JP2017037059A - 樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法及び生存率の予測方法 - Google Patents

Abstract

【課題】樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法を提供する。【解決手段】多形性膠芽腫患者由来の検体サンプルを調整するサンプル調整工程と、検体サンプルにおけるバイオマーカーの発見量を測定し基本値を計算する検査工程と、基本値とプリセット閾値とを比較し、基本値がプリセット閾値より低い場合、多形性膠芽腫患者に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適すると判定する比較工程と、を備える樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。【選択図】図１

Description

本発明は、癌患者への免疫治療の適用の評価方法、及び癌患者の治療後の生存率を予測する方法に関し、特に、樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法及び生存率の予測方法に関する。

多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ；ＧＢＭ）とは、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）における星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）であり、ＷＨＯ分類でグレードＩＶの星細胞腫に属し、最もよく見られる悪性度が一番高い原発性脳腫瘍である。

多形性膠芽腫を治療する従来方法としては、手術、放射線療法や化学療法があるが、多形性膠芽腫の浸潤性（「浸潤性」とは、脳中の膠細胞が神経系における組成単位の１つとして、支持、栄養供給、環境恒定維持、絶縁等の機能を与える。）が非常に高いため、神経膠細胞が神経軸索をきつく被覆することになる。軸索が長いため、神経膠細胞が癌化すると、癌細胞は軸索に沿って遠く広がる。手術では、癌細胞の遠く浸潤される部分を切除できないため、術後に残留しやすく、術後に更に化学や放射によって補助的に治療する必要があるが、また、放射線耐性及び耐薬品性の癌幹細胞があるので、治療後の再発率がかなり高い。

近年、癌に対する診断治療では、一般的な検査や従来の臨床病期に加え、あるバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）も癌の診断や、補助治療方法の決定、患者の予後状況に対する予測に用いられる。例えば、乳がんの診断治療では、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＲ）及び上皮成長因子受容体２（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２；ＨＥＲ２）をバイオマーカーとする治療医薬品の選用が既に進んでいる。多形性膠芽腫の悪性度が高く、治療後の再発率及び死亡率が高いので、医師が個別の患者により適する治療計画を臨床的に制定して、治療後の生存率を向上させるために、多形性膠芽腫治療方法の反応率又は患者の治療後の生存率への予測に関連する方法を更に発展する必要がある。

これに鑑みて、本発明の一目的は、多形性膠芽腫患者の腫瘍組織又は末梢血単核細胞における特定なバイオマーカーの発見量を検査することで、医師が臨床的に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適する多形性膠芽腫患者を快速で客観的に識別でき、樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療では殆ど効果のない患者を排除して、医療資源の効果的な分配・利用を確保する、樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、多形性膠芽腫患者の腫瘍組織又は末梢血単核細胞における特定なバイオマーカーの発見量を検査することで、直接多形性膠芽腫患者の樹状細胞腫瘍ワクチンの治療後の生存率を予測して、医師が臨床的に患者に対して更に他の医薬品又は治療計画を組み合う必要があるかを判断して、その全生存期間又は無病生存期間を長める、生存率の予測方法を提供することにある。

本発明による一態様では、多形性膠芽腫患者由来の検体サンプルを調整するサンプル調整工程と、検体サンプルにおける、ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−Ｌ１タンパク質及びＣＤ８タンパク質からなる群から選ばれるバイオマーカーの発見量を測定し基本値を計算する検査工程と、基本値とプリセット閾値とを比較し、基本値がプリセット閾値より低い場合、樹状細胞腫瘍ワクチンが適すると判定する比較工程と、を備える樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法を提供する。

前記樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法によれば、検体サンプルは、多形性膠芽腫患者由来の腫瘍組織又は血液であってもよい。

前記樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法によれば、腫瘍組織は、組織切片又は組織マイクロアレイであってもよい。

前記樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法によれば、検査工程は、免疫組織化学染色法によってバイオマーカーの発見量を測定してもよい。

前記樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法によれば、検査工程は、組織化学採点法、又はＲＧＢ（ｒｅｄ／ｇｒｅｅｎ／ｂｌｕｅ）カラーモード、ＣＭＹＫ（ｃｙａｎ／ｍａｇｅｎｔａ／ｙｅｌｌｏｗ／ｋｅｙ）カラーモード又はＨＳＩ（ｈｕｅ／ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）カラーモードによって検体サンプルの画像を分析する画像処理法によって信号値を計算することを更に含む。

前記樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法によれば、検査工程は、ＰＤ−１タンパク質の信号値をＣＤ８タンパク質の信号値で割って、基本値を得ることを更に含む。

本発明の別の態様では、多形性膠芽腫患者由来の検体サンプルを調整するサンプル調整工程と、検体サンプルにおける、ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−Ｌ１タンパク質及びＣＤ８タンパク質からなる群から選ばれるバイオマーカーの発見量を測定し基本値を計算する検査工程と、基本値とプリセット閾値とを比較し、基本値がプリセット閾値より低い場合、優れた生存率を有することを示す比較工程と、を備える生存率の予測方法を提供する。

前記生存率の予測方法によれば、治療としては、手術治療、放射線治療、化学治療、免疫治療又はそれらの如何なる組合せから選ばれてもよい。

前記生存率の予測方法によれば、免疫治療は、樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療であってもよい。

前記生存率の予測方法によれば、検体サンプルは、多形性膠芽腫患者由来の腫瘍組織又は血液であってもよい。

前記生存率の予測方法によれば、腫瘍組織は、組織切片又は組織マイクロアレイであってもよい。

前記生存率の予測方法によれば、検査工程は、免疫組織化学染色法によってバイオマーカーの発見量を測定してもよい。

前記生存率の予測方法によれば、検査工程は、組織化学採点法、又はＲＧＢカラーモード、ＣＭＹＫカラーモード又はＨＳＩカラーモードによって組織切片の画像を分析する画像処理法によって信号値を計算する画像処理法を更に含む。

前記生存率の予測方法によれば、検査工程は、ＰＤ−１タンパク質の信号値をＣＤ８タンパク質の信号値で割って、基本値を得ることを更に含む。

本発明の説明は、本開示内容を基本的に理解させるように、本開示内容の簡略化された概要を提供する。この発明の内容は、本開示内容の完全な記述ではなく、また本発明実施例の重要な・肝心な素子を指摘し、又は本発明の範囲を限定するものではない。
下記添付図面の説明は、本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするためのものである。

本発明の一実施形態に係る樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法を示す工程流れ図である。 本発明の一実施形態に係る生存率の予測方法を示す工程流れ図である。 免疫組織化学染色法によって測定する顕微写真である（（Ａ）部分がＰＤ−１タンパク質、（Ｂ）部分がＰＤ−Ｌ１タンパク質、（Ｃ）部分がＣＤ８タンパク質である）。 ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の強さの顕微写真である（（Ａ）部分が正常脳組織のＰＤ−Ｌ１低発見量の顕微写真、（Ｂ）部分が多形性膠芽腫患者の脳組織のＰＤ−Ｌ１高発見量の顕微写真、（Ｃ）部分が色変換された後の正常脳組織のＰＤ−Ｌ１低発見量の顕微写真、（Ｄ）部分が色変換された後の多形性膠芽腫患者の脳組織のＰＤ−Ｌ１高発見量の顕微写真である）。 ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量に基づいて多形性膠芽腫患者をグループ化させた全生存期間グラフである（（Ａ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者の全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の全生存期間グラフである）。 ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量に基づいて多形性膠芽腫患者をグループ化させた無病生存率グラフである（（Ａ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者の無病生存率グラフ、（Ｂ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の無病生存率グラフである）。 多形性膠芽腫患者全体の生存率グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ図、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。 ＣＤ８タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。 ＰＤ−１タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。 ＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量ことに基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。 ＰＤ−１タンパク質発見量及びＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。 ＰＤ−１タンパク質と全生存期間との関連図である。 ＰＤ−１タンパク質と無病生存期間との関連図である。 ＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量と全生存期間との関連図である。 ＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量と無病生存期間との関連図である。 末梢血単核細胞のＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量と腫瘍浸潤リンパ球のＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量との関連図である。 末梢血単核細胞のＰＤ−１タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存期間グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。 末梢血単核細胞のＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存期間グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。

本発明の開示内容は、多形性膠芽腫患者に免疫治療が適するかを評価する方法、生存率の予測方法を提出する。組織切片を染色するように多形性膠芽腫患者の検体サンプルの特定なバイオマーカーの発見量を測定し、組織化学採点法又は画像処理法によって半定量分析を行い、多形性膠芽腫患者に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適するかを評価し、多形性膠芽腫患者の治療後の生存率を予測する。以下、本明細書に用いられる特定な名詞を説明する。

前記「バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」の用語とは、生物学的状態の指標とするものであり、客観的な測定又は評価によって正常な生物メカニズム、病原メカニズム又は治療中の反応の指標とすることができる。

前記「ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍ ｄｅａｔｈ−１、プログラム細胞死受容体−１）」は、表面抗原分化群２７９（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７９；ＣＤ２７９）と呼ばれ、ヒトの体内のＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面受容体に属し、Ｔ細胞及び原始Ｂ細胞に発現される。

前記「ＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １；プログラム細胞死−配体１）」は、表面抗原分化群２７４（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７４；ＣＤ２７４）又はＢ７同族体１（Ｂ７ ｈｏｍｏｌｏｇ １；Ｂ７−Ｈ１）とも呼ばれ、ヒトの体内のＣＤ２７４遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、サイズが４０ｋＤａである１型膜貫通タンパクであり、妊娠、組織移植、自己免疫疾患又は、例えば肝炎のような他の疾患等の特殊な場合で、免疫システムの抑制に関連すると推測される。免疫抑制性受容体の伝送によって、負の調節シグナルを伝送するように、免疫反応の一部を発生させないように抑制し、周辺システムの免疫寛容を維持し、ＰＤ−１が免疫抑制性受容体の１つである。正常な状況において、免疫システムは、リンパ節又は脾臓に集中する外来抗原に対して反応し、抗原特異性を持つ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ）を増殖させる。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１とが結合すると、抑制性の信号を伝導して、リンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を減少させることができる。ＰＤ−１は、更に、Ｂｃｌ−２遺伝子を調節することで、リンパ節における抗原特異性Ｔ細胞の集合を制御することができる。

前記「ＣＤ８（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８；表面抗原分化群８）」は、膜貫通糖タンパク質であり、ＣＤ８が細胞傷害性Ｔ細胞の細胞膜マーカーであり、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）の共受容体であり、主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）と結合し、且つＩ型ＭＨＣタンパク質に特異性的に対応する。

図１を参照されたい。図１は、本発明の一実施形態に係る樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法１００の工程流れ図である。図１において、樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法１００は、工程１１０と、工程１２０と、工程１３０と、を備える。

工程１１０は、多形性膠芽腫患者由来の検体サンプルを調整するサンプル調整工程を含むサンプリング工程を行う。検体サンプルとしては、腫瘍組織又は血液であってもよく、腫瘍組織としては、凍結組織切片、組織のパラフィン切片又は組織マイクロアレイであってもよい。

工程１２０は、検体サンプルにおけるバイオマーカーの発見量を測定し基本値を計算する検査工程を行う。より具体的には、検査工程では、免疫組織化学染色法によって検体サンプルのＰＤ−１タンパク質やＰＤ−Ｌ１タンパク質の発見量、及びＰＤ−１タンパク質のＣＤ８タンパク質に対する発見量を測定してから、組織化学採点法又は画像処理法によって半定量分析を行って信号値を計算する。ＰＤ−１タンパク質の発見量及びＰＤ−Ｌ１タンパク質の発見量を計算する場合、前記の信号値を基本値とするが、ＰＤ−１タンパク質のＣＤ８タンパク質に対する発見量を計算する場合、ＰＤ−１タンパク質発見量の信号値をＣＤ８タンパク質発見量で割った信号値を基本値とする。画像処理法としては、ＲＧＢ（ｒｅｄ／ｇｒｅｅｎ／ｂｌｕｅ）カラーモード、ＣＭＹＫ（ｃｙａｎ／ｍａｇｅｎｔａ／ｙｅｌｌｏｗ／ｋｅｙ）カラーモード又はＨＳＩ（ｈｕｅ／ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）カラーモードによって検体サンプルの画像を分析してもよい。

工程１３０は、基本値とプリセット閾値とを比較し、基本値がプリセット閾値より低い場合、多形性膠芽腫患者に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適すると判定する比較工程を行う。プリセット閾値を、検査工程における基本値に対する計算方法によって調整する。

また、図２を参照されたい。図２は、本発明の一実施形態に係る生存率の予測方法２００の工程流れ図である。図２において、生存率の予測方法２００は、工程２１０と、工程２２０と、工程２３０と、を備える。

工程２１０は、多形性膠芽腫患者由来の検体サンプルを調整するサンプル調整工程を含むサンプリング工程を行う。検体サンプルとしては、腫瘍組織又は血液であってもよく、腫瘍組織としては、凍結組織切片、組織のパラフィン切片又は組織マイクロアレイであってもよい。

工程２２０は、検体サンプルにおけるバイオマーカーの発見量を測定し基本値を計算する検査工程を行う。より具体的には、検査工程では、免疫組織化学染色法によって検体サンプルのＰＤ−１タンパク質やＰＤ−Ｌ１タンパク質の発見量、及びＰＤ−１タンパク質のＣＤ８タンパク質に対する発見量を測定してから、組織化学採点法又は画像処理法によって半定量分析を行って信号値を計算する。ＰＤ−１タンパク質の発見量及びＰＤ−Ｌ１タンパク質の発見量を計算する場合、前記の信号値を基本値とするが、ＰＤ−１タンパク質のＣＤ８タンパク質に対する発見量を計算する場合、ＰＤ−１タンパク質発見量の信号値をＣＤ８タンパク質発見量で割った信号値を基本値とする。画像処理法としては、ＲＧＢカラーモード、ＣＭＹＫカラーモード又はＨＳＩカラーモードによって検体サンプルの画像を分析してもよい。

工程２３０は、基本値とプリセット閾値とを比較し、基本値がプリセット閾値より低い場合、多形性膠芽腫患者が治療後に優れた生存率を有することを示す比較工程を行う。プリセット閾値を、検査工程における基本値に対する計算方法によって調整する。前記治療としては、手術治療、放射線治療、化学治療、免疫治療又はそれらの如何なる組合せから選ばれてもよい。好ましくは、免疫治療は、樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療であってもよい。

下記の具体的な試験例によって、当業者であれば過度に解読せずに本発明を完全的に利用し実践できるように、更に本発明を示範的に説明する。しかし、これらの試験例は、本発明を限定するものと見なすはずではなく、本発明の材料及び方法を如何に実施するかを説明するためのものである。

＜試験例＞
一、多形性膠芽腫患者
この臨床試験計画は、中国医薬大学及び付属病院研究倫理委員会（Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたものであり、被験者が多形性膠芽腫患者であり、患者の状況を十年間追跡した。

２７〜７８歳（平均的に５０．９７歳）の年齢範囲にある、合計で３５人の多形性膠芽腫患者が２００５〜２０１４年間に本臨床試験計画に参与した。下記表１を参照されたい。表１は、多形性膠芽腫患者の臨床兆候であり、変数が性別、年齢及び治療形態に分けられ、治療形態が更に放射線治療、化学治療、手術治療、併用化学、放射線治療及び免疫治療に分けられる。性別を変数とする場合、３５人の多形性膠芽腫患者に１７人が男性であり、１８人が女性であるが、年齢を変数とする場合、８人の患者の年齢が６０歳以上であり、２７人の患者の年齢が６０歳未満である。治療形態の部分において、３５人の多形性膠芽腫患者に、２６人が放射線治療を、２３人が化学治療を、１０人が手術治療を、１４人が併用化学及び放射線治療を、２１人が免疫治療を受けたことがある。

二、免疫組織化学染色法によるバイオマーカーのタンパク質発見量の測定
１．検体サンプルが腫瘍組織である
実験上、従来の病理切片の方式により前記多形性膠芽腫患者の腫瘍組織を検体サンプルとして取り、検体サンプルが凍結組織切片、パラフィン組織切片又は組織マイクロアレイであってもよく、後で、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）により得られた検体サンプルにおけるバイオマーカーＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ８の発見を検査した。

免疫組織化学染色法の工程は以下の通りであり、パラフィン組織である場合、まず厚さが１〜２μｍのパラフィン組織切片サンプルを有機シランに覆われたスライドの上に置き、一晩ベーキング（５０〜５５℃）し、パラフィンを溶解させスライドと組織検体との付着力を強めて、後の免疫組織化学染色に寄与する。それから、まず脱ロウを行い、組織及び細胞間隙におけるパラフィンを除去してから、また免疫組織化学染色を行った。凍結切片組織である場合、厚さが２〜４μｍの凍結切片に対して直接免疫組織化学染色を行った。免疫組織化学染色法に使用される一次抗体は、それぞれＰＤ−１（Ｌｅｉｃａ）、ＰＤ−Ｌ１（Ａｂｃａｍ）及びＣＤ８（Ｌｅｉｃａ）であり、希釈倍数がそれぞれ１：２００、１：１００及び１：１００であり、まず組織切片をＥＤＴＡ 緩衝溶液により１００℃で２０分間反応させて抗原回復を行い、室温で一次抗体と１時間反応させた。またＤＡＢ二次抗体（検査ＰＤ−Ｌ１）又はＡＰ二次抗体（検査ＰＤ−１及びＣＤ８）により染色結果を検査した。すべてのサンプルに対しては、検査後にまたヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）により対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）を行った。

図３を参照されたい。図３は、免疫組織化学染色法によって測定する顕微写真であり、（Ａ）部分がＰＤ−１タンパク質、（Ｂ）部分がＰＤ−Ｌ１タンパク質、（Ｃ）部分がＣＤ８タンパク質であり、顕微写真の拡大倍率は何れも４００倍である。図３から分かるように、多形性膠芽腫患者の脳組織切片は染色された後で、細胞核の部分が青色を呈し、ＰＤ−Ｌ１が発現された部分がブラックブラウンを呈し、ＰＤ−１及びＣＤ８が発現された部分が赤色を呈する。

２． 検体サンプルが血液である
実験上、前記多形性膠芽腫患者に対して採血を行って、検体サンプルとしてその血液を取り、血液検体サンプルを細胞ブロック（ｃｅｌｌ ｂｌｏｃｋ）にした後で、免疫組織化学染色法により得られた検体サンプルにおけるバイオマーカーＰＤ−１及びＣＤ８の発見を検査した。

細胞ブロックの製造工程は、下記の通りである。患者の血液検体サンプルを室温でマイクロチューブに置いて、ホルマリンで１時間固定させた。また血液検体サンプルを１５０００ｒｐｍの遠心力で３０秒間遠心させた後で、ホルマリンにより固定された後の細胞沈澱を保留するように、上澄みを注意深く除去した。室温で最小体積の３％（ｗ/ｖ）の超低凝固温度の寒天液で再び細胞沈澱を懸濁させ、また１５０００ｒｐｍの遠心力で３０秒間遠心させた。上澄みを注意深く除去し、得られた寒天細胞の懸濁液を−２０℃で１０〜２０分間凝固させた。凝固した寒天細胞をマイクロチューブのカバーに転移して、また寒天細胞の入れたカバーを３％（ｗ/ｖ）の基準寒天液で十分に満たした。得られた寒天ゲルブロックをカバーから取って、パラフィンで埋め込んで組織処理を行って、細胞ブロックを得た。

前記細胞ブロックに対して免疫組織化学染色法を行い、免疫組織化学染色法に使用される一次抗体は、それぞれＰＤ−１（Ｌｅｉｃａ）及びＣＤ８（Ｌｅｉｃａ）であり、希釈倍数がそれぞれ１:２００及び１:１００であり、まず細胞ブロックをＥＤＴＡ緩衝溶液により１００℃で２０分間反応させて抗原回復を行い、室温で一次抗体と１時間反応させた。またＡＰ二次抗体により染色結果を検査した。すべてのサンプルに対しては、検査後にまたヘマトキシリンにより対比染色を行った。

三、結果分析
１．多形性膠芽腫組織切片の診断
通常、特定な細胞類別を鑑定することではなく、組織の様式により、組織病理学における多形性膠芽腫の診断を行った。未分化性が高い神経膠細胞、有糸分裂活性並びに血管増殖及び／又は壊死の存在は、多形性膠芽腫の診断に必要なものである。多形性膠芽腫を診断するために、小未分化細胞（ｓｍａｌｌ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＳＡＣ）、小線維細胞（ｓｍａｌｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ；ＳＦＣ）、線維化星状膠細胞（ｆｉｂｒｉｌｌａｔｅｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ；ＦＡ）、多形性星状細胞（ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ；ＰＡ）、原形質性星状膠細胞（ｇｅｍｉｓｔｏｃｙｔｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ；ＧＡ）及び大多形性細胞（ｌａｒｇｅ ｂｉｚａｒｒｅ ｃｅｌｌ；ＬＢＣ）の６種の異なる細胞類型を定義する。且つ免疫組織化学染色切片において、繊維状様式及び膜状様式の２種類のＰＤ−Ｌ１染色の組織様式が見られる。

下記表２を参照されたい。本臨床試験計画における３５人の多形性膠芽腫患者の免疫組織化学染色切片の診断結果であり、免疫組織化学染色切片の診断を行う場合、病理医師は、切片の元の診断の状況を知らずに切片を観察した。表２の診断結果に示すように、３５人の本臨床試験計画に関与する患者は、確実に多形性膠芽腫患者であった。

前記３５人の多形性膠芽腫患者の免疫組織化学染色検査の結果は、組織化学採点法又は画像処理法によって更に半定量分析を行ってもよい。

２．１．組織化学採点法
２．１．１．ＰＤ−Ｌ１
組織化学採点法は、２５ＨＰＦ（Ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ；高倍率視野）で（顕微鏡の拡大倍率は４００倍であり）、多形性膠芽腫細胞膜のＰＤ−Ｌ１タンパク質染色の強度により、０、１又は２と評点した。評点の原始の具体的な標準は、以下の通りである。０は、いかなる腫瘍細胞が染色されないことを示し、１は、腫瘍細胞の細胞膜又は細胞質が弱く又は中等程度且つ完全的に染色されることを示し、２は、腫瘍細胞の細胞膜又は細胞質が強く完全的に染色されることを示す。腫瘍細胞が染色されるパーセンテージ（染色される細胞数／すべての細胞数×１００％）を計算した。組織化学採点法は、下記の式１により信号値（ＨＳＣＯＲＥ）が得られた。
ｉは、バイオマーカーの染色の強度（０、１又は２）を示し、Ｐｉは、腫瘍細胞が染色されるパーセンテージ（０％〜１００％）を示し、得られる信号値が０〜２００にある。組織化学採点法においてプリセット閾値が８０であり、組織化学採点法による信号値が８０以上となる場合、ＰＤ−Ｌ１高発見量と定義される。組織化学採点法による信号値が８０未満となる場合、ＰＤ−Ｌ１低発見量と定義される。

２．１．２．ＰＤ−１及びＣＤ８
ＰＤ−１及びＣＤ８の組織化学採点法は、２５ＨＰＦで（顕微鏡の拡大倍率が４００倍であり）、染色された細胞数を計算し、２５ＨＰＦで得られた細胞数をプラス合計してから信号値が得られ、すべての樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者（ｎ＝２１）の免疫化学組織切片を組織化学採点法により計算してから、プリセット閾値である中央値が得られ、組織化学採点法による信号値が中央値以上となる場合、高いバイオマーカー発見量と定義される。組織化学採点法による信号値が中央値未満となる場合、低いバイオマーカー発見量と定義される。

下記表３を参照されたい。表３は、それぞれ組織化学採点法によりすべての樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者のＣＤ８タンパク質及びＰＤ−１タンパク質が発見される細胞数を計算し、そしてＰＤ−１タンパク質発見量をＣＤ８タンパク質発見量（ＰＤ−１／ＣＤ８比）の統計で割って、ＣＤ８の中央値が２３１、ＰＤ−１の中央値が２６、ＰＤ−１／ＣＤ８比の中央値が０．１３であることが明らかであり、組織化学採点法により計算されたＣＤ８タンパク質の信号値が２３１以上となる場合、高いＣＤ８発見量と定義される。組織化学採点法による信号値が２３１未満となる場合、低いＣＤ８発見量と定義される。組織化学採点法により計算されたＰＤ−１タンパク質の信号値が２６以上となる場合、高いＰＤ−１発見量と定義される。組織化学採点法による信号値が２６未満となる場合、低いＰＤ−１発見量と定義される。組織化学採点法により計算されたＰＤ−１／ＣＤ８比が０．１３以上となる場合、高いＰＤ−１／ＣＤ８比と定義される。組織化学採点法による信号値が０．１３未満となる場合、低いＰＤ−１／ＣＤ８比と定義される。

２．２．画像処理法
組織化学採点法によりＰＤ−Ｌ１発見量を定義することができるが、人力で画像分析を行うことで、ＰＤ−Ｌ１発見量を定義するには時間がかかり又はヒトの判読による誤りが発生し、更に細胞の染色程度が定量化し難く、ヒトにより主観的に染色の強度を判断できるほかないため、本発明において画像処理法によってＰＤ−Ｌ１タンパク質の発見量の半定量を行って、ＰＤ−Ｌ１高発見量及びＰＤ−Ｌ１低発見量を定義する時により客観的にする。

本試験例はＲＧＢ（ｒｅｄ／ｇｒｅｅｎ／ｂｌｕｅ）カラーモードによって色空間を転換させ、カラーの画像で必要な物体の特徴を強調した。実験上、まず２５ＨＰＦで（顕微鏡の拡大倍率が４００倍であり）顕微画像をキャプチャし、染色の強度を計算する時に、顕微画像をＲＧＢデジタルから赤チャンネル（ｒｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ）に転換させ、この時にＲＧＢ数値が得られた。画像処理法においてプリセット閾値が２５０００であり、画像処理法によって計算されたＲＧＢ数値が２５０００以上となる場合、ＰＤ−Ｌ１高発見量と定義される。画像処理法によって計算されたＲＧＢ数値が２５０００未満となる場合、ＰＤ−Ｌ１低発見量と定義される。画像は、本試験例においてＲＧＢカラーモードを例示として、注意すべきなのは、前記ＲＧＢカラーモードは単なる画像処理法のカラーモードの一実施形態であり、本発明はこれに限定されなく、ＣＭＹＫ（ｃｙａｎ／ｍａｇｅｎｔａ／ｙｅｌｌｏｗ／ｋｅｙ）カラーモード又はＨＳＩ（ｈｕｅ／ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）カラーモードによって画像処理を行ってもよい。

図４を参照されたい。図４は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の強さの顕微写真であり、（Ａ）部分が正常脳組織のＰＤ−Ｌ１低発見量の顕微写真、（Ｂ）部分が多形性膠芽腫患者の脳組織のＰＤ−Ｌ１高発見量の顕微写真、（Ｃ）部分が色変換された後の正常脳組織のＰＤ−Ｌ１低発見量の顕微写真、（Ｄ）部分が色変換された後の多形性膠芽腫患者の脳組織のＰＤ−Ｌ１高発見量の顕微写真である。緑の十字は、細胞核の部分であり、顕微写真における細胞数を示し、赤色は細胞のＰＤ−Ｌ１が染められる部分である。図４の結果から分かるように、（Ａ）及び（Ｂ）部分の顕微写真で計算された細胞数が２６０であり、ＲＧＢ数値が３９３８であり、信号値が２５０００未満となるため、ＰＤ−Ｌ１低発見量と定義される。（Ｃ）及び（Ｄ）部分の顕微写真で計算された細胞数が３０７であり、ＲＧＢ数値が７５３４７であり、信号値が２５０００を超えるため、ＰＤ−Ｌ１高発見量と定義される。

３．検体サンプルが腫瘍組織である場合の統計分析
３．１．生存率の分析
上記半定量方法によれば、３５人の多形性膠細胞瘤患者は、バイオマーカーの発見量により高バイオマーカー発見量及び低バイオマーカー発見量の患者に分けられ、評価に使用される検体サンプルは患者の腫瘍組織であった。また更にＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ４．０５（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＣＡ；ＵＳＡ）及びＳＡＳ ９．０１により統計分析を行った。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒの方法により生存期（ｓｕｒｖｉｖａｌ）を計算し、ログランク検定（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）方法により生存期の統計上の顕著性を評価した。すべての統計分析において、ｐ値が０．０５未満となる場合、それが顕著性を有すると認められる。

生存率分析（ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、各種類の癌臨床試験によくある統計分析方法であり、時間変数を処理する統計方法であり、観察開始から「イベント（ｅｖｅｎｔ）」の発生までかかる「時間長」を処理するデータである。本試験例で、それぞれ全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＯＳ）及び無病生存期間（Ｄｉｓｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ；ＤＦＳ）の２つの時間変数評価指標を用いた。全生存期間の評価指標は、「死亡」をイベントとし、被験者が臨床試験に入ることから死亡になるまでの時間を観察し、無病生存期間の評価指標は、「腫瘍再発」をイベントとし、被験者が臨床試験に入ることから腫瘍再発になるまでの時間を観察した。

図５〜図１１を参照されたい。図５は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量に基づいて多形性膠芽腫患者をグループ化させた全生存期間グラフ図であり、（Ａ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者の全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の全生存期間グラフである。図６ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量に基づいて多形性膠芽腫患者をグループ化させた無病生存率グラフであり、（Ａ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者の無病生存率グラフ、（Ｂ）部分が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の無病生存率グラフである。

図７は、すべての多形性膠芽腫患者の生存率グラフであり、（Ａ）部分が全生存期間グラフ図、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである。図８は、ＣＤ８タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフであり、（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである。図９は、ＰＤ−１タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフであり、（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである。

図１０は、ＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量によるものに基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフであり、（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである。図１１は、ＰＤ−１タンパク質発見量及びＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存率グラフであり、（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである。樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者の人数が１４人であり、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の人数が２１人であり、すべての多形性膠芽腫患者の人数が３５人であり、図面に示す中空ドットは、制限データが発生する時間点を標示した。

図５の結果から分かるように、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者又は樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者を問わず、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量患者の全生存期間時間は、高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量患者よりも長い。ログランク検定方法により評価すれば、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者のグループにおいて、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量及び高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の２組のｐ値が０．１８４であるが、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者のグループにおいて、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量及び高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の２組のｐ値が０．１３８であった。

図６の結果から分かるように、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者又は樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者を問わず、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量患者は、高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量患者よりも腫瘍再発の発生時間が長い。ログランク検定方法により評価すれば、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者のグループにおいて、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量及び高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の２組のｐ値が０．７７１であった。樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者のグループにおいて、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量及び高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の２組のｐ値が０．７４３であった。

図７において合計で４つのグループがあり、グループ１が低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量且つ樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者であり、グループ２が高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量且つ樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者であり、グループ３が低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量且つ樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者であり、グループ４が高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量且つ樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者である。

図７（Ａ）の結果から分かるように、グループ１及びグループ２の樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者は、グループ３及びグループ４樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者よりも全生存期間時間が長いが、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けるかを問わず、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の多形性膠芽腫患者の全生存期間時間の何れも高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の多形性膠芽腫患者よりも長い。ログランク検定方法により評価して、４つのグループのｐ値が０．００１未満となり、グループ３及びグループ１の２組のｐ値が０．００１未満となり、グループ４及びグループ２の２組のｐ値が０．００１未満となり、グループ３及びグループ２の２組のｐ値が０．００１未満となる。

図７（Ｂ）の結果から分かるように、グループ１及びグループ２の樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者は、無病生存率時間の何れもグループ３及びグループ４樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けない多形性膠芽腫患者よりも長いが、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けるかを問わず、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の多形性膠芽腫患者の無病生存率時間の何れも高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の多形性膠芽腫患者よりも長い。ログランク検定方法により評価して、４つのグループのｐ値が０．００４に等しく、グループ３及びグループ１の２組のｐ値が０．０１６に等しく、グループ４及びグループ２の２組のｐ値が０．０２０に等しく、グループ３及びグループ２の２組のｐ値が０．０４８に等しい。

図８の結果から分かるように、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者において、低ＣＤ８タンパク質発見量及び高ＣＤ８タンパク質発見量の患者は、全生存期間又は無病生存期間でも差異が無く、低ＣＤ８タンパク質発見量及び高ＣＤ８タンパク質発見量の２組は全生存期間におけるｐ値が０．７３４であり、無病生存期間におけるｐ値が０．７９２である。

図９の結果から分かるように、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者において、低いＰＤ−１タンパク質発見量及び高いＰＤ−１タンパク質発見量の患者は、全生存期間の面で顕著な差異があり、ｐ値が０．００４であり、無病生存期間の面でも顕著な差異があり、ｐ値が０．１４６である。

図１０の結果から分かるように、ＰＤ−１タンパク質発見量をＣＤ８タンパク質発見量（ＰＤ−１／ＣＤ８比）で割ることによるものを基準とする場合、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者において、低いＰＤ−１／ＣＤ８比の患者は、高いＰＤ−１／ＣＤ８比の患者よりも全生存期間が著しく長く、ｐ値が０．００６であった。無病生存期間の面では、低いＰＤ−１／ＣＤ８比の患者も高いＰＤ−１／ＣＤ８比の患者よりも長く、ｐ値が０．１５８であった。

別に図１１から、ＰＤ−１タンパク質発見量及びＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の各々の、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の全生存期間及び無病生存期への影響を同時に観察した。図１１において合計で４つのグループがあり、グループ５が低いＰＤ−１タンパク質発見量且つ低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者であり、グループ６が高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量且つ低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者であり、グループ７が低いＰＤ−１タンパク質発見量且つ高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者であり、グループ８が高いＰＤ−１タンパク質発見量且つ高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者である。

図１１（Ａ）の結果から分かるように、全生存期間が一番長いグループは低いＰＤ−１タンパク質発見量且つ低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者（グループ５）である。ＰＤ−１の発見量から見て、グループ５及びグループ７の低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者は、グループ６及びグループ８の高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者よりも全生存期間時間が長い。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１の発見量から見て、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量のグループにおいて（グループ５及びグループ６）、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量且つ高いＰＤ−１タンパク質発見量のグループ６は、逆に高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量且つ低いＰＤ−１タンパク質発見量のグループ７よりも全生存期間が短くなって、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者にとって、ＰＤ−１タンパク質の発見量がＰＤ−Ｌ１タンパク質の発見量よりも重要となることが明らかである。ログランク検定方法により評価して、４つのグループのｐ値が０．００７に等しく、グループ５及びグループ６の２組のｐ値が０．０４６に等しく、グループ５及びグループ７の２組のｐ値が０．８５１に等しく、グループ５及びグループ８の２組のｐ値が０．０１８に等しく、グループ６及びグループ７の２組のｐ値が０．３１７に等しく、グループ６及びグループ８の２組のｐ値が０．１４２に等しく、グループ７及びグループ８の２組のｐ値が０．１２９に等しい。

図１１（Ｂ）の結果から分かるように、無病生存期が一番長いグループは低いＰＤ−１タンパク質発見量且つ低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者（グループ５）である。しかしながら、無病生存期分析から見て、各組の間の差異が大きくなく、グループ５及びグループ７の低いＰＤ−１タンパク質発見量の患者の無病生存率時間は、グループ６及びグループ８の高いＰＤ−１タンパク質発見量の患者よりも長く、差異が大きくない。ログランク検定方法により評価して、４つのグループのｐ値が０．３４１に等しく、グループ５及びグループ６の２組のｐ値が０．８０９に等しく、グループ５及びグループ７の２組のｐ値が０．３８８に等しく、グループ５及びグループ８の２組のｐ値が０．２７４に等しく、グループ６及びグループ７の２組のｐ値が０．３１７に等しく、グループ６及びグループ８の２組のｐ値が０．３３０に等しく、グループ７及びグループ８の２組のｐ値が０．１２９に等しい。

生存分析の結果から分かるように、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者又は他の治療を受けた多形性膠芽腫患者を問わず、低いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者は、高いＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量の患者よりも全生存期間と無病生存期間との何れも長く、且つこの差異が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者においてより顕著となる。ＰＤ−Ｌ１発見量が低い多形性膠芽腫患者に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適し、且つその治療後の生存率が優れた。また、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者において、低いＰＤ−１タンパク質発見量の患者は、高いＰＤ−１タンパク質発見量の患者よりも全生存期間と無病生存期間との何れも長く、また、低いＰＤ−１／ＣＤ８比の患者も、高いＰＤ−１／ＣＤ８比の患者よりも全生存期間及び無病生存期間が長い。ＰＤ−１発見量が低い多形性膠芽腫患者、又はＰＤ−１／ＣＤ８比が低い多形性膠芽腫患者に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適し、且つその治療後の生存率が優れ、特に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療を受けた場合を指す。

３．２．処理効果の評価分析
ログランク検定方法により単なる異なるグループの間の差異の顕著性を判断できるが、処理効果（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔ）の見積もりを提供できなく、本試験例は更にＣｏｘ比例ハザードモデル（Ｃｏｘ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄ ｍｏｄｅｌ）により処理効果を評価した。

表４を参照されたい。表４は、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者のハザード比（ｈａｚａｒｄ ｒａｔｉｏ）の見積もり及び９５％信頼区間である。ハザード比が１を超える場合、このバイオマーカーが発見される患者の死亡イベントの発生比率は、このバイオマーカーが発見されない患者よりも大きいことを示し、ハザード比が１を超え、ｐ値が０．０５未満となり且つ９５％信頼区間が１未満となる場合、このバイオマーカーの発見が統計上の顕著な差異に達すことを示す。表４の結果から分かるように、統計上に顕著な意義を有するのはＰＤ−１が全生存期間における影響であり、高いＰＤ−１タンパク質発見量患者の死亡イベントの発生比率は低いＰＤ−１タンパク質発見量患者の４．７２倍であり、ＰＤ−１タンパク質発見量が樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の全生存期間に対して重要な影響がある。

３．３．関連係数の分析
本試験例は、更にピアソン関連係数（Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）により、それぞれ樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者のＰＤ−１タンパク質発見量と全生存期間の関連性、ＰＤ−１タンパク質発見量と無病生存期間の関連性、ＰＤ−１／ＣＤ８比と全生存期間の関連性及びＰＤ−１／ＣＤ８比と無病生存期間の関連性を分析した。ピアソン関連係数は２つの連続変数（ｘ，ｙ）の間の直線関係の強さの測量に用いられ、計算されたピアソン関連係数（ｒ）は−１〜＋１の間に介在し、ｒが０を超える場合、２つの変数が正の関連関係を有し、即ちｘの増加につれて、ｙも伴って逓増した。ｒが０未満となる場合、２つの変数が負の関連関係を有し、即ちｘの増加につれて、ｙが伴って逓減した。２つの変数の間の関連程度が｜ｒ｜により決められ、｜ｒ｜が約１である場合、２つの変数が完全的に関連することを示す。｜ｒ｜が０．７〜０．９９にある場合、２つの変数が高く関連することを示す。｜ｒ｜が０．４〜０．６９にある場合、２つの変数が中程度に関連することを示す。｜ｒ｜が０．１〜０．３９にある場合、２つの変数が低程度に関連することを示す。｜ｒ｜が０．０１〜０．０９にある場合、２つの変数が関連しないことに近似していることを示す。｜ｒ｜が０にほぼ等しい場合、２つの変数が関連しないことを示す。

図１２〜図１５及び表５〜表８を参照されたい。図１２は、ＰＤ−１タンパク質と全生存期間との関連図であり、表５は、ＰＤ−１タンパク質及び全生存期間の関連係数である。図１３は、ＰＤ−１タンパク質と無病生存期間との関連図であり、表６は、ＰＤ−１タンパク質と無病生存期間との関連係数である。図１４は、ＰＤ−１／ＣＤ８比と全生存期間との関連図であり、表７は、ＰＤ−１／ＣＤ８比及び全生存期間の関連係数である。図１５は、ＰＤ−１／ＣＤ８比と無病生存期間との関連図であり、表８は、ＰＤ−１／ＣＤ８比と無病生存期間との関連係数である。

図１２及び表５の結果から分かるように、ＰＤ−１及び全生存期間は負の関連関係となり、且つそのピアソン関連係数が−０．４４６であり統計上の顕著な関連性に達する。図１３及び表６の結果から分かるように、ＰＤ−１及び無病生存期間は負の関連関係となり、そのピアソン関連係数が−０．３３８であり、ＰＤ−１及び全生存期間が低く関連することを示す。図１４及び表７の結果から分かるように、ＰＤ−１／ＣＤ８比及び全生存期間は、負の関連関係となり、且つそのピアソン関連係数が−０．６７７であり統計上の顕著な関連性に達する。図１５及び表８の結果から分かるように、ＰＤ−１／ＣＤ８比及び無病生存期間は負の関連関係となり、そのピアソン関連係数が−０．３７７であり、ＰＤ−１／ＣＤ８比及び無病生存期間が低く関連することを示す。

関連係数分析の結果から分かるように、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者のＰＤ−１タンパク質発見量が低ければ低いほど、その全生存期間及び無病生存期間が長くなり、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者のＰＤ−１／ＣＤ８比が低ければ低いほど、その全生存期間及び無病生存期間も長くなる。ＰＤ−１発見量が低い多形性膠芽腫患者、又はＰＤ−１／ＣＤ８比が低い多形性膠芽腫患者に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適し、且つその治療後の生存率が優れ、特に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療を受けた場合を指す。

４．検体サンプルが血液である場合の統計分析
４．１．関連係数の分析
下記表９を参照されたい。表９は、それぞれ組織化学採点法により、１３人の樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）を計算し、ＣＤ８タンパク質及びＰＤ−１タンパク質が発見される細胞数、及びＰＤ−１タンパク質発見量／ＣＤ８タンパク質発見量（ＰＤ−１/ＣＤ８比）を統計した。

ＰＤ−１及びＣＤ８の組織化学採点法は、２５ＨＰＦで（顕微鏡の拡大倍率は４００倍であり）、染色された細胞数を計算し、２５ＨＰＦで得られた細胞数をプラス合計してから信号値が得られ、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者（ｎ=１３）の細胞ブロックを組織化学採点法により計算してから、プリセット閾値である中央値が得られ、組織化学採点法による信号値が中央値以上となる場合、高いバイオマーカー発見量と定義される。組織化学採点法による信号値が中央値未満となる場合、低いバイオマーカー発見量と定義される。ＣＤ８の中央値が２３１、ＰＤ−１の中央値が２６、ＰＤ−１/ＣＤ８比の中央値が０．１３であるため、組織化学採点法により計算されたＣＤ８タンパク質の信号値が２３１以上となる場合、高いＣＤ８発見量と定義される。組織化学採点法による信号値が２３１未満となる場合、低いＣＤ８発見量と定義される。組織化学採点法により計算されたＰＤ−１タンパク質の信号値が２６以上となる場合、高いＰＤ−１発見量と定義される。組織化学採点法による信号値が２６未満となる場合、低いＰＤ−１発見量と定義される。組織化学採点法により計算されたＰＤ−１/ＣＤ８比が０．１３以上となる場合、高いＰＤ−１/ＣＤ８比と定義される。組織化学採点法による信号値が０．１３未満となる場合、低いＰＤ−１/ＣＤ８比と定義される。

本試験例は、更にピアソン関連係数により、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者の末梢血単核細胞のＰＤ−１/ＣＤ８比と腫瘍浸潤リンパ球のＰＤ−１/ＣＤ８比との関連性を分析した。図１６及び表１０を参照されたい。図１６は、末梢血単核細胞のＰＤ−１/ＣＤ８比と腫瘍浸潤リンパ球のＰＤ−１/ＣＤ８比との関連図である。表１０は、末梢血単核細胞のＰＤ−１/ＣＤ８比と腫瘍浸潤リンパ球のＰＤ−１/ＣＤ８比との関連係数である。

図１６及び表１０の結果から分かるように、末梢血単核細胞のＰＤ−１/ＣＤ８比と腫瘍浸潤リンパ球のＰＤ−１/ＣＤ８比とが正の関連関係を有し、そのピアソン関連係数が０．７５２であるので、末梢血単核細胞のＰＤ−１/ＣＤ８比と腫瘍浸潤リンパ球のＰＤ−１/ＣＤ８比とが高い関連性となることが明らかになり、本発明の樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法及び生存率の予測方法によれば、患者の腫瘍組織を取得せずに、多形性膠芽腫患者の血液検体サンプルだけで評価することができることが証明された。

４．２．生存分析
上記半定量方法によれば、１３人の樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性??細胞瘤患者は、バイオマーカーの発見量により高バイオマーカー発見量及び低バイオマーカー発見量の患者に分けられ、評価に使用される検体サンプルは患者の血液であった。また更にＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ ４．０５ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ＣＡ；ＵＳＡ）及びＳＡＳ ９．０１により統計分析を行った。Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒの方法により生存期（ｓｕｒｖｉｖａｌ）を計算し、ログランク検定（ｌｏｇ ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）方法により生存期の統計上の顕著性を評価した。すべての統計分析において、ｐ値が０．０５未満となる場合、それが顕著性を有すると認められる。

図１７及び図１８を参照されたい。図１７は、末梢血単核細胞のＰＤ−１タンパク質発見量に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存期間グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。図１８は、末梢血単核細胞のＰＤ−１/ＣＤ８比に基づいて、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者をグループ化させた生存期間グラフである（（Ａ）部分が全生存期間グラフ、（Ｂ）部分が無病生存率グラフである）。

図１７の結果から分かるように、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者において、低いＰＤ−１タンパク質発見量及び高いＰＤ−１タンパク質発見量の患者は、全生存期間の面で顕著な差異があり、ｐ値が０．０１４であり、無病生存期間の面でも顕著な差異があり、ｐ値が０．２３２であった。

図１８の結果から分かるように、ＰＤ−１/ＣＤ８比を基準とする場合、樹状細胞腫瘍ワクチン治療を受けた多形性膠芽腫患者において、低いＰＤ−１/ＣＤ８比の患者は、高いＰＤ−１/ＣＤ８比の患者よりも全生存期間がが著しく長く、ｐ値が０．０１９であった。無病生存期間の面では、低いＰＤ−１/ＣＤ８比の患者も高いＰＤ−１/ＣＤ８比の患者よりも長く、ｐ値が０．０２４であった。

図１７及び図１８の結果から分かるように、多形性膠芽腫患者の血液を検体サンプルとして評価する場合、その結果が多形性膠芽腫患者の腫瘍組織を検体サンプルとして評価する場合と同じであり、多形性膠芽腫患者から採血するだけで、この多形性膠芽腫患者に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適するかを評価し、及び多形性膠芽腫患者の治療後生存率を予測することができることは再び証明された。

上記のことを纏めると、本発明は、多形性膠芽腫患者の腫瘍組織又は末梢血単核細胞におけるＰＤ−１タンパク質発見量、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量を検査し又はＰＤ−１／ＣＤ８比を計算することで、医師が臨床的に樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療が適する多形性膠芽腫患者を快速で客観的に識別し、樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療では殆ど効果のない患者を排除して、医療資源の効果的な分配・利用を確保する、樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法を提供する。本発明は、生存率の予測方法を別に提供する。多形性膠芽腫患者の腫瘍組織又は末梢血単核細胞におけるＰＤ−１タンパク質発見量、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発見量を検査し又はＰＤ−１／ＣＤ８比を計算することで、直接多形性膠芽腫患者の治療後の生存率を予測して、医師が臨床的に患者に対して更に他の医薬品又は治療計画を組み合う必要があるかを判断して、その全生存期間又は無病生存期間を長める。

本発明の実施形態を前述の通りに開示したが、これは、本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができ、したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。

１００ 樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法
１１０、１２０、１３０、２１０、２２０、２３０ 工程
２００ 生存率の予測方法

Claims (16)

1. 検体サンプルを調整するサンプル調整工程と、
   前記検体サンプルにおける、ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−Ｌ１タンパク質及びＣＤ８タンパク質からなる群から選ばれるバイオマーカーの発見量を測定し基本値を計算する検査工程と、
   前記基本値とプリセット閾値とを比較し、前記基本値が前記プリセット閾値より低い場合、樹状細胞腫瘍ワクチンが適すると判定する比較工程と、
   を備える樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。
2. 前記検体サンプルは、多形性膠芽腫患者由来の腫瘍組織又は血液である請求項１に記載の樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。
3. 前記腫瘍組織は、組織切片又は組織マイクロアレイである請求項２に記載の樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。
4. 前記検査工程は、免疫組織化学染色法によって前記バイオマーカーの発見量を測定する請求項２〜３の何れか一項に記載の樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。
5. 前記検査工程は、組織化学採点法又は画像処理法によって信号値を計算することを更に含む請求項４に記載の樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。
6. 前記検査工程は、ＰＤ−１タンパク質の前記信号値をＣＤ８タンパク質の前記信号値で割って、前記基本値を得ることを更に含む請求項５に記載の樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。
7. 前記画像処理法は、ＲＧＢカラーモード、ＣＭＹＫカラーモード又はＨＳＩカラーモードによって、前記検体サンプルの画像を分析する請求項５に記載の樹状細胞腫瘍ワクチンの適性評価方法。
8. 検体サンプルを調整するサンプル調整工程と、
   前記検体サンプルにおける、ＰＤ−１タンパク質、ＰＤ−Ｌ１タンパク質及びＣＤ８タンパク質からなる群から選ばれるバイオマーカーの発見量を測定し基本値を計算する検査工程と、
   前記基本値とプリセット閾値とを比較し、前記基本値が前記プリセット閾値より低い場合、優れた生存率を有することを示す比較工程と、
   を備える生存率の予測方法。
9. 前記治療としては、手術治療、放射線治療、化学治療、免疫治療又はそれらの如何なる組合せから選ばれる請求項８に記載の生存率の予測方法。
10. 前記免疫治療は、樹状細胞腫瘍ワクチンに基づく免疫治療である請求項９に記載の生存率の予測方法。
11. 前記検体サンプルは、多形性膠芽腫患者由来の腫瘍組織又は血液である請求項８に記載の生存率の予測方法。
12. 前記腫瘍組織は、組織切片又は組織マイクロアレイである請求項１１に記載の生存率の予測方法。
13. 前記検査工程は、免疫組織化学染色法によって前記バイオマーカーの発見量を測定する請求項１１〜１２の何れか一項に記載の生存率の予測方法。
14. 前記検査工程は、組織化学採点法又は画像処理法によって信号値を計算することを更に含む請求項１３に記載の生存率の予測方法。
15. 前記検査工程は、ＰＤ−１タンパク質の前記信号値をＣＤ８タンパク質の前記信号値で割って、前記基本値を得ることを更に含む請求項１４に記載の生存率の予測方法。
16. 前記画像処理法は、ＲＧＢカラーモード、ＣＭＹＫカラーモード又はＨＳＩカラーモードによって前記検体サンプルの画像を分析する請求項１４に記載の生存率の予測方法。