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JP2016533167A - インターロイキン−２融合タンパク質及びその使用 - Google Patents

インターロイキン−２融合タンパク質及びその使用 Download PDF

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JP2016533167A JP2016517535A JP2016517535A JP2016533167A JP 2016533167 A JP2016533167 A JP 2016533167A JP 2016517535 A JP2016517535 A JP 2016517535A JP 2016517535 A JP2016517535 A JP 2016517535A JP 2016533167 A JP2016533167 A JP 2016533167A
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Abstract

本発明は、インターロイキン−２融合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は一つには、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのタンパク質部分に連結されたインターロイキン−２タンパク質部分を含む、融合タンパク質を提供する。

Description

本発明は、インターロイキン−２融合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は一つには、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバータンパク質部分に連結されたインターロイキン−２タンパク質部分を含む融合タンパク質を提供する。
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、主に活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞により産生される多能性サイトカインであり、正常な免疫応答を生じるうえで非常に重要な役割を果たす。ＩＬ−２は、活性化Ｔリンパ球の増殖及び拡張を促進し、Ｂ細胞成長を強化して、単球及びナチュラルキラー細胞を活性化する。
ＩＬ−２は、協調的に発現される、インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ−２Ｒα又はＣＤ２５、「Ｔａｃ」抗原としても知られる）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ−２Ｒβ又はＣＤ１２２）及びインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ−２Ｒγ又はＣＤ−１３２；共通のガンマ鎖）に対するリガンドである。
ＩＬ−２Ｒαは、約１０−８ＭのＫｄでＩＬ−２に結合して「低親和性」ＩＬ−２受容体としても知られており、ＩＬ−２Ｒαのみを発現している細胞でのＩＬ−２の結合は、検出可能な生物学的応答を何ら導くものではない。
ほとんどの細胞、例えば休止Ｔ細胞は、ＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγを発現するのみなのでＩＬ−２に非感受性である。抗原受容体で媒介されるＴ細胞活性化に際し、ＩＬ−２Ｒαは速やかに発現される。ＩＬ−２ＲαがＩＬ−２に一旦結合すると、その後引き続きＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγと連動して、シグナル伝達と、ＩＬ−２で媒介される成長刺激とを導くことになる。
組み換えヒトＩＬ−２（Proleukin（登録商標）、アルデスロイキン）は、転移性黒色腫及び転移性腎癌を処置する免疫療法剤として認可されている。Proleukin（登録商標）は、１５年にわたって癌の処置に使用されてきており、転移性黒色腫又は腎癌の患者でおよそ１５％の、完全又は部分的な奏効率が示されている。しかしながら、Proleukinは肺の水腫及び肝損傷につながる副作用を引き起こす。
Ontak（登録商標）（デニロイキンジフチトクス）、標的指向化リガンドとしてのＩＬ−２と、細胞死滅ペイロードとしての、修飾された細菌性毒素とからなる融合タンパク質であり、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の処置に対して米国で認可されている。OntakはＣＴＣＬを処置するのに有効な薬物であると広く考えられているものの、重大な安全性の問題があり、結果的に米国及び米国以外での認可における使用が限られたものになってしまっている。ＣＴＣＬに対し１９９９年に認可されて以来、関節リウマチ、乾癬、肺癌及び他の徴候における試用でOntakの有効性の有望な兆候が示されているが、毒性副作用の重症度のせいで断念されてきた。したがって、ＩＬ−２の抗悪性腫瘍薬としての使用は、腫瘍応答のために必要な容量に伴う深刻な毒性に起因して限りあるものになっている。
環状順列置換された（circularly permuted）分子は、線状分子（例えばリガンド）の末端が、直接か又はリンカーを介して繋ぎ合わせられて環状の分子を形成し、その後当該環状の分子は別の位置で開環されて、元の分子の末端とは異なる末端を持つ新しい線状分子を形成するものである。ＩＬ−２の環状順列置換された変異形は、例えば２０００年１月４日にPastanらに発行された米国特許第６，０１１，００２号に記載されている。
プログラム細胞死すなわち「アポトーシス」は、動物細胞の発生において共通の現象であり、正及び負の双方に制御される。リンパ系発生並びに細胞集団全体の恒常性維持（ホメオスタシス）における関与に加えて、アポトーシスは、アポトーシス経路の異常な制御に起因する種々の疾患及び傷害で重要な役割も果たす。逆に、アポトーシスの異常な抑制の結果、細胞の過増殖を引き起こす可能性があり、これは癌及び他の過増殖性障害につながる。
アポトーシスは、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーを含むいくつかのタンパク質によって制御されている。Ｂｃｌ−２は、アポトーシスを制御するものとして同定された最初のタンパク質の１つであった（Cleary et al., Cell 47: 19-28, 1986; Tsujimoto and Croce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5214-5218, 1986）。その発見以降、いくつかのＢｃｌ−２関連タンパク質（「Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質」又は「Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー」）が、アポトーシスの制御因子として同定されている（White, Genes Dev. 10: 1-15, 1996; Yang et al., Cell 80:285-291, 1995）。
癌などの処置のための治療薬がいくつか検討されているが、臨床におけるそれらの使用を制限する限定事項を示すものである。例えば、多くの化学療法剤は、増殖している新生物性細胞においてアポトーシスを誘導することによって作用するが、それらの治療的価値は、正常細胞に対するそれらの毒性の程度によって限定される。標準的なアポトーシス阻害分子、例えばペプチド型カスパーゼ阻害剤（例えばＤＥＶＤ型）での処置は、これらの阻害剤の膜透過性が低いために臨床的作業には不要であることが分かっている。
癌細胞を選択的に排除しようと企図して、標的指向化された免疫毒素（例えば細菌性毒素などの毒性分子と、標的指向化ドメイン由来の、典型的には抗体からの分子との間の遺伝的又は生化学的融合体）が提案されている。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）変異形が作製され、癌細胞を選択的に死滅させるそれらの能力について試験されている（Thorpe et al., Nature 271 :752-755, 1978; Laske et al, Nature Medicine 3 : 1362-1368, 1997）。同様に、緑膿菌（シュードモナス）外毒素（ＰＥ）融合タンパク質が、可能性のある癌療法として研究されている（Kreitman and Pastan, Blood 90:252-259, 1997; Shimamura et al. Cancer Res. 67:9903-9912; 2007）。ＤＴ−ＢｃｌｘＬ融合タンパク質は、様々な細胞型においてスタウロスポリン、γ−照射及びポリオウイルスにより誘導されるアポトーシスを阻止するそれらの能力について検証されている（Youle et al, Proc Natl Acad Sci. 96:9563-9567）。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＢｃｌｘＬ（ＧＭ−ＣＳＦ−ＢｃｌｘＬ）融合タンパク質は、ヒト単球の増殖を高め、また誘導された細胞死から細胞を保護することが示されている（Youle et al, JBC 282(15): 11246-11254）。
本発明インターロイキン−２融合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は一つには、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバータンパク質部分に連結されたインターロイキン−２タンパク質部分を含む融合タンパク質及びその使用を提供する。
１つの態様では、本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びＢｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、当該Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、ＢＨ３ドメインを含むアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチド（Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ／Ｂｏｄ、Ｈｒｋ、Ｂａｋ又はＢａｘなど）であってよい。ＢＨ３ドメインはさらに、リン酸化を低減する変異を含んでよい。リン酸化を低減する変異をさらに含む、前記ＢＨ３ドメインを含むアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、Ｂａｄポリペプチドであってよい。当該融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒを発現している標的細胞の細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することができてよい。
いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチド（ＢＣＬ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ又はＢｃｌ−２など）であってよい。当該融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒを発現している標的細胞の細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができてよい。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２環状順列置換（ｃｐ）されていてよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒβに対する選択性が増強されているか、又は未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒγに対する選択性が増強されているか、又はＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγとの間の会合を破壊する、変異体ＩＬ−２であってよい。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質はさらにリンカーを含んでよい。リンカーは、配列GSを有するか、又はユビキチン若しくはユビキチン変異形分子であってよい。
いくつかの態様では、本願明細書に記載されるような融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞が提供される。
いくつかの態様では、本願明細書に記載されるような融合タンパク質を、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞含む医薬組成物が提供される。
いくつかの態様では、細胞死を誘導する方法であって、それを必要とする被験者に、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することによって細胞死を誘導する方法が提供される。
いくつかの態様では、ＩＬ−２Ｒを発現する標的細胞を、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることにより細胞死を誘導する方法が提供される。
いくつかの態様では、癌を処置する方法であって、それを必要とする被験者に、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することによって癌を処置する方法が提供される。
いくつかの態様では、癌を処置する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する新生物性細胞を、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることにより癌を処置する方法が提供される。
いくつかの態様では、癌を処置する方法であって、腫瘍微小環境でＩＬ−２Ｒを発現する非悪性細胞を、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることにより癌を処置する方法が提供される。
いくつかの態様では、癌を処置する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する免疫細胞を、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることにより癌を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞はナチュラルキラー細胞であり、前記融合タンパク質は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドである。他に採用しうる実施形態では、前記免疫細胞は制御性Ｔ細胞であり、前記融合タンパク質はアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドである。
いくつかの態様では、自己免疫障害を処置する方法であって、それを必要とする被験者に、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することによって自己免疫障害を処置する方法が提供される。
いくつかの態様では、細胞増殖を刺激する方法であって、それを必要とする被験者に、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することによって細胞増殖を刺激する方法が提供される。
いくつかの態様では、細胞増殖を刺激する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する標的細胞を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることにより細胞増殖を刺激する方法が提供される。
いくつかの態様では、免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする被験者に、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することにより免疫応答を増強する方法が提供される。
いくつかの態様では、免疫応答を増強する方法であってＩＬ−２Ｒを発現する標的細胞に、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターを接触させることにより免疫応答を増強する方法が提供される。
いくつかの態様では、養子細胞移入療法又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法における使用を目的として設計操作されたＴ細胞を増殖又は拡張する方法であって、前記設計操作されたＴ細胞を、本発明に係る融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法が提供される。
いくつかの態様では、細胞死を誘導するため、癌を処置するため、自己免疫障害を処置するため、細胞増殖を刺激するため、免疫応答を増強するため、又は養子細胞移入療法若しくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法における使用を目的として設計操作されたＴ細胞を増殖若しくは拡張するための、細胞における又はそれを必要とする被験者における、本発明に係る融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターの使用が提供される。
他に採用しうる態様の種々の実施形態において、前記被験者はヒトであってよい。
本要約は必ずしも、本発明のすべての特徴を記載するものではない。
本発明のこれらの特徴及び他の特徴は、添付の図面を参照する以下の説明からさらに明らかになるであろう。
図１は、ｐＧＷ０７大腸菌発現ベクターを示す図である。 図２Ａ〜Ｂは、ｐｒｏＳ２−ＢＡＤの核酸配列（Ａ）及びアミノ酸（Ｂ）配列を示す図である。
本開示は一つには、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に連結されたＩＬ−２タンパク質を含む融合タンパク質、及びその使用を提供する。
ＩＬ−２タンパク質
ＩＬ−２タンパク質は、未変性ＩＬ−２タンパク質と、さらには変異形ＩＬ−２タンパク質を包含する。「未変性」又は「野生型」ＩＬ−２配列とは、本願明細書で使用する場合、天然源から精製されたか又は組み換え技術を用いて作製されたかの、ヒトＩＬ−２配列（例えば、受託番号：ＮＰ＿０００５７７．２）を称する。いくつかの実施形態では、野生型ＩＬ−２配列は、以下のProleukin（登録商標）（アルデスロイキン）配列を含む。
Figure 2016533167
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−２タンパク質は、未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒβに対する選択性が増強されている、又は未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒγに対する選択性が増強されている、又は例えば、国際公開第ＷＯ２０１２／０８８４４６号パンフレットに記載の、ＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγとの間の会合を破壊する、変異形ＩＬ−２タンパク質である。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−２タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2016533167
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−２タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2016533167
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγとの間の会合を破壊するＩＬ−２タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比較して以下の置換：１８Ｒ、２２Ｅ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｉ、８９Ｉ、９３Ｖ及び１２６Ｔ；又は１８Ｒ、２２Ｅ、７４Ｓ、８０Ｌ、８１Ｔ、８５Ｖ、８６Ｉ、８９Ｉ、９２Ｆ、９３Ｖ及び１２６Ｔ；又は１８Ｒ、２２Ｅ、８０Ｆ、８１Ｄ、８５Ｖ、８６Ｖ、８９Ｉ、９２Ｆ、９３Ｖ及び１２６Ｔを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−２タンパク質は、例えば、２０００年１月４日にPastanらに発行された米国特許第６，０１１，００２号に記載のように、環状順列置換（ｃｐ）されている。
他に採用しうる実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−２タンパク質は、以下のタンパク質を含む。
Figure 2016533167
本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−２タンパク質の例として、本願明細書に記載されるもの、さらには変異形ＩＬ−２タンパク質がＩＬ−２受容体に結合する能力を保持するか、又は例えば国際公開第ＷＯ２０１２／０８８４４６号パンフレット若しくはLevinら、Nature 484: 529-533, 2012に記載されるように未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒβに対する選択性の増強を有するか若しくは未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒγに対する選択性が増強されているか、又は所望の生物活性を保持する限りにおいて、未変性ＩＬ−２（「変異形ＩＬ−２タンパク質」）と少なくとも８０％の配列一致度（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はさらに少なくとも９９％の配列一致度）を有する配列が挙げられる。
本開示のＩＬ−２タンパク質には、未変性アミノ酸のＩＬ−２タンパク質よりも小さいものでありうる断片であって、当該ＩＬ−２タンパク質断片はＩＬ−２受容体に結合する能力を保持するか、又は例えば国際公開第ＷＯ２０１２／０８８４４６号パンフレット若しくはLevinら、Nature 484: 529-533, 2012に記載されるように未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒβに対する選択性の増強を有するか若しくは未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒγに対する選択性が増強されているか、又は所望の生物活性を保持するかの条件付きであり、未変性配列の断片として、又はｃｐフォーム若しくはその断片として含まれるということを理解されたい。
本開示に包含されるのは、本願明細書に記載されるような、又は当該技術分野で公知のＩＬ−２タンパク質をエンコードする核酸分子であるということも理解されたい。
ＩＬ−２核酸分子の例として以下のものが挙げられる。
Figure 2016533167
ＢＣＬ−２ファミリータンパク質
Ｂｃｌ−２関連タンパク質又はポリペプチド（「Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質」又は「Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー」）は、アポトーシスの制御に関わっている。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、２つの別異のカテゴリー、すなわち、細胞死を阻害するもの（「抗アポトーシス性」Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質）、及び細胞死を増強するもの（「アポトーシス促進性」Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質）に属する。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４と表される、１から４の保存されたＢｃｌ−２相同性（ＢＨ）ドメインを共有する。
抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質には、Ｂｃｌ−２自体、Ｂｃｌ−ｘＬ（Boise et al., Cell 74:597-608, 1993; 例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０７８１７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２３１１５）、Ｂｃｌ−ｗなどが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質において使用することができるＢｃｌ−ｘＬタンパク質は、以下のとおりの配列を含む。
Figure 2016533167
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの少なくとも断片を含み、ここで抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又は断片は、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができる。「細胞生存を増強すること」とは、細胞死のリスクにある細胞が生存することになる蓋然性を増加させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞増殖を増強すること」とは、細胞の成長又は増殖を増加させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること」とは、細胞死のリスクにある細胞がアポトーシス、ネクローシス又はその他の何らかの型の細胞死に至ることになる蓋然性を低下させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。細胞生存の増強、細胞増殖の増強、又は細胞死若しくはアポトーシスの阻害を測定するための好適なアッセイは、本願明細書に記載されるか、又は当該技術分野で公知のものである。
アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質には、ＢａｄなどのＢＨ３ドメインを有するもの（例えば、受託番号：ＮＰ１１６７８４又はＣＡＧ４６７５７）、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ（例えば、受託番号：ＣＡＧ３０２７６）、Ｂｉｄ（例えば、受託番号：ＣＡＧ２８５３１）、Ｂｉｍ／Ｂｏｄ（例えば、受託番号：ＮＰ６１９５２７）、Ｈｒｋ、Ｂａｋ、又はＢａｘが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質において使用することができるアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、リン酸化を防止するために変異される（例えばセリン残基での変異、例えばセリンをアラニンに変異）。
Ｂａｄ（細胞死のＢｃｌ−２−関連作動薬）は、プログラム細胞死（アポトーシス）の制御因子である。Ｂａｄは、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２とヘテロ二量体を形成すること、並びにそれらの死抑制因子活性を逆転させることによって細胞アポトーシスを正に制御する。Ｂａｄのアポトーシス促進性活性は、そのリン酸化によって制御される。本開示の融合タンパク質において使用することができるＢａｄタンパク質の例としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ４６７５７；ＡＡＨ０１９０１．１；及びＣＡＧ４６７３３．１のもの、さらには米国特許第６，７３７，５１１号に示される配列のもの（参照により本願明細書に援用したものとする配列）及び本願明細書に記載される、そして変異形が未変性Ｂａｄタンパク質の増強された生物活性を保持するか有する限りにおいて、このような配列と少なくとも８０％の配列一致度（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はさらに少なくとも９９％の配列一致度）を有する配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質において使用することができるＢａｄタンパク質は、リン酸化を低減するセリン変異を第１１２及び／又は１３６位に含む。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質において使用することができるＢａｄタンパク質は、リン酸化を低減するセリンからアラニンへの変異を第１１２及び／又は１３６位に含む。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質において使用することができるＢａｄタンパク質は、以下のとおりの配列を含む。
Figure 2016533167
いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの少なくとも断片を含み、ここでアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又は断片は、細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することができる。「細胞生存を阻害すること」とは、細胞死のリスクにある細胞が生存することになる蓋然性を低減する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞増殖を阻害すること」とは、細胞の成長又は増殖を低減する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞死若しくはアポトーシスを増強すること」とは、細胞死のリスクにある細胞がアポトーシス、ネクローシス又はその他の何らかの型の細胞死に至ることになる蓋然性を増加させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。細胞生存の阻害、細胞増殖の阻害、又は細胞死若しくはアポトーシスの増強を測定するために好適なアッセイは、本願明細書に記載されるか、又は当該技術分野で公知のものである。
本開示に包含されるのは、本願明細書に記載されるようなＢｃｌ−２ファミリーメンバーをエンコードする核酸分子であるということも理解されたい。
Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの核酸分子の例としては、以下のものが挙げられる。
Figure 2016533167
ＩＬ−２／Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質
本開示にかかる「融合タンパク質」は、本願明細書に記載されるような、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーに、任意の付加的配列又は部分（リンカーなど）で連結されたＩＬ−２タンパク質、さらにはこのような融合タンパク質をエンコードする核酸分子を含む。さらに含まれるのは、融合タンパク質をエンコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結された組み換え核酸分子、このような分子を含むベクター、及びこのような分子を含む遺伝子導入細胞である。
ＩＬ−２（ｃｐＩＬ−２及びＩＬ−２断片並びに変異形を含む）は、Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ／Ｂｏｄ、Ｈｒｋ、Ｂａｋ若しくはＢａｘ又はこれらの組み合わせにより例示されるようなＢＨ３ドメインを含むアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドなどのＢｃｌ−２ファミリータンパク質、又はＢｃｌ−２、ＢＣＬ−ｘＬ又はＢｃｌ−ｗにより例示されるような抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドに、所望のとおりに組み合わせが抗アポトーシス性又はアポトーシス促進性活性のいずれかを保持している限りにおいて、連結させることができる。いずれの型のＩＬ−２又は誘導体も使用できる。例えば、ＩＬ−２、又はＩＬ−２受容体に結合するＩＬ−２の断片を使用できる。加えて、複数のＢｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形を、ＩＬ−２又はその断片若しくは変異形に連結可能であり、又は複数のＩＬ−２タンパク質又はその断片若しくは変異形を、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能である。
ｃｐＩＬ−２は、Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ／Ｂｏｄ、Ｈｒｋ、Ｂａｋ若しくはＢａｘ又はこれらの組み合わせにより例示されるＢＨ３ドメインを含むようなアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドなどのＢｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形、又はＢｃｌ−２、ＢＣＬ−ｘＬ又はＢｃｌ−ｗにより例示されるような抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドに、所望のとおりに組み合わせが抗アポトーシス性又はアポトーシス促進性活性のいずれかを保持している限りにおいて、連結させることができる。いずれの型のｃｐＩＬ−２又は誘導体も使用できる。加えて、複数のｃｐＩＬ−２タンパク質又はその断片若しくは変異形を、単数のＢｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能であり、又は複数のＢｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形を、ｃｐＩＬ−２タンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能である。
融合タンパク質の例を表１に示す。
Figure 2016533167
Figure 2016533167
ＩＬ−２タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーメンバーとの連結又は「融合」は、ＩＬ−２タンパク質の一部分がＢｃｌ−２ファミリーメンバーの一部分に直接付着するように直接であってよい。例えば、ＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列の一端を、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのアミノ酸配列の端に直接付着させることができる。例えば、ＩＬ−２タンパク質のＣ末端をＢｃｌ−２ファミリーメンバーのＮ末端に連結させることができ、又はＢｃｌ−２ファミリーメンバーのＣ末端をＩＬ−２タンパク質のＮ末端に連結させることができる。このような融合タンパク質を作製する方法は当該技術分野で通例のものであり、例えば組み換え分子生物学的方法を用いる。
リンカー
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２タンパク質部分は、リンカーによって間接的に、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー部分に連結させることができる。リンカーは、例えば、単純に２つの部分を連結する簡便な方法として、２つの部分を空間的に分離する手段として、ＩＬ−２タンパク質若しくはＢｃｌ−２ファミリーメンバー、又はこれらの組み合わせに付加的な機能性を提供するうえで役立つことができる。
一般に、ＩＬ−２タンパク質部分とＢｃｌ−２ファミリーメンバー部分とを連結させるリンカーは、（１）２つの分子を折り重ねて互いに独立に作用させ、（２）２つの部分の機能性ドメインを干渉しうる規則二次構造を生じる傾向を有さず、（３）機能性タンパク質ドメインと相互作用しうる疎水性若しくは荷電特性を最低限とし、且つ／又は（４）２つの領域の空間的分離をもたらすように設計可能である。例えば、ある例では、ＩＬ−２タンパク質とＢｃｌ−２ファミリーメンバーとを空間的に分離して、ＩＬ−２タンパク質がＢｃｌ−２ファミリーメンバーの活性を干渉し、且つ／又はＢｃｌ−２ファミリーメンバーがＩＬ−２タンパク質の活性を干渉することを防止するのが望ましいことがある。リンカーは、例えば、ＩＬ−２タンパク質とＢｃｌ−２ファミリーメンバーとの間の結合に不安定性を、酵素切断部位（例えば、プロテアーゼに対する切断部位）を、安定性配列を、分子タグを、検出可能なラベルを、又は種々のこれらの組み合わせを提供するのにも使用可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩＬ−２タンパク質（ｃｐ分子内など）又はＢｃｌ−２ファミリーメンバーの２つのドメインの間に存在することができる。
リンカーは、二官能性又は多官能性であることができ、すなわち、少なくとも概ね、ＩＬ−２タンパク質に結合することができるか又は結合するように修飾されているリンカーの第一端部に、又はその近傍に第一の反応性官能基と、修飾されているＢｃｌ−２ファミリーメンバーに結合することができるか又は結合するように修飾されているリンカーの反対側の端部に、又はその近傍に第二の反応性官能基とを含む。当該２つ以上の反応性官能基は、同じ（すなわちリンカーがホモの二官能性である）か、又はそれらは異なる（すなわちリンカーがヘテロの二官能性である）ことができる。
リンカーの長さ及び組成は、かなり変動可能である。リンカーの長さ及び組成は一般に、リンカーの意図された機能と、任意に、合成の容易さ、安定性、特定の化学物質及び／又は温度パラメータに対する耐性並びに生体適合性などの他の因子とを考慮して選択される。例えば、リンカーは、ＩＬ−２タンパク質及び／又はＢｃｌ−２ファミリーメンバーの活性を有意に干渉すべきではない。
本開示にかかる融合タンパク質での使用に好適なリンカーには、ペプチドが含まれる。リンカーは、組み換えＤＮＡ技術を用いてＩＬ−２部分及び／又はＢｃｌ−２ファミリーメンバー部分に付着させることができる。このような方法は当該技術分野で周知であり、本技術の詳細は例えば、Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989若しくはAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1994、又はその更新版に見出される。
連結されるペプチドは、１〜５００アミノ酸残基（１〜１００、１〜５０、６〜３０、１〜４０、１〜２０、又は３０アミノ酸未満若しくは５〜１０アミノ酸など）の鎖長を有することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７若しくは８アミノ酸の長さでありえ、又は約１０、２０、３０、４０又は５０アミノ酸の長さであることができる。
典型的には、可撓性タンパク質領域内の表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒが含まれ、このようなアミノ酸はリンカー配列内で使用することができる。Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の中性アミノ酸もまた、リンカー配列内で使用することができる。追加のアミノ酸を、リンカー内に入れて特有の制限酵素部位をリンカー配列にもたらし、融合体の構築を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えばアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）を含むものでも、又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）であっても、又はユビキチン配列：
GGGSMQIFVRTLTGRTITLEVEPSDTIENVRARIQDREGIPPDQQRLIFAGRQLEDGRTLSDYNIQRESTLHLVLRLRGGGS（配列番号１５）若しくはその変異形を含むものでもよい。リンカーとしての使用に好適なユビキチン分子は、例えば、Bachran, Cら、"Anthrax toxin-mediated delivery of the Pseudomonas exotoxin A enzymatic domain to the cytosol of tumor cells via cleavable ubiquitin fusions MBio. 2013 Apr 30; 4(3): e00201-13、又はＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１２／１３９１１２号に記載されている。
１つの例では、補体系の酵素、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素による切断を受けやすいペプチドリンカーが使用されてもよい。別の例によれば、ＩＬ−２タンパク質は、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン、トロンビン又はトリプシンなどのタンパク質分解活性を有する酵素による切断を受けやすいリンカーを介して付着させることができる。加えて、ＩＬ−２タンパク質は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）を介してＢｃｌ−２ファミリーメンバーに付着させることができる。例えば、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に関連して、多くの腫瘍は本来、高レベルのグルタチオン（還元剤）を遊離しているので、これがジスルフィド結合を低減することができ、次いで送達の部位でアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの遊離がなされる。
いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質は、切断可能なリンカー領域により連結されたＢｃｌ−２ファミリーメンバー及びＩＬ−２タンパク質を含むとよい。別の実施形態では、切断可能なリンカー領域はプロテアーゼで切断可能なリンカーであることができるが、他のリンカーで、例えば小分子により切断可能なものが使用されてもよい。プロテアーゼ切断部位の例としては、因子Ｘａ、トロンビン及びコラゲナーゼによって切断されるものが挙げられる。１つの例では、プロテアーゼ切断部位には、疾患と関連するプロテアーゼによって切断されるものが含まれる。別の例では、プロテアーゼ切断部位は、一般に癌と関連するか又は癌により上方制御されるプロテアーゼによって切断されるものである。このようなプロテアーゼの例は、ｕＰＡ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、カスパーゼ、エラスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、セリンプロテアーゼ）、及びプラスミノーゲン活性化因子ファミリー、さらには線維芽細胞活性化タンパク質である。さらに別の例では、癌関連細胞により分泌されるプロテアーゼによって切断部位が切断される。これらのプロテアーゼの例として、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、及びｕＰＡが挙げられる。別の例では、プロテアーゼ切断部位は、特定の癌と関連するか又はそれにより上方制御されるものである。的確な配列は、当該技術分野で得ることができ、当業者が好適な切断部位を選択するのに困難はないはずである。例として、因子Ｘａにより標的指向化されるプロテアーゼ切断領域は、IEGRである。エンテロキナーゼにより標的指向化されるプロテアーゼ切断領域は、DDDDKである。トロンビンにより標的指向化されるプロテアーゼ切断領域は、LVPRGである。１つの例では、切断可能なリンカー領域は、細胞内プロテアーゼにより標的指向化されるものである。
リンカーは、当該技術分野で公知のような通例の技術を用いて、ＩＬ−２タンパク質部分及び／又はＢｃｌ−２ファミリーメンバー部分に付着させることができる。
ＩＬ−２／Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質の調製
融合タンパク質は、当該技術分野で公知のような通例の方法を用いて調製することができる。融合タンパク質、さらにはそれに対する修飾体は、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて当該融合タンパク質をエンコードする核酸を設計操作することによって、又はペプチド合成によって作製可能である。融合タンパク質に対する修飾体は、例えば、化学修飾及び／又は限定タンパク質分解を用いて融合タンパク質ポリペプチド自体を修飾することにより作製してよい。これらの方法の組み合わせも、融合タンパク質を調製するのに使用してよい。
クローニング及びタンパク質発現の方法は、当該技術分野で周知であり、組み換えタンパク質の発現のための技術及び系の詳細な説明は、例えばCurrent Protocols in Protein Science（Coligan, J. E., et al, Wiley & Sons, New York）に見出すことができる。当業者であれば、組み換えタンパク質を提供するために実に様々な発現系を使用できることを理解するであろう。したがって、融合タンパク質は原核生物宿主（例えば、大腸菌、エロモナス・サルモニシダ（A. salmonicida）又は枯草菌）又は真核生物宿主（例えば、酵母菌属（サッカロマイセス属）若しくはピキア属；哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、若しくはＨｅＬａ細胞；又は昆虫細胞（バキュロウイルス））にて生成できる。融合タンパク質は、当該技術分野で公知の標準的な技術を用いて宿主細胞から精製することができる。
種々の融合タンパク質の例に対する配列を表１に示す。これらの配列の変異形及び相同体は、他に採用しうる配列が所望であれば、標準的な技術（例えば、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, NY (1997及び更新版); Sambrook et al., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989、又はその更新版を参照のこと）を用いてクローニングできる。例えば、核酸配列は、エロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）などの好適な生物から直接、ｍＲＮＡを抽出し、次いでｍＲＮＡ鋳型から（例えばＲＴ−ＰＣＲにより）、又はゲノムＤＮＡからの遺伝子をＰＣＲ増幅することにより、ｃＤＮＡを合成することによって得ることができる。あるいは、ＩＬ−２部分又はＢｃｌ−２ファミリー部分のいずれかをエンコードする核酸配列は、標準的な手法によって適切なｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。単離されたｃＤＮＡは次いで、クローニングベクター又は発現ベクターなどの好適なベクターに挿入される。
変異を（所望に応じて）当該技術分野で周知のインビトロ部位特異的変異誘発技術により、特定の、事前に選択した位置に導入することができる。変異は、コード配列を作り上げている適切なヌクレオチドの１つ以上の欠失、挿入、置換、反転、又はこれらの組み合わせによって誘導することができる。
発現ベクターはさらに、融合タンパク質をエンコードする配列の効率的な転写のために必要とされる転写エレメントなどの制御エレメントを含むことができる。ベクターに取り込ませることができる制御エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及びポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子改変された融合タンパク質をエンコードする核酸配列に作動可能に連結された制御エレメントを含むベクターを、融合タンパク質を作製するために使用することができる。
発現ベクターは、親和性タグ（例えば、金属親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンをエンコードする配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（転移酵素）（ＧＳＴ）をエンコードする配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をエンコードする配列又はビオチンをエンコードする配列）などの、発現された融合タンパク質の精製を容易にする異種核酸配列を付加的に含んでよい。１つの例では、このようなタグは、融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端に付着され、又は融合タンパク質内に位置させることもできる。タグは、当該技術分野で公知の方法に従い、発現された融合タンパク質から使用に先立って除去することができる。あるいは、タグが融合タンパク質の所望の活性の能力を干渉することがないのであれば、融合タンパク質に保持させておくことができる。
融合タンパク質は、１以上のリンカー、さらには他の部分を、所望のとおりに及び／又は本願明細書で論じられるとおりに含むことができる。これらには、アビジン若しくはエピトープなどの結合領域、又はポリヒスチジンタグなどのタグであって、融合タンパク質の精製及び加工に有用でありうるもの、さらには本願明細書に記載されるような他のリンカーを含むことができる。加えて、身体又は細胞での融合タンパク質の行き来を簡便にモニターすることが可能となるように、検出可能なマーカーを融合タンパク質に付着させることができる。このようなマーカーには、放射性核種、酵素、フルオロフォア、発色団などが含まれる。
当業者は、エンコードされるタンパク質の生物活性に影響を及ぼすことなく数々の方法でＤＮＡが変更されうるということはわかるであろう。例えば、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列における変化を生み出すために、ＰＣＲを使用することができる。融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列におけるこのような変化は、タンパク質を発現するのに用いられる宿主細胞におけるコドン選好（preference）を至適化するために使用することができ、又は発現を促進する他の配列変化を含んでもよい。
Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーへのＩＬ−２タンパク質の直接的な共有結合、又はリンカーを介した結合は、当該技術分野で公知のとおりの種々の形態をとってよい。例えば、共有結合は、ジスルフィド結合の形態であってよい。成分の１つをエンコードするＤＮＡを、特有のシステインコドンを含むように設計操作することができる。第２成分は、第１成分のシステインと反応性であるスルフヒドリル基で誘導化させることができる。あるいは、スルフヒドリル基を、それ自体か、又はシステイン残基の一部としてかのいずれかにて、固相ポリペプチド技術を用いて導入することができる。例えば、ペプチド内へのスルフヒドリル基の導入は、Hiskey（Peptides 3 : 137, 1981）によって報告されている。
アッセイ
融合タンパク質は、当該技術分野で公知であるか又は本願明細書に記載される標準的な技術を用いてアッセイされうる。
例えば、融合タンパク質が細胞を死滅させるか又はその成長を阻害する能力は、好適な細胞、典型的には標的又は癌細胞を発現している細胞系を用いてインビトロでアッセイされうる。一般に、選択された試験細胞系の細胞が適切な密度まで生育されて、候補融合タンパク質が添加される。融合タンパク質は、培養物におよそ少なくとも１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約０．４ｍｇ／ｍＬ添加できる。いくつかの例では、段階希釈が調べられる。適切なインキュベーション時間（例えば、約４８〜７２時間）の後、細胞生存又は成長を評定する。細胞生存を判定する方法は、当該技術分野で周知であって、レサズリン還元試験（Fields & Lancaster Am. Biotechnol. Lab., 11 :48-50, 1993; O'Brien et al, Eur. J. Biochem., 267:5421-5426, 2000又は米国特許第５，５０１，９５９号参照）、スルホローダミンアッセイ（Rubinstein et al, J. Natl. Cancer Inst., 82: 113-118, 1999）又は中性赤色染料試験（Kitano et al, Euro. J. Clin. Investg., 21 :53-58, 1991; West et al., J. Investigative Derm., 99:95-100, 1992）又はトリパンブルーアッセイが含まれるが、これらに限定されない。例えばCellTiter 96（登録商標）AQueous One 溶液細胞増殖アッセイ（Promega）など、数多くの市販のキットも使用してよい。細胞毒性は、処置培養物における細胞生存の、１以上の対照培養物における細胞生存との比較によって判定され、当該対照培養物の例としては、未処置の培養物及び／若しくは対照化合物（典型的には、既知の治療薬）で前処置された培養物、又は他の適切な対照が挙げられる。
さらなるアッセイは、例えば、Crouchら（J. Immunol. Meth. 160, 81-8）；Kangasら(Med. Biol. 62, 338-43, 1984）；Lundinら（Meth. Enzymol. 133, 27-42, 1986）；Pettyら（Comparison of J. Biolum. Chemilum. 10, 29-34, 1995）；及びCreeら（Anticancer Drugs 6: 398-404, 1995）に記載されている。細胞生存率は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を含めた様々な方法を用いてアッセイすることができる（Barltrop, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1 : 611, 1991; Cory et al, Cancer Comm. 3, 207-12, 1991; Paull J. Heterocyclic Chem. 25, 911, 1988）。細胞生存率に対するアッセイもまた、市販のものを利用できる。これらのアッセイには、ルシフェラーゼ技術を用いてＡＴＰを検出し、健全性（health）又は培養物における細胞数を定量する、CELLTITER-GLO（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega）、及び乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイ（Promega）であるCellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assayが含まれるが、これらに限定されない。
癌の特定の型に対する選択性をもたらす融合タンパク質を、それら融合タンパク質がかかる特定の癌細胞型を標的指向化する能力について試験してもよい。例えば、ＩＬ−２Ｒβ又はＩＬ−２Ｒγを提示している細胞を標的指向化する特異的なＩＬ−２を含む融合タンパク質は、その融合タンパク質が癌細胞を死滅させる能力と、正常細胞又は癌細胞の異なる型（例えば、標的指向化されたＩＬ−２Ｒを発現しないもの）を死滅させるその能力とを比較することにより、このような細胞を選択的に標的指向化する能力について評定することができる。あるいは、ＩＬ−２Ｒβ又はＩＬ−２Ｒγ鎖特異的ＩＬ−２を含む融合タンパク質が細胞の特定の型を選択的に標的指向化できるかどうかを判定するために、当該技術分野で公知のようなフローサイトメトリー法が使用されてもよい。標識化された抗体の、結合済み融合タンパク質への結合は、標的への融合タンパク質の結合を示唆するであろう。いくつかの実施形態では、本発明に係る融合タンパク質を使用して、ナチュラルキラー細胞又は制御性Ｔ細胞などの免疫細胞の集団を増加又は減少させてもよい。
同様に、細胞アポトーシスを測定するためのアッセイが、当該技術分野で公知である。アポトーシスを起こした細胞は、クロマチン凝縮、細胞収縮及び膜小疱形成（blebbing）を含む特徴的な形態学的変化によって特徴付けられ、光学顕微鏡法を用いて明確に観察することができる。アポトーシスの生化学的特徴には、ＤＮＡ断片化、特定の位置でのタンパク質切断、ミトコンドリア膜透過性の増加、及び細胞膜表面上へのホスファチジルセリンの出現が含まれる。アポトーシスに対するアッセイは、当該技術分野で公知である。アッセイの例としてはＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニックエンドラベリング）アッセイ、カスパーゼ活性（具体的にはカスパーゼ−３）アッセイ、並びにｆａｓ−リガンド及びアネキシンＶに対するアッセイが挙げられる。アポトーシスを検出するための市販の製品には、例えば、Apo-ONE（登録商標）Homogeneous Caspase-3/7 Assay, FragEL TUNELキット（ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS, San Diego, Calif）、ApoBrdU DNA Fragmentation Assay（BIO VISION, Mountain View, Calif）、及びQuick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit（BIO VISION, Mountain View, Calif）が含まれる。
候補融合タンパク質を試験するのに好適な様々な細胞系が、当該技術分野で公知であり、多くが市販されている（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）、Manassas, Vaより）。同様に、動物モデルが当該技術分野で公知であり、多くが市販されている。
治療指標及び使用
本願明細書に記載されるような、ＩＬ−２タンパク質とＢｃｌ−２ファミリーメンバーとを含む融合タンパク質は、様々な治療目的に使用することができる。一般に、本願明細書に記載される融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒを発現する細胞が関わっており、且つ細胞増殖を阻害すること若しくは細胞死を増強すること、又は細胞増殖を増強すること若しくは細胞死を阻害することが有益であろうような何れの疾患、障害又は病態の治療又は予防にも使用することができる。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒβ又はＩＬ−２Ｒγを発現する細胞が関わっており、そして受容体の一方の型を他方の型を凌いで選択することが有用であって、且つ細胞増殖を阻害すること若しくは細胞死を増強することが有益であろうようなものか、又は細胞増殖を増強すること若しくは細胞死阻害することが有益であろうようなものか何れかの、いかなる疾患、障害又は病態の治療又は予防にも使用することができる。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される融合タンパク質は、癌又は自己免疫疾患の治療又は予防に使用することができる。
いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、アポトーシス若しくは細胞死を誘導するために、又は癌などの、異常なアポトーシス若しくは細胞増殖と関連する障害を処置するために使用することができる。本願明細書で使用する場合、「癌」「癌性」「過剰増殖性」又は「新生物性」の用語は、自立成長に対する潜在能力を有している細胞（例えば、迅速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常な状態又は病態）をいう。過剰増殖性及び新生物性の病状は、「病的」にカテゴリー付けられうる（例えば、正常からは逸脱しているが病状と関連するわけではない）。したがって、「癌」又は「新生物」で意味するのは、生理学的機能に役立つものでない細胞の望ましくない成長である。一般に、新生物の細胞は、その正常な細胞分裂調節から遊離されており、すなわち、その成長が細胞環境における普通の生化学的及び物理的影響により制御されない細胞である。ほとんどの場合、新生物性細胞は増殖して良性又は悪性、いずれかの細胞のクローンを形成する。癌又は新生物の例としては、形質転換細胞及び不死化細胞、腫瘍、並びに乳房細胞癌腫及び前立腺癌腫などの癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。「癌（cancer）」の用語には、厳密には（technically）良性であるが悪性になるリスクを備えた細胞成長が含まれる。「悪性腫瘍」で意味するのは、何らかの細胞型又は組織の異常成長である。「悪性腫瘍」の用語には、厳密には良性であるが悪性になるリスクを備えた細胞成長が含まれる。この用語は、何れの癌、癌腫、新生物、新生物、又は腫瘍も含む。これらの用語が意味するものに含まれるのはしたがって、組織病理学的なタイプ又は浸潤性のステージに関わらず、あらゆる型の癌性成長又は癌化プロセス、転移性組織又は悪性に形質転換された細胞、組織又は器官である。いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、幹細胞に影響する癌に関連して用いられない。
ほとんどの癌は、３つの広範な組織学的分類に該当する。すなわち、主要な癌であって、上皮細胞、又は器官、腺、若しくは他の身体構造（例えば、皮膚、子宮、肺、乳房、前立腺、胃、腸）の外表面若しくは内表面を覆う細胞の癌であり、且つ転移する傾向のある癌腫；結合組織又は支持組織（例えば、骨、軟骨、腱、靱帯、脂肪、筋肉）から由来する肉腫；並びに骨髄及びリンパ組織から由来する血液腫瘍。癌の例として、癌腫、肉腫、及び造血性新生物性障害（例えば白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。
癌腫は、腺癌（乳房、肺、結腸、前立腺又は膀胱などの分泌をすることができる腺又は器官において一般に発症する）でありえ、又は扁平上皮癌（扁平上皮から発生し、身体の殆どの領域において一般に発症するもの）でありうる。
肉腫は、骨肉腫又は骨原性肉腫（骨）、軟骨肉腫（軟骨）、平滑筋肉腫（平滑筋）、横紋筋肉腫（骨格筋）、中皮肉腫若しくは中皮腫（体腔の膜裏）、線維肉腫（線維性組織）、血管肉腫若しくは血管内皮腫（血管）、脂肪肉腫（脂肪組織）、神経膠腫若しくは星状細胞腫（脳に認められる神経原性結合組織）、粘液肉腫（原始胚性結合組織、又は間葉性若しくは混合中胚葉性腫瘍（混合結合組織型）でありうる。
造血性新生物性障害は、造血性起源の過形成性／新生物性細胞が関わる疾患を含み、例えば、骨髄、リンパ系又は赤血球系統又はその前駆細胞から生じるものである。好ましくは、前記疾患は、低分化急性白血病（例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病）から生じる。さらなる骨髄障害の例としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられるが、これらに限定されることはなく、またリンパ系悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ系統ＡＬＬ及びＴ系統ＡＬＬが含まれる）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症が含まれるがこれらに限定されることはない。
悪性リンパ腫のさらなる型には、非ホジキンリンパ腫及びその変異形、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病及びリード・スタンバーグ（Reed-Stemberg）病が含まれるが、これらに限定されない。
癌はまた、それらの起源となった器官、すなわち、「一次部位」、例えば、乳房、脳、肺、肝臓、皮膚、前立腺、精巣、膀胱、結腸及び直腸、子宮頸部、子宮などの癌に基づいて命名されることもある。この命名は、たとえその癌が一次部位とは異なる別の身体部位に転移したとしても引き続き用いられる。一次部位に基づいて命名された癌は、組織学的分類に関連付けられうる。例えば、肺癌は一般に小細胞肺癌若しくは非小細胞性肺癌（扁平上皮癌、腺癌でありうる）、又は大細胞癌であり、皮膚癌は一般に基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、又は黒色腫である。リンパ腫は、頭部、頚部及び胸部と関連するリンパ節内で、さらには腹部リンパ節内又は腋窩若しくは鼠径リンパ節内で生じうる。癌のタイプ及びステージの同定及び分類は、例えばSurveillance, Epidemiology, and End Results (ＳＥＥＲ) Program of the National Cancer Instituteによって提供される情報を用いることにより行なってよい。
前記融合タンパク質は、癌を処置、安定化又は防止するために使用することができる。前記融合タンパク質は、無痛性癌、局所再発、遠隔再発を含む再発癌及び／又は難治性癌（すなわち、他の抗癌処置に反応していない癌）、転移性癌、局所進行癌及び強侵襲性癌の処置においても使用することができる。これらに関連して、前記融合タンパク質は、細胞毒性又は細胞増殖抑制性のいずれかの効果を奏しえ、その結果、例えば、癌細胞の数又は成長の低減、腫瘍のサイズの低減、腫瘍のサイズの増加の緩徐化又は防止、腫瘍の消失又は除去とその再出現との間の無疾患生存期間の増加、腫瘍の初発又は後発（例えば転移）の防止、進行までの時間の増加、腫瘍と関連する１以上の有害症候の低減、又は癌を有する被験者の全生存期間の増加がもたらされる。
アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を用いて処置できる増殖性及び／又は分化障害の他の例としては、皮膚障害、炎症性障害などが挙げられる。
皮膚障害には、細胞若しくは細胞の群又は真皮、上皮、若しくは皮下組織の層の異常な活性、又は真皮−上皮性接合部における異常が関わりうる。皮膚障害には例えば、角化細胞（例えば、過剰増殖性の基底細胞及び基底直上角化細胞）、メラニン形成細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、及び上皮層の１以上に認められる他の細胞、例えば、基底層、有棘層、顆粒層、透明層又は角質層の、異常な活性が関わりうる。他の実施形態では、障害には、真皮細胞、例えば、真皮層に認められる真皮内皮、線維芽細胞、免疫細胞（例えば、マスト細胞又はマクロファージ）、例えば、乳頭層又は網状層、の異常な活性が関わりうる。
皮膚障害の例としては、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎（湿疹）、例えば、剥脱性皮膚炎若しくはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹（pityriasis rubra pilaris）、粃糠疹酒さ（pityriasis rosacea）、類乾癬（parapsoriasis）、苔癬状粃糠疹（pityriasis lichenoiders）、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗病皮膚症（ichthyosiform dermatosis）、魚鱗癬、皮膚症、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、白斑、類天疱瘡（例えば、眼部瘢痕性類天疱瘡又は水胞性類天疱瘡）、蕁麻疹、汗孔角化症（prokeratosis）、関節包の内部を覆っている上皮関連細胞の過増殖及び炎症に伴って生じる関節リウマチ；脂漏性皮膚炎及び日光性皮膚炎などの皮膚炎；脂漏性角化症、老人性角化症、日光角化症、光誘発角化症、及び毛包性角化症などの角化症；尋常性ざ瘡；ケロイド、及びケロイド形成に対する予防；母斑；いぼ、コンジローム又は尖圭コンジローム、及び性病性疣贅などのヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）感染を含む疣贅；白板症；扁平苔癬；及び角膜炎が挙げられる。皮膚障害は、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎又はアレルギー性皮膚炎、又は乾癬でありうる。
処置に適合する患者には、乾癬があってよい。「乾癬」という用語は、医学的な意味を有することが意図され、すなわち、主に皮膚で罹るものであって、隆起し、肥厚し、落屑し、非瘢痕性の病変を生じる疾患である。その病変は通常、光沢のある折り重なった鱗屑片で覆われた、境界の極めて明瞭な紅斑性丘疹である。その鱗屑片は、典型的には銀色又はわずかに乳白色である。爪にも障害が及ぶことが多く、その結果陥凹、爪の剥離、肥厚及び変退色が引き起こされる。乾癬は関節炎と関連する場合があり、手足が不自由になることもある。角化細胞の過増殖は、上皮性炎症に伴う乾癬性上皮過形成、及び角化細胞の分化の低下の重要な特徴である。乾癬を特徴付ける角化細胞過増殖を説明するために、複数の機構が想起されている。障害を受けた細胞性免疫も、乾癬の病変形成に関わっている。乾癬性の障害の例として、慢性定常性乾癬、尋常性乾癬、発疹性（滴状（gluttate））乾癬、乾癬性紅皮症、汎発性膿疱性乾癬（Von Zumbusch）、輪状膿疱性乾癬、及び局所膿疱性乾癬が挙げられる。
いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバー、又はその断片を含む融合タンパク質は、自己免疫疾患、関節リウマチ、クローン病、乾癬、炎症性腸疾患、膵島炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、脈管炎、強皮症、全身性狼瘡、エリテマトーデス、移植片対宿主病疾患（ＧＶＨＤ）、ＨＩＶ感染、ブドウ膜炎、全身性肥満細胞症、リーシュマニア症などを処置する際に使用することができる。
いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバー、又はその断片を含む融合タンパク質は、白血病及びリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、転移性腎細胞癌腫、卵管癌、黒色腫、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、卵巣癌、腹膜癌腫などの癌を処置する際に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明に係る融合タンパク質を使用して、ナチュラルキラー細胞又は制御性Ｔ細胞などの免疫細胞の集団を増加又は減少させてもよい。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβへの結合が増強されており、よってＩＬ−２Ｒβに対して選択的なＩＬ−２変異形（ＰｒｏＳ２−Ｂａｄで、本願明細書に記載されるようなもの、又はＦ４２Ａ変異を欠くものなど）と、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバーとを含む融合タンパク質又はその断片を使用して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生存若しくは増殖を阻害し、又はその死若しくはアポトーシスを増強して、これによりＮＫ細胞数を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、このような融合タンパク質は、制御性Ｔ細胞の生存、増殖、死又はアポトーシスを実質的に変化させることはないであろう。いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバー（ＰｒｏＳ２−Ｂａｄで、本願明細書に記載されるようなもの、又はＦ４２Ａ変異を欠くものなど）を含む融合タンパク質、又はその断片は、自己免疫疾患を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγとの間の会合を破壊するＩＬ−２変異形、及びアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバーを含む融合タンパク質又はその断片を使用して、制御性Ｔ細胞の生存若しくは増殖を阻害、又はその死若しくはアポトーシスを増強させることができる。いくつかの実施形態では、このような融合タンパク質は、ＮＫ細胞の生存、増殖、死又はアポトーシスを実質的に変化させることはないであろう。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγとの間の会合を破壊するＩＬ−２変異形、及びアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバーを含む融合タンパク質又はその断片は、ＩＬ−２Ｒαを発現している細胞に関わる癌などの癌を処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバー、又はその断片を含む融合タンパク質は、細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２−アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質は、ＩＬ−２単独、非アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質等に連結されたＩＬ−２などの好適な対照と比較して、細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することができる。好適な対照は、これまでに確立された標準も含みうる。したがって、ＩＬ−２−アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質の活性又は有効性を判定するための何れの試験又はアッセイでも、確立された標準と比較されればよく、そのたびごとに比較用の対照を含める必要はなくてよい。「細胞生存を阻害すること」とは、細胞死のリスクにある細胞が生存することになる蓋然性を低減する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞増殖を阻害すること」とは、細胞の成長又は増殖を低減する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞死若しくはアポトーシスを増強すること」とは、細胞死のリスクにある細胞がアポトーシス、ネクローシス又はその他の何らかの型の細胞死に至ることになる蓋然性を増加させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。
いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバー、又はその断片を含む融合タンパク質は、同様の条件下であるが前記融合タンパク質と接触させずに培養された細胞と比較して、少なくとも２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も、細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することができる。細胞生存の阻害、細胞増殖の阻害、又は細胞死若しくはアポトーシスの増強を測定するために好適なアッセイは、本願明細書に記載されるか、又は当該技術分野で公知のものである。
いくつかの実施形態では、細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することにおける、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質メンバー、又はその断片を含む融合タンパク質のＩＣ５０は約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、又はそれらの間の何れかの数値、例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、又は１０００ｎｇ／ｍＬなどであることができる。
他に採用しうる実施形態では、細胞増殖を増強するために、又は例えば、低酸素症、虚血、再灌流、自己免疫疾患、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病などや、細胞、組織若しくは臓器移植を受けること、細胞毒性薬物での処置、化学療法を受けること、免疫療法を受けること、又は放射線療法を受けることなどの、細胞死若しくはアポトーシスと関連する疾患、障害若しくは状態を処置するために、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を使用することができる。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを又はアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー含む融合タンパク質は、骨髄異形成症候群、脱毛症、ＨＩＶ感染、慢性Ｃ型肝炎、菌状息肉腫、セザリー症候群、１型糖尿病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖血小板減少症などを処置する際に使用することができる。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、転移性腎細胞癌腫、黒色腫、ＣＮＳ 腫瘍（例えば、神経膠芽腫又は神経芽細胞腫）、肝癌、膀胱癌、肺癌、結直腸癌、白血病及びリンパ腫（例えば、急性骨髄性白血病； 非ホジキンリンパ腫又は慢性Ｂリンパ球性白血病）、固形腫瘍、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌、肉腫、肺転移（転移性肺腫瘍）、胃腺癌腫などの癌を処置する際に使用することができる。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー又はアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、癌免疫療法のため、癌に対する細胞養子免疫療法において、癌治療用の免疫細胞のエキソビボの拡張のため、樹状細胞のエキソビボの拡張及び成熟のため、又は癌の処置用若しくは例えば養子細胞移入療法及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法（ＣＡＲ−Ｔ）のために設計操作されたＴ細胞を増殖及び拡張用の、インビボ又はエキソビボの免疫モデュレーションのための、ワクチンアジュバントとして使用することができる。いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の拡張の際に使用することができる。いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、制御性Ｔ細胞の集団を枯渇又は減少させるために使用することができる。
他に採用しうる実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、樹状細胞又は細胞ベースのワクチンを刺激するために使用することができる。他に採用しうる実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、例えば癌治療又は感染症の処置のためのワクチンアジュバントとして使用可能である。他に採用しうる実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、例えば、感染症の処置又は移植において免疫系を刺激するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβへの結合が増強されており、よってＩＬ−２Ｒβに対して選択的なＩＬ−２変異形（本願明細書に記載されるようなＰｒｏＳ２−ＢｃｌＸＬなど）と、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーとを含む融合タンパク質又はその断片を使用して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生存若しくは増殖を増強し、又はその死若しくはアポトーシスを阻害して、これによりＮＫ細胞数を増加又は刺激することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２Ｒβへの結合が増強されており、よってＩＬ−２Ｒβに対して選択的なＩＬ−２変異形（本願明細書に記載されるようなＰｒｏＳ２−ＢｃｌＸＬなど）と、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーとを含む融合タンパク質又はその断片を使用して、癌を処置することができる。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２−抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質は、ＩＬ−２単独、非抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質等に連結されたＩＬ−２などの好適な対照と比較して、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することすることができる。好適な対照は、これまでに確立された標準も含みうる。したがって、ＩＬ−２−抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質の活性又は有効性を判定するための何れの試験又はアッセイでも、確立された標準と比較されればよく、そのたびごとに比較用の対照を含める必要はなくてよい。「細胞生存を増強すること」とは、細胞死のリスクにある細胞が生存することになる蓋然性を高める（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞増殖を増強すること」とは、細胞の成長又は増殖を高める（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること」とは、細胞死のリスクにある細胞がアポトーシス、ネクローシス又はその他の何らかの型の細胞死に至ることになる蓋然性を低減する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、同様の条件下であるが前記融合タンパク質と接触させずに培養された細胞と比較して、少なくとも２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができる。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の濃度、又はそれらの間の何れかの数値、例えば、約２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、３０００ｎｇ／ｍＬ、３５００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、４５００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、５５００ｎｇ／ｍＬ、６０００ｎｇ／ｍＬ、６５００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、７５００ｎｇ／ｍＬ、８０００ｎｇ／ｍＬ、８５００ｎｇ／ｍＬ、９０００ｎｇ／ｍＬ、９５００ｎｇ／ｍＬ、又は１００００ｎｇ／ｍＬを投与された場合、未変性ＩＬ−２と比較して少なくとも２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％、又は９０％以上も、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することを促進することができる。
細胞生存の増強、細胞増殖の増強、又は細胞死若しくはアポトーシスの阻害を測定するための好適なアッセイは、本願明細書に記載されるか、又は当該技術分野で公知のものである。
「標的細胞」には、ニューロン、リンパ球、幹細胞、上皮細胞、癌細胞、新生物細胞、免疫細胞、及び過増殖性細胞を含むその他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。選択される標的細胞は、前記融合タンパク質で処置することが意図される疾患又は傷害又は状態次第であろう。
医薬組成物、投薬量及び投与
本開示にかかる医薬組成物は、１以上の融合タンパク質及び１以上の無毒な、医薬的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤及び／又は佐剤を含むことができる。このような組成物は、本願明細書に記載されるような治療指標の処置での使用に好適でありうる。
所望に応じて、組成物に他の有効成分が含まれてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、１以上の抗癌療法又は他の療法と一緒に、治療上有効な量で投与されうる。融合タンパク質（１種以上）は、抗癌療法又は他の療法での処置前、処置中、又は処置後に投与することができる。「抗癌療法」は、癌細胞の成長及び／又は転移を防止又は遅延する化合物、組成物、又は処置（例えば外科手術）である。このような抗癌療法には、外科手術（例えば、腫瘍のすべて又は一部の除去）、化学療法剤処置、放射線、遺伝子治療、ホルモン操作、免疫療法（例えば、治療抗体及び癌ワクチン）及びアンチセンス又はＲＮＡｉオリゴヌクレオチド療法が含まれるが、これらに限定されない。有用な化学療法剤の例としては、ヒドロキシ尿素、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダウノルビシン（danorubicin）、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、シトシン、アラビノシド、ブレオマイシン、ネオカルシノスタチン（neocarcinostatin）、スラミン、タキソール、マイトマイシンＣ、アバスチン、ハーセプチン（登録商標）、フルオロウラシル、テモゾロミド（temozolamide）など挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質（１種以上）は、２種以上の化学療法剤を用いる標準的な併用療法との使用にも好適であるということを理解されたい。抗癌療法には、今後開発される新規な化合物又は処置が含まれる。
前記融合タンパク質放射線増感剤などの増感剤（例えば、Diehn et al, J. Natl. Cancer Inst. 98: 1755-7, 2006参照）と組み合わせて投与することもできる。一般に、増感剤は融合タンパク質の活性を高める何らかの薬剤である。例えば、増感剤は、癌細胞成長を阻害するか又は癌細胞死滅させる、融合タンパク質の能力を高めるであろう。増感剤の例としては、ＩＬ−１０に対する抗体、骨形成タンパク質及びＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる（例えば、Sakariassen et al, Neoplasia 9(11):882-92, 2007参照）。これらの増感剤は、融合タンパク質での処置前又は処置中に投与できる。このような増感剤の投薬量の例としては、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬなどの少なくとも１μｇ／ｍＬ、例えば５〜１００μｇ／ｍＬ又は１０〜９０μｇ／ｍＬが挙げられる。増感剤は、毎日、週３回、週２回、週１回又は２週に１回、投与できる。増感剤は、融合タンパク質での処置が完了した後に投与することもできる。
前記融合タンパク質は、被験者における癌を治癒することが意図される場合、ネオアジュバント療法（一次療法に対する）の一部として、アジュバント療法レジメンの一部として使用されてもよい。融合タンパク質は、進行性及び／又は強侵襲性異常増殖（例えば、外科手術又は放射線療法などの局所的な様式の処置による治癒に適していない被験者における顕性疾患）、転移性疾患、局所進行疾患及び／又は難治性腫瘍（例えば、処置に反応していない癌又は腫瘍）の処置を含め、腫瘍発生及び進行における種々のステージで投与することもできる。「一次療法」とは、被験者における癌の最初の診断に際しての第１選択の処置をいう。一次療法の例としては外科手術、広い範囲の免疫療法、化学療法及び放射線療法を挙げることができる。「アジュバント療法」とは、一次療法に続く療法であって、再発のリスクにある被験者に適用される療法をいう。アジュバント全身性療法は、一次療法後まもなく、例えば最後の一次療法処置の２、３、４、５、又は６週間後に開始され、再発を遅延し、被験者の生存又は治癒を延長するものである。本願明細書で論じられるとおり、アジュバント療法の一部として、融合タンパク質を単独又は１以上の他の化学療法剤と組み合わせて使用できるということが企図される。融合タンパク質と標準的な化学療法剤との組み合わせは、その化学療法剤の有効性を向上するように作用しえ、したがって、標準的な癌治療を改善するために使用することができる。本願は、標準的な処置に応答性のない薬物耐性癌の処置に特に重要でありうる。
癌において、腫瘍の微小環境には悪性及び非悪性細胞の双方が含まれる。腫瘍微小環境は、以下の基準の１以上を用いて同定することができる：（ａ）悪性細胞に直接隣接した、又は同じ生理的環境を共有する非悪性細胞を含む領域；（ｂ）拡張された腫瘍領域；（ｃ）腫瘍に取り囲まれた、又は近接した炎症の領域；（ｄ）制御性Ｔ細胞の数又は増殖速度が高まっている領域；及び（ｅ）マクロファージ、樹状細胞、又は骨髄由来サプレッサー細胞が高まっている領域。非固形腫瘍型に関連して、腫瘍微小環境は、悪性細胞同士や、悪性細胞と何れか隣接又は近隣の非悪性細胞との間の局所細胞間相互作用によっても判定されうる。このような相互作用には、例えば、１つの細胞（悪性又は非悪性）によって産生される可溶性メディエーターの、腫瘍微小環境内の別の細胞（悪性又は非悪性）への細胞接着事象及び／又はパラクリン効果が含まれうる。
腫瘍微小環境内の非悪性細胞は、腫瘍イニシエーション及び進行に重要である可能性がある（Reynolds et al., Cancer Res., 1996, 56(24):5754-5757）。非悪性細は、間質細胞とも呼ばれ、悪性細胞と同じ細胞空間、又は悪性細胞に隣接又は近接した細胞空間で占有又は蓄積するものであり、腫瘍細胞成長又は生存のモデュレーションを行う。例えば、炎症性応答及び免疫応答を支持するように通常機能している非悪性細胞は、腫瘍イニシエーション又は進行に寄与できる可能性がある。したがって、他に採用しうる実施形態では、腫瘍微小環境においてＩ型又はＩＩ型ＩＬ−４Ｒを発現する非悪性細胞の細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することのために、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を使用できる。このような非悪性細胞は、腫瘍微小環境内に存在する骨髄由来サプレッサー細胞（例えば、骨髄由来単球及びｔｉｅ−２発現単球）、又は抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞）などの免疫調節性又は炎症性細胞でありえ、腫瘍進行を支持するように機能するＴ細胞サブセット（例えば、制御性Ｔ細胞及びＴｈ２ヘルパー細胞）の阻害、及び／又は腫瘍微小環境内の１以上の炎症性サイトカインの産生の抑制ができる。腫瘍微小環境の非悪性細胞のうち、多くの腫瘍において高頻度で観察されるのは制御性Ｔ細胞であり、前記腫瘍にはホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（Shi et al, Ai Zheng., 2004, 23(5):597-601（要約のみ））、悪性黒色腫（Viguier et al., J. Immunol., 2004, 173(2): 1444-53; Javia et al, J. Immunother., 2003, 26(l):85-93）、並びに卵巣（Woo et al, Cancer Res., 2001, 61(12):4766-72）、消化管（Ichihara et al., Clin Cancer Res., 2003, 9(12):4404-4408; Sasada et al., Cancer, 2003, 98(5): 1089-1099）、乳房（Liyanage et al, J Immunol., 2002, 169(5):2756-2761）、肺（Woo et al, Cancer Res., 2001, 61(12):4766-72）、及び膵臓（Liyanage et al, J Immunol., 2002, 169(5):2756-2761）の癌が含まれる。制御性Ｔ細胞は、腫瘍細胞により分泌されたケモカインに応答して、腫瘍部位で補充される。例えば、Curielら、Nat. Med., 2004, 10:942-949を参照されたい。制御性Ｔ細胞の数の増加は、予後不良にも相関しうる（Curiel et al, Nat. Med., 2004, 10:942-949; Sasada et al, Cancer, 2003, 98: 1089-1099）。制御性Ｔ細胞は逆に、化学療法後に低減することが観察されている（Beyer et al., Blood, 2005, 106:2018-2025）。このような非悪性細胞は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、脈管細胞（血液及びリンパ脈管内皮細胞及び周皮細胞を含む）、常在及び／又は補充の炎症性及び免疫性（例えば、マクロファージ、樹状細胞、骨髄サプレッサー細胞、顆粒球、リンパ球など）、上記非悪性細胞の何れかを生じさせるか又はそれに分化することができる常在及び／又は補充細胞、並びに当該技術分野で公知の、上記細胞と機能的に別異の亜型であることもできる。
他に採用しうる実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、アポトーシスを低下させること、又は増殖を促進することに対して有用である。したがって、このような融合タンパク質を含む組成物は所望に応じて、過剰の細胞死によって特徴付けられる疾患又は障害を処置するために典型的に用いられる標準的な療法のいずれかと組み合わせられてよい。１つの実施形態では、標準的な療法は、低酸素症、細胞、組織若しくは臓器移植を受けること、化学療法を受けること、又は放射線療法を受けることと関連する、細胞死又はアポトーシスの処置に有用なものである。このような方法は、当業者により公知であり、E. W. MartinのRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
あるいは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、化学療法と組み合わせて投与して、典型的にその化学療法に伴う毒性効果を融合タンパク質が低減するようにすることができる。例えば、化学療法と融合タンパク質とを受ける患者は、その化学療法のみを受ける患者よりも正常細胞のアポトーシスと関連する副作用（例えば、好中球数減少）に見舞われにくい。以下のいずれか１以上の投与前、投与中又は投与後に、本発明の組成物は投与される：化学療法剤、放射線剤、ホルモン剤、生物学的製剤、抗炎症剤。化学療法剤の例としては、タモキシフェン、トラスツズマブ（trastuzamab）、ラロキシフェン、ドキソルビシン、フルオロウラシル／５−ｆｕ、パミドロン酸二ナトリウム、アナストロゾール、エクセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、レトロゾール、トレミフェン、フルベストラント、フルオキシメステロン、トラスツズマブ、メトトレキセート、メゲストロール（megastrol）アセテート、ドセタキセル、パクリタキセル、テストラクトン、アジリジン、ビンブラスチン、カペシタビン、ゴセレリン（goselerin）アセテート、ゾレドロン酸、タキソール、ビンブラスチン、及びビンクリスチンが挙げられる。
融合タンパク質に対する全身性免疫応答を必要に応じて低減するために、免疫抑制療法剤を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質と組み合わせて投与することができる。免疫抑制療法剤の例としては、全身性又は局所性副腎皮質ステロイド（コルチコステロイド）（Suga et al., Ann. Thorac. Surg., 73 : 1092-7, 2002）、シクロスポリンＡ（Fang et al, Hum. Gene Ther, 6: 1039-44, 1995）、シクロホスファミド（Smith et al., Gene Ther., 3 :496-502, 1996）、デオキシスパガリン（Kaplan et al., Hum. Gene Ther., 8: 1095-1104, 1997）、及び抗ＣＤ４０リガンド、抗ＣＤ４抗体、又は抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）などの、Ｔ及び／又はＢ細胞に対する抗体（Manning et al., Hum. Gene Ther., 9:477-85, 1998）が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質の投与前、投与中又は投与後に、このような薬剤を投与することができる。このような薬剤は、約１０ｍｇ／週から約１０００ｍｇ／週まで、約４０ｍｇ／週から約７００ｍｇ／週まで、又は約２００ｍｇ／週〜約５００ｍｇ／週までを、２、３、４、５、６、又は７週間、投与可能である。一連の処置は、被験者が応答性のまま（例えば、癌の症候が静的又は減少中）であれば、必要に応じ繰り返すことができる。
「被験者」は、処置を必要とする、ヒト、又は獣医の患者（例えば、マウス若しくはラットなどの齧歯動物、ネコ、イヌ、乳牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、又は他の家畜）などの哺乳動物であることができる。いくつかの実施形態では、「被験者」は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などであってよい。被験者は、本願明細書に記載されるように、細胞増殖によって特徴付けられる状態を有するか又は有するリスクがあることが疑われるものでも、細胞増殖によって特徴付けられる状態であると診断されるものでも、又は細胞増殖によって特徴付けられる状態を有しないことが確認されている対照被験者であってもよい。細胞増殖によって特徴付けられる状態に対する診断方法、及びこのような診断の臨床的描写は、当業者に公知である。被験者は、本願明細書に記載されるように、細胞死によって特徴付けられる状態を有するか又は有するリスクがあることが疑われるものでも、細胞死によって特徴付けられる状態であると診断されるものでも、又は細胞死によって特徴付けられる状態を有しないことが確認されている対照被験者であってもよい。細胞死によって特徴付けられる状態に対する診断方法、及びこのような診断の臨床的描写は、当業者に公知である。
組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、徐放性製剤、又は粉末であることができ、薬学的に許容できる担体を用いて製剤化することができる。組成物は、トリグリセリドなどの従前の担体及び結合剤を用い、座薬として製剤化されうる。「医薬的に許容できる担体」という用語は、有効成分の生物活性の有効性に干渉せず、且つ宿主又は被験者に毒性ではない分散媒（carrier medium）又は媒体（vehicle）をいう。
融合タンパク質は、医薬的に許容できる媒体と一緒に送達することができる。１つの例では、媒体は、安定性及び／又は送達特性を増強しうる。このため、本開示はまた、人工的膜小胞（リポソーム、ノイソーム（noisome）、ナノソーム（nanosome）などを含む）、微小粒子又はマイクロカプセルなどの好適な媒体を、融合タンパク質の製剤に与え、又は薬学的に許容できるポリマーを含むコロイド状製剤として提供する。このような媒体/ポリマーの使用は、徐放性融合タンパク質の徐放性を達成するのに有益でありうる。あるいは、又は加えて、融合タンパク質製剤は、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質をインビボで安定化させる添加剤、又は当該技術分野で公知の、タンパク質治療剤のための他の安定剤を含みうる。融合タンパク質製剤は、例えば、注射によって、又はカテーテルを介して投与された場合に製剤の逆流を防ぐ作用をする１以上の粘度増強剤も含むことができる。このような粘度増強剤には、生体適合性グリコール及びスクロースが含まれるが、これらに限定されない。
１以上の融合タンパク質を含有する医薬組成物は、当該技術分野で公知の方法により、好適な１以上の分散若しくは湿潤剤及び／又は懸濁剤であって前記したようなものを用いて、滅菌注射用の水性又は油性懸濁液として製剤化されうる。滅菌注射用調製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒な非経口的に（parentally）許容できる希釈剤又は溶剤中の滅菌注射用注射剤又は懸濁液でありうる。採用可能な許容できる媒体及び溶剤には、水、リンゲル液、乳酸リンゲル液及び等張の塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。他の例として、滅菌不揮発性油で、溶剤又は懸濁媒体として従来より採用されているもの、及び例えば合成モノ又はジグリセリドを含む、様々なブランド（bland）不揮発性油が挙げられる。オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製に使用することができる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は水溶性ポリマーに接合されて、例えば安定性若しくは循環半減期を高め、又は免疫原性を低減する。臨床的に許容できる、水溶性のポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、又はポリオキシエチル化グルコース、及び他の炭水化物ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧなどの水溶性ポリマーにポリペプチドを接合させるための方法は、例えば、米国特許公開第２００５０１０６１４８号及びその引用文献に記載されている。１つの例ではポリマーは、酸性エンドソーム区画から細胞質への薬物の遊離を増強するように設計されたｐＨ感受性ポリマーである（例えば、Henry et ah, Biomacromolecules 7(8):2407-14, 2006参照）。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質のポリペプチド（ｃｐＩＬ２−Ｂｃｌ−ｘＬ融合タンパク質など）は、治療又は予防ワクチンの製造時にアポトーシスを阻害すること、又は免疫細胞の増殖を促進するために使用することができる。いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質のポリペプチド（ｃｐＩＬ２−Ｂｃｌ−ｘＬ融合タンパク質など）は、ＧＭ−ＣＳＦ Ｂｃｌ−ｘＬ融合タンパク質と組み合わせて又はＧＭ−ＣＳＦ単独で使用される。一般に、当該ワクチンは、ワクチン接種を必要とする被験者由来の細胞（例えば、免疫細胞）を含む。一般に、その細胞は、血液試料又は骨髄試料など、被験者の生物試料から得られる。好ましくは、免疫細胞を被験者から得て、この細胞をインビトロで培養し、免疫細胞の一集団を得る。培養細胞を本発明の融合タンパク質の存在下で抗原（例えば、癌抗原）と接触させる。望ましくは、融合タンパク質の存在下に抗原と接触される免疫細胞は、その融合タンパク質の不存在化に接触される免疫細胞に比してアポトーシスのリスクが低減している。任意に、接触後の細胞の数を、インビトロで増加させる。次いで細胞を被験者に再導入し、それら細胞は、注目する抗原（例えば、癌抗原）に対する免疫応答を増強するか又は引き出す。このようなワクチンを製造するための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Zhuら、J Neurooncol. 2005 August；74(1):9-17; Nairら、Int. J. Cancer. 1997; 70:706-715；及びFongら、Annu. Rev. Immunol. 2000; 18:245-273に記載されている。
典型的には、ワクチンは、溶液として又は懸濁液としてのいずれかの注射剤型に調製される。注射に好適な固体形態もまた、エマルションとして、又はリポソームに封入されたポリペプチドを用いて調製されうる。細胞は、当該技術分野で公知の何れか好適な担体中にて注射される。好適な担体は、典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、リピド凝集体、及び不活性ウイルス粒子などの、ゆっくりと代謝される巨大高分子を含む。このような担体は、当業者にとっては周知である。これらの担体は、アジュバントとしても機能しうる。
アジュバントは、ワクチンの有効性を増強する免疫賦活剤である。有効なアジュバントには、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、ムラミルペプチド、バクテリア細胞壁成分、サポニンアジュバント、及び免疫賦活剤として作用して組成物の有効性を増強する他の物質が含まれるが、これらに限定されない。
ワクチンは、用量剤形に適合するように投与される。有効量とは、疾患又は障害の治療又は予防に有効な、単回投与量、複数回投与スケジュールにて投与されるワクチンを意味する。好ましくは、かかる用量は、新生物の成長を阻害するのに有効である。投与される用量は、処置すべき被験者、被験者の健康及び身体状態、被験者の免疫系が抗体を産生する潜在能力、望まれる保護の度合い、及び他の関連因子に応じて変化するであろう。必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断によるものとされよう。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２又はアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのポリペプチドを含む融合タンパク質は、要望に応じ、エキソビボ法において使用することができる。例えば、細胞（例えば、末梢血リンパ球、又は患者から単離して置いておいたもの若しくは培養して維持したものであるリンパ球の精製された集団）を培地中にてインビトロで培養でき、そして培地にＩＬ−２融合タンパク質を添加することによって接触工程が影響を受けることができる。培養工程には、例えば、増殖を刺激若しくは低減すべく、又は細胞の一集団（例えば、制御性Ｔ細胞）を増加又は枯渇させるべく、他の薬剤で細胞を刺激又は処置する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明に係る融合タンパク質は、例えば、養子細胞移入療法及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法（ＣＡＲ−Ｔ）用の、設計操作されたＴ細胞を増殖及び拡張するために使用することができる。その後、当該細胞は患者に投与される。
本願明細書に記載される医薬組成物は、意図された目的を成し遂げるのに有効な量の、１以上の融合タンパク質を含む。典型的には、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含有する融合タンパク質を含む組成物は、細胞死によって特徴付けられる疾患、障害若しくは状態に既に罹患しているか、又は疾患、障害若しくは状態などのリスクにある患者に、細胞死と関連する症候を治癒若しくは少なくとも部分的に停止させるのに、又は細胞成長を増強するのに十分な量で投与される。他に採用しうる実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含有する融合タンパク質を含む組成物は、細胞増殖によって特徴付けられる疾患、障害若しくは状態に既に罹患しているか、又はこのような疾患、障害若しくは状態などのリスクにある患者に、細胞増殖と関連する症候を治癒若しくは少なくとも部分的に停止させるのに、又は細胞成長を低減するのに十分な量で投与される。
当業者はしたがって、投与すべき投薬量は規定される限定に支配されるものでないことを認識するであろう。治療目的のために投与する前に、融合タンパク質の投薬量は、加減するか、又は特定の目的のために改める必要があるかもしれず、例えば全身投与のために必要な融合タンパク質の濃度は、局所投与に使用される場合と異なりうる。同様に、治療剤の毒性は投与方法及び使用される組成物全体（例えば、緩衝液、希釈剤、さらなる 化学療法剤など）によって変化しうる。
本発明に係る医薬組成物の「有効量」には、治療上有効量又は予防上有効量が含まれる。「治療上有効量」とは、投薬量及び必要な期間で、疾患、障害又は治療されるべき状態の症候を寛解させるのに有効な融合タンパク質の量をいう。化合物の治療上有効量は、被験者の病状、年齢、性別、及び体重などの因子、並びにその化合物が被験者において所望の応答を引き出す能力に応じて変動しうる。投薬治療方式は、最適の治療反応をもたらすように調整されてよい。治療上有効量はまた、融合タンパク質の何らかの毒性又は有害な効果よりも治療上有益な効果が上回るものである。当業者の潜在能力をもってすれば充分に、化合物の治療上有効な用量の決定はなされる。例えば、治療上有効な用量は当初、本願明細書に記載されるものなどの細胞培養液アッセイ、又は動物モデルのいずれかにて、見積もることができる。「予防上有効量」とは、投薬量及び必要な期間で、自己免疫障害の症候の発症の遅延、又は癌の寛解の継続などの、所望の予防的結果を成し遂げるのに有効な融合タンパク質の量をいう。適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために、動物モデルも使用することができる。このような情報は次いで、ヒトを含む他の動物における投与のための有用な用量及び経路を、当業者に公知の標準的な方法を用いて決定するために使用することができる。
最終的な製剤中の融合タンパク質の濃度は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬで、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ又は少なくとも１μｇ／ｍＬ又は少なくとも１ｍｇ／ｍＬなどとすることができる。例えば、最終的な製剤中の濃度は、約０．０１μｇ／ｍＬと約１，０００μｇ／ｍＬの間であることができる。１つの例では、最終的な製剤中の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬの間である。
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の濃度で、又は、約２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、３０００ｎｇ／ｍＬ、３５００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、４５００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、５５００ｎｇ／ｍＬ、６０００ｎｇ／ｍＬ、６５００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、７５００ｎｇ／ｍＬ、８０００ｎｇ／ｍＬ、８５００ｎｇ／ｍＬ、９０００ｎｇ／ｍＬ、９５００ｎｇ／ｍＬ、又は１００００ｎｇ／ｍＬなど、その間のいずれかの値で投与される。
いくつかの実施形態では、アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の濃度で投与される。
しかしながら、投与されるべき化合物（１種以上）の実際の量は、治療されるべき状態、選択された投与経路、実際に投与される化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答性、並びに患者の症候の重症度を含む関連状況を考慮して、医師により決定されることになる点は理解されるであろう。前記投薬量範囲は、例として示すに過ぎず、発明の範囲を限定することは何ら意図されない。場合によって、前記範囲の下限を下回る投薬量レベルで充分すぎることがあり、一方他の場合にあっては、有害な副作用を起こすことなくさらに多くの用量を用いうるが、これは例えば、１日全体にわたる投与のために先ず、当該さらに多くの用量をいくつかの少ない容量に分割することにより行なわれうる。
当業者は、前記投薬量がとりわけ、使用される融合タンパク質の型、及び処置される障害又は状態の型に依存することになるとわかるであろう。
一般に、本開示にかかる融合タンパク質は、実質的にヒト配列を含み、したがって、例えば、非ヒト配列を含む他の分子又は免疫毒素よりも抗原性が低い。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質は、少なくとも８０％、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のヒト配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質は、例えば、免疫毒素、又はＩＬ−２よりも実質的に低用量で投与することができる。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、被験者に投与されると、あるレベルの抗体応答を誘発することがあり、ある場合にはこれが望ましくない副作用を導きうる。したがって、必要に応じて、融合タンパク質の抗原性を当該技術分野で公知のように、及び／又は本願明細書に記載されるように評定することができる。例えば、融合タンパク質のインビボ毒性効果は、処置中の動物体重に対するそれらの効果を測定すること、及びその動物の死亡後に血液学的プロファイル及び肝臓酵素分析を実施することによって評価することができる。融合タンパク質の一般的な毒性は、当該技術分野で公知の方法によって試験することができる。例えば、融合タンパク質の全体としての全身毒性は、単回静脈内注射後にマウスの１００％（すなわちＬＤ１００）又はマウスの５０％（すなわちＬＤ５０）が死亡する用量を求めることによって調べることができる。そのＬＤ１００又はＬＤ５０の少なくとも約２、５、又は１０倍未満の用量を、ヒトなどの他の哺乳動物への投与に対して選択することができる。
本願明細書に記載される融合タンパク質に対する抗体応答の反応速度論及び大きさを、免疫が保たれているマウスにおいて求めることができ、それらは免疫が保たれているヒトにおいて使用される可能性のある投薬計画の開発を容易にするために使用できる。Ｃ５７−ＢＬ６系統などの免疫が保たれているマウスに融合タンパク質の静脈内用量が投与される。種々の間隔で（例えば、単回投与後、複数回投与後）マウスを屠殺して、血清を得る。抗融合タンパク質抗体の存在を検出するために、ＥＬＩＳＡによるアッセイを使用することができる。
マウスからの血清試料は、当該技術分野で公知のとおりに抗融合タンパク質抗体の存在について評定できる。別の例として、Sticklerら、J. Immunotherapy, 23 :654-660, 2000に記載のとおりに、タンパク質の抗原性を決定するためにエピトープマッピングも使用できる。手短に言えば、樹状細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞として知られる免疫細胞を、注目するタンパク質に曝されていないドナー群（community donors）からの血液より単離する。当該タンパク質長にかかる合成小ペプチドを次いで、培養中の細胞に添加する。特定のペプチドの存在に応答した増殖が、Ｔ細胞エピトープは当該配列に包含されていることを示唆する。このペプチド配列はその後、前記融合タンパク質において削除または修飾して、これによりその抗原性を低下させることができる。
治療的有効性及び毒性も、例えば、半有効量、つまりＥＤ５０（すなわち集団の５０％で治療上有効な用量）及び半致死量、つまりＬＤ５０（すなわち集団の５０％に対して致死的な用量）の決定によるなど、標準的な薬剤手段によって決定することができる。治療的用量と毒性効果量との用量比は、「治療指数」として知られており、比、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。細胞培養液アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒト又は動物での使用のための広範な投薬量を製剤化するのに使用できる。このような組成物に含有される投薬量は通常、ＥＤ５０を含む濃度の範囲内にあり、低毒性又は無毒性を示す。その投薬量は、採用される剤形、被験者の感受性、及び投与の経路などに応じてこの範囲内で変動する。
前記融合タンパク質の投与は、傷害内とすることができ、例えば、直接的に、アポトーシスの組織部位内へ；細胞成長を必要とする部位内へ；細胞、組織又は器官が細胞死のリスクにある部位内へ；又は過増殖の部位内へ若しくは腫瘍内への直接注射によるものとされうる。あるいは、融合タンパク質は全身投与することができる。融合タンパク質を化学療法剤と組み合わせて投与することを含む併用療法の方法のため、組成物が投与される順序は入れ替え可能である。同時投与も想定される。
癌の処置において典型的には、融合タンパク質は患者に全身投与され、これは、例えば、患者の血流内へのボーラス（巨丸剤）注射又は持続注入による。あるいは、融合タンパク質は、局所的に、腫瘍の部位に（腫瘍内に）投与されてもよい。融合タンパク質が腫瘍内に投与される場合、その投与は例えば、局所的、局部的、限局的、全身的、対流強化送達（convection enhanced delivery）又はこれらの組み合わせなど、何れの経路とすることもできる。
１以上の既知化学療法剤と併用する場合、その化学療法剤の投与前若しくは投与後に化合物を投与することができ、又はそれらを同時に投与することもできる。１以上の化学療法剤は、例えば、ボーラス注射若しくは持続注入により全身に投与されてもよく、又はそれらは経口投与されてもよい。
動物への投与のために、様々な経路による投与用に医薬組成物を製剤化できる。例えば、組成物を局所、直腸若しくは非経口投与用に、又は吸入若しくはスプレーによる投与用に製剤化できる。本願明細書で使用する場合、「非経口」の用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、髄腔内、胸骨内注射又は注入技術を含む。腫瘍内への直接注射又は注入も企図される。対流強化送達もまた、融合タンパク質を投与するのに使用することができる。
１つの例では、ブラキセラピー（brachytherapy）の複数の注射アプローチと同様の投与アプローチを用いて癌を有する被験者に融合タンパク質を注射することができる。例えば、医薬組成物又は製剤の形態にあり、且つ適切な投薬単位とされた精製融合タンパク質の複数のアリコートを、針を用いて注射してもよい。融合タンパク質の投与の他に採用しうる方法は、当業者には明らかであろう。このような方法には、例えば、治療が必要な被験者に融合タンパク質の持続注入を提供するために、カテーテル又は埋め込み型のポンプを使用することが含まれる。
例えば脳腫瘍又は他の局所化腫瘍を処置すべく、例えば、融合タンパク質の注入用カテーテルの配置のために、当該技術分野で公知のような、ソフトウェア計画プログラムを、ブラキセラピー処置及び超音波と組み合わせて使用できる。例えば、針の位置づけ及び配置を、一般に超音波ガイド下に成し遂げることができる。全量、したがって患者に投与される注射及びデポジット（deposits）の数は、例えば、処置すべき器官の容量又は面積に従って調整することができる。好適なソフトウェア計画プログラムの例は、ブラキセラピー処置計画プログラムVariseed 7.1（Varian Medical Systems, Palo Alto, Calif.）である。このようなアプローチは、とりわけ前立腺癌及び脳癌の処置において成功裡に実施されている。
抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、ａＩＬ−２−Ｂｃｌ−ＸＬ融合タンパク質）又はその断片を含む融合タンパク質のインビボ又はインビトロ発現は、細胞死を起こすリスクにある細胞の、生存又は増殖を促進するための別の治療的アプローチである。このような融合タンパク質をエンコードしている核酸分子を、アポトーシスのリスクがある被験者の細胞に送達することができる。細胞における融合タンパク質の発現は、増殖を促進するか、アポトーシスを防止するか、又はその細胞におけるか又は標的細胞若しくは組織におけるアポトーシスのリスクを低減する。治療上有効なレベルの融合タンパク質が産生できるように、核酸分子は、それらの取り込みが可能な形態で被験者の細胞へ送達されなければならない。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、被験者が免疫療法などの治療を開始する前に、被験者に投与される。形質導入ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス）ベクターは、とりわけそれらの感染が高効率であって組込み及び発現が安定であるがゆえに、体細胞の細胞遺伝子療法用に使用することができる（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71 :6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; and Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 10319, 1997参照）。例えば、融合タンパク質をエンコーディングするポリヌクレオチド、変異形、又はその断片をレトロウイルスベクターにクローニングして、その内在性プロモーターから、当該レトロウイルス末端反復配列から、又は注目する標的細胞型に特異的なプロモーターから発現を推進させることができる。使用することのできる他のウイルスベクターには、例えば、牛痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、又はエプスタイン・バール・ウイルスなどのヘルペスウイルスが含まれる（また、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244: 1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1 :55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; and Johnson, Chest 107:77 S-83S, 1995のベクターも参照されたい）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床現場で使用されている（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323 :370, 1990; Anderson et al., U.S. Pat. No. 5,399,346）。ウイルスベクターを使用して、キメラポリヌクレオチドを標的細胞、組織に、又は全身に与えるのが最も好ましい。
細胞死のモデュレーションを必要としている細胞（例えば、患者の細胞）への治療剤の導入のために、非ウイルスのアプローチを採用することができる。例えば、リポフェクション（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101 :512, 1983）、アシアロオロソムコイド−ポリリジン接合（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263 : 14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264: 16985, 1989）の存在下に細胞内へ核酸分子を投与することによって、又は外科的条件下にマイクロインジェクションすることによって（Wolff et al., Science 247: 1465, 1990）、当該核酸分子を導入することができる。好ましくは核酸は、リポソーム及びプロタミンと組み合わせて投与される。
遺伝子導入は、インビトロ形質移入を含む日ウイルスの手段を用いて成し遂げることもできる。このような方法には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、及びプロトプラスト融合の使用が含まれる。リポソームも、細胞内へのＤＮＡの送達に対して潜在的に有益でありうる。患者の病変組織内への融合タンパク質の移植は、培養可能細胞型内にエキソビボで正常核酸を導入し（例えば、自家又は異種の初代細胞又はその後代細胞）、次いでその細胞（またはその子孫）を標的指向化組織内に注射することによって成し遂げることもできる。
ポリヌクレオチド療法において使用するためのｃＤＮＡ発現は、好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）の何れかから導かれ、適切な哺乳類の制御エレメントの何れかによって制御されることができる。例えば、所望に応じて、特定の細胞型において遺伝子発現を優先的に導くことが知られているエンハンサーを、核酸の発現を導くために使用することができる。使用されるエンハンサーとしては、組織特異的又は細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものを挙げることができるが、これらに限定されない。あるいは、ゲノムクローンが治療的構築体として使用されるのであれば、同族の制御配列によって、又は所望に応じ、前記プロモーター又は制御エレメントのいずれかを含め異種供給源に由来する制御配列によって、制御を媒介させることができる。
本発明を、以下の実施例にてさらに説明する。
実施例１
標準的な技術を用いてｐｒｏＳ２−ＢＡＤを調製した。
より詳細には、ｐｒｏＳ２−ＢＡＤのｃＤＮＡをｐＧＷ０７大腸菌発現ベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にＰＣＲクローニングした（図１）。得られたベクターは、ＤＮＡ配列決定によって確認した（図２Ａ及びＢ）。
タンパク質発現は、大腸菌細胞において実施した。ｐｒｏＳ２−ＢＡＤタンパク質を、不溶性型で１Ｌ培養物において発現させ、ＩＭＡＣを用いて変性条件下に精製し、その後「迅速希釈」タンパク質リフォールディングを行った。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べたところ、「迅速希釈」によるリフォールディングで、凝集体のないインタクトなタンパク質が生成されていた。最終的な試料サイズ及び濃度は以下のとおりであった。ｐｒｏＳ２−ＢＡＤ（ｐＨ７．８）は、ＵＶ２８０ｎｍによる測定で０．１６ｍｇ／ｍＬにて約１ｍＬ（１ｍｇ／ｍｌでのＵＶ２８０ｎｍ吸光度＝１．２５）であり、ｐｒｏＳ２−ＢＡＤ（ｐＨ６．０）は、ＵＶ２８０ｎｍによる測定で０．０９ｍｇ／ｍＬにて約１ｍＬ（１ｍｇ／ｍｌでのＵＶ２８０ｎｍ吸光度＝１．１７）であった。タンパク質は、保存用緩衝液組成物：５００ｎＭ ＮａＣＬ、１０ｍＭ Ｎａ−リン酸塩、ｐＨ６．０又は７．８、１％グリセロール、１μΜ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中で保存した。
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ−ＲＡＲＥ２細胞を、ｐｒｏＳ２−ＢＡＤタンパク質発現構築体で形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを追加したＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベーションした。翌日、プレートからのコロニーを掻き取って、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐを含むＬＢ液体培地に再懸濁させた。次いで培養物を曝気しながら３７℃で成長させ、細胞培養液のＯＤ６００が約０．５に達したら１ｍＭ ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘導した。誘導は約４時間、３０℃にて継続した。その後細胞ペレットを集めて−２０℃で保存した。誘導しなかった培養物及び誘導した培養物の試料１０μＬを５０μＬの還元タンパク質ローディング緩衝液中で９５℃にて１０分間沸騰させることにより溶解させてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。誘導後４時間に集めた試料１ｍＬからの細胞は、低浸透圧性緩衝液中で溶解させ、超音波処理して１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。可溶性及び不溶性の画分からのアリコートを、還元タンパク質ローディング緩衝液中で沸騰させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。ｐｒｏＳ２−ＢＡＤタンパク質に対して観察された概算発現レベルは粗製材料の約２０ｍｇ／Ｌより多かった。ｐｒｏＳ２−ＢＡＤは主に、不溶性の画分中にあった。
誘導された培養物からの細胞ペレットを室温で溶解させ、封入体画分を集めてＰＢＳ−Ｔで洗浄した。不溶性材料は、８Ｍ尿素で可溶化し、３ｍＬの、Ｎｉがチャージされた樹脂に結合させた。樹脂は、１５倍カラム容量の洗浄緩衝液で洗浄し、イミダゾールを含む洗浄緩衝液８倍カラム容量の段階的勾配溶出にて、結合したタンパク質を溶出させた。各画分から７．５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。最大量のｐｒｏＳ２−ＢＡＤの画分を合わせて、リフォールディングさせた。残りの画分は、−２０℃で保存した。
ｐｒｏＳ２−ＢＡＤを含有する４ｍＬの５００〜１ｍＭイミダゾール画分を、２００ｍＬのリフォールディング緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ−リン酸塩、ｐＨ６．０又は７．８、１％グリセロール、１０μΜ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ）で迅速に希釈し、室温で一晩インキュベーションして、４，０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間回転沈降させ、Amicon 10 kDa MWCOを用いて３ｍＬに濃縮し、そしてＤＧ−１０カラムを用いて緩衝液を保存緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ−リン酸塩、ｐＨ６．０又は７．８、１％グリセロール、１μΜ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ）に交換した。最終的な試料濃度は以下のとおりであった：約０．１６ｍｇ／ｍＬにて１ｍＬのｐｒｏＳ２−ＢＡＤ（ｐＨ７．８）；及び約０．０９ｍｇ／ｍＬにて１ｍＬのｐｒｏＳ２−ＢＡＤ（ｐＨ６．０）。最終試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。
ｃｐＳ４−ＢＡＤの最終濃度は、約０．２３ｍｇ／ｍＬにて約３．５ｍＬであった。最終試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。
すべての引用文献は、参照により本願明細書に援用する。
本発明を１以上の実施形態に関して説明している。しかしながら当業者には、請求項に定義する本発明の範囲から逸脱せずに、いくらかの変更及び修飾を施しうることが明らかであろう。

Claims (34)

  1. インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びＢｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質。
  2. 前記Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、ＢＨ３ドメインを含むアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドである請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. ＢＨ３ドメインを含む前記アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ／Ｂｏｄ、又はＨｒｋである請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. ＢＨ３ドメインを含む前記アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、リン酸化を低減する変異をさらに含む請求項２又は３に記載の融合タンパク質。
  5. リン酸化を低減する変異をさらに含む、ＢＨ３ドメインを含む前記アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、Ｂａｄポリペプチドである請求項４に記載の融合タンパク質。
  6. 前記融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒを発現している標的細胞の、細胞生存を阻害すること、細胞増殖を阻害すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを増強することができる請求項２から請求項５のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  7. 前記Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドである請求項１に記載の融合タンパク質。
  8. 前記抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、ＢＣＬ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ又はＢｃｌ−２である請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 前記融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒを発現している標的細胞の、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができる請求項７又は８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ＩＬ−２は、環状順列置換されている（ｃｐ）請求項１から請求項９のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  11. 前記ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の鎖への結合に対して選択的な変異体ＩＬ−２である請求項１から請求項１０のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  12. 前記変異体ＩＬ−２は、未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒβに対する選択性が増強されているか、又は未変性ＩＬ−２に比してＩＬ−２Ｒγに対する選択性が増強されているか、又はＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγとの間の会合を破壊する請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. リンカーをさらに含む請求項１から請求項１２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
  14. 前記リンカーは、配列ＧＳを有するか、又はユビキチン若しくはユビキチン変異形分子である請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 請求項１から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質をエンコードする核酸分子。
  16. 請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
  17. 請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
  18. 請求項１から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、請求項１５に記載の核酸分子、請求項１６に記載のベクター、又は請求項１７に記載の宿主細胞を含む医薬組成物。
  19. 細胞死を誘導する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項２から請求項６及び請求項１０から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、又は該ベクターを含む宿主細胞を投与することを含む方法。
  20. 細胞死を誘導する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する標的細胞を、請求項２から請求項６及び請求項１０から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法。
  21. 癌を処置する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項２から請求項６及び請求項１０から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、又は該ベクターを含む宿主細胞を投与することを含む方法。
  22. 癌を処置する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する新生物性細胞を、請求項２から請求項６及び請求項１０から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法。
  23. 癌を処置する方法であって、腫瘍微小環境でＩＬ−２Ｒを発現する非悪性細胞を、請求項２から請求項６及び請求項１０から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法。
  24. 癌を処置する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する免疫細胞を、請求項１から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法。
  25. 前記免疫細胞はナチュラルキラー細胞であり、前記融合タンパク質は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドである請求項２４に記載の方法。
  26. 前記免疫細胞は制御性Ｔ細胞であり、前記融合タンパク質はアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドである請求項２４に記載の方法。
  27. 自己免疫障害を処置する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項２から請求項６及び請求項１０から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、又は該ベクターを含む宿主細胞、投与することを含む方法。
  28. 細胞増殖を刺激する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項７から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、又は該ベクターを含む宿主細胞を投与することを含む方法。
  29. 細胞増殖を刺激する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する標的細胞を、請求項７から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法。
  30. 免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項７から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、又は該ベクターを含む宿主細胞を投与することを含む方法。
  31. 免疫応答を増強する方法であって、ＩＬ−２Ｒを発現する標的細胞を、請求項７から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法。
  32. 養子細胞移入療法又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法における使用を目的として設計操作されたＴ細胞を増殖又は拡張する方法であって、該設計操作されたＴ細胞を、請求項１から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターに接触させることを含む方法。
  33. 細胞死を誘導するため、癌を処置するため、自己免疫障害を処置するため、細胞増殖を刺激するため、免疫応答を増強するため、又は養子細胞移入療法若しくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法における使用を目的として設計操作されたＴ細胞を増殖若しくは拡張するための、それを必要とする被験者又は細胞における、請求項１から請求項１４のいずれか一項記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は該核酸分子を含むベクターの使用。
  34. 前記被験者はヒトである、請求項１９、２１、２７、２８若しくは３０に記載の方法、又は請求項３３に記載の使用。
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CA (1) CA2925421C (ja)
WO (1) WO2015042707A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020515289A (ja) * 2017-03-24 2020-05-28 オルフェウス バイオサイエンス インコーポレイテッド 自己免疫障害の治療のためのｐａｎｔｉｄ
JP2021519336A (ja) * 2018-03-28 2021-08-10 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス Ｉｌ−２コンジュゲート
JP2023515247A (ja) * 2020-03-31 2023-04-12 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 新規な免疫活性インターロイキン２アナログ

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2860170C (en) 2010-12-22 2022-06-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2
CN104619334A (zh) 2012-08-09 2015-05-13 利兰斯坦福初级大学董事会 超级因子和合成因子:具有新的和增强的信号传导活性的经改造细胞因子
CA2925421C (en) * 2013-09-24 2023-08-29 Medicenna Therapeutics, Inc. Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
WO2015164815A1 (en) * 2014-04-24 2015-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
KR102623244B1 (ko) 2016-12-21 2024-01-09 주식회사 엔케이맥스 면역 세포 및 포나티닙을 포함하는 약학 조성물 및 방법
US11542312B2 (en) 2017-06-19 2023-01-03 Medicenna Therapeutics, Inc. IL-2 superagonists in combination with anti-PD-1 antibodies
WO2019073299A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Medicenna Therapeutics, Inc. IL-4 FUSION FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM (CNS) TUMORS
PH12020550661A1 (en) 2017-11-21 2021-04-19 Univ Leland Stanford Junior Partial agonists of interleukin-2
WO2019239213A2 (en) 2018-06-01 2019-12-19 Medicenna Therapeutics Inc. Uses and methods for oncolytic virus targeting of il-4/il-13 and fusions thereof
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
KR20210055070A (ko) * 2018-08-06 2021-05-14 메디카인 인코포레이티드 Il-2 수용체 결합 화합물
CN113646008A (zh) 2019-01-28 2021-11-12 罗德岛大学理事会 pHLIP®肽介导的细胞表面的表位束缚
JP2023527919A (ja) 2020-06-03 2023-06-30 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス Ｉｌ－２配列及びその使用
JP2024528660A (ja) * 2021-07-21 2024-07-30 トゥティーノ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド リンカーポリペプチド
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
CA3244795A1 (en) * 2022-03-08 2023-09-14 Medicenna Therapeutics, Inc. USES AND METHODS FOR BIFUNCTIONAL CYTOKINE MOLECULES OF IL-2, IL-13 AND IL-4
US20250222027A1 (en) 2022-04-01 2025-07-10 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999045128A2 (en) * 1998-03-02 1999-09-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Chimeric proteins with cell-targeting specificity and apoptosis-dinducing activities
US6011002A (en) * 1994-04-08 2000-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Circularly permuted ligands and circularly permuted chimeric molecules
WO2012054929A2 (en) * 2010-10-22 2012-04-26 Protox Therapeutics Corp. Use of human serum albumin to decrease antigenicity of therapeutic proteins
WO2012088446A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816249A (en) 1981-11-17 1989-03-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monoclonal anti-idiotype antibodies
EP0091539B2 (en) 1982-03-31 1996-11-27 Ajinomoto Co., Inc. Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5068177A (en) 1983-12-28 1991-11-26 Scripps Clinic And Research Foundation Anti-idiotype antibodies induced by synthetic polypeptides
US4656132A (en) 1984-03-28 1987-04-07 Cetus Corporation Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria
US4569790A (en) 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US4530787A (en) 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
US4604377A (en) 1984-03-28 1986-08-05 Cetus Corporation Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
US4572798A (en) 1984-12-06 1986-02-25 Cetus Corporation Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins
US4748234A (en) 1985-06-26 1988-05-31 Cetus Corporation Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4931543A (en) 1987-05-11 1990-06-05 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5501959A (en) 1989-01-17 1996-03-26 Alamar Biosciences Laboratory, Inc. Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents
US5227159A (en) 1989-01-31 1993-07-13 Miller Richard A Anti-idiotype antibodies reactive with shared idiotopes expressed by B cell lymphomas and autoantibodies
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
NZ234674A (en) * 1989-08-02 1992-02-25 Seragen Inc Mutant interleukin-2,dna encoding it, host cells, cytotoxic and toxin-mutant il-2 conjugates
US5858784A (en) 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
DK0668777T3 (da) 1992-11-05 2007-02-19 Sloan Kettering Inst Cancer Prostataspecifikt membran-antigen
US6451308B1 (en) 1996-04-26 2002-09-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Antagonists of interleukin-15
US5856445A (en) * 1996-10-18 1999-01-05 Washington University Serine substituted mutants of BCL-XL /BCL-2 associated cell death regulator
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
ATE316982T1 (de) 1999-08-09 2006-02-15 Lexigen Pharm Corp Mehrere zytokin-antikörper komplexen
US6737511B1 (en) 1999-08-16 2004-05-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Receptor-mediated uptake of an extracellular BCL-xL fusion protein inhibits apoptosis
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
WO2001027156A1 (en) 1999-10-08 2001-04-19 Curagen Corporation Interleukin-2 like protein and nucleic acids encoding same
DK1230378T3 (da) 1999-11-15 2007-10-08 Onyx Pharma Inc Et onkolytisk adenovirus
AU2001233027A1 (en) 2000-01-27 2001-08-07 Genetics Institute, Llc Antibodies against ctla4 (cd152), conjugates comprising same, and uses thereof
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
US20030138405A1 (en) 2001-04-17 2003-07-24 Juan Fueyo Conditionally replicative adenovirus to target the Rb and Rb-related pathways
DK1454138T3 (da) 2001-12-04 2012-02-13 Merck Patent Gmbh Immunocytokiner med moduleret selektivitet
US6894527B1 (en) 2003-05-12 2005-05-17 Xilinx, Inc. Evolved circuits for bitstream protection
US7569215B2 (en) * 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
KR20070003934A (ko) * 2004-03-05 2007-01-05 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 치료제의 환자 내약성을 예측하기 위한 시험관 내 테스트시스템
WO2005086922A2 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Board Of Regents, University Of Texas System Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CA2595959A1 (en) 2005-01-27 2006-08-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Methods for treating renal cell carcinoma
EP1866339B8 (en) 2005-03-25 2021-12-01 GITR, Inc. Gitr binding molecules and uses therefor
EP2418278A3 (en) 2005-05-09 2012-07-04 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(PD-1) and methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
KR101607288B1 (ko) 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
JP5114418B2 (ja) * 2005-09-09 2013-01-09 ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ・アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー・デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 細胞死を抑制する又は細胞増殖を高めるための方法及び組成物
WO2009046104A1 (en) 2007-10-01 2009-04-09 University Of Miami Aptamer-targeted sirna to prevent attenuation or suppression of t cell function
EP2057972A1 (en) 2007-11-07 2009-05-13 N.V. Organon Intrauterine deposit
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
US20110171219A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Fahar Merchant Treating cancer stem cells using targeted cargo proteins
US20100183545A1 (en) * 2008-10-14 2010-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Targeted cargo protein combination therapy
TWI729512B (zh) 2008-12-09 2021-06-01 美商建南德克公司 抗pd-l1抗體及其於增進t細胞功能之用途
CA2749539C (en) 2009-01-21 2022-07-19 Amgen Inc. Compositions and methods comprising interleukin-2 mutants for treating inflammatory and autoimmune diseases
BRPI1008692B8 (pt) 2009-02-17 2021-05-25 Ucb Biopharma Sprl anticorpo antagonista tendo especificidade para ox40 humano, sequência de dna isolado, vetor de clonagem ou de expressão, célula hospedeira, processo para a produção do referido anticorpo, composição farmacêutica, uso do 5 referido anticorpo e proteína de fusão
CU23734A1 (es) 2009-11-27 2011-11-15 Centro Inmunologia Molecular Polipéptidos inmunomoduladores derivados de la il-2 con actividad antagonista de esta citocina útiles en la terapia del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas
NZ705128A (en) 2010-03-04 2015-04-24 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
BR112012026227A2 (pt) 2010-04-13 2020-08-04 Celldex Therapeutics, Inc. anticorpo monoclonal humano ou humanizado, molécula biespecífica, vetor de expressão, célula transformada, composição, e, usos de um anticorpo
US20120213771A1 (en) 2010-04-13 2012-08-23 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
SG10201912092VA (en) 2010-09-09 2020-02-27 Pfizer 4-1bb binding molecules
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
WO2012119093A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
WO2012139112A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Ubiquitin fusions for improving the efficacy of cytosolic acting targeted toxins
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
FI20115914L (fi) 2011-09-16 2013-03-17 Oncos Therapeutics Ltd Muunnettu onkolyyttinen virus
KR101981873B1 (ko) 2011-11-28 2019-05-23 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｐｄ-ｌ1 항체 및 그의 용도
US9810692B2 (en) 2012-10-26 2017-11-07 Institut Gustave Roussy Methods for predicting the sensitivity of a subject to immunotherapy
DK2956175T3 (da) 2013-02-15 2017-11-27 Univ California Kimærisk antigenreceptor og fremgangsmåder til anvendelse deraf
RU2702108C2 (ru) 2013-07-16 2019-10-04 Дженентек, Инк. Способы лечения рака с использованием антагонистов, связывающих с осью pd-1, и ингибиторов tigit
JP6936934B2 (ja) * 2013-09-24 2021-09-22 メディシナ セラピューティクス インコーポレイテッド インターロイキン−４受容体結合融合タンパク質及びその使用
CA2925421C (en) 2013-09-24 2023-08-29 Medicenna Therapeutics, Inc. Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
US10711272B2 (en) 2014-01-21 2020-07-14 City Of Hope CTLA-4 aptamer siRNA species
MX379210B (es) 2014-02-07 2025-03-10 Univ Mcmaster Acoplador trifuncional de antígeno de células t y métodos y usos del mismo.
WO2015164815A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
JP2018510151A (ja) 2015-03-06 2018-04-12 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｔｉｍ３に結合する抗体医薬
US20180044429A1 (en) 2015-03-09 2018-02-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
CN107949573B (zh) 2015-09-01 2022-05-03 艾吉纳斯公司 抗-pd-1抗体及其使用方法
EP3387155A4 (en) 2015-12-10 2019-06-12 Definiens AG METHOD FOR THE TREATMENT AND SELECTION OF PATIENTS THAT APPLY TO IMMUNE-ACTED CANCER THERAPY
IL261188B (en) 2016-03-04 2022-08-01 Jn Biosciences Llc An anti-tigit antibody that binds to the tigit polypeptide on one or more amino acid residues

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6011002A (en) * 1994-04-08 2000-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Circularly permuted ligands and circularly permuted chimeric molecules
WO1999045128A2 (en) * 1998-03-02 1999-09-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Chimeric proteins with cell-targeting specificity and apoptosis-dinducing activities
WO2012054929A2 (en) * 2010-10-22 2012-04-26 Protox Therapeutics Corp. Use of human serum albumin to decrease antigenicity of therapeutic proteins
WO2012088446A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CURRENT BIOLOGY, 2000, VOL.10, P.1151-1154, JPN6018029742, ISSN: 0003851296 *
NATURE, 2012, VOL.484, P.529-533, JPN6018029741, ISSN: 0003851295 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020515289A (ja) * 2017-03-24 2020-05-28 オルフェウス バイオサイエンス インコーポレイテッド 自己免疫障害の治療のためのｐａｎｔｉｄ
JP2021519336A (ja) * 2018-03-28 2021-08-10 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス Ｉｌ−２コンジュゲート
JP7490563B2 (ja) 2018-03-28 2024-05-27 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス Ｉｌ－２コンジュゲート
JP2024073467A (ja) * 2018-03-28 2024-05-29 アセンディス ファーマ オンコロジー ディヴィジョン エー／エス Ｉｌ－２コンジュゲート
JP2023515247A (ja) * 2020-03-31 2023-04-12 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 新規な免疫活性インターロイキン２アナログ
US11746137B2 (en) 2020-03-31 2023-09-05 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Immunostimulating IL-2 analogs
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