヒドリル化剤は、たとえば、無水酢酸、塩化アセチル、Ｎ−アセチルホモシステインチオールアセトン、ホモシステインチオールアセトン、チオ酢酸及びＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）のような試薬の群、好ましくはＳＡＴＡから選択される。ＳＡＴＡはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解され、前記合成オリゴ糖の溶液と共に室温で１時間撹拌される。次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ約７．５で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィに反応混合物を適用し、未反応のＳＡＴＡを取り除く。次いで、前記ＳＡＴＡで修飾したオリゴマーを還元剤の群から選択される求核試薬、好ましくは塩酸ヒドロキシルアミンと共に室温で２時間混合し、スルフヒドリル基の反応性チオール基への変換を促す（図２ａ）。オリゴ糖含量の測定は、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ及びＭｅｎＷについてはレゾルシノールアッセイによって、ＭｅｎＸ及びＭｅｎＡについてはＣｈｅｎのアッセイによって、Ｈｉｂについてはオルシノールアッセイによって行う。チオール（−ＳＨ）含量はオリゴマーすべての型についてＥｌｌｍａｎアッセイによって測定する。チオール化の程度（％）はモル基準でチオールの濃度をオリゴマーの濃度で割ることによって決定される。

好ましくは、しかし限定されない、破傷風トキソイド（ＴＴ）及び交差反応変異体（ＣＲＭ１９７または単にＣＲＭ）またはそれらの組換え型の好適な細菌キャリアタンパク質を活性化して反応性のマレイミド官能基を生成する。好ましくは、しかし限定されない、Ｎ−（ベータ−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）脂肪族ヘテロ二官能性架橋剤を用いて前記キャリアタンパク質を活性化する。ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ約７．６における前記キャリアタンパク質、たとえば、ＴＴ及びＣＲＭ１９７をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）におけるＢＭＰＳの前記溶液と室温で２時間混合する。次いで、好適な遠心分離カットオフフィルターを介して前記キャリアタンパク質の反応混合物をＰＢＳ緩衝液ｐＨ約６．８によって６〜７回洗浄する（図２ｂ）。ＢＳＡを標準として用いるＬｏｗｒｙ法によって前記活性化キャリアタンパク質のタンパク質含量を測定する。マレイミド含量はＥｌｌｍａｎアッセイによって間接的に概算されるが、その際、マレイミド標識したキャリアタンパク質を先ず既知の量のβ−メルカプトエタノールと反応させ、未反応のβ−メルカプトエタノールをＤＴＮＢによって分析する。キャリアタンパク質のモル濃度及びマレイミドのモル濃度を用いてキャリアタンパク質の単位当たりのマレイミド基の数を算出する。

ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ約７．５における、たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、Ｘ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｂ型のようなグラム陰性細菌の群から選択されるチオール化したオリゴ糖と、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ約６．８における破傷風トキソイド（ＴＴ）及び交差反応変異体（ＣＲＭ１９７）から選択されるマレイミド標識した活性化キャリアタンパク質とをコンジュゲーションのために一緒に混合する。これは室温で実施することができるが、好ましくは２〜８℃にて６．５〜７．５の範囲のｐＨを有する反応混合物を一晩ゆっくり撹拌する。５０ｋＤのカットオフ遠心分離フィルターを介してＭＥＳ緩衝液ｐＨ約６．５で６〜７回洗浄してコンジュゲートしなかったオリゴマー及び未反応の塩酸ヒドロキシルアミンのような不純物を取り除くことによって粗精製のコンジュゲートを精製する。最終的な精製されたオリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートを０．２μのフィルターで濾過し、使用まで２〜８℃で保存する（図２ｃ）。本発明の前記オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートのコンジュゲーションの化学的性質はチオエーテル結合である。

前記改善されたコンジュゲーション方法から得られるオリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートを、たとえば、タンパク質含量、オリゴ糖含量、オリゴ糖／タンパク質の比、遊離のオリゴ糖含量のような物理化学的解析について標準の方法によってさらに特徴づける。コンジュゲートを高速サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰ−ＳＥＣ）によって解析して反応物のコンジュゲートへの変換及び分子サイズの分布を観察する（図３ａ、図３ｂ、図３ｃ、図３ｄ）。こうして得られたオリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートの抗原性（図４）及び動物での免疫原性を調べる試験を実施する（図５ａ、図５ｂ、図５ｃ、図５ｄ）。

本発明は、完全なプロセス所要時間が１４〜２２時間の範囲にある合成コンジュゲーションを提供する。本発明は、窒素パージを必要とせず、特定の取り扱い技能を必要としない試薬を使用し、それによって方法を好都合で費用効果の高いものにする。

本発明は、親オリゴマーの主鎖を修飾することなくコンジュゲートを提供するので、エピトープすべてをインタクトに保持し、天然の免疫応答を生じる。本発明はまた、単一ステップの精製が実施され、それによって方法におけるステップを減らし、さらに良好な収率及び少ないプロセス所要時間を生じる合成コンジュゲーションの方法も提供する。

本発明の改善された方法のほとんどの重要な成果は、たとえば、再現可能な成績を伴った合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲーションに由来する、たとえば、Ｈｉｂ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＷ−ＴＴコンジュゲート、ＭｅｎＹ−ＴＴコンジュゲート、Ｈｉｂ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＸ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＷ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、ＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートのような、しかし、これらに限定されないオリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートを提供することである。前記オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートは、特異的で且つ均質な免疫応答を引き出し、一価のワクチンまたは多価の混合ワクチンの製造として及び診断ツールとして有用である。

実施例１：反応性チオール官能基を生成するオリゴマー（ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＸ及びＨｉｂ）の活性化及び解析
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５における１０ｍｇ／ｍｌの濃度での合成オリゴ糖の溶液をジメチルスルホキシドにおける２５倍モル過剰のＳ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）の溶液と混合した。溶液を室温にて穏やかに１時間撹拌した。ＳＡＴＡは合成オリゴマーのリンカー鎖に存在するアミンと反応し、第２の反応ステップにて反応性チオール基を生成するためのアセチル化された中間体を形成する。０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５によって平衡化したセファデックスＧ１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（２０〜３０ｍｌのベッド体積）によるゲル濾過クロマトグラフィに反応混合物を適用し、未反応のＳＡＴＡを取り除いた。平衡化緩衝液を用いて定組成状態で４．０ｍｌの溶離液に反応したオリゴマーを回収し、その後５００μｌに濃縮した。こうして得られたＳＡＴＡで修飾したオリゴマーを、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５におけるチオール化オリゴマーの約３５モル過剰の濃度での塩酸ヒドロキシルアミンの溶液と混合した。室温で２時間混合した後、さらなる使用までチオール化オリゴマーを−２０℃で保存した。オリゴマーの活性化の模式図を図２ａにて示す。ＭｅｎＸ４量体の２つの異なるアノマー、すなわち、アルファアノマー（αＸＴＭ）及びベータアノマー（βＸＴＭ）が活性化及びコンジュゲーションに使用された。

次いで活性化されたオリゴマーを精製し、オリゴ糖含量及びチオール含量について解析する。
ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ及びＭｅｎＷについては、オリゴ糖含量は標準としてＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を用いるレゾルシノールアッセイによって測定し、ＭｅｎＡ及びＭｅｎＸについては、標準としてリンを用いるＣｈｅｎのアッセイによって測定し、Ｈｉｂについては標準としてリボースを用いるオルシノールアッセイによって測定した。チオール（ＳＨ）含量はＥｌｌｍａｎアッセイによって測定した。％チオール化は、チオールのミリモル濃度をオリゴマーのミリモル濃度で割ることによって得られる。オリゴマーの活性化実験のわずかな代表的な結果は表１、２、３及び４にて与えられる。
表１：反応性チオール基を生成するＭｅｎＣ合成４量体（ＭｅｎＣ）_４の活性化

表２：反応性チオール基を生成するＭｅｎＣ合成８量体（ＭｅｎＣ）_８の活性化

表３：反応性チオール基を生成するＭｅｎＸ合成４量体（ＭｅｎＸ）_４の活性化

表４：反応性チオール基を生成するＨｉｂ合成４量体（Ｈｉｂ）_４の活性化

オリゴマーの活性化の方法は末端アミンリンカーを伴った活性化された合成オリゴ糖を生じる。図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅということでまとめた図１は、チオエーテルコンジュゲーション化学的性質によって様々なオリゴマー／タンパク質のコンジュゲートを調製するのに使用される末端アミンリンカーを伴った様々な合成の髄膜炎菌血清型群を表す。

実施例２：反応性マレイミド官能基を生成するＴＴの活性化及び解析
破傷風トキソイド（ＴＴ）は０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．６にて２０ｍｇ／ｍｌの濃度（０．１３３ミリモル）で利用したが、１−メチル−２−ピロリドンにおける７．２ｍｇのＮ−（ベータ−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）（２７ミリモル）と反応する。室温での２時間の混合の後、５０ｋＤのカットオフ遠心分離フィルターを介して０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ緩衝液ｐＨ６．８によって反応混合物を６〜７回洗浄した。０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ緩衝液ｐＨ６．８にて０．５ｍｌの容量で活性化ＴＴを回収し、実施例４におけるコンジュゲーションにてさらに使用した。ＴＴの活性化の方法についての模式図を図２ｂにて示す。

タンパク質含量及びマレイミド含量について活性化されたタンパク質を解析する。活性化されたＴＴのタンパク質含量は、標準としてＢＳＡを用いるＬｏｗｒｙ法によって測定し、マレイミド含量はＥｌｌｍａｎアッセイによって間接的に概算し、その際、マレイミド標識したＴＴを先ず、既知の量のβ−メルカプトエタノールと反応させ、未反応のβ−メルカプトエタノールをＤＴＮＢによって分析した。ＴＴの分子当たりのマレイミドの数はＴＴ及びマレイミドのモル濃度によって算出される。活性化ＴＴの解析のデータは表５にて与えられる。
表５：反応性マレイミド基を生成するタンパク質（破傷風トキソイド）の活性化

実施例３：反応性マレイミド官能基を生成するＣＲＭ１９７の活性化
ＣＲＭ１９７は、１．８ｍｌの０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．６にて２５ｍｇ（０．２４ミリモル）の濃度で利用し、１−メチル−２−ピロリドンにおける２．６ｍｇのＮ−（ベータ−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）（３．７ミリモル）と反応させた。室温での２時間の混合の後、１０ｋＤのカットオフ遠心分離フィルターを介して０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ緩衝液ｐＨ６．８によって反応混合物を６〜７回洗浄した。０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ緩衝液ｐＨ６．８にて０．５ｍｌの容量で活性化タンパク質を回収し、コンジュゲーションにてさらに使用した。活性化タンパク質をＬｏｗｒｙ法によって総タンパク質含量について、及びＥｌｍａｎアッセイによってマレイミド含量について調べ、ＣＲＭ分子当たりのマレイミド基を決定した。活性化されたＣＲＭ１９７の解析についてのデータは表６にて与えられる。
表６：反応性マレイミド基を生成するＣＲＭ１９７の活性化

実施例４：チオエーテル結合を介した活性化タンパク質（ＴＴまたはＣＲＭ）への活性化オリゴマー（Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ、ＭｅｎＷ及びＭｅｎＸ）のコンジュゲーション
０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５における１０ｍｇ／ｍｌの濃度での実施例１のチオール化されたオリゴマーを、０．１ＭのＰＢＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．８における新しく調製した約１０ｍｇ／ｍｌのマレイミド標識したＴＴまたはＣＲＭと混合した。ｐＨ６．５〜７．５（好ましくは７．０）での反応ミックスを好ましくは２〜８℃にて一晩穏やかな撹拌で保持したが、撹拌は室温でも実施することができる。５０ｋＤのカットオフ遠心分離フィルターを介して０．２ＭのＮａＣｌを含有する０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５で６〜７回洗浄してコンジュゲートしなかったオリゴマー及び未反応の塩酸ヒドロキシルアミンのような不純物を取り除くことによって粗精製のコンジュゲートを精製した。最終的な精製したコンジュゲートは０．２μのフィルターで濾過し、使用まで２〜８℃で保存した。コンジュゲーションの模式図を図２（２ｃ）にて示す。

実施例５：実施例４から得られたＭｅｎＣオリゴマーコンジュゲートの物理化学的な解析
０．２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを標準として用いるＬｏｗｒｙ法によってタンパク質含量について、及び０．５ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を標準として用いるシアル酸アッセイによってオリゴマー含量について、［ＭｅｎＣ］_４及び［ＭｅｎＣ］_８のコンジュゲートを調べた。オリゴ糖とタンパク質の比はｗｔ／ｗｔ基準で数学的に算出した。遊離のＯＳの量はデオキシコール酸ナトリウムによる沈殿の後評価した。９００μｌのコンジュゲート試料（およそ１００μｇのＯＳ含量）に、８０μｌの１％ｗ／ｖのデオキシコール酸ナトリウム水溶液ｐＨ６．８±０．２を加えた。反応混合物を２〜８℃で３０分間保持し、５０μｌの１ＮのＨＣｌを加え、試料を６０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を回収し、遊離の糖含量をレゾルシノールアッセイによって概算した（表７、８、９）。ＵＶ検出器にてコンジュゲートのＨＰＳＥＣピーク特性をタンパク質ピークのＨＰＳＥＣピーク特性と比較し、ＴＳＫｇｅｌ ＰＷＸＬガードカラム（６．０×４０ｍｍ、ＴＯＳＯＨ）によるシリーズにおけるＴＳＫｇｅｌ４０００ＰＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、粒度７μｍ，ＴＯＳＯＨ）及びＴＳＫｇｅｌ３０００ＰＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ，粒度７μｍ，ＴＯＳＯＨ）にてタンパク質すべてのコンジュゲートへの変換を確認した。移動相は定組成形態で１．０ｍｌ／分の流速にて３０分間の０．１ＭのＮａＮＯ_３、ｐＨ７．２である。空隙容量及びカラム容量はそれぞれＭＷ５０,００，０００〜４００,００，０００のデキストラン（ＨＩ−ＭＥＤＩＡ）及び酸化重水素（Ｄ_２Ｏ、Ｍｅｒｃｋ）によって決定した。タンパク質及びコンジュゲートのピークは図３ａ及び図３ｂで示す２８０ｎｍで検出した。（ＭｅｎＣ）_４−ＴＴコンジュゲート、（ＭｅｎＣ）_８−ＴＴコンジュゲート、（ＭｅｎＣ）_4＆８−ＣＲＭコンジュゲートの種々のロットの性状分析のデータを表７、８及び９にて示す。
表７：（ＭｅｎＣ）_４−ＴＴコンジュゲートの種々のロットの性状分析

表８：（ＭｅｎＣ）_８−ＴＴコンジュゲートの種々のロットの性状分析

表９：（ＭｅｎＣ）_4＆８−ＣＲＭコンジュゲートの種々のロットの性状分析

実施例６：実施例４から得られたＨｉｂコンジュゲートの物理化学的解析
精製されたコンジュゲートのタンパク質含量は０．２５ｍｇのＢＳＡを標準として用いるＬｏｗｒｙ法によって測定し、Ｈｉｂ総含量は０．２モルのｄ−リボースを標準として用いるオルシノールアッセイによって測定し、Ｈｉｂ対タンパク質の比は数学的に算出した。遊離のオリゴ糖含量は前の実施例で実施したように１％デオキシコール酸塩（ＤＯＣ）沈殿の後の上清で測定した。（Ｈｉｂ）_４−ＴＴコンジュゲートの種々のロットの性状分析のデータを表１０にて示す。前の実施例で実施したようにコンジュゲーションで使用された修飾されたＴＴと比較してＨＰ−ＳＥＣによって（Ｈｉｂ）_４−ＴＴコンジュゲートを解析し、タンパク質（ＴＴまたはＣＲＭ）のコンジュゲートへの完全な変換が図３ｃにて示されることを確認した。
表１０：（Ｈｉｂ）_４−ＴＴコンジュゲートの種々のロットの性状分析

実施例７：実施例４から得られたＭｅｎＸコンジュゲートの物理化学的解析
オリゴマー含量についてはＣｈｅｎのアッセイによって、リンについては０．２ｍＭのリン溶液を標準として用いて、タンパク質含量についてはＬｏｗｒｙ法によって［ＭｅｎＸ］_４コンジュゲートを調べた。オリゴ糖とタンパク質の比はｗｔ／ｗｔ基準によって数学的に算出した。遊離のオリゴ糖の量は表１１にて付与されたレゾルシノールアッセイによって概算した。［ＭｅｎＸ］_４コンジュゲートをＨＰＳＥＣによって解析し、修飾されたキャリアタンパク質のＭｅｎＸコンジュゲートへの変換の完了を確認した。コンジュゲートのＨＰＳＥＣピーク特性を図３ｄにて示す。
表１１：（ＭｅｎＸ）_４−ＴＴコンジュゲートの種々のロットの性状分析

実施例８：実施例４から得られたＭｅｎＹコンジュゲートの物理化学的解析
オリゴマー含量については０．５ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を標準として用いるシアル酸アッセイによって、タンパク質含量についてはＬｏｗｒｙアッセイによって［ＭｅｎＹ］_４コンジュゲートを調べた。オリゴ糖とタンパク質の比はｗｔ／ｗｔ基準によって数学的に算出した。遊離のオリゴ糖の量は表１２にて付与されたレゾルシノールアッセイによって概算した。［ＭｅｎＹ］_４コンジュゲートをＨＰＳＥＣによって解析し、修飾されたキャリアタンパク質の［ＭｅｎＹ］_４コンジュゲートへの変換の完了を確認した。
表１２：（ＭｅｎＹ）_４−ＴＴコンジュゲートの様々のロットの性状分析

実施例９：実施例４から得られたＭｅｎＷ１３５コンジュゲートの物理化学的解析
オリゴマー含量については０．５ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を標準として用いるシアル酸アッセイによって、タンパク質含量についてはＬｏｗｒｙアッセイによって［ＭｅｎＷ］_４コンジュゲートを調べた。オリゴ糖とタンパク質の比はｗｔ／ｗｔ基準によって数学的に算出した。遊離のオリゴ糖の量は表１３にて付与されたレゾルシノールアッセイによって概算した。［ＭｅｎＷ］_４コンジュゲートをＨＰＳＥＣによって解析し、修飾されたキャリアタンパク質の［ＭｅｎＷ］_４コンジュゲートへの変換の完了を確認した。
表１３：（ＭｅｎＷ）_４−ＴＴコンジュゲートの種々のロットの性状分析

実施例１０：合成ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲートの抗原特性の決定
競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）にて合成ＭｅｎＸ４量体−ＴＴコンジュゲートの抗原性をＭｅｎＸ４量体及び抗原無しの対照と比較した。このアッセイでは、９６穴マイクロタイタープレートにてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｘ（２２８８０１；ＢＤ）に対する８０００倍希釈したウサギ抗血清を、０．１％ｖ／ｖのＢｒｉｊ３５及び５％ＦＢＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で希釈した様々な濃度（１０、５０、１００、２００、４００、１０００μｇ／ｍｌ）での異なる抗原（合成ＭｅｎＸ４量体−ＴＴコンジュゲート及び合成ＭｅｎＸ４量体）と共に３７℃で１時間インキュベートした（プレートＡ）。別のプレート（プレートＢ）をＭｅｎＸ細菌多糖及びメチル化したヒト血清アルブミン（ｍ−ＨＳＡ）の混合物で被覆し、２〜８℃で一晩インキュベートした後、続いて５％ＦＢＳでブロックした。このプレートＢにプレートＡの抗毒素／抗原ミックスを加え、３７℃で１時間及び室温で１時間インキュベートした。０．１％Ｂｒｉｊ３５を含有するリン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７．４でプレートを洗浄した。ＰＢＳ、０．１％Ｂｒｉｊ３５及び５％ＦＢＳにおけるペルオキシダーゼ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体と共に室温で６０分間プレートをインキュベートした。プレートを再び洗浄し、酢酸ナトリウム緩衝液における１００μｌのペルオキシダーゼの基質、３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン−Ｈ_２Ｏ_２と共に室温で１０分間インキュベートした。２ＭのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ加えることによって反応を止めた。ＥＬＩＳＡリーダー（マイクロプレートリーダー）にて吸光度（Ａ_４５０）を記録した。結果を阻害（％）ｖ／ｓ濃度（μｇ／ｍｌ）としてプロットし、図４にて示した。

実施例１１：ＭｅｎＣオリゴマーコンジュゲートによるマウスの免疫
１μｇのオリゴマーＭｅｎＣコンジュゲートによって０、１４及び２８日目に８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜８週齢）の群を免疫した。免疫はすべて皮下経路を介して２００μｌのワクチン希釈液を投与することによって行った。陰性（ビヒクル）対照群には生理食塩水のみを使用し、ＭｅｎＣ細菌多糖のコンジュゲートを含有する多価の認可されたワクチンを陽性対照群を免疫するのに使用した。１４、２８及び３５日目に血清を採取した。間接ＥＬＩＳＡによって特異的な抗ＯＳＩｇＧ抗体の力価を概算した。表１４のように様々な合成ＭｅｎＣコンジュゲートを動物に投与した。
表１４：マウスモデルにて免疫原性を検討するための様々な（ＭｅｎＣ）_４コンジュゲート製剤

実施例１２：ＩｇＧＥＬＩＳＡによる合成ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲート及び合成ＭｅｎＣ−ＣＲＭコンジュゲートの抗原特性の決定
ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４における５μｇ／ｍｌのＰＳ及びｍ−ＨＳＡの混合物をウェル当たり１００μｌ加えることによってＭｅｎＣＰＳにより９６穴プレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．４）における５％ＦＢＳ溶液のウェル当たり２００μｌによって３７℃にて１時間ブロックした。各インキュベートのステップには３回のＰＢＳ緩衝液による洗浄が続いた。参照試料及び試験血清試料をＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｂｒｉｊ３５、５％ＦＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈し、被覆し且つブロックしたプレート（２００μｌ）に移し、２倍連続希釈した後、４℃で一晩インキュベートした。次いでウェル当たり１００μｌの１：１０００希釈したペルオキシダーゼ結合した抗マウスＩｇＧを加え、２５℃で１時間放置した。発色のためにウェル当たり１００μｌの基質、３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン−Ｈ_２Ｏ_２を加えた。２５℃で１０分間発色させた後、２ＭのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ加えることによって反応を止め、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍでＯＤを測定した。Ｃｏｍｂｉｓｔａｔソフトウエアを用いて各製剤について抗ＭｅｎＣ多糖ＩｇＧの濃度（ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌという点で）を評価し、幾何平均濃度（ＩｇＧのＧＭＣ）を図５ａにて示した。

実施例１３：合成の（ＭｅｎＣ）_４−ＴＴコンジュゲート及び（ＭｅｎＣ）_８−ＴＴコンジュゲートについての血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）
３７℃で５％ＣＯ_２にてヒツジ血液寒天プレート上でＮ.ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｃ細菌ストック（ＡＴＣＣ（登録商標）１３１０２（商標））を一晩増殖させた。単離したコロニーを取り出し、３７℃で５％ＣＯ_２にて別のヒツジ血液寒天プレートの表面上で４時間インキュベートした。１または２白金耳量の細菌を５ｍｌのアッセイ緩衝液（カルシウム及びマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液における５％ウシ血清アルブミン）に懸濁し、懸濁液の光学密度（ＯＤ_６５０）を０．１に合わせ、アッセイ緩衝液を用いてそれをさらに希釈してｍｌ当たり６〜１０×１０^４コロニー形成単位の作業希釈を達成した。品質管理（ＱＣ）血清試料及び試験血清試料を５６℃で３０分間熱非働化した。マイクロウェルプレートにて２０μｌの連続２倍希釈した試験血清を作業希釈での１０μｌの細菌及び１０μｌの幼若ウサギ補体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）と混合した。陰性対照については、別のウェルにて細菌を試験血清なしで幼若ウサギ補体と共に、及び試験血清と熱非働化した幼若ウサギ補体と共にインキュベートした。アッセイプレートを穏やかに叩くことによってウェルの内容物を混合し、３７℃で５％ＣＯ_２にて１時間プレートをインキュベートした。各ウェルからの１０μｌの試料を条痕プレート法によって血液寒天プレート上に載せた。３７℃で５％ＣＯ_２にて一晩、血液寒天プレートをインキュベートし、コロニーを数えた。各活性のある補体対照と比べて細菌の反応混合物とのインキュベートの後、ｍｌ当たりのコロニー形成単位で≧５０％の低下を示す最高の血清希釈をＳＢＡ力価と見なした。

６つの異なる試験を検討し、認可されたワクチンに比べてＭｅｎＣ４量体についてのＳＢＡ力価を評価したが、その結果を図５ｂに示す。ＭｅｎＣ８量体のＳＢＡ力価の評価について３つの試験を検討したが、その結果を図５ｃに示す。

免疫及び血清の殺菌アッセイは、本発明のＯＳ／ＰＲコンジュゲートが高いＩｇＧ抗体の総力価を生じることを明らかにしている。１μｇ用量で３回投与後のＯＳ／ＰＲコンジュゲートは髄膜炎Ｃオリゴ糖コンジュゲートについての免疫前力価よりも４倍を超えて１８倍までの高いＩｇＧ力価を示す。ＩｇＧ総力価はＭｅｎＣについて認可されたワクチンの力価に匹敵するまたはそれより高い。

機能的な抗体の力価（ＳＢＡ力価とも呼ばれる）はＭｅｎＣタンパク質コンジュゲートについて免疫前のＳＢＡ力価よりも常に４倍を超えて高く、認可されたワクチンの力価に匹敵するまたはそれより高い。

実施例１４：（ＭｅｎＸ）_４−ＴＴコンジュゲートによるマウスの免疫及びＥＬＩＳＡによるＩｇＧの測定
生理食塩水中で製剤化した１μｇ及び０．１μｇ（２００μｌ）の（ＭｅｎＸ）_４−ＴＴコンジュゲートによって皮下経路を介して０、１４及び２８日目に８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜８週齢）の群を免疫した。陰性対照群には生理食塩水のみを使用した。１４、２８及び３５日目に血清を採取した。ＭｅｎＸ群については市販のワクチンがないので、力価は陰性対照と比べた。試験には、２つの異なる用量（１μｇ及び０．１μｇ）及び２つの異なるロットのαＸＴＭ−ＴＴとβＸＴＭ−ＴＴコンジュゲートのロット１つの評価が含まれた。異なる（ＭｅｎＸ）_４コンジュゲート製剤を利用して図５ｄのようなマウスモデルにてその免疫原性を検討した。

特異的な抗ＯＳＩｇＧ抗体の力価をＥＬＩＳＡによって概算した。ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４における５μｇ／ｍｌのＰＳとｍ−ＨＳＡの混合物をウェル当たり１００μｌ加えることによって９６穴プレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を細菌ＭｅｎＸＰＳによって被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．４）における５％ＦＢＳ溶液のウェル当たり２００μｌで３７℃にて１時間ブロックした。各インキュベートのステップには３回のＰＢＳ緩衝液による洗浄が続いた。血清試料はすべてＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％Ｂｒｉｊ３５、５％ＦＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈し、被覆し且つブロックしたプレート（２００μｌ）に移し、２倍連続希釈した後、４℃で一晩インキュベートした。次いでウェル当たり１００μｌの１：１０００希釈したペルオキシダーゼ結合した抗マウスＩｇＧを加え、２５℃で１時間放置した。発色のためにウェル当たり１００μｌの基質、３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン−Ｈ_２Ｏ_２を加えた。２５℃で１０分間発色させた後、２ＭのＨ_２ＳＯ_４を５０μｌ加えることによって反応を止め、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍでＯＤを測定した。図５ｄにて示すようにＣｏｍｂｉｓｔａｔソフトウエアを用いて各製剤についてＩｇＧのＧＭＣを評価した。

実施例１５：合成（ＭｅｎＸ）_４−ＴＴコンジュゲートについての血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）
３７℃で５％ＣＯ_２にてヒツジ血液寒天プレート上でＮ.ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｘ細菌ストック（ＡＴＣＣ（登録商標）３５５６０）を一晩増殖させた。単離したコロニーを取り出し、３７℃で５％ＣＯ_２にて別のヒツジ血液寒天プレートの表面上で４時間インキュベートした。１または２白金耳量の細菌を５ｍｌのアッセイ緩衝液（カルシウム及びマグネシウムを伴ったハンクス平衡塩溶液における５％ウシ血清アルブミン）に懸濁し、懸濁液の光学密度（ＯＤ_６５０）を０．１に合わせ、アッセイ緩衝液を用いてそれをさらにｍｌ当たり６〜１０×１０^４コロニー形成単位の作業希釈に希釈した。品質管理（ＱＣ）血清試料及び試験血清試料を５６℃で３０分間熱非働化した。マイクロウェルプレートにて２０μｌの連続２倍希釈した試験血清を作業希釈での１０μｌの細菌及び１０μｌの幼若ウサギ補体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）と混合した。陰性対照については、別のウェルにて細菌を試験血清なしで幼若ウサギ補体と共に、及び試験血清と熱非働化した幼若ウサギ補体と共にインキュベートした。アッセイプレートを穏やかに叩くことによってウェルの内容物を混合し、３７℃で５％ＣＯ_２にて１時間プレートをインキュベートした。各ウェルからの１０μｌの試料を条痕プレート法によって血液寒天プレート上に載せた。３７℃で５％ＣＯ_２にて一晩、血液寒天プレートをインキュベートし、コロニーを数えた。各活性のある補体対照と比べて細菌の反応混合物とのインキュベートの後、ｍｌ当たりのコロニー形成単位で≧５０％の低下を示す最高の血清希釈をＳＢＡ力価と見なす。

陰性（ビヒクル）対照血清及びコンジュゲートしなかったＭｅｎＸ４量体に対して３つの異なるＭｅｎＸコンジュゲートを評価し、図５ｄのように結果を提示する。ＩｇＧ総力価及びＳＢＡ力価は、陰性（ビヒクル）対照よりも少なくとも４倍高く、陰性（ビヒクル）対照よりも総ＩｇＧという点では４５倍まで高く、３５０倍まで高いＳＢＡ力価である。

Claims (15)

1. 新規の合成オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートを得るための改善されたコンジュゲーション方法であって、
   （ａ）少なくとも１つの末端アミンリンカーを有する合成オリゴ糖を少なくとも１つの反応性チオール官能基を有する試薬と反応させて活性化されたオリゴ糖を得るステップと；
   （ｂ）キャリアタンパク質を少なくとも１つの脂肪族ヘテロ二官能性架橋剤と反応させて反応性マレイミド官能基を有する活性化されたキャリアタンパク質を得るステップと；
   （ｃ）ステップ（ａ）の前記活性化されたオリゴ糖と、ステップ（ｂ）の前記活性化されたキャリアタンパク質とのコンジュゲーション反応を行い、チオエーテル結合を有する合成オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲート（ＯＳ／ＰＲ）を得るステップとを含み、
   その際、
   コンジュゲーションの前記方法は１４時間〜２２時間の範囲内で完了し、
   前記方法は従来のコンジュゲートからの収率に対比してオリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートの高い収率を生じ、
   前記オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲートは機能的な抗体を含む有意に高い抗体力価を示す、前記改善されたコンジュゲーション方法。
2. 前記オリゴ糖が、
   少なくとも１つの内蔵末端アミノリンカーと
   多糖の４〜８の反復モノマー単位とを含んで成る合成オリゴ糖であり、
   そのように形成される前記オリゴ糖が、たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのようなグラム陰性細菌の天然の多糖類を模倣する請求項１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
3. 前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、Ｘを含んで成り、前記Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅがｂ型を含んで成る請求項２に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
4. 前記キャリアタンパク質が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ（破傷風トキソイド）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ＣＲＭ１９７）またはそれらの組換え型から選択されるグラム陽性細菌から得られる請求項２に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
5. 前記活性化されたオリゴ糖が
   （ａ）少なくとも１つの末端アミンリンカーを有する前記オリゴ糖を所定の条件で少なくとも１つのスルフヒドリル化剤と反応させてスルフヒドリル化されたオリゴ糖を得るステップと
   （ｂ）ステップ（ａ）の前記スルフヒドリル化されたオリゴ糖をゲル濾過クロマトグラフィに供して未反応のＳＡＴＡを取り除くステップと
   （ｃ）ステップ（ｂ）の前記スルフヒドリル化されたオリゴ糖を少なくとも１つの求核試薬と反応させて活性化されたオリゴ糖を得るステップとによって得られ、
   前記所定の条件が、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．５での２〜５倍、好ましくは２．５倍モル過剰のスルフヒドリル化剤の添加である請求項１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
6. 前記スルフヒドリル化剤が末端アミノリンカーのスルフヒドリル基への変換を促す化学的スルフヒドリル化剤であり、前記スルフヒドリル化剤が好ましくはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）である請求項１に記載のコンジュゲーションの改善された方法。
7. 前記求核試薬が、スルフヒドリル基の反応性チオール基への変換を促す還元剤の群、好ましくは塩酸ヒドロキシルアミンから選択される請求項５に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
8. 前記脂肪族ヘテロ二官能性架橋剤が反応性マレイミド官能基を生成する化学架橋剤であり、前記脂肪族ヘテロ二官能性架橋剤が好ましくは、Ｎ−（ベータ−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）である請求項１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
9. 前記方法が、４０％〜９０％の範囲での活性化されたオリゴ糖の回収を生じる請求項１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
10. 前記方法が、たとえば、ＭｅｎＸ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹのコンジュゲートのような髄膜炎菌コンジュゲートについて２１％〜４８％の範囲で、好ましくは２５％〜３０％の範囲で、及びＨｉｂコンジュゲートについては４５％〜６５％の範囲で、好ましくは５０％〜６０％の範囲で前記合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートの高い収率を生じる請求項１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
11. 前記方法が、１μｇ用量にて高いＩｇＧ抗体の総力価及びＳＢＡの力価を生じる請求項１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
12. 血清型Ｃオリゴ糖コンジュゲートについて前記ＩｇＧ総力価が免疫前の力価よりも４倍〜１８倍高く；
    血清型Ｃオリゴ糖コンジュゲートについて前記ＳＢＡ力価が免疫前のＳＢＡ力価よりも少なくとも４倍高い；
    ＭｅｎＸオリゴマー／ＴＴコンジュゲートについての前記ＩｇＧ総力価及びＳＢＡ力価が陰性（ビヒクル）対照よりも４倍高く、陰性（ビヒクル）対照よりも総ＩｇＧという点で４５倍まで高く、３５０倍まで高いＳＢＡ力価である請求項１１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
13. 前記方法が、窒素パージの非存在下で実施され、特定の取り扱い技能を必要としない試薬を使用し、それによって前記方法を好都合で費用効果の高いものにする請求項１に記載の改善されたコンジュゲーション方法。
14. 前記合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲートが特異的で且つ均質な免疫応答を引き出し、単一ワクチンにてまたは混合ワクチンとして、及び診断ツールとしても合成コンジュゲートワクチンの調製にて使用することができる請求項１に記載の方法から得られる新規の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲート。
15. 前記コンジュゲートが、０．１７〜０．５の範囲での、好ましくは０．２〜０．４の範囲でのＯＳ／ＰＲの比を有する請求項１４に記載の新規の合成ＯＳ／ＰＲコンジュゲート。

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