JP2017015709A - 血液検査キット、その部材及びそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて、微量の血液検体に含まれる対象成分の分析を精度高く行うこと。
【解決手段】血液検体を希釈するための希釈液と、前記希釈液が収容された第一の収容器具、前記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、前記分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具からなる群より選択される部材と、を含む、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析するための、血液検査キットであって、前記希釈液中に含まれうる前記部材に由来する前記標準成分の量を規定したことを特徴とする、血液検査キット。
【選択図】なし

Description

本発明は、微量の血液検体中の対象成分を分析するための、血液検査キット、キットに用いるための部材、及びそれらの製造方法に関する。

一般に、採血には、医師等一定の有資格者が注射器を用いて静脈から血液を採取する一般採血と、検査対象者が、自分の手の指等に採血針を刺して血液を採取する自己採血とがある。

一般採血により採取された血液は、採取容器に密閉された状態で医療機関又は検査機関に搬送され、そこで検査が行われている。血液を血球と血漿とに分離せずに搬送する場合には、医療機関又は検査機関にて遠心分離機により血液を血球と血漿とに分離した後に検査が行われる。また、検査対象者が行う自己採血では、採血後の血液は分離膜により血球と血漿とに分離され、この分離された状態で検査場所に輸送され、そこで検査が行われる。

特許文献１には、自己採血により採取された血液検体の検査方法が記載されている。具体的には、１）容量を定量することなしに採取した定量すべき成分を含有する未知容量の生体試料と一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液とからなる定量用試料を調製する工程、２）一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液中の指示物質の濃度（Ｃ₁）と定量用試料中の指示物質の濃度（Ｃ₂）とから生体試料の希釈倍率（ａ）を求める工程、３）定量用試料中の定量すべき成分の濃度（Ｙ）を求める工程、４）上記２）で求めた生体試料希釈倍率（ａ）と上記３）で求めた定量用試料中の定量すべき物質の濃度（Ｙ）とから生体試料中の定量すべき成分を決定する工程を含む生体試料中の定量すべき成分の定量方法が記載されている。

特許文献２には、検体中の分析対象成分量を測定し、さらにこれ以外の恒常的に検体中に元来存在する標準成分の量を測定し、この標準成分の量と、検体中での標準成分の既知濃度とから検体の量を決定し、この検体量と、分析対象成分量とから、検体中の分析対象成分の濃度を決定する定量分析法が記載されている。

また、特許文献３には、血液希釈定量器具を用いてヒトや動物から微量血液を採取しそのまま又は希釈したのち一定量を他の機器や容器又は直接試薬に供給することが記載されている。さらに特許文献４には、希釈用水溶液中の指示物質の吸光度を利用して、生物学的試料中の定量すべき成分の濃度を定量する方法が記載されている。

現在、市販されている血液検査キットにおいては、特許文献１に記載されているような指示物質、いわゆる内部標準物質を用いる方法が採用されている。

特開２００３−１６１７２９号公報 特開２００１−３３０６０３号公報 特開２００９−１２２０８２号広報 特開２００９−１０９１９６号広報

特許文献１に記載の方法においては、血液検体が微量である場合には、血液検体量に対する希釈液の割合を高くすることが必要になる。しかし、この場合、血液検体を希釈する前後での希釈液の体積変化率が非常に小さくなるため、内部標準物質の濃度の変化率が小さくなり、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。

特許文献２には、健常者全血約１００μＬを多孔質膜に滴下し、血球を分離して血清を展開した後に、１５０μＬの生食等張ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ： ｐＨ７．４）を添加して得た液を遠心分離して得られた上清を分析試料として分析しているが、１００μＬ未満の採血については記載されていない。

特許文献３の方法では、１０μＬの血液量をマイクロピペットで正確に採取して分析しているが、採血に不慣れな患者が採取する場合には一定量を正確に採取することは難しく、誤差を含む採血で検査をした場合には測定値に誤差が含まれる結果となる。

特許文献４に記載の測定方法は希釈倍率が１０倍程度の測定であり、希釈倍率をさらに高めて希釈血液量を十分に確保する場合には、特許文献１と同様に、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。

上述の通り、微量の血液検体を使用する場合について測定値の繰り返し再現性が高い血液分析方法が望まれている。本発明者らは、分析を精度高く行う為には、従来から提案されている内部標準物質を用いることでは充分ではないと考え、外部標準物質を用いる方法を検討した。

本発明は、微量血液を緩衝液で希釈して成分を定量分析する方法として、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析する方法において、血液検査キットの部材から、緩衝液中に溶出する血液に恒常的に存在する標準成分濃度を規定することで、例えば、特許文献１及び、特許文献２の従来技術にはない精度で、正確に希釈倍率を求めて成分の定量分析をするための血液検査キットを提供することを目的とする。また、さらに内部標準を用いて希釈倍率を求める方法を併用することで、さらに精度を高めることが可能な血液検査キットを提供する。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、採取された血液検体を希釈液で希釈し、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定し、血液検体中の対象成分の濃度を分析する血液分析方法において、部材に由来する上記標準成分の量を一定量以下に抑えることで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を提供する。

［１］ 血液検体を希釈するための希釈液と、
上記希釈液が収容された第一の収容器具、上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、上記分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具からなる群より選択される部材と、を含む、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析するための、血液検査キットであって、
上記希釈液中に含まれうる上記部材に由来する上記標準成分の量を規定したことを特徴とする、血液検査キット。
［２］ 上記希釈液中に含まれうる上記部材に由来する上記標準成分の量が、希釈液の量の０．５質量％以下である、１に記載の血液検査キット。
［３］ 上記希釈液の容量が、血漿の容量の１５倍以下である、１又は２に記載の、血液検査キット。
［４］ 血液中に恒常的に存在する上記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、１から３のいずれかに記載の血液検査キット。
［５］ 血液中に恒常的に存在する上記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに別の血液中に恒常的に存在する標準成分である、１から４のいずれかに記載の血液検査キット。
［６］ 上記別の標準成分が、総タンパク又はアルブミンである、請求項５に記載の血液検査キット。
［７］ さらに別の血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて、上記血液検体中の対象成分の濃度の分析を検証する、請求項１から６のいずれか１項に記載の血液検査キット。
［８］ 上記血液検査キットが備える部材が、上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を回収するための分離器具を含む、１から７のいずれかに記載の血液検査キット。
［９］ 上記希釈液が、血液中に恒常的に存在する標準成分を含まない、１から８のいずれかに記載の血液検査キット。
［１０］ 上記希釈液が、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−エチルアミノエタノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群より選択されるアミノアルコール化合物、並びにＨＥＰＥＳとも称する２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、ＴＥＳとも称するＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸，ＭＯＰＳとも称する３−モルホリノプロパンスルホン酸、及びＢＥＳとも称する（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝剤を含む、１から９のいずれかに記載の血液検査キット。
［１１］ 上記希釈液が、血液中に存在しない標準成分をさらに含有する、１から１０のいずれかに記載の血液検査キット。
［１２］ 血液中に存在しない標準成分が、リチウムイオン又はグリセロール三リン酸である、１１に記載の血液検査キット。
［１３］ １から１２のいずれかに記載の血液検査キットに用いるための、部材。
［１４］ 部材が、希釈液を収容するための第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、上記分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具からなる群より選択される部材である、１３に記載の部材。
［１５］ 血液中に恒常的に存在する標準成分の除去上有効な条件で部材を洗浄する工程を含む、１から１２のいずれか１項に記載の血液検査キットの、又は１３もしくは１４に記載の部材の、製造方法。
［１６］ 上記条件が、電気電導度が１μＳ／cm以下の水の使用である、１５に記載の製造方法。

本発明の血液検査キット及びその部材によれば、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度の分析を精度よく行うことができる。
本発明の製造方法によれば、上述の分析を精度よく行うことができる血液検査キット及びその部材が提供できる。

図１は、本発明の実施の態様に係る血液検査キットの断面図である。 図２は、希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度（希釈液に対する重量％）を算出した結果の例である。

以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、Ｘ〜Ｙで示される範囲は、上限Ｘと下限Ｙの値を含む。血液中に恒常的に存在する標準成分のことを、外部標準物質又は外部標準ということがある。また、血液中に存在しない標準成分のことを、内部標準物質又は内部標準ということがある。

微量の血液を採取する方法として濾紙を用い血液分析行う方法が特開平１０−１０４２２６号公報に開示されている。また濾紙の代わりに血液保持性の高い多孔質材を用いる方法が特許文献２に開示されている。これらの方法では、素材に吸収された血液成分を緩衝液などで抽出して測定することになるため、血液に恒常的に存在する外部標準物質であるナトリウムイオン、塩化物イオン、カルシウムイオン、蛋白などを、血液を溶出して再溶解した場合の緩衝液による希釈率を見積もる基準物質として用いることが記載されている。しかしながらこれらの方法では、血液の採取量はさまざまで、採取した血液の希釈率が高くなってしまうとその後の分析精度が下がり結果がばらつき、一旦血液を凝集させて固化するために分析対象となる成分の安定性の保証が不十分にあることがあった。また、乾燥した試料から生体成分を抽出する緩衝液は、ｐＨ調整や生体成分安定化のためにＮａＯＨやＮａＣｌ、ＨＣｌを添加した緩衝液を利用する必要がある。このため、試料の成分で比較的高い濃度で存在し、恒常性があり、個体間差が少ないナトリウムイオンや塩化物イオンの濃度を外部標準として、希釈された元の他の生体成分濃度の補正をすることに利用できないという問題があった。

一方、採取した微量血液を内部標準入り緩衝液で希釈し、内部標準物質の希釈倍数から希釈血漿中の未知量の存在する成分量を定量する方法として特許文献１に記載の方法が開示されている。内部標準物質としてはＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩（ＨＳＤＡ）、あるいはアシッドブルー９（ブリリアントブルーＦＣＦ）が利用されており、血液を安定に保持するための緩衝剤や防腐剤が用いられている。このような処方は、血液を凝固させないことでその成分の安定性を維持することを実現したが、やはり血液採取量がばらつき、採取量が少ない場合には、希釈後の内部標準物質の希釈率が小さくなることや、血液成分量そのものが低下する為に、検査精度の信頼性が低下することが問題であった。また、緩衝液で希釈する方法は生体成分がｐＨ７．４の生理的条件の緩衝液で保存され、輸送中の安定性にも優れているが、内部標準添加緩衝液への試料による内部標準の希釈率が小さく、少ない試料添加では測定誤差が生じ易い問題があった。

さらにこれら先行技術の実施例では、抽出する緩衝液にはリン酸緩衝生理食塩水が生体成分の安定保持に優れているので利用されているが、リン酸緩衝生理食塩水にはナトリウムイオンや塩化物イオンが含まれている。そのためナトリウムイオンや塩化物イオンは外部標準として利用できず、カルシウムイオン、蛋白等が利用されている。従って、微量血液での血液検査を精度高く行う為には、従来技術にあるように希釈率を補正する外部標準物質の使用や、従来提案されている内部標準物質を含有する緩衝液の使用では検査精度の確保が充分でなかった。

また、血液中の恒常性物質とはいえ、例えば、ナトリウムイオンにおいては、正常値１３４〜１４６ｍｍｏｌ／Ｌの分布の幅を有するため、より正確な希釈倍率を算出することが必要となる。希釈倍率の精度が低下すると検査精度に悪影響を与えて、検査の信頼性を損なってしまうリスクが高まってしまう。特に、キットを構成する部材から緩衝液中に溶出する外部標準物質による汚染（いわゆるコンタミ）が多少なりともあった場合に、血液採取量が多かったり少なかったりすると、コンタミの希釈倍率算出に与える影響度が異なってしまう。特許文献２には、このようなキットを構成する部材から緩衝液中に溶出する外部標準物質のコンタミの希釈倍率算出に与える影響度を一定にすることに関しては、一切言及していない。

また、特許文献１には、内部標準に関する記載はあるが、外部標準と併用することに関する記載はない。従って、外部標準のコンタミに関する記載はなく、コンタミを防止するための具体的な手段は一切提案されていない。

本発明は、微量血液検体を緩衝液で希釈して対象成分の濃度を分析するためのキットにであって、血液中に恒常的に存在する外部標準を用いて対照成分の分析を行うに際して、従来技術にはない精度で希釈倍率を求めることができる、血液検査キットを提供することを目的とする。そのための解決手段として、希釈液中に含まれうる上記部材に由来する上記標準成分の量を規定したものである。また、好ましい態様においては、外部標準を用いるのみならず、内部標準を用いることとしている。

本発明により、血液中の分析対象成分を測定する測定方法において、患者自らが血液を採血する場合に微量な血液成分を希釈液に投入して希釈したときに、合成樹脂（なお本明細書では、プラスチックを合成樹脂と同義に用いている。）、ガラス又はゴムを素材とするキットを構成する部材を、事前に洗浄しておくことで、キットを構成する部材から溶出する恒常性のある標準成分を極力抑えることで、血液に由来する恒常性のある標準成分を十分に精度高く検出することにより、分析対象成分の定量を精度よく行うことができる測定方法、あるいは、測定方法を使用した血液検査システムを実現することが可能となる。
また、さらに内部標準を用いて希釈倍率を求める方法を併用することで、さらに精度を高めることが可能な血液検査キットを提供する。

［１］血液検査キット
本発明の血液検査キットは、
血液検体を希釈するための希釈液と、
上記希釈液が収容された第一の収容器具、上記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具からなる群より選択される部材と、
を含み、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて 血液検体中の対象成分の濃度を分析するための、血液検査キットであって、
上記希釈液中に含まれうる上記部材に由来する上記標準成分の量を規定したことを特徴とする。

血液検体中の対象成分の濃度を分析するとは、対象成分の濃度を決定すること（即ち、対象成分を定量すること）、又は対象成分の濃度が所定の基準値以上であるか所定の基準値以下であるかを決定することなどを包含し、分析の形態は特に限定されない。

〔採血方法と量〕
本発明の血液検査キットは、血液検体を採取するために使用される。本発明の血液検査キットによる血液の採取は、対象者自身が行ってもよく、医師等の有資格者が行ってもよい。

好ましい態様では、患者本人が、ランセットなどのナイフ付の器具を用いて指先などを傷つけて皮膚外にでた血液を採取する。患者の負担を減らすために、侵襲性低く血液を採取することが好ましく血液を採取するときに無痛、あるいは、痛みが非常に少ない状態で採血できることが望ましく、その場合、傷の深さ、大きさは小さいことが望ましく、採取できる血液も非常に少なくなる。従って、本発明の血液検査キットで採取される検体の容量（すなわち、採血量）は１００μＬ以下であることが好ましい。このように少ない患者の採血量でも、本発明では、血液検査キットの部材から、希釈液中に溶出しうる血液に恒常的に存在する標準成分濃度を低く規定し、また、血液に恒常的に存在する標準成分として、例えば、ナトリウムイオン、又は塩化物イオンを用いることで、測定精度よく分析対象物を測定するための方法を提供することが可能となる。

〔血液に恒常的に存在する標準成分〕
上記のように、血漿成分の希釈倍率の高い希釈血漿の希釈後の対象成分について、希釈前の血液の血漿中に存在する濃度を正確に分析するためには、希釈液中にあらかじめ存在する物質の濃度の変化率から求める方法では、濃度の変化の割合が非常に小さくなるために測定誤差が大きく、また、測定の再現性が悪化する弊害がある。従って本発明の血液検査キットは、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析するための、血液検査キットである。

ここで、標準成分を「用いて」とは、標準成分についての標準値（恒常値）に基づき、対象成分の濃度を分析するための希釈倍率を決定する意である。したがって、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析することは、血液中に恒常的に存在する標準成分の恒常値（標準値）に基づき希釈倍率を決定し、対象成分の濃度を分析することでもある。

血液中に恒常的に存在する標準成分は、例えば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、総タンパク、及びアルブミン等が挙げられる。血液検体の血清及び血漿中に含まれるこれらの標準成分の濃度は、ナトリウムイオン濃度は、１３４〜１４６ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）、塩化物イオン濃度は、９７〜１０７ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：１０２ｍｍｏｌ／Ｌ）、カリウムイオン濃度は、３．２〜４．８ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：４．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、マグネシウムイオン濃度は、０．７５〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：０．９ｍｍｏｌ／Ｌ）、カルシウムイオン濃度は、４．２〜５．１ｍｍｏｌ／Ｌ（平均値：４．６５ｍｍｏｌ／Ｌ）、総タンパク濃度は、６．７〜８．３ｇ／１００ｍｌ（平均値：７．５ｇ／１００ｍｌ）、アルブミン濃度は、４．１〜５．１ｇ／１００ｍＬ（平均値：４．６ｇ／１００ｍＬ）である。本発明では、患者の痛みを和らげるために採血する血液量が非常に少ない場合における対象成分の測定を可能にするためのものであり、微量の血液を希釈液で希釈した際に、希釈液中に存在する「血液中に恒常的に存在する標準成分」の濃度を精度よく測定する必要がある。希釈倍率が高くなると、もともと血液中に存在する成分の希釈液中の濃度が低下し、希釈倍率によっては濃度測定時に、測定誤差を含む可能性がある。従って、微量な血液成分を希釈倍率高く希釈したときに、上記標準成分を十分に精度高く検出するためには、微量な血液中に高い濃度で存在する標準成分を測定することが好ましい。本発明では、血液検体中に恒常的に存在する成分の中でも高濃度に存在する、ナトリウムイオン（Ｎａ⁺）又は塩化物イオン（Ｃｌ^-）を用いることが好ましい。更には、上述の血液中に恒常的に存在する標準成分の中でも血液中に存在する量が一番高いナトリウムイオンを測定することが最も好ましい。ナトリウムイオンは、平均値が標準値（基準範囲の中央値）を表し、その値は、１４２ｍｍｏｌ／Ｌであり、血漿中の総陽イオンの９０モル％以上を占める。

被検者の血液中における血漿成分の占有率は、容積の比率で約５５％であるが、被検者の塩分摂取量の変化などで変動する。そのため、本発明のキットを用いる場合は、血漿中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて血漿の希釈倍率を決定し、決定された希釈倍率を用いて血液検体の血漿中の対象成分の濃度を分析する。希釈倍率を決定する方法としては、血漿の希釈液中の外部標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の測定値（濃度Ｘ）と、血液検体の血漿中に含まれる上記外部標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の既知濃度値（濃度Ｙ；ナトリウムイオンの場合には１４２ｍｍｏｌ／Ｌ）とから、血液検体中の血漿成分の希釈倍率（Ｙ／Ｘ）を算出することにより希釈倍率を求めることができる。この希釈倍率を用いて、血漿の希釈液中の対象成分の測定値（濃度Ｚ）を測定し、この測定値に希釈倍率を掛け合わせることにより、実際に血液検体の血漿中に含まれる分析対象成分の濃度［Ｚ×（Ｙ／Ｘ）］を測定することが可能となる。

ナトリウムイオン濃度及び塩化物イオン濃度は、例えば、炎光光度法、ガラス電極法、滴定法、イオン選択電極法、酵素活性法等により測定することができる。

ナトリウムイオンの測定ではナトリウムイオンにより酵素ガラクトシダーゼは酵素活性が活性化することから、緩衝液で希釈された非常に低濃度ナトリウムイオン（２４ｍｍｏｌ／Ｌ以下）試料を数μＬで測定する酵素的測定法を用いることができる。この方法は生化学・免疫自動分析装置に適応でき、ナトリウムイオン測定のために別の測定機器を必要としない点で効率性が高く経済的である。

また、部材に由来する標準成分の量を規定した血液検査キットが実際に使用されているか、また、血液の希釈と血漿の回収の方法が正常に行われているか確証するためには、血漿中の別の標準成分から独立に希釈倍率を追加的に求めて、その値が上で求めた希釈倍率と一致することを確認することが好ましい。一致するとは、２つの測定値（ａ，ｂ）において、それらの差のそれらの平均値に対する割合、すなわち｜ａ−ｂ｜／｛（ａ＋ｂ）／２｝×１００が、２０％以下であることであり、好ましくは１０％以下であることであり、より好ましくは５％以下であることである。これにより、血液検体中の対象成分の濃度の分析が正常に行われていることの検証が可能となる。ここで、ナトリウムイオン又は塩化物イオン以外の血漿中に恒常的に存在する標準成分の例としては、総タンパク又はアルブミンから選択されることが好ましく、総タンパクであることがより好ましい。総タンパクの測定法は、ビューレット法や、紫外吸収法、ブレッドフォード法、ローリー法、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ：ＢＣＡ）法、蛍光法など公知の方法があり、測定試料の特性や感度、試料量などに応じて適宜使用する方法を選択することができる。

〔血液中に存在しない標準成分〕
好ましい態様の一つとして、キットは、血液中に恒常的に存在する標準成分とともに、血液中に存在しない標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析するためのものである。

血液中に存在しない標準成分は、キット中の希釈液（後述する。）に、所定の濃度になるように添加して用いることができる。血液中に存在しない標準成分としては、血液検体中に全く含まれないか、若しくは含まれていたとしても極微量である物質を使用することができる。血液中に存在しない標準成分としては、血液検体中の対象成分の測定に干渉を与えない物質、血液検体中の生体酵素の作用を受けて分解しない物質、希釈中で安定な物質、血球膜を透過せず血球中に含まれない物質、緩衝液の保存容器に吸着しない物質、精度良く測定できる検出系が利用できる物質を用いることが好ましい。

血液中に存在しない標準成分としては、希釈液に添加した状態で長期間保管しても安定な物質が好ましい。血液中に存在しない標準成分の例としては、グリセロール三リン酸、アルカリ金属としてＬｉ、Ｒｂ、Ｃｓ、又はＦｒ、そしてアルカリ土類金属としてはＳｒ、Ｂａ、又はＲａが挙げられ、これらの中で、Ｌｉ及びグリセロール三リン酸が好ましい。

これらの血液中に存在しない標準成分は、血液希釈後の濃度測定時に第二の試薬を添加することで発色させ、その発色濃度から希釈血液中の濃度を求めることができる。例えば、希釈液に添加したリチウムイオンの測定は、キレート比色法（ハロゲン化ポルフィリンキレート法：パーフルオロ−５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン）を利用して生化学自動分析装置で大量試料を微量の試料で容易に測定できる。

血液中に恒常的に存在する標準成分とともに、血液中に存在しない標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析するための血液検査キットを用いること、すなわち２つの標準成分を併用することで、より信頼性の高い分析が実現可能となる。

２つの標準成分を併用する態様において、血液中に恒常的に存在する標準成分としてナトリウムイオンを、血液中に存在しない標準成分としてリチウムイオンを用い、ナトリウムイオンの測定をβ−ガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素活性法で行い、リチウムイオンの測定を上述のキレート比色法で測定する場合には、血液検体の希釈倍率は、下記式１から４のいずれかの式で算出することができる。

上記式において、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｂ’及びＸは、以下のように定義される。
Ａ ： 緩衝液を発色させた際の吸光度
Ｂ ： 血漿添加後の吸光度変化量
Ｃ ： 血漿ナトリウム中央値１４２ ｍｍｏｌ／Ｌの吸光度
Ｄ ： 血漿希釈後のナトリウムイオン濃度における吸光度
Ｂ’： 血漿ナトリウムの吸光度から算出した希釈倍率による、希釈血漿中の血液中に存在しない標準成 分の吸光度の補正値
Ｘ ： 血漿希釈倍数

希釈率を求める際のもう一つの算出方法として、二乗平均法を用いた式５で算出し、希釈液中の分析対象成分の濃度に、式５で算出した希釈率を乗じて血液検体の成分中の対象成分の濃度を分析する態様も好ましい。

血液検体の成分中の対象成分の濃度は、希釈液中の対象成分の濃度から、上記希釈倍率に基づいて算出できる。

〔希釈液〕
本発明の血液検査キットは、採取した血液検体を希釈するための希釈液を含む。血液検体を希釈するための希釈液は、希釈倍率を求めるために使用する血液中に恒常的に存在する標準成分を含有しない希釈液である。本明細書において「含有しない」とは、「実質的に含有しない」ことを意味する。ここで、「実質的に含有しない」とは、希釈倍率を求める時に使用する恒常性のある物質をまったく含まないか、あるいは含まれていたとしても、血液検体を希釈した後の希釈液の恒常性のある物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる場合を意味する。血液中に恒常的に存在する標準成分として、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを用いる場合には、希釈液としては、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを実質的に含有しない希釈液を使用する。

本発明においては、患者が採血した血液検体を希釈した後、医療機関又は検査機関に輸送して対象成分の濃度を分析することができる。採血から分析までには長時間かかる可能性があることから、その間に、血液の希釈液中において対象成分が分解や変性することを防止することが好ましい。血液のｐＨは、健常者では通常ｐＨ７．３０〜７．４０程度で一定に保たれている。従って、対象成分が分解や変性を防止するために、希釈液は、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ７．５、更に好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．４のｐＨ域で緩衝作用を有する緩衝液であることが好ましく、希釈液は、ｐＨの変動を抑える緩衝成分を含有する緩衝液であることが好ましい。

緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液（Ｎａ）、リン酸緩衝液（Ｎａ）、クエン酸緩衝液（Ｎａ）、ホウ酸緩衝液（Ｎａ）、酒石酸緩衝液（Ｎａ）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）緩衝液（Ｃｌ）、Ｈｅｐｅｓ（［２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸］）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ）等が知られている。これらの中でｐＨ７．０〜ｐＨ８．０付近の緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液が代表的なものである。しかしながら、リン酸緩衝液はリン酸のナトリウム塩が含まれていること、Ｔｒｉｓ緩衝液は、解離ｐＫａは８．０８であるため、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０付近で緩衝能を持たせるためには通常は塩酸と組み合わせて使用されること、Ｈｅｐｅｓのスルホン酸の解離のｐＫａは７．５５であるが、イオン強度一定での緩衝溶液を調整するため、通常は水酸化ナトリウムと塩化ナトリウムとＨＥＰＥＳの混合物が用いられることから、これらはｐＨを一定に保つ作用を有する緩衝液としては有用であるが、本発明において外部標準物質として用いることが好ましい物質であるナトリウムイオンあるいは塩化物イオンを含有するため、本発明への適用は好ましくない。

本発明のキットに含まれる希釈液としては、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを含有しない緩衝液を用いることが好ましい。本発明で用いる希釈液は好ましくは、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−エチルアミノエタノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノアルコール化合物、並びにＧｏｏｄ’ｓ緩衝液（グッドバッファー）でｐＫａが７．４付近の緩衝剤であるＨＥＰＥＳとも称する２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル］ エタンスルホン酸） （ｐＫａ＝７．５５）、ＴＥＳとも称するＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．５０）、ＭＯＰＳとも称する３−モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＫａ＝７．２０）、及びＢＥＳとも称する（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．１５）からなる群から選択される緩衝剤を含む希釈液である。上記の中でも、２−アミノー２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）とＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ又はＢＥＳとの組み合わせが好ましく、さらに、２−アミノー２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）とＨＥＰＥＳとの組み合わせが最も好ましい。

上記緩衝液を調製するためには、アミノアルコールとＧｏｏｄ‘ｓ緩衝液を１：２〜２：１、好ましくは１：１．５〜１．５：１、更に好ましくは１：１の濃度比で混合すればよい。緩衝液の濃度は限定されないが、アミノアルコール又はＧｏｏｄ‘ｓ緩衝液の濃度は、０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。

緩衝液中には、分析対象成分を安定に保つことを目的にキレート剤、界面活性剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類等が含有されていてもよい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、シュウ酸塩等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤又は非イオン界面活性剤が挙げられる。防腐剤としては、たとえば、アジ化ナトリウムや抗性物質等が挙げられる。補酵素としては、ピリドキサールリン酸、マグネシウム、亜鉛等が挙げられる。赤血球安定化剤の糖類としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖等が挙げられる。特に、抗生物質の添加により、手指採血時に手指表面から一部混入する細菌の増殖を抑えることができ、細菌による生体成分の分解を抑制し、生体成分の安定化を図ることができる。

これらの緩衝液は血液に恒常的に存在する標準成分や内部標準物質を含まず、測定系に干渉を与えないことが重要である。また、これらの緩衝液で希釈された成分は生化学・免疫自動分析装置での種々の測定法でも測定に干渉しないこと、さらに血球が溶血をしないことや生体成分が３７℃でも安定に保存できることが好ましい。

血液検体に全血を使用する場合には、希釈した血液中の血球成分をフィルター濾過する必要から、緩衝液の浸透圧を血液と同等（２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇは、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす））又はそれ以上とすることにより血球の溶血を防止することができる。浸透圧は、対象成分の測定、及び血液中に恒常的に存在する標準成分の測定に影響しない塩類、糖類又は緩衝剤等により、等張に調整することができる。

緩衝液で希釈された血漿ナトリウムイオンを血液に恒常的に存在する標準成分として測定する方法には炎光光度計、原子吸光法、そしてイオン選択電極法がある。本発明では微量な血液を手指から採取して緩衝液で希釈した試料は僅か１５０μＬ程度であり、生化学成分や免疫検査項目を１０項目以上測定することから血液に恒常的に存在する標準成分の測定は数μＬの微量で測定できることが好ましい。また、多数の試料を分析する必要から、市販の生化学・免疫自動分析装置に適応できることが好ましい。

〔希釈液の量、希釈倍率〕
血液検査として、肝機能、腎機能、メタボリズムなど、特定の臓器、特定の疾患を検査する場合には、臓器や疾患に特有の複数の測定対象成分の情報を入手して、臓器の状態、生活習慣の予測などを行うために、一般的には、複数の測定対象成分の分析が同時に行われる。例えば、肝臓の状態を検査するためには、一般的には、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、γ―ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、総ビリルビン、総タンパク、アルブミン等、数種類以上もの物質の血液中の濃度が測定される。このように、複数の対象成分をいつの血液検体から測定するためには、再測定の可能性も考慮して、希釈された血液の量はある程度必要となる。従って、採取した血液を希釈する希釈液は、ある程度の量を確保することが重要である。キットにおける希釈液の量は、血漿の容量の２０倍以下（すなわち希釈倍率は、血漿の容量の２０倍以下）であることが好ましく、また、１５倍以下であることがより好ましい。例えば、採血量を５０μＬとすると、血漿の容量は２８μＬと計算でき、希釈液が３６０μＬであれば、希釈倍率は１４倍となる。なお、血球／血漿比を５０／５０とすれば、血漿を基準とした場合の希釈倍率を５０／（５０＋５０）倍することにより、血液検体を基準とした希釈倍率が概算できる。キットにおける希釈液の量は、血液検体の容量に対しては１０倍以下（すなわち希釈倍率は、血液検体の容量の１０倍以下）であることが好ましく、また、７．５倍以下であることがより好ましい。すなわち本発明は実施態様の一つとして、希釈液の容量が、血液検体の容量の７．５倍以下である、上述の血液検査キットを提供する。

〔血液検体の希釈物から血漿を分離回収するための分離器具〕
本発明のキットにより採取された血液検体は、分析が行われるまで、希釈された状態で長時間経過する可能性がある。その間に、例えば赤血球の溶血が起こると、血球内に存在する物質や酵素などが血漿あるいは血清中に溶出して検査結果に影響を与えたり、溶出したヘモグロビンが有する吸収により、分析対象成分の光学的な吸収などの光情報で分析対象成分量を測定する場合に影響を及ぼす可能性がある。従って、溶血を防止することが好ましい。そのため、血液検体の希釈物から血漿を分離回収するための分離器具をキットに含む態様が好ましい。分離器具の好ましい例は、分離膜である。分離膜は、例えば血液検体の希釈液に圧力を加えることによって、血球成分は分離膜で捕獲し、血漿成分を通過させて、血球を分離して血漿成分を回収するように用いることができる。この場合、抗凝固剤を用いることが好ましい。また、測定の精度を確保するために、分離膜を通過した血漿が血球側へ逆流しないことが好ましく、そのためには具体的には、特開２００３−２７０２３９号公報に記載の、逆流防止手段をキットの構成要素とすることができる。

〔部材、及び部材からの溶出〕
本発明のキットにおいては、希釈液中に含まれうる血液キットの部材に由来する血液中に恒常的に存在する標準成分の量が規定される。希釈液中に含まれうる量は、対象となる部材を実際に適切な量の希釈液に一定時間曝し、部材に由来して希釈液に含まれることとなった標準成分の量を測定することにより求めることができる。この部材に由来する標準成分の量は、血液検体の希釈率の測定に大きな影響を与えずに、対象成分の濃度の分析が精度よく行える量であれば、特に限定されない。具体的には、血液に恒常的に存在する標準成分の部材に由来する量は、希釈液の量の０．５質量％以下であり、好ましくは０．４重量％以下であり、より好ましくは０．３重量％以下である。希釈液中に含まれうる血液キットの部材に由来する血液に恒常的に存在する標準成分の量は少ないことが好ましく、下限値は特に限定されない。

血液検査キットにおいては、通常、血液を採取する吸引器にはファイバーロットが使用されており、このファイバーロットには抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩が使用されている。また、血漿を分離回収するための器具としてガラスフィルターが使用されており、これにはソーダガラス、炭酸ナトリウム等の微量のナトリウムイオンが含まれている。ソーダガラスは、ケイ砂（ＳｉＯ２）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を混合して融解することにより得られる。ガラスフィルターを保持するためのガスケットの素材、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具がゴム製であれば、除タンパクのためのＮａＯＨ洗浄、及び成形の際に使用される離型剤（硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム等の混合物）等の残渣分として微量のナトリウムイオンが含まれる場合がある。プラスチック（樹脂）成形品である部材は、表面に微量Ｎａが含まれる場合がある。樹脂成形に使用する離型剤中に金属元素としてスズ、亜鉛、カルシウムなどとともに、ナトリウムが含まれるからである。

これらがキットに由来するナトリウムイオンとして、希釈液中に混入することが想定される。本発明者らの検討によると、希釈液に実際に含まれうるキット由来の血液に恒常的に存在する標準成分（好ましくはナトリウムイオン又は塩化物イオン）の量を十分に少なくすることにより、具体的には、希釈液における濃度を０．５重量％以下にすることにより、採血量５０μＬ以上（推定される希釈倍率は１５倍以下）において、高精度の希釈倍率再現性が得られることを見出した。また、このとき、希釈液中に溶出するナトリウムイオン量（血液由来でないナトリウムイオン量、即ち、コンタミ成分）が、血漿中のナトリウムイオン量に対して、好ましくは±２％以下であれば、希釈倍率算出の高精度に維持できる。

本発明の血液検査キットは、血液を採取する血液採取器具、希釈液が収容された第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具からなる群より選択される部材の少なくとも一つを有する。本発明の血液検査キットの一例としては、血液検体の成分を希釈するための希釈液、希釈液が収容された第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具、皮膚に傷をつけて血液を皮膚外に染み出させる針や、ランセット、傷に貼る絆創膏又は消毒部材（例えば、イソプロパノール（７０％イソプロパノールなど）又はエタノールなどを含浸させた不織布）、取扱説明書、等を備えることができる。希釈された血液検体から血漿成分を回収するための分離器具としては、分離膜である態様が好ましく、血球成分を分離可能な細孔を有するフィルタがより好ましい。

第一の収容器具、及び第二の収容器具は、１つの器具を第一の収容器具及び第二の収容器具として兼用してもよいし、別々の器具を備える態様であってもよい。収容器具内にある血液を希釈した希釈液を、患者、あるいは、希釈倍率の測定や分析対象成分の分析を行う測定者に確認可能とするために、第一の収容器具、及び第二の収容器具は、透明な素材でできていることが好ましい。

分離器具を保持する保持器具は、ガスケットである態様が好ましい。また、封止器具としては、収容器具が筒状の形状をした器具などの場合には、開口に蓋をすることが可能なキャップや、螺旋状の溝を有する蓋、あるいはゴム栓などを使用することができる。

上記の構成により、希釈液により血液を希釈した後に、直ちに血漿血球分離する機能を血液と希釈液の混合容器に付与することにより、血液成分の安定性と 血球細胞からの溶血による成分の変動の影響を排除し、血液採取後の試料の安定性を付与できる。

本発明のキットは、１００μＬ以下の採血量であっても、測定精度よく分析対象成分を分析できる方法を実現可能とするものであり、患者に、１００μＬ以下の少ない採血量でも精度よく測定することが可能であること等の情報が記載された取り扱い説明書を含むキットであることが好ましい。

〔キットの具体例〕
好ましい態様の一つにおいて、キットは、希釈液、希釈液が収容された第一の収容器具（血液検体の希釈物を収容するための収容器具でもある。）、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具を含む。具体的な器具としては、例えば、特許第３５９７８２７号公報の図１から図１３に記載された器具を使用することができる。特許第３５９７８２７号公報の図１を、本願の図１として援用する。

血液分離器具１は採血容器２（希釈液が収容された収容器具、第一の収容器具ということもある。血液検体の希釈物を収容するための収容器具でもある。）と、採血容器２に嵌挿可能な筒体３（回収した血漿を収容するための第二の収容器具）と、筒体３に冠着可能なキャップピストン４と、キャップピストン４の下端に設けられた密閉蓋５（封止器具）とを備え、使用前は、図１に示すように、採血容器２の上端開口部はキャップ６によりパッキン７を介して密閉されている。本発明における希釈された血液検体を収容するための収容器具は、図１の構成においては、採血容器２と筒体３の組み合わせに対応する。すなわち、希釈された血液検体を収容するための収容器具は１個でも２個以上の組み合わせでもよい。

採血容器２は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には、外面に螺子部８が形成され、内面に係止部９が突設されている。また、採血容器２の下端部には、逆円錐状の底部１０が形成され、底部１０の周囲に円筒状の脚部１１が形成されている。脚部１１は、血液の分析検査時に使用するサンプルカップと同一外径を有しており、好ましくは、その下端の対向する位置にそれぞれ鉛直方向にスリット溝１２が形成されている。さらに、採血容器２内には、図１に示されているように、所要量、例えば、５００ｍｍ³の希釈液１３
が予め入れられていてもよい。

筒体３は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には拡径部１４が形成されている。拡径部１４は薄肉部１５を介して本体部１６と接続されている。筒体３の下端部には、縮径部１８が形成され、縮径部１８の内面には係止突起部１９が形成されている。さらに、縮径部１８の下端部には外鍔部２０（保持器具）が形成され、外鍔部２０の下端開口部は濾過膜２１（分離器具）により覆われ、濾過膜２１は血液中の血漿の通過を許容し、血球の通過を阻止するようになっている。

縮径部１８の外周にはシリコンゴム製のカバー２２が装着されている（図１）。

キャップピストン４は、略円筒状の摘み部２６と、摘み部２６と同心で下方に延びる心棒部２７とで構成されている。摘み部２６の内側上端部には筒体３の拡径部１４が嵌合可能な円筒状の空間２８が形成され、また、その下方は螺刻され、螺子に螺合可能となっている。心棒部２７はその下端部２９がピン状に形成され、下端部２９に密閉蓋５が着脱可能に設けられている（図１参照）。密閉蓋５はシリコンゴム製である。

血液検体の希釈物からの血漿の分離回収操作は、具体的には、次のように行う。希釈液を収容する採血容器２に、採取した血液を投入した後、採血容器２の上部を持って泡立てないように注意しながら血液と希釈液とを十分に振り混ぜる。次に、濾過膜２１を保持する筒体３（血漿、血球分離時のシリンダ側面への回りこみによる液漏れを防止）を濾過膜が下になるように採血容器２に差し込み、ゆっくりと一定のスピードで採血容器２の底面まで濾過膜を押し下げる。このとき、筒体３の濾過膜を通って血漿が上部に上がり、血球は採血容器２の下部に残る。その後、キャップピストン４を筒体３にゆっくりと差し込んで、密閉栓５により逆流による血漿と血球の混合を防止する。

上記した器具による血液分離方法の詳細は、特許第３５９７８２７号公報の段落番号００２３〜００２６並びに図１２及び図１３に記載されており、その内容は本明細書に引用される。

本発明の血液検査キットに含まれる各々の要素の個数は特に限定されず、各々１個でもよいし、２個以上の複数でもよい。

本発明の血液検査キットに含まれる部材の材料は、破損しにくさ、衛生面、価格等の観点から、合成樹脂であることが好ましい。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂（ＡＢＳ樹脂）、アクリロニトリルスチレン樹脂（ＡＳ樹脂）、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、シリコーン樹脂等が挙げられる。

本発明の血液検査キットは、種々の部材のすべてを、収納容器に収納した形態として提供することができる。

［２］キット及び部材の製造方法
本発明はまた、上述したキット及び部材の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、血液中に恒常的に存在する標準成分の除去上有効な条件で部材を洗浄する工程を含む。

〔部材の洗浄工程〕
本発明の血液検査キットに使用される部材は、プラスチック、ガラス又はゴムを素材としているが、本発明者らは、こうした部材から溶出するであろう血液に恒常的に存在する標準成分を、部材の製造工程を含む血液検査キットの製造工程において、所定の方法により有効に除去することができることを見出した。

血液中に恒常的に存在する標準成分の除去上有効な条件は、具体的には、対象部材を、電気電導度が１μＳ／cm以下の純水で洗浄する工程、好ましくは対象部材を、電気電導度が１μＳ／cm以下の純水をシャワー状に当てる工程である。このような工程により十分に洗浄することで溶出濃度を希釈液に対して０．５重量％以下に下げられることを本発明者らは見出した。

なお、部材洗浄の観点からも、血液中に恒常的に存在する標準成分は、微量な血液中に高い濃度で存在するナトリウムイオン又は塩化物イオンであることが好ましい。例えば、ナトリウムイオンに対して、平均値で１５分の１であるカルシウムイオン、或いは、８０分の１であるマグネシウムイオンより、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを分析上問題ないレベルにまで除去することは容易である。カルシウムイオン又はマグネシウムイオンを除去するためには、高レベル純水（例えば、０．１μＳ／ｃｍ以下）、又は超純水（０．０６μＳ／ｃｍ以下）で洗浄するとよいが、コスト的には不利である。

［３］その他
本発明はまた、本明細書の上記［１］で説明した構成のキットを用いた血液分析方法を提供する。血液分析方法は、ヒトに対する医療行為（医師が行う行為）である態様とヒトに対する医療行為ではない態様（例えば、採血者が患者自身であり、かつ分析者が医師以外の者である態様、非ヒト動物に対する態様、等）が含まれる。本発明の血液分析方法は、対象者自身が血液を採取する自己採血で実施してもよいし、医師等の有資格者が注射器を使用して血液を採取する一般採血においても実施してもよい。好ましい態様としては、患者本人が、ランセットなどのナイフ付の器具を用いて指先などを傷つけて皮膚外に滲み出た血液を採取する。

本発明のキットを用いた分析の対象となる生体試料は血液であり、血液とは、血清又は血漿を含む概念である。血液の起源はヒトに限定されず、ヒト以外の動物（非ヒト動物）である哺乳類、鳥類、魚類等であっても良い。ヒト以外の動物としては、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、クマ、パンダ等が挙げられる。好ましくは、生体試料の起源はヒトである。

本発明のキットを用いて分析を行う場合、分析の対象成分は限定されず、血液中に含まれるあらゆる物質が対象となる。例えば臨床診断に用いられる血液中の生化学検査項目、腫瘍マーカーや肝炎のマーカー等各種疾患のマーカー等が挙げられ、タンパク質、糖、脂質、低分子化合物等が挙げられる。また、測定は物質濃度だけでなく、酵素等の活性を有する物質の活性も対象となる。各対象成分の分析は、公知の方法で行うことができる。

以下、本発明の実施例及び比較例について説明する。

血液に恒常的に存在する標準成分であるナトリウムイオンを標準物質とし、ナトリウムイオン濃度の平均値を１４２ｍｍｏｌ／Ｌとすると、血液検体を希釈液で希釈し、分離回収した血漿中に存在するナトリウムイオンの平均値が算出できる。一方、部材に由来する希釈液中のナトリウムイオン量（血液由来でないナトリウムイオン量、即ち、コンタミ成分）が、血漿中のナトリウムイオン量の±２％以下であれば、希釈倍率の算出を高精度に維持できることが判っているので、希釈液を３００μＬとし、希釈倍率が３〜２５倍の範囲において、希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度（希釈液に対する重量％）を算出した。結果を図２に示す。

例えば、希釈倍率５倍においては、希釈液中の部材に由来するナトリウムイオンの許容濃度は１．７質量％、即ち希釈液３６０μＬに対してナトリウムイオンの許容溶出量は±６．１μｇであり、また、希釈倍率２０倍においては、希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度は０．３５質量％、即ち、希釈液３６０μＬに対して、±１．３μｇとなり、希釈倍率が高くなるにつれて、急激に希釈液に溶出するナトリウムイオンの許容溶出量が厳しくなり、より少ない希釈液の溶出量がコンタミとして、希釈倍率の精度を低下させてしまうことが判る。

（参考例１）
１．部材の洗浄と希釈液の調製
デメカル血液検査キット（株式会社リージャー社）を用いた。その際、血液検査キットの部材であるボトル（希釈液を収容するための第一の収容器具）、フィルター（希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具）、ガスケット（分離器具を保持するための保持器具）を、洗浄なし、水道水洗浄、蒸留水洗浄、純水洗浄（電気伝導度１μＳ／ｃｍ）を事前に実施した。そして、下記のように調製した希釈液−１の３６０μＬをボトルに入れ、ガスケットで保持されたフィルターをボトルに押し込んで希釈液をろ過し、フィルターを通過した液のナトリウムイオン量を測定した。なお洗浄は、水を部材にシャワー状に当てることにより行った。

（希釈液組成）
希釈液を以下の組成で調製した。浸透圧は、ＯＳＭＯＡＴＡＴ ＯＭ−６０４０（アークレイ（株）社製）を用いて測定した値を表示した。浸透圧の単位は、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす。
ＨＥＰＥＳ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
２−アミノー２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−マンニトール ２８４ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化リチウム １ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ−２Ｋ ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＡＬＰ（ピリドキサールリン酸） ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
チアベンダゾール ０．０００１質量％
アミカシン硫酸塩 ０．０００３質量％
硫酸カナマイシン ０．０００５質量％
メロペネム三水和物 ０．０００５質量％
浸透圧 ３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ
ｐＨ ７．４

２．ナトリウム濃度の測定
１．で調製したそれぞれの希釈液について、ナトリウム濃度の測定を行った。測定には、β−ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、それぞれの希釈液中のナトリウム濃度とβ−ガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素活性法により測定した。具体的には、ナトリウムイオンを含まない精製水で血液の希釈液を５倍希釈した後、３μＬを秤量し下記のように調製した第一試薬５２μＬを加えて、３７℃で５分間加温し、下記のように調製した第二試薬を２６μＬ加え、１分間の吸光度の変化をＪＣＡ−ＢＭ６０５０型生化学自動分析装置（日本電子（株）社製）を用いて主波長４１０ｎｍ、副波長６５８ｎｍで吸光度を測定することにより求めた。あらかじめ作成した検量線から、ナトリウムの濃度を測定した。

（ナトリウム測定試薬の調製）
以下の組成のナトリウム測定試薬を調製した。
第一試薬
ＨＰＥＰＳ・ＬｉＯＨ（ｐＨ８．０） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｄ−マンニトール ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ−アセチルシステイン ３０ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム １．５２ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ガラクトシダーゼ １．１ｋＵ／Ｌ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０５質量％
第二試薬
ＨＰＥＰＳ・ＬｉＯＨ（ｐＨ８．０） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ １５ｍｍｏｌ／Ｌ

各種洗浄での分離後の上澄み液を５ずつ作製した、希釈液中に溶出するＮａイオン量の平均値とばらつきの尺度である変動係数であるＣＶ（coefficient of variation）（％）をもとめた。結果を表１に示した。

図２に血液検査キットの部材（ボトル、ガスケット、フィルター）の純水洗浄及び、水道水洗浄における希釈液に溶出するナトリウムイオンの希釈液に対する濃度レベルを点線で記入した。
図２及び表１の結果から、血液中に存在する恒常性のある成分であるナトリウムイオンを標準物質に用いた場合において、血液検査キットの部材であるボトル、ガスケット、フィルターを事前に純水洗浄しておくことで、希釈液に溶出するナトリウムの希釈液に対する濃度を平均値で０．１４重量％程度に低下させることができ、高い希釈倍率までの広い範囲において、高精度の希釈倍率を算出するための希釈液へのナトリウムイオンの許容溶出濃度を十分にクリアできることが判った。実験では、ナトリウムイオンを実質的に含まない希釈液に含まれるリチウムイオンを標準物質とした希釈液で実施したが、リチウムイオンの有無に関わらず、実質的にナトリウムイオンを含まなければ、同様の結論を得ることは言うまでもない。

（実施例１）
（希釈液中のリチウムイオンの測定）
参考例１で調製したそれぞれの希釈液に対して、リチウムイオン濃度を以下のように測定した。
希釈液に添加したリチウムイオンの測定は、キレート比色法（ハロゲン化ポリフィリンキレート法：ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ−５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌ−２１Ｈ，２３Ｈ，−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）により行った。具体的には、リチウムイオンを含まない精製水を用いて血液の希釈液を４．５倍に希釈した後、５μＬを秤量し下記のように調製した第三試薬５５μＬを加えて、３７℃で１０分間加温し、ＪＣＡ−ＢＭ６０５０型生化学自動分析装置（日本電子（株）社製）を使用して、主波長５４５ｎｍ、副波長５９６ｎｍで吸光度を測定することにより求めた。あらかじめ作成した検量線から、リチウムイオンの濃度を測定が可能である。

（リチウムイオン用測定試薬の調製）
以下の組成のリチウムイオン職定試薬を調製した。
第三試薬
Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ−５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌ−２１Ｈ，２
３Ｈ−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ０．０５質量％
ジメチルスルホキシド ５質量％
トリエタノールアミン ２質量％
ポリエチレングリコール−ｔ−オクチルフェニルエーテル ２質量％
ドデシル硫酸ナトリウム ２質量％

血液血漿の希釈倍率を求める方法と計算式を以下に示す。

Ａ：緩衝液を発色させた際の吸光度
Ｂ：血漿添加後の吸光度変化量
Ｃ：血漿ナトリウム中央値１４２ ｍｍｏｌ／Ｌの吸光度
Ｄ：血漿希釈後のナトリウム濃度における吸光度
Ｘ：血漿希釈倍数
血漿の緩衝液による希釈倍数は下記の（１）式の関係を用いた。

上記の（１）式のように、希釈液中に存在する内部標準物質のリチウムイオンの希釈液の情報と、血液に恒常的に存在する標準成分として、ナトリウムイオンの情報の平方の和の平方根を求めることで、内部標準物質と血液に恒常的に存在する標準成分の両方の情報から、希釈率を求めることが可能であり、血液に恒常的に存在する標準成分の溶出量を規定したキットを用いることで、精度の高い希釈率の測定が可能となることがわかる。

（実施例２）
ボランティアの患者から、インフォームドコンセントを行った後に静脈から注射器で採取した血液数１０μＬをスポンジに回収し、参考例１と同様に、純水洗浄を事前に実施したボトル、フィルター、ガスケットを用いたキットを使用して準備した希釈液にスポンジに回収した血液を混合し、フィルタで血球を分離した。このようにして得た血球分離後の希釈血漿に対して、参考例１と同様にしてナトリウムイオンの濃度を測定した。また、同じ希釈血漿に対して、下記に示す方法により、総タンパクの濃度を測定した。

（希釈血漿中の総タンパク濃度の測定）
ビューレット法を測定原理とする測定を行った。ビウレット試薬：３．０ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸銅 ４００μＬ、酒石酸カリウムナトリウム ２１．３ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＯＨ ０．７５ｍｏｌ／Ｌを準備し、希釈血漿と混合した。混合後、３７℃で１０分間放置して、アルカリ性下で血漿中のタンパクと銅イオンによる５４０〜５６０ｎｍの青紫色を呈する錯体が形成されるまで待ち、５４５ｎｍで吸光度を測定し、標準溶液の吸光度から得た検量線を用いて血球分離後の希釈血漿中の総タンパク濃度を定量した。

上記のように測定した、ナトリウムイオン濃度、総タンパク濃度の測定値と、恒常的に血漿中に存在するナトリウムイオン濃度、総タンパク濃度の標準成分の濃度とから、それぞれ血漿の希釈倍率を算出したところ、一致した希釈倍率が得られた。従って、ナトリウムイオン濃度に加えて、ナトリウムイオンとは異なる少なくとも１種類の恒常性物質を用いて希釈倍率を求めることにより、部材に由来する標準成分の量を規定した血液検体中の対象成分の濃度の分析が正常に行われていることがわかり、測定結果の検証が可能であることがわかった。

１ 血液分離器具
２ 採血容器
３ 筒体
４ キャップピストン
５ 密閉蓋
６ キャップ
７ パッキン
８ 螺子部
９ 係止部
１０ 底部
１１ 脚部
１２ スリット溝
１３ 希釈液
１４ 拡径部
１５ 薄肉部
１６ 本体部
１８ 縮径部
１９ 係止突起部
２０ 外鍔部
２１ 濾過膜
２２ カバー
２６ 摘み部
２７ 心棒部
２８ 空間
２９ 下端部
３１ 段差部
３３ 上端部
３４ 頂部

Claims (16)

1. 血液検体を希釈するための希釈液と、
   前記希釈液が収容された第一の収容器具、前記希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、前記分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具からなる群より選択される部材と、
   を含む、血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析するための、血液検査キットであって、
   前記希釈液中に含まれうる前記部材に由来する前記標準成分の量を規定したことを特徴とする、血液検査キット。
2. 前記希釈液中に含まれうる前記部材に由来する前記標準成分の量が、希釈液の量の０．５質量％以下である、請求項１に記載の血液検査キット。
3. 前記希釈液の容量が、血漿の容量の１５倍以下である、請求項１又は２に記載の、血液検査キット。
4. 血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、請求項１から３のいずれか１項に記載の血液検査キット。
5. 血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに別の血液中に恒常的に存在する標準成分である、請求項１から４のいずれか１項に記載の血液検査キット。
6. 前記別の標準成分が、総タンパク又はアルブミンである、請求項５に記載の血液検査キット。
7. さらに別の血液中に恒常的に存在する標準成分を用いて、前記血液検体中の対象成分の濃度の分析を検証する、請求項１から６のいずれか１項に記載の血液検査キット。
8. 前記血液検査キットが備える部材が、前記希釈液で希釈された血液検体から血漿を回収するための分離器具を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の血液検査キット。
9. 前記希釈液が、血液中に恒常的に存在する標準成分を含まない、請求項１から８のいずれか１項に記載の血液検査キット。
10. 前記希釈液が、
    ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２−エチルアミノエタノール、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群より選択されるアミノアルコール化合物、並びに
    ＨＥＰＥＳとも称する２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、ＴＥＳとも称するＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、ＭＯＰＳとも称する３−モルホリノプロパンスルホン酸、及びＢＥＳとも称する（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝剤
    を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の血液検査キット。
11. 前記希釈液が、血液中に存在しない標準成分をさらに含有する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の血液検査キット。
12. 血液中に存在しない標準成分が、リチウムイオン又はグリセロール三リン酸である、請求項１１に記載の血液検査キット。
13. 請求項１から１２のいずれか１項に記載の血液検査キットに用いるための、部材。
14. 部材が、希釈液を収容するための第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、前記分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具からなる群より選択される部材である、請求項１３に記載の部材。
15. 血液中に恒常的に存在する標準成分の除去上有効な条件で部材を洗浄する工程を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の血液検査キットの、又は請求項１３もしくは１４に記載の部材の、製造方法。
16. 前記条件が、電気電導度が１μＳ／cm以下の水の使用である、請求項１５に記載の製造方法。

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